Sunteți pe pagina 1din 26

BAREM BACTERIOLOGIE- VIRUSOLOGIE

Bacteriologie general 1.Coloraia Gram- principiu,metodologie, interpretare - Principiu-evideniaz forma, gruparea i afinitatea tinctorial a germenului, clasificnd germenii Gram pozitivi i Gram negativi pe baza structurii fizico-chimice a peretelui celular. Germenii Gram pozitivi au peretele gros, dar simplu care rezist la decolorare i pstreaz culoarea violet iniial. Germenii Gram negativi au peretele subire dar complex ca structur dup culorare devenind roii. - Metodologie- frotiul uscat i fixat se acoper cu violet de genian 2 minute. - mordansarea-se acoper lama cu Lugol care se menine 2 minute, apoi se vars fr a se spla. -diferenierea-se acoper frotiul cu un amestec alcool-aceton i se imprim micri de inclinare a lamei. Dup 10 secunde se spal frotiul cu ap de la robinet. -recolorarea-se acopera frotiul cu fuxin Ziehl diluat 1/10 timp de 1-2 minute Se spal cu ap de la robinet. Se usuc i se examineaz la microscop. 2.Coloraia Ziehl-Neelsen principui, metodologie, interpretare - Principiu-bacilii acido-alcoolo-rezisteni au n structura peretelui substane lipidice care se coloreaz greu dar odat colorai nu-i pierd culoarea nici cu un decolorant puternic rmnnd colorai n rou. Celelalte microorganisme, mpreuna cu elementele celulare, se decoloreaz i, dup recolorare, devin albastre. -Metodologie-se acoper frotiul cu fuxin fenicat. Se aeaz flacra sub frotiu i se menine pn la emisie de vapori. nclzirea dureaz 5 minute. Se nltur fuxina, se spal lama cu ap de la robinet . -decolorarea cu o soluie de acid sulfuric 20% timp de 1 minut. Se spal pe ambele fee. -recolorarea cu albastru de metilen 1% timp de 1 minut. Se spal cu ap de la robinet. Se usuc i se examineaz la microscop cu obiectivul cu imersie. n coloraia Ziehl-Neelsen bacilii alcool-acido rezisteni apar roii, iar restul florei i elementele celulare colorate cu albastru. 3.Formele fundamentale ale bacteriilor, aezarea bacteriilor, exemple. -forme-coci (sferici) -cocobacili(intermediari ntre coci i bacili) -bacili(bastonae drepte sau ncurbate) -vibrioni(form de virgul) -spirili i spirochete(form spiralat) -filamente lungi ramificate ce se pot fragmenta -aezare-n diplo:diplococi, diplobacili -n lanuri de lungimi diferite:streptococi -n cub -neregulat sau n ciorchine de strugure:stafilococi -formeaz litere chinezeti:bacilul difteric

4.Elementele structurale obligatorii ale celulei bacteriene-exemple. -peretele celular -citoplasma-membrana citoplasmatic -mezozomi -ribozomi -plasmide -incluzii granulare -nucleul 5.Elementele structurale facultative ale celulei bacteriene-exemple. -capsula -cilii(flagelii) bacterieni -fimbriile(pilii) -sporii 6.Caractere de cultur ale bacteriilor pe medii lichide-exemple. -turbiditatea-omogen, n toat masa mediului de cultur: stafilococ, Salmonella, Proteus -inegal, sub forma unui depozit grunjos la partea inferioar i pe pereii eprubetei cu un aspect mai limpede n celelalte dou treimi supeioare:streptococul -hemolitic. -depozit floconos i aderent la fundul eprubetei, mediul fiind clar n rest:bacilul antraxului -aspecte la suprafaa mediului-formare de val subire la suprafa:vibrion holeric, C.diphteriae -formarea unei pelicule fine:unele tulpini de Proteus -formarea unei membrane groase, rugoase, ncreite la suprafa, restul mediului fiind limpede:bacilul tuberculos -formarea unei membrane uscate scuamoase:Bacillus subtillis -formarea unui inel aderent la jonciunea dintre concavitatea nivelului superior al lichidului i pereii eprubetei:tulpini E.coli -culoare-apariia unei coloraii diferite de cea a mediului nensmnat -miros caracteristic-aromat, de flori de tei: Pseudomonas -fecaloid: E.coli -putrid: Proteus -corn ars: bacilul tetanic 7.Caractere de cultur ale bacteriilor pe medii solide-exemple -dimensiuni-mici: Haemophylus,Brucella, Bordetella -mijlocii: Proteus, Salmonella, Streptococcus -mari: Staphylococcus, E.coli -form: rotunde, ovalare, dendritice, lenticulare, filamentoase -suprafa-netede -rugoase -bombate: Stafilococul, E.coli, Vibrionul holeric -mamelonate: Bacilul tuberculos, Bacilii difterici -aplatizate: Pseudomonas -ombilicate: Pneumococ -contur: circular, regulat, ntreg, ncreit, ondulat, cu prelungiri -transparen-opacitate-hiperopacitate: vibrion holeric -transparente: Haemophzllus, Shigella -translucide: Salmonella, Proteus -opace: Stafilococ, E.coli -strlucire-matitate-lucioase: Streptococ -hemolitic 2

-mate -uscate, granulare: bacilul tuberculos -consistena-friabile:bacilul tuberculos -mucoase:Klebsiella, Streptococ -hemolitic -untoas -spumoas -aderena la mediu-neaderente: streptococ, stafilococ, Shigella -aderente: bacilul piocianic -incastrate n mediu -culoare-prin pigment propriu-albe: stafilococ alb -galben-aurii: stafilococ aureu -galben-citrin: stafilococ citrin -verde fluorescent: Pseudomonas aeruginosa -portocalii: streptococ de grup B -virarea culorii indicatorului din mediu -mirosul -hemoliza-dimensiunile zonei-mari: stafilococ -hemolitic, streptococ -hemolitic -mici: stafilococ -gradul hemolizei-parial de tip alfa: streptococ -hemolitic -complet de tip beta: streptococ -hemolitic -de tip gamma: streptococii nehemolitici -de tipcald-rece -forma-S-contur circular, suprafa neted, bombate -R-contur ncreit, suprafa rugoas, turtite 8.Sterilizarea cu ajutorul cldurii uscate-principii, exemple. -nclzirea la rou-trecerea prin flacra becului de gaz a obiectului care conine germeni microbieni(anse bacteriologice, pipete Pasteur i a gurii tuburilor care conin medii de cultur) -sterilizarea prin aer cald-se realizeaz n etuv la 160-180oC timp de o or(obiecte de laborator din sticl, seringi Luer din sticl, instrumentar chirurgical, substane grase, pulberi termostabile) -incinerarea-presupune arderea cu reducere la cenu(materiale de plastic, reziduuri organice solide, gunoiul, cadavrele i carcasele animalelor de experien). 9.Streilizarea cu ajutorul cldurii umede-principii, exemple. -prin autoclavare-se bazeaz pe relaia care exist ntre temperatura vaporilor supranclzii i presiune -autoclavele cu perete simplu-pentru sterilizarea soluiilor i materialului contaminat din laborator, sticlria pentru culturi de celule i aparatele de filtrare -autoclavele cu manta de abur-pentru materiale chirurgicale din bumbac, obiecte i instrumente din cauciuc, instrumentar metalic, seringi cu componente metalice -autoclavul vertical cu manta de abur-pentru soluii, materiale chirurgicale, seringi, sticlrie cu destinaie special -autoclavul cu evacuare gravitaional a aerului -pasteurizare-reprezint o metod de sterilizare incomplet, distrugnd formele vegetative, nu i pe cele sporulate; const n trecerea lichidelor ntr-un strat subire peste o suprafa nclzit (60-90oC) o anumit perioad de timp, urmat de o rcire brusc -tyndalizarea-n medii care permit germinarea sporilor, nclzirile repetate omoar att formele vegetative existente iniial, ct i pe cele germinate din spori n intervalele dintre nclziri

10.Medii de cultur utilizate pentru izolarea bacteriilor-exemple -medii simple-lichide:bulion, ap peptonat -solide:geloz simpl -medii complexe-mediul geloz snge(stafilococi, streptococi, pneumococi) -medii elective-mediul Loeffer(bacilul difteric) -medii selective-mediul Lowenstein Jensen -mediul hiperclorurat solid Chapman(stafilococi manito-pozitivi) -mediul Tinsdale, mediul Gundel-Tietz(bacilul difteric) -mediul Rogose(lactobacili) -medii pentru izolarea enterobacteriilor -mediul PPLO -mediul Diudonne -medii de mbogire-mediul OCST(bacil difteric) -mediul hiperclorurat lichid Chapman(stafilococi) -mediul Picke(streptococ -hemolitic grup A) -mediul Muller-Kauffmann-Salmonella -medii difereniale-mediul Drigalski(bacteriile are fermenteaz lactoza) -medii pentru punerea n eviden a anumitor proprieti biochimice -medii politrope(TSI, MIU, MILF) -mediul Hiss -mediul Clark-Lubs -mediul Simons -mediul cu fenilalanin -mediul cu lizin -mediul cu esculin -medii pentru cultivarea bacteriilor anaerobe-mediul Veillon -mediul Tarozzi -mediul Willis-Hobbs -medii pentru cultivarea fungilor-mediul Sabouraud 11.Medii politrope de identificare biochimic a bacteriilor(TSI, MIU)-exemple. -mediul TSI(agar triplu zaharat feros) evideniaz fermentarea glucozei cu sau fr gaz, fermentarea lactozei i zaharozei i producerea de hidrogen sulfurat. -mediul MIU(mobilitate, indol, uree) este semisolid i evideniaz mobilitatea germenilor, producerea de ureaz; pentru evidenierea producerii de indol se ataeaz o band indicatoare. 12.Morfologia unui bacteriofag -dimensiuni-1-10m -forma i aezarea: -cocii-diametru 0,8-1m -forma-rotunde(stafilococ), ovalare(enterococi), lanceolate, reniforme -aezare-n grmezi sub form de ciorchini de strugure(Staphylococcus) -n tetrade, coci dispui simetric cte 4 -n grupuri de cte 8 coci orientai n spaiu tridimensional -in diplo -n lanuri(Streptococcus) -izolai(micrococii) -bacilii-sunt bacterii cu form de bastonae, cu dimensiuni ntre 1,5-10m -aezarea poate fi cel mai des sub form izolat, dar i n poziii ntmpltoare unul fa de cellalt -pot fi grupai-cte doi(Klebsiella pneumoniae) 4

-aezai n lanuri(streptobacili, bacilul antrax) -sub forma literelor chinezeti(bacili difterici) -cocobacilii-sunt bacterii cu form intermediar ntre coci i bacili, cu dimensiuni 1-1,5 m(Bordetella pertussis, Haemophilus influenzae) -vibrionii-sunt bacterii ncurbate n form de virgul(Vibrio cholerae) -spirilii-sunt bacterii cu corpul spiralat cu filamentul mai scurt i cteva spire(Borrelia recurrentis) -spirochete-sunt bacterii cu filamentul mai lung, corpul flexibil cu 15-20 de spire strnse i regulate(Treponema pallidum) 13.Antibiograma-metode, importan n practica medical. Este testarea sensibilitii unei tulpini bacteriene la ageni chimioterapici sau antibiotice. Principiul metodei const n punerea n contact a suspensiei bacteriene cu diferite antibiotice. a) Metoda difuzimetric-gradientul de concentraie necesar determinrii se realizeaz n mediu agarizat prin difuzarea radial a antibioticului dintr-un depozit depus pe suprafaa mediului, nsmnat n pnz cu bacteria de testat. Acest gradient scade proporional cu ptratul distanei de la antibiotic. Cultura nu apare n aria n care antibioticul realizeaz CMI pentru bacteria testat. Metoda difuzimetric se utilizeaz numai pentru bacteriile cu cretere rapid. Permite testarea mai multor antibiotice pe aceeai flor. b) Metoda diluiilor permite determinarea concentraiei minime inhibitorii(CMI). n mediul lichid, inoculul bacterian se distribuie ntr-o serie de tuburi sau godeuri, coninnd bulion Mueller-Hinton cu antibioticul n concentraii crescnde(0; 0,25; 1; 2; 4; 8; 16 mg/l). Inoculul const dintr-o suspensie din tulpina microbian de testat diluat de ordinul 105germeni/ml. Dup incubare 24 de ore la 37oC, CMI este indicat de tubul sau godeul care conine cea mai mic concentraie de antibiotic la care creterea bacterian nu mai este vizibil. 14.Criterii de clasificare a chimioterapicelor antibacteriene-exemple. a)Dup structura chimic: -beta-lactamine peniciline: penicilina G, penicilina V, penicilina de depozit(moldamin), ampicilina, oxacilina, cloxacilina, carbenicilina, amoxicilina, carboxipeniciline, ticarcilina, imipenem. -cefalosporine- I-a generaie:cefalexin, cefalothin, cefapirin, cefadroxil, cefazolin -a II-a generaie:cefuroxim, cefonicid, ceforamid, cefoxitin, cefotetan, cefotiam, cefamandol -a III-a generaie:cefotaxim, ceftazidim, ceftriaxon, cefoperazon, moxalactam -a IV-a generaie:cefepima, carbacefema -carbapenemi -monobactami -inhibitori de beta-lactamaz -aminoglicoside: streptomicin, Kanamicin, Gentamicin, Neomicin, Spectinomicin. -polimixine: polimixina B, polimixina E. -alte antibiotibe: cloramfenicol, tetracicline, macrolide, lincomicin, clindamicin, novobiocin, vancomicin, rifampicin -chimioterapice antibacteriene considerate non-antibiotice: sulfamide, biseptol, acid nalidixic, nitrofurantoin, tiosemicarbazona, isoniazida, acid paraaminosalicilic b)Dup origine -anibiotice propriu-zise(chimioterapice naturale) produse de microorganisme: penicilina, polimixina, bacitracina, streptomicina. -chimioterapice de semisintez- prezeni n laborator pe baza unui nucleu sintetizat de ctre un microorganism viu: meticilina, penicilina V, G, ampicilina. 5

-produi de sintez chimic integral(chimioterapice sintetice): sulfamidele, acid nalidixic, biseptol, HIN, PAS, nitrofurantoin. c)Dup scopul folosirii Chimioterapice: antibacteriene, antifungice, antiparazitare, antivirale. d)Dup spectrul de activitate -chimioterapice cu spectru larg: cloramfenicol, tetraciclinele, ampicilina, sulfamidele, cefalosporinele. -chimioterapice cu spectru ngust-cu aciune predominant asupra bacteriilor Gram pozitive (majoritatea penicilinelor, eritromicina, streptomicina). -cu aciune predominant asupra unor bacterii Gram negative (kanamicina, gentamicina, cefalosporine, acidul nalidixic). -cu aciune predominant asupra BK (streptomicina, HIN, PAS). -cu aciune predominant asupra spirochetelor (penicilina). e)Dup felul n care i exercit efectul antibacterian -bacteriostatice- mpiedic multiplicarea germenilor bacterieni, fr s-i omoare (cloramfenicol, sulfamide, tetraciclin) -bactericide-au efect letal asupra celulelor bacteriene (streptomicin, penicilin, ampicilin) f)Dup mecanismul de aciune -ageni cu aciune asupra structurilor de suprafa ale celulei bacteriene (perete celular, membrana citoplasmatic) -ageni care interfer cu sinteza proteinelor celulelor bacteriene -ageni care interfer cu sinteza acizilor nucleici 15.Patogenitatea bacteriilor prin factori de virulen corpusculari-exemple. Patogenitatea reprezint capacitatea bacteriei de a produce boala prin virulen i/sau toxinogenez. Virulena este proprietatea unor ageni microbieni de a ptrunde n organismul gazdei, de a-l invada, de a se multiplica i de a produce leziuni sau modificri funcionale ale esuturilor pentru care prezint tropism. Factorii de virulen corpusculari sunt reprezentai de anumite elemente din structura celulei bacteriene, care i confer protecie mpotriva mijloacelor de aprare ale organismului, dar i posibilitatea de a ptrunde n esuturi: -capsula -componente ale peretelui celular -mobilitatea -fimbrii -adezine nefimbriale 16.Patogenitatea bacteriilor prin factori de virulen enzimatici-exemple. Enzimele sunt factori favorizani ai ptrunderii germenilor dincolo de poarta de intrare. -colagenaza -hialuronidaza -fibrinolizine -coagulaza -lecitinaza -hemolizinele i leucocidinele 17.Patogenitatea bacteriilor prin toxinogenez-exemple. 6

Toxinogeneza reprezint capacitatea unor bacterii de a produce toxine. Toxinele sunt de dou feluri: -exotoxine, secretate n mediul nconjurtor ca un proces al metabolismului propriu bacterian -endotoxine care fac parte din structura peretelui celular i care sunt eliberate n mediu numai dup moartea bacteriei 18.Postulatele lui Robert Koch-enumerare. Definiia unui patogen: 1.Organismul trebuie s fie gsit n leziunea unei boli; 2.Organismul trebuie s fie izolat de la gazda infectat i crescut ntr-o cultur pur; 3.Inocularea organismului pur ntr-o alt gazd ar trebui s iniieze boala; 4.Organismul trebuie s fie recuperat din nou de la a doua gazd. 19.Anticorpi cu rol n aprarea antibacterian-exemple. -IgG -anticorpi antitoxici -IgA -IgM 20.Celule implicate n aprarea nespecific i specific antibacterian. -limfocitele Thelper -limfocite T imune 21.Vaccinuri bacteriene-clasificare, exemple. a)Dup tipurile de preparate vaccinale -vaccinuri corpusculare-cu germeni bacterieni omori(vaccinul tifoidic, holeric, pertussis) -cu germeni bacterieni vii atenuai(vaccinul BCG, vaccinul viu atenuat, vaccinul difteric T32 viu) -vaccinuri subunitare-vaccinul pertussis acelular, vaccinul acelular contra difteriei, tetanosului i tusei convulsive -anatoxine-vaccinul difteric absorbit (VDA-IC) b)Dup numrul componentelor antigenice -monovaccinuri-vaccinul monovalent alctuit din vaccin holeric, anatoxin tetanic -vaccinuri asociate(mixte)-bivaccinul diftero-tetanic, trivaccinul diftero-tetano-pertussis.

Bacteriologie special 1. Stafilococ: caractere morfologice Este coc Gram pozitiv, sferic, cu diametrul cuprins ntre 0,5-1,2 m. Se grupeaz sub form de grmezi, asemntor boabelor din ciorchinele de strugure. Este nesporulat, imobil i uzual necapsulat, existnd i forme capsulate la tulpinile virulente. 2. Stafilococ: caractere de cultur Sunt germeni nepretenioi din punct de vedere metabolic, putnd crete pe medii simple lichide i solide la un pH optim de 7,5 i temperatur 36-37oC, n condiii de aerobioz sau anaerobioz. Creterea n mediu lichid (bulion simplu) duce la tulburarea uniform a acestuia, cu depozit moderat la baza tubului nsmnat. Pe mediu solid, dup incubare timp de 18-24 ore la 37oC, dezvolt colonii cu aspect S, rotunde, cu diametru cuprins ntre 1-3 mm, lucioase, bombate, opace, cu margini perfecte, pigmentate n auriu. Dac stafilococul posed capsul, colonia va avea aspect mucos, filant. n cazul izolrii pe mediu agar-snge, colonia este nconjurat de o zon de hemoliz total. 3. Stafilococ: aspecte clinice n infecii umane Se caracterizeaz printr-un polimorfism, att n ceea ce privete varietatea organelor i esuturilor interesate, ct i prin intensitatea fenomenelor clinice, care pot fi uoare, dar i severe. Localizrile cutanate ale infeciei se manifest prin dermatoz, acnee, furuncule localizate pe ceaf, fese, panariii, ulcior, infecie a glandelor sudoripare, infecii ale plgilor. Localizrile mucoase se manifest clinic prin: flegmon amigdaloidian, rinit purulent la nou-nscui, conjunctivite, angine, sinuzite, otite, mastoidite. Localizrile viscerale ale infeciei stafilococice au diverse manifestri: pneumonie, abces pulmonar, pleurezie purulent, endocardite, pericardite, flebite, osteomielit, artrit, meningite, accidente vasculare, tromboflebite, uretrite, cistite, prostatite, metro-anexite, sindromul ocului toxic, abces renal, intoxicaie alimentar, enterocolit pseudomembranoas. 4. Stafilococ: schema diagnosticului de laborator a)Recoltarea produselor patologice se fac n condiii de strict asepsie prin metode ce depind de produsele patologice. b)Diagnosticul bacteriologic Examenul direct-se efectueaz prin frotiuri colorate Gram i albastru de metilen. Pune n eviden coci Gram pozitivi aezai n ciorchine, necapsulai, eventual prezena unei alte flore de asociaie i a granulocitelor, precum i relaia de fagocitoz dintre fagocite i germeni. Izolarea-se face prin nsmnarea pe medii simple(geloz, bulion), pe medii complexe(geloz-snge) i pe medii hiperclorurate sau solide. Mediile hiperclorurate au scopul de a selecta stafilococii dintr.un produs normal contaminat. Stafilococul este un germen aerob, facultativ anaerob. Identificarea -caractere de cultur- pe mediile solide produc colonii S, bombate, lucioase, cu margini regualte, pigmentate. Pe mediul cu geloz-snge speciile patogene produc o hemoliz total, clar, de tip cald-rece. Pe mediile lichide tulbur uniform bulionul. 8

-caractere morfologice- examenul microscopic al frotiurilor efectuate din coloniile de stafilococ, colorate Gram pune n eviden coci Gram pozitivi aezai n grmezi, necapsulai. -caracter de patogenitate- pentru stabilirea proprietilor patogenice se fac cu urmtoarele teste: 1.Teste de patogenitate in vitro 1.1) Testul hemolizei- tulpinile patogene determin n jurul coloniilor o zon caracteristic de hemoliz. Este complet i incomplet. 1.2) Testul coagulazei-cercetarea prezenei coagulazei se poate efectua n tuburi de hemoliz sau pe lam, dup cum se cerceteaz forma liber sau legat a enzimei. Cercetarea coagulazei libere se pune ntr-o eprubet cu 1 ml plasm de om sau iepure, diluat 1/5, iar n ea se suspend 1-2 picturi din cultura de bulion de 24 ore a tulpinii n cauz. Eprubeta se menine la 37oc i este urmrit procesul lent de coagulare din 30 n 30 minute timp de 4-6 ore, agitndu-se lent eprubeta. Cercetarea coagulazei legate se face pe lam depunndu-se o pictur de plasm uman n care emulsionm o colonie din tulpina de cercetat. Coagulaza determin adunarea n grmezi a stafilococilor, vizibile ca nite fire de nisip. 1.3) Frementarea manitei-tulpinile de stafilococ scindeaz n condiii de aerobioz manitolul inclus n mediul de cultur. Coloniile de stafilococ care fermenteaz manita se coloreaz n galben-portocaliu cu un halou galben. 1.4) Pigmentogeneza-pentru a cerceta capacitatea de a produce pigment a tulpinilor de stafilococ izolate pe mediile de cultur, acestea se nsmneaz pe geloz-snge sau pe un mediu cu ser de bou. Dup o incubare de 20-24 ore se menin 24-48 ore la temperatura camerei, la care randamentul produciei de pigment este crescut. 1.5) Testul fibrinolizinei-elaborarea de fibrinolizin se pune n eviden prin nsmnarea unor colonii de stafilococi n arii mici pe un mediu geloz cu plasm oxalatat. n cazul unei reaciipozitive apare o zon calr. 2. Teste de patogenitate in vivo Filtratul unei culturi de stafilococ n bulion inoculat n cantitate de 0,1-0,2 ml intradermic la iepure produce n zilele urmtoare o dermonecroz. Dac se inoculeaz intravenos la iepure n cantitate de 0,5 ml animalul va muri. -identificarea pe baza sensibilitii la bacteriofagi-lizotipia testeaz sensibilitatea la bacteriofagi c)Antibiograma-se efectueaz antibiograma difuzimetric obligatorie, deoarece tulpinile de stafilococ capt repede rezisten la chimioterapice ca urmare a tratamentului necorespunztor cu antibiotice ca doz i ca timp. 5. Streptococ beta-hemolitic grup A: caractere morfologice Streptococii beta-hemolitici sunt coci sferici(diametru 1m), Gram pozitivi, aezai n lanuri, nesporulai, imobili, rareori capsulai. Sub aciunea antibioticelor pot suferi modificri morfologice i tinctoriale. 6. Streptococ beta-hemolitic grup A: caractere de cultur Pentru dezvoltare necesit suplimentarea mediilor de cultur cu ser sau snge integral, la pH=7,5 i T=37oC; sunt aerobi sau facultativ anaerobi. Pe medii lichide produce depozit la fundul eprubetei i pe perei. Pe mediile solide produc colonii mici, translucide, nconjurate de o zon de hemoliz beta . Dup aspectul coloniilor pe geloz-snge se disting : -colonii mucoide-lucioase, mici, filante -colonii mott-mici, cu suprafa mamelonat i cu margini neregulate, cu consisten apoas 9

-colonii glossy-lucioase, convexe, strlucitoare -colonii rough-colonii pitice, turite, uscate, rugoase, nepatogene 7. Streptococ beta-hemolitic grup A: aspecte clinice n infeciile umane Streptococii beta-hemolitici, prin complexitatea componentelor celulare pot s determine numeroase forme de mbolnviri. n raport de: calea de ptrundere, localizare, patogenitatea germenului i rezistena organismului, streptococii piogeni pot determina infecii acute cu localizate la nivelul tractului respirator, pielii, tractului genital etc. a)Infecii acute - infecii respiratorii-faringit, angine, otite, sinuzite, mastoidite, bronhopneumonii, pleurezii, pneumopatii - infecii cutanate-impetigo, infecia comisurii bucale, infecia interdigital, erizipetul, suprainfecia plgilor chirurgicale sau a arsurilor - infecii genitale - scarlatina b)Complicaii poststreptococice - glomerulonefrit acut difuz, reumatismul articular acut, febra reumatismal, cardita reumatismal, coreea, eritemul nodos 8. Streptococ beta-hemolitic grup A: schema diagnosticului de laborator a)Recoltarea produselor patologice: exudatul faringian, sput, puroi, lichide de puncie, snge. b)Diagnosticul microbiologic Diagnosticul bacteriologic Examenul direct- se efectueaz pe frotiuri colorate Gram i albastru de metilen avnd rol de orientare n cazul produselor normal contaminate cu flor saprofit. Prin examenul microscopic se observ coci Gram pozitivi, sferici, dispui n lanuri scurte, nesporulai i necapsulai. Izolarea se afce pe medii complexe geloz-snge, bulion ser sau lichid de ascit. Identificarea tulpinilor streptococice se face avndu-se n vedere urmtoarele caractere: 1) Caractere de cultur 1.1)Pe medii solide-streptococul beta-hemolitic pe geloz snge, dup 18 ore de incubare la 37oC se dezvolt sub forma unor coloniimici, punctiforme de tip S, translucide nconjurate de o zon de hemoliz beta. Tulpinile capsulate formeaz colonii mucoide, rotunde, lucioase. Se mai pot diferenia colonii matt apoase, colonii glossy, colonii R. 1.2)Pe medii lichide germenii se dezvolt manifestnd o cretere granular sub form de grunji care se depun la fundul i pe pereii eprubetei, lsnd supernatantul limpede. 2)Caractere morfologice-pentru a stabili caracterele morfologice, din cultura pur se face un frotiu colorat Gram. Pe frotiu streptococii beta hemolitici se prezint sub form de celule sferice Gram pozitivi, aezate caracteristic n lanuri lungi asemntoare unui irag de mrgele. 3)Identificarea serologic de grup i tip 3.1)Identificarea grupului serologic se poate realiza prin mai multe metode: -testul sensibilitii la bacitracin-reprezint o metod de difereniere rapid a streptococilor beta hemolitici de grup A de testul streptococilor beta hemolitici din grupele C i G. -reacii serologice de certitudine-urmresc identificarea grupului streptococic: a) Reacia de prercipitare n inel- const n punerea n contact a doi reactani, antigenul C de grup i anticorpii din serurile precipitante de grup A, C, G. 10

b) Metoda coaglutinrii se efectueaz pe lam utiliznd suspensia tulpinii de identificat i reactivi streptici A, B, C, G, D c) Tehnica imunofluorescenei-folosete seruri imune standard fluorescente specifice d) Tehnica latex aglutinrii n care anticorpii specifici de grup sunt fixai pe latex 3.2)Identificarea tipului se efectueaz n cadrul anchetelor epidemiologice pentru a contribuii la stabilirea surselor epidemiologice i filaiei cazurilor. Se folosesc: -reacia de aglutinare pentru evidenierea antigenului T -reacia de precipitare pentru evidenierea antigenului M Sensibilitatea la chimioterapice- numai cei din grupul A i-au pstrat sensibilitatea la penicilin i eritromicin. Diagnosticul imunobiologic Diagnosticul serologic urmrete evidenierea anticorpilor antistreptococici fa de antigenele microbiene i fa de toxinele streptococice. 1) Evidenierea anticorpilor antimicrobieni se realizeaz prin reacii de aglutinare i precipitare. Prezena anticorpilor antiprotein M denot o imunitate de protecie fa de infecia streptococic. 2) Evidenierea anticorpilor antitoxici se poate realiza in vitro sau in vivo 2.1) In vitro anticorpii antitoxici frecvent decelerai n diagnosticul afeciunilor streptococice sunt: -anticorpii antistreptococici-O(ASLO) este o reacie de neutralizare a streptolizinei O de ctre anticorpii specifici prezeni n serul bolnavului. Neutralizarea activitii hemolitice a streptolizinei se evideniaz macroscopic prin adugarea de hematii de iepure. n prezena anticorpilor hematiile rmn nehemolizate i se depun la fundul eprubetei de reacie. Titrul anticorpilor este dat de ultimul tub n care nu se mai produce hemoliza. Titrul normal este pn la 250 uniti ASLO/ml. Rezultatele pozitive indic existena unei infecii streptococice acute a complicaiilor poststreptococice sau ineficiena tratamentului. 2.2) In vivo se poate realiza prin reacii de neutralizare: -IDR dick testeaz prezena sau absena anticorpilor antitoxin eritrogen n organismul uman -fenomenul de stingere Schultz-Charlton identific erupia cutanat dat de streptococi betahemolitici grup A Testarea rspunsului imun celular se efectueaz : -in vitro-testul transformrii blastice fa de antigene streptococice -testul de inhibiie a migrrii macrofagelor -in vivo-depistarea strii de hipersensibilitate la subiecii cu infecii repetate prin intradermoreacii la vaccin streptococic sau streptolizin O. n ambele cazuri reacia pozitiv const n apariia dup 24 de ore de la inoculare a unui eritem. 9. Bacilul Koch : caractere morfologice Se poate evidenia la microscopul optic dup colorarea preparatului cu metoda ZiehlNeelsen. Prezint alcool-acido rezisten. n prezena fuxinei concentrate i la cald, lipidele din peretele celular formeaz complexe cu acest colorant, ceea ce face ca bacilii s se coloreze n rou. Sunt subiri, rectilinii, aezai izolai sau sub forma literelor X, Y, V, Z, K, sunt imobili, nesporulai, necapsulai. n cazul n care frotiul provine dintr-un produs patologic, se mai pot evidenia ca elemente de asociaie flor bacterian, celule de descuamare, leucocite, colorate n albastru, datorit faptului c au pierdut fuxin dup tratamentul preparatului cu alcool-acid. Dac preparatul microscopic este efectuat din cultura de pe mediul de izolare(Lowenstein), bacilii Koch 11

se vor dispune n cordoane rsucite, reprezentnd un semn de patogenitate a tulpinii. Examenul microscopic se mai face i cu ajutorul reaciei de imunofluorescen.

10. Bacilul Koch : caractere de cultur Este strict aerob, pretenios din punct de vedere metabolic. Crete pe mediul LowensteinJensen(glbenu de ou, acid glutamic, glicerin, amidon, asparagin, extracte de esuturi) dup 2-3 sptmni n condiii de aerobioz. Coloniile sunt rugoase, cu suprafaa i marginile neregulate, cu aspect conopidiform, de culoare alb-glbuie. Pe mediul lichid mbogit cu substane organice, BK formeaz o pelicul care se ngroa treptat i cade la fundul eprubetei. 11. Bacilul Koch : aspecte clinice n tuberculoz Apariia infeciei tuberculoase depinde att de virulena tulpinii, ct i de reactivitatea nespecific i specific a organismului. Boala la om are consecina inhalrii sau ingestiei de bacili tuberculoi. Primoinfecia tuberculoas se produce de obicei la persoanele tuberculino-negative, n primii ani de via. Localizarea este preponderent pulmonar. Complexul primar este format din: -afectul primar(folicul de celule epiteloide i gigante) -limfagit -adenopatie(inflamaia i hipertrofia ganglionilor regionali) Leziunile pot evolua ctre stabilizare i scleroz. Dac multiplicarea bacililor este mai mare se poate antrena o necroz cu producerea de cazeum. Poate surveni o evoluie nefavorabil prin ramolirea zonei cazeificate cu formarea unei caverne care poate erupe ntr-o bronhie, cu diseminare n restul plmnului i formarea de noi focare. n cazul erupiei ntr-un vas sanguin germenii trec n circulaie, cu localizri extrapulmonare (intestinale, genitale, renale, meningeale, osoase, cutanate, seroase). 12. Bacilul Koch : schema diagnosticului de laborator a)Recoltarea produselor patologice:sput, spltur gastric, bronic, exudat pleural, LCR, urin, probe de biopsie. b)Diagnosticul microbiologic Examenul direct se face pe frotiu colorat Ziehl-Neelsen, depisteaz bacilii acido-alcoolo rezisteni fr indicaii referitoare la specie. -Tehnica coloraiei Ziehl-Neelsen pune n eviden forma tipic, bacilii incubai, de culoare roie pe fondul albastru al preparatului. Examinarea se face cu obiectivul cu imersie. Se examineaz minim 100 de cmpuri. Trebuie avute n vedere posibile erori. -Tehnica examinrii prin fluorescen se utilizeaz un amestec de auramin-rhodamin. Se consider rezultat negativ dac nu se evideniaz niciun bacil alcoolo-acido-rezistent i rezultat cert pozitiv dac se evideniaz 1-5 bacili. -Reacia PCR pune n eviden ADN-ul mycobacteriei n LCR n cazul efecturii unui diagnostic rapid al meningitei tuberculoase. Izolarea prelevatele contaminate se nsmneaz dup decontaminare. Pentru izolare se folosesc medii mbogite Lowenstein-Jensen. Identificarea -pe baza caracterelor de cultur -caractere morfologice -pe baza caracterelor biochimice -Testul catalazei const n acoperirea coloniilor obinute pe mediile solide cu o soluie de perhidrol. Reacia pozitiv const n apariia unor bule de gaz. -Testul lui Konno-punerea n contact a unei culturi de bacili vii cu o soluie(anilin, 12

alcool, bromur de cialogen). n caz pozitiv tulpina niacino-pozitiv apare de culoare galben. -pe baza caracterelor de patogenitate-se inoculeaz 2 cobai pe cale subcutanat. Se observ dup 2 sptmni modificarea strii generale. La locul de inoculare apare un nodul fluctuent care ulcereaz. Dup moartea animalului la autopsie se constat hepatosplienomegalie. -lizotipia este important din punct de vedere epidemiologic, evideniind circulaia mycobacteriilor patogene ntre diferite zone geografice Antibiograma-testarea se face pe mediul Lowenstein-Jensen, diluiile de antibiotic se adaug pe suprafaa mediului. Pentru streptomicin i PAS se folosesc serii de tuburi dintre care 2 sunt martori. c)Diagnostic imunobiologic -in vivo prin intradermoreacia la tuberculin -in vitro prin testul de transformare blastic specific limfocitelor T -imunitatea umoral se studiaz n ser a anticorpilor IgA specifici i a anticorpilor IgG fa de fraciunile antigenice A60 i 38KD folosind tehnici imunoenzimatice. 13. Pneumococ : caractere morfologice Coci Gram pozitivi, n form de flacr de lumnare sau vrf de lance. De obicei, n produsul patologic se gsesc grupai cte doi indivizi, cu predominan extracelular. n cultur, sunt aezai tot n perechi sau n lanuri scurte, mai ales cnd concentraia ionilor de magneziu este sczut. Prezint capsul sub form de halou luminos n jurul germenilor cu coloraia albastru de metilen sau tu de China, de natur polizaharidic. Sunt imobili, nesporulai. 14. Gonococ : caractere morfologice Coci Gram negativi, reniformi, aezai in diplo, predominant intracelular. Ca structur, tipurile 1 i 2(virulente) prezint fimbrii, iar tipurile 3 i 4(avirulente) nu prezint fimbrii. Fimbriile se evideniaz cu microscopul electronic i sunt atributul germenilor viruleni.

13

Virusologia general 1. Morfologie i simetrie virala exemple. Virusuri animale Forma virusurilor: Cilindric-unele virusuri vegetale de tipul virusului mozaicului tutunului Sferoidal-virusuri gripale Cristaliform(poliedric)-enterovirusurile Prism sau crmid-poxvirusurile Structura viral: Virionul(particula viral) este alctuit din miez genomic,capsid i uneori anvelop. a) Miezul genomic-alctuit din ADN sau ARN cu structur polinucleotidic. Conine informaia necesar pentru multiplicarea viral.Genomul poate fi simplu sau dublu, spiralat, linear, circular sau suprainfurat. Genomul poate fi simplu sau dublu, continuu sau fragmentat. b) Capsida-nvelisul extern al genomului viral, pe care l protejaz. Este format din subuniti identice numite capsomere. Din punct de vedere structural acestea sunt alctuite din proteine simple, hetero-proteine sau glicoproteine virale. Genomul viral mpreun cu capsida formeaz nucleocapsida. c) nveliul(peplos,manta,anvelopa) este alctuit din subuniti denumite peplomere de natur proteic. Este prezent la unele virusuri: HIV,virusul gripal. Tipuri de simetrie viral: Capsomerele se pot aeza spaial n 3 modele de simetrie viral: Simetrie helicoidal-virusul mozaicului tutunului,virusurile gripale,virusul rabic Simetrie icosaedric(cubic)-enterovirusuri,adenovirusuri,herpesvirusuri Simetrie mixt-poxvirusuri Virusuri bacteriene(bacteriofagi) Prezint: a) cap-format din miez de ADN sau ARN b) gt c) coad-format din-miezul lacunar -teac contractil -plac bazal 2. Schema diagnosticului de laborator n viroze. a. Recoltarea i prelucrarea produselor patologice Eficiena examenului depinde de: -momentul prelevrii produselor -locul de unde se recolteaz-n general pentru viroze-secreii nazo-faringiene,oculare sau n secreia conjunctival -modul de prelevare-puncie-snge,LCR -tampon-secreii conjunctivale, nazale, faringiene, vaginale -eliminare direct-fecale, urin, sput -post-mortem se recolteaz fragmente de organe Dup prelevare, produsele patologice sunt conservate i transportate n medii de cultur cu antibiotice Penicilin, Streptomicin pentru inhibarea dezvoltrii florei microbiene. Prelucrarea 14

produselor cu densitate mare se face cu ajutorul mediului conservant IC65 i dup centrifugare 30 de minute la 5000 turaii/minut, se va reine supernatantul. Izolarea virusului se face pentru identificarea virusului i stabilirea etiologiei virale a infeciei. a) izolarea virusului pe culturi celulare: culturile celulare reprezint suspensii din eucariote cultivate in vitro n condiii adecvate de nutriie, temperatur, pH. Mediile conin: ioni minerali, vitamine, aminoacizi, indicator de pH iar pentru stimularea creterii se adaug ser de viel. Culturile celulare se clasific n: -culturi primare din esuturi adulte normale(cultura primar de rinichi de maimu sau rinichi de iepure) -linii celulare continue sau tumorale-linia Hella -tulpinile diploide-sursa un esut embrionar. Efecte virus specifice n cultura celular: efect citopatic (ECP) se manifest prin modificrile n urma multiplicrii unor virusuri citopatogenice. ECP se observ cu microscopul dup culorare cu Giemsa sau cu hematoxilin. Enterovirusurile determin ECP distructiv:celule globuloase, refringente, alte virusuri determin formarea de celule gigante Incluzii virale intracelulare Efectul hemaglutinant: este produs de virusurile gripale, paragripale n prezena hematiilor de coco sau om grup 0 Efectul hemoabsorbant(HAD)const n ataarea hematiilor de la diverse specii animale la suprafaa celulelor virus infectate Efectul de interferen - se utilizeaz pe virusuri ce nu determin efect citopatic b)izolarea virusului pe oul embrionat (embrioni de 7-11 zile)constituie gazda pentru mixovirusuri, herpes virusuri. Inocularea se face intraamniotic, intraalantoidian, pe membrana corio-alantoidian, intravitelin sau direct n embrion. Se inoculeaz 0,2 ml din produs prelucrat i se incubeaz la 35o C timp de 2-5 zile. Prezena virusului se recunoate prin reducerea micrilor pn la imobilizarea embrionului, la membre-hemoragii, ngroarea i opacifierea lor, lichidele embrionare capt activiti proprii virusului(hemaglutinare). c)izolarea pe animale de laborators :sunt folosii oarecii aduli, oareci nou-nscui, dihori. Ci de inoculare subcutanat, intracerebral, intranazal, intraperitoneal. Efectele sunt specificeincluzii virale, paralizii, inducerea de tumori la animale imunosupresate. Titrarea virusului izolat are ca scop evaluarea cantitativ a concentraiei particulelor virale infectate capabile s produc virus specific la gazda sensibil. Se realizeaz diluii binare sau logaritmice din virusul izolat. Exprimarea titrului se face n: -doze citopatogene -uniti hemaglutinante -doze letale Identificarea virusului izolat Identificare orientativ i serologic prin reacii imune antigen-anticorp, ce utilizeaz seruri standard specifice livrate de Institutul Cantacuzino. a) Reacia de imunofluorescen - pentru identificarea serologic a unor virusuri din genul Herpes simplex, virusul rabic, virusuri gripale, paragripale. Principiu: Cultura celular se trateaz cu ser imun standard specific virusului marcat cu o substan fluorescent(metoda directa)sau cu ser imun standard i ulterior cu ser antigamaglobulina speciei pe care s-a obinut serul de referin fluorocromat(metoda indirect). La reacia pozitiv se produce fixarea anticorpilor specifici pe cultura celular virus infectat,observndu-se o fluorescen intens a celulelor n lumina ultraviolet. b) Reacia de neutralizare Principiu: 15

Punerea n contact a virusului izolat cu un ser imun standard i inocularea amestecului la gazde sensibile are ca rezultat, n cazul reaciei pozitive absena efectului virus specific. Se folosete la identificarea serologic a enterovirusurilor, arbovirusurilor, virusurilor din grupul Herpes. c) Reacia de inhibare a neutralizrii Principiu: n prezena serului imun specific, efectul hemaglutinant nu se mai produce. d) Reacia de inhibare a hemadsorbiei Principiu: n urma unirii dintre virusurile hemadsorbante i serul imun standard virusurile nu-i mai pot exercita efectul hemadsorbant al eritrocitelor la suprafaa celulelor virus infectate. e) Reacia de fixare a complementului Principiu: n prezena virusului necunoscut(antigen) i a anticorpilor specifici, se realizeaz complexul antigen-anticorp pe care se fixeaz complementul(alexina), iar sistemul hemolitic indicator rmne integru(absena hemolizei). f) Reacia de dubl imunodifuzie n gel Principiu: n urma migrrii n gel a celor doi reactani imuni(antigenul viral de identificat i serul imun standard specific) se formeaz complexul antigen-anticorp, care se vizualizeaz prin apariia n gel a unei linii de precipitare. g) ELISA Se bazeaz pe reacia imun antigen-anticorp n care elementul cunoscut(anticorpii specifici fa de antigenul necunoscut din proba de analizat) este fixat pe suport denumit imunosorbent, iar un element al reaciei, conjugatul este cuplat cu o enzim. n cazul reaciei pozitive se formeaz complexe imune antigen-anticorp pe care se vor fixa anticorpii specifici din conjugat. Enzima va deveni activ i se va modifica culoarea. h)RIA Principiu: RIA este o metod simpl, precis, specific i sensibil care permite evidenierea tipurilor de antigene i evaluarea cantitativ a acestora. Antigenul de testat i antigenul standard marcat radioactiv intr n concurena fa de cellalt. Concentraia antigenului de testat prezent n eantionul biologic studiat se determin prin msurarea radioactivitii. Nivelul radioactivitii este invers proporional cu cantitatea de antigen nemarcat introdus n reacie. Diagnosticul imunobiologic n viroze Presupune testarea radioactiviii imune att pe linie umoral ct i celular a individului infectat viral. a) Diagnosticul serologic(testarea reactivitii imune umorale) n cursul infeciilor virale, n sngele bolnavilor apar anticorpi specifici fa de diferitele structuri antigenice ale virusului gazd, detectarea i identificarea acestora constituie diagnosticul serologic. Reaciile serologice pentru decelerarea anticorpilor antivirali sunt antigen-anticorp, n care elementul cunoscut este titrul seric n anticorpi, iar elementul cunoscut e reprezentat de tulpinile standard de virusuri. Reaciile folosite sunt: Reacia de seroneutralizare Amestecurile ntre diluii binare din serul de testat i antigenul viral standard se incubeaz o perioad de timp dup care se inoculeaz la gazda sensibil. Reacia pozitiv const n absena efectului virus specific asupra gazdei. Titrul seroneutralizant al serului este dat de diluia cea mai mare de ser de bolnav care, n amestec cu virusul standard, mpiedic apariia efectului virus specific.

16

Reacia de inhibare a neutralizrii Diluii binare din serul de cercetat se pun n contact cu o concentraie bine stabilit de antigen viral standard i dup o perioad de incubare se adaug o suspensie eritrocitar proaspt. Interpretarea reaciei se bazeaz pe aflarea diluiei maxime de ser capabil s mpiedice hemaglutinarea viral.

Reacia de fixare a complementului Are 2 etape: n I etapa se formeaz complexul antigen-anticorp cu fixarea la complement. n a II-a etap se poate observa fenomenul cu ajutorul hematiilor sensibilizate cu anticorpi corespunztori=sistem hemolitic. Dac s-a format complexul antigen-anticorp nu sunt afectate hematiile; dac lipsesc anticorpii specifici antigenului n serul de testat, complementul se va fixa pe hematiile sensibilizate, declannd liza acestora. RFC poate fi - calitativ - BORDET-WASSERMAN - cantitativ - IDA-BENGSTON Titrul alexinei (1 unitate de alexin) se stabilete printr-o reacie de titrare n prezena sistemului hemolitic. n diagnosticul serologic al virozelor se folosesc 3 uniti de alexin. Reacia de hemaglutinare pasiv (HAP) n prezena anticorpilor specifici i a antigenului viral standard (adsorbit anterior pe eritrocite penetrate cu tanin) se produce aglutinarea eritrocitelor (reacie pozitiv). Titrul serului este reprezentat de diluia cea mai nalt la care se produce hemaglutinarea complet. Reacia de imunofluorescent n diagnosticul serologic se folosete metoda indirect. Are 2 timpi: -n primul rnd preparatul care conine antigenul standard viral se trateaz cu ser de cercetat n care se caut anticorpii specifici. n cazul reaciei pozitive se formeaz complexul antigenanticorp nefluorescent. -n timpul al doilea, preparatul se trateaz cu ser antiglobulinic fluorescent care n cazul reaciei pozitive apare la lumina ultraviolet. ELISA Reacie antigen-anticorp care folosete antigene sau anticorpi marcai cu o enzim care acioneaz pe substrat i va da o reacie de culoare ce se va citi la spekol. Reacia e de dou tipuri: -direct -competitiv b) Testarea reactivitii imune celulare Intradermoreacia de tip tuberculinic Se utilizeaz pentru depistarea unor stri de hipersensibilitate de tip ntrziat induse de anumite virusuri Limfocitele T, sensibilizate de anumii antigeni virali, reacioneaz la al doilea contact cu acelai antigen viral prin eliberarea unor mediatori imuni celulari(limfokine). Dup administrarea intradermic a antigenului viral de testat, la un anumit interval de timp, n cazul reaciei pozitive se produc modificri la locul de inoculare. Testul de transformare blastic limfocitar Limfocitele sensibilizate puse n contact cu antigenul viral sensibilizat prolifereaz i se transform n celule cu aspect limfoblastic. 17

Testul de citometrie imun Testul pune n eviden eliberarea unei limfokine de ctre celulele T efectorii, n contact cu celula int ca antigen. Celulele marcate cu Crom-51 sunt puse n contact cu limfocitele T de testat. Nivelul izotopului crete progresiv n cazul reaciei pozitive. Testul de inhibiie a migrrii macrofagelor Factorul inhibitor al migrrii macrofagelor face parte dintre mediatorii eliberai de ctre limfocitele imune in vivo i in vitro n prezena antigenului sensibilizat viral, n cursul imunitii celulare mediate celular. Acest test apreciaz eliberarea de limfokine. Suspensia de celule obinut din snge este introdus n tuburi capilare de sticl care dup centrifugare unde se obin fragmente de celule cu sticl se introduc n camere cu medii de cretere suplimentat cu ser fetal de viel. Se incubeaz. La martori se va constata o coroan de macrofage la captul tubului. Dac testul e pozitiv coroana e mic sau lipsete. Testul de rozetare Permit stabilirea procentual a populaiilor limfocitare n funcie de diferii determinani antigenici. Metoda uzual const n centrifugarea sngelui n gradient cu Ficoll-Odiston. Determinarea populaiei de limfocite T totale periferice se face prin testul de rozetare E de mic afinitate. Testul de rozetare E de mare afinitate stabilete proporia de limfocite Thelper. Metoda citometriei de flux Anticorpii monoclonari obinui in vitro cuplai cu o substan fluorescena se unesc cu antigenele de membrana specific cunoscute sub denumirea de CD. 3. Izolarea virusurilor pe gazde sensibile Izolarea virusului se face pentru identificarea i stabilirea etiologiei virale a infeciei. a) izolarea virusului pe culturi celulare:culturile celulare reprezint suspensii din eucariote cultivate in vitro n condiii adecvate de nutriie, temperatur, pH. Mediile conin: ioni minerali, vitamine, aminoacizi, indicator de pH iar pentru stimularea creterii se adaug ser de viel Culturile celulare se clasific n: -culturi primare din esuturi adulte normale (cultura primar de rinichi de maimu sau rinichi de iepure) -linii celulare coninue sau tumorale - linia Hella -tulpinile diploide - sursa un esut embrionar. b) izolarea virusului pe oul embrionat (embrioni de 7-11 zile) constituie gazda pentru myxovirusuri, herpes virusuri. Inocularea se face intraamniotic, intraalantoidian, pe membrana corio-alantoidian, intravitelin sau direct n embrion. Se inoculeaz 0,2 ml din produs prelucrat i se incubeaz la 35 o C timp de 2-5 zile. Prezena virusului se recunoate prin reducerea micrilor pn la imobilizarea embrionului, la membre-hemoragii, ngroarea i opacifierea lor, lichidele embrionare capt activiti proprii virusului(hemaglutinare). c) izolarea pe animale de laborator Sunt folosii oareci aduli, soareci nou-nscui, dihori. Ci de inoculare subcutanat, intracerebral, intranazal, intraperitoneal. Efectele sunt specifice-incluzii virale, paralizii, inducerea de tumori la animale imunosupresate. 4. Efecte virus specifice pe culturile de celule-exemple Efecte virus specifice n cultura celular: Efect citopatic (ECP) poate fi: 18

-ECP distructiv-apariia celulelor rotunjite, globuloase care se desprind de filmul celular i plutesc n mediul de cultivare. ex: virusurile poliomielitice, virusurile ECHO -ECP sincitial-determinat de unele mixovirusuri (paragripale,virusul respirator sincitial) apar sinciii celulare multinucleare -ECP n focar-celulele infectate viral se aaz n grupuri asemntoare cu un ciorchine de strugure(unele poxvirusuri) Incluzii virale intracelulare-poxvirusuri Efectul hemaglutinant:este produs de virusurile gripale, paragripale n prezena hematiilor de coco sau om grup 0 Efectul hemoabsorbant(HAD) const n ataarea hematiilor de la diverse specii animale la suprafaa celulelor virus infectate(virusul rujeolic, paragripal) Efectul de interferena-se utilizeaz pe virusuri ce nu determin efect citopatic Efectul de interferen-virus citopatogen-ECHO 5. Etapele relaiei virus-celula gazd de tip litic-exemple Etapele ciclului replicativ viral dureaz ntre 6-36 ore: a)faza de eclips-dureaz 10-20 minute imediat dup infecie b)faza de cretere linear care debuteaz iniial intracelular c)faza de platou Faza de eclips cuprinde: Ataarea virusului de suprafaa celulei susceptibile la nivelul unor receptori specifici. Penetrarea reprezint trecerea virusului din exteriorul celulei n interiorul acesteia. Decapsidarea const n separarea fizic a acidului viral de inveliurile proteice cu ajutorul enzimelor virus induse i a enzimelor lizozomale celulare. Creterea lineara cuprinde: -sinteza proteinelor timpurii nestructurale i a proteinelor tardive structurale -faza de platou cuprinde eliberarea virionilor progeni extracelular, reprezint faza final -fenomenul se nsotete de liza celulei gazd Exemple: bacteriofag-bacterie de tip litic 6. Etapele relaiei virus-celula gazd de tip simbiotic-exemple Ataarea virusului de suprafaa celulei susceptibile la nivelul unor receptori specifici. Penetrarea reprezint trecerea virusului din exteriorul celulei n interiorul acesteia. Decapsidarea const n separarea fizic a acidului viral de nveliurile proteice cu ajutorul enzimelor virus induse i a enzimelor lizozomale celulare. Modalitatea de programare a sintezelor virale este diferit ntre virusurile cu genom ADN i ARN: Virusurile ADN -ADN-ul viral se integreaz n ADN-ul celular ce va sintetiza un ARN mesager complementar mixt, ce ajunge la ribozomi, dup citire se vor sintetiza proteine cu secvene de aminoacizi codificai de ADN-ul celular ct i de cel viral -dac ADN-ul viral nu se integreaz n ADN-ul celular, se produce sinteza de ARN-polimeraz care induce formarea de ARN mesager pe matricea de ADN viral Virusurile ARN folosesc modelul de replicare denumit revers-transcripie. Exemple:bacteriofag-bacterie de tip simbiotic 7. Variaii antigenice virale-importana medical Mutaii virale-greeli n replicarea intracelular a genomului viral. Structural: 19

-mutaii punctiforme-apar prin schimbarea unei baze din codon -prin deletie-omiterea unui segment din matri Mutaiile virale pot fi: -spontane -induse Funcional: -mutante conditionat letal -mutante atenuate -mutante rezistente la anumite medicamente antivirale -mutante legate de citopatogenitate -mutante legate de citopatogenitate Recombinarea viral-cuplarea a 2 sau mai multe genomuri virale, avnd ca rezultat apariia unui nou tip de virus numit hibrid viral sau recombinat. Recombinarile pot fi: -spontane(naturale) -dirijate-induse experimental: virusurile gripale pot suferi mutaii virale minore sau majore la nivelul genelor Reasortarea viral-includerea n aceeai nucleocapsid a unor segmente de ARN din genomuri virale parentale diferite care infecteaz simultan aceeai celul, cu condiia respectrii numrului final de segmente nglobate. Reactivarea ncruciat-infecia mixt a celulei gazd cu virus activ i un virus parial inactivat cu ultraviolete. Pleitropism i covariaie Pleitropism-mutantele virale selectate se manifest fenotipic i prin alte caractere asociate Covariaia-aspectul practic al fenomenului de pleitropism Interaciuni genetice ntre virusuri-se produc ca urmare a infeciei concomitente a unei celule gazd cu 2 sau mai multe virusuri diferite. Importana medical a fenomenelor genetice virale a)modificri de patogenitate n lumea virusurilor b)variaia antigenic i pcatul antigenic originar la virusurile gripale c)obinerea de vaccinuri virale atenuate d)obinerea de vaccinuri virale recombinate 8. Cile de ptrundere ale virusurilor n organism-exemple -calea tegumentelor i mucoaselor-virusul rabic, virusurile hepatice B,C,D,HIV, virusul herpes simplex -calea respiratorie-orthomixo i paramixovirusuri, adenovirusuri, picorna i coronavirusuri, virusul gripal. -calea digestiv-picornavirusurile 9. Stadiile infeciilor virale acute 1. perioada de incubaie-intervalul de timp de la ptrundere pn la apriia primelor semne de boal -incubaie scurt 1-7 zile -incubaie medie 14 zile -incubaie lung 21 zile 2. perioada de invazie-intervalul de timp de la apariia primelor semne de boal i instalarea tabloului clinic caracteristic bolii: -perioada preeruptiv -perioada preicteric -perioada preparalitic 3.perioada de stare-virusul se multiplic 20

4. perioada de declin-sfritul bolii datorit aprrii organismului 5.perioada de convalescen-vindecarea leziunilor 6.vindecarea-ncetarea multiplicrii agentului patogen i a diseminarii lui 10. Vaccinuri virale : clasificare,exemple Vaccinurile virale pot fi alctuite din: corpusculi virali infectai vii atenuai virusuri slbatice inactivate A. Vaccinuri virale vii -vaccinuri virale vii cu virusuri nepatogene:virusul vaccinia pentru vaccinarea antivariolic -vaccinuri virale vii atenuate:-vaccinul antipolio -vaccinul antirabic B. Vaccinuri virale inactivate -antirabic, antigripal, antipolio, antihepatitic A i B C. Alte tipuri de vaccinuri virale -proteine virale recombinate -peptide sintetice -construirea de tulpini atenuate -hibrizi virali -anticorpi virali -vaccinurile ADN 11. Tipuri de anticorpi sistemici i locali n viroze-exemple Anticorpi imunoglobulinici din clasele IgA , IgG , IgM , IgD , IgE Imunoglobulinele pot fi sistemice (circulante) i locale(IgA secretorii)la nivelul pielii i mucoaselor.

21

Virusologia special 1. Morfologia virusului gripal Dimensiunea variaz ntre 80-120 nm Forma sferoidal, ovoidal, filamentoas Sunt virusuri ARN, cu simetrie helicoidal. Genomul format din ARN monocatenar situat central, care mpreun cu capsida formeaz nucleocapsida. Capsida este alctuit din capsomere dispuse n mod metameric sub form de elice. nveliul extern (peplos, anvelop)-complex glucido-lipido-proteic, alctuit din elemente mprumutate de la celula parazitat de virus, dar i din material codificat de genomul viral. n nveli sunt ancorate nite proiecii specifice (spikes) ale unor proteine structurale virus-specifice, cu rol foarte important n variaia antigenic i n stimularea rspunsului imun, denumite hemaglutinina(HA) i neuramidaza(NA) care reprezint determinani majori implicai n edificarea rspunsului imun. 2. Aspecte chimice n infecia gripal Gripa debuteaz cu febr, frisoane, mialgii, cefalee, catar respirator i conjunctival, tuse seac, astenie i stare general alterat. La copii poate debuta cu manifestri digestive, vrsturi, diaree. Evoluia dureaz 3-7 zile. Pot aprea complicaii infecioase, bacteriene, virale, parazitare mai ales la copii i btrni. Tablou virusologic specific al infeciei cu virusul gripal tip B denumit Sindromul Reye -semne necaracteristice - febr - tuse - mialgii -vrsturi i lipotimie n perioada de stare - semne de afectare hepatic i a SNC. Paraclinic se constat hipoglicemie, creterea bilirubinei serice i a transaminazelor. Mortalitatea e n procent de 90 %. 3. Schema diagnosticului de laborator n grip I Recoltare : secreie nazal, exudat faringian, secreie traheal, snge i n caz de deces triturat de plmn II Prelucrarea virusului III Izolarea virusului pe gazde sensibile reprezentate de: - ou embrionate de gin - culturi celulare IV Titrarea virusului gripal izolat prin reacia de hemaglutinare Se efectueaz diluii binare din lichidul cu particule virale prezente care se pun n contact cu suspensie de eritrocite de coco, sau de om grup 0 n concentraie de 0,5 %. Dup o uoar agitaie i incubare la 4 oC , aproximativ 1 or, se citete titrul hemaglutinant (1 unitate hemaglutinant) la diluia cea mai mare de virus unde s-a produs hemaglutinarea complet. V Identificarea virusului izolat a) orientare dup efecte: - hemaglutinant i hemadsorbant b) serologic: - reacia de inhibare a hemaglutinrii - reacia de dubl imunodifuzie n gel c) imunologic: - HAI - RFC Teste de imunitate celular : - transformare blastic limfocitar 22

- testul de inhibiie a migrrii macrofagelor - citometria de flux

4. Epidemiologia i profilaxia gripei. Sursa de virus este bolnavul, se transmite pe cale respiratorie. Gripa este o afeciune frecvent n sezonul rece. Boala apare n epidemii sau pandemii. Periodicitatea epidemiilor cu virus de tip A este de 2-4 ani, 4-6 ani pentru virusul de tip B. Tulpinile pandemice sunt complet diferite fa de cele anterioare datorit reasortrii genetice. Variabilitatea antigenic inepuizabil a tulpinilor de gripa A este rspndirea lor la numeroase specii de psri i mamifere. Exist o profilaxie nespecific i specific. Profilaxia nespecific - prin aplicarea msurilor de izolare a bolnavilor, limitarea vizitelor la spitale, investigaii serologice pentru testarea anticorpilor serici la populaia uman fa de antigenele gripale standard corespunztoare subtipurilor circulante. Profilaxia specific se bazeaz pe vaccinarea antigripal. Vaccinuri inactivate se prepar prin izolarea recent a tulpinilor circulante n oul embrionat i apoi se inactiveaz cu formol sau raze UV. Se administreaz subcutanat, intranazal sau pe cale oral. Avantajele vaccinurilor inactivate: -facilitate la administrare -eliminarea riscului contaminrii cu virusuri hepatice -reduce infecia cu alte virusuri cu tropism respirator Vaccinuri vii atenuate - administrate pe cale nazal. Variaia antigenic a tulpinilor de virusuri gripale, instabilitatea genetic ridic probleme n producia de vaccin viu. Obiectivele programelor de supraveghere i prevenie a gripei sunt: -depistarea precoce a puseelor epidemice -definirea agentului etiologic implicat -estimarea impactului gripei asupra populaiei privind morbiditatea i mortalitatea -definirea grupelor de populaie expus i cu risc crescut de apariie a complicaiilor 5. Morfologia virusurilor poliomielitice Virusurile polio au form poliedric i dimensiuni reduse (22-23 nm). Posed ARN monocatenar simplu, infecios, nesegmentat, nconjurat de o capsid format din 60 de capsomere n simetrie icosaedric. Particula viral este lipsit de nveli, ARN-ul codific sinteza urmtoarelor proteine: -proteina VPg legat de replicarea ARN-ului viral -polipeptidele majore - VP1 VP2,VP3VP4 -oligopeptide minore - precursori ai polipeptidelor majore 6. Epidemiologia i profilaxia infeciilor cu virusuri poliomielitice Poliomielita este o boal ereditar. Probleme importante: -infeciile inaparente surse de rspndire a virusului -prin trecerea interuman din tulpini fr potenial neuropatogen sau cu neuropatogenitate slab Profilaxia nespecific const n aplicarea msurilor de igien, ameliorarea condiiilor socio-econimice, ridicarea nivelului de trai . Profilaxia specific const n vaccin -viu atenuat de tip SABIN polivalent cu administraie oral -urmrirea excreiei de tulpuni de ctre populaia vaccinat -creterea titrului de anticorpi specifici sistemici Avantaje oferite de vaccin : -uurina aplicrii 23

-inducerea rezistenei specifice generale Dezavantaje : -n cazul tipului 3 care e mai labil genetic pot aprea mutante neurovirulente prin selecie -vaccin inactivat 7. Morfologia virusului rujeolos Aspect de sfer cu diametrul de 100-250 nm. Virusul e alctuit din ARN monocatenar, capsida cu capsomerele dispuse dup simetrie helicoidal i nveli lipoproteic cu 2 tipuri de proiecii: -hemaglutinina (H) -factorul de fuziune (F) care sunt glicoproteine Virusul e alctuit din 6 proteine structurale. Posed 3 categorii de antigene: -hemaglutinant -hemadsorbant -fixator de complement 8. Morfologia virusului herpes simplex Morfologia viral se studiaz prin tehnici de nalt specialitate reprezentat de : difracie cu raze X i microscopie electronic. Diametrul variaz ntre 150-200 nm. Alctuire morfologic: -genom - situat central, format din ADN bicatenar liniar, dar se circularizeaz spontan dup decapsidare, conine un lan lung L i unul scurt S unite prin legturi covalente -capsida - 162 capsomere dispuse n simetrie icosaedric, mpreun cu nucleul alctuiete nucleocapsida -tegumentul - structur amorf, proteic, situat ntre capsid i anvelop -anvelopa - este nveliul exterior, deriv din membrana nuclear a celulei gazd infectat 9. Aspecte clinice n infecia cu virus herpes simplex. a)Herpesul primar -leziuni cutanate urmate de prurit i senzaie de arsur sau durere local persistent -leziunile mucoaselor - veziculele se rup la scurt timp de la apariie datorit umiditii i sunt nlocuite de mici zone erozive. b)Herpesul recidivant -apare la circa 120 zile de la herpesul primar -infecia evolueaz benign, se vindec n 10 zile -localizrile sunt variabile - herpes cutanat(labial,facial), ocular, genital pe gland sau n anul prepuial la brbat, la nivelul nevraxului. c)Herpesul neonatal -copii nscui din mame cu herpes genital pot prezenta infecie herpetic -copii care supravieuiesc au sechele la SNC d)Relaia herpes genital-cancer -rolul oncogen a fost dovedit clinic i experimental. 10. Virusul hepatic B - morfologie VHB e format din 2 tipuri de particule: -DANE, cu diametrul de 42 nm, reprezint virionul intact, complet infecios alctuit din miez central i nveli periferic -particule neomogene, sferice cu diametrul de 22 nm sau filamentoase lipsite de acid nucleic Virionul VHB e format din : Nucleocapsid, cu diametrul de 21-22 nm, format din genom viral, enzime, capsid. 1) Genom viral - ADN bicatenar, parial monocatenar; n VHB se gsete extracromozomial dar i integrat n cromozom. ADN are 2 spire L(lung) i S(scurt). Lanul L are 4 gene care conin 24

informaia genetic pentru sinteza proteinelor virale structurale(AgHBs,AgHBc). Aceste gene se numesc ferestre de citire informaional sau ORF. Gena S ORF1 format din regiuni:-S1preS1, preS1 i preS2 Gena P-ORF4 -codific ADN polimeraza viral capabil s copieze ARN n ADN i ADN n ARN Gena C-ORF2 -codific proteinele nucleocapsidare(core) -are 2 codoni start; o regiune pre-core i o regiune core Gena X-ORF3 -codific sinteza proteinelor activatoare a transcrierii genomului viral HBX 2) Capsida - 180 capsomere aezate n simetrie icosaedric; conine ADN polimeraz viral care funcioneaz ca revers transcriptaz. -anvelopa - nveli extern al VHB; de natur glicoproteic, alctuit din dublu strat lipidic i proteine de suprafa. 11. Virusul hepatic C - morfologie Form sferic, diametru de 55-65 nm. Alctuit din nucleocapsid cu diametru de 30-35 nm i nveli extern cu proiecii fine de 6 nm lungime. Genomul VHC are un lan de ARN monocatenar, posed o singur gen codant. 12. Imunomarkeri n infeciile cu virusuri hepatice 1) antigenul de suprafa al VHB(AgHBs) 2) anticorpii fa de AgHBs (anti-HBs) 3) antigenul e al VHB (AgHBe) 4) anticorpii anti AgHBe(anti HBe) 5) anticorpii IgM fa de miezul corpusculului viral(IgM-anti-HBc) 6) anticorpii totali fa de miezul corpusculului viral (antiHBc) 13. HIV - morfologie Form sferic cu diametrul de 90-120 nm cu 72 de proiecii exterioare Componente: a)nveliul extern - format din dublu strat lipidic derivat din celula gazd de care sunt ataate glicoproteinele codificate de gena ENV: - proteina extern - proteina transmembranar b)Matricea - tapeteaz virionul i conine: - proteina MA - proteina virala PROT c)Nucleocapsida-cu simetrie icosaedric - proteina capsidal (core)-marker al replicrii virale - proteina nucleocapsidal - echipamentul enzimatic propriu - genomul viral format din 2 molecule de ARN monocatenar, la margini regiuni lungi repetitive cu rol de integrare n genomul celulei gazd. Conine gene majore i gene funcionale. Regiuni ce codific proteine structurale i enzime virale: - GAG - POL - ENV Regiuni ce codific proteine reglatoare-funcionale: - TAT,REV,NEF - VIF - ART/TRS 25

Regiuni ce codific proteine accesorii: - gena VPR - gena VPX (numai la HIV II) 14. Triada imunologic n infecia cu HIV 1) scderea raportului CD4+/CD8+ prin diminuarea numrului de CD4+ Th1 2) hipo sau anergia tuberculinic 3) hipergamaglobulinemia 15. Epidemiologia i profilaxia infeciei cu HIV Transmiterea se face pe ci multiple: -pe cale sexual -pe cale parenteral (transfuzii cu snge contaminat, seringi) -vertical (transplacentar n uter, n cursul naterii prin contactul cu fluidele tractului genital matern) -prin transplant de organe sau prin sperm -accidental,profesional Sursa de infecie este omul cu HIV aparent sau inaparent Grupele de risc sunt: -homosexualii -hemofilicii, toxicomanii -copii nscui din mame cu SIDA Profilaxia nespecific se bazeaz pe educaia sexual, sterilizarea corect a instrumentarului chirurgical, perfecionarea mijloacelor de diagnostic de laborator. Profilaxia specific activ: -vaccinuri coninnd virus ntreg : inactivat, viu atenuat -vaccinuri obinute prin inginerie genetic (vaccinuri recombinate, peptide sintetice ,vaccinuri recombinate cu vectori vii)

26