Prctica Extraccin de ADN de chcharos

Introduccin:
En las clulas eucariotas, el ADN se encuentra asociado con protenas formando estructuras compactas denominadas cromosomas, cada cromosoma consta de una sola molcula de ADN. En el caso de los chcharos, Pisum sativum, sta molcula esta formada por 122 mil pares de bases (como comparacin el genoma del hombre tiene mas de 3,000 millones de pares de bases), lo que nos da por resultado una molcula de varios centmetros si fuera completamente desenredada. La separacin de ADN requiere de la disociacin de esta molcula y las protenas, para lo cual se utilizan enzimas, detergente y alcohol, y por supuesto, una muestra biolgica que lo contenga. El aislamiento de ADN es una de las etapas en la investigacin en biologa molecular para el estudio de uno o ms genes. El ADN celular total es usado como patrn para hacer copias (llamados clones) de un gen particular. Esas copias pueden ser luego separadas y usadas para estudiar la funcin de ese gen particular. En un laboratorio se utilizan mecanismos fsico-qumicos con diversos reactivos y herramientas que incluyen el uso de jabones especializados, enzimas, centrfugas e isopropanol a -20C, o el uso de paquetes (kits) especficos para la extraccin de ADN con una pureza que nos permita trabajar con l, pero en este caso utilizaremos simples herramientas y reactivos que podemos encontrar en cualquier cocina para obtener una buena cantidad de ADN. Objetivos Identificar la presencia de ADN en las semillas de chcharos Demostrar la naturaleza qumica del ADN Utilizar una tcnica de separacin del ADN que permita disociarlo de las protenas con las que se encuentra asociado en los cromosomas de las clulas. Identificar las fibras del ADN extrado utilizando una tincin especfica

Material licuadora 1 vaso de precipitado de 250 ml 2 probetas de 100 ml 2 tubos de ensayo grandes 100 ml de chcharos (Pisum sativum) 200 ml de agua fra

Alcohol etlico fro Detergente lquido para platos

Cloruro de sodio Ablandador de carne Naranja de Acridina

Procedimiento 1. Licua los chcharos secos, con aproximadamente 1 ml de cloruro de sodio y el agua fra durante varios segundos hasta que los chcharos estn molidos. La sal ayuda a que el ADN precipite cuando se agregue el alcohol. 2. Filtra la pasta obtenida con un colador de plstico en un vaso de precipitado de 250 ml. 3. Agrega alrededor de la sexta parte de esa cantidad (aproximadamente 30 ml) de detergente lquido y mzclalo. Deja reposar la mezcla durante 10 minutos. La licuadora separa las clulas, mientras que el detergente rompe las membranas celulares y nucleares que contienen al ADN (figura 1). 4. Vierte una parte de la mezcla en un tubo de ensayo, (mide la cantidad aproximada). 5. Aade una pizca de ablandador de carnes y agita la mezcla suavemente con una varilla de vidrio. El ablandador de carnes contiene enzimas denominadas proteasas que separan a las protenas asociadas al ADN. 6. Ladea el tubo de ensayo y vierte lentamente por las paredes alcohol etlico al 95 % en una cantidad equivalente a la mezcla depositada en el tubo de ensayo. El ADN precipita en la presencia de alcohol, debido a que no se disuelve en l. Esto causa que el ADN se agregue en forma de fibras visibles a simple vista (figura 2). 7. Con una aguja de diseccin toma una pequea muestra de las fibras blancas, disgrgalas sobre un portaobjetos y agrega una gota de naranja de acridina para observar en el microscopio ptico en los objetivos 10X y 40X.

Figura 1. Diagrama de las reacciones para la exraccin de ADN

Resultados y anlisis de resultados 1. Elabora esquemas o incluye fotografas donde se ilustre la presencia de las fibras de ADN en las muestras observadas en el microscopio. 2. De qu manera est organizado el ADN en los cromosomas de los eucariotas? 3. Qu papel tienen las protenas que se asocian al ADN en los cromosomas eucariotas? 4. Investiga que es la naranja de acridina y por qu se utiliza para identificar ADN 5. Por qu es posible observar los agregados de las fibras de ADN a simple vista? 6. Compara esta tcnica con el protocolo original de extraccin de ADN fenol-cloroformo-alcohol isoamlico (Cuadro 1). Qu paso de nuestro protocolo representa cada uno de los pasos del protocolo original? Por qu usamos un protocolo tan complicado en un laboratorio?
Protocolo de Extraccin de ADN
TE SDS 10% Proteinasa K 20 mg/mL NaCl 5M CTAB/NaCl al 10% en NaCl 5M Cloroformo:Alcohol isoamlico 24:1 Fenol:cloroformo:alcohol isoamlico 25:24:1 Isopropanol Etanol 70%

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2. 3.

Centrifugar 1.5 mL del cultivo de E. coli x 2 a 14,000 rpm x 5 y descartar el sobrenadante. Resuspender la pastilla en 575 L de TE. Adicionar 30 L de SDS al 10% y 3 L de proteinasa K (20 mg/mL) para dar una concentracin final de 100 g/mL. Mezclar e incubar 1h a 37 C. Agregar 100 L de NaCl 5M y mezclar. Agregar 80 L de CTAB y mezclar. Incubar 10 a 65 C Agregar de 0.7 a 0.8 mL de fenol:CHCl3:IsoOH mezclar y centrifugar a 14,000 rpm x 10. Remover la interfase y pasarla a un tubo nuevo. Agregar un volumen de CHCl3:IsoOH y mezclar. Centrifugar 5y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. Agregar 2 volmen (o 500 L) de isopropanol y mezclar cuidadosamente hasta pp el ADN. Dejar a -20 C toda la noche. Centrifugar a 14,000 rpm a 4 C x 20. Decantar y agregar 500 L de etanol fro al 70%. Centrifugar a 14,000 rpm a 4 C x 10 y decantar el sobrenadante. Repetir. Dejar secar el botn de ADN y resuspender en 100 L de TE. Agregar 1 L de RNAasa (10 mg/mL) Incubar a 37 C x 60 min Agregar 200 L de cloroformo:alcohol iso, mezclar y centrifugar a 14,000 rpm x 10. Remover la interfase y pasarla a un tubo nuevo.

4. 5.
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Cuadro 1. Protocolo para extraccin de ADN con fenol-cloroformo-alcohol isoamlico