5.

Tehnici de bandare a cromozomilor

Bandarea cromozomilor reprezint o tehnic citogenetic de identificare precis a fiecrui cromozom i de depistare a eventualelor mutaii. Banda este definit ca o parte a unui cromozom care se deosebte de segmentele adiacente printr-o coloraie mai intens sau mai slab; cromozomii apar alctuii dintr-o succesiune de zone intens colorate (benzi) i mai puin colorate (interbenzi), dispuse transversal pe braele cromozomilor. Regiunea reprezint aria cromozomial dispus ntre dou repere adiacente. Reperul este o trstur morfologic constant i distinct: telomer, centromer sau anumite benzi. Att regiunile ct i benzile sunt numerotate dinspre centromer spre extremitile braelor. Pentru a desemna o anumit band, se menioneaz n ordine numrul cromozomului, simbolul braului, numrul regiunii i numrul benzii din regiune. De exemplu, lq25 indic cromozomul 1, regiunea 2, banda 5. Benzile sunt submprite n subbenzi. Benzile sunt aceleai la cromozomii omologi; sunt particulare ca numr, poziie, succesiune, dimensiune i intensitate a coloraiei pentru cele 23 de perechi; sunt identice n toate celulele organismului i la toi indivizii unei specii. Benzile se datoreaz organizrii biochimice diferite a cromozomilor (AT/GC) i condensrii diferite a cromatinei (heterocromatin/eucromatin). Mecanismul de formare a benzilor este nc neelucidat. Prin intercalare, unele substane colorante prezint o afinitate mai mare pentru unele regiuni ale ADN-ului. Preparatele cromozomiale sunt tratate specific cu diverse substane care realizeaz digestie enzimatic sau denaturare termic, n vederea obinerii unor benzi cromozomiale permanente ce pot fi examinate i fotografiate la microscopul optic. Benzile sunt denumite dup colorantul folosit sau dup segmentul cromozomial evideniat. A. Benzi utilizate pentru identificarea longitudinal a cromozomilor (1) Benzile Q sunt benzi transversale luminoase (fluorescente) (pozitive), care alterneaz cu interbenzi ntunecate (benzi negative); se obin prin colorare cu quinacrin sau quinacrin mutar i sunt examinate n lumin ultraviolet (microscop cu fluorescent). Benzile Q evideniaz regiunile cromozomiale heterocromatice, bogate n AT i secvene repetitive LINES. Benzile Q prezint un polimorfism accentuat referitor la dimensiunea benzilor i variaiile strlucirii (mai ales braele scurte i sateliii cromozomilor acrocentrici); este caracteristic 7

fluorescenta deosebit de intens a celor 2/3 distale a braul lung (q) al cromozomului Y, fapt ce permite o identificare rapid a acestui cromozom. Tehnica implic ns un echipament costisitor, iar fluorescenta nu este permanent, astfel nct imaginile microscopice trebuie fotografiate imediat; din aceste motive, bandarea Q este nlocuit cu bandarea G (cel puin pentru examinrile de rutin). (2) Benzile G sunt benzi transversale colorate, corespunztoare benzilor fluorescente; se obin prin colorare Giemsa. Ca i benzile Q, corespund zonelor heterocromatice bogate n AT i secvene LINES. [Exist cromozomi marker care conin regiuni ce nu se bandeaz G, ci se coloreaz uniform, denumite regiuni colorate omogen (HSR-homogenously stained regions); mpreun cu cromozomii minusculi (DM-double minutes) acentrici, reprezint o manifestare a amplificrii genice din unele tipuri de cancer]. (3) Benzile R (reverse bands) au dispoziie invers fa de benzile G (benzile R corespund interbenzilor G) i evideniaz regiunile cromozomiale formate din eucromatin, caracterizate prin coninut ridicat n GC i secvene repetitive SINES (benzile R conin majoritatea genelor). Se obin prin denaturare termic moderat i colorare Giemsa (coloraia este palid i necesit examinare n contrast de faz) sau, mai recent, colorare cu acridin-oranj. B. Benzile utilizate pentru evidenierea unor regiuni cromozomiale (1) Benzile T reprezint un subset de benzi R, obinute prin denaturare termic marcat (telomerele sunt rezistente la cldur) i colorare cu acridin-oranj; telomerele emit o fluorescen deosebit de intens (benzi T). (2) Benzile C se obin prin colorare Giemsa i evideniaz heterocromatina constitutiv (ADN satelit), n special de la nivelul centromerelor tuturor cromozomilor (braele rmn necolorate), dar i de la nivelul constriciilor secundare de pe braul lung (q) al cromozomilor 1, 9, 16 i braul lung al cromozomului Y. Dimensiunea benzilor C prezint un polimorfism accentuat (vezi curs Heteromorfismul cromozomilor). (3) Benzile NOR se obin prin colorare cu nitrat de argint; evideniaz regiunile organizatoare nucleolare (NOR - nucleolar organizer regions), localizate pe braele scurte ale cromozomilor acrocentrici (perechile 13-15, 21-22), care conin genele ribozomale ce codific ARNr 28S, 18S i 5,8S.