Preparatele microscopice si coloratiile mai importante Preparat nativ care se mai numeste si preparat proaspat, umed, necolorat, sau

u preparat intre lama si lamela. Se foloseste pentru detectia unor protozoare, si anume chisturile sau trofozoizii acestora, sau si heminti, si anumite oua respectiv larve de helminti, si unori fungi. Daca se foloseste pentru evidentierea bacteriilor, se foloseste pentru bacteriile mobile dintr-un produs patologic lichid sau solid sau dintr-o cultura bacteriana dezvoltata pe un mediu solid sau intr-unul de cultura lichid. Pe o lama curata si degresata sa aplica cu pipeta o picatura din produsul de examinat, fie direct din acesta daca este vorba de un produs lichid, fie dintr-o suspensie a lui in ser fiziologic steril daca este vorba de un produs patologic solid. Apoi se ia o lamele de sticla, mai ingusta decat prima, se aseaza cu o latura pe lama, se inclina la 45 de grade si se lasa sa cada peste picatura de lichid, rezultand in acest fel preparatul intre lama si lamela. Examinarea se face cu obiectivele mici, sau obiectivele uscate, care asigura o marime de 10-20, respectiv de 40x, aceasta este deosebirea intre preparatul nativ sau preparatul colorat care se examineaza cu obiectivul mare, de imersie. Preparatul fixat (frotiu) Se poate efectua un frotiu cel mai frecvent dintr-un produs patologic recoltat de la un bolnav, sau de la animalul de laborator, sau se mai poate efectua dintr-o cultura bacteriana dezvoltata pe un mediu solid sau intr-unul lichid. Etape de realizare 1.etalarea, 2.uscarea, 3.fixarea, 4.colorarea. 1.intinderea produsului patologic pe lama, se face diferit in functie de starea produsului patologic recoltat si anumite: -dintr-un produs lichid sau dintr-o cultura in mediu lichid: pe o lama se pune cu pipeta sau cu axa bucla o picatura din produsul patologic care se va intinde cu axa bucla intr-un strat cat mai subtire, prin miscari circulare; -dintr-un produs patologic solid, sau cultura pe mediu solid: se aplica pe lama o picatura de ser fiziologic, in apropierea careia se va descarca cu ansa bucla, o cantitate mica de produs patologic; cele 2 se vor amesteca circular cu ansa bucla intr-un strat cat mai subtire. -daca produsul patologic recoltat este sangele: pe o lama se pune o picatura de sange care se intinde rapid in strat uniform si cat mai subtire cu o lama de sticla slefuita, mai ingusta, care este tinuta inclinat la 45 de grade si careia i se imprima o usoara miscare de translatie in lungul lamei. Frotiul corect trebuie sa fie transparent si omogen si sa nu atinga marginile lamei. 2.se face prin agitarea lui in aer in cazul frotiului sangvin, sau pur si simplu se lasa sa se usuce acoperit cu in capac de sticla. 3.determina aderarea frotiului la lama si practic pregateste etapa urmatoare, de colorare. Se poate face in 2 moduri: -fixarea prin caldura, in care se va trece frotiul cu fata in sus de 3-4 ori prin partea superioara a flacarii becului buse, apoi se aplica lama pe tegumentul fetei dorsale a mainii, considerat fixarea suficienta daca se percepe o senzatie de arsura suportabila.

Daca fixarea a fost insuficienta, se va produce spalarea frotiului de pe lama in etapa ulterioara, in schimb o fixare prea puternica poate distruge elementele bacteriene. -fixarea cu substante chimice (mai putin utilizata) se foloseste pentru bacteriile mai sensibile care nu suporta fixarea prin caldura, si consta din introducerea lamei intr-un recipient cu solvent (alcool etilic) un interval de timp. 4.Bacteriile vii, necolorate, sunt greu vizibile la microscopul optic, de aceea frotiurile treuiesc intotdeauna colorate inainte de a fi examinate. Colorarea bacteriilor este rezultatul unor interactiuni fizico-chimice care au loc intre substanta colorata si anumiti constituienti ai celulei bacteriene. Colorantii sunt niste compusi colorati, capabili sa-si transfere culoarea unui substrat, substrat care din cauza structurii lui chimice prezinta afinitate pentru acesta. Colorantii au 2 tipuri de grupari chimice care sunt active: prima se numeste Cromofor, aceasta determina culoarea proprie a colorantului, a 2-a este gruparea auxocroma care va determina colorarea substratului, si care de fapt va imprima colorantului caracterul acid respectiv bazic (OH, COOH, SH, NH2). Majoritatea bacteriilor se coloreaza cu coloranti bazici, cum ar fi: albastrul de metilen, fuxina bazica, violetul de gentiana. Clasificarea colorantilor: - in functie de numarul colorantilor folositi, si respectiv dificultatea de realizare. -Coloratiile uzuale: pot fi coloratii simple in care se foloseste un singur tip de colorant, si respectiv coloratii compuse sau diferentiale, in care se folosesc 2 sau mai multi coloranti. Aceste coloratii uzuale evidentiaza caractere morfologice ale bacteriilor, si anume: forma, dimensiunea, gruparea pe frotiu, tinctorialitatea (modul de colorare), raportul cu celelalte celule ale organismului. -Coloratiile speciale - se numesc asa deoarece evidentiaza constituienti bacterieni care se coloreaza putin sau deloc in coloratiile uzuale: coloratia capsulei bacteriene, respectiv coloratia sporilor. Coloratiile uzuale simple: - coloratia cu albastru de metilen si cu fuxina bazica. Frotiul care a fost fixat prin caldura este acoperit cu o solutie penicata (fenolat) de albastru de metilen 1% care se lasa sa actioneze timp de 1-2 minute. Apoi se varsa colorantul de pe lama, se spala frotiul cu apa de robinet, se usuca si in final se examineaza la microscop cu obiectivul de imersie (90x), folosind o picatura de ulei de cedru. Mecanismul coloratiei: - albastru de metilen este un colorant bazic care realizeaza schimburi ionice cu gruparile acide, in speta cele carboxilice din structura celulei bacteriene. Bacteriile si celulele organismului uman vor aparea colorate in albastru. -coloratia cu fxina bazica se realizeaza identic (ca si tehnica) doar ca se foloseste alt colorant, fuxina bazica 1%, timp de 2 minute. Mecanismul este acelasi, difera interpretarea, in aceasta coloratie bacteriile si elementele celulare apar colorate in rosu. Coloratiile compuse: - coloratia Gram are 4 etape: a) colorarea, b)modansarea, c)decolorarea, d)recolorarea; toate coloratiile compuse evidentiaza pe langa morfologia bacteriana si tinctorialitatea acestora.

a)in aceasta etapa frotiul fixat se acopera cu o solutie de violet de gentian 1%, 1-2minute, se varsa apoi colorantul de pe lama si se trece la etapa a 2-a (modansarea). b) in aceasta etapa lama se acopera cu o substanta numita mordat, aceasta fiind solutia lugol, timp de 12 minute, se varsa apoi mordatul de pe lama si se trece la etapa c. c) etapa in care pe lama tinuta inclinat se toarna un amestec decolorant care este format din alcool si acetona in proportie variabila 5-1. Se spala cu acest colorant pana cand lichidul scurs de pe lama devine incolor, apoi se spala frotiul cu apa de robinet si se trece la ultima etapa de recolorare. d) etapa in acre frotiul se acopera cu colorant, fuxina 1%, 1-2 minute, se spala, se usuca si in final se examineaza la microscopul de imersie. Mecanismul acestei coloratii: - in prima etapa colorantul coloreaza toate elementele de pe lama, prin schimburi ionice intre gruparile lui bazice si cele acide ale peretelui bacterian. In etapa a 2-a, mordantul are loc de fixator de culoare. Iodul din solutia lugol care are afinitate si pentru colorant si pentru constituientii peretelui bacterian va patrunde in celula bacteriana si va forma complexe insolubile cu colorantul, adica cu violetul de gentiana, care este legat la randul lui de structurile peretelui bacterian. Singurul lucru care se intampla in a 2-a etapa este ca se formeaza aceste complexe. Etapa a 3-a, acest amestec decolorant are proprietate de a dizolva lipidele din structura peretelui bacterian si in cazul bacteriior gram negative care au un continut ridicat de lipide in perete se va produce decolorarea, pentru ca violetul de gentiana este eliminat din celula bacteriana odata cu lichidele, in schimb la bacteriile gram pozitive, care sunt mai sarace in lipide, colorantul se va mentine in celula, ele raman in continuare violet. In ultima etapa se vor recolora bateriile care sau decolorat anterior, adica cele gram negative care vor deveni de culare rosie. In final putem vedea la microscop 2 tipuri de bacterii: cele gram pozitive colorate in violet, iar cele gram negative vor aparea colorate in rosu. Exemple de bacterii gram pozitive: - Stafilocici, Streptococi, Pneumococi, Bacilul difteric, Bacilul Antraxului, Bacilul tetanic, Levurile (SSPDATL). -gram negative: ella Salmonella, Shigella, Klebsiella; Escherichia (E.Coli), genul Vibrio (vibrionul holeric), etc. -coloratia Ziehl Nielsen, are doar 3 etape, a)colorare, b)decolorare, si c)recolorare. a) frotiul fixat se acopera cu o solutie de fuxina bazica 1%, si apoi este incalzit pe dedesupt cu flacara becului buelsen pana la emisia de vapori, cu mentiunea ca lichidul nu trebuie sa fiarba, se raceste si se repeta operatiunea de 2-3 ori in 10minute. b) se scurge colorantul de pe lama si pe lama se toarna un amestec decolorant (alcool si acid). Se toarna acest colorant pana cand lichidul scurs de pe lama devine incolor, apoi se spala cu apa de robinet. c) recolorarea, care se face cu albastru de metilen 1%, timp de 1-2 minute, se spala, se usuca, si se examineaza in final la microscopul cu imersie. Aceasta coloratie se foloseste pentru a evidentia bacterii cu un continut ridicat de lipide in peretele celular, bacterii care se coloreaza cu dificultate in celelalte

coloratii si numai la temperaturi ridicate cu coloranti foarte puternici. Aceste bacterii au o proprietate nmita acido-alcoolo-rezistenta, au capacitate de rezistenta la acest amestec. Acesta capacitate este data de un hidroxiacid din structura lipidelor peretelui bacterian (Acidul Micolic). Cel mai important gen de bacterii pentru care se foloseste aceasta coloratie este genul Mycobacterium, o specie importanta este bacilul Tuberculosis (Koch). Ca si interpretare, bacteriile acidoalcoolo-rezistente apar colorate in rosu pe fondul albastru al preparatului. Coloratiile speciale evidentiaza componente bacteriene care nu se pot evientia prin coloratii uzuale, si anume capsul bacteriana. Capsula datorita structurii chimice nu se poate colora in coloratiile uzuale, si atunci in coloratiile uzuale capsula apare ca o zona stralucitoare situata in jurul corpului bacterian. Coloratia capsulei seamana cu coloratia Ziel-nielsen, primul colorant fiind tus de china iar al 2lea este fuxina bazica. Ca si interpretare, capsula apare in negru pe fondul rosu al colorantului. Coloratia sporilor - in coloratiile uzuale nici sporii nu sunt colorati, ci ei apar luminati, stralucitori, atasati de corpul bacterian. Datorita structurilor, si anume a faptului ca au o densitate mare a continutului si o activitate scazuta pentru coloranti, ei se pot colora numai la temperaturi ridicate si cu coloranti puternici. Tot 2 coloranti se folosesc: 1. verde Malahit, iar al 2-lea fuxina bazica. Ca interpretare sporii vor aparea in coloratie verde pe un fond rosu.

Caractere de cultura pe medii lichide Mediile lichide folosite pentru insamantari sunt sterile si limpezi, transparente. Ca urmare a dezvoltarii bacteriilor pot aparea diverse modificari: 1. turbiditate se tulbura omogen (tulpini virulente de stafilococi); 2. formarea unui depozit pe fundul si peretii eprubetei, depozit grunjos (ca un gris) streptococi; 3. formarea unui inel la suprafata lichidului E.coli; 4. formarea unei pelicule la suprafata lichidului, de ex. Pseudomonas Spp (spisis); 5. formarea unei membrane uscate pe suprafata lichidului genul Bacillus; 6.pigmentarea lichidului Pseudomonas Spp; 7. modificari specifice unor specii fermentarea unui zahar care determina schimbarea culorii mediului sau hemoliza; 8. producerea de bule de gaz bacterii anaerobe; 9. mirosul Pseudomona are miros de flori de tei, alt ex. Proteus miros de putrefactie, E.coli miros acid, bacteriile anaerobe miros fetid (cadavru). Caractere de cultura pe medii solide: - pe medii solide bacteriile formeaza colonii, coloniile sunt clone, adica populatii bacteriene provenite dintr-un stramos comun. Dimensiuni: pot fi punctiforme pana la cativa mm.

Forma: pot fi rotunde, ovalare, lenticulare, cu forma neregulata. Ridicarea in suprafata: pot fi plate, bombate, ombilicate - (cu o depresiune centrala), sau mamelonate, cu o proeminenta centrala. Aspectul marginilor: - Pot fi bine definite, sau estompate, neclare. Consistenta: pot fi apoase, cremoase, vascoase, gelatinoase, pufoase, uscate. Pigmentarea diverse culori Miros la fel pe toate mediile de cultura. Particularitati ale unor specii: - Proteus fenomenul de migrare; fermentarea unor zaharuri sau hemoliza. Antibiograma Este o tehnica folosita frecvent in laborator, pentru testarea sensibilitatii la antibiotice a bacteriilor patogene. Metoda este indicata pentru bacterii cu crestere rapida, adica 24 72 de ore, la care nu se cunoaste sensibilitatea la antibiotice. Nu se face pentru streptocicii beta-hemolitici de grup A. Metode calitative, si metode cantitative. Metodele cantitative permit determinarea CMI concentratie minima inhibitorie = cea mai mica concentratie de antibiotic care inhiba dezvoltarea bacteriei respective. Antibiograma difuzimetrica Kirky Bauer - este o metoda semicantitativa, strandardizata. Materiale necesare: - mediul de cultura Mueller Hinton. Acesta este ideal pentru antibiograma deoarece permite dezvoltarea majoritatii bacteriilor patogene, nu are efecte antagonice cu antibioticele, compozitia sa este stabila, usor de mentinut, si este izoton cu sangele care poate fi adaugat in mediu pentru cultivarea unor bacterii pretentioase nutritiv. Mediul trebuie turnat in placi Petri cu o inaltime constanta de 4mm. Mediile se pastreaza in frigider, de unde se scot cu minimum 30minute inainte de utilizare. -cultura de testat - aceasta trebuie sa fie pura si proaspata, de max 24h. -microcomprimate de antibiotice sau discuri, rondele. Acestea se pastreaza in frigider de unde se scot cu minim 30 de minute inainte de folosire, trebuie sa fie in termen de valabilitate, ele sunt livrate in cartuse. -eprubete sterile -pipete sterile -ser fiziologic sterile -rigla -pensa sau aplicator

-tabel de interpretare Tehnica se scoate o placa cu mediul Muller-Hinton din frigider si se aduce la temperatura camerei, se noteaza pe capacul placii numarul de inregistrare al probei respective cu un marker. Se verifica calitatea mediului apoi se prepara inoculul (suspensia bacteriana). Intr-o eprubeta sterila se pun 5mm de ser fiziologic steril peste care se adauga 4-15 colonii bacteriene identice din bacteria patogena izoltata anterior, apoi se agita eprubeta pentru omogenizare si se acopera cu dop de vata steril, dupa care se standardizeaza inoculul prin compararea acestuia cu un etalon de turbiditate sau folosind un densimat. Se foloseste o concentratie a inoculului de 0.5, inoculul se foloseste in maxim 15 minute de la preparare. Se insamanteaza prin inundare mediul Muller-Hinton cu inoculul standardizat. Intinderea se poate realiza si cu un tampon steril imbibat cu inocul, pe 2-3 directii. Se lasa placa pe masa, acoperita cu capacul, circa 15 minute pentru uscare, apoi se aplica rondelele de antibiotice cu pensa flambata dupa fiecare rondea sau cu aplicatorul. Se acopera placa cu capacul si se lasa pe masa 15minute pentru predifuzie. Antibioticele din rondele difuzeaza circular in mediul de cultura, apoi placa se pune in termostat la 37 de grade, 24h. Se masoara cu rigla diametrul zonelor de inhibitie a cresterii bacteriene din jurul rondelelor, valorile in mm obtinute se transforma in calificative cu ajutorul tabelului de interpretare. Calificativele sunt: - S bacterie sensibila la antibioticul respectiv, adica se poate folosi in doze uzuale; IS bacterie intermediar sensibila la antibioticul respectiv, se poate da in situatii de rezerva si in doze mai mari decat cele uzuale. R bacterii rezistente, nu se poate folosi acel antibiotic. Erorile antibiogramei a) erori legate de mediu folosirea altui mediu decat MH. -neadaugarea de sange in mediul Muller-Hilton pentru bacteriile pretentioase nutritiv. -folosirea mediior direct din frigider -folosirea unor medii turnate gresit (prea groase, prea subtiri, sau inclinate). -b)erori legate de cultura, cultura veche, cultura amestecata, sau inocul nestandardizat. -c)erori legate de microcomprimate, folosirea unor discuri exprimate, folosirea discurilor direct din frigider, folosirea unui set necorespunzator germenului testat; -nemasurarea cu rigla a diametrelor. -neverificarea mediilor si rondelelor cu tulpini de referinta. -d)erori legate de tehnica nerespectarea timpilor, (15minute uscare, 15min predifuzie, 15min folosirea inoculului, 24h incubarea).

Schema diagnosticului bacteriologic I diagnosticul bacteriologic = izolarea si identificarea bacteriei patogene din produsul pacientului, parcurge 7 etape: 1 recoltarea produselor patologice 2 transportul probelor la laborator 3 examenul macroscopic al produsului 4 examenul microscopic direct = examinarea microscopica a unui frotiu colorat gram din produsul pacientului 5 cultivarea in vitro a bacteriei patogene pana la obtinerea unei culturi pure 6 identificarea genului +- speciei bacteriene (biochimica sau serologica). 7 antibiograma II diagnosticul serologic = detectarea anticorpilor specifici in serul pacientului prin reactii antigen-anticorp.