Sunteți pe pagina 1din 30

IMUNOHISTOCHIMIE Cursul II

Complexul antigen-anticorp Punerea n contact a unui antigen cu anticorpul specific determin formarea unui complex antigen-anticorp, ntre cele dou molecule existnd o analogie structural la nivelul determinan ilor antigenici de tip lac t-cheie. Acest complex este men inut prin: - formarea unor pun i de hidrogen, - apari ia unor for e electrostatice - formarea de leg turi Van der Waals. Combinarea unui anticorp cu antigenul s u este o reac ie imun prin care se urm re te neutralizarea toxicit ii sau patogenit ii antigenului. Complexele antigen-anticorp pot fi vizualizate numai prin marcarea anticorpului specific cu fluorocromi sau cu enzime.

1. Marcarea fluorescent 1.1. Metoda direct const n punerea n contact a antigenului cu anticorpul specific, marcat fluorescent. Cei mai frecven i reactivi utiliza i pentru marcarea i anticorpilor sunt izotiocianatul fluoresceina (FITC) izotiocianatul tetrametilrodamina (TRITC). Aceste substan e, n solu ie alcalin (pH 9-10) se combin covalent cu proteinele, reac ionnd n principal cu grupul amino al lizinei. Materialul care urmeaz a fi marcat este un antiser primar. Fluorocromul se va conjuga cu toate tipurile de proteine prezente n ser, nu numai cu anticorpul sau anticorpii interesa i. Materialul fluorescent nelegat va fi de asemenea prezent din cauza unor hidrolize ale agen ilor de marcaj care survin n mediu alcalin necesar dezvolt rii reac iei cu aminele.

Materialul fluorescent neconjugat trebuie s

fie eliminat din

cauz c ar colora nespecific esuturile. Serul marcat este dializat pentru a ndep rta moleculele mici (gm < 5000 daltoni) i pentru a nlocui solventul alcalin cu o solu ie salin cu un pH fiziologic. Apoi serul imun este trecut printr-o coloan filtru de gel, care re ine moleculele mici sau poate fi tratat cu c rbune activat. Rezultatul final duce la ob inerea unui ser ce con ine n cea mai mare parte anticorpul specific marcat cu un fluorocrom. Acest ser este pus n contact cu esutul care con ine antigenul ntr-o atmosfer umed , timp de aproximativ o or . Apoi se nl tur excesul cu o solu ie salin i se monteaz ntre lam i lamel utiliznd un amestec de glicerol i tampon alcalin.

Aceste tenhici prezint mai multe dezavantaje: - prezen a unui microscop cu lamp de ultraviolete, filtre speciale i obiective microscopice speciale; - preparatul histologic trebuie examinat i fotografiat ct mai repede deoarece emisia de lumin se reduce progresiv cu trecerea timpului; - montare nu se poate face n balsam de Canada i de aici imposibilitatea de a fi p strat mult timp (nu poate fi p strat ca preparat permanent).

Procedura de imunocolorare. Materialul biologic care con ine antigene pe care vrem s le studiem sunt sec ionate la microtom i montate pe lame histologice. Sec iunile sunt cl tite cu solu ie de ser fiziologic dup care se adaug o pic tur de antiser marcat, pe fiecare lam , acoperind toat sec iunea. Pentru o reac ie bun se vor efectua mai multe dilu ii ale serului n solu ie salin . (Dilu ii mai slabe de 1:8 ale anticorprului primar nu sunt utilizate pentru metodele directe cu anticorpi fluorescen i). Serul este l sat n contact cu sec iunile, n atmosfer umed , aproximativ o or . Apoi este ndep rtat surplusul de ser primar cu solu ie salin dup care se aplic o lamel (se realizeaz montarea preparatului histologic). Preparatele imunofluorescente sunt de obicei montate n amestec de glicerol i un oarecare tampon alcalin, deoarece mediul de montare permanent scade intensitatea fluorescen ei. Sec iunile colorate i montate sunt examinate la microscopul cu fluorescen , cu excita ie i filtrare adecvate pentru marcaj.

Deficien ele metodei directe. Cu metoda direct cu anticorpi fluorescen i nu este posibil totdeauna s localiz m antigenele prezente n esutului, unele antigene fiind n cantitate foarte mic , deci sensibilitatea metodei este foarte redus , cel pu in pentru unele antigene. Dac concentra ia antigenului este sc zut , densitatea moleculei fluorocrom legata nu poate fi suficient de mare pentru a permite detectarea lor la microscop. n plus, procesul de marcare al anticorpulul primar poate fi deficitar, reducnd capacitatea acestuia de a pune n eviden complexul antigen-anticorp. Un ser ideal marcat are aproximativ 10 molecule fluorocromice ata ate la fiecare molecul de IgG. Alte deficien e al acestei tehnici este faptul c antiserurile primare sunt greu de preparat sau scumpe i adesea sunt disponibile n cantit i mici.

1.2. Metoda indirect const n cuplarea antigenului cu un anticorp primar, cuplat la rndul sau cu un anticorp secundar marcat fluorescent. Cu aceasta tehnic (indirect ) este posibil s se identifice orice antigen sau anticorp n esut. Anticorpul secundar reprezint un anti-anticorp. Procedeele de ob inere al anticopului secundar sunt extrem de variate. n principiu, un antigen este injectat unei specii de animale (ex. iepure). Prezen a unei structuri imunogene va duce la producerea de c tre plasmocitele de iepure a unui anticorp specific numit anticorp primar =gama globulin (ser primar). Dup recoltare i purificare o parte din acest anticorp este injectat la alt specie de animale (capr ). Aceasta va reac iona i plasmocitele sale vor produce imunoglobuline mpotriva anticorpului primar. Aceste imunoglobuline noi poart numele de anticorp secundar sau ser anti-iumunoglobulinic. Anticorpul secundar va fi marcat cu un fluorocrom.

Procedura de imunocolorare. O sec iune con innd antigenul este mai nti incubat pentru 30-60 minute cu o concentra ie adecvat (de obicei 1:20 sau 1:50) anticorpul primar. Moleculele de anticorpi care se ata eaz la situsurile antigenice (se leag de epitropi) din esut, sunt imunoglobuline. Ele se cupleaz cu antigenele prin intermediul fragmentelor Fab. Segmentele Fc ale moleculelor de imunoglobuline din anticorpul primar pot nsele servi ca antigene. n stadiul urm tor al metodei de colorare, sec iunea este tratat cu antiserul secundar marcat fluorescent. Moleculele anti-IgG (anticorpul secundar) se vor lega de fregmentele Fc ale moleculelor de imunoglobuline deja ata ate derivate din antiserul primar. Aceast metod este o metod de amplificare a cantit ii de fluorocrom si deci, de amplificare a semnalului luminos emis de fluorocrom.

Aceast metod este superioar metodei directe pentru 2 motive: - nu este necesar marcarea anticorpului primar. Ob inerea antiserurilor secundare i marcarea lor este mai ieftin ; - mai mult de o molecul de anticorp fluorescent din antiserul secundar va putea s se ata eze de fiecare molecul a anticorpului primar. Fiecare molecul de antigen a legat de dou ori mai multe molecule fluorescente dect ar fi legat dac s-ar fi folosit metoda direct de imunofluorescen . n realitate factorul de amplificare poate fi mult mai mare (nu numai de 2 ori), deci tehnicile imunohistochimice indirecte sunt ntotdeauna mai sensibile dect cele directe. Metoda imunofluorescen ei indirecte este foarte sensibil , mai rapid i mai eficient .

Folosind antiserurile primare dezvoltate la specii diferite, este posibil localizarea a cel pu in trei antigene diferite n aceea i

sec iune, prin conjugarea antiserurilor secundare cu fluorocromi diferi i. Procedurile de marcaj multiplu sunt constituite din mai multe etape i sunt folosite n principal n cercetare. Microscopia confocal asigur o rezolu ie nalt i posibilitatea colect rii i

manipul rii electronice a imaginilor ob inute de la specimene care con in fluorocromi diferi i.

II. Marcarea enzimatic Enzimele sunt cei mai folosi i markeri n imunocitochimie. Prin aceste tehnici anticorpii sunt marca i prin conjugare cu enzime. Incuba ia complexului antigen-anticorp-enzim cu un cromogen folosind o metod histochimic standard genereaz un produs final de reac ie, colorat, stabil, u or de examinat la microscopul optic obi nuit. n plus, varietatea enzimelor i cromogenilor disponibili, permit utilizatorului alegerea culorii produsului final de reac ie.

Peroxidaza din hrean este cea mai folosit

enzim , i n

combina ie cu un cromogen favorabil diaminobenzidina (3,3diaminobenyidi tetraclorid)(DAB), conduce la formarea unui produs de reac ie maro nchis, stabil, insolubil i permanent. Cu toate c DAB a fost considerat poten ial carcinogen, actual riscul demonstrat a fi mic. n afar de DAB, peroxidaza poate fi combinat naftol pironina (rezultnd o colora ie rosie purpurie), etc. Amplificarea semnalului const enzim marcate cu un cromogen. n faptul c la o singur i cu al i cromogeni: 4 clor-1-naftol (rezultnd o colora ie albastr ), alfa

molecul de imunoglobulin pot fi ata ate mai multe molecule de

Procedura de imunocolorare. Pot fi folosi i anticorpii primari marca i cu enzim ntr-o reac ie direct . Aceast metod nu se mai folose te curent, ci se folosesc metode indirecte, n care antiserurile secundare sunt marcate enzimatic. La ora actual sunt foarte mul i produc tori de reactivi de imunohistochimie i fiecare produc tor recomad metodologia de utilizare, inclusiv dilu ia anticorpului primar. Solu ia ce con ine un anticorp marcat peroxidaz din hrean (HRP) este folosit la fel ca antiserul secundar marcat fluorocromic. Locurile de ata ament al HRP la esut sunt detectate histochimic, de obicei cu ajutorul reac iei DAB-peroxid de hidrogen. Legarea HRP e capabil s catalizeze oxidarea multor molecule de DAB prin peroxid de hidrogen cu acumulare consecutiv de cantit i substan iale ale unui produs maro insolubil. M rimea aparent a fiec rui loc antigenic n esut este de aceea m rit pn cnd enzima este inhibat de acumularea produ ilor activit ii sale. Factorul de amplificare este mai mare dect poate fi ob inut n tehnicile cu anticorpi fluorescen i.

n forma sa ea mai simpl metoda urm torii timpi: - cl tirea sec iunilor n solu ie salin ; - aplicarea anticorpului diluat primar dup indica iile produc torului; se folosesc dilu ii seriate de la 1:20 la 1:320. Se las n contact cu sec iunile 30-60 min la temperatura camerei i atmosfer umed ; - se cl tesc sec iunile de trei ori n solu ie salin ; - se aplic antiser secundar marcat enzimatic la recomand rile produc torului; se utilizeaz dilu ii 1:20 i 1:80, 30-60 min; - se cl tesc sec iunile de trei ori n solu ie salin ; - se aplic metoda histochimic pentru detectarea marc rii enzimatice. Pentru HRP se folose te metoda DAB, pentru c produsul final este stabil i insolubil; - sp lare n solu ie salin ; - deshidratarea cu solu ii de alcool etilic n concentra ii crescnde; - clarificare, montare n balsam de Canada. Complexele antigen anticorp sunt puse n eviden maronie. printr-o colora ie

Marcaje enzimatice, altele dect HRP Peroxidaza din hrean este cea mai utilizat marcare enzimatic pentru anticorpi, dar nu este unica folosit . Alte enzime utilizate: fosfataza alcalin , -galactozidaza i glucozoxidaza. Aceste enzime pot fi de asemenea folosite la metodele enzimatice cu anticorpi nemarca i i cu metoda avidin-biotin, folosindu-se marcaje duble sau triple, care pun n eviden mai mul i antigeni n acela i timp, n culori diferite. Cnd locurile antigenice sunt pu ine i departe ntre ele, o tehnic indirect cu anticorpi fluorescen i este preferat , pentru c este mai u or de observat pete fluorescente izolate pe un fundal ntunecat dect s g se ti acumul ri mici ocazionale de produ i de reac ie enzimatic pe un fundal luminos. Anticorpii marca i enzimatic sunt utiliza i i pentru imunohistochimia ultrastructural , pentru c produ ii finali ai multor reac ii histochimice, inclusiv metoda DAB-H2O2 pentru peroxidaz , pot fi detectate de microscopia electronic .

Metoda peroxidaz - antiperoxidaz Principiul metodei. Peroxidaza din hrean poate servi drept antigen cnd este injectat la un animal (de exemplu la iepure). Se ob in imunoglobuline (anticorpi) antiperoxidaz . Prin amestecarea atent a acestor anticorpi cu peroxidaza din hrean se ob ine un complex antigenanticorp solubil cunoscut sub numele de peroxidaz -antiperoxidaz (PAP). Dou molecule de IgG specifice sunt asociate cu 3 de peroxidaz . Acest complex este disponibil comercial. Fiecare molecul complex de PAP are 2 segmente Fc, care sunt apte pentru ata amentul la moleculele anti-IgG adecvate. De exemplu, segmentele Fc de PAP la iepure se vor lega de segmentele Fab ale IgG specifice la anti-( -globulina de iepure) la capr . Complexul PAP este de aceea un reactiv imunohistochimic valoros pentru detectarea locurilor de legare ale anti-anticorpilor. Combinarea cu anticorp nu inhib activitatea peroxidazei.

Procedura de imunocolorare: - se aplicarea anticorpul primar de iepure (antiserul primar) pe sec iuni, 1 or la temperatura camerei. Dac acesta nu a mai fost folosit, se ncearc cteva dilu ii (n solu ie salin tamponat cu fosfat) de la 1:50 la 1:20000. O expunere mai mare (12-24 ore la 4oC) este avantajoas cnd este necesar un antiser primar foarte diluat sau dac investiga ia necesit folosirea unor sec iuni groase (50-150m); - se cl te te de 3 ori n solu ie salin tamponat cu fosfat; - se aplic antiserul secundar, anti-(imunoglobulin de iepure) de la capr , 30 minute la temperatura camerei. Se folose te o dilu ie a serului de 1:10 i 1:40. Concentra ia nu este critic , dar ea trebuie s fie mult mai mare dect cea a antiserului primar sau PAP; - se cl te te de 3 sau 4 ori n solu ie salin tamponat cu fosfat;

- se aplic complexul peroxidaz -antiperoxidaz de la iepure (PAP de la iepure) 30 min. la temperatura camerei. Acest reactiv este pus la dispozi ie ca o solu ie ce con ine 1 mg proteine/ml. Este diluat 1:50 cu solu ie salin tamponat cu fosfat; - se cl te te de 3 sau 4 ori n solu ie salin tamponat cu fosfat; - se incubeaz pentru demonstrarea activit ii peroxidazei. Metoda DAB-H2O2 este de obicei folosit cu mediul de incubare tamponat la ph 7,6. - se spal n ap . Dac a fost folosit DAB, se deshidrateaz , se clarific i se monteaz folosind un mediu r inos. Intensitatea color rii produsului final este influen at de dilu ia

antiserului primar. Cnd antigenul este prezent n concentra ie mare n esut, densitatea produsului final este mai mare dup aplicarea solu iilor mai diluate ale antiserului primar.

Aprecierea metodei Principalul avantaj al metodei anticorp-enzim (PAP) este marea ei sensibilitate. Rezultate pozitive pot adesea fi ob inute cu sec iuni de esut fixat i prelucrat prin metode ce denatureaz majoritatea antigenelor prezente. Este posibil chiar s se foloseasc lame vechi colorate H-E de la care lamelele, mediul de montare i coloran ii au fost ndep rta i. Marea sensibilitate de datoreaz ata rii celor 3 molecule de peroxidaz la fiecare loc de legare al complexului PAP. De i procedurile de control sunt necesare pentru a exclude colorarea nespecific , aceasta este o metod mai curat dect altele, probabil pentru c reactivul PAP este un complex antigen-anticorp pur, incapabil s se asocieze cu alte proteine dect anticorpii s i specifici. Folosirea metodei PAP ne permite s apreciem destul de bine cantitatea de antigen dintr-un esut, celul etc i s facem compara ii importante ntre regiunile colorate mai puternic i mai slab n cadrul unei singure sec iuni.

Metoda avidin -biotin


Biotina, un metabolit al multor tipuri de microorganisme, este o vitamin ce formeaz coenzim sau grup prostetic al ctorva enzime ce transfer grupul carboxil. Avidina este o glicoprotein din ou. Fiecare molecul este format din 4 subunit i identice, fiecare capabil s lege o molecul de biotin . Afinitatea ntre biotin i avidin este foarte mare, de i nu sunt formate leg turi covalente, astfel nct legarea apare repede i este reversibil numai n condi ii extreme, precum aciditate puternic . Streptavidina este o protein microbian care nu con ine carbohidra i. Propriet ile sale sunt similare cu cele ale avidinei. Cele 2 proteine sunt folosite n acelea i scopuri, dar streptavidina este de aproximativ 5 ori mai scump dect avidina. Este posibil ca i alte molecule mari proteice s se conjuge cu biotina. Aceast reac ie este cunoscut ca biotinila ie. Molecula de biotin este suficient de mic pentru a nu interfera cu activitatea biologic a macromoleculelor pe care le marcheaz , iar reactivitatea sa cu avidina este neschimbat . La ora actual exist n comer multe seruri biotinilate i enzime sunt disponibile.

Procedura de marcare avidin -biotin : - aplicarea antiserului primar; - aplicarea antiserului secundar biotinizat; - aplicarea solu iei de avidin ce a fost conjugat covalent cu fluorocrom sau o enzim demonstrabil histochimic, precum peroxidaza din hrean. Enzima este apoi localizat histochimic n modul obi nuit.

Metoda ABC
Sensibilitatea metodei avidin -biotin a putut fi crescut prin folosirea ca agent de imunomarcare a complexului avidin -biotin (ABC) proasp t preparat, realizat prin amestecarea solu iei de avidin cu peroxidaz din hrean (HRP) biotinilat . Reca ia este asem n tare cu procedura anterioar , dar difer de acesta prin faptul c acest complex peroxidaz din hrean (HRP)-avidin -biotin preformat este o molecul enorm , legat ncruci at, ce con ine mai mult de 3 molecule HRP per loc liber pe biotin . Procedura de detectare a antigenului Fixarea materialului biologic ( esutului) i procesarea sunt similare altor metode imunohistochimice. Sec iunile histologice sunt deparafinate, hidratate i echilibrate cu PBS. (PBS = solu ie salin de tampon fosfat).

Solu iile necesare 1. Un antiser primar ce se va combina cu antigenul c utat. 2. Un antiser biotinilat secundar ce se va combina cu imunoglobulinele speciilor din antiserul primar. 3. O solu ie avidin . Aceasta con ine tipic 10g de avidin /ml n PBS. 4. O solu ie peroxidaz biotinizat horseradish n PBS. 5. ABC realizat prin combinarea solu iilor 3 i 4. Se amestec 15-20 min. nainte de ntrebuin are. 6. Reactivii pentru demonstrarea activit ii peroxidazei la pH neutru. 7. Orice solu ie colorant (DAB).

Tehnica de lucru
- deparafinare; - hidratare; - sp lare 5 minute n PBS; - se inhib peroxidaza endogen prin tratarea sec iunilor pentru 30 minute cu peroxid de hidrogen 0,3% n PBS; - sp lare n 2 b i de PBS; - se incubeaz n antiser primar diluat adecvat (gradul dilu iei poate varia ntre 1:200 i 1:6400) . Incub rile lungi (12-48 ore) la 4oC sunt preferate pentru sec iunile sub iri (50150m). Incub rile mai scurte (ca 1 or ) la temperatura camerei sunt satisf c toare pentru sec iunile montate la parafin . - cl tire n 3 bai de PBS; - se incubeaz n antiserul secundar biotinilat 30-60 minute la temperatura camerei n dilu ie de 1:10 la 1:40; - cl tire de 3 ori n PBS; - se incubeaz sec iunile n solu ie ABC timp de o ora la temperatura camerei; - se cl tesc de 3 ori n PBS; - se activeaz peroxidaza; - se pune solu ia marcatoare (DAB); - se spal n ap , - se coloreaz de contrast cu Hematoxilin Mayer ct se dore te - se deshidrateaz i se monteaz .

Rezultate Locurile de imunoreactivitate recunoscute de antiserul primar sunt marcate prin culoare maro,. Aprecierea metodei Metodele ABC i PAP sunt probabil de intensitate aproximativ egal . n ambele proceduri sunt folosite molecule mari, complexe, pentru a introduce enzima detectoare la locurile unde sunt lega i anticorpii. Totu i, tehnica ABC este preferat pentru ob inerea unor preparate curate. Unii utilizatori pretind c rezultatele sunt mai exacte cu streptavidin dect cu avidin .

Alte metode imunohistochimice Tehnicile descrise pn acum sunt cele mai larg utilizate pentru demonstrarea antigenelor n esuturi. Dar la ora actual exist i alte tehnici ingenioase pentru localizarea antigenelor i anticorpilor. Tehnica sandwich pentru anticorpi n esut Anticorpii dintr-un esut sunt demonstra i prin aplicarea antigenului purificat, urmat de antiserul marcat fluorescent al antigenului. Metoda este adesea folosit pentru studiul nodulilor limfatici. Anticorpii, n general, sunt detecta i prin combinare lor cu antigenele specifice. De exemplu o imunoglobulin G uman , poate fi localizat pe sec iunile histologice cu ajutorul antiserului de iepure mpotriva imunoglobulinei G umane, urmat de combinarea acestui complex cu un antiser marcat provenind de la o alt specie de animal (capr ) mpotriva imunoglobulinei de iepure.

Detectarea anticorpului n ser n bolile autoimune, sngele con ine anticorpi circulan i mpotriva anumitor componente ale esuturilor pacientului sau animalului. Existen a i specificitatea unor asemenea anticorpi poate fi detectat imunohistochimic prin aplicarea serului suspect pe sec iunile criostatice nefixate de esut cunoscut ce con ine auto-antigene adecvate. Locurile de legare ale anticorpilor la sec iuni sunt f cute vizibile prin aplicarea antiserului fluorescent sau marcat enzimatic mpotriva imunoglobulinelor speciilor de la care a fost ob inut serul sub testare.

Metode ce folosesc proteina A stafilococic Peretele celular al Stafilococului aureu, con ine o component numit proteina A ce este capabil s se lege de segmentele Fc ale multor tipuri de molecule IgG la mamifere. Legarea este nonimun rezult dintr-o afinitate similar celei existente ntre antigene i anticorpi. Molecula de protein A este bivalent i poate de aceea fi realizat pentru a servi drept punte ntre por iunile Fc ale moleculelor de IgG de tipuri diferite. Este de asemenea posibil s marcheze proteina A cu fluorocromi sau cu HRP. De aceea proteina A poate fi folosit pentru acelea i scopuri ca un antiser la IgG. Un conjugat al proteinei A cu HRP este implicat ntr-o tehnic asem n toare unei metode cu anticorpi marca i enzimatic. Antiserul primar specific este aplicat pe o sec iune de esut, urmat de conjugatul HRP-proteina A. Locurile de legare HRP sunt demonstrate histochimic n modul obi nuit. Aceast metod pune la dispozi ie uneori o colorare mai curat , cu mai pu in culorare de fond nonimunologic , dect tehnica cu anticorpi marca i enzimatic echivalent . Avantajul principal al proteinei A este c aceasta este capabil s se combine cu IgG de la toate mamiferele, a a nct ea are un num r mai mare de poten iale ntrebuin ri dect un antiser la imunolgobulina unei singure specii.

Marcarea cu aur coloidal Este u or de realizat deoarece este o suspensie coloidal (numit sol) de aur, con innd particule cu diametru cunoscut n medie de 20150 nm. Pentru a preveni ca particulele suspendate s se grupeze sau s se scufunde, suspensia con ine un agent stabilizator macromolecular care acoper suprafe ele particulelor. Dac acest agent stabilizator este sau include o protein cu afinitate specific precum o lecitin sau o imunoglobulin , metalul va servi drept marcator ca si un colorant fluorescent sau o enzim demonstrabil histochimic. n mod obi nuit, un ser anti-IgG, fie o protein A stafilococic este legat de particulele de aur. In acest fel aurul este folosit pentru a identifica locurile de ata ament ale anticorpului primar. Avidina poate fi de asemenea folosit pentru a acoperi particulele de aur coloidale. Metodele cu aur coloidal au fost introduse pentru a se folosi n microscopia electronic .