Curs 3 Surse de azot 1.

Azotul molecular N2 Desi principala sursa de azot molecular este aerul (79%), foarte putine microorganisme au capacitatea de a-l asimila. Pentru a-l putea metaboliza, microorganismele au nevoie de un aparat enzimatic care sa contina obligatoriu nitrogenaza (azotaza) N2 NEx.: azobacter (azotobactr este o bacterie aerob din grupul microorganismelor
fixatoare de azot, capabil s utilizeze n nutriia sa azotul atmosferic, mbogind astfel solul cu acest element)

2. Acid azotic sau acidul azotos Acesti acizi pot fi metabolizati (asimilati) de microorganisme ce au in componenta nitrat sau nitrit-reductaza, care sunt niste enzime ce favorizeaza reducerea nitratilor si nitritilor. 3. Solutiile amoniacale sau sarurile de amoniu Ionul de amoniu este metabolizat de majoritatea microorganismelor, in special de fungi si drojdii. Drept urmare, in mediile de cultura industriale sunt utilizate in mod uzual solutiile amoniacale si sarurile de amoniu ca sursa de azot. 4. Ureea Definitie: URE s. f. Substan organic incolor, cristalizat, care se gsete n urin i n snge (produs de dezagregarea substanelor azotoase n organismul animal). Ureea este compusul organic cu formula molecular CH4ON2. Microorganismele heterotrofe necesita, pe langa o sursa de azot anorganic, si compusi organici cu azot. Unul dintre acestia este ureea, des folosita fiind accesibila si care prezinta si proprietati de tamponare a mediului. 5. Faina de cereale Fainurile de cereale reprezinta principalele surse de azot organic utilizate in mediile de fermentatie industriale. Avantaje: - sunt produse naturale - sunt subproduse ale industriei de prelucrare a produselor de origine vegetala - sunt surse importante de aminoacizi, vitamine, saruri minerale. Dezavantaje: in faza de preparare a mediului de cultura acestea se pot aglomera in mediul apos in faza de separare a metabolitului se pot intampla urmatoarele doua fenomene: proteinele din faina pot emulsiona cu solventii utilizati la extractia metabolitului grasimile reziduale se extrag odata cu metabolitul 6. Extractul de porumb este un produs secundar obtinut la separarea amidonului din porumb. Este utilizat la scara industriala datorita continutului ridicat aminoacizi, saruri minerale si vitamine. Are si un dezavantaj, deoarece compozitia lui difera in functie de punctul de germinare al porumbului si de tehnicile de prelucrare. 7. Hidrolizatele de drojdii sunt bogate in proteine, vitamine, azot aminic. Compozitia lor variaza in functie de tipul de drojdie folosit. 8. Hidrolizatele proteice de natura vegetala sau animala Compozitia lor difera in functie de sursa de materie prima si de tehnicile de obtinere.

Saruri minerale Sarurile minerale sunt folosite in procesele biotehnologice pentru cresterea si producerea de metaboliti. Exemple: Fosfor element esential pentru cresterea celulara si pentru reglarea unor procese metabolice. Ca sursa de fosfor avem in principal extractul de porumb si diversi fosfati. Sulf are acelasi rol ca si fosforul si este adus in mediul de cultura sub forma se sulfati. Macroelemente (K, Mg, Ca, Zn, Fe) sunt adaugate sub forma de saruri, sulfati sau fosfatisau sunt continute in materiile prime utilizate ca sursa de carbon sau sursa de azot. Concentratia acestora in mediul de cultura este de 0.11 mmol/l. Microelemente (Co, Cr, Ni, Cu, Mb) sunt adaugate in concentratii cuprise intre 0.1100 mmol/l. Pentru mediile de cultura complexe, aceste microelemente sunt continute de materiile prime utilizate. Vitamine Microorganismele heterotrofe necesita in mediul de cultura prezenta unor vitamine, necesare cresterii. Majoritatea acestora sunt continute in materiile prime folosite (ex. Melasa din trestie de zahar). Consideratii asupra realizarii industriale a proceselor biotehnologice Procesele biotehnologice presupun rezolvarea mai multor probleme: izolarea tulpinilor de microorganisme din diferite medii, selectionarea si/sau modificarea genetica a acestora in scopul obtinerii de tulpini inalt productive, stabilirea compozitiei optime de mediu de cultura utilizat si a conditiilor optime de operare, stabilirea unei scheme adecvate de separare si purificare a metabolitului obtinut, alegerea si proiectarea echipamentelor utilizate. Procesele biotehnologice cuprind urmatoarele faze: 1) Prepararea mediului de cultura 2) Prepararea culturii de inocul 3) Sterilizarea mediului de cultura, a fermentatorului si a echipamentelor conexe 4) Fermentatia de regim 5) Separarea masei celulare 6) Separarea si purificarea metabolitului 7) Tratarea si eliminarea efluentilor si a produsilor secundari 1) Prepararea mediului de cultura In procesle biochimice industriale, mediile de cultura pot fi simple sau complexe, de compozitie bine definita sau semidefinita, dar care trebuie sa conduca la productii rapide, reproductibile. La stabilirea compozitiei mediului de cultura se tine seama de compozitia elementara a microorganismului utilizat. In mediile de fermentatie (mai alea in cazul proceselor aerobe), pe langa componentele principale ale mediului de cultura, se utilizeaza antispumanti cum ar fi: uleiuri naturale sau siliconice, propilen glicol. Nici concentratia mediilor de cultura nu se stabileste aleator, se tine cont de posibilitatea aparitiei fenomenului de inhibitie, datorata substratului sau produsului. La selectarea materiei prime trebuie sa se tina cont si de cateva aspecte economice: pretul de cost al materiei prime, disponibilitatea, accesibilitatea si constanta calitatii, stabilitatea la depozitare si transport.

2) Prepararea culturii de inocul Tulpinile de microorganisme izolate din diferite medii sunt selectionate in vederea obtinerii de tulpini inalt productive. In multe cazuri, cresterea productivitatii tulpinilor se face prin mutatie genetica, in urma unor tratamente cu factori mutageni (fizici sau chimici). Cultura de inocul se realizeaza pe substrat cu compozitie similara cu cea din fermentatia de regim, pentru a realiza acomodarea microorganismelor cu substratul folosit. 3) Sterilizarea mediului de cultura, a fermentatorului si a echipamentelor conexe Obtinerea unor culturi pure si a unor productii corespunzatoare impune asigurarea sterilizarii mediului de cultura, a aerului tehnologic (pentru procesele aerobe), sistemelor de transvazare si a utilajelor tehnologice. Sterilizarea are drept scop distrugerea oricaror forme de microorganisme si agenti patogeni si se poate realiza prin metode termice, fizice sau chimice. Sterilizarea termica are cele mai numeroase aplicatii datorita eficientei si simplitatii. Se poate efectua in procese continue sau discontinue, prin metode uscate sau umede, cu aer cald la 140200 oC, cu vapori de apa sub presiune la 120140 oC sau prin incalziri repetate la 70100 oC. Metodele de sterilizare se aleg in functie de proprietatile fizico-chimice ale materialului ce urmeaza a fi sterilizat. Deoarece sterilizarea cu aer cald necesita temperaturi mai ridicate si un timp de actionare mai mare, in procesele industriale se prefera sterilizarea umeda careeste mult mai eficienta datorita actiunii de hidratare, coagulare si de hidroliza a aburului asupra elementelor microbiene. In cazul materialelor termolabile, sterilizarea se face prin filtrare fie la rece, fie cu agenti chimici. Majoritatea proceselor fermentative sunt aerobe. Sterilizarea aerului prezinta dificultati datorita debitului mare, al numarului mare si variat de microorganisme contaminate, si datorita rezistentei acestora la temperatura in absenta umiditatii. Cea mai utilizata metoda de sterilizarea aerului este filtrarea prin materiale din fibra de sticla, poliamida, teflon. Si sterilizarea cu radiatii este un procedeu din ce in ce mai utilizat. Conditiile de sterilizare trebuie mentinute nu numai la prepararea mediului de cultura si a culturii de inocul, ci pe intreg fluxul tehnologic. Sterilizarea bioreactoarelor si a echipamentelor conexe se realizeaza de obicei cu abur sub presiune, iar tranvazarea aseptica cu aer steril sub presiune. 4) Fermentatia de regim In faza de fermentatie are loc cresterea microorganismelor si producerea de metaboliti. Conditiile optime pentru aceasta etapa sunt determinate, in afara de compozitia mediului de cultura si de natura microorganismelor, de temperatura, pH, concentratie de O2 in mediu si intensificarea amestecarii. Industrial s-a stabilit ca nu este necesar un control strict al temperaturii, aceasta putand varia cu 5 o C fata de temperatura optima. Regimul de pH este specific fiecarui microorganism, dar are in majoritatea cazurilor o tendinta de scadere datorita punerii in libertate de acizi organici. Pe parcursul fermentatiei pH-ul trebuie mentinut constant. Asigurarea necesarului de O2 ridica probleme de natura tehnica deosebite datorita solubilitatii foarte scazute in mediile apoase. In vederea realizarii unui contact interfazic gaz-lichid-solid cat mai bun se utilizeaza diferite sisteme constructive de barbotare a aerului la care se adauga un sistem de amestecare a mediului. Gradul de amestecare depinde de tipul constructiv si de turatia agitatorului. In cazul proceselor biochimice, turatia agitatorului este limitata de pericolul distrugerii mecanice a microorganismelor. Ca urmare, s-au dezvoltat fermentatoare cu diferite modificari constructive cum ar fi: tuburi centrale, sicane, tuburi externe de recirculare a mediului.

Durata proceselor fermentative poate varia de la 40-42 ore pana la 8-10 zile. 5) Separarea masei celulare Separarea masei celulare este precedata de inactivarea microorganismelor. Acest lucru se poate realiza modificand semnificativ temperatura sau pH-ul, sau prin adaugarea in mediul de fermentatie de substante chimice. Cele mai utilizate metode pentru separarea masei celulare sunt filtrarea, centrifugarea si aplicarea medodelor cu membrana. 6) Separarea si purificarea metabolitului Aceasta etapa este cea care da eficienta procesului si influenteaza semnificativ economicitatea. De obicei, procesele biotehnologice se caracterizeaza prin obtinerea unor concentratii scazute de produs, care mai prezinta si labilitate structurala. Operatiile de separare si purificare se aleg in functie de natura produsului, de concentratia sa in mediul de fermentatie, de proprietatile fizico-chimice si de locul in care este obtinut (intacelular sau extracelular).