MINISTERUL EDUCAIEI, CERCETRII I INOVRII UNIVERSITATEA TEFAN CEL MARE, SUCEAVA FACULTATEA DE INGINERIE ALIMENTAR SPECIALIZAREA:MIASP

LUCRARE DE DISERTAIE

COORDONATOR TIINIFIC: Prof. Univ. Dr. Ing. SONIA GUTT

ABSOLVENT: COTURBA ECATERINA-MARIA

- SUCEAVA 2011 -

LAPTELE ALTOR SPECII DE ANIMALE SI CONTAMINANTII PREZENTI IN LAPTE

CUPRINS

CAPITOLUL.I. Definia laptelui i generaliti ale acestuia.................................................................. CAP ITOLUL II. Laptele altor specii de animale... II.1. Laptele de oaie. II.2.Laptele de bivoli.... II.3. Laptele de capr.. CAPITOLUL.III. Contaminarea chimic i biochimic a laptelui........................................................ III.1. Contaminarea chimic cu metale grele..... III.2. Contaminarea biochimic cu furaje. CAPITOLUL.IV. Analize ale calitii laptelui............................................................................... CAPITOLUL.V. Concluzii. CAPITOLUL.VI. Bibliografie.................

CAPITOLUL.I. DEFINIIA LAPTELUI I GENERALITI

ALE ACESTUIA Laptele este un lichid de culoare alb-glbuie secretat de glanda mamar a mamiferelor, ce conine toate substanele nutritive necesare pentru hrnirea i dezvoltarea noilor nscui, fiind un aliment ce se stimuleaz uor n organism. Consumul de lapte i produse lactate este considerat avantajos pentru formarea oaselor n perioada de cretere i o soluie eficient pentru reducerea pierderilor din sistemul osos la aduli. Un rol important n realizarea unei alimentaii raionale i dietetice revine laptelui i produselor din lapte. Laptele a reprezentat n decursul miilor de generaii un aliment ce a ridicat nivelul de sntate al populaiei i a scos n eviden c marii consumatori de lapte prezint o mare vigoare fizic, o stare de sntate normal i o c bolile infecioase apar mai rar la cei ce consum lapte. Medicii dieteticieni susin c pinea i vinul reprezint "proza poeziei", n timp ce laptele i fructele reprezint "poezia ei". Alimentaia cu lapte este recomandat ntr-o serie de afeciuni precumtulburrile acute digestive la sugar i copilul mic, n faza a treia, pentru realimentare cu produse dietetice(n afeciunile esofagului, stomacului)n afeciunile hepato-biliare (se consum cu anumite restricii), n alte afeciuni ale tubului digestiv(colit, constipaie cronic), n boli cardiovasculare (insuficien cardiac, hipertensiune arterial), boli renale, (glumerulonefrit, sindromul nefrotic), n diabetul zaharat i n obezitate. Este cunoscut i recunoscut efectul pe care laptele i produsele din lapte l au n prevenirea cancerului de colon. CAPITOLUL II LAPTELE ALTOR SPECII DE ANIMALE II.1. LAPTELE DE OAIE n Romnia laptele de oaie este folosit, n special, la fabricarea brnzeturilor, i ntr-o msur mai redus la fabricarea iaurturilor. Are culoare alb datorit prezenei n stare coloidal a cazeinei . Gustul laptelui de oaie este uor dulceag, plcut, miros specific. Acest miros se datoreaz prezenei n laptele de oaie a unor acizi grai n stare liber (capronic, caprilic). Dac oile nu sunt adpostite, hrnite i ngrijite n mod corespunztor i nu se respect msurile de igien la recoltarea laptelui, atunci poate s aib un miros neplcut de stn , ce este mai accentuat n situaia n care condiiile sunt ntru totul necorespunztoare. Consistena laptelui de oaie este fluid, opacitatea mai pronunat, datorit coninutului sporit n substan uscat. Compoziia chimic i proprietile fizico-chimice Compoziia laptelui de oaie se difereniaz de cea a celorlalte specii de animale de la care se preia laptele pentru prelucrare (vac, bivoli i capr), prin faptul c toi componenii se gsesc ntr-o proporie mult mai mare. Variaia compoziiei laptelui de oaie dintr-o zon de munte, n timpul unei perioade de lactaie

Tabelul 1 Luna VI VII VII IX

Ap% 81,34 81,18 80,26 75,02

Substan uscat % 18,66 18,82 19,74 24,98

din care Grsime 7,78 8,00 8,71 11,66

Proteine 4,81 4,87 5,26 8,90

Lactoz 5,14 4,96 4,82 3,42

Sruri 0,82 0,83 0,87 1,00

Grsimea laptelui de oaie prezint variaii mari,ce se ncadreaz ntre 78%, dar poate ajunge pn la 12%, spre sfritul perioadei de lactaie. Grsimea laptelui de oaie se deosebete de cea a laptelui de vac prin calitile sale gustative, fizice i chimice. Substanele proteice. Laptele de oaie se evideniaz printr-un coninut mai ridicat de substane proteice, n comparaie cu laptele celorlalte specii de animale i care n perioada de lactaie crete de la 4,5 la 9..9,5%. Proteinele din laptele de oaie sunt reprezentate n principal de cazein, ce se caracterizeaz printr-o capacitate sporit de coagulare, rezultnd un coagul dens. Lactoza este componentul ce se menine cel mai constant n timpul unei perioade de lactaie, coninutul acesteia variind ntre 3,5..5,0%. Srurile minerale au un coninut ce se situeaz ntre limtele 0,81,1%, pe tot parcursul lactaiei.Valori ce sunt apropiate de cel al laptelui de vac, din punct de vedere al cantitii. Compoziia chimic medie a laptelui de oaie este : Ap82,2% Substan uscat.....17,8% din care grsime...6,8% substane proteice.......5,7% lactoz.4,5% sruri minerale0,8% Densitatea minim admis de STAS 2418-61 este de 1,033, dar poate varia n timpul perioadei de lactaie ntre 1,034.1,040, n funcie de modificrile ce intervin n compoziia laptelui. Aciditatea maxim admis de STAS 2418-61 este de 24T. Principalele ri productoare de lapte de oaie sunt:Italia, Spania, Romnia i Frana. II. 2. LAPTELE DE BIVOLI Cu creterea bivolilor se ocup populaia din regiunile montoase n Bulgaria, Grecia, dar cele mai mari efective de bivoli sunt concentrate n India i China. Principalul productor al acestui sortiment de lapte este Asia, cu 97%. Laptele de bivoli este folosit la noi n ar, n cea mai mare parte n amestec cu laptele de vac. n unele regiuni ale rii, din laptele de bivoli se fabric brnza telemea i iaurt.

Laptele de bivoli ca i cel de oaie are culoare alb, gust dulceag, miros pronunat specific, datorit coninutului n el a unor acizi grai,volatili n stare liber. Laptele de bivoli se caracterizeaz printr-un coninut mai mare de substan uscat dect cel al laptelui de vac ce variaz ntre 17,5.19,5%, apropiat de cel al laptelui de oaie. Untul obinut din laptele de bivoli are culoarea alb, lipsindu-i pigmenii galbeni, carcteristici untului obinut din laptwele de vac. Coninutul de grsime variaz n limite destul de mari fiind cuprins ntre 5,39,0%. Grsimea laptelui de bivoli are temperatura de topire i de solidificare mai mic dect a grsimii laptelui de vac. Proteinele laptelui de bivoli sunt mai bogate n amoniac i acid glutanic. Substanele proteice ale laptelui de bivoli, au un coninut total de 3,74,3%, formate din cazein 3,23,6% i proteine serice (lacoalbumin i lactoglobulin) 0,5..0,6%. Compoziia chimic medie a laptelui de bivoli este : Ap 81,5% Substan uscat.18,5% din care - grsime.8.2% - substane proteice.....................4,5% - lacotz...5,0% - sruri minerale..0,8% Densitatea minim n laptele de bivoli este de 1,031%, pe cnd aciditatea mixim este de 24T. II.3. LAPTELE DE CAPR Capra este unul din animalele domestice cu cel mai mare randament n producia de lapte. Ea produce anual de 13-15 ori mai mult lapte dect cntrete singur, iar coninutul de proteine lactate din produse lactate este de 8-10 ori mai mare n comparaie cu totalul de proteine din corpul su. Are compoziia asemntoare cu a laptelui de vac, dar se deosebete de acesta printr-un coninut de grsime un pic mai ridicat, n schimb este mai srac n cazein dar mai bogat n lactoalbumin. Laptele de capr are o culoare alb, cu nuan glbuie abia perceptibil, din cauza coninutului redus de caroten, mirosul laptelui este plcut, iar gustul dulce caracteristic speciei. Grsimea este format din globule mai mici dect ale laptelui de vac, motiv pentru care smntnirea acestuia se face mai greu. Compoziia chimic medie a laptelui de capr este : Ap86,7% Substan uscat.....13,3% din care grsime...4,2% substane proteice.......3,9% lactoz.4,4% sruri minerale0,8%

Densitatea minim n laptele de capr este de 1,028%, pe cnd aciditatea mixim este de 19T. Principalele ri productoare de lapte de capr sunt : Frana, Ucraina, Rusia, Italia, Spania. CAPITOLUL.III CONTAMINAREA CHIMIC I BIOCHIMIC A LAPTELUI III.1.CONTAMINAREA CHIMIC CU METALE GRELE Diferitele activiti industriale i traficul pe pist au crescut ceea ce a cauzat o cretere semnificativ n contaminarea mediului. Omniprezena unor poluani din metal, n special Cd i Pb, faciliteaz intrarea lor n lanul alimentar, i astfel, crete posibilitatea de a avea efecte toxice asupra oamenilor i animalelor. Cu toate acestea, activitile agricole, precum utilizarea de ngrminte i irigarea terenurilor, poate fi, de asemenea,o important surs de contaminare a mediului, a produselor alimentare i n cele din urm a produselor alimentare consumate de om (Beretta, 1984; Cerutti, 1999; Casarett i Doull lui, 2000). Laptele reprezint alimentul de baz n alimentaia uman, att n original ct i sub form de diverse produse lactate. Ca o excreie a glandei mamare, se pot transporta numeroase substane xenobiotice (Pesticide, dezinfectante, droguri, metale i diversi contaminani din mediul nconjurtor), care constituie un factor de risc tehnologic pentru produsele lactate comerciale legate de imagine i, mai presus de toate, pentru sntatea consumatorilor. Astzi, consumatorul este mai ambiios dect n trecut i se ateapt ca''laptele'' s fie bogat n substane nutritive, cu mare valoare biologic, dar fr riscuri pentru sntate. Prin urmare, determinarea concentraiilor reziduale de metale n lapte ar putea fi un indicator important''direct'', n funcie de starea de igien a laptelui i / sau aproduselor sale derivate, precum i un indicator indirect'', n funcie de gradul de poluare a mediului n care laptele a fost produs. Au fost efectuate mai multe studii n ceea ce privete contaminarea cu metale n laptele din unele regiuni italiene (Maggi et al., 1975; Gregorio i Siracusano, 1976; Bertolani et al, 1977.; Feller, 1983; Baldini et al, 1990; Pittia et al, 1992;.. CONI et al, 1994, 1995, 1996;. Imparato et al, 1999).S-a constatat c, rezultatele difer n funcie de diferitele zone de prelevare ale probelor i metodele de analiz utilizate. Condiiile de lucru adoptate de determinri de As, Cd, Cr, Cu, Pb, SE i Zn Tabelul 2

Levels of toxic and essential metals in samples of bovine milk from various dairy farms in Calabria, Italy

Acurateea i precizia procedurii analitice (Standard Material de referin: lapte praf BNS-1549) i limitele de detecie Tabelul 3

N: numrul de determinri. e (%): acuratetea datelor, exprimat ca eroare relativ. sr (%): precizie de cinci determinri independente, exprimat ca deviaie standard relativ. Limitele absolute de detecie n ng / ml =[3*S.D. (Control)* Conc. (Stand.)] / absorbie medie de standard. S.D. (Control) = deviaia standard de control. Conc. (Stand.) = cea mai mic concentraie standard folosit (ng / ml). absorbana medie standard = Abs semnal de la cele mai mici concentraii. o concentrare Certificat: Standard Material de referin exprimat n g / g. b concentrare observat:Standard Material de referin exprimat n g / g. Levels of toxic and essential metals in samples of bovine milk from various dairy farms in Calabria, Italy n prezent, nu exist date privind nivelurile contaminrii cu metale grele n laptele din Calabria, o regiune din sudul Italiei, cu un risc industrial foarte sczut sau de poluare auto. n studiul de fa, s-au determinat concentraiile de metale grele din probele de lapte de la unele ferme de lactate din Calabria. ntr-adevr, este necesar s se examineze LMR stabilite de UE i / sau respectiv ADI, pentru a le compara cu rezultatele rapoartelor de literatur (Moreiras et al, 1995;. Biego et al, 1998;. Triphathi et al,. 1999). Materiale i metode 40 de eantioane de lapte de bovine au fost luate de la uger (dup exacte splari cu alcool i ap) la fermele de lapte din Calabria, conservate n containere PET i congelate la 20C pn la analiz. Vacile au fost meninute n circulaie i au avut caracteristicile eterogene ale rasei: vrst i greutate. Dup omogenizare i agitaie, cu un vortex, 10 ml din fiecare eantion de lapte a fost ngheat la 20 C i apoi liofilizat, ulterior 1 g de ngheat,prob uscat a fost amestecat cu HNO3/H2O2 (5:2) i mineralizat ntr-un cuptor cu microunde (MDS model2100, CEM, Matthews, NC, Statele Unite ale Americii; 950F50 W putere la 100%) i reactoare teflon PFA, echipate cu un sistem de reglare a presiunii (prin intermediul unei nave care acioneaz ca un senzor). Dup mineralizare, probele au fost aduse la un volum de 25 ml cu ap ultrapur.Toate vasele de sticl au fost tratate cu o soluie diluat de HNO3 (10%) pentru a preveni contaminarea. Concentraiile din diferite metale au fost determinate prin trei metode de spectroscopie de absorbie atomic

- Analiza de grafit spectrometrie de absorbie atomic cuptor pentru Cd, Cr, Cu, Pb i (Se Salvato et al, 1992.;Alegria et al,1994; Aleixo et al, 2000); - Analiza prin metoda flacr aer-acetilen pentru Zn; - Analiza prin tehnica fierbinte generarea vaporilor pentru As. Spectroscopia de absorbie atomic determinri de Cd, Cr, Cu,Pb i Se ,corectate pentru fundal nseamn efectul Zeeman; au fost efectuate cu un AA Varian model 220/Zeeman Spectrofotometru (Varian Australia, Mulgrave, Victoria, Australia), este dotat cu un singur element lamp cu catod tubular, SpectraAA 220/Zeeman software pentru procesarea electronic a rezultatelor i o Varian autosampler PSD. Pentru aceste investigatii, s-a folosit tuburi de grafit ''Varian''. Soluii tip standard din diferite metale au fost pregtite pentru diluare ncepnd de la concentraii de 1 mg / ml n HNO3 / H2O2 (05:02) pentru a obine concentraiile analitice; fiecare punct din curba de calibrare a fost obinut prin autodiluie cu un autosampler. Pentru determinarea As, am folosit VGA 77 adaptat la un spectrofotometru Varian AA=475,pentru canalul de acid, am folosit HCl (10 M) i pentru reducerea canalului, NaBH4 (0,6%) n NaOH (0,5%), fluxul a fost de 1 ml / min. Probele au fost tratate cu KI 1,0%, n scopul de a reduce arsenicV la arsenicIII. Aceast reducere a durat 50 min la temperatura camerei i 4 min la 70 C. Curbele de calibrare au fost obinute folosind soluii standard la concentraii de 1,5, 3,0 i respective 4,5 ng / ml n HNO3/H2O2 (5:2). Zn a fost determinat de un aer / flacr de acetilen folosind un spectrofotometru Varian AA=475 . Modificatorii Matrix : nitrat de magneziu 1%, monobazici, fosfat de amoniu 10%, clorur de paladiu 0,5% i acid ascorbic 0.056%, cu condiia de Sigma (Italia). Ali reactivi i amestecuri de substane chimice : peroxid de hidrogen 30% oferit de Sigma, ap ultrapura, acid azotic 75% pentru analiza urmelor de metale, cu condiia de J.T. susintor (Backer Mallinckrodt, Milano, Italia). Condiiile experimentale adoptate pentru fiecare metal sunt raportate n Tabelul 2. Datele obinute pentru fiecare metal reprezint valoarea medie a cinci determinri.

Cd, Pb i Ca (metale toxice) n ntregime n laptele crud de bovine (Ag / WW kg) de la fermele de lactate, n Calabria

Tabelul 3

Levels of toxic and essential metals in samples of bovine milk from various dairy farms in Calabria, Italy

Cr, Cu, SE i Zn (metale eseniale) n ntregime n laptele crud de bovine (Ag / WW kg) de la fermele de lactate, n Calabria Tabelul 4

Levels of toxic and essential metals in samples of bovine milk from various dairy farms in Calabria, Italy

Buna practic de laborator (BPL) a fost aplicat n ntreaga ebo i au fost de asemenea analizate procedurile. Pentru toate elementele, concentraiile martor au fost mai mici dect respectivele limite de detecie. Calitatea datelor analitice a fost verificat prin analiza materialelor de referin certificate (Lapte praf Non-Fat a Biroului Naional de Standarde-1549, Gaithersburg) i compararea rezultatelor cu valori certificate. Acurateea i precizia analizei au fost exprimate ca procent de eroare (e) i respectiv abatere standard relativ (sr), (tabelul 2). n scopul de a determina limitele de detecie a unui element, dou soluii au fost pregtite: concentraia primei soluii a fost aproape de limitele de detecie,concentraia celei de a doua soluii

a fost dublu fata de limita concentratiei de detecie .Testul a fost repetat de 12 ori (Tabelul 2). Limitele de detecie au fost n conformitate cu urmtoarea formul: Limita de detecie n ng =ml

n tabelele 3 i 4, sunt raportate procentele de nondetecii geometrice valori medii (GM), mediane i gama pentru fiecare metal Rezultate Acurateea i precizia analizei au fost bune n toate cazurile, confirm valabilitatea metodei utilizate (Tabelul 2). Concentraiile (g/Kg) de metale grele n probele de lapte de bovine din Calabria sunt raportate n tabelele 3 i 4. Concentraiile de metale''toxice'' (As, Cd i Pb) n mostrele noastre de lapte sunt raportate n Tabelul 3. n general, au fost cele mai ridicate niveluri de As(g.m 37.90, gama <0,15 -684.00 g /kg w.w) cu 10% din eantioane fiind nondetectabile. Cele mai sczute niveluri au fost cele ale Cd (GM 0.02, gama <0.01 - 22.80 g/kg), care au fost sub limita de detecie,n aproape toate probele (92,5% din eantioane nondetectate). Nivelurile de Pb sunt prezente n toate probele n concentraii cuprinse 0.10-9.92 g / kg i 1.32 g / kg. Nivelurile de metale ''eseniale'' (Cr, Cu, SE i Zn) sunt raportate n Tabelul 4. Concentraiile cele mai ridicate au fost cele de Zn (GM n 2016, gama <24.73-4961 g / kg) Se (GM 13.24, gama <1.060-110.58 g /kg), Cr (gm 2.03, gama <1.5-82.08 g / kg) i au urmat niveluri de Cu (gm 1.98, gama <0.136-737.58 g / kg). Cu toate acestea, trebuie subliniat c, n analiza noastr de lapte, concentraiile neglijabile (limitele de detecie instrumental) de Se i Zn au fost observate n 5% din probe, de Cr n 85% i de Cu n 60%. Discuie O comparaie a concentraiilor de metale grele n lapte, mostre din Calabria, cu cele raportate de ctre muli autori este prezentat n Tabelul 5. Acest studiu demonstreaz c, n laptele din Calabria,sunt cele mai mari concentraii de arsenic n rndul ''metalelor toxice''. De la o analiz mai detaliat a rezultatelor obinute, se pare c 30% din mostrele de lapte arat un interval de As (242.82-684.00 g / kg) mai mare dect cel raportat de ctre Alais Cerutti (1999), (2000) i Simsek et al. (2000). n total, toate celelalte nivele(interval <0.15-106.02 g / kg) sunt n conformitate cu diferii autori.(Tabelul 5). Nivelurile ridicate de As ar putea fi ca urmare a utilizrii anterioare de paraziticide i dezinfectani de mediu (compui arsenici), deoarece n diverse zone unde sunt situate fermele sunt de asemenea folosite fructe pentru agricultur. Concentraiile de Pb i Cd n toate probele au fost mai mici dect cele raportate n literatura de specialitate naional i internaional (Baldini et al, 1990; Wojciechowska-Mazurek et al,1995; Cerutti, 1999;. Triphathi et al, 1999; Alais, 2000; Simsek et Al, 2000., Martino et al., 2001). Nivelurile de Pb (gm 1.32, intervalul 0.10-9.92 g / kg) au fost n gama de valori raportate de Triphathi et al. (1999) i Martino et al. (2001) (1.70 i respectiv 1.8 g / kg). Cu toate acestea, este de interes special de menionat prezena Pb n toate probele studiate chiar dac nu n concentraii periculoase, care arat cum acest metal este tot mai frecvent gsit n lapte, chiar i n Calabria, care nu este o regiune cu mare activitate industrial. Prezena de Pb n probele de lapte ar putea fi cauzat de diveri factori: transhumani de-a lungul drumurilor

i/autostrzilor,contaminarea furajelor, factori climatici,cum ar fi vnturile,i utilizarea compuilor de pesticide. Prin urmare,este necesar s se monitorizeze acest metal de-a lungul timpului pentru o mai bun clarificare a prezenei sale n lapte. n ceea ce privete Cd, prezena lui n probele de lapte doar trei, cu concentraii de 1.14, 3.42 i respectiv 22.80 g / kg, sunt deosebit de frapante i arat c nu exist Cd-legat de riscurile toxicologice n Calabria. Concentraiile de metale''eseniale'' gsite sunt diferite de cele raportate de ali autori. Dintr-o analiz mai detaliat a acestor rezultate, se pare c 5% din eantioane sunt cuprinse sub limitele de detecie instrumental n timp ce la celelalte probe arat concentraie mai mic de Zn (Gm 2016,gama 294-4961 mg / kg) dect cele raportate n literatura de specialitate (Baldini et al, 1990;. Wojciechowska-Mazurek et al, 1995;.. Campillo et al, 1998; Cerutti, 1999; Triphathi et al, 1999; Alais, 2000; Simsek et al, 2000, Tiecco, 2000.; Martino et al, 2001). Nivelurile de Se(gm 13.24, intervalul 3.42-25.08 g / kg) sunt n linie cu cele raportate de ali autori (tabelul 5), cu excepia unui eantion care a artat o concentraie de 110.58 g / kg. Tabelul 5 Compararea game sau mijloace concentraii (Ag / WW kg) de metale grele n probele de lapte cu referine relative De compl pag 5

Levels of toxic and essential metals in samples of bovine milk from various dairy farms in Calabria, Italy

Doar dou probe (5%), conin niveluri sub limitele de detecie instrumental. n ceea ce privete valorile Cu, este important s se sublinieze faptul c 24 de probe (60%) au prezentat concentraii mai mici decat limitele de detectie instrumentala, 12 probe (30%), niveluri mai mici dect cea raportat n literatura de specialitate i doar 4 probe (10%) o serie de concentraii (406.98-737.58 g/kg) nu cu mult mai mare dect ali autori (Tabelul 5). Concentraii sczute de Cu ar putea fi din cauza Zn coninut n produsele

alimentare, care interfereaz cu sistemul de absorbie de cupru, explicnd astfel prezena unor niveluri sczute ale acestui metal n lapte (Casarett i Doull lui, 2000). n sfrit, n ceea ce privete concentraiile de Cr, este de subliniat faptul c doar 15% (6 probe) au prezentat un nivel semnificativ (n intervalul 2.28-82.08 g / kg) n timp ce 85% au prezentat valori mai joase decat limitele de detecie instrumental. Aceste niveluri sczute gsite de noi sunt n concordan cu cele raportate de ali autori (Tabelul 5). n prezent, nu exist LMR specifice pentru metale grele n lapte; Regulamentul CE nr. 2001/466 stabilete doar o limit de Pb n lapte (LMR= 0,02 mg /kg).Prin urmare, concentraiile de Pb gsite n probele de lapte n Calabria indic faptul c laptele este sigur pentru consumator. Pentru o siguran alimentar mai bun, ar fi recomandabil s se stabileasc LMR pentru diverse metale, nu doar pentru lapte i alte produse lactate, ci pentru toate produsele alimentare. n concluzie, datele merit o atenie deosebit nu numai pentru semnificaia lor, dar mai ales pentru c au fost nregistrate n Calabria, o regiune cu un risc foarte sczut de poluare a mediului din cauza lipsei de industrii i a managementului tradiional al fermelor de lapte. Studiile suplimentare sunt necesare pentru a evalua coninutul''esenial''i metalele grele toxice ,pe un numr mai mare de eantioane de lapte de la diferite ferme din Calabria i s confirme lipsa de posibile riscuri toxicologice n aceast regiune. III.1.CONTAMINAREA BIOCHIMIC CU FURAJE

Productorii de furaje combinate pentru animale utilizeaz diferite tipuri de materii prime pentru furaje.Originea,transportul,transformarea i depozitarea materiilor prime pentru furaje poate duce la contaminarea hranei pentru animale n combinaie cu mai multe alimente patogene (Durand et al, 1990;Whyte et al,2002). Salmonella enterica a fost identificat ca pericol microbiologic major n hrana pentru animale,dar implicarea acesteia pentru sntatea animal i uman rmne neclar (Davies et al., 2001, EFSA, 2006). n rile cu un nivel sczut prevalena Salmonellei n hrana pentru animale este considerat a fi o surs major de agent patogen. Cu toate acestea,este dificil de cuantificat riscul pentru sntatea public asociat cu prezena de Salmonella n furaje n rile cu rate ridicate de prevalen (EFSA, 2008). Nivelurile de contaminare cu Salmonella n furajele combinate variind de la 0% la 6% au fost raportate de unele ri ale Uniunii Europene(UE) (EFSA, 2006). Distribuia de Salmonella n furajele contaminate este neuniform. Protocoalele de eantionare trebuie s fie proiectate conform unei analize statistice adecvate (Legan et al, 2001.). Metoda ISO 6579:2002, cu o sensibilitate de pn la 65% i o specificitate de 97% (Koyuncu i Haggblom, 2009), a fost adoptat de UE ca standard pentru monitorizarea prezenei de Salmonella n probele de hran pentru animale (EFSA, 2008). La nivelul morii contaminarea furajelor cu Salmoella poate fi legat de diveri factori, precum contaminarea praf,prezena vectorilor i condiiile precare de igien (EFSA, 2008). Descrcarea ingredientelor n groapa de admisie creeaz cantiti mari de praf care ar putea transporta Salmonella n sediul (Davies i Wray,1996; Whyte et al, 2002.).

Contaminarea cu Salmonella se poate produce, de asemenea, n cazul n care instalaiile sunt uor accesibile de vectori,cum ar fi insecte, psri sau roztoare (Maciorowski et al, 2006.). n manipularea i prelucrarea ingredientelor se poate rspndi, de asemenea, contaminarea cu Salmonella n special n instalaiile morii n cazul n care sunt frecvent observatepracticile precare de igien din timpul prelucrrii hranei pentru animale (EFSA, 2008). Condiiile de fabricare, precum:umiditatea i temperatura au de asemenea, un efect asupra nivelului de contaminare bacterian n furajele combinate. Granularea nu poate fi capabil s elimine complet contaminanii microbiologici,dar reduce semnificativ ncrctura bacterian n furaje (Hacking et al, 1978; McCapes et al,1989). Riscurile pentru sntatea public asociate cu prezena de Salmonella n furaje combinate, ar putea depinde de serotipurile care sunt implicate (Herikstad et al, 2002;. EFSA, 2008).Actuala int n controlul UE pentru speciile de animale include serotipruri de Salmonella Enteritidis, Typhimurium, Infantis,Virchow i Hadar,deoarece acestea sunt responsabile pentru majoritatea cazurilor de infecie uman (EFSA, 2009). n acest context,scopul acestui studiu a fost de a evalua prevalena de Salmonella enterica n fabricile spaniole de furaje,de a identifica i evalua factorii poteniali de risc asociai cu contaminarea hranei pentru animale. 2. Materiale i metode 2.1. Studiu de proiectare i de eantionare Un studiu transversal a fost realizat n Spania din Octombrie 2007 pn n decembrie 2008.Cadrul de eantionare include cele 1328 de fabrici de furaje nregistrate conform Regulamentului (CE) 183/2005. Datele epidemiologice din literatura de specialitate au fost limitate cu privire la prevalena de Salmonella n fabricile spaniole de furaje.Mrimea eantioanelor a fost calculat pentru a estima prevalena de 50% n fabricile de furaje cu precizie de 99% i ncredere 5% (Kirkwood i Sterne, 2003). Dimensiunea eantionului a fost apoi calculat, i a crescut cu un factor de corecie de 20% din cauza testului de sensibilitate sczut care rezult ntr-un eantion de aproximativ 530 de furaje. Populaia eantionului a fost selectat printr-o metod proporional de eantionare aleatorie stratificat.Mrimea eantionelor a fost proporional fiecrei regiuni autonome lund n considerare numrul de fabrici de furaje i furajele combinate,produse lunar n fiecare dintre ele. n cadrul fiecrui strat fabricile de furaje au fost aleatoriu selectate utiliznd un computer generat aleator tabel(Microsoft Office Excel 2003).Toate probele au fost luate sub supravegherea medicilor veterinari oficiali. Site-urile i tipul de probe care urmeaz s fie investigate precum i numrul de probe prelevate de la fiecare site sau tip de probe au fost decise n funcie de opiniile experilor i susinute de rezultatele nepublicate ale unei analize de risc calitativ efectuate nainte de proiectarea studiului. apte probe de 500g fiecare au fost colectate n fiecare moar de furaje folosind materiale de unic folosin n conformitate cu dispoziiile generale ale Directivei Europene 71/250/CEE adaptate special pentru acest studiu.Protocolul de eantionare a inclus un eantion de praf din instalaiile morii de alimentare, trei eantioane de materii prime pentru furaje i trei probe de furaje combinate de la fiecare dintre fabricile de furaje investigate. Toate eantioanele au fost nsoite printr-un chestionar nchis,proiectate i validate de autori ntr-un studiu-pilot care implic 8 fabrici de furaje cu producie lunar diferit. Chestionarul (disponibil la cerere) a inclus ntrebri referitoare la factorii de risc derivai din literatura de specialitate i mprii n 5 grupe majore (materii prime pentru furaje,furaje faciliti de moar i de construcie,condiii de depozitare, de personal i biosecuritate).

2.2. Analize bacteriologice Probele au fost trimise la laboratoarele regionale desemnate oficial n termen de 48 ore de la colectare. Probele au fost pstrate la temperature mai <de 7 C i au fost procesate n termen de 7 zile de la colectare. Fiecare eantion a fost mprit n dou poriuni (250 g fiecare).O poriune de 25 g a fost folosit ca un eantion final pentru izolarea Salmonellei n conformitate cu metoda ISO 6579:2002 / AMD 1:2007.O singur Salmonella din fiecare eantion pozitiv a fost confirmat izolat i a fost transmis la Laboratorul Naional de Referin (LNR) pentru testare. Salmonella izolat, au fost pstrat ntr-o tripton, laptele degresat i amestecul de glicerin care asigur integritatea tulpinilor pentru cel puin doi ani au fost congelate la -80C. Informaiile culese din chestionare i rezultatele microbiologie au fost stocate ntr-o baz de date.

Rezumatul variabil derivat din chestionar i investigat ca factor de risc potenial n contaminarea cu Salmonella Tabelul 6

# Analiz statistic univariabil. a numai n hrana pentru animale subset material de date. b Numai n praful de la hrana pentru animale moara faciliti subset de date. c Numai n subsetul compus feed de date

2.3.Analiza statistic Prevalena de Salmonella a fost estimat lund n considerare o moar de hran pentru animale; a fost clasificat ca Salmonella pozitiv dac cel puin o colonie Salmonella a fost izolat de la oricare din probele investigate.Prevalena de Salmonella i intervalele de ncredere au fost estimate pe baza unei aproximri normale prin metoda Wilson (Altman et al, 2000.). Asocierea ntre factorii de expunere de categoric i rezultatul "prezena de Salmonella" a fost investigat ntr-o analiz cu un singur nivel de mas de urgen(Semnificaie

determinat utiliznd statistic chi-ptrat). Toate variabilele de expunere cu o valoare a p mai mic dect. 0.25 au fost selectate pentru analiz multivariabil (tabelul 6). Analiza multivariabil a implicat stratificarea setului de date de origine eantion n trei subseturi de date din cauza diferenelor biologice pentru fiecare grup de probe.Modelul de regresie logistic a fost construit la fiecare prelevare de probe specifice subsetului de date statistice, cu ajutorul pachetului de Stata V.10 (Stata Corporation, Timberlake). Primul model exclusiv s-a construit cu date considerate a fi obinute din probe prelevate de la praf a instalaiilor de uzine furajere combinate (n = 607), al doilea model a fost construit cu datele corespunztoare probelor de materii prime pentru furaje (n = 1579) i al treilea model a inclus date din probele de furaje combinate (n = 1658). Strategia model de construire a implicat o selecie de variabile cu test semnificativ de dou valori (p 0,05). Categoria cea mai frecvent de expunere a fiecrei variabile a fost selectat drept categorie de referin. Hosmer i testul Lemesshow au fost folosite pentru a verifica dac se potrivesc modelele finale (Kirkwood i Sterne, 2003). Confuzia a fost evaluat de fiecare dat cnd o variabil a fost sczut de la model. O variabil a fost considerat ca un factor derutant, modificat sau brut pentru variabil independent cu 10% sau mai mult (Kirkwood i Sterne, 2003). Toi parametrii au fost estimai cu 95% . Serotipuri de Salmonella cel mai frecvent izolate Tabelul 7

Rezultate 3.1. Prevalena Salmonella 523 de fabrici de furaje au fost n mod individual investigate. Dintre acestea, 240 (45,9%),produc mai puin de 1000 de tone pe lun, 159 (30,4%),produc ntre 1000 i 5000 de tone pe lun, 56 (10,7%), produc ntre 5.000i 10.000 de tone pe lun i 68 (13,0%), produc mai mult de 10.000 de tone pe lun. Un total de 3844 probe au fost analizate, Salmonella a fost izolat din 185 probe (4,8% 95% CI: 4.2-5.5). n stratificarea eantioanelor pozitive,Salmonella a fost detectat n 3,5%(95% CI: 2.5-4.4) probe din materii prime pentru furaje, 3,3% (95% CI: 2.4-4.1) probe furaje combinate i 12,5% (I 95%: 9.8 - 15.2) din probe de praf luate din instalaiile de alimentare a morii.Salmonella a fost izolat n probele de la 144 fabrici de furaje diferite; astfel prevalena estimat de fabricile de furaje contaminate cu Salmonella a fost 27,5% (CI 95%: 23.9 - 31.5).Atunci cnd numai mostrele de furaje combinate au fost luate n considerare 47(8,9% CI 95%: 7.1 - 11.2) din toate fabricile de furaje investigate au avut cel puin un eantion pozitiv. Au fost identificate 65 de serotipuri diferite, Mbandaka (n = 14, 7,6%) i Anatum (n =13, 7,0%)au fost cele mai frecvente. Printre cele 5 serotipuri cel mai frecvent detectat,a fost serovarul numai cu semnificaie pentru sntatea public,dup cum se menioneaz de ctre UE, a fost Typhimurium

(n =10,5,4%) (Tabel 7). Stratificarea n funcie de tipul de eantion,serovarurile de Salmonella, Anatum (n= 9,10,7%) i Mbandaka (n = 6, 7,1%) au fost cele mai comune serotipuri n praf de la instalaiile de uzine furajere combinate. Aceste serotipuri au fost, de asemenea, cel mai frecvent izolate n probele de furaje combinate (n = 5, 8,5% n ambele cazuri).n probele de ser din material de furaje Salmonella,Senftenberg (n = 8, 13,7%) a fost cea mai frecvent.

Descrierea numeric i procentul de probe pozitive pentru fiecare dintre categoriile de variabile expunere nu sunt asociate cu prezena de Salmonella Tabelul 8

N = numrul de probe de la fiecare categorie. a compus numai din subsetul de date al furajelor . 3.2.Rezultatele univariable i analiz multivariabil Analiza univariabil a relevat faptul c variabilele de sezonalitate (p = 0.239), nivelul de producie lunar (p=0.792)i furajele combinate destinate animalelor (p = 0.964)nu au fost asociate cu prezena de Salmonella.n analiza multivariabil, variabila regiunii autonome (p = 0,008) a fost considerat un potenial factor de confuzie n asocierea dintre factorii de expunere i rezultatul prezenei de Salmonella (Tabelele 6 i 8 ). Primul model de regresie logistic exclusiv de prelevare de probe include site-ul ca o variabil de expunere (Tabelul 9). Groapa de admisie a fost site-ul cu cea mai mare probabilitate de izolare a Salmonellei, avnd n vedere cotele de Salmonella izolate n praf de la coolerele morii,furaje ca baz de referin(OR=6,4; 95% CI:2.7 - 15.1). Hosmer i statistica Lemesshow au artat o bun potrivire a modelului (p= 0.875). Al doilea model de regresie logistic a fost construit utiliznd ca variabil de expunere material folosit n producia de furaje. Regiunea autonom variabil nu a fost meninut n ecuaia final. Acest model a artat c seminele de bumbac au avut de patru ori mai puin ansele de a fi contaminate cu Salmonella dect fin de soia (OR = 3,8; 95% CI: 1.7-8.3). S-a constatat,de asemenea, c cereale de orz(OR=0,1; 95% CI:0.01 - 0.8) i porumb (OR = 0,1; 95% CI: 0.01-0.5) au fost mai puin susceptibile de a fi contaminate dect fina de soia (Tabelul 5). Hosmer i test Lemesshow au indicat o bun potrivire a modelului (p= 0.909). Frecvena de Salmonella n diferite locaii investigate n moara de furaje i ieirea primului model de regresie logistic. Tabelul 9

N = numrul de probe prelevate de la fiecare moara de furaje Al treilea model include regiunile autonome ca un factor derutant, iar prezentarea variabil a furajelor combinate, ca o expunere variabil. Furajele combinate nongranulate au avut de 8 ori mai puin cote de a fi contaminate dect furajele combinate granulate (OR = 8.2; I 95%: 2.5 - 26.6) (Tabelul 11). Hosmer i test Lemesshow au indicat faptul c modelul de montat date este n mod adecvat (p = 0.869).

Frecvena de Salmonella n materiile prime pentru furaje investigate i ieirea celui de-al doilea model de regresie logistic Tabelul 10

N = numrul de probe prelevate din fiecare ingredient Frecvena de Salmonella n cele dou tipuri de prezentare a furajelor combinate investigate i ieirea celui de-al treilea model de regresie logistic Tabelul 11

N = numr de eantioane prelevate pentru fiecare categorie. a Aici au fost apte regiuni autonome(Asturias, Baleares, Canarias, Cantabrra, Extremadura,La Rioja i Madrid; N= 242) dar nu au fost gasite eantioane pozitive

Sigurana alimentar este esenial pentru pstrarea sntii publice.Punerea n aplicare a abordrii "holistice"de la ferm la "furculi" de-a lungul lanului alimentar este necesar pentru a garanta c alimentele destinate consumului uman sunt sigure (EFSA,2006). Furajele contaminate cu Salmonella sunt o surs important de bacterii pentru lanul alimentar (EFSA, 2008). Cu toate acestea, exist controverse cu privire la rolul pe care fabricile de furaje l joac n epidemiologia de Salmonella(Usera et al,2001,Hggblom,comunicare personal).De menionat este faptul c, acest studiu este primul sondaj pe scar larg de estimare a prevalenei de Salmonella n fabricile de furaje din Spania. Metoda de eantionare utilizat, mpreun cu numrul mare de probe investigate prevede o sensibilitate ridicat n detectarea contaminrii cu Salmonella n fabricile de furaje. n acest studiu s-a confirmat faptul c, un sfert din fabricile investigate produc cel puin un eantion pozitiv.Cnd au fost utilizate numai probe de furaje combinate pentru a estima prevalenta,procentul fabricilor de furaje pozitive a fost mult mai mic.Rezultate similare au fost obinute n studiile anterioare (Whyte et al., 2002, EFSA, 2008).Ali autori, de asemenea,au subliniat c riscul de contaminare a furajelor combinate este redus la nivelul morii i numai dup ce ajung furajele la ferm devine relevant.(Hernndiz, comunicare personal). Nivelul de contaminare cu Salmonella i serotipurile de cultur din materiale vegetale,hran pentru animale, au fost similare cu cele publicate n literatura de specialitate (EFSA, 2008).Cu toate acestea,prevalena n aceste surse de proteine a fost mai mic dect rezultatele obinute n cadrul studiilor efectuate n Suedia i Norvegia,n cazul n care au fost gsite niveluri de contaminare de pn la 30% (Weirup, 2006).Serotipurile de Salmonella cu semnificaie pentru sntatea public n conformitate cu regulamentele UE, au fost observate la un procent mic de probe investigate,indicnd semnificaia limitei poteniale pentru sntatea public. Salmonella ser. Enteritidis, serovarul dominant n fermele spaniole de gini outoare i n focarele de salmonella(EFSA, 2007),au fost izolate doar ntr-un eantion de praf de la instalatiile de uzine furajere combinate. Aceast prob a fost luat din zona gropii de admisie a unei mori, care a fost amplasat pe un ser. Salmonella Enteritidis pozitiv. n mod similar,ser Salmonella Typhimurium a fost izolat de la groapa de aport ntr-o moar integrat la o ferm de porcine Salmonella-pozitiv. mprejurimile morii de furaje ar putea fi o surs important de Salmonella iar fabricile de furaje ar trebui s nu fie situate n apropiere de alte activiti agricole (EFSA,2008). Informaiile despre riscul de a introduce Salmonella la efectivele de animale ca urmare a produciei de furaje combinate nu sunt suficiente(EFSA,2008).n acest studiu s-a constat c cele mai multe dintre fabricile de furaje care au produs mai puin de 1000 tone/luna au avut faciliti la ferm, dar analiza statistic nu a reuit s identifice asociaiile de contaminare cu Salmonella.Sezonul prelevrii de probe nu a putut fi statistic asociat cu prezena de Salmonella n furaje, n ciuda focarelor umane de salmoneloz, fiind puternic legat de producia n lunile de var(Kinde et al, 2005). Regiunea autonom n cazul n care moara de furaje a fost localizat s-a considerat ca fiind o variabil confundat n analiza multivariabil a trei subseturi de date. Diferenele observate n analiza univariabil legate de prezena Salmonellei s-ar putea explica prin diferenele tehnologice dintre regiuni. Cu toate acestea,aceast variabil n cele din urm a fost reinut doar n ecuaia subsetului de date a furajelor.Tipul de prob a fost problema-cheie atunci cnd s-a analizat prezena de Salmonella. Frecvena de a gsi Salmonella a fost mai mare n eantioanele de praf prelevate de la instalaiile de alimentare a morii dect cele prelevate de la materii prime sau

de furaje combinate. Acest lucru ar putea fi din cauza testului mai sensibil atunci cnd probele de praf includ i particule fine (EFSA,2008). Rezultate similare au fost obinute prin servicii daneze de supraveghere la fabricile de furaje (Brondsted i Rask, 2008).Aceste concluzii subliniaz importana planurilor de monitorizare pentru sisteme de curenie i igienizare n cadrul programului riguros HACCP (EFSA, 2008). Groapa de admisie a fost site-ul de eantionare cu un risc crescut de izolare a Salmonellei n comparaie cu alte site-uri de prelevare a probeloa rer investigate.Este un loc unde acumularea de praf este uor de gsit i,de asemenea, un loc foarte atractiv pentru vectori, cum ar fi insecte,roztoare,psri (EFSA, 2008). Nu s-a reuit a se investiga influena combaterii duntorilor n contaminarea cu Salmonella, din cauza lipsei de variaie n populaia de studiu.Studiile suplimentare ar trebui s ia n considerare relaia dintre eficiena programelor de combatere a duntorilor i prezena Salmonellei n zona gropii de admisie. Mai multe studii au identificat fina de soia ca materie prim pentru furaje i avnd cel mai mare risc de contaminare cu Salmonella (EFSA, 2008). Acest studiu a mai investigat de asemenea un numr mare de probe de materii prime i semine de bumbac identificate ca materii prime pentru furaje,cu cea mai mare probabilitate de a fi contaminate cu Salmonella. Proprietile hidroscopice ale seminelor de bumbac,care cresc coninutul de ap pot explica acest rezultat ca un coninut de ap ce favorizeaz creterea de Salmonella. De asemenea,este posibil ca roztoarele s fi fost mai atrase de seminele de bumbac dect de alte materiale de furaje i,prin urmare, a fost o ans mai mare de contaminare cu Salmonella,datorit prezenei roztoarelor. Susceptibilitatea animalelor pentru Salmonella variaz n funcie de speciile de animale i serotipurile de Salmonella implicate (EFSA, 2008).n cadrul programelor de control oficial al furajelor EFSA se recomand ca speciile destinate furajelor combinate s fie luate n considerare (EFSA, 2008).Rezultatele din acest studiu a indicat faptul c efectivele de animale destinate speciilor nu au fost asociate cu prezena de Salmonella. Aceste rezultate ar putea s confirme faptul c aplicarea standardelor de igien n fabricile spaniole de furaje nu variaz n funcie de speciile de animale ci n funcie de destinaie.Cu toate acestea,numrul mare de probe nu relev nici o informaie cu privire la destinaia animalelor. Granularea a fost recomandat ca metod eficient de contaminare pentru hrana animalelor (Hacking et al, 1978;. McCapes et al, 1989;. EFSA, 2008). Temperaturi de 80C, vor fi suficiente pentru a elimina Salmonella din hrana animalelor (Blankenship et al., 1984b),excepie fcnd atunci cnd exist o ncrctur bacterian extrem de mare (EFSA, 2008). Rezultatele obinute au fost n concordan cu avizul granular care este capabil s reduc contaminarea cu Salmonella n furajele combinate.Cu toate acestea,eficacitatea de granulare ,ca un tratament de micorare a rspndirii de Salmonella la nivel de ferma este pus sub semnul ntrebrii de unii autori. Hrana granulat pentru animale a fost identificat ca factor principal de risc asociat cu fecale ,vrsare de Salmonella n fermele spaniole de porci (Garcia et al, 2009.). Datele arat c serotipurile gsite n animalele i oamenii din Spania (Echeita et al, 2007;. EFSA, 2009b) au fost rare n probele investigate n studiul prezent i, prin urmare, este puin probabil ca fabricile de furaje s poat aciona ca o surs relevant de contaminare cu Salmonella.

5.Concluzie Studiul efectuat arat c Salmonella este frecvent izolat de fabricile de furaje spaniele,dar este mai puin probabil s fie izolat de furajele combinate la nivel de moar. n plus, rolul pe care fabricile de furaje l joac n epidemiologia uman sau animal salmoneloza poate fi limitat, n special avnd n vedere serotipurile gsite n mod obinuit n animale sau focare umane. Msurile de control la nivel de uzine furajere combinate ar trebui s ia n considerare toate etapele de producie ale furajelor. Potrivit rezultatelor acestui studiu, pentru a obine o msur mult mai sensibil i un cost efectiv al controlului trebuie s se adopte o abordare bazat pe risc.

CAPITOLUL.IV. ANALIZE LA CALITATEA LAPTELUI Stocarea extins de alimente crude frigorifice permite o cretere a microorganismelor psychrotrophice, ageni de alterare n aceste produse. Unele psychrotrophs sunt, de asemenea, patogeni (Champagne, Laing, Roy, si Mafu, 1993). bacteriile Gram-negative psychrotrophic domin microflora laptelui crud frigorific, cu Pseudomonas, fiind cel mai abundent. Cele mai multe dintre aceste bacterii nu supravieuiesc tratamentelor termice aplicate laptelui n timpul prelucrrii normale. Cu toate acestea n timpul creterii, n laptele crud, ele produc unele proteaze extrem de rezistente la cldur i lipaze extracelulare.Cantitatea acestor enzime se coreleaz cu deteriorarea senzorial ,calitatea laptelui i unele produse lactate (Suhren, 1989; Srhaug & Stepaniak, 1991; Stepaniak & Srhaug, 1995). Unele dintre defectele cauzate de y enzimele din psychrotrophs Gram-negative sunt gelation, dezvoltarea de off-arome din lapte pasteurizat i UHT, si pierderi de randament la fabricarea brnzeturilor (Shah,1994). Niveluri semnificative de enzime extracelulare i defectele de consecin, n general, apar atunci cnd numrul de bacterii poate depi 106 ufc mL-1(Richter, 1979; Shah, 1994).Cantitatea de produse fabricate i numrul consecvent a probelor de analizat n metodele de azi din industria produselor lactate, i a cererii de ncredere sunt facile pentru a determina att calitatea laptelui crud cat i a produselor finite. Metodele standard de contaminare sunt consumatoare de timp. n cazul psychrotrophs, culturile trebuie s fie incubate timp de 8-10 zile la 7 C (Cousin, Jay, si Vasavada, 1992). Prin urmare, metodele rapide pentru numrarea de microorganisme sunt de o importan capital. Numrul de teste rapide pentru estimarea calitii microbiologice a alimentelor a crescut n mod considerabil n ultimii ani. Multe teste au fost propuse, inclusiv pentru metode bazate pe recunoaterea de anticorpi i de acid nucleic, o gam larg de biochimice i enzymatice,prin filtrare cu membran i impedan (Vasavada, 1993; Fung, 1994, 1997; Patel, 1999; Entis et al. , 2001). n ciuda numrului de metode rapide care au fost dezvoltate, metodele sunt n general nesatisfctoare pentru lactate. Industria produselor lactate ca multe dintre celelalte prezint lips de precizie pentru populaiile bacteriene mixte, sunt prea scumpe, inexacte sau complexe, i multe sunt nc prea lente pentru a oferi rezultate utile productorului. n plus, o serie de metode rapide disponibile n cadrul produselor lactate industriale sunt folosite pentru a detecta microorganismele, mai degrab dect a le enumera. Enumerarea, mai degrab dect detectarea, este o cerin foarte important n prelevarea probelor de calitate a laptelui. Pentru toate aceste motive, cteva dintre

metodele actuale au ctigat acceptare larg, cu excepia tehnicii Bactoscan (Foss electrice, Danemarca), pe baza citometriei n flux, care este nregistrat ca o metod de rutin de ctre autoritile multor ri. Un test de aminopeptidaze, bazat pe activitatea enzimei ataat la peretele celular bacterian, a fost dezvoltat de identificarea bacteriilor Gram-negative de Cerny (1978). Aceast activitate poate fi cuantificat cu ajutorul L alanina p-nitroanilidei (incolor), ca substrat, care este desfcut enzimatic la p-nitroanilin (galben). Acest compus poate fi detectat att instrumental prin msurarea absorbanei, ct i vizual prin dezvoltarea culorii n probe. O metod bazat pe activitatea aminopeptidazei a fost dezvoltat pentru a evalua calitatea microbiologic a crnii refrigerate (n Pe'rez de Castro, Asensio, Sanz, si Ordo "~ EZ, 1988; Alvarado, RodriguezYunta, Hoz, Garc'a de Fernando, & Ordo "-n ~ EZ, 1992). Acest lucru a permis determinarea unei mulimi bacteriene de aproximativ 104 - 105 ufc cm -2 n aproximativ 2,5 ore, i niveluri mai ridicate dect 107 ufc cm- 2, o culoare galben intens suficient pentru a fi detectat cu ochiul liber. Cu toate acestea, acest test nu are sensibilitatea necesar atunci cnd se aplic pentru lapte; reglementrile pentru lapte n multe ri, inclusiv Uniunea European, stabilesc o limit de 105 ufc mL-1 pentru lapte crud destinat consumului uman (Uniunea European, 1992). Aplicarea acestei metode presupune ca bacteriile s fie concentrate la niveluri detectabile. n carne, acest lucru poate fi uor de realizat prin splarea succesiv a suprafaei cu o soluie salin steril. Lucrarea prezint rapoarte ale adaptrii metodei de aminopeptidaze pentru estimarea calitii microbiologice a laptelui crud refrigerat , prin mbuntirea recuperrii bacteriene i creterea sensibilitii metodei de a ajunge la standardele UE. 2. Materiale i metode 2.1. Probe de lapte Probele de lapte au fost colectate de la patru fabrici de produse lactate la nivel local i transportate sub refrigerare la laborator. Probele s-au meninut la 5 C pentru o sptmn i au fost analizate fiecare timp de 24 h pentru a detecta bacteriile psychrotrophice i activitatea de aminopeptidaze. Analizele s-au fcut n trei exemplare. 2.2. Bacterii ce conteaz Psychrotrophys a fost enumerat pe plci de geloz (APC) (Condalab, Madrid), la 7 C dup 8 zile de incubare (Cousin et al, 1992.). O spiral plac de sistem (Eddy-Jet, iul-Instruments, Barcelona) a fost folosit pentru a se inocula plcile i au fost stabilite pe un contor automat(Countermat-Flash, iul-Instruments, Barcelona). 2.3. Extracia bacteriilor din lapte O soluie de compensare de lapte a fost folosit pentru mbuntirea separrii de bacterii din probele de lapte (reactiv A) (Promega Corporation, Madison, WI). Aceast soluie este disponibil n comer ca parte a testului de lapte luminiscent Enliten, folosit pentru determinarea organismelor totale viabile (McClelland & Pinder, 1994). Cantiti diferite de reactiv A ,au fost adugate n lapte pentru a produce diferite proporii de lapte: Un reactiv, a fost analizat, iar cele mai bune rezultate au fost obinute la adugarea a 4 ml reactiv la 10 ml de lapte. Probele au fost amestecate i se centrifugheaz la 4 C pentru 15 min. Crema tampon care s-a format pe partea de sus i supernatantul separat dup centrifugare au fost ndeprtate cu grij n timp ce extractul bacterian la partea de jos a tubului a fost resuspendat ntr-un mL de 0.1M tampon Tris-HCl, pH 8,0. 2.4. Determinarea activitii de aminopeptidaze Extractul concentrat bacterian resuspendat (1 ml) a fost mprit n dou loturi de 0,5 ml, folosit pentru testare, i proba martor. L alanine-p-nitroanilide (Sigma, St Louis, MO, Statele Unite ale Americii; 250 ml de 0,1 g 100 ml o soluie apoas) a fost adugat eantionului i amestecul a fost incubat cu agitare continu la 37 C pentru 2 h. Proba martor a fost meninut la 1C i dup 2 ore,

a fost adugat 250 L soluie de Lalanine-p-nitroanilide, de 0,1 mL 100 mL-1. Att proba ct i martorul au fost filtrate prin filtre de 0.45 mm (Millipore Corporation, Bedford, MA). Dou metode au fost folosite pentru a determina valoarea de p-nitroaniline lansate n probe. Metoda direct a constat n msurarea direct a absorbanei probelor la 390 nm (A390) ntr-un Hitachi U2000 spectrofotometru cu fascicul dublu (Hitachi Ltd., Tokyo, Japonia). Pentru metoda indirect, 600 ml de soluie 20% de acid acetic ,600 mL de 0,2g100 mL-1 nitrit de sodiu, 300 mL de 2 g100 mL-1sulfamat de amoniu i 300 ml de 0,1 g100 mL-1 n-(1-naftil 300 )etilendiamin au fost adugate n probe i au fost msurate la absorbia de 540nm (A540). Culoarea probelor a fost nregistrat, incolor pn la galben, n primul caz i de la roz la roz intens n al doilea caz. n ambele cazuri (metoda direct i indirect) o curb standard de corelare a concentraiei de p-nitroanilin i absorban a fost pregtit cu soluii diferite de p-nitroanilin (Sigma). Activitatea aminopeptidazei a fost exprimat n mg de p-nitroanilin , eliberat de bacterii dup incubare la 37 C pentru 2 h. O diagram a procedurii este prezentat n Fig 1. Analiza statistic Regresia liniar i analiza varianei, folosind Sigma Stat 1.1. au fost folosite pentru a compara numrul de microbi cu suma de p-nitroanilin lansat n probe. 3. Rezultate i discuii Fig. 2 prezint corelarea liniar ntre log10 ufc mL-1 din lapte i log10 concentrare pnitroanilina lansat n probe utiliznd metoda direct n intervalul 3 *103-2* 108 ufc mL-1. Fig. 2 arat, de asemenea, ecuaia de regresie i coeficientul de corelaie obinute din analiza datelor.Alte rezultate obinute n analiza de regresie sunt raportate n Tabel 1. Un coefficient simplu de corelaie mare (r = 0,93) a fost observat ntre bacteriile ce conteaz i activitatea de aminopeptidaze corespunztoare, cu o eroare standard de 70.414 log10 ufc mL -1 pentru date precise. Cele mai multe eantioane de lapte (85%), care conineau bacterii ce conteaz ntre 2 *104 i2 *105 ufc mL- 1 au demonstrat o activitate suficient de aminopeptidaze care s elibereze cantiti mici, dar spectrofotometrul cuantificabil de p-nitroanilin (0.4 - 1 mg), dei era n mediul de reacie a rmas incolor. 80% din probe variaz intre 2*105 - 1.25 *107 ufc mL- 1, suma de p-nitroanilin a fost suficient pentru a dezvolta o culoare glbuie, care ar putea fi detectat cu ochiul liber, i a corespuns la o concentraie de p-nitroanilin de1-4 mg.

Fig. 1. Reprezentarea schematic a testului aminopeptidase pentru evaluarea calitii microbiologice a laptelui crud.

Fig. 2. Relaia (ale logarithmicsc) ntre p-nitroanilina de concentrare i numrul de bacterii psychrotrophice din laptele crud (n = 92) folosind testul aminopeptidase directe (msur a nitroanilinei p lansat n probele de la 390nm). Toate probele cu un numr de bacterii mai mare de 1.25* 107 ufc mL-1 au dezvoltat o culoare galben intens, datorit volumului mare de prezen de p-nitroanilin n probe (<4 g). Sensibilitatea metodei directe a fost stabilit ca fiind mai 2* 105 ufc mL-1. O valoare de absorbie 0.1 a fost considerat fiabil i respingtoare, deoarece ar putea rezulta din erori de echipament sau tehnica de lucru. Limita de detecie obinut poate fi considerat ca suficient pentru a respinge un lot de lapte, la sosire n fabrica de prelucrare, dei este nc deasupra nivelului de bacterii admisibil de ctre reglementrile UE (105 ufc mL-1). Din punct de vedere practic, apariia culorii galben n probe ar putea fi folosit ca baz pentru respingerea de lapte de proast calitate, deoarece indic niveluri de bacterii cu un numr mai mare de 5*105 ufc mL- 1, dei un rezultat negativ ar putea nsemna c proba nu respect standardele UE de 105 ufc mL-1.

Rezultatele obinute prin metoda indirect pentru a detecta cantitatea de p-nitroanilina lansat n probe sunt prezentate n Fig. 3. O regresie liniar a fost observat ntre bacteriile ce conteaz i activitatea de aminopeptidaze n intervalul 2 *103-5*107 ufcmL-1. Coeficientul de corelaie a fost 0.95, cu o eroare standard de 70.376. Aproximativ 15% din probe au dezvoltat o culoare roz deschis, corespunztoare la cantiti mici de p-nitroanilin (mai mic dect 0,6 mg) i ncrctur bacterian sub 2 *104 ufc mL-1. Aproximativ 40% din probe au dat absorbanei o valoare corespunztoare 0.6-1.2 g de pnitroanilin i cuprinse ntre 2*104 i 5 *105 ufc mL -1. Aceste probe au artat o culoare roz la mijloc. Toate probele care conin mai mult de 5*105 ufcmL -1 au dezvoltat o culoare roz intens, care corespunde mai mult cu 1,2 g de p nitroanilin. Corelaia obinut ntre bacteriile ce conteaz i valoarea de p-nitroanilin detectat n probe a fost mai mare prin metoda indirect (r = 0,95) dect n metoda direct. Sensibilitatea metodei a fost stabilit ca fiind 2*104 ufcmL-1. Din nou, o valoare de absorbie 0.1 a fost considerat fiabil i aruncat. Limita de detecie obinut respect reglementrile UE pentru calitatea microbiologic a laptelui crud. Deoarece culoarea roz este suficient de intens la aceste niveluri, o scal de culoare ar putea fi stabilit n scopul de a evalua vizual calitatea microbiologic a laptelui. Ambele teste directe i indirecte de aminopeptidaze au artat valori de corelaie cu numrul de bacterii similare cu cele oferite de alte metode rapide, de exemplu, direct Tehnica epifluorescent filtru (abil) (r = 0.91 la 0.94) (Pettipher, Mansell, McKinnon, i vrul 1980; Beck & Hehir, 1982), PCR-ELISA (r = 0,94) (rrez Gutie ", et al, 1997a). i teste de Bioluminiscenta (r = 0,93) (O'Toole, 1983). Ambele metode (direct i indirect) au dat valori de corelaie mai mari dect cele ale amoebocyte Limulus Procedura de lysate (LAL) (r = 0.71-0.85) (Episcopul & White, 1986; White, 1993) i metoda de citometrie in flux (FCM) (r = 0,91) (Gunasekera, Attfield, i mnzat 2000). Tehnicile de Impedan (r = 0.96) (Firstenberg-Eden & Tricarico, 1983) i ELISA (r = 0.96) (Gutie'rrez et al., 1997b), dau mai bine dect corelaiile de testare de aminopeptidaze.

Fig. 3. Relaia (ale logarithmicsc) ntre concentraia de p-nitroanilin i numrul de bacterii psychrotrophice din laptele crud (n= 54), folosind testul de aminopeptidaze indirecte (msur a absorbanei la 540nm dup adugarea la probele de acid acetic, nitrit de sodiu, sulfamat de amoniu i-n (1-naftil) etilendiamin n sumele corespunztoare).

Valorile obinute n analiza de regresie ntre concentraia de p-nitroanilin din probe (log10) i numrul de bacterii psychrotrophice din lapte (log10) (metoda indirect) Tabelul 12

Valorile obinute n analiza de regresie ntre concentraia de p-nitroanilin din probe (log10) i numrul de bacterii psychrotrophice din lapte (log10) (metoda indirect) Tabelul 13

n timp ce cele mai multe dintre metodele de mai sus-menionate sunt capabile s detecteze numere bacteriene peste 104 ufcmL -1, n general, cele mai precise rezultate sunt obinute cu un numr de peste 105 ufcmL-1. n unele cazuri, este necesar o incubaie preliminar pentru creterea populaiei bacteriene i sensibilitatea metodei (Firstenberg-Eden & Tricarico, 1983; Mikolacjik, 1983; Episcopul & White 1986,; White, 1993). n ceea ce privete timpul necesar pentru analiz, testul de aminopeptidaze dureaz aproximativ 2,5 ore. Procedura de LAL, abil, Bioluminescence i fluxul citometric necesit mai puin timp (aproximativ 0.5 - 1 h), dar aceste metode implic manipularea complex a probelor i necesit costuri ridicate,echipamente i reactivi.

Msurarea Impedanei i testul ELISA au nevoie de mai mult timp pentru execuie i sunt, de asemenea, costisitoare. Alegerea unei metode rapide de evaluare a calitii microbiologice a laptelui depinde de tipul de testare, natura probelor, precizia dorit, numrul de probe care urmeaz s fie testate,disponibilitatea personalului calificat i echipamentele de laborator. Testul de aminopeptidaze n formatul su indirect este potrivit pentru monitorizarea calitii laptelui crud ntr-un timp rezonabil n conformitate cu standardele UE. Mai mult, este o metod de cost ridicat, deoarece necesit doar echipament de obicei utilizat n multe laboratoare (de exemplu, o camer de incubare sau o baie termostatat, o centrifug i un colorimetru / spectrofotometru). Metoda aminopeptidazei ofer, de asemenea, posibilitatea de a evalua cu ochiul liber calitatea microbiologic de culoare dezvoltat n probe, o scal de culoare stabilit anterior. Aceast metod este uor de efectuat i poate fi efectuat de ctre tehnicieni de laborator unispecializai.