PCR en Temps Réel

PCR en temps rel
Jalila RAHOUI
Plan
Dfinitions & Principes Technologies de dtection Les agents se liant lADN double brin Les sondes fluorescentes Hydrolyse de sondes : Taqman assay Hybridation de 2 sondes : HybProbes Balises molculaires : Molecular Beacons Amorces scorpion : Scorpion primers Applications Conclusion
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Plan
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PCR classique
Polymerase Chain Reaction Raction en chane par polymrase
Mthode de biologie molculaire d'amplification d'ADN partir dune simple copie dune squence dacides nucliques, cette squence peut tre spcifiquement amplifie
PCR classique
Volume rduit de 20 50 l : ADN Matrice Amorces dNTP (les 4) Taq polymrase Tampon
tapes dune PCR classique
1er Cycle
1. Dnaturation
tapes dune PCR classique

2. Hybridation
3. longation
2me Cycle
n Cycle
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PCR classique
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PCR Classique
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PCR en temps rel
Mme principe que la PCR classique Diffrence :
Permet le suivi de la fluorescence mise pendant la raction avec un

indicateur de la production des amplicons durant chaque cycle :
loppos de la PCR classique o les amplicons ne sont dtects qu la
fin du processus.
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PCR en temps rel

Base sur la dtection et la quantification dun reporter fluorescent.
Laugmentation du signal fluorescent est directement proportionnelle la quantit damplicons gnrs durant la raction de PCR.
En observant la quantit de fluorescence mise chaque cycle, il devient possible de suivre la raction PCR durant sa phase exponentielle o la premire augmentation significative dans la quantit damplicons est en corrlation directe avec la quantit initiale de la matrice originale cible.
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Cycle seuil
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P CR en t em ps r el V S P CR c l as s i qu e
PCR en temps rel PCR classique
Spcificit Sensibilit
Risques de contaminations Mesure Rapidit Rsultats
+++ +++
Rduit En continue +++ Quantitatifs
+ +
+++ En point final + Qualitatifs 16
Plan
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Les agents se liant lADN double brin

Deux classes :
1. Les agents intercalants :
Bromure dthidium BET YO-PRO-1 SYBR Green I
2. Les agents se fixant au sillon mineur minor groove binders :

le Hoeschst 33258
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Exemple
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Le SYBR Green I est lagent le plus frquemment utilis. Ses avantages :

conomique, facile utiliser et possde plus de sensibilit que le bromure
dthidium sans inhiber la raction damplification.
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Le SYBR Green I prsente le dsavantage des faux positifs :
1. 2. 3.
Il peut se fixer nimporte quelle molcule dADN double brin Mauvais appariement Lmission de fluorescence peut tre biaise par la masse molculaire de lADN amplifi par un amplicon plus long qui fixera davantage de molcules fluorescentes par rapport un amplicon plus court dans la mme raction.
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Plan
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Hydrolyse de sondes : Taqman assay
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Hydrolyse de sondes : Taqman assay
La spcificit dhybridation entre la sonde fluorescente et sa squence dADN cible rduit significativement lmission de fluorescence non spcifique due des mauvais appariements ou des dimres damorces.
Les sondes fluorescentes possdent comme avantage par rapport aux agents se liant lADN : - Une spcificit accrue ; - et une capacit de multiplexage.
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Plan
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Hybridation de 2 sondes : HybProbes
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Hybridation de 2 sondes : HybProbes
Cette technologie possde une grande spcificit et permet aussi une

grande flexibilit dans le design des sondes.
De plus, comme les sondes ne sont pas hydrolyses, elles sont

rutilises chacun des cycles.
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Plan
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Balises molculaires : Molecular Beacons
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Avantages :
Spcificit : permet de dtecter les diffrences de squences au nuclotide prs. Technologie efficace pour la dtection et le criblage grande chelle des SNPs (single nucleotide polymorphisms). Les sondes sont dessines pour demeurer intactes durant la raction damplification et doivent se rhybrider la cible chaque cycle pour mesurer le signal. Constituant ainsi un autre avantage par rapport aux sondes Taqman hydrolyses chaque cycle.
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Dsavantages :
Le design des sondes dhybridation : Un design optimal du tronc des balises molculaires est crucial Avec un design non adquat, le tronc pourrait adopter une conformation diffrente qui loignerait le fluorochrome metteur de lenvironnement immdiat du suppresseur rsultant ainsi en une population de sondes mal supprimes et un bruit de fond important.
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Plan
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Amorces scorpion
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Amorces scorpion : Scorpion primers
Ses sondes prsentent une grande sensibilit et une grande spcificit. Ce systme est prfr lors de PCR comportant des cycles courts. Leur conception est dlicate et leur prix lev.
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Plan
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Applications
Dtection et la quantification rapide dagents pathognes viraux, bactriens et parasitaires.
Analyse dexpression de gnes, de mutations, de rponse cellulaire diffrentes substances, de gnotypage, Essais dexpression et de distribution pour la thrapie gnique Quantification du nombre de copies dans une collection de cellules et dvaluation dADN rsiduel.
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Plan
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Conclusion
PCR maison toujours prsentes dans de nombreux laboratoires
mais avec une tendance rapide vers lapparition de kits commerciaux

et lautomatisation en amliorant la standardisation et la
reproductibilit des rsultats.
Nouvelle
gnration
de
termocycleurs
et
robots
permettant
lapplication en routine.
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Rfrences
Elyse Poitras et Alain Houde, 2002. La PCR en temps rel: principes et applications. Reviews in Biology and Biotechnology, Vol.2, No 2, pp.211.
Ameziane N., Bogard M., Lamoril J. 2006. Principes de biologie molculaire en biologie clinique. Elsevier. ISBN : 2-84299-685-2 Morrison, T. M., Weis, J. J. and Wittwer, C. T. 1998. Quantification of low-copy transcripts by continuous SYBR green I monitoring during amplification. Biotechniques : 24, 952-962. http://www.ilm.pf/PCRtempsreel
39
Merci pour votre attention
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Mme principe que la PCR classique Diffrence :

Permet le suivi de la fluorescence mise pendant la raction avec un

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Les agents se liant lADN double brin

2. Les agents se fixant au sillon mineur minor groove binders :

Les agents se liant lADN double brin

Les agents se liant lADN double brin

Le SYBR Green I est lagent le plus frquemment utilis. Ses avantages :

Les agents se liant lADN double brin

Le SYBR Green I prsente le dsavantage des faux positifs :

Hydrolyse de sondes : Taqman assay

Hydrolyse de sondes : Taqman assay

Hybridation de 2 sondes : HybProbes

Hybridation de 2 sondes : HybProbes

Cette technologie possde une grande spcificit et permet aussi une

De plus, comme les sondes ne sont pas hydrolyses, elles sont

Balises molculaires : Molecular Beacons

Balises molculaires : Molecular Beacons

Balises molculaires : Molecular Beacons

Amorces scorpion : Scorpion primers

mais avec une tendance rapide vers lapparition de kits commerciaux

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