C i t o m e t r a

d e

F l u j o

DEFINICION
LA CITOMETRA DE FLUJO ES UNA TCNICA DE ANLISIS CELULAR MULTIPARAMTRICO, QUE PERMITE ANALIZAR DE MANERA OBJETIVA CARACTERIASTICAS FISICAS Y BIOLOGICAS DE LAS CELULAS EN SUSPENSIN A UNA VELOCIDAD APROXIMADA DE 500 A 4000 CELULAS POR SEGUNDO.

PARMETROS DETECTADOS
FORWARD SCATTER ( FSC )
Luz refractada en ngulo cnico pequeo (0-10) que casi coincide con la direccin de la luz incidente. Es proporcional al que produce la refraccin.

tamao de la partcula

FSC

FUENTE DE LUZ INCIDENTE

SSC

SIDE SCATTER (SSC)

Luz refractada en ngulo recto. Es proporcional a la estructura interna de la partcula.

complejidad de la

PARMETROS DETECTADOS
FLUORESCENCIA
Relacionada a caractersticas antignicas de la clula ( FL-1, FL-2,

FL3,......) FL3
PerCP PE-Cy5

Antigeno-3

FL2
PE PI

Antigeno-2

FL1
FITC EGFP EYFP Alexa 488

Antigeno-1

CONCEPTOS BSICOS
ESPECTRO ELECTROMAGNETICO

El espectro visible a la vista humana se encuentra entre los 400nm a 700 nm

CONCEPTOS BSICOS
FLUOROCROMO Son molculas qumicas que absorben luz a una determinada longitud de onda y emiten a otra diferente. En CMF los Ac-Mo. estn conjugados con fluorocromos siendo la intensidad de fluorescencia detectada por el citmetro directamente proporcional al nmero de molculas unidas al Ag

La diferencia entre la longitud de onda de absorcin y emisin se denomina Stokes shiff.

CONCEPTOS BSICOS
ANTICUERPOS MONOCLONALES
SON ANTICUERPOS ESPECIFICOS PARA UN SOLO ANTIGENO. EN CMF ESTOS Ac. MONOCLONALES ESTAN UNIDOS A FLUOROCROMOS.
FLUOROCROMO

RECONOCIMIENTO ESPECIFICO

Complejos Ag-Ac

FUNCIONAMIENTO DEL CITOMETRO DE FLUJO

COMPONENTES DE UN CITOMETRO DE FLUJO

SISTEMA DE FLUIDOS

- Inyeccin de la muestra - Cmara de flujo

SISTEMA OPTICO

- Fuentes de luz - Detectores

SISTEMA ELECTRONICO

- Amplificador-convertidor - Sistema informatico

SISTEMA DE FLUIDOS

CREA UN FLUJO LAMINAR EN EL SENO DEL FLUIDO DE ARRASTRE. LAS PARTICULAS SON ARRASTRADAS DE FORMA DEFINIDA.

BOMBA DE AIRE

REGULADOR DE PRESIN

FILTRO

CAMARA DE FLUJO

CONTROLADOR DE FLUJO DE MUESTRA

CONTENEDOR DE BUFFER

CONTENEDOR DE DESHECHOS

TUBO CON MUESTRA

SISTEMA DE FLUIDOS

ENFOQUE HIDRODINAMICO PRODUCE UN TORRENTE UNICO DE PARTICULAS

SISTEMA OPTICO
La ptica de lectura, compuesta por las lentes de recoleccin de luz emitida luego de la interaccin entre el haz del lser y las partculas y el sistema de filtros para direccionar longitudes de onda especficas hacia los detectores correspondientes.

Absorcin

TIPOS DE FILTROS OPTICOS

Interferencia

SISTEMA OPTICO
Detectores
Fotomultiplicadores (PMT): Se usan para la
deteccin de la seal de fluorescencia (FL1, FL2, FL3FL4) y luz dispersada a 90 grados (SSC).

Fotodetectores diodos: Se usan para detectar la dispersin frontal de la luz (FSC).

SISTEMA OPTICO
PMT 4

PMT 3

Sample Dichroic Filters

PMT 2 PMT 1

Flow cell

SSC FSC
Bandpass Filters
PMT 1

Laser

SISTEMA ELECTRONICO
Convierte todas las seales de luz detectadas en seales electrnicas que son almacenadas en el ordenador (computador)

Creacin de las seales de voltaje

CITOMETRO DE FLUJO
FACSCAN FACSCALIBUR

FACSCANTO

FACSARIA

Sorting celular
Permite separar fsicamente, poblaciones de clulas o partculas previamente reconocidas por su tamao o granulosidad y la fluorescencia de sus marcadores.

Sorting electrosttico

Sorting celular
Los tipos de separacin que se realizan mediante citometra de flujo son: - sorting de poblaciones celulares en base a sus tamaos (FS) y granulosidades (SS). - sorting de linfocitos en base a marcadores de expresin. - sorting de ncleos de clulas tumorales en base a su contenido de DNA. - sorting de clulas vivas en base a parmetros metablicos. - sorting de clulas vivas/muertas en funcin de su afinidad a colorantes vitales/letales.

PRESENTACION DE LOS DATOS

histogramas

2D-plot

PRESENTACION DE LOS DATOS

Contour diagram

200

400 600 Forward Scatter

800

1000

200

400 600 Forward Scatter

800

1000

PRESENTACION DE LOS DATOS

Density plot

3D-PLOT

ANLISIS DE LOS DATOS

Eje Y SSC COMPLEJIDAD CELULAR

Granulocitos
R7

Monocitos Linfocitos
0 200 400 600 Forward Scatter 800 1000

INTERPRETACION DEL FSC y el SSC

Eje X FSC TAMAO CELULAR

ANLISIS DE LOS DATOS

INTERPRETACION DE LA FLUORESCENCIA

+
FL2
(FITC, PE, PerCP..etc)

++

+ + ++

Positivo simple para FL1 Positivo simple para FL2 Doble positivo para FL1 y FL2

+
10 0 10 1 10 2 Mouse IgG1 FITC 10 3 10 4

FL1 (FITC, PE, PerCP..etc)

ANLISIS DE LOS DATOS

GATE CD45/SIDE

CD45: ANTIGENO
COMUN LEUCOCITARIO

GRANULOCITOS Complejidad celular MONOCITOS LINFOCITOS

10 0 10 1 10 2 CD45 APC 10 3 10 4

FL4

ANLISIS DE LOS DATOS

One-Color Cell Analysis
Control Negativo Dot-plot Histograma

R1

PE
10 4

10 0

10 1 10 2 10 3 Mouse IgG1 FITC

10 4

10 0

10 1

10 2 CD5 PE

10 3

10 0

10 1

10 2 CD5 PE

10 3

10 4

FITC
R1
10 0 10 1 10 2 CD7 FITC 10 3 10 4

10 0

10 1 10 2 10 3 Mouse IgG1 FITC

10 4

10 0

10 1

10 2 CD7 FITC

10 3

10 4

Fluorescencia

ANLISIS DE LOS DATOS

Control Negativo

Dot-plot

Histograma

R1

PerCP
10 4

1 00

1 01 1 02 1 03 M o u s e Ig G 1 F IT C

1 04

10 0

10 1

10 2 CD3 P e rCP

10 3

1 00

1 01

1 02 C D 3 P e rC P

1 03

1 04

R1

APC
10 4

10 0

10 1 10 2 Mouse IgG1 FITC

10 3

10 4

10 0

10 1

10 2 CD45 APC

10 3

10 0

10 1

10 2 CD45 APC

10 3

10 4

Fluorescencia

ANLISIS DE LOS DATOS

Two-Color Cell Analysis
Control Negativo

Control Negativo

Clulas CD8+
10 0 10 1 10 2 10 3 Mouse IgG2a PE 10 4

10 0

10 1 10 2 10 3 Mouse IgG1 FITC

10 4

Clulas CD4+

Clulas CD38+ HLA-DR+ Clulas CD38+

FL1

FL3

10 0

10 1

10 2 CD4 PE

10 3

10 4

10 0

10 1

10 2 CD38 PE

10 3

10 4

FL2

FL2

ANLISIS DE LOS DATOS

Three-Color Cell Analysis

Clulas CD45+

10 0

10 1

10 2 CD45-PerCP

10 3

10 4

Clulas CD4+ Clulas CD3+

Clulas CD3+ CD4+

10 0

10 1

10 2 CD3-FITC

10 3

10 4

Clulas CD3+

APLICACIONES DE LA CITOMETRIA DE FLUJO

INMUNOFENOTIPIFICACION DE SUBPOBLACIONES LINFOCITARIAS T CD4, CD8,

EN PACIENTES HIV POSITIVOS.

INMUNOFENOTIPIFICACION DE LEUCEMIAS AGUDAS , CRONICAS Y LINFOMAS ENUMERACION, IDENTIFICACION DE CELULAS stem cell CD34 ANALISIS MULTIPARAMETRICO DEL CONTENIDO DEL DNA Y FASES DEL CICLO
CELULAR.

DETECCION Y CUANTIFICACION DE
(CITOQUINAS)

PROTEINAS INTRACELULARES

ESTUDIOS DE LA FUNCIN INMUNE APOPTOSIS ESTUDIOS CINTICOS (FUNCIN CELULAR) ANLISIS PLAQUETARIO (ENFERMEDAD CORONARIA) DETECCIN DE MICROORGANISMOS (BACTERIAS, PARSITOS) ANLISIS DE MUESTRAS AMBIENTALES (GIARDIA, CRYPTOSPIRIDIUM)

INMUNOFENOTIPIFICACION
Es la identificacin y cuantificacin de distintas poblaciones celulares en base a la expresin diferencial de marcadores de membrana.

ANLISIS EN CITMETRO

INMUNOFENOTIPIFICACION

RECUENTO DE SUBPOBLACIONES DE LINFOCITOS T

IDENTIFICACIN DE SUBPOBLACIONES CELULARES EN LA HEMATOPOYESIS

NIVELES DE LINFOCITOS T EN PACIENTES CON VIH IMPLICACIN EN LA RESPUESTA INMUNE CELULAR GRADO DE INMUNOSUPRESIN

DIAGNSTICO Y CLASIFICACIN DE ENFERMEDADES HEMATOPOYTICAS LEUCEMIAS AGUDAS Y CRNICAS LINFOMAS INMUNODEFICIENCIAS DETECCIN DE ENFERMEDAD MNIMA RESIDUAL ENUMERACIN DE PRECURSORES HEMATOPOYTICOS Stem cell DIAGNSTICO DE ENFERMEDADES CONGNITAS PLAQUETARIAS

INMUNOFENOTIPIFICACION

MUESTRAS BIOLGICAS
SANGRE PERIFRICA MDULA SEA LIQUIDO CEFALORAQUDEO (LCR) LAVADO BRONCO ALVEOLAR LIQUIDO ASCTICO GANGLIO TEJIDO LINFOIDE AMIGDALA TIMO

RECUENTO DE SUBPOBLACIONES DE LINFOCITOS T : en pacientes HIV+

INMUNOFENOTIPIFICACION

El recuento de clulas CD4 se usa junto con la carga viral (CV) para evaluar el estado de salud del paciente seropositivo. Para determinar cundo iniciar tratamiento antirretroviral de Alta Actividad (HAART). Las current guidelines for antiretroviral therapy de la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) recomienda iniciar HARRT: Estadio I y recuentos de linfocitos T CD4 inferiores a 200 clulas/mL Estadio III y recuentos de linfocitos T CD4 inferiores a 350 clulas/mL Estadio IV independientemente del recuento de linfocitos T CD4. Para el seguimiento durante la terapia HAART. Evaluacin de la respuesta inmune celular.

INMUNOFENOTIPIFICACION
LYSE - NO WASH
ABSOLUTE COUNTS USING TRITEST / TRUCOUNT

R2
+ 3 5 ) 6 , 3 9

, C 0 D 0 1 8 3

R4R4 R2 R1
10 0 10 1 10 2 CD45-PerCP 10 3
R1 4 10

2 9 7 2 1 , 6 5 1 1 0 6 5 , 9 8

1 4 , 5 7

R3
10 0 10 1 10 2 CD3-FITC 10 3 10 4

10 0

10 1

10 2 CD3-FITC

10 3

10 4

total # of of beads per test total # beads per test # CD4 cells/L # of events in Absolute Count bead region test volume test volume

# of events in quadrant # of events in quadrant containing cell population containing cell population

297 959

2540 50

15,00 cel/ml

RECUENTO DE SUBPOBLACIONES DE LINFOCITOS T : en pacientes pos-trasplante

INMUNOFENOTIPIFICACION
SEGUIMIENTO DURANTE TERAPIA INMUNOSUPRESORA DESPUES DEL TRASPLANTE DE ORGANOS SOLIDOS: HIGADO, RION, PULMON. DETECCION TEMPRANA DE RECHAZO AGUDO

R1

10 0

10 1

10 2 CD45-PerCP

10 3

10 4

INMUNOSUPRESION

10 0

10 1

10 2 CD3-FITC

10 3

10 4

10 0

10 1

10 2 CD3-FITC

10 3

R4

10 4

CONCLUSIONES
1. Nuestros resultados sugieren el utilizar la CV como un marcador predictivo a la hora de iniciar la terapia antirretroviral sin importar el tipo de tratamiento, lo cual concuerda con investigaciones realizadas por otros autores Mellors y col. 1996, Romera y col. 1998. En relacin a la progresin a SIDA la CV se sita como el marcador de eleccin con mayor valor predictivo de progresin a diferencia del recuento de linfocitos T CD4+, en los resultados de nuestro estudio se pudo demostrar mediante un anlisis de rangos establecidos en el Laboratorio que pacientes que iniciaron su terapia antiretroviral con valores de carga viral entre los rangos de log CV 5-5.99 el 25% progresaron a SIDA mientras que los pacientes con recuento de CD4 menor a 100 celulas, no muestran diferencias estadsticamente significativa con respecto al grupo de pacientes con recuento de CD4 entre 300 -400 celulas. Es de importancia sealar que descenso del nmero de linfocitos T CD4+ es una consecuencia del aumento de la carga viral y que tienen una importancia decisiva para la supervivencia y el desarrollo a SIDA.

2.

3.

IDENTIFICACIN DE SUBPOBLACIONES CELULARES EN LA HEMATOPOYESIS

INMUNOFENOTIPIFICACION

CD 45 -APC

Linfocitos B CD19+ CD45+

10 0

10 1

CD 19 - FITC

10 2 CD20 PE

R2

10 3

10 4

DIAGNSTICO Y CLASIFICACIN DE ENFERMEDADES HEMATOPOYTICAS LEUCEMIAS, LINFOMAS, ETC.

INMUNOFENOTIPIFICACION
LLA-B Pre-B

R1

10 0

10 1

10 2 CD45 APC

10 3

10 4

10 0

10 1

10 2 CD34 PerCP

10 3

10 4

10 0

10 1

10 2 CD10FITC

10 3

10 4

10 0

10 1

10 2 CD19 PE

10 3

10 4

DIAGNSTICO Y CLASIFICACIN DE ENFERMEDADES HEMATOPOYTICAS LEUCEMIAS, LINFOMAS, ETC.

INMUNOFENOTIPIFICACION
LLA-T Madura

10 0

10 1

10 2 CD45 APC

10 3

10 4

10 0

10 1

10 2 CD4 PE

10 3

10 4

10 0

10 1

10 2 CD7 FITC

10 3

10 4

10 0

10 1

10 2 CD10 FITC

10 3

10 4

ENUMERACIN DE PRECURSORES HEMATOPOYTICOS Stem cell0

INMUNOFENOTIPIFICACION
P A CHE CO URIB E S .P 3 0 -1 0 -7 .0 0 1

PACHECO URIBE S.P 30-10-7.001

CD45 CD34

100

101

102 103 CD45 FITC

104

1 00

1 01

1 02 CD3 4 P E

1 03

1 04

PACHECO URIBE S.P 30-10-7.001

PACHECO URIBE S.P 30-10-7.001

Stem cells = %CD34+ de CD45+ = Viabilidad=

21.89 cel/uL 0.12% 100.00%

R6

R7

100

101

102 103 CD45 FITC

104

200

400 600 800 Forward Scatter

1000

CONCLUSIONES
1. EL ESTUDIO DE MARCADORES INMUNOLGICOS POR CITOMETRA DE FLUJO PERMITE HACER UN DIAGNSTICO DIFERENCIAL DE LA LEUCEMIA HAIRY CEL DE OTROS PROCESOS LINFOPROLIFERATIVOS Y OTRAS POBLACIONES CELULARES NORMALES CON MORFOLOGA SIMILAR (RINSHO K ET AL, Blood (1997) 89: 2008-14.

2.

LA ACENTUADA EXPRESIN DE CD103+, CD11C+ Y CD25+ PARA NUESTROS CASOS REPORTADOS SUGIERE UN APORTE DIAGNSTICO PRECISO Y ESPECFICO DE UNA HAIRY CELL CLSICA CON EXPRESIN DEL PAN DE MARCADORES DE LINAJE LINFOIDE B CD22+, CD20+ Y CD19+

3.

EL USO DE CD45/CD103/CD11C/CD25 SON DE GRAN UTILIDAD PARA DIFERENCIAR LAS CLULAS ATPICAS EN LA LEUCEMIA HAIRY CELL DEL RESTO DE POBLACIONES CELULARES, POR SU POSICIN Y POSITIVIDAD A LOS MARCADORES INMUNOFLUORESCENTES EVIDENCIADOS EN LAS GATES CD45/CD103/CD11C/CD25 RESPECTIVAMENTE.