Markeri genetici si proteomici in AD

Tehnici de genetica moleculara si proteomica

Genele critice in AD si repartitia lor cromozomala
Cromozomii purtatori ai genelor critice in AD
Cariotipare clasica- nu este relevanta in analiza indivizilor suspectati AD
Citogenetica moleculara
Citogenetica moleculara si fluorescenta obtinuta in urma hibridizarii in situ a
cromozomilor (FISH-Fluorescent in situ hybridization)
ofera informatii despre organizarea genelor;
ajuta cercetatorii sa localizeze si detecteze alterarile cromozomale, cum ar
fi rearanjamentele, deletiile; acestea altereaza morfologia cromozomala
care insa nu e vizibila prin metoda de cariotipare clasica;
informatiile referitoare la aceste aspecte de instabilitate genomica sunt
utile in diagnosticul unor boli de reproducere, oncologie etc
Metode de genetica moleculara
A. RESTRICTIA ADN
Southern blotting
(hibridizarea ADN cu sonde marcate formate din fragmente ADN)
Southern blotting. DNA este tratat cu enzime de restrictie; fragmentele ADN rezultate sunt fragmentate printr-un
gel de agaroza; dupa separarea electroforetica se poate marca ADN cu bromura de etidiu; probele ADN
nemarcate se denatureaza in catene separate. Gelul astfel tratat se amplaseaza pe un suport cu hartie de filtru
saturat cu tampon avand tarie ionica mare (se supune fortelor de suctiune prin cpilarele h de filtru, pentru
blotarea fragmentelor ADN in dreptul pozitiei de migrare in gelul initial). Pe gel se plaseaza h de nitroceluloza
sau un filtru de nylon, peste care se aseaza un tesut pentru a initia procesul de adsorbtie. Catenele de ADN sunt
stopate de h de nitroceluloza. Pozitia fragmentelor ADN pe hartie reflecta pozitia ADN in gel, dupa fractionaarea
initiala prin electroforeza. Aceste fragmente sunt analizate prin hibridizarea cu sonde marcate (monocatenare,
care complementeaza secventa omoloaga in fragmentul ADN de nalizat)
B. Amplificarea ADN, metoda PCR
Principiul metodei PCR
Curbele tipice in RTPCR
Rezultatele RTPCR
Secventierea ADN: marcare si amplificare,
electroforeza
Microarray
Chip de detectie fluorescenta a secventei ADN
C. Analiza ADN/ARN/Proteine: western blotting
D. Metode biochimice-metabolomice
hplc
Echipamente si etape in desfasurarea analizei HPLC
E. Proteomica:Principiul MS
Spectrometria de masa este o tehnica utila in analiza structurilor
chimice subtile ale moleculelor si compusilor bioactivi.
Are valoare de validare a secventei in aminoacizi a proteinelor,
peptidelor/oligopeptidelor si in acelasi timp in validarea modificarii
lor postranslationale (epigenetice) precum atasarea grupei
metil/acetil/ubiquitil, sumoil etc in resturi de aminoacizi speciali
pentru definirea unui genotip represiv/activ transcriptional
MALDI- TOF principiul de detectie a proteinelor fractionate prin HPLC
Abordari actuale proteomice
Vizeaza utilizarea metodelor high-throughput
prin utilizarea chip-urilor cu aranjamente de proteine marcate (array)
in vederea studiului structurii si functiilor proteinelor si identificarea unor proteine noi intr-
un material biologic prin spectrometrie de masa;
In acest mod se realizeaza activitati de cercetare, iar proteinele candidat pentru un diagnostic pot
fi validate
Detectia de rutina se poate realiza ulterior prin metode genetice, chimice sau imunochimice
Metode si tehnici de proteomica in sistem microarray
actualmente se disting
prin capacitatea de
automatizare,
computerizare,
miniaturizare,
dispunere a sondelor in
aranjamente de tip
array-pe chipuri
Profil proteomic obtinut prin western-blotting
in studiile bolilor neurodegenerative
Vizualizarea formelor Abeta agregate si solubile prin tehnici imagistice (A) si
prin tehnici imunochimice (hibridizare de tip Western blotting (B)
A
B
Microarray
Principiul microarray
Copyright restrictions may apply.
Britschgi, M. et al. Arch Neurol 2009;66:161-165.
Expression patterns of Alzheimer disease (AD) signature proteins discriminate between plasma
samples from patients with AD and controls
METODE EPIGENETICE
MSPCR-PCR specific de metilare-
estimeaza gradul de metilare in situ-intr-o gena sau fragment reglator de gena (promotor)
GENOTIPARE de susceptibilitate
(SNP-single nucleotide polimorfism)
personalizare
SNP-mutatia punctiforma intr-o alela care se regaseste mai frecvent (peste 1%)
la nivel populational (o mutatie familiala are frecventa mai mica decat 1%)
Asigurarea stabilitatii genomice/metilomului
in functie de aportul nutritional/stil de viata/genotipul personalizat (SNP-uri
care controleaza activitatea enzimelor implicate in metabolismul grupei metil)
Influenta dietei bogate/sarace in folati (donori de grupe metil)
si a activitatii enzimei critice MTHFR asupra proceselor de metilare ADN si
implicit asupra stabilitatii genomice
Utilitatea markerilor genetici polimorfici
SNP
SNP pot fi indicative pentru raspunsul unei populatii purtatoare a unei
alele specifice fata de:
stimuli ambientali si
anumiti patogeni sau
susceptibiltati la diverse boli.
Sunt markeri utili in dezvoltarea de scheme de diagnostic in algoritmi si
in scheme de tratamente personalizate
Metabolismul colinei
Metabolismul colinei. Enzimele sunt reprezentate prin coduri numerice EC :
1.1.99.1, colin dehidrogenaza
1.2.1.8, betaina-aldehid dehidrogenaza;
2.1.1.5, betaina-homocisteina S-metiltransferaza;
2.1.1.13, metionin sintaza
2.1.1.17, fosfatidiletanolamina N-metiltransferaza;
2.1.1.37, ADN (citozina-5-)-metiltransferaza
2.3.1.6, colina O-acetiltransferaza
2.5.1.6, metionina adenosiltransferaza
2.7.1.32, colin kinaza
2.7.7.15, colin-fosfat citidiltransferaza cytidylyltransferase;
2.7.8.2, diacilglicerol colinfosfotransferaza3.1.1.4, phospholipase A2;
3.1.1.5, lizofosfolipaza
3.1.4.2, glicerofosfocolin fosfodiesteraza
3.1.4.3, fosfolipaza C
3.1.4.4, fosfolipaza D;
3.3.1.1, adenozilhomocisteinaza
THF, tetrahidrofolat; PtdEtn, fosfatidiletanolamina
Deficienta in colina afecteaza dezvoltarea creerului
Gena MTHFR
Locus cromozomal 1p36.3
DNA codificator: 2,2kb , 11 exoni
Produsul genei: enzima MTHFR 656AA;
74,5kDa
Forma activa este un dimer cu 2 domenii
majore- N-terminal (catalitic) si C- terminal
(reglator)
Polimorfismul C677T in gena MTHFR
Lxooul 4 . 677 C - - - 1, alaoloa - - - valloa
LfecLul. forma Lermolablla, locLablla, a eozlmel
HomozlgoLll 11 . prezloLa o acLlvlLaLe mal claba V1HFP -
J6-6O faLa de cea oormala aceacLa forma ecLe
acoclaLa cu cooceoLraLle mare de HomoclcLeloa
Pollmorflcmul 1298C polymorpHlcm lo geoa
Lxooul 7. 1298 A ---C, gluLamaL ---alaoloa
HomozogoLll CC - prezloLa o ccadere claba a acLlvlLaLll 6O)
-Nu ecLe acoclaL cu crecLerea HooceoLraLlel lo Hclc
-LfecLul. de oblcel ecLe lo combloaLle cu efecLul pollmorflcmulul
C6771
-HeLerozlgoLll cu ambele pollmorflcme. prezloLa o crecLere
cemolflcaLlva a Hclc, lo parLlcular- lo coodlLllle uoel cooceoLraLll
ccazuLe de folaLl
Metoda-Reverse hybridization - pentru analiza
polimorfismelor in gena pentru MTHFR C677 si A1298
A- homozigota pentru MTHFR 1298C Mut
B- heterozigota pentru MTHFR C677 WT si MTHFR 677T Mut
C- heterozigota pentru MTHFR A1298 WT si MTHFR 1298C Mut
D- homozigota ptr MTHFR 1298C Mut
E- homozigota ptr MTHFR C677 WT
F- homozigota ptr MTHFR A1298
SNP-MTHFR-C677T este
foarte comun.
-Cca 40% din populatie este
homozigota pentru tipul salbatic
C677,
-45% este heterozigota pentru
ambele alele C677 si T677; iar -
-cca 15% sunt homozogoti
purtatori ai alelei cu mutatia
T677.
Factorii epigenetici studiati: procesele de metilare ADN. La nivel global, un
proces de instabilizare genomica este frecvent asociat cu hipometilarea ADN.
La nivel local, in gene critice, procesul de metilare ADN aberant este asociat
cu hipermetilarea promotorilor.
Metoda de estimare a hipometilarii globale ADN utilizeaza perechi de enzime
isoschizomere ex. (MspI/HpaII) si este abordata pentru estimarea
comparataiva a profilelor de restrictie a ADN genomic.
Hipometilarea aberanta ADN global este frecvent asociata cu aneuploidii si cu
fenomene de anafaze timpurii sau disocieri promature de cetromeri (cromatide
surori)-PCD.
Metoda de estimare a hipermetilarii (methylation specific PCR-MSPCR) este
deseori asociata cu silentierea aberanta a unor gene critice precum cele care
sunt implicate in metabolismul si activitatea hormonala. O astfel de gena
critica in cancerogeneza si in imbatranire este gena pentru receptorul de
estrogen (ESR). Hipermetilarea promotorului acestei gene a fost asociata cu
cancerul mamar, endometrial si cu imbatranirea.
ACE- angiotensin converting enzyme (peptidyl-dipeptidase A)
1
Locuc cromozomal . 17q2J.J
Pegluoea A0N codlflcaLa. 21 kb -26
exool
Producul geoel ACL. eozlma ACL,,
cooLloe1JO6 aa,, ecLe o pepLlda cu rol de
cemoallzare lo axa raa
cooLloe doua domeoll caLallLlce
C-Lermloal reprezloLa approxlmaLlv 76
dlo capaclLaLea caLallLlca
N-Lermloal-ecLe foloclL lo loacLlvareaL
bradykloloel, oeuroLeocloel cl a
cubcLaoLel-P
Pol. ecLe o eozlma proLeollLlca cooverLecLe
forma loacLlva a aogloLeocloel ll loLr-o
forma acLlva vacocoocLrlcLoare) ,
loacLlveaza bradykloloa cl kallldloa
vacodllaLaLoare)
ACE-structura 3D
A. Titia Lely 2007
Polimorfismul genei ACE: insertie-deletie
(I/D) a unui segment de baze de
dimensiunea 287 pb in intronul 16
Genotipul ACE DD a fost asociat cu concentratia crescuta in plasma a
enzimei ACE circulante, ceea ce determina conversia mai eficienta a
angiotensinei I la II
Pattern-ul electroforetic al polimorfismelor ACE
I/D
L- Ladder
ID- heterozigot (insertie/deletie)
DD- homozigot (deletie)
II- homozigot (insertie)
Bolile neurodegenerative, precum boala Alzheimer nu pot
fi inca diagnosticate pe baza abordarilor standardizate
genetice, biochimice, epigenetice, metabolomice
Metoda gold-standard- imunohistochimia aplicata tesutului
de creer postmortem
Preventia, monitorizarea progresiei bolilor
Cercetare/validare gene-proteine candidat
Abordarea GWAS:
Genome wide association screening
Multe gene/multifactorial/complex/algoritmic/modele matematice
Abordari microarray