IMPORTANA TESTELOR ADN PENTRU IDENTIFICAREA PERSOANELOR

Drd. Mihai ulescu Universitatea de Medicin i Farmacie Timioara

Until now, through, the application of DNA technology to forensic problems have been solved more than 50,000 cases worldwide. In forensic science, DNA analysis has become the new form of scientific evidence and has come under public scrutiny and the demand to show competence. More and more courts admit the DNA based evidence. There are two main applications of DNA analysis in forensic medicine: criminal investigation and paternity tests. In this article we present background information about the application of DNA analysis to paternity tests, as well as mathematical models commonly applied to its evaluation1.

Introducere Pn acum dou decenii cercetarea genetic a diferitelor cazuri specifice medicinei legale s-a fcut prin analiza markerilor serologici clasici. Pentru aceasta s-au folosit grupele sanguine, sistemul HLA, proteinele polimorfe i enzimele, cercetate prin metode imunologice sau electroforetice. Aceti markeri genetici nu au dat niciodata rezultate suficient de concludente, mai ales n cazurile n care probele analizate erau n cantiti minime sau erau degradate, fapt des ntlnit n medicina legal. n plus, n afara analizei sngelui, celelalte probe, cum ar fi prul, saliva sau sperma, nu puteau fi analizate dect limitat. Dup o perioad iniial de dispute (i inexactiti tiinifice) (Lewin, 1989; Norman, 1989), amprentarea ADN a devenit bine implementat n tiinele medico-legale (Lander i Budowle, 1994; Roberts, 1992; Benecke, 1995). Descoperirea polimorfismului n segmentele repetitive ale ADN, de ctre Jeffreys i col., n anul 1985, a avut un impact major asupra geneticii din medicina judiciar. n ultimii 15 ani au fost descoperite sisteme de tipizare ADN foarte robuste i cu un mare potenial informativ. Aceasta a crescut la maximum posibilitatea individualizrii oricrui material biologic de origine uman. Toate genele umane sunt codificate de aproximativ 10-20% din genomul uman. Astfel, cea mai mare parte (80-90%) a genomului uman conine regiuni non-codificante, care nu conin informaie genetic cu semnificaie direct pentru sinteza proteinelor. Variabilitatea genetic este relativ limitat n ADN codificant, cu excepia regiunilor HLA. Aceasta se datoreaz faptului c genele care se exprim sunt supuse presiunii seleciei pe parcursul evoluiei, n sensul c trebuie s-i menin funciile specifice. Spre deosebire de acestea, prile non-codificante ale genomului nu pot fi controlate de presiunea seleciei, astfel c mutaiile din aceste regiuni sunt reinute i transmise la descendeni, provocnd o semnificativ cretere a variabilitii genetice. De aceea, aceste regiuni sunt foarte utile pentru investigaiile din genetica medico-legal, avnd o valoare informativ mare (Schneider, 1997).
Pn n prezent, aplicaiile tehnologiei de analiz molecular a ADN n problemele medico-legale de identificare de persoan, au rezolvat un numr de peste 50.000 de cazuri n toat lumea. n acest domeniu, analiza ADN a devenit o nou form de probare tiinific i majoritatea organelor juridice accept astzi ca elemente probatorii analizele ADN. Exist dou aplicaii generale ale analizelor ADN n medicina legal: investigaiile criminalistice i testele de paternitate. n lucrare se prezint informaiile de baz privind aplicaiile analizelor ADN n aceste domenii, precum i modul de interpretare matematic a rezultatelor, ca urmare a experienei acumulate n 5 ani de activitate a autorilor.
1

Drept public

O proporie important din ADN non-codificant (30%) conine secvene repetitive, care pot fi incluse n dou clase: secvene repetitive n tandem (tandemly repetitive sequences) i elemente dispersate (interspersed elements). Majoritatea sistemelor de tipizare ADN aflate n uz curent se bazeaz pe analiza locilor cu secvene repetitive n tandem. Asemenea secvene se afl n ADN satelit, iar din punctul de vedere al geneticii medico-legale, cele mai interesante sunt regiunile de ADN repetitiv mai scurte dect cele ntlnite n ADN satelit. Aceste regiuni pot fi clasificate n minisatelii i microsatelii, sau repetiii scurte n tandem (short tandem repeat - STR) (Litt i Lutz, 1989). Minisateliii, denumii i loci VNTR (variable number of tandem repeats) (Nacamura i col., 1988) sunt formai din 15-50 bp lungime, care se repet n tandem pe lungimi de 500 bp-20 kb. STR sunt mult mai scurte. Unitatea repetitiv variaz ntre 1 i 6 bp, care se repet pe o lungime de 50 bp, pn la 500 bp. n plus, minisateliii i STR difer prin distribuia lor n genomul uman i, probabil, prin funciile lor biologice. Astfel, minisateliii sunt mai frecvent ntlnii n regiunile subtelomerice, pe cnd STR sunt larg rspndii n ntregul genom uman cu o frecven de 1 locus pentru fiecare 6-10 kb (Beckman i Weber, 1992). Originea variabilitii acestor regiuni pare s fie i ea diferit. Variabilitatea microsateliilor i are originea din crossing-over inegal i uneori din conversia genelor (Jeffreys i col., 1994), iar cea a STR, n erorile de replicaie (replication slippage) (Di Rienzo i col., 1994). Variabilitatea genetic dintre indivizi, cu privire la VNTR i STR, se bazeaz pe numrul diferit al elementelor repetitive, ns are la baz i diferenele privind nsi secvena ADN, deoarece repetiiile pot avea mici diferene n secvena lor2 Metode de analiz ADN Prima metod care a fost aplicat n analizele ADN pentru medicina legal a fost metoda polimorfismului lungimii fragmentelor de restricie (RFLP), n care ADN este digerat cu endonucleaze de restricie, fragmentele sunt separate prin electroforez pe gel de agaroz, transferate pe o membran de nylon i detectate prin hibridizare cu probe radioactive sau chemiluminescente. Prin tehnologia RFLP sunt studiate dou tipuri de polimorfisme ADN: modificri de baze unice i loci VNTR minisatelitici. Analiza polimorfismului bazelor unice are o valoare limitat pentru identificrile ADN deoarece exist un numr limitat de alele cu asemenea modificri i un numr mic de loci. De la mijlocul anilor 1980 ns, cea mai comun metod utilizat n analizele ADN a devenit analiza RFLP a locilor minisatelitici VNTR. Aceti loci difer n lungime datorit numrului variabil de segmente repetitive de la nivelul locusului. Ei conin secvene repetitive care variaz ca lungime ntre 15 i 70 baze. Standardizarea sistemelor de testare n medicina legal a determinat utilizarea n Statele Unite a enzimei de restricie HaeIII i n Europa a enzimei HinfI. Aceast tehnic prezint dezavantajul c necesit o cantitate relativ mare de ADN, este foarte laborioas, dureaz mult i n unele situaii utilizeaz pentru determinare preparate radioactive. Reacia
2

Levin, R. Science 244, 1033 (1989) ; Norman, C. Science 246, 1556 (1989) ; Lander, E.S., Bodowle, B. Nature 371, 735 (1994) ; Roberts, L. Science 257, 732 (1992) ; Benecke, M. Die Zeit 20, 43 (1995) ; Jeffreys, A.J., Wilson, V., Thein, S.L. Nature, 314,67 (1985) ; Schneider, P.M. Forensic Sci.Int. 88, 17 (1997); Litt, M., Lutz, J.A. Am.J.Hum.Genet. 44, 397 (1989); Nakamura, Y., Carlson, M., Krapcho, K., Kanamori, M., White, R. Am.J.Hum.Genet. 43, 854 (1988) ; Beckman, J.S., Weber, J.L. Genomics 12, 627 (1992); Jeffreys, A.J., Tamaki, K., MacLeod, A., Moncton, D.G., Neil, D.L., Armour, J.A.L. Nature Genetics 6, 136 (1994) ; Di Rienzo, A., Peterson, A.C., Garza, J.C., Valdes, A.M., Slatkin, M., Freimer, N.B. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91, 3166 (1994) 185

Revista de ]tiin\e juridice

de polimerizare n lan (PCR) a depit toate dificultile tehnice iniiale i a determinat creterea spectaculoas a utilitii amprentrii ADN n tiinele medico-legale. Majoritatea sistemelor de tipizare ADN bazate pe PCR permit identificarea alelelor ca entiti discrete, evitndu-se astfel problemele statistice care apar la compararea benzilor electroforetice, iar standardizarea a devenit mult mai simpl. Pe lng creterea sensibilitii inerente oricrei tehnici PCR, devine mult mai probabil succesul analizei materialului vechi i degradat, deoarece mrimea mic a poriunilor polimorfe de ADN analizat este foarte susceptibil efecturii reaciei PCR. Dup ce, prin PCR, a devenit posibil generarea unui numr mare de copii ale segmentului ADN de interes, au aprut o serie de metode pentru detecia variaiei segmentelor amplificate. Deoarece se pot produce cel puin 10 6 copii de secven de interes, este posibil s se utilizeze pentru detecie, metode care nu folosesc izotopii. Pentru aceasta au fost aplicate mai multe metode. Prima dintre acestea a utilizat probe de oligonucleotide specifice de secven (SSO). Kitul AmpliType PM PCR (PerkinElmer, Foster City, Ca) este unul din cele mai folosite n laboratoarele de profil. Cu acest kit se amplific n sistem multiplex locii HLA DQA1, LDLR, GYPA, HBGG, D7S8 i GC. Sistemul a fost validat pentru analizele medico-legale i este nc larg utilizat, dei multe laboratoare prefer astzi sistemele STR mult mai informative, precum i alte strategii pentru analiza variantelor HLA. Analiza secvenelor cu repetiii scurte n tandem (STR) prin utilizarea reaciei PCR este astzi metoda preferat pentru identificarea medico-legal. STR-urile dinucleotidice sunt cele mai comune STR-uri din genomul uman, ele fiind markerii genetici cei mai utilizai pentru analizele de linkage. Totui, nu acetia sunt cei utilizai n medicina medico-legal din cauz c aceste STR sunt afectate n cursul amplificrii prin erori de replicare (strand slippage), ceea ce produce benzi artefactuale n electroforez. Spre deosebire de acestea, repetiiile tetra i pentanucleotidice sunt mult mai puin supuse acestor artefacte de replicare i de aceea sunt mult mai potrivite pentru studiile de amprentare ADN. Datorit structurii lor, STR variaz prin faptul c pot fi extrem de complexe, pn la extrem de simple. STR complexe prezint avantajul hipervariabilitii. STR simple au avantajul unei foarte simple standardizri i al sczutei rate mutaionale. Pe lng caracteristicile menionate, selectarea STR ideale pentru scopurile medico-legale include analiza minuioas a bezilor artefactuale pe care le pot genera, precum i robusteea i mrimea lor. n general, dimensiunile scurte sunt preferabile deoarece mrimea produsului amplificat este critic la probele degradate n care fregmentele mici pot fi amplificate, iar cele mai mari, nu. Un alt avantaj important l constituie posibilitatea amplificrii simultane a mai multor loci STR printr-o singur reacie de tip multiplex. Acesta, cuplat cu detecia direct a produilor de amplificare pe gel de poliacrilamid, face posibil automatizarea amprentrii ADN pe baza STR. STR au fost pentru prima dat analizate prin folosirea sistemelor manuale de electroforez. Pentru standardizare sunt recomandabile gelurile de poliacrilamid denaturante pentru c prin folosirea lor pot fi detectai i produi de amplificare generai de erori de replicare. Domeniul a fost revoluionat prin introducerea tehnicilor bazate pe evidenierea fluorescent i prin utilizarea secveniatoarelor ADN. Folosirea secveniatoarelor permite folosirea unor reacii multiplex mari (cu peste 10 sisteme STR). Pentru tipizarea STR este esenial utilizarea ladder-ilor alelici cu secvena de referin. n general, aceti ladderi alelici cuprind toate alelele unui sistem, dei, uneori, pot apare i alele intermediare la STR-urile mai simple. Pentru distingerea acestor alele intermediare exist ghiduri de interpretare i astfel ele pot fi uor implementate la sercveniatoarele automate.
186

Drept public

Exist mai multe multiplexe disponibile comercial. Unul din cele mai cunoscute este sistemul SGM Plus (Perkin-Elmer), care cuprinde 10 loci: HUMFIBRA/FGA, HUMVWFA, HUMTH01, D18S51, D21S11, D6S477, D8S1179, D16S539, D19S433 i amelogenina. Multiplexele produse de Promega (Madison, WI) sunt foarte utilizate mai ales n laboratoarele care folosesc sistemele electroforetice manuale i platforme de secveniere monocromatice. Dei au fost descrise sisteme de analiz STR foarte robuste, necesitatea standardizrii a determinat concentrarea procuprii majoritii laboratorelor asupra sistemelor STR clasice. Ca exemplu, Interpol Working Party on DNA Profiling, recomand pentru Europa, urmtorul set standard de 7 loci: VWAFA31/A, TH01, D21S11, FGA, D8S1179, D3S1358, D18S51 i amelogenina. n general, puterea de discriminare combinat a STR este enorm, iar probabilitatea ca doi indivizi nenrudii s fie identici este mai mic de 10 -10, pentru majoritatea multiplexelor existente. Amprentele ADN clasice se pot obine din cel puin 510 g de ADN nedegradat. De aceea, tehnologia clasic nu poate fi utilizat pentru analiza petelor care conin cantiti de ADN mult mai mici i/sau ADN degradat. De exemplu, 1 ml de ejaculat conine 150-300 g ADN, pe cnd dintr-un tampon vaginal recoltat post-coitum se pot extrage doar 0,01-3 ng de ADN. Un fir de pr smuls cu tot cu rdcina conine pn la 30 ng de ADN genomic, pe cnd un fir de pr fr bulb conine maximum 0,1 ng ADN. ADN degradat conine fragmente moleculare scurte. De aceea tipizarea ADN trebuie s utilizeze tehnici care permit detecia unor loci repetitivi scuri i, n acelai timp, s ofere informaiile necesare. Aceti loci (STR) au fost descoperii acum aproximativ 20 de ani, deci mai trziu dect debutul amprentrii ADN. Genomul fiecrei persoane conine sute de loci STR (numrul exact nu este nc cunoscut). S-a observat c fiecare locus are un numr limitat de alele posibile, n general de la cinci, la zece allele. Fiecare individ poate fi heterozigot sau homozigot pentru fiecare locus STR. Comparaia allelelor unui individ cu allelele obinute dintr-o pat de snge de la locul unei crime sau cu ale unui copil, permite determinarea identitii sau paternitii. Locii STR sunt astzi mijlocul primordial de analiz a petelor i de investigaii criminalistice n lume. n Statele Unite, unde pn n 1997 erau utilizai cu anumite restricii, cazul O.J. Simpson a demonstrat n mod impresionant utilitatea STR pentru tipizarea unor cantiti mici de ADN. Pentru a evidenia STR este necesar ca aceti loci s fie amplificai prin PCR. Astzi pot fi amplificai simultan pn la 16 loci STR folosindu-se primeri care detecteaz specific un anumit locus. Dup separarea electroforetic a produilor PCR, vizualizarea se face prin coloraie argentic sau prin detecia fluorescent semiautomatizat. Concluzii n SUA, exist dou reguli majore care decid dac o descoperire tiinific poate fi admis ca prob juridic: testul s fie "general acceptat", i metodologia s fie standardizat. Pentru prima condiie, teoria i metodologia utilizat trebuie s fie general acceptat n comunitatea tiinific. Ct de dificil se poate aplica aceast condiie este ilustrat de celebrul caz "Kelly contra stat", cnd pentru prima dat a fost admis ca prob analiza ADN. A fost nevoie ca la ntrebarea "Nu este tehnologia folosirii testului ADN prea nou pentru a putea fi acceptat de comunitatea tiinific?", s rspund cinci experi. A doua condiie, standardizarea determinrii, implic o mult mai larg reea de specialiti care s decid dac metodologia propus are suficient validitate tiinific. Consiliul Europei, Comitetul de Minitri, cu prilejul reuniunii 470, n februarie 1992, a publicat Recomandarea nr. 92 cu privire la utilizarea analizelor ADN n reeaua sistemului judiciar. Astzi, dup ce sistemul CODIS a fost elaborat i standardizat n SUA, a fost extins i n alte juristdicii. Cei 13 loci CODIS au fost introdui i n Forensic Science Service din Marea Britanie, pentru baza de date naional i pentru INTERPOL, precum i n majoritatea rilor din Uniunea European.
187