Sunteți pe pagina 1din 27

Biotehnologia Molecular ADN

Genetic curs universitar


Dr. Radu tefnescu

Universitatea Titu Maiorescu

Abordri
Amplificare specific Clonarea ADN
Polimerizarea ADN (PCR) in vitro Clonarea celular in vivo

Detecie specific
Hibridizare molecular Probe (sonde) ADN/ARN

Clonarea ADN
Amplificare selectiv a secvenelor ADN ce genereaz un produs ADN omogen n vederea purificarii i multiplicrii framentului dorit Astfel, structura i funcia acestuia pot fi studiate pe larg prin:
Secveniere Studii de expresie genic in vitro Mutagenez in vitro
3

Clonarea celular
Prima form de clonare Const n ataarea de fragmente ADN la secvene ADN capabile de replicare independent Se formeaz fragmente de ADN recombinant ce sunt transferate n celule gazd unde sunt multiplicate selectiv

Clonarea celular - etape


1.
-

Construcia ADN-ului recombinant


Aranjarea capetelor moleculelor de ADN cu endonucleaze de restricie (foarfece molecular) Legarea prin legturi covalente a moleculelor de ADN cu ligaze

2.

Transformarea moleculele recombinante sunt transferate n celulele gazd unde ADN-ul se va replica independent de cromozomul celulei gazd nmulirea selectiv a clonelor celulare
Celulele transformate sunt cultivate pe o suprafa agar la densitate redus pentru a realiza colonii unicelulare Coloniile individuale sunt cultivate n recipiente separate

3.

4.

Izolarea ADN-ului recombinant prin recoltarea celulelor i izolare selectiv


5

Clonarea celular - schem

Hibridizarea molecular
Detecia specific a fragmentului de interes ntr-un amestec de mai multe secvene diferite (ADN genomic, extras total ARN) Determinarea localizrii cromozomiale Analiza structurii fragmentului de interes Analiza pattern-ului (modului) de expresie genic ntr-o populaie complex de ADN complementar
7

Hibridizarea acizilor nucleici


Se bazeaz pe capacitatea moleculelor monocatenare de acizi nucleici de a forma molecule dublu-catenare, adic de a hibridiza Condiia este ca s existe un grad nalt de complementaritate a bazelor azotate Implic folosirea unei probe (sonde) de acid nucleic marcat pentru identificarea moleculelor ADN sau ARN nrudite (cu grad nalt de similaritate a secvenei de nucleotide), numite secvene int ntr-un amestec complex de molecule nemarcate
8

Hibridizarea acizilor nucleici - schem

10

Hibridizare ADN

Fiecare set de cromozomi este colorat specific. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bookres.fcgi/mboc4/ch4f10.jpg


11

Cromozomul Philadelphia (Ph)

12

Hibridizarea dot-blot
Folosete ca probe oligonucleotidele specifice unei allele ASO (allele-specific oligonucleotide) Poate distinge ntre allele ce difer i numai printr-un nucleotid Este direct cnd proba este marcat sau revers cnd ADN-ul int este marcat Identificarea se face pe membran poroas St la baza analizelor ADN microarray
13

Hibridizarea dot-blot - schem

14

Tehnologia ADN microarray


Se mai numesc i chipurile ADN Reprezint o extindere a tehnologiei de hibridizare Capacitate enorm de miniturizare i automatizare Hibridizarea are loc pe lamele de sticl

15

Construcia microarray cu ADN i oligonucleotide

16

Chipuri ADN

17

Secvenierea ADN

18

Tehnologia de secveniere Solexa


Secveniere prin sintez Detecie folosind 4 fluorophori (unul pt fiecare nucleotid) Citete 10 milioane grupuri de secvene ADN cu cate 1000 copii fiecare ntr-un cm ptrat Poate citi 1 miliard de baze azotate le un singur ciclu Cartografierea ntrrgului genom (genome-wide mapping) Relaiile dintre organizarea cromatinei i metilarea histonelor Baze de date (DB) bioinformatice pentru anliza site-urilor de start al transcripiei (TSS) - DBTSS
19

Solexa - schem

20

Pyrosequencing
Secveniere prin sintez Cuantificarea moleculelor de pyrophosphate eliberate la ncorporarea nucleotidelor Detecia se face cu ajutorul unui sistem enzimatic chemiluminescent luciferaz Spike-ul luminos este direct proprional cu numrul nucleotidelor adugate Detecia mutaiilor punctiforme SNP (single nucleotide polymorphism)
21

Pyrosequencing - schem

22

Tehnologia SOLiD
Supported Oligonucleotide Ligation and Detection Platform Secveniere fluorescent in situ pe colonii de polimeraz (polonii) Densitate mare a reaciilor de secveniere

23

24

Terapia genica
Orice procedura care trateaza sau amelioreaza o boala prin modificarea genetica a celulelor unui pacient Se poate realiza prin introducerea in celulele pacientului de gene, segmente de gene sau oligonucleotide Materialul genetic poate fi transferat direct in celule (terapie in vivo) sau celulele sunt extrase de la pacient si materialul genetic inserat in vitro si apoi transplantate inapoi la pacient (terapie ex vivo)
25

26

Product
Blood clotting factor VIII Blood clotting factor IX Erythropoietin Insulin Growth hormone Tissue plasminogen activator Hepatitis B vaccine -Interferon -Interferon -Interferon

For treatment of
Hemophilia A Hemophilia B Anemia Diabetes Growth hormone deficiency Thrombotic disorders Hepatitis B Hairy cell leukemia; chronic hepatitis Multiple sclerosis

Infections in patients with chronic granulomatous disease Renal cell carcinoma


Neutropenia following chemotherapy Cystic fibrosis
27

Interleukin-2
Granulocyte colony-stimulating factor (GCSF) DNase (deoxyribonuclease)