Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
- introducere -
I. Preambul
Definiie
Genetica Forensic este ramura geneticii care se ocup cu aplicarea cunotinelor genetice pentru probleme juridice i de procedur legal. Genetica Forensic este, de asemenea, o ramur a medicinei legale care se ocup mai pe larg, cu punerea n aplicare a cunotinelor medicale pentru probleme juridice.
Genetica Forensic astzi tinde s evoce ADN-ului. Cu toate acestea, chiar termenul de amprentare ADN este o reminiscen a unor metode mai vechi de identificare a poliiei. Genetica Forensic nu este un domeniu nou. Cu mult nainte de epoca de amprentare a ADN-ului, a existat testarea grupei sanguine (HLA i alte teste ale unor markeri genetici specifici sngelui) pentru a se determina cine este faptaul i cel mai adesea, cine nu este faptaul.
MedicineNet.com
Flux de lucru
1
3
4
Film 1
Introducere
Metodele i tehnicile aferente izolarii ADN-ului, au evoluat odat cu progresele fcute n Genetic i Biochimie. Iniial au fost folosite protocoalele de izolare laborioase, toxice, consumatoare de mult material biologic (ex. izolare organic), apoi au fost descoperite protocoale ultrarapide uor de realizat (ex. izolarea folosind rin Chelex sau FTA paper), precum i protocoale ce permit automatizarea (ex. izolarea magnetic).
Tendinele generale ale acestei evoluii au fost: specificitatea crearea de protocoale de izolare specifice categoriilor tisulare (ex. protocoalele pentru esut osos, difer de cele de izolare a ADN-ului din snge) sau specifice tipului de ADN (ex. ADN total, ADN mitocondrial, etc.);
eficientizarea reducerea etapelor protocoalelor de izolare considerate toxice (ex. izolarea ADN-ului folosind Fenol:Cloroform:Izopropanol) sau a reduceri pailor de lucru (scderea anselor de contaminare a probelor cu ADN strin);
calitatea obinerea de extracte ADN cu un nalt grad de puritate i totodat cu un grad redus de degradare (fragmentare);
cantitatea obinerea de ADN din cantiti reduse de material biologic (ex. izolarea dintr-o singur celul epitelial sau dintr-un singur spermatozoid folosind microdisecia laser).
Prelevarea probelor biologice prin metode ct mai puin invazive (n cazul probelor biologice de referin), n condiii sterile, uor de conservat. Evitarea contaminrii i inter-contaminrii probelor biologice analizate prin purtarea de echipament special (halat, cotiere, bonet, masc, ochelari i mnui sterile) i folosirea de instrumente decontaminate n prealabil cu hipoclorit de sodiu (NaOCl), UV, autoclavare, etc..
Utilizarea unei probe de control negativ (tub fr prob biologic) i a unei probe de control pozitiv (tub cu prob biologic cunoscut) pe parcursul fluxului de lucru. Numerotarea corespunztoare a tuburilor. Toi reactivii, instrumentele i echipamentul folosit trebuie s satisfac standardele minime pentru controlul calitii (termen de valabilitate, parametrii de calitate, etc.).
6. Splarea ADN-ului - Se folosete alcool etilic, alcool izopropilic i/sau aceton, pentru a elimina diferiii contaminani care pot rmne intercalai printre moleculele de ADN, sau ataai de acestea (ARN, proteine, polizaharide, lipide, compui chimici folosii n protocol, etc.).
7. Izolarea i conservarea ADN-ului - ADN-ul se usuc la t.c., prin evaporarea alcoolului folosit n etapa precedent, se rehidrateaz n tampon TE sau ap distilat steril, dup care se depoziteaz pn la noi etape de analiz la -40 C (pentru cteva sptmni) sau la -200 C (pentru mai mult timp).
Natura probelor biologice: Fire de par cu bulb Fragmente tisulare Snge Saliva esut Osos esut Dentar
Natura probelor biologice: Celule epiteliale Fire de par cu bulb Fragmente tisulare Snge Saliva
FTA Paper
FTA paper este un sistem de colectare, arhivare i purificare oferit de Whatman, foarte uor de folosit, caracterizat prin liza celular la contactul celulelor cu suprafaa hrtiei FTA i expunerea acizilor nucleici. Conform productorilor, acest sistem permite: a) liza membranei nucleare i a organitelor celulare; b) denaturarea proteinelor; c) blocarea fizic a acizilor nucleici n matricea de fibre ce intr n componena acesteia; d) imobilizeaz acizi nucleici ntr-o faz solid; e) previne degradarea cauzat de aciunea enzimelor; f) inhib creterea fungal i microbian; g) inactiveaz virusurile; h) protejeaz ADN-ul de degradarea mecanic; i) permite pstrarea probelor biologice la temperatura camerei.
Imagine de microscopie electronic a unui fragment de hrtie FTA, imediat dup ce s-a adugat snge lichid pe suprafaa acestuia. Se pot observa elementele figurate aflate n stadiul de liza celular.
Imagine de microscopie electronic a unui fragment de hrtie FTA dup ce acesta a fost splat de cteva ori. Se pot observa ADN-ul imobilizat n matricea de fibre.
Transferul Energiei de Rezonan Fluorescent (FRET) de la valori energetice nalte la valori mici Nu se genereaz semnale reporter n cazul probelor intacte.
Clivarea secvenei specifice TaqMan Probe ca urmare a activitii nucleazice a enzimei Taq Polimeraza FRET se dezactiveaz genernd un semnal reporter.
Amplificare complet. Un semnal reporter este eliberat pentru fiecare nou copie a secvenei de ADN iniiale
Stanciu F., Stoian I. M., Popescu O. R; Evaluation of Freedom Evo 150 with AGOWA sep9600 for Databasing Purposes, P17, Book of Abstracts, Forensica 2008, Praque, Czech Republic.
Film 2
Markerii STR
Au rspndire randomic n genomul uman, dimensiuni relativ mici i variabilitate ridicat la nivelul indivizilor unei populaii
sunt secvene de ADN necodificatore compuse din 2-6 perechi de baze repetate n tandem
Sunt instrumente genetice importante pentru realizarea hrilor genetice, analiza transmiterii nlnuite a caracterelor ereditare, filogenie, identificarea de persoan, etc..
Nomenclatura markerului Microsatelii SSR (Simple Sequence Repeat) STS/STMS (Sequence-Tagged Microsatellite Site) STR (Short tandem Repeat).
Nomenclatura locilor Secvene ADN intronice TH01 - n intronul 1 al genei pentru tirozin hidroxilaza, FGA - n intronul 3 al genei pentru alfa fibrinogenul uman; Secvene ADN intergenice denumire standard de tipul: Dn1Sn2 (Exemplu D5S818)
Nomenclatura alelelor Conform recomandrilor ISFH, alelele markerilor STR trebuie denumite innd cont de numrul unitilor repetitive ale markerului, iar atunci cnd exist alele care se abat de la motivul complet al unitii repetitive, se ia n considerare numrul unitilor repetitive complete, urmat de punct i numrul de nucleotide din motivul incomplet. (Exemplu: TH01 [AATG]9 = alela 9, [AATG]6 ATG [AATG]3 = alela 9.3)
Clasificare (I)
Clasificare (II)
Repetiii mononucleotidice - dou motive posibile: A i C Repetiii dinucleotidice 4 motive posibile: AC, AG, AT i CG Repetiii trinucleotidice 10 motive posibile: AAC, AAG, AAT, ACG, ACT, AGC, AGC, AGG, ATC i CCG Repetiii tetranucleotidice 33 motive posibile: AAAC, AAAG, AAAT, AACC, AACG, AACT, AAGC, AAGG, AAGT, AATC, AATG, AATT, ACAG, ACAT, ACCC, ACCG, ACCT, ACGC, ACGG, ACGT, ACTC, ACTG, AGAT, AGCC, AGCG, AGCT, AGGC, AGGG, ATCC, ATCG, ATGC, CCCG i CCGG Repetiii pentanucleotidice 102 motive posibile Repetiii hexanucleotidice 350 motive posibile Din punct de vedere matematic exist 4, 16, 64, 256, 1024 i 4096 motive posibile pentru repetiii mono-, di-, tri-, tetra-, penta- i hexanucleotidice. Cu toate acestea, datorit repetiiei n tandem a acestor secvene, unele motive repetitive sunt echivalente ntre ele. Pentru a determina dac un motiv A este echivalent cu un altul B se ine cont dac: - motivul A este complementar cu motivul B, - motivul A este diferit de motivul B i de secvena complementar a acestuia, datorit modificrii cadrului de citire (frameshift). Exemplu: motivele (GAAA)n, (AGAA)n, (AAGA)n, (AAAG)n, (TTTC)n, (TTCT)n, (TCTT)n i (CTTT)n sunt echivalente.
Clasificare (III)
- Repetiii simple cu motive complete: FES/FPS, CSF1PO, D5S818, D13S317, etc. (GATA)(GATA)(GATA) - Repetiii simple ce prezint i alele cu motive incomplete: TH01, F13A1, D7S820,etc. (GATA)(GAT)(GATA)
- Repetiii compuse, formate din dou sau mai multe motive : GABRB15
(GATA)(GATA)(GACA) - Repetiii compuse ce prezint i alele cu motive incomplete: VWA, FGA, D8S1179, etc.
(GATA)(GACA)(CA)(CATA)
- Complexe repetitive: D21S11 - Repetiii hipervariabile: SE33
FAM (blue)
JOE (green)
TAMRA (yellow)
ROX (red)
D18S51
D16S539
TPOX D7S820
TH01
VWA
D5S818
D3S1358
Amelogenin
PowerPlex 16 BIO
Separarea Culorilor
Fluorescenta
Separarea Ampliconilor
Capilar
Injectarea Ampliconilor
GeneScan/Genotyper software
Interpretarea rezultatelor
RAPD
mici
mici
AFLP
mici
medii
STR
mari
mici
SNP
mari
mari
Probe / zi
Nivel de pregtire necesar Automatizare
20
mic dificil da/nu
50
mic da nu mic / mediu D mediu
50
mediu da da/nu
50
mic / mediu da da/nu
20
mare da da/nu
mare C mediu
mare C mare
mtDNA
Mica Inceata
Simplicitate tehnica
Informativite
Genotip
ADN degradat
Amestec
Multilocus Probe
+++
Single locus
Minisatelii Microsatelii (repetiii de 2pb) PCR Microsatelii (repetiii de 3 i 4 pb)
++
++ ++ ++
++
+ + +
(+)
+ + ++
+ ++ ++
++
+ + +
++
+++
++
AmpFlSTR Blue
AmpFlSTR Green I AmpFlSTR COfiler AmpFlSTR Profiler Plus AmpFlSTR Profiler Plus ID AmpFlSTR Profiler
1.0 x 10-3
7.8 x 10-4 2.0 x 10-7 2.4 x 10-11
2.4 x 10-11
9.0 x 10-11 4.5 x 10-13 5.1 x 10-15 7.2 x 10-19
D3S1358, VWA, D16S539, D2S1338, Amelogenin, D8S1179, D21S11, D18S51, D19S433, TH01, FGA
FGA, TH01, VWA, D3S1358, D8S1179, D16S539, D18S51, D21S11, D2S1338, D19S433, SE33, amelogenin
CSF1PO, FGA, TPOX, TH01, VWA, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, D21S11, D2S1338, D19S433, amelogenin
6-FAM
D3S1358
TH01 D13S317 D16S539 D2S1338 D19S433 vWA
3p
11 pi 5.5 13q22-31 16q24-qter 2q35-37.1 19q12-13.1 12p12-pter
12,13,14,15,16, 17,18,19
4,5,6,7,8,9,9.3, 10,11,13.3 8,9,10,11,12, 13, 14,15 5,8,9,10,11,12,13, 14,15 15,16,17,18,19, 20,21,22,23,24, 25, 26, 27, 28 9,10,11,12,12.2, 13,13.2, 14,14.2, 15,15.2, 16,16.2, 17, 17.2 11,12,13,14,15,16, 17,18,19,20,21, 22, 23, 24 VIC
14,15
8,9.3 11 11,12 19,23 14,15 17,18 NED
TPOX
D18S51 Amelogenina D5S818 FGA
2p23-2per
18q21.3 X:p22.1-22.3 Y:p11.2 5q21 -31 4q28
8
15,19 X 11
PET 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 26.2, 27, 28, 29, 30, 30.2, 31.2, 32.2, 33.2, 42.2, 43.2, 44.2, 45.2, 46.2, 47.2, 48.2, 50.2, 51.2 23,24
Fluorocrom
DNA007
15
DYS389I
DYS390
1015
1827
6-FAM
13
24
DYS389II
DYS458
2434
1420
29
17
DYS19
DYS385 a/b
1019
725
VIC
15
11,14
DYS393
DYS391 DYS439 DYS635 DYS392 Y GATA H4 DYS437 DYS438 DYS448
816
713 815 2026 718 813 1317 813 1724 PET NED
13
11 12 24 13 13 15 12 19
miniSTR (I)
Markerii miniSTR sunt markeri STR a cror secvene primer au fost micorate n vederea creterii eficienei n dou situaii posibile: 1) n cazurile mutaiilor prezente n regiunea de legare a primerilor clasici i 2) n cazul probelor biologice degradate n care ADN-ul se gsete foarte fragmentat.
miniSTR (II)
D21S11
21q11.2-q21
24, 24.2, 25, 26, 27, 28, 28.2, 29, 29.2, 30, 30.2, 31, 31.2, 32, 32.2, 33, 33.2, 34, 34.2,35, 35.2, 36, 37, 38
5.8,9. 10,11.12.13.14. 15 7, 9, 10, 10.2, 11, 12, 13, 13.2, 14, 14.2, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 26.2, 27, 28, 29, 30, 30.2, 31.2, 32.2, 33.2, 42.2, 43.2, 44.2, 45.2, 46.2, 47.2, 48.2, 50.2, 51.2
FGA
4q28
24,26
Artefacte Pull-up
n urma excitrii laser a fluorocromilor cu care sunt marcai primeri, rezult un fascicul de lumin care este descompus n culorile componente cu ajutorul unor filtre speciale. Aceast descompunere nu este total existnd un grad de suprapunere ntre culorile cu lungime de und apropiat. Dintre cele patru culori folosite cel mai frecvent, albastru i verde au cel mai mare grad de suprapunere. Aceste suprapuneri fac ca uneori s apar artefacte de tip pull-up respectiv, ntreptrunderea peak-ului unei alele de pe o culoare pe o alta, ceea ce poate duce la atribuirea de alele false (ntruct un pull-ul poate corespunde ntmpltor unei zone care de obicei i este atribuit unei alele din ladder) n cazul n care nu se compar culorilor ntre ele pentru anumii loci, n momentul interpretrii rezultatelor.
5-FAM JOE NED ROX
100
80
60
40
20
520
540
560
580
600
620
640
Laser excitation
(488, 514.5 nm)
Bazele de Date
Baze de Date Publice PubMed [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/] The Allele Frequency Database (ALFRED) Internet DataBase (STRBase)
[http://alfred.med.yale.edu/alfred/index.asp]
Y-STR haplotype reference database [http://www.yhrd.org] ENFSI DNA WG STR Population Database [http://www.str-base.org] Earth Human STR Allele Frequencies Database (EHSTRAFD)
[http://www.ehstrafd.org]
florin.stanciu@genes.ro