CATEDRA DE BIOQUIMICA LABORATORIO DE BIOQUIMICA GENERAL

Tecnologa Mdica

Elaborada por: Prof. Barbara Butendieck A.

2012

Introduccin
Normas generales de proteccin, prevencin y comportamiento:
Por todos los riesgos indicados, es necesario (y obligatorio) llevar delantal para protegerse de los productos qumicos. Como proteccin personal se puede utilizar, cuando sea necesario, guantes y mscara. Todas las damas y caballeros que tienen el pelo largo, deben recogerlo en forma completa en un moo con un collet, pinche o traba. En el laboratorio no se debe fumar, comer ni beber, para evitar el peligro de un envenenamiento o contagio por contacto accidental con algn producto txico o agente patgeno. El material de vidrio debe ser manipulado con precaucin para evitar roturas. Se recomienda fijarse en el nombre de las disoluciones y productos antes de utilizarlos. Si se utilizan pipetas de vidrio o plstico, hay que pipetear con el dedo ndice, nunca con el pulgar. No se debe pipetear directamente del frasco de agua destilada o de las disoluciones que se comparten con otros grupos: debe pipetearse de la disolucin transvasada previamente a un vaso precipitado. Hay que manejar con precaucin las sustancias peligrosas: cidos, lcalis, disolventes orgnicos y productos txicos. Estos productos no deben pipetearse nunca con la boca, sino con ayuda de una propipeta.

Seguridad en el laboratorio
Deben tener presente las reglas generales de seguridad. Se debe estar consciente que los reactivos utilizados en el laboratorio son potencialmente txicos, irritantes o inflamables. Sin embargo estas sustancias son peligrosas solo cuando no se manipulan correctamente. La gua y el cuaderno de laboratorio Es muy importante hacer un diagrama de flujo antes de iniciar la sesin. Los procedimientos, detalles, observaciones y resultados se deben registrar en la gua o cuaderno de laboratorio mientras el experimento se est llevando a cabo.

Breve pauta para preparar el Informe de Laboratorio.

Portada Logo institucional, facultad, escuela; nombre del laboratorio, integrantes del grupo, asignatura, docentes, fecha de entrega. Introduccin Breve resumen de conceptos y/o importancia del tema. La informacin debe tener relevancia para el prctico y no debe ser una copia de un libro, de la gua o de internet. Procurar que no exceda de una plana. Objetivo Aqu se debe incluir cual es el objetivo del prctico, porque, para qu? Parte experimental Materiales y mtodos Se describen los reactivos, materiales y equipo que se utilizan, as como la metodologa empleada Se debe redactar en tercera persona.

Resultados y discusin Se describen los resultados obtenidos, se indican los clculos, tablas, grficas o figuras, as como una explicacin con fundamentos cientficos del porqu se obtuvieron esos resultados. Los resultados experimentales se resumen en forma de tabla o de grfica. Las tablas y grficas deben nombrarse ordenadamente en el texto (Tabla 1, Tabla 2, etc.) y deben tener un ttulo. En algunos casos, adems, puede ser interesante dar detalles adicionales en forma de una leyenda colocada debajo del ttulo. Las unidades en que se expresan los resultados deben indicarse en la parte superior de cada columna (y nunca en cada lnea de cifras). Estas unidades deben elegirse de manera que presenten un nmero limitado de cifras (por ejemplo, una concentracin de 0.0072 mol/L se escribe ms fcilmente 7.2 mmol/L o 72 x 10-4 mol/L). En general, los valores obtenidos se presentan en forma de grfica y no de tabla. Para trazar una grfica se representan los valores de la variable independiente (parmetro conocido) en el eje de abscisas (eje x) y los de la variable dependiente (parmetro desconocido) en el eje de ordenadas (eje y). Cuestionario En caso de existir cuestionario, incluirlo en el informe. Bibliografa Reportar las fuentes utilizadas con el formato estndar: Para libros: Autor(s), ao de publicacin, ttulo, editorial y pginas consultadas, en el caso de internet sealar la direccin completa. Para el caso de revistas cientficas: Autor(es), ao, nombre del artculo, nombre de la revista, volumen, nmero, pginas.

Los Informes se escribirn a mano en un cuadernillo de matemticas cuadro chico y se entregarn en la escuela el da lunes siguiente al prctico hasta las 12:00 hrs. La entrega del informe fuera de plazo devengar automticamente en un 1 en la calificacin. Considere en el informe la redaccin y la ortografa. Se descontarn decimas de nota por estos errores.

SOLUCIONES Y TAMPONES
I. SOLUCIONES

Una solucin es una mezcla homognea de dos o ms componentes. El componente que est en mayor proporcin se llama solvente y el o los componentes que estn en menor proporcin se llaman solutos. En soluciones lquidas, el solvente es lquido en tanto que los solutos pueden ser slidos, lquidos o gases. La mayora de las soluciones usadas en bioqumica son soluciones acuosas (solvente agua). Para caracterizar una solucin no basta indicar sus componentes, sino que tambin la proporcin en que estos estn presentes en la solucin, es decir, la concentracin de cada uno de los solutos en la solucin. UNIDADES DE CONCENTRACIN Las ms usadas en la prctica son de dos tipos: -. Unidades de concentracin referidas a volumen: Indican cantidad de soluto disuelto por unidad de volumen de solucin. Ej.: la molaridad, la normalidad, porcentaje p/v, g/l, etc. -.Unidades de concentracin referidas a peso: indican cantidad de soluto disuelto por unidad de peso de solucin o de solvente. Ej.: % p/p, molalidad. 1.-Molaridad (M): nmero de moles de soluto por litro de solucin. Para preparar una solucin de molaridad dada es necesario conocer el peso molecular (PM) del soluto. Se usan las relaciones: Peso soluto (g) = nmero de moles de soluto PM (g/mol) N moles de soluto = M Volumen solucin (l) Ej.: Una solucin 1 M (1 molar) de NaCl contiene 1 mol (58,8g) de NaCl por litro. Un mol de NaCl corresponde a un valor igual al nmero de Avogadro de molculas, que es 6,023 x 1023. La concentracin de iones en solucin tambin se indica en unidades molares, en este caso el in es la molcula. Ejemplos: Consideremos la solucin 1 M de NaCl. Los enlaces inicos de la red cristalina de cloruro de sodio se rompen al disolverse la sal. NaCl ------------- Na + Cl
+ -

Por cada mol de NaCl slido se forma 1 mol de Na+ y un mol de Cl-. Luego: Concentracin de Na = 1M Concentracin de cloruro = 1 M Para las molculas ms complejas como MgCl 2 MgCl2 ------------- Mg+2 + 2 ClUna solucin de cloruro de magnesio 1M contiene:
+

Concentracin de Mg =1M Concentracin de cloruro = 2 M Las concentraciones de soluciones diluidas se suele expresar en unidades que son submltiplos de M: Milimolaridad (mM): nmero de milimoles de soluto por litro de solucin. La milimolaridad y los otros submltiplos se definen en forma anloga: Milimolaridad (mM): 1 mmol = 10-3 moles, luego 1mM = 10-3 M -6 -6 Micromolaridad (M) 1mol = 10 moles, luego 1M = 10 M -9 Nanomolaridad (nM) 1 nmol = 10 moles, luego 1nM = 10-9 M 2. Normalidad (N): Nmero de pesos equivalentes (PE) de soluto por litro de solucin. Solamente para algunos compuestos se define un PE, y este siempre tiene relacin con la reactividad del compuesto. En general : PE = PM N cidos y bases: n = N de protones que puede ceder (el cido) o captar (la base) por molcula. Compuestos que sufren reacciones redox: n= N de electrones captados (agente oxidante) o cedidos (agente reductor) por molcula. 3. Peso de soluto/volumen de solucin en g/l, mg/l: Esta es la forma ms sencilla de indicar la concentracin de una solucin, es la forma ms usual, aparte de la molaridad. 4. Porcentaje peso/volumen (% p/v): Peso de soluto en gramos por 100 ml de solucin (g%). Se habla de porcentaje ya que 100 ml de una solucin acuosa relativamente diluida pesan aproximadamente 100g. para soluciones muy diluidas se usa el submltiplo mg% = peso del soluto en mg por 100 ml de solucin. 5. Porcentaje peso/ peso (%p/p): Peso en gramos de soluto por 100 gramos de solucin. La concentracin de la mayora de los cidos comerciales viene dada en %p/p. Aqu la proporcin de soluto puede ser mayor que la proporcin del solvente. Ej.: H2SO4 96%. Para poder transformar %p/p a concentracin molar o normal es necesario conocer la densidad (d) de la solucin. Ejemplo: Calcular la molaridad de HCl comercial del 28%, densidad 1,15 (kg/l). Primero calculamos cunto pesa 1 litro de la solucin. 1 l x 1,15 (kg/l) = 1,15 kg = 1150 g Ahora calculamos el peso de HCL puro contenido en este litro: 100 g de solucin contienen 28 g, por lo tanto 1150 g de solucin contienen 1150g x 0,28 = 322g Finalmente, calculamos a cuntos moles corresponde este peso de HCl: (g/mol) 322 (g) = 8,82 moles 36,5 (g/mol) Hemos calculado que 1 litro del cido comercial contiene 8,82 moles de HCl, es decir, su concentracin es 8,82 M. PM del HCl = 36,5

+2

6. Molalidad (m): Nmero de moles de soluto por 1000 gramos de solvente. Esta unidad de concentracin se usa solamente para ciertos clculos fsico-qumicos. Expresar la concentracin en estas unidades presenta la ventaja de que se hace independiente de la temperatura. Al contrario, una concentracin expresada en unidades referidas a volumen, como la molaridad, vara con la temperatura, ya que sta afecta el volumen. Para soluciones acuosas diluidas m es prcticamente igual a M.

PREPARACIN DE SOLUCIONES Para preparar una solucin de un soluto dado se puede usar el soluto puro ( generalmente slido) o una solucin concentrada de l en el mismo solvente ( solucin stock). Este ltimo caso constituye una dilucin. Para diluciones rige la relacin: V1 x C1 = V2 x C2 V1 = volumen de la solucin concentrada C1 = concentracin de la solucin concentrada V2 = volumen de la solucin diluida C2 =concentracin de la solucin diluida C1 y C2 pueden ser unidades de concentracin de cualquier sistema referido a volumen. Ejemplo: En un matraz aforado de 100 ml se colocaron 10 ml de una solucin 2M de cloruro de sodio y se afor con agua. Cul ser la concentracin de la solucin resultante? Nuestro sentido comn nos dice que la respuesta ser 0,2 M, ya que la solucin se diluy 10 veces. El clculo segn la relacin dada sera: C2 = V1 x C1 = 10 ml x 2M = 0,2 M V2 100 ml

PROBLEMAS SOLUCIONES
1.- a) Cuntos g de NaOH slido se requieren para preparar 500 ml de una solucin 0,04 M? b) Exprese la concentracin de la solucin preparada en a) en trminos de N, g/l, (% p/v). 2.- Cuntos mililitros (ml) de H2SO4 3M se requieren para preparar 500 ml de una solucin de H2SO4 de concentracin? a) 0,05 M b) 0,002 N 3.- Describa la preparacin de 3 litros de HCl 0,25 M, utilizando una solucin comercial concentrada de HCl ( 32% p/p, d= 1,16 kg/l). 4.- 50 ml de H3PO4 85% p/p, d= 1,71 g/ml se diluyeron a 200 ml con agua. Calcule la normalidad de la solucin. 5. a) Cuntos ml de NaCl 0,5 M se necesitan para preparar 2 litros de NaCl 2 mM? b) Cuntos ml de KCl 0,3 M se necesitan para preparar 2 litros de solucin 50 mM?

6.- Ud. dispone de varias soluciones concentradas: NaCl 2M; KCl 0,5 mM; MgCl 2 100 mM y CaCl2 1,3 M. A partir de esto, describa la preparacin de 2 l de una solucin que contenga NaCl 120 mM, KCl 35 M, MgCl2 0,03mM y Na2SO4 0,06 M. 7.- Respecto de la solucin preparada en 6, calcule la concentracin para el anin Cl y para el catin Na+.
-

pH Y TAMPONES
ACIDOS Y BASES Segn la definicin de Bronstedt: CIDO: es un compuesto que tiende a ceder protones al medio. BASE: es un compuesto que tiende a captar protones del medio. En medio acuoso, la reaccin correspondiente de un cido HA ser: HA + H2O -- H3O+ + A u obviando la participacin del agua: HA -- H + A
+ -

(1)

Considerando esta reaccin en el sentido inverso, la especie a- puede captar protones. A- es la base conjugada de HA. Similarmente para una base B: B- + H+ - BH+ BH es el cido conjugado B. Ejemplos de bases segn Bronstedt son los compuestos orgnicos bsicos, que deben su basicidad al grupo funcional amino. FUERZA DE ACIDOS Y BASES Un cido o una base fuerte es el que est completamente disociado en solucin. En cambio, un cido dbil est solamente parcialmente disociado y la base parcialmente protonada. cidos fuertes son: HCl, HNO3, HClO4, H2SO4 (ambos protones), H3PO4 (solamente el primer protn que se disocia). Bases fuertes son: NaOH, KOH, etc. cidos y bases dbiles: prcticamente todos los cidos y bases orgnicos pertenecen a este grupo. cidos y bases dbiles Consideremos a modo de ejemplo el cido actico, HOAc. Frmula estructural: CH3- COOH Este cido dbil posee un solo protn cido. En solucin acuosa coexisten en equilibrio molculas de la especie protonada con molculas del anin acetato (OAc) y protones. La relacin entre la concentracin de las especies nombradas a una temperatura determinada est dada por la constante de equilibrio de la reaccin de disociacin, llamada constante de acidez, Ka: HOAC ---- OAc- + H+ (3)
+

(2)

Ka = OAc H
+

HOAc Ka de HOAc (25 C): 1,78 x 10-5 Se suele expresar la acidez a travs del pKa en vez de usar Ka: pKa = - log Ka pKa de HOAC (25 C)=4,75 Se cumple: que a mayor Ka ======== menor pKa ===== mayor acidez Con el fin de comprender mejor el significado de la constante de acidez, calcularemos la concentracin de las especies presentes en una solucin 0,1 M de HOAc. Segn la ecuacin 3 H+ = OAc = x HOAc = 0,1 x El valor numrico de Ka indica que HOAC estar poco disociado, luego podemos aproximar: HOAc = 0,1 reemplazando en la expresin de Ka Ka = x2 = 1,78 x 10-5 0,1 x = 1,33 x 10 M Es decir, en nuestra solucin: HOAc = 0,1 M OAc = H+ = 1,33 mM Comprobamos que la aproximacin hecha fue correcta. El pH de la solucin es igual a pH = - log (1,33 x 10-3) = 2,88 Para una base dbil B se puede definir la constante de basicidad Kb Kb = BH+ B H+ Sin embargo, lo usual es caracterizar las bases dbiles a travs de la constante de acidez de su + cido conjugado BH (invirtiendo la reaccin 2). Para un par cido/base conjugada se cumple: Ka x Kb = Kw y Kw = H+ x OH- = 10-14 (25 C) Kw = constante de disociacin del agua ECUACIN DE HENDERSON-HASSELBACH En forma anloga a lo visto para HOAC, para un cido dbil HA: Ka = A H HA
+ -3

Despejando H+ y aplicando log se obtiene

pH = pKa + log A
-

Ecuacin de Henderson-Hasselbach HA

Esta ecuacin establece la relacin entre pH y la proporcin entre la especie protonada y desprotonada. Se usa para calcular el pH de la mezcla de un cido dbil con un cido fuerte o una base fuerte de un cido dbil con su sal, mezclas tampn, etc..

SOLUCIONES TAMPON Cuando se titula una solucin de HOAc con una solucin de una base fuerte (NaOH), midiendo el pH despus de cada adicin se obtiene el siguiente grfico, llamado curva de titulacin:

pH

zona tamponante

punto de equivalencia

ml NaOH
Se aprecia que en un rango de pH alrededor de 4,75 (pKa) el pH vara muy poco durante la adicin de base, se trata de la zona tamponante del par HOAc/OAc-. (Definiremos este concepto ms adelante). Las reacciones involucradas son: 1. NaOH 2. OH- + H+ 3. HOAc Na+ + OHH2O + OAc + H

La suma de las dos primeras reacciones hace disminuir la concentracin de protones en la solucin. Sin embargo, la tercera reaccin simultneamente repone parte de los protones neutralizados. El equilibrio de disociacin de HOAc se desplaza hacia la formacin de acetato. Para: pH = pKa ocurre que [HOAc] = [OAc-] (Verifique esta aseveracin)

A medida que la concentracin de la especie protonada HOAc en la solucin se hace pequea, el pH comienza a aumentar ms fuertemente, hasta que la solucin pierde su caracterstica de tampn. Al titular una solucin bsica que contiene el anin acetato con un cido fuerte se observa el mismo fenmeno. Estaramos recorriendo nuestra curva de derecha a izquierda. Solucin tampn (solucin amortiguadora o buffer): Es una solucin cuyo pH se mantiene prcticamente constante cuando se le agregan pequeas cantidades de cido o base. Las soluciones tampn son sistemas formados por un cido dbil y su base conjugada o por una base dbil con su cido conjugado. Zona tamponante de un sistema tampn: Es el intervalo de pH en el cual el sistema posee propiedades de tampn, depende del valor del pKa de la especie protonada. Un tampn es "bueno" aproximadamente 1 unidad de pH alrededor del pKa. Los valores de pKa para algunos tampones de uso comn en bioqumica estn contenidos en la tabla 1. Tambin se usan mezclas de dos diferentes sistemas tampn, ejemplos: Tampn tris/fosfato, trietanolamina/dietanolamina. Capacidad de una solucin tampn: La capacidad de una solucin tampn indica la cantidad de cido o de base que es capaz de absorber sin cambiar fuertemente su pH y depende de: - pH : es mxima para pH = pKa - concentracin: a mayor concentracin, mayor capacidad tamponante. Concentracin de una solucin tampn: Es la suma de las concentraciones de la especie protonada y de la especie deprotonada.

Compuesto Acido fosfrico (pka1) Glicina Acido ctrico (pKa1) Acido frmico Acido actico Acido ctrico (pKa2) Acido ctrico (pKa3) MES (cido conjugado) Imidazol (cido conjugado) Acido fosfrico (pKa2) HEPES (cido conjugado) Trietanolamina (cido conjugado) TRIS (cido conjugado) Acido fosfrico (pKa3) Seleccin de un tampn: Las variables a considerar son en primer lugar: a) El pH al cual deseamos trabajar b) La capacidad que necesitamos Otros aspectos importantes pueden ser:

pKa (20C) 1,96 2,45 3,10 3,75 4,75 4,75 5,40 6,15 7,00 7,21 7,55 7,77 8,08 12,30

c) Solubilidad de los compuestos Ejemplo: Una desventaja de los buffer de fosfato es la baja solubilidad de sus sales. d) Variacin del pH con la temperatura: Ejemplo: Una desventaja de los tampones de Tris es que su pH vara notoriamente con la temperatura.

e) Volatilidad: Algunos sistemas tampn presentan la ventaja de ser voltiles. Ejemplo: Acetato de amonio, bicarbonato de amonio. f) Transparencia a la luz U.V.: Cuando se desea detectar un compuesto por absorciometra, es necesario usar un buffer que sea suficientemente transparente a la longitud de onda de la determinacin. g) Interacciones entre el sistema tampn y las sustancias en estudio. Ejemplo: influencia de un sistema tampn sobre la actividad de determinada enzima. Clculos relacionados con la preparacin de tampones: Ejemplo: Se desea preparar un litro de buffer acetato 0,1 M de pH = 4,60 a partir de cido actico 2 M y acetato de sodio. La ecuacin de Henderson-Hasselbach permite calcular la razn de las concentraciones de HOAc y OAc- necesaria para que el pH de la solucin sea igual a 4,60: pH = pKa + log [OAc-] ; reemplazando el pKa de HOAc y el pH: [HOAc] 4,60 = 4,75 + log [OAc-] [HOAc] log [OAc-] = -0,15 [HOAc] [OAc-] = 0,708 [HOAc]

Por otra parte: [HOAc] + [OAc-] = 0,1 (todas las concentraciones en M) [HOAc] = 0,1 - [OAc-] Reemplazando: [OAc-] = 0,708 0,1 - [OAc-] [OAc-] = 0,0708 - 0,708 [OAc-] [OAc-] = 0,0708 = 0,0415 M 1,708 [HOAc] = 0,1 - 0,0415 = 0,0585 M Se desea preparar un volumen igual a un litro, luego se necesitan 0,0415 moles de acetato de sodio. NaOAc : PM = 82 0,0415 moles = 3,4 g HOAc: se aplica la relacin de las diluciones

V1 = 1 (l) x 0,0585 M = 0,0293(l) 2M Preparacin de la solucin: en un matraz aforado de 1 litro se colocan 3,4 g de acetato de sodio ms 29,3 ml de HOAc 2 M y se afora con agua.

PROBLEMAS TAMPONES
1. Cules son a) H , b) OH ; c) pH; de una solucin de un cido fuerte HX de concentracin 5 mM? Resp.: a) 5 x 10-3 M c) 2,30 b) 2 x 10-12 M 2. a) La concentracin de iones H de una muestra de orina es 2 x 10 M. Cul es su pH? b) El pH de una muestra de suero es 7,4 Cul es la concentracin de iones hidrgeno? Resp.: a) 6,7 b) 4 x 10-8 M 3. Cuntos iones de a) H+ y b) OH- estn presentes en 250 ml de una solucin de pH = 4? Resp.: a) 1,51 x 1019 b) 1,51 x 1013 4. Cuntos millitros de HCl 0,05 N se requieren para neutralizar exactamente 20 g de NaOH? Resp.: 10000 ml = 10 litros 5. Cuntos g de NaOH slido se necesitan para preparar?: a) 250 ml de una solucin 0,08 M y b) 500 ml de una solucin de NaOH a pH 9,7? Resp.: a) 0,8 g b) 1,00 mg 6. El pH de una solucin 0,02 M de cido dbil HA es 4. a) cul es el grado de ionizacin de HA en la solucin? b) cul es el Ka? Resp.: a) 0,5% b) 5,03 x 10-7 7. El Ka de un cido HA es 1,6 x 10-6 a) Cules son pH y grado de ionizacin del cido en una solucin 10-3 M? b) Calcular el pKa Resp.: a) 4,40; 4% b) 5,80 8. Cul es la concentracin de cido actico y acetato en un tampn acetato de concentracin 0,1 M y pH 6,0? El Ka para el cido actico es 1,78 x 10-5 Resp.: 94,7 mM; 5,3 mM ( [OAc-] y [HOAc] respectiv.) 9. Calcule el pH de las soluciones obtenidas al mezclar 10 ml de NaOH 0.01 M, con 90 ml de: a) H2O b) NaCl 0,1 M c) una solucin que contiene 0,05 M HOAc y 0,05 M NaOAc. Cul ser el valor inicial del pH de la solucin? Discuta los resultados. Resp.: a) 11 b) 11 c) 4,77 10.Cul es el pH de una solucin que contiene acetato potsico 0,3 M y cido actico 0,15 M? (pKa cido actico = 4,75) Resp.: 5,05 11. Cul es el pH de una solucin que contiene NH4Cl 0,1 M y NH3 0,2 M. pKb NH3 = 4,6. Resp.: pH 9,7 12. Se prepar un "buffer" disolviendo en agua 5 x 10-3 moles de cido frmico y 7 x 10-3 moles de formiato de sodio en un volmen final de 1 l. El Ka del cido frmico es 1,8 x 10-4. a) calcular el pH de la solucin resultante b) si esta solucin se diluyera 10 veces cul sera el pH final? Resp.: a) 3,89 b) 3,89 13. Calcular el pH de una solucin formada cuando a 200 ml de cido actico 0,5 M se le aaden 100 ml de NaOH 0,1 M. pKa cido actico = 4,75 Resp.: 3,8 14. Los tampones Tris/HCl se pueden obtener agregando HCl a una solucin de Tris. Tris = Tris (hidroximetil)aminometano Frmula estructural: (CH3OH)3 CNH2 PM: 121,1 Acido + conjugado: Tris H , pKa = 8,1. Calcule la cantidad en gramos de Tris y el volmen de HCl 1 M que se requiere para preparar 1 l de un buffer Tris/HCl 0,2 M, pH 7,5
+ -7 + -

Resp.: 24,2 g; 160 ml 15. Una solucin amortiguadora contiene cido actico 0,1 M y acetato de sodio 0,1 M. Calcular el pH despus de la adicin de 10 ml de HCl 0,1 N a 90 ml del amortiguador. Resp.: 4,65 16. Describir la preparacin de 2 litros de tampn fosfato 0,15 M, pH 6,9 partiendo de: a) solucin 2 M de H3PO4 y solucin 1 M de KOH b) soluciones 1 M de KH2PO4 y Na2HPO4 c) KH2PO4 slido y K2HPO4 slido Resp.: a) 150 ml H3PO4 2 M b) 200 ml KH2PO4 c) 27,2 g KH2PO4 400 ml KOH 1 M 100 ml Na2HPO4 17,4 g K2HPO4 17. La piridina es una base orgnica que reacciona con los H+ para formar Pyr-H+ Para Pyr-H+ : pKa = 5,36. Se desea preparar un tampn de piridina/HCl de pH 5,5 titulando 50 ml de piridina 0,1 M con HCl 0,1 M. Cunto HCl se gastar? Cul ser la concentracin del tampn? Resp.: 21 ml; 0,070 M OBSERVACION: Grado de ionizacin de un cido es la fraccin de la concentracin total que se encuentra disociada, se suele expresar como porcentaje.

Laboratorio 1: Determinacin del pH y preparacin de soluciones amortiguadoras y diluciones Objetivo: Aprender el uso correcto del pH metro y preparar soluciones con diferentes valores de pH. Materiales y mtodos Materiales Potencimetro, pipetas Pasteur, probetas de 100 ml, vasos precipitados de 250 ml, piseta con agua, agitador magntico, esptula. Muestras para determinar pH: leche, jugo, bebidas, etc. Reactivos Solucin estndar pH 4, pH 7; Solucin de NaOH 10M, HCl concentrado, cido actico, acetato de sodio, EDTA, Sulfato de cobre 10g/L Mtodos Uso del pH metro y medicin del pH 1.- El electrodo del pHmetro siempre debe estar sumergido en una solucin de KCl o agua destilada. Enjuagar el electrodo con agua destilada y secar. 2.- Ajustar el pHmetro primero a pH 7, despus a 4 con soluciones reguladoras comerciales. 3.- Entre cada pH enjuagar con agua destilada. 4.- Determinar el pH de varias muestras como leche, jugos, refrescos, etc, Preparacin de diferentes soluciones 1.- Preparar 100 mL de una solucin amortiguadora de acetato de sodio 50 mM, pH 5. Para realizar esto, primero debe calcular cuntos gramos de acetato de sodio se necesitan, disolverlos en menos de 100 ml de agua destilada (por ejemplo 70mL) y ajustar el pH a 5 con cido actico. Usar la formula M= (n/V) = (m PM)/V (M= molaridad, m=masa en gr, P.M.= peso molecular y V= volumen en litros) para hacerlos clculos. 2.- Preparar 100 ml de EDTA 0.5 M pH 8 Calcular cuntos gramos de EDTA necesitas, poner en 60 ml, comenzar a disolver con agitador magntico y tratar de ajustar el pH cercano a 8 (el EDTA comenzar a disolverse) y adicionar poco a poco ms agua. Ajustar a pH 8 y aforar a 100 ml. Preparacin de diluciones 1.- Calcular la concentracin molar y el % p/v de una solucin de sulfato de cobre (CuS04) que tiene 10g/L. 2.- A partir de esta solucin, calcular la preparacin de soluciones de un volumen final de 5 ml, diluidas 1/2 v/v, 1/5 v/v, 1/10 v/v y 1/20 v/v, indicando los volmenes de cada componente a mezclar. DILUCION 1/2 1/5 1/10 1/20

Volumen mL Cu SO4 H2O Total

Cuestionario 1. Porque el pH del potencimetro se ajusta primero a pH 7 y no a 4 o 10? 2. Porque el electrodo se tiene que mantener en una solucin de KCl saturado? En caso de no contar en el laboratorio con KCl, Que otros compuestos pueden usarse? 3. Si quisieras preparar un buffer de fosfatos de potasio pH 11, que sales seleccionaras? 4. El buffer de acetato de sodio que preparaste est a un pH que se puede considerar adecuado para servir como solucin amortiguadora? .Explica tu respuesta. 5. En la preparacin del acetato de sodio, cual es el cido y cual la base conjugada. Bibliografa 1. Wilson, K., and Walker, J. 2000. Principles and Techniques of practical Biochemistry. Fifth edition. Cambridge University Press. 2. Robert, JF., and White B.J. 1990. Biochemical techniques theory and practice. 1st edition. Waveland Press, Inc. USA. 3. Douglas A. Skoog and Donald M. West.1971.Principles of Instrumental Analysis. Holt, Rinehart and Winston, Inc. 4. Rodney F. Boyer.1986. Modern Experimental Biochemistry. The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 5. Sambrook, J., E.F. Fritsch and T. Maniatis. 1989. Molecular cloning. A laboratory Manual. Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press

Laboratorio 2 : Espectrofotometra: Absorciometria Montaje de una Tcnica Fotocolorimetrica

PRINCIPIOS DE ABSORCIOMETRIA DE UV/VISIBLE La absorciometra aprovecha la propiedad de ciertos compuestos de absorber radiacin electromagntica. Los diferentes tipos de radiacin electromagntica, como ser rayos X, luz ultravioleta (UV), luz visible, luz infrarroja, ondas de radio, etc., se propagan a velocidad comn pero difieren en longitud de onda y frecuencia. Se cumple que: c=x c = velocidad de la luz en el vaco = longitud de onda = frecuencia El ojo humano detecta la radiacin del rango de longitudes de onda de 400 a 800 nm, llamada luz visible (1 nm = 10-9 m). La luz del espectro visible y del UV cercano (200 a 400 nm) posee la energa necesaria para producir transiciones de electrones desde un orbital molecular de menor energa a otro de mayor energa de ciertos compuestos, llamados cromforos. Las sustancias coloreadas absorben luz visible, su color corresponde a la radiacin no absorbida. La luz solar es blanca, ya que contiene radiacin de todo el espectro visible, aparte de otras radiaciones. LEY DE LAMBERT-BEER La ley de Beer-Lambert (o Lambert-Beer) es la ley fundamental de la absorciometra, ya que relaciona la absorcin de la luz con la concentracin de soluciones. Consideremos un haz de luz monocromtica (luz de una sola longitud de onda) que atraviesa una solucin de un compuesto contenido en un recipiente de vidrio. El siguiente esquema ilustra la situacin:

cubeta concentracin c

solucin

de

I0 luz incidente
l
Io I l c = intensidad del haz incidente = intensidad del haz transmitido = camino ptico (ancho interior de la cubeta medido en cm). = concentracin

I luz transmitida

Si el compuesto absorbe a la longitud de onda dada, I es menor que Io. Cuanto mayor es el nmero de molculas de este cromforo encontradas por el haz de luz en su camino, menor ser la intensidad de la luz transmitida. Dicho nmero de molculas depende de la distancia recorrida a travs de la solucin (camino ptico) y de la concentracin. La relacin entre estos parmetros est dada por la ley de Lambert-Beer:

I = Io x 10- lc

(1)

La forma de esta ley usada en la prctica es ms sencilla y se obtiene de la siguiente manera: Reordenando y aplicando logaritmos: log I = - l c Io Se define como absorbancia (A) de una solucin: A = log Io ----I A=lc (2)

Luego:

(3)

ley de Beer-Lambert (forma lineal)

Por convencin se usa el siguiente sistema de unidades: l = camino ptico en cm c = concentracin en M = coeficiente de extincin molar, en cm-1 x M-1 Sinnimos de absorbancia: densidad ptica, extincin.
El coeficiente de extincin molar: es una caracterstica propia del cromforo a una longitud de onda dada y representa la probabilidad de que el cromforo absorba la radiacin. Para explicar el significado se suele sealar que es igual al valor numrico de la absorbancia que tendra una solucin 1 M del cromforo si el camino ptico es igual a 1 cm. Es importante recalcar el carcter hipottico de esta afirmacin, ya que normalmente no es posible preparar soluciones de concentracin 1 M de los cromforos (si el PM es alto, 1 M es una concentracin extremadamente alta), y por otra parte el rden de magnitud de los coeficientes de extincin molar importantes corresponde a valores muy superiores al intervalo de absorbancias medibles en la prctica. Los coeficientes de extincin pueden tomar valores hasta 100.000 cm-1 M-1, aproximadamente. Para compuestos de peso molecular desconocido se usa en vez del coeficiente de extincin molar la absorbancia de una solucin de concentracin estndar expresada en % P/V, 0,1% medida en una cubeta de camino ptico dado como referencia. Ejm.: para protenas se usa A (l = 1 cm), y para protenas tpicas a 280 nm tiene valores cercanos a 1. Por otra parte, se define como transmitancia (T) de una solucin: T=I (4) Io Es decir, la transmitancia es la fraccin de la intensidad incidente transmitida por la solucin. T se puede expresar como porcentaje (%T). %T = I x 100 Io Aplicando logaritmos a (4) y reemplazando con (2) se obtiene: A = - log T (5) Ejm: Si %T = 50, entonces T = 0,50 y A = 0,301 La ley de Lambert-Beer indica que para un cromforo a una longitud de onda dada la absorbancia aumenta en forma lineal con la concentracin (con l = cte), mientras que la transmitancia disminuye en forma exponencial. (Fig. 1 y 2).

A A=lc T T = 10 - l c

pendiente = x l c Fig. 1 Fig. 2 c

El grfico de la absorbancia de un cromforo en solucin en funcin de la longitud de onda se denomina espectro de absorcin. Un espectro de absorcin se obtiene variando la longitud de onda para l y c constantes, y por lo tanto representa la variacin de A con la longitud de onda (segn (3)). A continuacin se muestra como ejemplo el espectro de absorcin de riboflavina (en fosfato de sodio, a pH 7,0). A

260 longitud de onda ()

340

420

500 nm

El espectro de absorcin de UV/visible es caracterstico para un cromforo determinado, por lo tanto se puede usar para su identificacin. Las caractersticas espectroscpicas se pueden resumir, indicando la posicin de los mximos de las bandas de absorcin ( mx) con los correspondientes coeficientes de extincin. Por ejemplo, para riboflavina a pH 7,0: mx (nm) 266 373 445 (M-1 cm-1) 31.800 10.400 12.500

La riboflavina tiene color amarillo, debido a que su nica banda en la regin del visible a 445 nm, corresponde a absorcin de luz azul. CALCULOS EN ABSORCIOMETRIA De la ley de Lambert-Beer se puede deducir: a) Para diluciones, si la absorbancia se mide a una misma longitud de onda, en la misma cubeta: A1 A2 b) V2 V1

En un espectro: A1 A2 1 2

La aditividad de la absorbancia: La absorbancia de una solucin a cierta longitud de onda es igual a la suma de las absorbancias de todos los cromforos que contiene. AT = A1 + A2 + A3 + ...

INSTRUMENTOS DE MEDIDA Los componentes bsicos de todos los instrumentos que se usan en absorciometra de UV/visible son: - Fuente de luz - Dispositivo que permite seleccionar la longitud de onda - Compartimento de muestra - Detector - Dispositivo que permite la lectura directamente o inscriptor Se pueden distinguir dos tipos de instrumentos: a) Fotmetros de filtro: La seleccin de la longitud de onda se realiza mediante filtros intercambiables. Espectrofotmetros: Poseen un monocromador, son ms sofisticados que los fotmetros de filtro. Por otra parte se distinguen instrumentos que operan en el rango visible solamente y otros que abarcan el UV y el visible (tienen 2 fuentes de luz). Adems existen instrumentos de 1 solo haz y de doble haz.

b)

El siguiente esquema muestra el trayecto de la luz en un espectrofotmetro que opera con luz visible:

I0
lmpara de Tungsteno Monocromador Cubeta en portacubetas

I 0.532
Fototubo Pantalla de lectura

1. FUENTE DE LUZ: No existe una fuente de luz que proporcione radiacin de todo el rango espectral UV/visible de suficiente intensidad, por consiguiente se usan fuentes diferentes: Fuente de luz visible: lmpara de tungsteno. Sirve para 340-850 nm aproximadamente. Fuente de luz UV: lmparas de H2 o D2. Sirven para 200-375 nm aproximadamente. 2. SELECCION DE LA LONGITUD DE ONDA: 2.1. Filtros No proporcionan luz realmente monocromtica sino que permiten el paso de un cierto rango de longitudes de onda alrededor de la longitud de onda de mxima transmitancia del filtro. 2.2. Monocromadores Poseen un elemento dispersor, que puede ser un prisma o una red de difraccin. El elemento dispersor separa los haces de luz de diferente longitud de onda. Un sistema de espejos permite dirigir el haz de luz de la longitud de onda deseada hacia la ranura de salida:

493 nm 492 nm 491 nm 490 nm 489 nm 488 nm 487 nm 486 nm

Monocromador

ranura 491 nm 490 nm 489 nm luz monocromtica

Al cerrar ms la ranura aumentar la monocromaticidad de la luz, pero siempre pasar un cierto rango de longitudes de onda. La monocromaticidad de esta luz se mide a travs del "ancho de banda" del espectrofotmetro (tpicamente es de 1 a 10 nm). En la prctica se considera que un espectrofotmetro opera con luz prcticamente monocromtica. Un monocromador permite variar la longitud de onda en forma continua, condicin necesaria para obtener espectros de absorcin. Con un fotmetro de filtro no es posible obtener espectros de absorcin. 3. COMPARTIMENTO DE MUESTRAS: All se ubica la o las cubetas con las soluciones de muestra y de referencia. Las cubetas son de vidrio o plstico (para el visible) o cuarzo (para el UV). 4. DETECTOR: Los detectores son de tipo fotoelctrico: al incidir luz producen corriente elctrica, de intensidad proporcional a la intensidad de la luz. Los detectores ms usuales son los fototubos y los tubos fotomultiplicadores o fotomultiplicadores. 5. LECTURA O REGISTRO: La mayor parte de los instrumentos indican o registran el valor de la absorbancia. Si el instrumento informa la transmitancia se calcula A usando la ecuacin (5). La absorbancia normalmente se mide con 3 cifras despus de la coma. El rango fotomtrico de los espectrofotmetros normalmente es desde A = 0,000 hasta A = 2,000 3,000, dependiendo del modelo. APLICACION DE LA ABSORCIOMETRIA EN EL ANALISIS CUANTITATIVO 1. DETERMINACION DE LA CONCENTRACION DE UN CROMOFORO PURO Midiendo la absorbancia de la solucin problema en un espectrofotmetro y conociendo el correspondiente coeficiente de extincin molar se puede calcular la concentracin. Normalmente se usa la longitud de onda del mximo de una banda, cuyo valor se encuentra en la literatura. Un mtodo alternativo es construir una curva de calibracin de A en funcin de c, que ser una recta si se cumple la ley de Lambert-Beer (ver fig.1). Interpolando en la recta con la absorbancia de la solucin problema se puede determinar su concentracin. Una ventaja del mtodo con curva de calibracin es que permite usar tambin un fotmetro de filtro. La pendiente de la curva de calibracin se ha llamado factor de calibracin, k. Luego:

A=kc

(6)

Si se ha usado un espectrofotmetro de buena calidad: k = x 1 Si el nmero de muestras es alto, ser ms prctico determinar k, desde el grfico y usar la ecuacin (6) que interpolar. 2. DETERMINACIONES A TRAVES DE UNA ENSAYO O "TEST" Muchos compuestos que no pueden ser determinados directamente (midiendo su propia absorbancia), se pueden determinar por absorciometra usando un ensayo o "test". En el ensayo se agrega uno o varios reactivos cromognicos que interaccionan o reaccionan especficamente con el compuesto a determinar, generndose un compuesto o complejo que absorbe. Normalmente en los test se genera un color (absorbancia de luz visible), por lo que se denominan ensayos colorimtricos. Casos en los cuales se realiza un test: 1. El compuesto no absorbe en todo el UV/visible: Ejemplo: Determinaciones de azcares, determinacin de fosfato. El compuesto absorbe en una regin espectral (generalmente UV), pero no se puede efectuar la determinacin directa porque la muestra o "solucin problema" es una mezcla que contiene otros compuestos que absorben en la misma regin que el compuesto a determinar o/y la absorbancia es demasiado baja Ejemplo: Determinacin de protenas. En este caso adems es indispensable un test, si se analiza una muestra con varias protenas, de coeficientes de extincin desconocidos. El test se realiza en paralelo con la muestra problema, con una o varias soluciones del compuesto a determinar, de concentracin conocida (soluciones patrn o estndar) y con el solvente (blanco del test). Posteriormente se miden las absorbancias "contra" el blanco, es decir, en instrumentos de 1 solo haz, se calibra A = 0 con el blanco en el haz. Alternativamente se pueden medir contra agua, y restar la absorbancia del blanco de todas las absorbancias. Esta A ser proporcional a la concentracin del compuesto que se va a determinar dentro de cierto rango de concentraciones, especfico para cada test. Si se us solamente una solucin, se calcula la concentracin por proporcin directa: C (problema) = A (problema) C (estndar) A (estndar) Si se usaron varias soluciones estndar se construye la curva de calibracin del test. Para determinar la concentracin del compuesto en la muestra problema se puede interpolar en la recta o usar el factor de calibracin, como se explic anteriormente. Es necesario destacar que para un test k no es igual a un producto x 1. Al usar un test, debe tomar en cuenta la posible presencia en la muestra de compuestos que interfieran con el test, sealados normalmente en la literatura, junto al mtodo. BIBLIOGRAFIA (Espectrofotometra) 1. 2. 3. 4. H.Willard, L.Merrit, J.Dean "Instrumental Methods of Analysis". G.Ewing "Instrumental Methods of Chemical Analysis". D. Freifelder, "Physical Biochemisty". S.B.Brown, Ed. "An Introduction to Spectroscopy for Biochemists".

2.

Parte Experimental: En el presente prctico se estudiar la validez de la ley de Lambert Beer para soluciones acuosas de permanganato de potasio. Este compuesto presenta en el espectro visible una banda de absorcin ancha, provista de hombros, cuyo mximo est a 525nm ( = 2.500M-1 cm-1). Para la determinacin fotocolorimtrica de sustancias que no absorben en la regin del visible, se usa una reaccin especfica que lleva a la formacin de un producto (o productos) coloreado. En estos casos es indispensable construir una curva de calibracin para la determinacin. Ejemplos tpicos son las determinaciones de protenas (mtodo de Biuret, Mtodo de Bradford, etc). Materiales: Solucin de permanganato de potasio 0.1M Buretas, matraces aforados de 100 ml Pipetas. Procedimiento: 1.- Prepare 100ml de una solucin de KMnO4 que tenga absorbancia cercana a 1 a 525 nm. No es necesario efectuar una dilucin rigurosamente cuantitativa. Esta solucin se usar como muestra problema 2.- Trace el espectro de absorcin de la solucin problema en el rango espectral 400-600 nm Efectuar las lecturas a intervalos de 10, 5, 2 o 1 nm, determinando la posicin de los mximos con mayor exactitud posible. Grafique los valores en papel milimetrado. 3.- Prepare 7 soluciones estndar cuya absorbancia en el mximo cubra en el rango entre 0 y 1.4 Utilice para ello una solucin prediluida de permanganato 1mM. Mida la absorbancia de las soluciones en el mximo y a dos longitudes de onda situados en los flancos. En forma previa al prctico: Efecte los clculos necesarios para 1 y 3 y prepare una tabla de la siguiente forma: Tabla 1 Solucin ml KMnO4 1mM Concentracin 525nm A (medida) ___nm _____nm

N 1 2 3 4 5 6 7 Contenido del informe adicional:

Espectro de absorcin del KMnO4 Clculo de la concentracin de la solucin problema Tabla N 1 Curvas de calibracin: Grfico de A en funcin de C para cada longitud de onda ( en el mismo grfico) Determinacin de la concentracin de la solucin problema usando la curva de calibracin ms adecuada.

Laboratorio 3y 4: Reconocimiento de Hidratos de Carbono

Mtodos cualitativos para la identificacin de carbohidratos (Monosacridos, Disacridos y Polisacridos) 1. Objetivos: Identificar por mtodos colorimtricos cualitativos los principales monosacridos, disacridos y polisacridos. 2. Introduccin Los carbohidratos estn distribuidos ampliamente en vegetales y animales en los cuales tiene participacin estructural, funcional y metablica. Los carbohidratos se clasifican dependiendo del nmero de tomos de carbono que posee y la funcin aldehdica o cetonia, estas a su vez le confiere la base para la mayora de las reacciones usadas para su identificacin y cuantificacin. Cuando el carbohidrato est formado por una sola molcula de carbohidrato, se denomina monosacrido, por dos, disacrido y por ms de dos, polisacrido. Los disacridos son azucares formados por la unin de dos monosacridos mediante el enlace glucosdico. Si este enlace se efecta entre dos carbonos anomricos, el disacrido no tendr el potencial aldehdo o cetona libre, por lo tanto no dan positivas aquellas pruebas que involucren la participacin de estos grupos, recibiendo el nombre de azcar no reductor, la sacarosa y la trealosa son ejemplos de los disacridos no reductores (ver anexos). Todos los disacridos que posean un carbono anomrico libre, darn positivas estas reacciones, llamndose azucares reductores, debido a que promueven la reduccin del reactivo usado y ellos mismos se oxidan. Aunque la mayora de los disacridos carecen de importancia para el hombre, con algunas excepciones como la sacarosa, su estudio se debe a que disacridos como la maltosa y la celubiosa, se originan como producto de la hidrlisis de polisacridos, la maltosa, por ejemplo, es el producto de la hidrlisis del glucgeno y el almidn. Los polisacridos, si son abundantes y representan para el hombre la principal fuente de energa metablica de fcil aprovechamiento, el almidn, constituido por solo molculas de glucosa es sin lugar a dudas la base alimenticia del globo terrestre, especialmente en la poblacin de bajos recursos. En el anexo, se muestran las estructuras de los principales mono, di y polisacridos. 3. Material y Metdos A.- Prueba de Molish Es una reaccin general para carbohidratos que contienen ms de 5 tomos de carbono, la reaccin se muestra en la siguiente figura: Fig. 1: Reaccin de Molish

B.- Prueba de Barfoed: Es una reaccin para identificar monosacridos, aunque algunos disacridos (los reductores) dan positiva la reaccin, pero con mas tiempo de calentamiento, ya que as se hidroliza el disacrido. El fundamento radica en la reduccin del acetato cprico a oxido cuproso. C.- Prueba de Bial o de Orcinol-HCl Es una prueba especfica para pentosas la cual se muestra en la figura 2. La positividad se reconoce por la formacin de una coloracin verde botella brillante. Fig. 2: Reaccin de Bial

D.- Prueba de Seliwanoff: Es especfica para cetosas que contengan 5 o ms tomos de carbono, pero se usa casi exclusivamente para identificar fructosa. La reaccin se presenta en la figura 3. Fig. 3: Reaccin de Seliwanoff

E.- Prueba de Lugol: Es una prueba que se usa para identificar almidn. El color azul, se debe, posiblemente a la formacin de un complejo: Ioduro de almidn.

G.- Prueba de Benedict: Es una prueba especfica para las sustancias reductoras con grupos carbonilos libres. Fig. 4 Reaccin de la prueba de Benedict cualitativo

H.- Prueba Fenilhidrazina Es una prueba para distinguir asas (y oligosacridos). Los carbohidratos que solo se diferencian en sus tomos de carbono 1 y/o 2 darn la misma osazona, como es el caso de la glucosa y la fructosa, que son isomeros de funcin. La figura 5 muestra la reaccin. Fig. 5 Reaccin de la prueba de Fenilhidrazina

Procedimiento: Materiales Tubos de ensayo, mechero, pinzas de madera Prueba de Molish Procedimiento: En un tubo de ensayo colocar: Sustancia problema Reactivo de molish: MEZCLAR Agregar H2SO4 concentrado Dejar caer lentamente por las paredes del tubo el cido. La aparicin de un anillo violeta-rojizo en el sitio de contacto de los dos lquidos indica que la muestra contiene carbohidratos. Sustancia problema Reactivo de Barfoed: Mezclar y calentar en bao de agua hirviente, contando los minutos y sacra del bao cada tubo inmediatamente despus que haya aparecido el precipitado rojo ladrillo de Cu2O. Anotar el tiempo que corresponda a cada carbohidrato. La aparicin de un precipitado rojo antes de los 6 minutos indica la presencia de un monosacrido. La aparicin de un escaso precipitado rojo, entre los 9 y 12 minutos indica la presencia de LACTOSA o MALTOSA. Sustancia problema Reactivo de Bial: MEZCLAR Llevar a bao mara hirviente durante 3 minutos. La aparicin de un color verde botella, brillante y totalmente transparente indica la presencia de una PENTOSA. Algunos azucares dan con el Bial una coloracin verde, pero sta es opaca. Sustancia problema Reactivo de Seliwanoff: Llevar a bao mara hirviente durante 10 minutos. La formacin de un color rojo cereza indica la presencia de FRUCTOSA. Sustancia problema Reactivo de Lugol: Mezclar y observar. La aparicin de una coloracin azul indica la presencia del ALMIDON y una coloracin roja indica el GLUCOGENO o Eritrodextrina. Si el color no cambia, el carbohidrato es un monosacrido o un disacrido. Sustancia problema Reactivo de Benedict cualitativo: MEZCLAR Llevar a bao mara hirviente por 5 minutos. La aparicin de un precipitado verde, amarillo o rojo indica la presencia de un AZUCAR REDUCTOR. Sustancia problema Reactivo de Fenilhidrazina: MEZCLAR BIEN Coloque los tubos en agua de bao Mara hirviendo durante 10 minutos. Al final del periodo de calentamiento, enfre los tubos en chorro de agua. DEJAR EN REPOSO POR 5 MINUTOS Examinar al microscopio la forma caracterstica de los cristales de osazona colocando con mucho cuidado una gota en el portaobjeto. Cubrir con la laminilla cubreobjeto evitando daar los cristales con movimientos bruscos o exceso de muestra. Volumen 1 ml 2 gotas 0.50 ml

de Barfoed

1 ml 2.5 ml

de Bial

1 ml 1.5 ml

de Seliwanoff

1 ml 2 ml

de Lugol

2 ml 1 gota

de Benedict

0.5 ml 2 ml

Fenilhidrazina

2 ml 5 ml

Marcha analtica para monosacridos, disacridos y polisacridos

INFORME RECONOCIMIENTO DE CARBOHIDRATOS 1. Complete el siguiente cuadro con la informacin deseada. En la casilla N Muestra, coloque el numero de cada tubo de las muestras problemas que se le entrego. Use los signos (+) o (-), para reportar la positividad o negatividad de la reaccin. Sobre la base de los resultados de sus pruebas, Ud. puede identificar la muestra problema. N Muestra 1 2 Molish Barfoed Bial Seliwanoff Lugol Benedict

ANEXO
1.- REPRESENTACIN DE FISCHER DE MONOSACRIDOS Representacin de Fischer de los monosacridos ms frecuentes en la naturaleza:

2.- REPRESENTACIN DE HAWORTH Representacin en estructuras de Haworth: 3.- DISACRIDOS MAS IMPORTANTES Y ESTRUCTURAS DEL PIRANO Y FURANO. Disacridos ms importantes:

4.- ANMEROS DE LA GLUCOSA Y REPRESENTACIN EN SILLA

Laboratorio 5
INTRODUCCION:

Cuantificacin de Protenas

Se han descrito muchos mtodos diferentes para la determinacin cuantitativa de protenas. Estos mtodos difieren entre s en sensibilidad, existencia de interferencias, exactitud y sencillez. La seleccin del mtodo adecuado se realiza considerando las caractersticas de las muestras que se desean analizar, que pueden ser extractos de tejidos animales o vegetales, lquidos biolgicos de inters en bioqumica clnica (suero, orina), muestras obtenidas en el curso de la purificacin de una protena, fracciones de una columna cromatogrfica, muestras de una protena pura, etc. En general los mtodos utilizados para la determinacin cuantitativa de protenas consisten en la determinacin absorciomtrica directa o en ensayos de tipo colorimtrico, turbidimtrico o fluoromtrico. Absorciometra de protenas La mayora de las protenas presentan un mximo de absorbancia a 280 nm aproximadamente, debido principalmente a la presencia de residuos de triptfano y tirosina, y en menor proporcin fenilalanina. Los residuos de histidina, cistena y cistina tambin presentan bandas de absorbancia en el ultravioleta cercano, pero se encuentran a menores longitudes de onda y son de menor intensidad. La posicin exacta del mximo de absorbancia, as como el coeficiente de extincin molar de una protena depende de su composicin aminoacdica. Por consiguiente, solamente para soluciones de una protena pura, conocida, cuyo coeficiente de extincin se ha determinado previamente, se puede calcular la concentracin a partir de su absorbancia. Se han efectuado estimaciones de la concentracin total de protenas en mezcla a partir de la absorbancia a 280 nm (A 280) o usando la razn A 280/A 260 (mtodo de Warburg), que permite corregir el error debido a la contaminacin por cidos nucleicos los cuales presentan un mximo de absorbancia a 260 nm. Las protenas tambin absorben fuertemente a longitudes de onda menores a 240 nm, debido principalmente a la contribucin de los residuos de aminocidos aromticos, as como de los enlaces peptdicos (bajo los 220 nm). La literatura describe mtodos para efectuar estimaciones de concentracin utilizando la absorbancia en esta regin. Sin embargo, todas estas estimaciones pueden llevar a un error considerable debido a la presencia de contaminantes o a una composicin aminoacdica atpica. Ensayos colorimtricos Los ensayos ms usados son los de Biuret, de Bradford, de Lowry y el ensayo usando cido bicinconnico. El ensayo de Biuret se utilizar en el presente prctico. El ensayo de Lowry es de sensibilidad algo menor al de Bradford (0,025 - 0,5 mg/ml), es ms confiable, pero es ms complicado.

Cuantificacion de protenas por el mtodo de Biuret El reactivo de Biuret (sulfato cprico en medio alcalino), reacciona con compuestos que contienen dos o ms enlaces peptdicos dando una coloracin violeta. El color desarrollado se debe a un complejo de coordinacin entre el Cu++ y cuatro tomos de nitrgeno que provienen de dos cadenas peptdicas. El mtodo de Biuret sirve para la determinacin de concentraciones entre 1 y 10 mg/ml. Los dipptidos y los aminocidos (excepto serina y treonina) no dan esta reaccin. Interferencias: Pptidos, Tris, sacarosa y pigmentos biliares tambin generan el color, sales de amonio y sacarosa afectan el color.

PARTE EXPERIMENTAL 1. ENSAYO DE BIURET

MATERIALES Reactivo de Biuret: Preparacin: Colocar 1.5 g de sulfato de cobre (CuSO4 X 5 H2O) y 6 g de tartrato de sodio y potasio (NaKC4H4O6 x 4 H2O) en un vaso de 1000 ml. Agregar alrededor de 500 ml de agua destilada y agitar hasta disolucin. Agregar lentamente y agitando constantemente, 300 ml de hidrxido de sodio 2.5 N. Las dos soluciones deben estar a temperatura ambiente. Agregar 1.0 g de ioduro de potasio y agitar hasta que est totalmente disuelto. Diluir a 1000 ml y guardar en frasco de polietileno. Este reactivo es estable indefinidamente. (Se entregar preparado). Espectrofotmetro. Solucin patrn de albmina 10 mg/ml

PROCEDIMIENTO CURVA DE CALIBRACION Atencin: realice el ensayo de la muestra en forma paralela a la curva de calibracin. Disponga de seis tubos y coloque en ellos volmenes de solucin estndar que contengan 2; 4; 6; 8 y 10 mg de albmina. El sexto tubo selo como blanco, coloque 1 ml de agua destilada en vez de albmina. Complete a 1 ml con agua destilada (De esta forma Ud. ha preparado soluciones de albmina de la concentracin correspondiente al rango del test). Agregue 4 ml del reactivo de Biuret Deje desarrollar color durante 30', luego mida A a 540 nm contra el blanco. (En forma previa la prctico, prepare una tabla que indique para cada tubo: volumen de agua, volumen de solucin estndar, mg/ml (protenas), A.

DETERMINACION DE PROTEINAS EN UNA MUESTRA En un tubo coloque 1 ml de la muestra a determinar. Si es necesario, use la muestra prediluda. Agregue 4 ml del reactivo de Biuret. Deje desarrollar color durante 30' y mida A a 540 nm.

INFORME Contenido (aparte de lo habitual): Tablas de valores Curva de calibracin: grfico de absorbancia en funcin de concentracin. Calculo de la concentracin de la muestra, considerando prediluciones.

BIBLIOGRAFIA

Methods in Enzymology Vol. 3 pg. 447 Bradford, M.M., Analytical Biochemistry 72, 248 - 254 (1976).

Laboratorio 6: Reconocimiento de Enzimas

1. Objetivos: Poner de manifiesto la presencia de la enzima CATALASA en tejidos animales y vegetales. Comprobar la accin de la temperatura sobre la actividad de las enzimas y comprobar la accin hidroltica de la AMILASA. 2. Introduccin Las enzimas son biocatalizadores de naturaleza proteica. Todas las reacciones qumicas del metabolismo celular se realizan gracias a la accin de catalizadores o enzimas. La sustancia sobre la que acta una enzima se denomina substrato. Pasteur descubri que la fermentacin del azcar mediante levaduras, con su conversin en alcohol etlico y anhdrido carbnico es catalizada por fermentos o enzimas. En 1897 Buchner logr extraer de las clulas de levadura las enzimas que catalizan la fermentacin alcohlica. Sumner en 1926, aisl en forma cristalina la enzima ureasa, a partir de extractos obtenidos de Cannavalia enzyformis (Fabaceae) la que hidroliza la urea segn la siguiente reaccin: UREASA (NH2)2 CO + H2O CO2 + 2 NH3 En 1930, Northrop aisl en forma cristalina las enzimas digestivas: pepsina, tripsina y quimotripsina. En la actualidad se conocen ms de 2000 enzimas que han sido aisladas en forma cristalina. En trminos generales los catalizadores se caracterizan por las siguientes propiedades: 1 Son eficaces en pequeas cantidades. Tienen un nmero de recambio alto, que vara entre 100 y 36 millones (anhidrasa carbnica). El nmero de recambio o actividad molar, se define como la cantidad de substrato transformado en la unidad de tiempo por una cantidad dada de enzima, por ej. la catalasa hidroliza 5,6 x 106 molculas de H2 O2 por molcula de enzima por minuto, por lo que su nmero de recambio es 5,6 x 106. 2 No se alteran durante las reacciones en que participan. 3 Aceleran el proceso para la obtencin del equilibrio de una reaccin reversible. 4 Muestran especificidad. La accin de la enzima es extremadamente selectiva sobre un substrato especfico. Las enzimas tienen pesos moleculares que oscilan entre 12.000 y un milln. Algunas enzimas son protenas conjugadas; ya que poseen un grupo no proteico o prosttico, por Ej. un azcar glucoprotenas, un lpido -lipoprotenas, un cido nucleico -nucleoprotenas. Una enzima completa se denomina holoenzima, y est formada por una parte proteica (apoenzima) y un cofactor no proteico (coenzima). HOLOENZIMA = APOENZIMA + COENZIMA Entre los cofactores que requieren las enzimas para su funcionamiento estn las coenzimas: NADPH+H (nicotinamida adenina dinucletido fosfato reducido), NAD (nicotinamida adenina dinucleotido), FAD (flavina adenina dinucletido), piridoxal, biotina, tiamina, cido tetra hidroflico, cobalamina, etc. As mismo, muchas enzimas requieren activadores metlicos, y he de all la importancia de los minerales para el buen funcionamiento y crecimiento de las plantas. 3. MATERIAL Y METODOS Gradilla Pipetas Soluciones de Fehling A y B Trocitos de hgado Tubos de ensayo Agua oxigenada

Bao Mara Trocitos de tomate Mechero Solucin de Lugol Almidn

1.- Reconocimiento de la Catalasa La Catalasa es una enzima que se encuentra en las clulas de los tejidos animales y vegetales. La funcin de esta enzima en los tejidos es necesaria porque durante el metabolismo celular, se forma una molcula toxica que es el perxido de hidrogeno o agua oxigenada. (H2 O2). La enzima descompone el perxido de hidrogeno en agua y oxigeno, por lo que se soluciona el problema. La reaccin de la Catalasa sobre el H2 O2, es la siguiente: 2 H2 O2 Catalasa REACCION: La existencia de la catalasa en los tejidos animales, se aprovecha para utilizar el agua oxigenada como desinfectante cuando se echa sobre una herida. Como muchas de las bacterias patgenas son anaerobias mueren con el desprendimiento de oxigeno que se produce cuando la catalasa de los tejidos acta sobre el agua oxigenada. En esta primera experiencia vamos a demostrar su existencia: 1. Colocar en tubo de ensayo unos trocitos de hgado 2. Aadir 5 ml de agua oxigenada 3. Se observar un intenso burbujeo debido al desprendimiento de oxigeno. Nota: Se debe repetir esta experiencia con diferentes tejidos animales y vegetales. Puede ser interesante ir observando la mayor o menor actividad, segn el tejido con el que se realice la experiencia. 2.- Desnaturalizacin de la catalasa. Mediante esta experiencia, vamos a ver una propiedad fundamental de las protenas, que es la DESNATURALIZACION. Ya que la catalasa qumicamente es un protena, podemos desnaturalizarla al someterla a altas temperaturas. Al perder la estructura terciaria, perder tambin la funcin y como consecuencia su funcin cataltica, por lo que no podr descomponer el agua oxigenada y no se observar ningn tipo de reaccin cuando hagamos la experiencia anterior con muestras de tejidos hervidos. 1. 2. 3. 4. 5. colocar en un tubo de ensayo varios trocitos de hgado. Aadir agua para hervir la muestra. Hervir durante unos minutos. Despus de este tiempo, retirar el agua sobrenadante. Aadir 5 ml de agua oxigenada. Observar el resultado. 2 H2 O + O2

3.- Hidrlisis del Almidn. Mediante esta experiencia, vamos a ver la actividad de otra enzima, la AMILASA o ptialina, presente en la saliva. Esta enzima acta sobre el polisacrido Almidn, hidrolizando el enlace o-glicosdico, por lo que el almidn se terminara por transformar en unidades de glucosa. Es importante que recuerden las reacciones caractersticas de glcidos para comprender esta experiencia. Procedimiento: 1. Poner en una gradilla 4 tubos de ensayo numerados del 1 al 4. 2. Aadir a cada tubo 5 ml de una solucin diluida de almidn 3. A los tubos 3 y 4 aadir una pequea cantidad de saliva. En el tubo 1 hacer reaccin de Fehling.

Reaccin de Fehling: - Tomar la muestra que se quiera analizar (normalmente una cantidad de 3 ml.) 1. Aadir 1 ml. de Fehling A y 1 ml. de Fehling B. El lquido del tubo de ensayo adquirir un fuerte color azul. 2. Calentar el tubo al bao Mara o directamente en un mechero de Laboratorio. 3. La reaccin ser positiva si la muestra se vuelve de color rojo-ladrillo. 4. La reaccin ser negativa si la muestra queda azul, o cambia a un tono azul-verdoso. Fundamento: Se basa en el carcter reductor de los monosacridos y de la mayora de los disacridos (excepto la sacarosa). Si el glcido que se investiga es reductor, se oxidar dando lugar a la reduccin del sulfato de cobre (II), de color azul, a xido de cobre (I), de color rojoanaranjado. En el tubo 2 realicen la reaccin de Lugol Reaccin del Lugol: Este mtodo se usa para identificar polisacridos. El almidn en contacto con unas gotas de Reactivo de Lugol (disolucin de yodo y yoduro potsico) toma un color azul-violeta caracterstico. 1. Poner en un tubo de ensayo unos 3 ml del glcido a investigar. 2. Aadir unas gotas de Lugol. 3. Si la disolucin del tubo de ensayo se torna de color azul-violeta, la reaccin es positiva. Fundamento: La coloracin producida por el Lugol se debe a que el yodo se introduce entre las espiras de la molcula de almidn. No es por tanto, una verdadera reaccin qumica, sino que se forma un compuesto de inclusin que modifica las propiedades fsicas de esta molcula, apareciendo la coloracin azul violeta. Los resultados son los esperados para un polisacrido como el almidn Los tubos 3 y 4 contienen el almidn, al que se le ha aadido saliva. Colocar los tubos precipitados al bao mara, controlando la temperatura del agua que no hierva, ya que lo que intentamos es que la enzima de la saliva actu a 37 C. Mantener por 15 minutos. Despus de este tiempo realizar las siguientes reacciones: En el tubo 3 realice la reaccin de Fehling En el tubo 4 realizar la prueba de Lugol

El resultado positivo obtenido en el tubo 3 nos indica que la amilasa de la saliva ha hidrolizado el almidn transformndolo en glucosa, por eso la reaccin de de Fehling es ahora positiva. De forma similar, se puede interpretar el resultado del tubo 4, ahora nos da la reaccin de polisacridos negativa, ya que el almidn se ha hidrolizado.

Laboratorio 7: Efecto temperatura y pH sobre la actividad enzimtica

1.-OBJETIVOS Estas actividades prcticas tienen como objetivo que los alumnos; 1. Conozcan algunos procedimientos para determinar la actividad de una enzima en muestras biolgicas. 2. Comprueben el efecto que tiene en la actividad de una enzima las variaciones de pH y temperatura. 2.-INTRODUCCIN Las enzimas son biocatalizadores proteicos esenciales para mantener los procesos metablicos a velocidades compatibles con la vida, contribuyendo adems a su regulacin. Debido a su naturaleza proteica las enzimas pueden modificar su actividad por cambios de temperatura y pH, factores que pueden alterar la estructura molecular de la enzima, provocando su desnaturalizacin. En general una reaccin qumica aumenta su velocidad de reaccin al aumentar la temperatura, pero en el caso de las reacciones catalizadas por enzimas, este efecto se observa slo entre 0 y 40 C, ya que a temperaturas mayores la enzima se desnaturaliza debido a la ruptura de enlaces dbiles, principalmente puentes de hidrgeno y la prdida de su conformacin nativa. Debido tambin a su naturaleza proteica la enzima presenta numerosos grupos ionizables, los que derivan de los radicales de sus aminocidos constituyentes. Las alteraciones del pH pueden cambiar el grado de ionizacin de los grupos qumicos involucrados en el sitio activo de la enzima, afectando su actividad cataltica. Las enzimas son activas en un rango estrecho de pH, con una actividad mxima a un valor de pH denominado pH ptimo. Por tal motivo la actividad enzimtica se mide en presencia de tampones o amortiguadores de pH. Actividades Objetivo: Estudiar el efecto de las variaciones de pH y temperatura sobre la actividad de la amilasa salival. La amilasa salival es una enzima que rompe especficamente los enlaces glicosdicos 1-4 de los polisacridos. La hidrlisis del almidn por amilasa salival da como producto una mezcla de maltosa, maltotriosa (dextrinas) y glucosa. El almidn es un polisacrido formado por 2 tipos de cadena: amilasa (lineal), que presenta slo enlaces 1-4 y amilopectina (ramificada), con enlaces 1-4 y 1-6 El almidn se reconoce qumicamente por el color azul intenso que desarrolla en presencia de yodo, por lo que la hidrlisis enzimtica del almidn se puede determinar por la prdida del color azul de una mezcla de reaccin.

3.-REACTIVOS Y MATERIALES 1. Preparacin enzimtica: Lavado bucal con agua destilada, filtrado y mantenido en hielo. 2. Tampn fosfato 0.1 M, pH 7.0, pH 5.0, pH 6.0 y pH 8.0 3. solucin de Cloruro de sodio 0.03 M 4. solucin de almidn 1% p/v 5. solucin de lugol 6. Bao termorregulado y de agua hirviendo

PROCEDIMIENTO A.- Efecto de la Temperatura sobre la hidrlisis enzimtica del almidn. Numere 4 tubos de ensayo y agregue a cada uno 2 ml de la preparacin enzimtica, 1 ml de la solucin de cloruro de sodio, 1 ml de la solucin tampn fosfato pH 7.0 y 2 ml de solucin de almidn. Mezcle suavemente sin agitar e incube durante 15 minutos en las siguientes condiciones: tubo 1 a 0C (sobre hielo), el tubo 2 a 37C en un bao termorregulado, el tubo 3 a 100C (bao mara) y el tubo 4 a temperatura ambiente. Incluya un quinto tubo sin cloruro de sodio en la mezcla de Reaccin a temperatura ambiente. Al cabo de los 15 minutos agregue 1 gota de lugol, mezcle y observe. Anote y discuta sus resultados. Tubo Solucin Almidn Tampn fosfato pH 7.0 Sol. cloruro de sodio Preparacin enzimtica Temperatura incubacin Lugol (gotas) 1 2 ml 1 ml 1 ml 2 ml 0C 1 2 2 ml 1 ml 1 ml 2 ml 37C 1 3 2 ml 1 ml 1 ml 2 ml 100C 1 4 2 ml 1ml 1ml 2 ml TA 1 5 2 ml 1 ml 2 ml TA 1

B.- Efecto del pH sobre la actividad de la amilasa salival. Numere 4 tubos de ensayo y agregue a cada uno 2 ml de preparacin enzimtica, 1 ml de solucin de cloruro de sodio y 2 ml de solucin de almidn. Posteriormente adicione 1 ml de tampn fosfato pH 5.0 al tubo 1, 1 ml buffer pH 6.0 al tubo 2 , 1 ml buffer pH 7.0 al tubo 3 y 1 ml buffer pH 8.0 al tubo 4. Mezcle y deje incubando a temperatura ambiente por 15 minutos. Al cabo de ese tiempo agregue una gota de lugol, mezcle y observe. Anote y discuta sus resultados. Tubo Solucin Almidn Tampn fosfato Sol. cloruro de sodio Preparacin enzimtica Temperatura incubacin Lugol (gotas) 1 2 ml 1 ml pH 5.0 1 ml 2 ml TA 1 2 2 ml 1 ml pH 6.0 1 ml 2 ml TA 1 3 2 ml 1 ml pH 7.0 1 ml 2 ml TA 1 4 2 ml 1ml pH 8.0 1ml 2 ml TA 1

Laboratorio 8: FERMENTACIN DE LA GLUCOSA POR LEVADURAS

(Sacharomyces cereviceae) Fundamento: La glucosa es un carbohidrato fermentable por las levaduras. La fermentacin alcohlica es un proceso anaerbico realizado por las levaduras y algunas clases de bacterias. Estos microorganismos transforman la glucosa en alcohol etlico y dixido de carbono. La fermentacin alcohlica, comienza despus de que la glucosa entra en la clula. La glucosa se degrada hasta cido pirvico, en el proceso denominado gluclisis. Este cido pirvico se convierte luego en CO2 y etanol. Los seres humanos han aprovechado este proceso para hacer pan, cerveza, y vino. En estos tres productos se emplea el mismo microorganismo que es la levadura comn o Saccharomyces cerevisae. Reactivos: Solucin de glucosa (1 g en 100 ml) Reactivo de Benedict. Levadura de panadero seca activa. Procedimiento 1.- En un vaso de precipitado de 25 ml. agregar 10 ml de la solucin de glucosa y aadir 0.3 g (la punta de una esptula) de levadura. Agitar hasta que la mezcla sea homognea. Incube a 37 grados. Realizar la prueba de Benedict a esa mezcla a: los 30 min., y a la hora y media de incubacin. 2.- Para verificar que la solucin de glucosa es un azcar reductor, realice una prueba de Benedict a la solucin de glucosa. 3.- Para verificar que la levadura no contiene ningn azcar reductor, realizar un blanco de reaccin (control) de la siguiente manera: Mezcle 0.3 g (la punta de una esptula) de levadura con 10 ml de agua destilada. Efecte una prueba de Benedict tomando 0.5 ml de esta solucin de levadura. Nota: La prueba de Benedict se efecta de la siguiente manera: 1.- Pipetear 0.5 ml. de la solucin problema en un tubo de ensayo 2.- Aadir 1 ml. de Reactivo de Benedict. 3.- Calentar en bao de agua hirviente durante 3 min. Si la muestra cambi de color azul a rojo ladrillo, hay presencia de azcares reductores.

Laboratorio 9: Determinacin de Glicemia

1. Objetivo: Determinar la concentracin de glucosa sangunea (Glicemia) en una muestra de Sangre. 2. Introduccin: La glucosa es el principal monosacrido del organismo y constituye un metabolito que aporta energa vital para las funciones celulares. El catabolismo de la glucosa se realiza durante la gliclisis. Su determinacin en sangre es til para el diagnstico y monitoreo de trastornos en el metabolismo de los hidratos de carbono, como la Diabetes Mellitus, hipoglicemias, tumores de los islotes pancreticos y otras patologas. 3. MATERIAL Y METODOS: - Gluco tester - Lancetas - Tiras reactivas para determinacin Glucosa en sangre - Algodn (trulas) - Alcohol 70% - Guantes desechables Actividades : Determinacin de glicemia. Se utilizar un instrumento para la determinacin enzimtica de la concentracin de glucosa en una muestra de Sangre Discuta los resultados obtenidos y realice un informe, pudiendo considerar el anexo proporcionado a continuacin:

ANEXO: METABOLISMO GLUCIDICO La glicemia normalmente se encuentra en el rango de 70 110 mg/dL. Normalmente una glicemia en ayunas superior a 126 mg/dl es francamente sospechosa de diabetes Mellitus. Pueden encontrarse hiperglicemias severas (400 mg/dl). r La principal causa de hiperglicemia es la Diabetes Mellitus, una enfermedad endocrina altamente prevalente en nuestro pas, afectando a una 5% de la poblacin. Sin embargo pueden existir otras causas de hiperglicemia. Otras causas de Hiperglicemia: Hipofisiarias, suprarrenales, tiroideas, infeccin aguda, encefalopata, txicos, infarto miocardio, pancreatitis aguda, diabetes gestacional. Causas de Hipoglicemia: Esfuerzos musculares agotadores, hiperinsulismo, tratamiento insulnico, insuficiencia suprarrenal, hipotiroidismo, afecciones hepticas, trastornos de la nutricin y digestivos, afecciones nerviosas, alcoholismo agudo. Cualquier alteracin metablica relacionada con la glicemia puede asociarse a la alteracin de otros analitos como: hemoglobina glicosilada, insulina, glucagn, pptido C, glucosuria (concentracin de glucosa en orina), proteinuria, albuminuria, etc.

INSULINA: Hormona producida por el pncreas que es esencial para la utilizacin de la glucosa por la clula. Esta hormona se encuentra en concentraciones normales en el plasma entre 2 5 U/mL. En condiciones patolgicas como la obesidad y en los diabticos obesos adultos, la insulinemia basal suele ser alta y luego de la administracin de glucosa su aumento es tardo y alcanza cifras superiores a lo normal (250 U/mL o ms). En la diabetes juvenil se observa una disminucin de insulina en ayunas, pero sobre todo una falta de respuesta de secrecin de insulina frente a la ingesta de glucosa. PEPTIDO C: La insulina es una protena que se secreta como una pro-hormona. En el plasma sufre una hidrlisis que conduce a la hormona activa ms un pptido denominado PPTIDO C, el cual tiene una vida media biolgica superior a la de la insulina. La determinacin de este pptido es til para determinar la actividad secretora de las clulas beta del pncreas, an en los enfermos tratados con insulina es un ndice indirecto de la secrecin de insulina endgena residual del paciente diabtico. Valores ayuno: Post-prandial: 2,10 ng/mL 4,2 ng/mL

HEMOGLOBINA GLICOSILADA HbA1c: Los prolongados estados de hiperglicemia que presentan los pacientes diabticos, conducen a la glicacin no-enzimtica de las protenas. Una protena susceptible a glicarse es la hemoglobina, cuya vida media es de 120 das, por lo tanto, la glicacin de la hemoglobina indica que el paciente no ha tenido un buen control de su glicemia durante los 120 das previos a la evaluacin de este parmetro. En otras palabras es una forma indirecta de evaluar la glicemia promedio de los 2 a 3 meses previos Valores referencia: 6.2% a 8.2% PROTEINURIA: Los pacientes diabticos suelen presentar durante el curso de su patologa, la denominada Nefropata diabtica, que es un tipo de insuficiencia renal. La proteinuria o concentracin de protenas en la orina es un buen indicador de la funcin del rin. Normalmente la excrecin de protenas por la orina puede alcanzar unos 200 mg/24 horas o 20 mg/dL. Las protenas que en condiciones normales aparecen en la orina son: la protena de Tamm-Horsfall (40-70 mg) y la albmina (10-20 mg). Rangos superiores a 20 mg/dl requieren exploracin adicional y cifras superiores a 250 mg/24 requieren exploracin uronefrolgica. . Sobre 1000-2000 mg/24 hay que sospechar de insuficiencia renal avanzada. MICROALBUMINURIA: La microalbuminuria se define como pequeas cantidades de albmina que son excretadas en la orina, por sobre los niveles considerados normales. Estos valores pueden ocurrir entre 30 a 300 mg/24hr., cifras superiores son consideradas como macroalbuminuria y se asocian a insuficiencia renal severa. La nefropata en la diabetes insulino dependiente puede ser reconocida en sus fases iniciales a travs de la pesquisa de la microalbuminuria. Adems de la diabetes Mellitus, la Hipertensin Arterial es otra condicin que puede conducir a microalbuminuria. La microalbuminuria es considerada como un marcador precoz de dao renal. Valores normales: hasta 10 mg/L NOTA Emia: sufijo con el cual se denomina la concentracin de un determinado analito en el suero o plasma Uria : sufijo con el cual se denomina la concentracin de un determinado analito en la orina. Procedimiento: Se entregar con anticipacin el protocolo del Kit a utilizar para este procedimiento.

Laboratorio 10: Reconocimiento de Lpidos

1. Objetivos: Identificar por mtodos cualitativos las caractersticas de los lpidos. 2. Introduccin: Los lpidos son un grupo heterogneo de sustancias que se encuentran tanto en animales como en vegetales. Desde el punto de vista nutritivo, constituyen una de las reservas energticas ms importantes de los seres vivos. Adems de la funcin energtica cumplen otras funciones en el organismo: estructural, aislante trmico y regulador del metabolismo. Las grasa y los aceites son insolubles en agua pero solubles en disolventes orgnicos como benceno, ter, gasolina o acetona. Clasificacin de lpidos Los lpidos pueden clasificarse de acuerdo a su estructura qumica, aquellos que presentan enlaces ster y pueden ser hidrolizados, tales como ceras, glicridos se denominan lpidos hidrolizables y los que no presentan enlaces ster, denominados no hidrolizables en los que se encuentran los esteroles, esteroides, terpenos y terpenoides. Los lpidos hidrolizables, se clasifican en: lpidos simples, compuestos, los lpidos no hidrolizables se clasifican en isoprenoides y esteroides. Los lpidos se clasifican en dependencia de las reacciones qumicas que experimentan , de esta manera aquellos que reaccionan con disolucin de NaOH al 40%, originando sales, se denominan lpidos saponificables, y los que no experimentan este tipo de reaccin se consideran lpidos no saponificables. Los Lpidos se pueden clasificar en dependencia de las funciones que realiza en los organismos vivos, encontrando en la naturaleza aquellos que realizan la funcin de reserva y lpidos citoplasmticos (presentes en orgnulos celulares, mitocondrias y membrana celular). Los lpidos tambin se clasifican considerando si aportan cidos grasos que no son sintetizados por los organismos animales, los que reciben el nombre de esenciales; y los no esenciales son producidos por el metabolismo animal no necesitan ser ingeridos, son producto del metabolismo. Saponificacin Es una reaccin tpica de los cidos grasos, en la cual reaccionan con lcalis o bases y dan lugar a una sal de cido graso que se denomina jabn. La formacin de jabones favorece la solubilidad y la formacin de micelas de cidos grasos. La clasificacin de los lpidos se puede hacer atendiendo al criterio de si producen o no esta reaccin y as se habla de lpidos saponificables y no saponificables. 3. MATERIAL Y METODOS: - Tubos de ensayo - Gradilla - Varillas de vidrio - Mechero o bao mara - Vasos de precipitados - Pipetas - Solucin de NaOH al 20% - Solucin de Sudn III - Tinta china roja - Cloroformo - Aceite comn

SAPONIFICACIN : Las grasas reaccionan en caliente con el hidrxido sdico o potsico descomponindose en los dos elementos que las integran: glicerina y cidos grasos. stos se combinan con los iones sodio o potasio del hidrxido para dar jabones, que son en consecuencia las sales sdicas o potsicas de los cidos grasos. En los seres vivos, la hidrlisis de los triglicridos se realiza mediante la accin de enzimas especficos (lipasas) que dan lugar a la formacin de cidos grasos y glicerina. Procedimiento: Colocar en un tubo de ensayo 2ml de aceite y 2ml de NaOH al 20%. Agitar enrgicamente y colocar el tubo al bao Mara de 20 a 30 minutos. Pasado este tiempo, se pueden observar en el tubo 3 fases: una inferior clara que contiene la solucin de sosa sobrante junto con la glicerina formada, otra intermedia semislida que es el jabn formado y una superior lipdica de aceite inalterado. TINCIN: Los lpidos se colorean selectivamente de rojo -anaranjado con el colorante Sudn III. Procedimiento: Disponer en una gradilla 2 tubos de ensayo colocando en ambos 2ml de aceite. Aadir a uno de los tubos 4-5 gotas de solucin alcohlica de Sudn III. Al otro tubo aadir 4-5 gotas de tinta roja. Agitar ambos tubos y dejar reposar. Observar los resultados: en el tubo con Sudn III todo el aceite tiene que aparecer teido, mientras que en el tubo con tinta, sta se ir al fondo y el aceite no estar teido. SOLUBILIDAD: Los lpidos son insolubles en agua. Cuando se agitan fuertemente en ella se dividen en pequesimas gotas formando una emulsin de aspecto lechoso, que es transitoria, pues desaparece en reposo por reagrupacin de las gotitas de grasa en una capa que, por su menor densidad, se sita sobre el agua. Por el contrario, las grasas son solubles en disolventes orgnicos, como el ter, cloroformo, acetona, benceno, etc. Procedimiento: Poner 2ml de aceite en dos tubos de ensayo. Aadir a uno de ellos 2ml de agua y al otro 2ml de cloroformo u otro disolvente orgnico, Agitar fuertemente ambos tubos y dejar reposar. Observar los resultados: Se ver cmo el aceite se ha disuelto en el ter y, en cambio no lo hace en el agua y el aceite subir debido a su menor densidad.

Observe y anote sus resultados

Laboratorio 11: Determinacin de Colesterol

1. Objetivos: Determinar colesterol en una muestra de sangre 2. Introduccin: El Perfil lipdico consta de la determinacin de Colesterol Total, triglicridos y colesterolHDL. Adicionalmente, con estos parmetros se puede calcular el colesterol de LDL. El Colesterol es una molcula de naturaleza esteroidal con un grupo hidroxilo secundario en la posicin C3. Se sintetiza principalmente en el hgado y se absorbe aquel que proviene de la dieta. Se estima que aproximadamente tres cuartos de colesterol se forman por neo sntesis y una cuarta parte proviene de la dieta. Los triglicridos son steres de glicerol, un alcohol trivalente con tres cidos grasos de cadena larga. Una parte de ellos se ingiere por la dieta y se transporta a travs de los quilomicrones (triglicridos exgenos). El hgado adems sintetiza triglicridos, los cuales son transportados a travs de la VLDL (triglicridos endgenos). El colesterol de HDL o lipoprotenas de alta densidad representa el transporte de colesterol desde los tejidos perifricos hacia el hgado, para su posterior excrecin por la va biliar. Este proceso de denomina, transporte reverso de colesterol, una ruta esencialmente antiaterognica. Valores elevados de HDL protegen contra las cardiopatas coronarias, mientras que valores disminuidos de HDL, especialmente en combinacin con triglicridos elevados se asocian a un elevado riesgo cardiovascular. El colesterol de LDL o lipoprotena de baja densidad es proveniente del catabolismo de las VLDL (lipoprotena de muy baja densidad) y constituye una fuente de aporte de colesterol para ciertos requerimientos celulares como son: la sntesis de membranas, sntesis de hormonas esteroidales, sntesis de cidos biliares y sntesis de vitamina D. La determinacin del perfil lipdico sirve para el screening del riesgo aterognico de un determinado paciente. 3. MATERIAL Y METODOS: - Kit Para medicin de Colesterol y LDL - Muestra de Suero - Guantes desechables 4. Procedimiento: Se les entregar el Protocolo del Kit a utilizar con anticipacin.

Laboratorio 12: Aislamiento de ADN

1. Objetivos: Aislar ADN cromosmico de sangre perifrica total de humano. Analizar sobre la importancia del conocimiento de la molcula de la vida en la medicina del futuro. 2. Introduccin El cido desoxirribonucleico (polmero de unidades menores denominados nucletidos) junto con el cido ribonucleico, constituye la porcin prosttica de los nucleoproteidos, cuyo nombre tiene un contexto histrico, ya que se descubrieron en el ncleo de la clula. Se trata de una molcula de gran peso molecular (macromolcula) que est constituida por tres sustancias distintas: cido fosfrico, un monosacrido aldehdico del tipo pentosa (la desoxirribosa), y una base nitrogenada cclica que puede ser prica (adenina o citosina) o pirimidnica (timina o guanina). La unin de la base nitrogenada (citosina, adenina, guanina o timina) con la pentosa (desoxirribosa) forma un nuclesido; ste, unindose al cido fosfrico, nos da un nucletido; la unin de los nucletidos entre s en enlace diester nos da el polinucletido, en este caso el cido desoxirribonucleico. Las bases nitrogenadas se hallan en relacin molecular 1:1, la relacin adenina + timina / guanina + citosina es de valor constante para cada especie animal. Estructuralmente la molcula de ADN se presente en forma de dos cadenas helicoidales arrolladas alrededor de un mismo eje (imaginario); las cadenas estn unidas entre s por las bases que la hacen en pares. Los apareamientos son siempre adenina-timina y citosina-guanina. El ADN es la base de la herencia. 3. EXTRACCIN DE ADN HUMANO : Todas las clulas, a excepcin de las clulas anucleadas de los eritrocitos maduros en humanos, contienen ADN en sus ncleos celulares. Tambin podemos encontrar ADN dentro de otros compartimentos celulares diferentes al ncleo, como las mitocondrias y los cloroplastos. La cantidad de ADN presente en algunos tejidos es muy pequeo; por este motivo no representa una fuente conveniente de extraccin, aislamiento y purificacin, para ser empleado en diferentes estudios de carcter gentico, biolgico. y/o bioqumico. Muchos tejidos contienen alta actividad de desoxirribonucleasa (DNAasa) que rompe la macromolcula en pequeos fragmentos. Para seleccionar un tejido como fuente de ADN debe reunir dos condiciones: contener gran cantidad de material gentico y poseer baja actividad de DNAasa. El tejido linfoide, y en este caso el timo y el bazo representan materiales biolgicos que son utilizados con mucha frecuencia como fuente de cantidades considerables de ADN para diferentes estudios. Despus de extrado el ADN suele ser rpidamente desnaturalizado y por lo tanto se debe tener mucho cuidado en su remocin, aislamiento y purificacin con el fin de obtener un producto que conserve la identidad e integridad estructural con el ADN de la clula de la cual proviene. El estrs o tensin mecnica o fsicoqumica, que acompaan los procesos de purificacin de las molculas de ADN deben ser evitadas al mximo y las nucleasas inhibidas. Factores como los iones Ca2+ y Mg2+ son importantes para la actividad del las DNAasas .El citrato de sodio presente en las soluciones empleadas para la extraccin y purificacin del ADN, atrapa estos iones e impide, de esta forma, la accin de las enzimas que digieren estas molculas. Con el fin de eliminar en forma definitiva la actividad de las nucleasas, las etapas de remocin de las protenas deben ser llevadas a cabo tan rpido como sea posible y en fro. Las nucleoprotenas, son protenas que aparecen asociadas con los cidos nucleicos de las clulas eucariotas; son insolubles en agua y en soluciones de baja fuerza inica pero solubles en soluciones de alta fuerza inica; propiedad que debe ser tenida en cuenta durante los procesos de extraccin inicial.

4.-Materiales y mtodos: Venoject con EDTA Aguja Venoject Capucha Venoject Liga Tubos Eppendorf de 1.5 ml Micropipetas de volumen variable Puntas para micropipetas Microcentrfuga Kit de extraccin de DNA Procedimiento: Se les entregar en forma oportuna el procedimiento del KIT