Livro Fiocruz Vol 2

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Conceitos e Mtodos para a Formao de Tcnicos em Laboratrios de Sade
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FUNDAO OSWALDO CRUZ Presidente Paulo Ernani Gadelha Vieira ESCOLA POLITCNICA DE SADE JOAQUIM VENNCIO Diretora Isabel Brasil Pereira Vice-diretor de Pesquisa e Desenvolvimento Tecnolgico Maurcio Monken Vice-diretora de Ensino e Informao Mrcia Valria Morosini Vice-diretor de Gesto e Desenvolvimento Institucional Sergio Munck INSTITUTO OSWALDO CRUZ Diretora Tnia Cremonini Arajo Jorge Vice-diretora de Pesquisa, Desenvolvimento Tecnolgico e Inovao Mariza Gonalves Morgado Vice-diretora de Ensino, Informao e Comunicao Helene dos Santos Barbosa Vice-diretora de Servios de Referncia e Colees Cientficas Elizabeth Ferreira Rangel Vice-diretor de Desenvolvimento Institucional e Gesto Christian Maurice Gabriel Niel
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Conceitos e Mtodos para a Formao de Tcnicos em Laboratrios de Sade
Volume 2
ORGANIZADORAS
Etelcia Moraes Molinaro Luzia Ftima Gonalves Caputo Maria Regina Reis Amendoeira
Copyright 2010 dos autores Todos os direitos desta edio reservados Escola Politcnica de Sade Joaquim Venncio/Fundao Oswaldo Cruz
Conselho Editorial Dr. Ana Luzia Lauria Filgueiras Dr. Ftima Conceio Silva Dr. Herman Schatzmayr Dr. La Camillo-Coura Dr. Lycia de Brito Gitirana Dra. Marcia Ferro Dr. Marco Antonio Ferreira da Costa Dr. Margareth Maria de Carvalho Queiroz Dr. Maria Regina Reis Amendoeira Dr. Otlio Machado Pereira Bastos Capa Z Luiz Fonseca Projeto Grfico e Editorao Marcelo Paixo
Fotos Rodrigo Mexas Maria Eveline Castro Pereira Moyses Gomes Marcelino Desenhos Newton Marinho da Costa Jnior Reviso Luciana Duarte Joo Sette Camara Secretria Executiva da Coleo Josane Ferreira Filho
Catalogao na fonte Escola Politcnica de Sade Joaquim Venncio Biblioteca Emlia Bustamante
M722c Molinaro, Etelcia Moraes Conceitos e mtodos para a formao de profissionais em laboratrios de sade: volume 2 / Organizao de Etelcia Moraes Molinaro, Luzia Ftima Gonalves Caputo e Maria Regina Reis Amendoeira. - Rio de Janeiro: EPSJV; IOC, 2010. 290 p. : il. , tab. ISBN: 978-85-98768-41-0 1. Tcnicas e Procedimentos de Laboratrio.2. Pessoal de Laboratrio. 3. Laboratrios. 4. Formao de Tcnicos. 5. Sade e Educao. I. Ttulo. II. Caputo, Luzia Ftima Gonalves. III. Amendoeira, Maria Regina Reis. CDD 542.1
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Autores
Anna Christina Rosa Guimares Tecnloga em Processos Qumicos Industriais, Tcnica em Sade Pblica do Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Sade/INCQS/Fiocruz. Daniel Santos de Souza Bilogo, Especialista em Polticas Pblicas em Sade, Mestrando em Sade Pblica pela Escola Nacional de Sade Pblica/ENSP/Fiocruz, Tcnico em Sade Pblica da Escola Politcnica de Sade Joaquim Venncio/EPSJV/Fiocruz. (Egresso do Curso Tcnico de Laboratrio de Biodiagnstico em Sade/Escola Politcnica de Sade Joaquim Venncio/EPSJV/Fiocruz). Emanuele Amorim Alves Farmacutica industrial, Especialista em Percia Criminal pela Universidade Castelo Branco, Mestranda em Qumica pela Universidade Federal do Rio de Janeiro/UFRJ, Tcnica em Sade pblica da Escola Politcnica de Sade Joaquim Venncio/EPSJV/Fiocruz. Ester Maria Mota Biloga, Doutora em Biologia Parasitria pela Fundao Oswaldo Cruz. Pesquisadora Associada do Laboratrio de Patologia do Instituto Oswaldo Cruz/IOC/Fiocruz. Helene Santos Barbosa Biloga, Especialista em Protozoologia pelo Bernhard Nocht Institut da Alemanha, Doutora em Biologia Celular e Molecular pela Fundao Oswaldo Cruz. Pesquisadora Titular do Laboratrio de Biologia Estrutural do Instituto Oswaldo Cruz/IOC/Fiocruz.
Leandro Medrado Bilogo, Especialista em Educao Profissional pela Escola Politcnica de Sade Joaquim Venncio/EPSJV/Fiocruz. Mestrando em Educao Profissional em Sade pela EPSJV/Fiocruz. Tcnico em Sade Pblica da EPSJV/Fiocruz (Egresso do Curso Tcnico de Laboratrio de Bodiagnstico em Sade/Escola Politcnica de Sade Joaquim Venncio/EPSJV/Fiocruz) Luzia Ftima Gonalves Caputo Biloga, Tecnologista em Sade Snior do Instituto Oswaldo Cruz/IOC/Fiocruz. (Egressa do Curso Tcnico de Pesquisa em Biologia Parasitria/Instituto Oswaldo Cruz/IOC/Fiocruz, 1984) Lycia de Brito Gitirana Biloga, Mestre em Histologia e Embriologia pela Universidade Federal do Rio de Janeiro/UFRJ, Doutora em Biologia pela University of Heidelberg. Professora Associada II do Instituto de Cincias Biomdicas/ICB/UFRJ. Pedro Paulo de Abreu Manso Bilogo, Mestre em Cincias pelo programa de Biologia Celular e Molecular do Instituto Oswaldo Cruz/IOC/Fiocruz. Tecnologista em Sade Pblica do IOC/Fiocruz. (Egresso do Curso Tcnico de Histologia da Escola Politcnica de Sade Joaquim Venncio/EPSJV/ Fiocruz) Suzana Crte-Real Biloga, Doutora em Patologia pela Universidade Federal Fluminense e Especialista em Microscopia Eletrnica pelo Instituto Pasteur Lyon Frana. Pesquisadora Titular III do Laboratrio de Biologia Estrutural do Instituto Oswaldo Cruz/IOC/Fiocruz.
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Sumrio
Prefcio 9 Apresentao 13 Um sonho quase realizado 15 Captulo 1. Biologia celular e ultraestrutura 19 Captulo 2. Histologia 43 Captulo 3. Tcnicas histolgicas 89 Captulo 4. Tcnicas citolgicas 189 Captulo 5. Cultivo celular 215
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PREFCIO
O Chico Trombone costumava me dizer: Isso eu sei fazer, dr. Luiz Fernando, aprendi com Joaquim Venncio. E era com orgulho que se referia a seu mestre. Vimos, portanto, que a formao de tcnicos j vem dos tempos de Oswaldo. claro que no era institucionalizada como hoje. Eram outros tempos. Joaquim Venncio nasceu na fazenda Bela Vista, em Minas Gerais. Era a fazenda da me de Carlos Chagas, pai. Em 1916, veio trabalhar no Instituto Oswaldo Cruz. Veio e deu certo. O dr. Lutz teria dito certa vez: No troco o Venncio por nenhum doutor de Oxford ou de Cambridge. Se no disse, pensou. Eficincia nos processos de seleo de pessoal? Competncia do servio de recursos humanos? Evidentemente que no. No havia nada disso nessa poca. As coisas eram muito mais simples, e davam certo. Veio porque era amigo do velho Carlos Chagas. Amigos de infncia. Brincaram juntos na fazenda. Quando Joaquim Venncio faleceu, em 27 de agosto de 1955, teve seu necrolgio publicado na Revista Brasileira de Biologia. Lugar de ne-
crolgio de cientista famoso. Cito textual: Joaquim Venncio conseguiu, durante cerca de 35 anos que trabalhou ativamente, aprender zoologia que conhecia de modo invejvel. Como decorrncia das contingncias da vida, no teve oportunidade de instruir-se, mas sua mentalidade era de um homem culto. Pela convivncia com o dr. Lutz, pela observao direta do que via nas excurses e no laboratrio, adquiriu conhecimento detalhado de vrios grupos zoolgicos, principalmente anfbios, moluscos fluviais e trematdeos. Chegou a conhecer muito bem os anfbios e, com grande facilidade, os classificava nas excurses pela voz. Dadas as indicaes feitas pelo dr. Lutz em seus trabalhos, h casos em que foi citado na literatura como colaborador direto. Joaquim Venncio era, sem dvida, um naturalista. Era competente, tinha o domnio do ofcio, a maestria da arte. E gostava de ensinar. Ensinou muita gente. Certa vez, o Venancinho me disse: Era a Escola do Venncio, n? Foi muito boa, n? * * * Na presidncia de Sergio Arouca, resolvemos atualizar a Escola de Venncio. E foi assim que surgiu a Escola Politcnica, com o nome do seu patrono. Cresceu e abriu vrias frentes, desde a vocao cientfica aos cursos de nvel mdio complementados pela formao de tcnicos. Foi um xito, como a antiga. Aparece sempre nos primeiros lugares nas avaliaes e j se estendeu a outras instituies. * * * E agora surgem os livros didticos. Organizado por Etelcia Moraes Molinaro, Luzia Ftima Gonalves Caputo e Maria Regina Reis Amendoeira, vem luz a coleo Conceitos e Mtodos para a Formao de Tcnicos
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em Laboratrios de Sade, reunindo professores de vrias unidades da Fiocruz. Os captulos oferecem a histria da tcnica, os seus fundamentos, a maneira moderna de realiz-la, as suas aplicaes, a organizao do laboratrio etc. til para os cursos da Fundao e para outros externos. Mostra, tambm, o quanto as unidades da Fiocruz esto integradas na realizao de suas tarefas. Ensino questo primordial. Sem ele, o pas no se desenvolve. Est de parabns a Fiocruz pela realizao de mais uma tarefa de primordial importncia. Oswaldo Cruz est orgulhoso dos seus continuadores.
Pesquisador Emrito da Fundao Oswaldo Cruz
Luiz Fernando Ferreira
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Apresentao
A coletnea de livros intitulada Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade, organizada por Etelcia Moraes Molinaro, Luzia Ftima Gonalves Caputo e Maria Regina Reis Amendoeira antes de tudo uma obra original, importante e necessria. Original porque no existe na literatura tcnica em sade, na rea biomdica brasileira e internacional, pelo menos que eu saiba, algo semelhante em abrangncia, profundidade e seleo dos temas abordados; importante pelo pblico-alvo a que se destina, muito alm da Formao de Tcnicos de Laboratrios, abrangendo certamente todos os profissionais de sade; e necessria porque servir como obra de referncia para a formao dos mencionados tcnicos e de consulta obrigatria para todos os profissionais de sade que necessitem de esclarecimento dos aspectos tcnicos ali abordados. Versada em 5 volumes e 22 captulos, organizados em sequncia lgica, desde a biossegurana e boas prticas de laboratrio, passando por todos os fundamentos das tcnicas laboratoriais, bioqumica bsica, biologia celular e molecular, histologia e ultraestrutura, at atingir o cerne da prtica laboratorial, da imunologia infectoparasitologia virologia, bacteriologia, micologia, protozoologia e helmintologia e seus vetores, com a entomologia mdica e a malacologia. Os autores que escrevem os respectivos captulos so do melhor
nvel intelectual e cientfico, com a titulao de mestres, doutores e especialistas, com grande experincia prtica nos assuntos de que tratam. Parabenizo o Instituto Oswaldo Cruz e a Escola Politcnica Joaquim Venncio, que patrocinaram esta obra de referncia e que desde seus primrdios, valorizaram a qualidade da formao dos seus tcnicos e com eles povoaram e esto povoando o Brasil de Norte a Sul e de Leste a Oeste com o que temos de melhor os fundamentos para uma boa pesquisa. Aproveito esta oportunidade para homenagear a figura de Henry Willcox, que, no incio da dcada de 1980, quando o convidei para me ajudar na coordenao dos cursos de ps-graduao em Biologia Parasitria e Medicina Tropical do Instituto Oswaldo Cruz, foi o grande incentivador para criarmos paralelamente o Curso de Tcnico em Pesquisa, do qual foi o seu primeiro coordenador. Igualmente parabenizo as organizadoras desta coletnea e a Fiocruz como um todo pelo lanamento desta obra pioneira.
Jos Rodrigues Coura Pesquisador Titular Emrito Chefe do Laboratrio de Doenas Parasitrias IOC/Fiocruz
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Um sonho quase realizado

(Oswaldo Cruz, 1872-1917)
As alteraes pelas quais passa o mundo com a globalizao trazem como consequncia o surgimento de novos paradigmas tecnolgicos, fazendo-se necessrio que o ensino da rea da sade atenda s exigncias do mundo moderno, do trabalho e do atual perfil do tcnico da rea. Os cursos para a formao de tcnicos da Fundao Oswaldo Cruz (Fiocruz) buscam demonstrar os princpios cientficos envolvidos com as tcnicas laboratoriais, preparando os alunos para as transformaes no mundo do trabalho em sade, decorrentes do desenvolvimento tecnolgico e cientfico. Neste contexto, duas unidades tcnicas cientficas desta instituio, o Instituto Oswaldo Cruz (IOC) e a Escola Politcnica de Sade Joaquim Venncio (EPSJV), historicamente so as responsveis por coordenarem cursos e especializaes tcnicas que se firmaram como modelos desses princpios. Essas unidades, na rea de ensino tcnico, sempre estiveram intrinsecamente ligadas, e os professores realizam permanente parecerias entre si. Muitos de ns, egressos desses cursos, so hoje docentes e autores desta coleo. Alm da formao tcnica de profissionais em nvel regional e nacional, intensificou-se, na Fiocruz, a demanda para o estabelecimento de cooperaes tcnicas internacionais, que por sua expertise e capacidade de produzir, pas-
sou a divulgar conhecimentos, elaborando cursos, metodologias e tecnologias educacionais. A Escola Politcnica Centro Colaborador da Organizao Mundial da Sade (OMS) para a educao de tcnicos em sade desde 2004. A ideia da publicao dessa coleo surgiu da necessidade conjunta das duas Unidades da Fiocruz de produzir material didtico, que atendesse aos alunos dos cursos de nvel tcnico em Sade da Fiocruz e de outros locais.Desse modo, o nosso principal desafio oferecer contedo que abarque toda a rea tcnica de sade utilizada nos principais cursos de nvel mdio, e que, ao mesmo tempo, possa manter-se suficientemente atualizado. Dada a complexidade da estrutura instrumental e pedaggica dos cursos tcnicos, se fez necessria a publicao de uma coleo, escolhendo-se tpicos de importncia bsica. Para tanto, foram convidados pesquisadores/professores com experincia em ensino de cursos de nvel tcnico e de destacado conhecimento nos temas abordados nos 22 captulos, que constituem os 5 volumes da coleo. A coleo Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade tem como objetivo integrar conhecimentos tericos e prticos, proporcionando ao aluno informaes que possibilitem uma permanente reflexo de seu papel como agente transformador dos processos e atividades de ensino, pesquisa cientfica e desenvolvimento tecnolgico. Outro objetivo inconteste destes livros servir para professores, como norteadores da definio curricular de seus cursos. Visando garantir a autonomia dos autores, e respectivas responsabilidades, foi mantida a formatao original dos textos, inclusive as fotos, figuras, diagramas. Podem ocorrer tambm algumas repeties de contedo em alguns captulos, mas, a nosso ver, a retirada de partes de captulos j abordadas poderia descontextualizar o texto.
Um Sonho Quase Realizado | 17
O pontap inicial deste sonho s foi possvel pelo incondicional apoio dado pelo professor Andr Paulo da Silva Malho, pela dra. Isabel Brasil Pereira, pessoa-chave desencadeadora do processo, e pela dra. Tnia Cremonini de Arajo Jorge, que apoiaram e incentivaram institucionalmente este projeto. Agradecemos especialmente aos autores que abraaram este trabalho com muito entusiasmo e que possibilitaram a sua concretizao. E um carinho especial para Josane Ferreira Filho pela organizao paciente de nossas reunies e textos, com a gratido das organizadoras e autores. Agradecemos em especial aos renomados cientistas emritos da Fundao Oswaldo Cruz, doutores Luiz Fernando Ferreira patrono da EPSJV e Jos Rodrigues Coura, que nos deram a honra de apresentar esta coleo. Esperamos, assim, contribuir para a sistematizao do conhecimento dos leitores sobre os diversos tpicos abordados em cada captulo, apresentando cada assunto de forma didtica e sinttica, recomendando a consulta literatura especializada sempre que houver necessidade de aprofundamento do conhecimento em determinados temas.
Etelcia Moraes Molinaro Luzia Ftima Gonalves Caputo Maria Regina Reis Amendoeira Organizadoras
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Captulo 1
Biologia celular e ultraestrutura
Helene Santos Barbosa Suzana Crte-Real Histrico 1. H istrico
Citologia, ou biologia celular, a cincia que estuda os vrios sistemas celulares, a maneira como as clulas so reguladas e a compreenso do funcionamento de suas estruturas. A construo dos microscpios pticos foi um passo decisivo para a descoberta das clulas, e acredita-se que o primeiro tenha sido inventado em 1592, por Jeiniere da Cruz e seu pai, Zacharias Jansen, dois holandeses fabricantes de culos. Tudo indica, porm, que o primeiro a fazer observaes microscpicas de materiais biolgicos foi o holands Antonie van Leeuwenhoek (1632-1723). O microscpio simples com apenas uma lente, construdo por Leeuwenhoek, foi aprimorado por Robert Hooke em 1665, ganhando mais uma lente. A partir dos estudos de Hooke em biologia, publicados em um livro intitulado Micrographia (1665), que analisou cortes finos de cortia obtidos da casca do sobreiro, verificou que estes eram constitudos por pequenas cavidades polidricas (no latim, cella), as quais foram denominadas clulas. Estes compartimentos representavam as paredes das clulas vegetais mortas. Em
1838, o botnico alemo Matthias Schleiden descreveu que a clula era a unidade bsica de todas as plantas e, mais tarde, em 1839, o zologo alemo Theodor Schwann chegou mesma concluso para os animais. Com base nestes conhecimentos, elaborou-se a teoria celular que foi proposta por Schleiden e Schwann. Posteriormente, a associao de tcnicas de colorao e de citoqumica foi capaz de revelar as estruturas e a fisiologia das clulas. O grande avano no conhecimento da biologia celular, sem dvida, foi a inveno dos microscpios eletrnicos em 1931, por dois engenheiros alemes Ernst Ruska e Max Knoll , o que possibilitou a visualizao das organelas celulares em grande detalhe. A clula uma unidade funcional que estabelece interao entre seus componentes, sob o aspecto fisiolgico, biossinttico e reprodutivo. A dinmica celular para a manuteno da vida regida por um processo de automanuteno, que compreende a modificao de estruturas, a substituio de componentes, de tal forma articulada que garanta a sua organizao estrutural e funcional.
2. Clulas procariticas e eucariticas
A divergncia entre procariontes e eucariontes deve ter ocorrido aps serem estabelecidos os mecanismos de replicao e transcrio do cido desoxirribonucleico (DNA), a traduo, o sistema de cdons e os metabolismos energticos e biossintticos. O principal critrio de distino entre estes grupos a sua organizao celular. As clulas procariticas (do latim proprimeiro e cario-ncleo) so relativamente simples e se caracterizam por no apresentarem membrana, segmentando os cidos nucleicos DNA) e ribonucleicos (ARN) do citoplasma. Alm disso, algumas destas clulas apresentam uma membrana plasmtica circundada externamente pela parede celular. As clulas eucariticas (do latim eu-verdadeiro e cario-ncleo) constituem o tipo celular da constituio dos fungos, protozorios, animais e plantas. Estruturalmente, so clulas mais complexas, ricas em membranas que formam compartimentos,
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ou seja, uma diviso de funes metablicas entre as organelas citoplasmticas e o ncleo, circundado pelo envoltrio nuclear, onde est contido todo seu material gentico. Para os eucariontes, a compartimentalizao de atividades celulares em organelas circundadas por membranas fosfolipdicas foi decisiva para a homeostase celular. Os componentes das clulas eucariticas (Figura 1) compreendem: a membrana citoplasmtica, o citoplasma, o ncleo, o retculo endoplasmtico, o complexo de Golgi, os lisossomos, as mitocrndrias, os peroxissomos, as incluses lipdicas, o glicognio, o citoesqueleto, os centrolos, o centrossomo, os cloroplastos (encontrados em vegetais) e a parede celular, sendo esta ltima encontrada em fungos e vegetais. As caractersticas morfolgicas e fisiolgicas das principais estruturas encontradas nas clulas eucariticas sero apresentadas a seguir. Figura1. Clula eucaritica mostrando membrana plasmtica, ncleo (N) e organelas.
2.1. Membrana celular
A membrana plasmtica ou celular atua na manuteno de microambientes, formando uma barreira que impede o contedo celular de escapar e se misturar com o meio circundante. Esta membrana confere individualidade a cada clula,
definindo os meios intra e extracelulares. Alm desta funo, a membrana plasmtica o primeiro contato entre esses meios, traduzindo informaes para o interior da clula e permitindo que ela responda a estmulos externos que podem influenciar nas suas funes biolgicas, participando decisivamente das interaes clula clula e clula matriz extracelular. A membrana plasmtica e a membrana das diferentes organelas celulares medem cerca de 7 a 10 m de espessura e so visveis somente ao microscpio eletrnico. Trata-se de uma estrutura trilaminar constituda de duas camadas eletrondensas (escuras) e uma camada eletronlcida (clara) central. Molecularmente so formadas por uma bicamada fluda de fosfolipdios (fosfoglicerdeos e esfingolipdios) e colesterol, onde esto inseridas molculas de protenas. A membrana plasmtica no uma estrutura esttica, os lipdios movem-se proporcionando fluidez membrana. Esquema mostrando a bicamada da membrana plasmtica: Figura 2. A membrana plasmtica formada por molculas de lipdeos (fosfoglicerdeos e esfingolipdeos), colesterol, protenas perifricas (localizadas somente em uma das camadas dos fosfolipdeos) e as transmembranares (localizadas nas duas camadas dos fosfolipdeos, ligando o meio extracelular ao citoplasma). A cadeia de pequenas molculas verdes representa os carboidratos localizados somente no lado externo da membrana plasmtica.
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Os carboidratos presentes nesta estrutura, como, por exemplo, glicose, manose, fucose e galactose, esto ligados s protenas, formando as glicoprotenas; ou aos lipdios, resultando nos glicolpidios e nos glicoesfingolipdios. Estes carboidratos esto presentes apenas na face externa da membrana e fornecem identidade clula. A membrana apresenta uma propriedade imprescindvel para manuteno da viabilidade celular, que a permeabilidade seletiva, controlando a entrada e a sada de substncias da clula. A passagem de molculas polares maiores e os ons requer canais, formados por protenas transmembranares. O transporte de molculas para o interior das clulas pode ser: a) transporte passivo por difuso ou por osmose, quando no envolve o consumo de energia do sistema, sendo utilizada apenas a energia cintica das molculas. Sendo assim, a movimentao dos ons e molculas d-se a favor do gradiente de concentrao (do meio hipertnico para o meio hipotnico). A difuso pode ser auxiliada por enzimas (difuso facilitada) ou pode no ter participao de nenhuma delas (difuso simples). A difuso simples ocorre quando molculas hidrofbicas pequenas e polares, como O2, CO2, N2 e C6 H6, passam pela membrana sem serem bloqueadas; b) transporte ativo quando o transporte das molculas envolve a utilizao de energia pelo sistema, na forma de adenosina trifosfato (ATP). A movimentao das substncias se d contra o gradiente de concentrao, ou seja, do meio hipotnico para o hipertnico, como, por exemplo, a bomba de sdio e potssio, que tem funo de manter o potencial eletroqumico das clulas. Entretanto, partculas maiores no conseguem atravessar a membrana, mas podem ser incorporadas clula pela prpria estrutura da membrana celular, ocorrendo, assim, a formao de vesculas. A este processo, no qual a membrana celular envolve partculas ou fluido do exterior, d-se o nome de endocitose. Ele ocorre por dois mecanismos:
a) fagocitose quando ocorre a captao de molculas maiores, partculas ou microrganismos. Neste processo, a partcula a ser ingerida toca na membrana celular, formando projees chamadas de filopdios; b) pinocitose processo utilizado pela clula para englobar pores de fluidos extracelulares e pequenas molculas. Neste caso, a membrana sofre um processo de invaginao, ocorrendo a formao de pequenas vesculas. Estas so direcionadas para o citoplasma para que ocorra a absoro dos nutrientes. Por outro lado, para eliminar substncias residuais, a clula utiliza o processo de exocitose, no qual uma vescula, vinda do citoplasma contendo material que deve ser eliminado, se funde membrana plasmtica, lanando o seu contedo no meio extracelular.
2.1.1. Especializaes da membrana plasmtica
A comunicao e a coeso entre as clulas so estabelecidas por meio das membranas, formando trs classes funcionais de junes celulares: a) juno ancorante ou aderente clula-clula ou clula-matriz, s quais a fora de estresse transmitida ao citoesqueleto. Existem vrios tipos desta juno; destacamos, dentre eles, os desmossomas, os hemidesmossomas e junes que circundam completamente as clulas, atuando como uma barreira de permeabilidade e tenso; b) juno apertada ou oclusiva (tight junctions) um tipo de juno que liga duas clulas vizinhas, selando os espaos entre elas e tornando essa regio impermevel, no permitindo, assim, a passagem de pequenas molculas ou ons; c) juno mediada por canais proteicos so as junes comunicantes (gap junctions) que permitem a passagem de molculas e de ons entre duas clulas adjacentes.
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2.2. Citoplasma
O citoplasma, ou citossol das clulas eucariotas, formado por uma soluo coloidal, viscosa e de aspecto relativamente uniforme, que contm gua (80%), ons diversos, aminocidos e protenas. No citoplasma esto localizados o ncleo e as organelas celulares, o retculo endoplasmtico, o complexo de Golgi, os lisossomos, as mitocndrias, os peroxissomos e, ainda, as incluses lipdicas, os grnulos de glicognio e os ribossomos. Estas estruturas so responsveis pelas funes celulares, como digesto, respirao, secreo, sntese e transporte de protenas. No citoplasma esto tambm os elementos do citoesqueleto, responsveis por vrias atividades dinmicas das clulas, e os centrolos, estruturas geradoras dos microtbulos.
2.3. Ncleo
Estrutura extremamente importante para as clulas eucariticas, pois nele esto contidos os cidos nucleicos (cdigo gentico), protegidos pelo envoltrio nuclear. no seu interior que ocorre a duplicao do DNA e a transcrio dos ARNs. O ncleo tem sua localizao geralmente no centro da clula e a sua forma pode estar relacionada ao tipo celular. O envoltrio nuclear composto por duas membranas, uma externa e outra interna, com composies proteicas distintas, que delimitam um espao varivel que oscila entre 40 e 70 mm. A membrana interna deste envoltrio se encontra associada lmina nuclear, que, por sua vez, est ligada fortemente cromatina. A membrana externa do envoltrio circunda a membrana interna e contnua com a membrana do retculo endoplasmtico (RE). Este fato faz com que o espao existente entre as membranas do envoltrio seja tambm contnuo luz do RE. Assim como a membrana do RE, a membrana externa do envoltrio face citoplasmtica apresenta ribossomos aderidos que esto envolvidos ativamente na sntese proteica. O envoltrio nuclear interrompido regularmente, formando os poros nucleares.
Eles tm nmero e densidade bastante variveis, dependendo do tipo celular e estado metablico da clula. Pelos poros, ocorre o transporte bidirecional seletivo de protenas e ARNs entre o citossol e o ncleo. No ncleo (Figura 3) de clulas em intrfase encontra-se a cromatina compactada (heterocromatina) ou frouxa (eucromatina) composta de molculas de DNA, protenas histnicas e no histnicas. As histonas, protenas bsicas encontradas nos eucariotos, so importantes componentes da estrutura da cromatina, participando no somente como repressoras, mas tambm como ativadoras na transcrio do DNA. Por outro lado, as protenas no histnicas desempenham papel estrutural e enzimtico, participando da atividade gnica. No ncleo interfsico tambm esto os nuclolos, cuja funo sintetizar ARNs e envi-los para o citoplasma. Os nuclolos podem ter estrutura reticular ou compacta e o tamanho e a forma dependem do estado funcional da clula, variando conforme o tipo celular. Durante o ciclo celular, geralmente os nuclolos desaparecem a partir do final da prfase, reaparecendo no final da telfase. A lmina nuclear est presente no ncleo, tendo papel importante na reorganizao nuclear aps o trmino da diviso celular. Ela est ancorada s protenas integrais da membrana interna do envoltrio nuclear e ligada fortemente cromatina. constituda por protenas filamentosas intermedirias do tipos A e B que se polimerizam em uma rede bidimensional. Da estrutura do ncleo faz parte a matriz nuclear, que forma uma rede proteica fibrogranular alicerando o ncleo. Ela est associada ao DNA durante os processos de duplicao e regula a transcrio nos eucariotos, juntamente com as histonas.
Figura 3. (A) Moncitos mostrando o ncleo ocupando grande extenso do citoplasma da clula; (B) clula eucaritica, apresentando ncleo com poros (setas) e mitocndrias (M).
(A) (B)
2.4. Retculo endoplasmtico
O retculo endoplasmtico (RE) encontrado na maioria das clulas, ocupando cerca de 10% do volume celular. formado por uma rede de membranas interconectadas na forma de tubos ou cisternas. Dois tipos de retculo endoplasmtico so observados: liso (ou agranular) e rugoso (ou granular), os quais apresentam caractersticas morfolgicas e funcionais distintas. O retculo endoplasmtico liso, ou agranular, caracterizado pela ausncia de ribossomos aderidos sua membrana e apresenta-se como uma rede de delgados tbulos que se anastomosam entre si. As funes desse retculo so muito variadas, dentre elas a sntese de hormnios e de lipdios, a desintoxicao celular com a converso de substncias nocivas lipossolveis ou insolveis em compostos hidrossolveis e o armazenamento de clcio. O retculo endoplasmtico rugoso (Figura 4), ou granular, caracterizado pela presena de polirribossomos (ribossomos e ARNm) aderidos ao lado externo da membrana. Esta organela apresenta formas variadas, frequentemente em forma de tbulos achatados e longos ou bem dilatados, podendo estar
localizada em vrios pontos da clula ou concentrada em determinadas reas do citoplasma. O RE rugoso, em parceria com os polirribossomos, tem um importante papel na sntese e exportao de protenas. As protenas so capturadas pelo RE, por receptores presentes na sua membrana, assim que comeam a ser sintetizadas pelo complexo de ribossomos e ARNm. As protenas sintetizadas podem ter dois destinos: como protenas transmembranares ou protenas hidrossolveis. As protenas transmembranares podem permanecer na membrana do retculo ou serem destinadas membrana plasmtica e membrana de outras organelas. Por outro lado, protenas hidrosolveis, quando sintetizadas, podem ser direcionadas para o complexo de Golgi ou encaminhadas ao lmen de alguma organela e secretadas no meio extracelular. Figura 4. Retculo endoplasmtico rugoso (RE) dilatado de fibroblasto, apresentando ribossomos aderidos membrana.
2.5. Complexo de Golgi
O complexo de Golgi, aparelho de Golgi ou simplesmente Golgi (Figura 5) foi descrito em 1898 pelo bilogo italiano Camilo Golgi e formado por vesculas e tbulos achatados empilhados e organizados, chama-
dos de cisternas (cerca de 4 a 8 cisternas). As cisternas voltadas para o retculo endoplasmtico so convexas (cisternas cis). As centrais so denominadas cisternas medianas, e as mais prximas ao stio de secreo so cncavas (cisternas trans). O complexo de Golgi apresenta como principais funes o processamento de lipdeos e protenas (denominados de glicosilao, sulfatao e fosforilao) e a separao e o endereamento de molculas sintetizadas fazendo parte da via biossinttica secretora (RE sntese; Golgi processamento e seleo; vesculas transporte). As vias secretoras compreendem o transporte de lipdeos, protenas e polissacardeos aos destinos finais e o empacotamento das macromolculas em diferentes vesculas de transporte. Essas vesculas transportadoras direcionam protenas/lipdeos/hormnios do retculo endoplasmtico para o complexo de Golgi (face cis); o transporte de protenas/lipdeos (modificados) do complexo de Golgi para o retculo endoplasmtico (face cis) e para a superfcie celular (face trans) e, ainda, o transporte das molculas que originam os lisossomos (face trans). Figura 5. Citoplasma de clula eucaritica apresentando complexo de Golgi (G) com suas cisternas empilhadas, vesculas e mitocndrias.
2.6. Lisossomos
Os lisossomos so estruturas geralmente esfricas, delimitados por uma membrana, que apresentam uma grande variao no seu tamanho. Eles so formados no complexo de Golgi, e em seu interior se encontram acumuladas cerca de quarenta enzimas hidrolticas com propriedade de digerir uma grande gama de substratos, incluindo nucleases, proteases, glicosidases, lipases, fosfolipases e sulfatases. Estas hidrolases tm um pH timo entre 3 e 6, e, assim, o interior dos lisossomos cido. A acidificao realizada por bombas de H+, que usam ATP. As suas enzimas so glicoprotenas provenientes do Golgi, que saem da sua face trans em vesculas especficas. A compartimentalizao destas enzimas impede a lise indiscriminada dos contedos celulares. A principal funo do lisossomo a digesto intracelular, permitindo, assim, que a clula seja capaz de degradar partculas, macromolculas, microrganismos ou outras clulas provenientes da endocitose. Alm disso, os lisossomos agem na eliminao de organelas ou partes danificadas da prpria clula, por um processo denominado autofagia. A formao dos autolisossomos se inicia quando uma poro de RE envolve uma organela que deve ser destruda, formando uma vescula em seu redor. Esta vescula posteriormente acidificada e fundese com um lisossomo primrio, que inicia a degradao. Na heterofagia, os lisossomos fundem-se com endossomos (provenientes da endocitose) ou fagossomos (provenientes da fagocitose).
2.7. Mitocndrias
As mitocndrias (Figura 6) esto presentes no citoplasma das clulas eucariticas, sendo caracterizadas por uma srie de propriedades morfolgicas, bioqumicas e funcionais. Geralmente, so estruturas cilndricas, podendo ser esfricas, ovoides e alongadas, com aproximadamente 0,5 mm de dimetro e vrios micrmetros de comprimento. Possuem grande mobilidade, localizandose em stios intracelulares onde h maior necessidade de energia, pois sua funo principal a produo de ATP. Uma clula heptica normal pode
conter de 1.000 a 1.600 mitocndrias, enquanto alguns ovcitos podem conter at 300 mil. Possuem organizao estrutural e composio lipoproteica caractersticas, e contm um grande nmero de enzimas e coenzimas que participam das reaes de transformao da energia celular. Esta organela caracterizada pela presena de um envoltrio formado por duas membranas estrutural e funcionalmente distintas, as quais delimitam dois espaos. Existe um espao intermembranar separando as membranas interna e externa, e um segundo gerado pela membrana interna, delimitando a matriz mitocondrial. A membrana interna apresenta uma srie de invaginaes para o interior da mitocndria, gerando as cristas mitocondriais, onde esto presentes os componentes da cadeia respiratria responsveis pela sntese de ATP. As mitocndrias apresentam uma molcula de DNA circular, semelhante quelas encontradas nas bactrias. Alm disso, contm todo mecanismo necessrio para replicao e transcrio do DNA e traduo de protenas. Entretanto, apenas uma pequena quantidade de protenas codificada pelo DNA mitocondrial. Com base nessas evidncias, surge a teoria endossimbitica. A mitocndria considerada a usina da clula, uma vez que esta capaz de processar oxignio e glicose e convert-los em energia na forma de ATP, por meio do ciclo de Krebs e da cadeia respiratria. Figura 6. Fibroblasto: mitocndrias apresentando a matriz mitocondrial eletrodensa, cristas mitocondriais e a dupla membrana.
2.8. Peroxissomos
Os peroxissomos (Figura 7) so organelas envolvidas por apenas uma membrana e no contm DNA e nem ribossomos; todas as suas protenas devem ser importadas do citosol. Apresentam em seu interior um contedo granuloso fino e so geralmente arredondadas, medindo cerca de 0,5mm de dimetro. No seu interior, comum se observar a presena de uma poro fortemente eletrodensa, o nucleoide. Dentre as enzimas encontradas nos peroxissomos destacam-se a catalase, a urato oxidase, a Daminocido oxidase e as enzimas responsveis pela beta oxidao dos cidos graxos. Os peroxissomos assemelham-se ao retculo endoplasmtico porque se autorreplicam sem possuir genomas prprios. Nas clulas animais, os peroxissomos participam da biossntese de precursores de glicerolipdeos, do colesterol e do dolicol. O nmero relativo de peroxissomos na clula pode variar rapidamente em resposta s mudanas ambientais e s condies fisiolgicas. Os processos de sequestro e degradao dos peroxissomos so denominados macroautofagia e microautofagia.
2.9. Incluses lipdicas
Incluses lipdicas (tambm chamadas de corpos lipdicos, gotas lipidcas ou adipossomas) so organelas ricas em lipdios presentes em todos os organismos, incluindo fungos, procariotos e eucariontes. Elas variam de tamanho, tm aspecto circular e esto distribudas por todo o citoplasma das clulas. Os corpos lipdicos so circundados no pela clssica bicamada de membrana, mas por uma monocamada de fosfolipdios, a qual, no mnimo em algumas clulas, deve ter uma nica composio de cidos graxos. O ncleo interno dos corpos lipdicos rico em lipdios neutros, mas estudos com leuccitos tm demonstrado que os corpos lipdicos no so simples sacos de lipdios neutros. Considera-se atualmente que sejam organelas funcionalmente ativas, altamente reguladas e dinmicas. Pelo uso de tcnicas para identificao
subcelular de fraes enriquecidas de corpos lipdicos, combinado com imunodeteco de protenas por microscopia eletrnica e de luz, tem sido demonstrado que corpos lipdicos compartimentalizam enzimas envolvidas na biossntese, transporte e catabolismo de lipdios, caveolina e de protenas envolvidas no transporte vesicular. A formao regulada de corpos lipdicos, seus contedos proteico e lipdico, e sua associao com outras organelas intracelulares, em algumas clulas especializadas, atuam na sinalizao e ativao celulares, regulao do metabolismo de lipdios, trfego de membrana e controle da sntese e secreo de mediadores inflamatrios. Figura 7. Incluses lipdicas.
2.10. Glicognio
O glicognio (Figura 8) um polissacardeo constitudo por subunidades de glicose com uma ramificao a cada oito ou dez unidades. Ocorre internamente, na forma de grandes agregados ou grnulos no citoplasma. o meio de armazenamento mais importante nas clulas animais, servindo de reservatrio de glicose. Os hepatcitos so responsveis pela manuteno da glicemia, ao
mesmo tempo em que fornecem glicognio para outras clulas do organismo. Principal fonte de energia no crebro, os glicognios produzidos pelos astrcitos so mobilizados para atividade neuronal. Figura 8. Glicognio distribudo no citoplasma de clula eucaritica.
2.11. Citoesqueleto
O citoesqueleto confere s clulas eucariticas a manuteno da diversidade de formas, a realizao de movimentos coordenados e direcionados e sua estruturao interna. Esse citoesqueleto depende de uma complexa rede de filamentos de protenas que se estende por todo o citoplasma, sendo constitudo por trs principais tipos de estruturas: os microtbulos, os filamentos intermedirios e os filamentos de actina. Os microtbulos so formados por subunidades: b-tubulina e a-tubulina, as quais se associam uma s outras, conferindo-lhe assim uma forma cilndrica, com o dimetro de 25 mm. Os microtbulos direcionam o deslocamento de vesculas, participam da diviso celular com a formao do fuso mittico para o deslocamento dos cromossomos e esto presentes na manuteno da estrutura celular e na morfologia dos clios e flagelos.
Os filamentos intermedirios recebem esta denominao por apresentarem um dimetro intermedirio entre filamentos de actina e microtbulos (10 mm de dimetro). Sua composio proteica, formando uma rede estrutural por toda a clula. Os filamentos de actina (Figura 9) esto distribudos por todo o citoplasma das clulas eucariticas e apresentam dimetro de 5 mm. Eles so formados por uma protena globular, a actina, que apresenta as isoformas: a, b e g. Estes filamentos, nas clulas epiteliais, esto concentrados nos prolongamentos citoplasmticos, participando, juntamente com os desmossomos, do contato com outras clulas e com a membrana basal, mantendo, assim, a integridade organizacional do epitlio. Nos miofibroblastos, importantes clulas do tecido muscular, os filamentos de actina esto organizados paralelamente membrana plasmtica, mantendo estas clulas tensionadas ao substrato e so, ento, denominados fibras de estresse. Figura 9. Fibra estresse (asterisco) localizada abaixo da membrana, formada por microfilamentos de actina.
2.12. Centrossomo
O centrossomo, principal centro organizador de microtbulos, est localizado prximo ao ncleo da clula em intrfase e contm um par de formaes cilndricas e curtas dispostas perpendicularmente entre si e envolvidas por material pericentriolar, denominadas centrolos. Estas estruturas so formadas por nove triplex de microtbulos, semelhantes aos corpos basais de flagelos e clios. Esto presentes na maioria das clulas animais, porm ausentes nas clulas vegetais.
3. Tcnicas para visualizao das organelas celulares 3.1. Protocolos para revelao do ncleo
O ncleo pode ser visualizado tanto por microscopia de campo claro, com a utilizao do corante Giemsa, quanto por microscopia de fluorescncia, utilizando o corante fluorescente DAPI (4,6-diamidino-2-phenilindole). Por ME, ele pode ser visualizado quando se utiliza acetato de uranila, que torna a cromatina eletrodensa.
3.1.1. Marcao nuclear com DAPI
1- Fixar com 4% de PFA por 20 minutos a 4C; 2- Lavar duas vezes com PBS; 3- Lavar duas vezes com soluo de BSA 1% diluda em PBS por 10 minutos cada; 4- Incubar com DAPI 1:10.000 em 0,85% NaCl por 5 minutos em temperatura ambiente; 5- Lavar trs vezes com soluo de BSA 1% diluda em PBS por 10 minutos cada; 6- Montar com DABCO;
7- Selar com esmalte.
3.1.2. Colorao com Giemsa
1- Fixar com Bouin por 5 minutos em temperatura ambiente; 2- Lavar trs vezes com lcool etlico a 70%; 3- Lavar uma vez com gua destilada; 4- Corar com Giemsa (6 gotas de corante para cada 1mL de tampo
fosfato 0,2M soluo de uso filtrado), por 15 minutos em temperatura ambiente;

5- Lavar duas vezes em gua destilada. Para clarificao, passar em
srie de acetona / xilol (acetona 100% duas vezes, acetona 70% / xilol 30%, acetona 50% / xilol 50%, acetona 30% / xilol 70%, xilol 100% duas vezes);
6- Montar com Permount.
Preparao do tampo fosfato 0,2M:

Soluo A: NaH2PO4 . 1 H2O (fosfato de sdio monobsico) ................. 27,6 g gua tridestilada.......................................................................... 1 L Soluo B: Na2HPO4 (fosfato de sdio bibsico)...................................... 39,4 g gua tridestilada.............................................................................1L Soluo estoque do tampo: Soluo A................................................................................28 mL Soluo B.................................................................................72 mL Soluo de uso: Diluir 1:10 (soluo estoque: gua tridestilada).
3.2. Protocolo de marcao do retculo endoplasmtico
O RE pode ser observado por microscopia de fluorescncia pela utilizao de marcador fluorescente especfico, o ER-Tracker. E, por microscopia eletrnica de transmisso, utilizando-se citoqumica ultraestrutural, revelando a enzima glicose-6-fosfato.
3.2.1. ER-Tracker
Preparao de reagentes O ER-Tracker Green fornecido liofilizado em 100 mg. Preparar uma soluo estoque de 1mM. Para isso, deve-se diluir todo o contedo do frasco liofilizado em 128 mL de DMSO. recomendado que esta soluo seja separada em alquotas e estocada em freezer com dessecante. Preparo da soluo de marcao
Diluir a soluo estoque de ER-Tracker a 1 mm para a concentrao recomendada de 500 mm em meio simples; Para clulas aderidas, remover o meio da cultura, lavar trs vezes com
meio simples e adicionar a soluo de marcao pr-aquecida. Incubar as clulas por 30 minutos a 37 C. Substituir a soluo de marcao por meio de cultura e visualizar as clulas, utilizando microscpio de fluorescncia. Se as clulas a serem marcadas precisarem ser fixadas, consultar as etapas de marcao a seguir. Fixao das clulas ER-Tracker Green Lavar as clulas em meio simples por trs vezes. Fixar com PFA 4% por 20 minutos em temperatura ambiente. Lavar trs vezes com PBS, montar entre lmina e lamnula com DABCO.
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3.3. Protocolo para marcadores seletivos de mitocndria
Mitocndrias podem ser reveladas com marcadores fluorescentes especficos, como MitoTracker e Rhodamine 123, os quais so visualizados por microscopia de fluorescncia. Graas sua morfologia tpica, so facilmente identificadas durante as anlises por microscopia eletrnica.
3.3.1. Mito-Tracker Preparando a soluo estoque
Dissolver o produto liofilizado em DMSO de alta qualidade para uma concentrao final de 1 m; o peso molecular indicado no rtulo do produto. Solues em que se utilizam derivados di-hidro devem ser preparadas no dia do uso. A soluo estoque pode ser armazenada em freezer a -20 C, protegida da luz.
Preparando soluo de marcao
A concentrao para uma boa marcao varia de acordo com a sua aplicao. As condies sugeridas aqui podem necessitar de modificaes baseadas nos tipos celulares utilizados ou em outros fatores, tais como permeabilidade das clulas ou dos tecidos a serem marcados. Diluir a soluo estoque de MitoTracker a 1 mm para uma soluo de uso com meio de crescimento Dulbeccos modified Eagle medium (D-MEM), sem soro, ou de acordo com o meio em que as clulas esto crescendo. Para marcao em clulas vivas, usar uma concentrao de 100 mm.
Marcando clulas aderidas
Crescer as clulas em lamnulas dentro de uma placa de Petri coberta pelo meio de cultura apropriado. Quando as clulas alcanarem a confluncia desejada, remover o meio da placa, lavar trs vezes em meio simples e adicionar o meio pr-aquecido (37 C) contendo MitoTracker. Incubar as clulas por 30 minutos sob condies de crescimento apro-
priadas para cada tipo celular. Substituir o meio com marcador por meio pr-aquecido e observar as clulas em microscpio de fluorescncia, utilizando o filtro adequado. Para fixar as clulas, deve-se retirar o meio com marcador e lav-las com meio simples. Fixar com PFA 4% por 20 minutos em temperatura ambiente, lavar trs vezes com PBS e montar entre lmina e lamnula com DBCO.
3.4. Protocolo de marcao de grnulos de glicognio
Para caracterizar a expresso de polissacardeos grnulos de glicognio , utilizamos mtodos citoqumicos ultraestruturais, empregando a tcnica de Thiry. O material deve ser processado de acordo com o protocolo de microscopia eletrnica de transmisso, sendo as amostras includas em resina Epon. Os cortes ultrafinos so obtidos e recolhidos em grades de ouro e submetidos ao seguinte protocolo:
3.4.1. Thiry
1- As clulas so oxidadas por 20 minutos com 1% de cido peridico; 2- Lavadas rapidamente por duas vezes em gua destilada; 3- Incubadas por 30 minutos, 24, 48 ou 72 horas, em cmara mida, com 2% de tiocarbohidrazida diluda em 20% (v/v) de cido actico; 4- Lavadas sucessivamente em concentraes decrescentes de cido actico (10%, 5%, 3% e 1%) por 1 minuto cada; 5- Reveladas com 1% de proteinato de prata diludo em soluo aquosa por 30 minutos. OBS: metodologia alternativa, aps as etapas descritas anteriormente, a revelao ser realizada pelo vapor de tetrxido de smio por 1 minuto;
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6- Lavadas com gua (uma vez rapidamente), seguidas de uma lavagem por 10 minutos, trocando a gua sucessivas vezes; 7- Ao final, os cortes sero examinados diretamente ao microscpio eletrnico EM10C da Zeiss, sem prvia contrastao. Os controles da reao sero feitos por: a) Omisso de tiocarbohidrazida; b) Omisso da oxidao com cido peridico; c) Omisso dos agentes reveladores.
3.5. Protocolo para marcao de compartimentos intracelulares cidos
A marcao de compartimentos intracelulares cidos lisossomos pode ser feita utilizando os marcadores laranja de acridina e Lysotraker: 1- Diluir a soluo estoque a 1 mM para uma soluo de uso a uma concentrao de 75 nM. A diluio deve ser feita em meio de cultura simples; 2- Remover o meio da placa, lav-la com meio simples trs vezes e adicionar o meio pr-aquecido (37 C) contendo o marcador; 3- Incubar as clulas com laranja de acridina ou Lysotraker diluda em meio utilizado para o cultivo celular na concentrao de 10mg/ml e 75 nM, respectivamente, por 30 minutos a 37 C, sob condies apropriadas para crescimento de cada tipo celular; 4- Aps incubao, lavar duas vezes em salina tamponada com fosfato (PBS) e observar as clulas em microscpio de fluorescncia com o filtro adequado; 5- Fixar com 2% paraformaldeido durante 20 minutos a 4 C e, em seguida, lavar trs vezes com PBS;
6- Em seguida, incubar com 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para visualizao do ncleo por cinco minutos temperatura ambiente; 7- Lavar com PBS; 8- Montar a lmina com antifading 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO).
Referncias bibliogrficas
ALBERTS, B. et al. Biologia molecular da clula. 4. ed. Porto Alegre: Artes Mdicas, 2004. CARVALHO, H. F.; RECCO-PIMENTEL, S. M. A Clula. So Paulo: Manole, 2001. GIEMSA, G. Eine Vereinfachung und Vervollkommung meiner Methylenblau-EosinFrbemethode zur Erzielung der Romanowsky-Nochtschen Chromatinfrbung. Centralblatt fr Bakteriologie, I, Abteilung Originale, v. 32, p. 307-313, 1904. THIRY, J. P.; RAMBOURG, A. Cytochimie des polysaccharides. J. Microscopie, v. 21, p. 279-282, 1974.
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Captulo 2
Histologia
Daniel Santos Souza Leandro Medrado Lycia de Brito Gitirana 1. Introduo
A histologia um ramo da cincia que estuda os tecidos de animais e vegetais e como estes tecidos se organizam e se relacionam para compor estes diferentes organismos. A separao dos tecidos em estruturas distintas algo artificial e feita com fim puramente didtico, como estratgia para a compreenso de suas caractersticas principais. S com um bom conhecimento das suas caractersticas individuais poderemos entender e avaliar a histologia nos diferentes rgos do organismo e como os diferentes tecidos se inter-relacionam de maneira dinmica. O termo histologia foi usado pela primeira vez em 1819 por Mayer, ao utilizar o termo tecido (do grego histos) cunhado pelo anatomista e fisiologista francs Xavier Bichat (1771-1802). Foi Bichat quem aprofundou a anlise anatomopatolgica, deslocando a doena dos rgos para os tecidos, utilizando como princpio bsico o isomorfismo dos tecidos (Foucault, 2008).
De acordo com suas anlises, o organismo era composto de tecidos com texturas semelhantes, que podiam ser lidas, identificando as similaridades, parentescos e inter-relaes das doenas inscritas na configurao do corpo. Ao identificar estas semelhantes texturas do organismo e suas respectivas funes que nasce a histologia como base da que conhecemos hoje. Nos humanos, os tecidos so divididos em quatro grandes grupos de acordo com as diferenas morfolgicas e suas especializaes funcionais (condutibilidade, contratilidade, absoro, excreo e reproduo, dentre outras). Esses quatro tecidos so: os tecidos epiteliais, tecidos conjuntivos, tecidos musculares e tecidos nervosos.
2. Tecido epitelial Tecido
O tecido epitelial se caracteriza principalmente por ser constitudo de clulas bem justapostas, geralmente polidricas, com pouca substncia intercelular e ausncia de vascularizao. As clulas epiteliais so bastante dinmicas, possuindo uma elevada atividade mittica que promove a constante renovao epitelial. Essa taxa de renovao, entretanto, varivel de acordo com o tecido avaliado. As funes mais caractersticas dos epitlios so a de revestimento de superfcies externas e internas do organismo, e a formao das glndulas. As clulas epiteliais so provenientes das clulas que constituem os trs folhetos germinativos do embrio (ectoderma, endoderma e mesoderma). A forma de suas clulas e a justaposio celular que apresentam garantida por um conjunto de junes celulares especializadas. Essas junes celulares vo ter apresentao varivel de acordo com a especificidade funcional do tecido no qual se encontram, mas de uma forma geral apresentam as seguintes caractersticas:
Histologia | 45
Znula de ocluso: localizada na poro apical das clulas epiteliais,
formada por protenas integrais da membrana plasmtica que se ligam ao cinturo adesivo das clulas vizinhas, impedido a passagem de molculas entre elas, havendo, portanto, obliterao do espao intercelular.
Znula de adeso: localizada abaixo da znula de ocluso, tem como
funo aumentar a adesividade intercelular.

Desmossomos: podem ser comparados a um boto de presso, cons-
titudos por duas metades que se encaixam, estando uma metade localizada na membrana de uma das clulas e, a outra, na clula vizinha. So responsveis por conferir maior adeso celular e resistncia.
Junes comunicantes: interconectam clulas epiteliais, mas esto pre-
sentes tambm em alguns tecidos musculares, permitindo a troca de molculas por meio dos poros que constituem.
Membrana basal, lmina basal e camada basal
Como o tecido epitelial no possui vasos sanguneos, apesar de participar na constituio deles, ele nutrido por meio da difuso dos nutrientes que chegam por meio de vasos sanguneos presentes no tecido conjuntivo (este sim, rico em vasos sanguneos). Uma fina camada composta de colgeno do tipo IV, a protena laminina e proteoglicanos1 a responsvel por selecionar e filtrar o que se poder passar do tecido conjuntivo para as clulas epiteliais. Essa estrutura a lmina basal, que totalmente sintetizada pelas clulas epiteliais, sendo somente visvel em microscopia eletrnica. A lmina basal desempenha importante funo de nutrir as clulas epiteliais, alm de sustent-las e promover sua adeso ao tecido conjuntivo.
Proteoglicanos so formados por polissacardeos que formam ligaes covalentes com protenas. So molculas grandes capazes de manter um grande espao de hidratao na matriz extracelular.
1
Em algumas regies, em continuao lmina basal, h uma camada de fibras reticulares (principalmente colgeno do tipo III) conjugadas a complexos de protenas, produzidas pelo tecido conjuntivo. Esses elementos formam uma espessa camada, identificada na microscopia de luz pela reao do cido peridico + reativo de Schiff (PAS) ou impregnao pela prata. Nem todos os estudiosos da rea concordam com esta distino, mas a lmina basal somada camada de fibras reticulares que se denomina membrana basal (MB).
2.1. Epitlios de revestimento
O tecido epitelial de revestimento responsvel por separar o tecido conjuntivo subjacente do meio externo ou das cavidades internas do corpo e funciona como um protetor e um controlador da passagem de substncias do meio externo para o tecido conjuntivo (TC).
Classificao dos epitlios (EP)
Os epitlios de revestimento se classificam principalmente de acordo com a forma das clulas e o nmero de camadas nas quais essas clulas esto dispostas. De acordo com a forma das clulas, os epitlios podem ser classificados em:
Epitlios pavimentosos (Figura 1A): clulas mais largas do que
altas, achatadas como ladrilhos e com o ncleo redondo ou alongado e central.
Histologia
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Figura 1A. Epitlio pavimentoso. EP epitlio, MB membrana basal, TC tecido conjuntivo.
Epitlios cbicos (Figura 1B): clulas com altura e largura equivalen-
tes, com forma de cubo e ncleo redondo central. Figura 1B. Epitlio cbico. EP epitlio, MB membrana basal, TC tecido conjuntivo.
Epitlios cilndricos (Figura 1C): tambm chamados de prismticos
ou colunares, estes epitlios possuem clulas cuja altura maior do que a sua largura. Suas clulas so alongadas, com um ncleo basal tambm alongado.
Figura 1C: Epitlio cilndrico. EP epitlio, MB membrana basal, TC tecido conjuntivo.
Epitlio especial ou de transio: clulas epiteliais cuja forma varia
constantemente, impedindo sua classificao nas categorias anteriores. De acordo com o nmero de camadas, os epitlios podem ser:
Simples: formado por uma s camada celular, na qual todas as clulas
esto em contato com a lmina basal, como representado nas figuras 1A, 1B e 1C.
Estratificado (Figura 2): formado por mais de uma camada celular, de
forma que s as clulas da base (camada basal) tm contato com a lmina basal. Figura 2: Tecido epitelial estratificado. EP epitlio, MB membrana basal, TC tecido conjuntivo.
Histologia | 49
2.2. Epitlios glandulares
As clulas epiteliais glandulares so originadas durante o processo de proliferao das clulas do epitlio de revestimento no desenvolvimento embrionrio. Essas clulas de revestimento invadem o tecido conjuntivo subjacente e se diferenciam, especializando-se na elaborao de produtos de secreo variados (Figura 3). Figura 3: Formao das glndulas pela invaginao do tecido epitelial em direo ao tecido conjuntivo. EP epitlio, MB membrana basal, TC tecido conjuntivo.
Os epitlios glandulares podem ser classificados de acordo com diversos aspectos:

Glndulas unicelulares e multicelulares
Clulas que desempenham, isoladamente, funo de secreo so chamadas de glndulas unicelulares. Dessas, o melhor exemplo a clula caliciforme, presente tanto na via digestria quanto na via respiratria, atuando na produo de muco. O termo glndula , entretanto, usado de forma mais comum para se fazer referncia s glndulas multicelulares, que so compostas pelo agrupamento de vrias clulas secretoras. As glndulas sudorparas, salivares e adrenais so alguns exemplos de glndulas multicelulares.
Glndulas excrinas e endcrinas
Durante o processo de diferenciao celular e formao das glndulas, quando ocorre a invaso do tecido conjuntivo pelo epitlio de revestimento embrionrio,
algumas glndulas mantm sua ligao s clulas de revestimento. Essa ligao adquire a forma de um tubo ou ducto celular pelo qual as secrees podem ser eliminadas para a superfcie do tecido, do rgo, ou mesmo do organismo. Dessa forma, quando h um ducto secretor, a glndula considerada excrina (Figura 4). Quando, durante este processo de diferenciao celular, as clulas glandulares no mantm nenhuma ligao com o epitlio de revestimento, isolando-se no interior do tecido conjuntivo, a glndula chamada endcrina. Nesse caso, devido ausncia de um ducto secretor, estas glndulas endcrinas liberam suas secrees, os hormnios, diretamente na corrente sangunea (Figura 5). Figura 4. Gndula Excrina. EP epitlio, MB - membrana basal, TC - tecido conjuntivo, DE - ducto excretor, PS - poro secretora Figura 5. Gndula Endcrina. EP epitlio, MB - membrana basal, TC tecido conjuntivo, VS - vaso sanguneo, PS - poro secretora, HR hormnio
No corpo humano, o fgado2 e o pncreas3 realizam funes excrinas e endcrinas, e so chamados glndulas mistas.
A funo excrina do fgado representada pela produo da bile, que liberada na luz do tubo digestrio (mais especificamente no duodeno). O fgado tambm classificado como endcrino por produzir protenas (como a albumina, protrombina e fibrinognio) que so liberadas diretamente na corrente sangunea.
2
A secreo excrina do pncreas o suco pancretico, rico em enzimas digestivas e liberado no duodeno. A poro endcrina do pncreas produz e libera os hormnios insulina e glucagon, ambos fundamentais no metabolismo da glicose no organismo.
3
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Glndulas mercrinas, holcrinas e apcrinas (Figura 6)
As glndulas so classificadas tambm pelo modo como as suas clulas secretam. Nas glndulas mercrinas, as clulas glandulares eliminam somente a sua secreo, por meio de exocitose, mantendo intacto o seu citoplasma (pncreas, por exemplo). Nas glndulas holcrinas, as clulas glandulares acumulam os seus produtos de secreo no citoplasma, morrem em seguida, desfazendo-se e passando a constituir, elas prprias, a sua secreo (glndulas sebceas, por exemplo). As glndulas apcrinas representam um meio-termo entre estas e outras formas de secretar. Nelas, as clulas glandulares, ao eliminarem sua secreo, perdem certa quantidade do seu citoplasma apical (glndulas mamrias, por exemplo). Figura 6. Diferentes modos de secretar. Glndulas mercrinas, apcrinas e holcrinas. GS - grndulos de secreo, EP - epitlio, MB - membrana basal, TC - tecido conjuntivo.
Um grupo de clulas que desempenha uma atividade de apoio secreo glandular excrina so as clulas mioepiteliais. Trata-se de clulas epiteliais cujo citoplasma contm filamentos de actina e de miosina, o que lhes confere a
capacidade de se contrair. Essas clulas possuem uma forma estrelada, e se localizam entre a lmina basal e a clula secretora, ligando-se umas s outras, envolvendo assim a poro secretora da glndula. Elas atuam contraindo-se e ajudando a glndula excrina a expelir seu produto pelo ducto excretor.
Tecidos 3. Tecidos conjuntivos
Os diversos tipos de tecido conjuntivo existentes no corpo tm a funo de unir outros tecidos, conferindo-lhes sustentao e dando conjunto ao corpo, da sua denominao. A denominao tecido conjuntivo, entretanto, um ttulo geral que designa um grupo de diversos tecidos com vrias funes. O tecido conjuntivo compreende um tecido tradicionalmente conhecido como tecido conjuntivo propriamente dito e um amplo grupo de tecidos chamados tecidos conjuntivos especiais, com funes altamente especializadas. Esse grupo de tecidos conjuntivos especiais compreende os tecidos adiposo, cartilaginoso, sseo, sanguneo e hematopoitico, que sero tratados mais adiante. De uma forma geral, todos os tecidos conjuntivos so originrios de clulas alongadas no mesnquima embrionrio4, e so formados essencialmente por clulas mesenquimais e uma matriz extracelular abundante. Sero variaes tanto nas caractersticas celulares quanto nas peculiaridades da matriz extracelular que determinaro, nos diferentes tecidos conjuntivos, sua especializao no desempenho de determinadas atividades e funes.
3.1. Tecido conjuntivo propriamente dito
O tecido conjuntivo propriamente dito o que mantm as caractersticas mais elementares nos seus componentes. ricamente vascularizado e se
Clulas mesenquimais ou mesenquimatosas so originadas do mesoderma, folheto germinativo intermedirio dos tecidos embrionrios.
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encontra sempre abaixo do tecido epitelial, dando-lhe suporte e garantindo sua nutrio. Suas clulas tero funes na manuteno da homeostase5 tecidual, mas no tero caractersticas especializadas no sentido de conferir especificidade funcional ao tecido. Da mesma forma, a matriz extracelular se apresentar em sua configurao mais bsica.
Clulas do tecido conjuntivo propriamente dito
Grande parte das clulas encontradas nos tecidos conjuntivos produzida nos prprios tecidos, mas algumas outras clulas, como os leuccitos, por exemplo, que transitam na corrente sangunea, podem habitar temporariamente o interior desses tecidos. De um modo geral, as clulas do tecido conjuntivo propriamente dito so:
Fibroblastos/fibrcitos
So as mais importantes clulas deste tecido conjuntivo, estando responsveis pela produo e manuteno da matriz extracelular. Os fibroblastos (Figura 7) so clulas jovens, com forma estrelada devido a seus vrios prolongamentos celulares. Apresentam tambm grande basofilia6, devido ao seu ncleo grande e ao retculo endoplasmtico granular e complexos de Golgi desenvolvidos, o que indica a sua produo ativa de componentes da matriz extracelular. Funcionando de certa maneira como uma regra entre os tecidos conjuntivos, a clulas essenciais dos tecidos, jovens e encarregadas de produzir a matriz extracelular, tm em sua nomenclatura o termo blasto, que indica
Homeostase a propriedade de um sistema orgnico regular o seu ambiente interno de modo a manter uma condio estvel, mediante mltiplos mecanismos de ajuste. 6 A basofilia caracterizada pela afinidade de uma clula ou de um tecido pelos corantes bsicos por possuir carter cido. Indica a presena de organelas associadas produo ativa de substncias proteicas, como retculo endoplasmtico granular, complexo de Golgi e polirribossomos no citoplasma.
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que esta clula est em crescimento ativo e sintetizando matriz extracelular. Essas clulas, porm, no se mantm continuamente ativas, e quando entram em estado de repouso retraem-se, tornando-se menores e mais alongadas, sem os prolongamentos celulares, com organelas menos desenvolvidas. Essas clulas passam, ento, a receber o sufixo cito. Nesse caso, os fibroblastos, ao entrarem em repouso, adquirem as caractersticas descritas acima, e passam a ser chamados fibrcitos (Figura 7), embora esse termo no deva ser mais empregado, pois sugeriria um tipo celular diferenciado, o que no a realidade, mas representa apenas um momento funcional do fibroblasto. Esse processo pode ser revertido se o tecido for lesionado ou se, por outro motivo, houver a necessidade de novos fibroblastos para produzir novamente a matriz extracelular. Nestes casos, os fibrcitos so estimulados e passam, de novo, a produzir ativamente, readquirindo suas caractersticas peculiares de quando estavam ativos. Figura 7. Clulas do tecido conjuntivo: fibroblasto e fibrcito
FIBROBLASTO
FIBRCITO
Macrfagos
So clulas grandes e ameboides, com ncleo ovoide ou em forma de rim, que se deslocam continuamente entre as fibras procura de bactrias e restos de clulas. Sua funo principal proteger os tecidos, fagocitando agentes infecciosos que penetram no corpo, e identificando
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substncias potencialmente nocivas ao organismo, apresentando antgenos e alertando o sistema imunolgico. Os macrfagos fazem parte do sistema fagocitrio mononuclear (SFM), derivando indiretamente de clulas da medula ssea.
Mastcitos
Clulas globosas, grandes, com o ncleo pequeno e central e o citoplasma repleto de grnulos basfilos. Seu ncleo, s vezes, fica encoberto pela grande quantidade de grnulos e no visto.
Plasmcitos
Essas clulas esto presentes em pequena quantidade nos tecidos conjuntivos, sendo responsveis pela produo de imunoglobulinas (anticorpos) importantes nos processos imunolgicos. So derivadas da ativao, proliferao e diferenciao de linfcitos B originrios da medula ssea. Em caso de aumento da permeabilidade vascular, causada por processos inflamatrios, outros leuccitos podem ser tambm encontrados no tecido conjuntivo propriamente dito.
Matriz Extracelular
A matriz extracelular um meio no qual as clulas do tecido conjuntivo esto dispostas, e lhes confere nutrio e substrato para sua organizao e atuao. formada por um conjunto de fibras imersas em uma substncia fundamental amorfa.
Elementos fibrosos do tecido conjuntivo
As principais fibras que compem o tecido conjuntivo so compostas de protenas produzidas pelos fibroblastos (no caso do tecido conjuntivo
propriamente dito). Sua distribuio varia conforme o tipo de tecido conjuntivo, sempre de acordo com as caractersticas morfofuncionais destes tecidos. Os elementos fibrosos observados por meio de tcnicas histoqumicas nos preparados histolgicos so: Fibras colgenas O colgeno um tipo de protena que possui mais de 20 variaes conhecidas, apresenta um ntido padro de estrias transversais e representa a protena mais abundante do corpo, constituindo 30% de seu peso seco. As fibras colgenas so o principal componente da matriz extracelular e podem ter caractersticas peculiares que as diferenciam nos vrios tipos conhecidos. As fibras colgenas tm como componente bsico a protena colgeno, e, para os estudos histolgicos mais bsicos, os tipos mais importantes de colgeno so:
Colgeno I: o tipo de colgeno mais abundante em todo o
organismo, sendo capaz de formar fibras espessas, as quais conferem resistncia aos tecidos.
Colgeno II: o tipo de colgeno encontrado na matriz
extracelular das cartilagens, formando fibrilas e atuando como molas biomecnicas.

Colgeno III: forma delicadas fibrilas, sendo o principal consti-
tuinte das fibras reticulares.

Colgeno IV: so fibrilas extremamente delicadas presentes na
lmina basal. Fibras reticulares Apesar da designao fibras, as fibras reticulares so formadas principalmente por colgeno do tipo III e, na realidade, so fibrilas delicadas. Por essa razo, muitos autores preferem inclu-las no sistema de fibras colgenas, isto ,
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elementos fibrilares que tm o colgeno como protena bsica, independente do tipo do colgeno. As fibras reticulares so delicadas e formam uma rede de tranado firme, dando sustentao aos rgos hematopoiticos7 e s clulas musculares, estando presente na parede de rgos de forma varivel, como no intestino, no tero e nas artrias. So chamadas fibras argirfilas por sua grande afinidade aos mtodos histoqumicos que tm como base a prata, como a reticulina de Gomori. Fibras elsticas So fibras delgadas que se ramificam e formam uma malha irregular. As fibras elsticas tm uma cor amarelada a fresco, que a sua presena abundante confere a alguns tecidos. As fibras elsticas so, na verdade, formadas por fibrilas maiores da glicoprotena fibrilina, na forma de um arcabouo, que ter sua poro central preenchida pela protena elastina. Estas fibras vo conferir elasticidade aos tecidos, sendo evidenciadas por tcnicas histoqumicas especiais, particularmente nos tecidos de sustentao do pulmo, na pele e nos vasos sanguneos.
Substncia fundamental
A substncia fundamental corresponde a uma matriz gelatinosa hidratada, na qual as fibras e as clulas esto imersas. composta em parte por um lquido chamado fluido tissular ou plasma intersticial, que derivado do plasma sanguneo e apresenta a mesma composio; porm, a gua presente na substncia fundamental no gua lquida, mas est sob a forma de gua de
rgos hematopoiticos so aqueles capazes de produzir os elementos figurados do sangue, como a medula ssea hematognica, o fgado e o bao.
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solvatao. A esse meio aquoso somam-se glicosaminoglicanos8, proteoglicanos e glicoprotenas adesivas que atuam como componentes estruturais da matriz extracelular, relacionando-se com as clulas e dando coeso a este conjunto.
Variedades do tecido conjuntivo propriamente dito
O tecido conjuntivo propriamente dito pode se apresentar como frouxo e denso. O tecido conjuntivo propriamente dito frouxo, ou simplesmente tecido conjuntivo frouxo, o tecido conjuntivo com ampla distribuio no corpo, estando presente em praticamente todos os rgos. chamado de frouxo, pois apresenta uma consistncia delicada, com clulas e fibras esparsas, casualmente organizadas e largamente espaadas, imersas em abundante substncia fundamental. O tecido conjuntivo denso, em contrapartida, se caracteriza pela abundncia de elementos fibrosos, preferencialmente fibras de colgeno, o que lhe confere grande resistncia, no deixando grandes espaos visveis de substncia fundamental. De acordo com a disposio de suas fibras, pode ser subclassificado ainda como tecido conjuntivo denso modelado ou no modelado.
Tecido conjuntivo denso modelado: apresenta predomnio de fibras
colgenas orientadas em um mesmo sentido, paralelas e alinhadas aos fibroblastos e s clulas que as produzem. Essa orientao em um determinado sentido confere ao tecido maior capacidade de resistncia trao. Esse tecido denso e modelado o principal constituinte dos ligamentos, tendes e aponeuroses.
Glicosaminoglicanos so polissacardeos grandes que contribuem para a integridade tecidual e auxiliam na difuso de substncias pela matriz extracelular (Stevens e Lowe, 2001).
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Tecido conjuntivo denso no modelado: neste tecido, h grande
quantidade de fibras colgenas, que esto dispostas de maneira irregular, orientadas em vrias e distintas direes.
3.2. Tecido adiposo
O tecido adiposo um tecido conjuntivo especial caracterizado pela predominncia de clulas especializadas, os adipcitos, associados a uma grande irrigao sangunea. O tecido adiposo corresponde, em pessoas de peso normal, a 2025% do peso corporal na mulher e 15-20% no homem. Esse tecido considerado a maior reserva de energia do corpo, apesar de no ser a nica. Alm da dimenso do depsito energtico que o tecido adiposo representa, por meio dos triglicerdeos, esse lipdeo ainda mais eficiente na produo de energia do que o glicognio. Um grama de triglicerdeos fornece 9,3 Kcal, enquanto um grama de glicognio fornece apenas 4,1 Kcal de energia. O tecido adiposo no tem s a funo de armazenar energia, mas ele atua tambm:
na modelagem da pele, tendo uma distribuio diferenciada em homens
e mulheres, conferindo-lhes as formas que lhes so peculiares;

na absoro de choques, amortecendo impactos externos sobre o
corpo;
no isolamento trmico, impedindo a perda de calor do corpo; preenchendo espaos e sustentando rgos.
Os tecidos adiposos podem ser de dois tipos:

Tecido adiposo unilocular
Nos seres humanos adultos, praticamente todo o tecido adiposo o unilocular (Figura 8). Os adipcitos uniloculares so clulas arredondadas e volumosas, com um ncleo achatado localizado na periferia da clula. Seu citoplasma escasso e aparece de forma delgada envolvendo a gota lipdica. Esse tipo de tecido adiposo possui uma cor que varia do branco ao amarelo a fresco, de acordo com a dieta do indivduo e a ingesto de alimentos com caroteno, um corante natural que escurece a cor da gordura. Ao nascimento, o tecido adiposo do beb forma uma camada uniformemente distribuda sob a pele, chamada panculo adiposo. Com o envelhecimento do indivduo, aspectos genticos e a liberao de hormnios sexuais e hormnios do crtex da glndula adrenal, essa gordura redistribuda por todo o corpo, remodelando o corpo do jovem.
Tecido adiposo multilocular
O tecido adiposo multilocular (Figura 8) recebe esse nome porque seus adipcitos apresentam vrias pequenas gotas lipdicas distribudas em seu citoplasma, em contraposio grande e nica gota do tecido unilocular. tambm chamado de tecido adiposo pardo, devido vascularizao abundante e presena de numerosas mitocndrias (que tm cor avermelhada) em suas clulas. Esse tecido tambm chamado, em animais que hibernam, de glndula hibernante, por ser abundante e possuir clulas dispostas de forma epitelioide. A principal funo deste tecido gerar energia na forma de calor, auxiliando na termorregulao do organismo.
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Figura 8. Tipos celulares do tecido adiposo.
3.3. Tecido cartilaginoso
A cartilagem um tipo de tecido conjuntivo formado de dois tipos celulares, condrcitos e condroblastos, e de uma matriz extracelular abundante, altamente especializada e vascular. Tem as funes de conferir suporte a tecidos moles (anis da traqueia, por exemplo), revestir as superfcies articulares dos ossos, e propiciar a formao e o crescimento dos ossos longos.
Formao da cartilagem
Durante sua formao embrionria, as clulas do mesnquima retraem seus prolongamentos e adquirem uma forma arredondada, multiplicando-se rapidamente e formando um aglomerado celular. Essas clulas jovens so chamadas condroblastos (Figura 9), e iniciam a sntese da matriz extracelular, distanciando-se umas das outras. Quando a matriz comea a adquirir uma consistncia mais rgida, os condroblastos ficam presos em espaos ligeiramente maiores do que eles, denominados cpsulas ou condroplastos. Os condroblastos multiplicam-se por mitose, dando origem a grupos de at 8 condrcitos chamados grupos de isgenos (Figura 9).
Figura 9. Tecido cartilaginoso
Pericndrio
Como o tecido cartilaginoso no possui vasos sanguneos prprios, suas clulas so nutridas por meio da difuso de substncias a partir de vasos do tecido conjuntivo adjacente. Desta forma, quase todas as cartilagens so envolvidas por uma camada de tecido conjuntivo chamada pericndrio (Figura 9). O pericndrio responsvel pela nutrio, oxigenao e eliminao de resduos metablicos da cartilagem, mas sua importncia vai alm disso. Suas clulas so semelhantes aos fibroblastos, mas as localizadas mais prximas da cartilagem podem se multiplicar, dando origem a novos condroblastos. Nas cartilagens presentes em articulaes sinoviais, a nutrio deste tecido feita por difuso pelo lquido sinovial.
Tipos de cartilagem Cartilagem hialina
a cartilagem mais comum no corpo humano. Possui uma cor brancoazulada e translcida a fresco e a responsvel pela formao do esqueleto
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temporrio no desenvolvimento fetal, at que esse esqueleto seja substitudo por tecido sseo. encontrada principalmente sustentando as fossas nasais, a traqueia e os brnquios, na extremidade ventral das costelas e recobre as superfcies articulares dos ossos longos. Localiza-se ainda entre a epfise e a difise9 dos ossos longos, na forma de um disco cartilaginoso chamado disco epifisrio (Figura 10). esse disco epifisrio o responsvel pelo crescimento dos ossos longos em comprimento.
Cartilagem elstica
Essa cartilagem encontrada no pavilho auditivo e na epiglote. Possui uma matriz extracelular semelhante da cartilagem hialina, mas possui ainda uma rede de fibras elsticas que confere a esse tipo de cartilagem, quando examinada a fresco, uma cor amarelada.
Cartilagem fibrosa
Tambm chamada de fibrocartilagem, a cartilagem mais resistente das trs, apresentando caractersticas intermedirias entre o tecido conjuntivo denso e a cartilagem hialina. Durante sua diferenciao, as fibras de colgeno orientam as clulas, de forma que esta cartilagem vai apresentar os condrcitos dispostos em fileiras, de acordo com a disposio das fibras de colgeno. Na cartilagem fibrosa no existe pericndrio morfologicamente distinto, sendo esse tecido nutrido pelos vasos do tecido conjuntivo denso ao qual est intimamente ligado. Por ser to resistente, encontrada em locais sujeitos a grande presso, como nos discos intervertebrais e na snfise pubiana.
As extremidades dos ossos longos so chamadas de epfises e o alongamento que as une chamado de difise. Essas denominaes sero mais bem exploradas no tpico sobre tecido sseo.
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O crescimento das cartilagens acontece de duas formas:

Crescimento intersticial: s acontece nos primeiros momentos
da vida da cartilagem, referindo-se diviso mittica dos condroblastos, dando origem aos grupos isognicos e expanso da cartilagem da resultante.
Crescimento aposicional: esse tipo de crescimento se d a partir
das clulas condrognicas do pericndrio, que se diferenciam em condroblastos, se multiplicam e produzem uma nova matriz cartilaginosa, promovendo o crescimento da cartilagem.
3.4. Tecido sseo
Os ossos so os principais componentes do esqueleto, tendo diversas funes:

proteo para rgos como corao, pulmes e o sistema nervoso
central;
sustentao e conformao do corpo; local de armazenamento de ons de clcio e fsforo10 e a restituio
desses elementos corrente sangunea de acordo com as necessidades do organismo, ou seja, participam da regulao da calcemia, cuja estabilidade indispensvel ao bom equilbrio de vrias funes orgnicas (ao de enzimas, permeabilidade de membranas, coagulao do sangue, transmisso do impulso nervoso, contrao muscular etc.);
constituem um sistema de alavancas que, juntamente com os msculos,
permite a locomoo de partes do corpo e a ampliao da fora muscular;

alojam e protegem a medula ssea.
Durante a gravidez, a calcificao fetal se faz em grande parte pela reabsoro desses elementos armazenados no organismo materno, por isso, recomendvel a ingesto, pela me, de alimentos ricos em clcio durante a gestao.
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De uma forma geral, nos indivduos adultos, os ossos so constitudos de uma parte externa de osso compacto, sem cavidades aparentes, e de uma parte interna, trabecular, com mltiplas cavidades intercomunicantes, constituindo o osso esponjoso. As cavidades intertrabeculares do osso esponjoso e o canal medular da difise dos ossos longos correspondem a um espao designado medula ssea, a qual possui duas variedades de tecido relacionadas com a produo dos elementos figurados do sangue: medula ssea vermelha ou hematognica (encontrada nos ossos longos, nos ossos chatos, no esterno e nas costelas), na qual desenvolvem-se os elementos figurados do sangue, e medula ssea amarela, preenchida por tecido adiposo e encontrada na cavidade medular dos ossos longos. Tanto o osso compacto quanto o osso esponjoso possuem os mesmos componentes histolgicos, mudando apenas a sua disposio estrutural, que lhes confere to distinta aparncia. Figura 10. Esquema de um osso longo, evidenciando suas pores: epfise, metfise e difise.
Matriz ssea
A matriz extracelular do tecido sseo pode ser dividida em dois tipos de constituintes: uma matriz orgnica e uma matriz inorgnica.
Matriz orgnica: formada principalmente por colgeno I, cujas fibras
esto imersas em um meio gelatinoso de mucopolissacardeos, gua e eletrlitos, alm de glicoprotenas especficas com grande afinidade pelo clcio (osteocalcina, por exemplo).
Matriz inorgnica: representa cerca de 50% da matriz ssea, e
composta de ons, principalmente de clcio e fosfato, alm de bicarbonato, magnsio, potssio, sdio e citrato em pequenas quantidades. Assim que produzida, a matriz ssea ainda no est classificada e possui uma consistncia delicada, sendo chamada osteoide. ons de clcio e fosfatos provenientes da circulao sangunea se ligam, formando cristais de hidroxiapatita (Ca10(PO4)6(OH)2). Esses cristais de hidroxiapatita, por sua vez, ligam-se s fibras de colgeno I do osteoide, promovendo o endurecimento caracterstico do osso.
Clulas do tecido sseo Osteoblastos
So as clulas do tecido sseo encarregadas de produzir a osteoide, a parte orgnica da matriz ssea. So clulas grandes e cuboides com vrias expanses citoplasmticas que se ligam s expanses citoplasmticas dos osteoblastos vizinhos. Mantm essas caractersticas descritas at o enrijecimento da matriz ssea decorrente da ligao da hidroxiapatita osteoide.
Ostecitos
Quando ocorre o enrijecimento da matriz ssea, os osteoblastos ficam aprisionados em espaos chamados lacunas (ou osteoplastos), que circunscre-
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vem a estrutura principal das clulas. A partir desse momento, suas caractersticas se modificam e eles passam a ser chamados ostecitos. A interrupo da produo de matriz faz com que toda a clula se retraia, tornando-se achatada e com pouca basofilia. Os prolongamentos celulares percorrem canais, os canalculos sseos que vo se ligar s lacunas e canalculos vizinhos, constituindo uma rede que vai permitir a intercomunicao entre os prolongamentos dos ostecitos, permitindo a sua nutrio a partir de vasos sanguneos que atravessam a estrutura ssea. Embora no produzam mais matriz, a presena dos ostecitos essencial para a homeostase do tecido e a manuteno da matriz ssea. A morte de uma dessas clulas seguida pela reabsoro da matriz que a envolve.
Osteoclastos
Localizadas na superfcie do tecido sseo que vai ser reabsorvido, essas clulas so caracterizadas por sua grande dimenso, sua multiplicidade de ncleos, sua mobilidade e por possuir vrias projees celulares na face voltada para o tecido sseo. A superfcie dos osteoclastos, que est em contato com a regio onde ocorrer a reabsoro da matriz ssea, rica em microprojees celulares irregulares, chamadas tambm borda em escova. O citoplasma, principalmente nessas reas, contm abundantes vesculas e vacolos, cujo material vai realizar a hidrlise enzimtica da osteoide, liberando o clcio para ser reutilizado pelo organismo. Todo tipo de osso vai possuir dois elementos essenciais que revestem suas superfcies internas e externas. Essas estruturas so, respectivamente, o endsteo e o peristeo, e so responsveis, principalmente, pela nutrio, crescimento e recuperao de danos nos ossos.
Endsteo: representado por uma camada de clulas osteognicas
achatadas que revestem a cavidade do osso esponjoso, o canal medular e os canais de Havers e de Volkmann.
Peristeo: a camada de tecido conjuntivo denso, muito fibroso na
sua poro mais externa, estando ancorado ao osso por suas fibras colgenas, que a ele se ligam fortemente (fibras de Sharpey). Sua poro mais interna, mais prxima do osso, mais celular, com clulas osteoprogenitoras, sendo bastante vascularizada. Essas clulas osteognicas (ou osteoprogenitoras) apresentam caractersticas semelhantes aos fibroblastos. Porm, quando ativadas, dividem-se por mitose e diferenciam-se em osteoblastos, atuando na reparao de fraturas e possibilitando o crescimento dos ossos.
Tipos de tecido sseo
Histologicamente, o tecido sseo pode estar estruturado de duas formas distintas: o tecido sseo primrio e o tecido sseo secundrio. As clulas e componentes da matriz so os mesmos nos dois tipos e essa distino se refere disposio das fibras colgenas na matriz ssea.
Tecido sseo primrio
O tecido sseo primrio (ou imaturo) se estrutura durante a vida embrionria ao ocorrer a primeira ossificao, ou durante a reparao de uma fratura. Nesse tipo de osso, as fibras colagenosas esto dispostas aleatoriamente, sem orientao definida, havendo uma menor quantidade de minerais, o que confere a esse tecido sseo resistncia menor que o tecido sseo secundrio.
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Tecido sseo secundrio
O tecido sseo secundrio (ou lamelar) surge em substituio ao tecido sseo primrio. No tecido sseo secundrio, as fibras colagenosas se organizam de modo a formar lamelas concntricas ao redor de canais onde transitam vasos sanguneos. Esse conjunto chamado sistema de Havers, e confere ao osso secundrio maior resistncia do que o osso primrio. O canal no centro das lamelas sseas que contm um vaso sanguneo chamado canal de Havers. Acompanhando a arquitetura ramificada dos vasos sanguneos, h canais transversais chamados canais de Volkmann. Os canais de Volkmann ligam os canais de Havers entre si e os canais de Havers com a cavidade medular e com a superfcie externa do osso (Figura 11). Figura 11. Sistema de Havers ou steon: LC lacunas, CN - canalculos, CH canal de Havers, SH sistema de Havers.
Tipos de ossificao
No embrio, a formao do osso ocorre por meio de dois mecanismos: a ossificao intramembranosa e a ossificao endocondral. Histologicamente, no h diferenas entre os tecidos sseos formados por esses dois tipos de ossificao, e ambos produziro tecido sseo primrio, o qual ser reabsorvido e substitudo por tecido sseo secundrio.
Ossificao intramembranosa ou endoconjuntiva
A designao intramembranosa conferida a esse processo por ele ocorrer em uma rea de densificao de elementos fibrosos do tecido conjuntivo embrionrio, erroneamente denominado membrana conjuntiva. Atualmente, h autores que utilizam a designao endoconjutiva para ressaltar que esse processo de ossificao ocorre no tecido conjuntivo. As clulas mesenquimais, de determinada rea do mesnquima programado a se diferenciar em tecido sseo, comeam a se diferenciar em osteoblastos, que por sua vez iniciam a produo de osteoide. O local onde se inicia a ossificao chamado centro de ossificao primria. Nesse novo tecido, os osteoblastos estabelecem contato e, com a deposio de clcio no osteoide, se transformam em ostecitos. Assim estruturam-se os canalculos sseos, as lacunas e todas as outras estruturas caractersticas do tecido sseo. As regies do mesnquima que no se diferenciam em clulas sseas originam o peristeo na superfcie externa e o endsteo na superfcie interna do osso em formao. Nos processos de reabsoro e reestruturao ssea que se seguem, se originam as camadas de osso compacto que constituem a superfcie perifrica desses ossos.
Ossificao endocondral
A ossificao endocondral o processo de formao dos ossos longos e curtos, a partir de um molde de tecido cartilaginoso. Pode-se dizer que este processo segue os seguintes passos: 1- Ao redor da pea cartilaginosa, o pericndrio comea a se ossificar, formando, assim, um cilindro sseo ao redor da pea de cartilagem. 2- Os condrcitos, situados no interior deste modelo cartilaginoso, se hipertrofiam, dilatando as suas cpsulas. Eles tambm, quando
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hipertrofiados, produzem fatores angiognicos (fator de crescimento endotelial vascular VEGF) que induziro formao de vasos sanguneos a partir do pericndrio. 3- Com o surgimento desses vasos sanguneos, as clulas condrognicas se transformam em osteognicas, dando origem a osteoblastos. Estes osteoblastos iniciam a produo de osteoide, que enrijece formando centros de ossificao primria, colaborando na formao de um colar subperistico ao redor da difise cartilaginosa. 4- Esse colar sseo impede a difuso dos nutrientes para o interior da cartilagem, levando morte dos condrcitos hipertrofiados, formando grandes concavidades no interior do molde cartilaginoso. 5- Osteoclastos, ao reabsorver o tecido sseo, formam orifcios no colar sseo, permitido que um broto vascular peristico (composto de clulas osteognicas, clulas hematognicas e vasos sanguneos) penetre nas cavidades do molde cartilaginoso. 6- As clulas osteognicas que penetraram no molde diferenciam-se em osteoblastos, iniciando a produo de tecido sseo por sobre os restos de cartilagem ainda existentes, formando um complexo cartilagem calcificada/osso calcificado. 7- Conforme o osso subperistico se espessa, osteoclastos comeam a reabsorver o material do complexo cartilagem calcificada/osso calcificado, aumentando a cavidade interna da difise, que ser a futura cavidade medular. 8- Nas epfises, ocorre um processo semelhante ossificao da difise, com a diferena de no se formar um colar sseo. As clulas osteognicas invadem as cavidades ocasionadas pela destruio da cartilagem, produzindo o complexo cartilagem calcificada/osso calcificado. Esse complexo ser reabsorvido pelos osteoclastos, restando apenas a cartilagem hialina do disco epifisrio e a cartilagem articular.
3.5. Tecido sanguneo
O sangue um tecido conjuntivo especializado que circula em um sistema fechado de canais, representado pelo corao, artrias, capilares e veias. Alm de transportar nutrientes a todas as clulas e retirar os produtos txicos resultantes do metabolismo, o sangue conduz, de um rgo para o outro, hormnios e outras substncias reguladoras da atividade celular. O sangue atua tambm nos processos de defesa, carregando anticorpos e clulas que destroem agentes invasores e ajudam na cicatrizao e recuperao de tecidos lesionados. O sangue ainda distribui calor, mantendo constante a temperatura do corpo, e auxilia na manuteno do equilbrio cido/bsico e osmtico dos fluidos corporais. No homem, o sangue consiste de um fluido viscoso, de cor vermelha e tonalidade varivel. Possui um pH levemente alcalino (7,4) e responsvel por aproximadamente 7% do peso corporal (+/- 5,5 L num indivduo adulto). Os componentes do sangue podem ser separados por centrifugao, desde que seja coletado com uso de anticoagulantes. Dessa forma, podem-se obter:
glbulos vermelhos (hemcias): representam de 42% a 47% do
volume total de sangue (hematcrito);

glbulos brancos (leuccitos) e plaquetas: vo formar a papa
leucocitria, designao conferida camada delgada e translcida, que representa apenas 1% do volume total de sangue;
plasma sanguneo: componente lquido do sangue, no qual os outros
componentes esto diludos e que representa aproximadamente 55% do volume do sangue.
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Plasma sanguneo
O plasma sanguneo a parte lquida do sangue, que transporta substncias solveis em gua. constitudo por gua, protenas, glicose, sais minerais e outros nutrientes, materiais de excreo, hormnios e anticorpos. Dentre as protenas presentes no plasma, destacam-se:
as albuminas: encarregadas de regular a presso osmtica do sangue; as globulinas: representam os anticorpos que atuam na defesa do
organismo;
o fibrinognio: atua nos processos de coagulao sangunea.
Na ausncia de anticoagulantes, o fibrinognio, juntamente com os outros elementos celulares do sangue, forma um cogulo. Esse processo de coagulao permite a obteno do soro sanguneo, que , essencialmente, o plasma sanguneo sem o fibrinognio.
Glbulos vermelhos
Nos vertebrados no humanos, os glbulos vermelhos so tambm chamados de eritrcitos (do grego erythros = vermelho). Porm, em humanos, esses elementos, por no possurem ncleo, so chamados hemcias. As hemcias so estruturas altamente diferenciadas, encarregadas de manter em estado funcional o pigmento respiratrio, a hemoglobina. As hemcias possuem a forma de um disco bicncavo de 6,5 a 8,5 mm de dimetro e 2 mm de espessura na regio mais larga, sendo flexveis, sem organelas e anucleadas11. A concentrao normal de hemcias de +/- 4,5 e 5,5 milhes por mm3 de sangue, na mulher e no homem, respectivamente.
As hemcias so clulas anucleadas somente em mamferos. Aves, peixes e rpteis, por exemplo, possuem hemcias nucleadas.
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Glbulos brancos
Essas clulas, tambm chamadas de leuccitos, so incolores e esfricas quando no sangue. So originadas na medula ssea e s permanecem na circulao sangunea enquanto so transportadas at os locais onde atuam. Ao chegar nesses locais, orientadas pela liberao de substncias quimiotticas, os leuccitos atravessam a parede dos vasos, por um processo chamado diapedese, e, s ento, ao atingirem os tecidos, que vo desempenhar suas funes especficas. Em um indivduo adulto normal h entre 6.500 e 10 mil leuccitos por mm . Quando esse nmero est alterado, pode ser classificado como leucocitose (nmero aumentado) e leucopenia (nmero reduzido).
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De acordo com a presena de grnulos citoplasmticos, os leuccitos so classificados em dois grupos:

os granulcitos, que possuem grnulos primrios (lisossomos) e grnu-
los especficos como os neutrfilos, eosinfilos e basfilos;

os agranulcitos, que possuem apenas grnulos primrios e so os
moncitos e os linfcitos.
Neutrfilos
Os neutrfilos so clulas esfricas tambm chamadas de leuccitos polimorfonucleares, sendo os mais numerosos, equivalendo a aproximadamente 65% da populao total dos leuccitos circulantes, e possuem grnulos azurflicos. Os neutrfilos no fagocitam quando transitam no sangue circulante, mas tornam-se ameboides e fagocitrios ao atingir os tecidos, onde so muito mveis, com a funo primordial de ingerir e destruir micro-organismos encontrados neles. Exerce papel principal nos estgios iniciais da resposta bacteriana aguda, em leses teciduais, e o principal constituinte do pus.
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Eosinfilos
Os eosinfilos representam de 2% a 4% do total de leuccitos e tm o mesmo tamanho dos neutrfilos. Seu ncleo bilobado e os grnulos citoplasmticos, altamente eosinoflicos, so ovoides e maiores do que os grnulos dos neutrfilos. Representam a primeira linha de defesa contra parasitas, pois so especializados na digesto de complexos antgeno anticorpo, caractersticos dos processos alrgicos.
Basfilos
So os leuccitos menos frequentes no sangue, representando menos de 1% do seu total. Seu ncleo volumoso, em forma de S retorcido e irregular. Possuem grnulos citoplasmticos grandes, basfilos e metacromticos, que frequentemente recobrem o ncleo. Ao deixar a circulao e penetrar no tecido conjuntivo, adquirem aparncia semelhante ao mastcito. Ao entrar em contato com algum alrgeno, os basfilos exocitam seus grnulos e provocam uma reao de hipersensibilidade imediata (anafilaxia), que , de fato, uma reao exagerada do organismo no combate ao alrgeno.
Moncitos
Os moncitos so as maiores clulas do sangue circulante e representam de 3% a 8% da populao leucocitria. Os moncitos so constituintes da unidade funcional denominada sistema mononuclear fagocitrio. Esse sistema se origina da clula mononuclear fagocitria, presente na medula ssea. A clula precursora atinge o sangue circulante, onde permanece alguns dias completando sua maturao e se torna um moncito. Enquanto circulante, essa clula continua um moncito; porm, quando realiza a diapedese e penetra no tecido conjuntivo, transforma-se num
macrfago. Dependendo do rgo no qual se encontre, esse macrfago recebe diferentes designaes: clulas de Kupffer, no fgado; macrfagos alveolares, nos pulmes; clulas de Langerhans, na pele; microglia, no sistema nervoso central; dentre outros.
Linfcitos
De uma forma geral, os linfcitos so clulas pequenas (de 9 a 12 mm) com ncleos centrais, ovoides ou reniformes, e cromatina condensada; o citoplasma levemente basfilo e se apresenta normalmente como um anel delgado ao redor do ncleo. De 20% a 25% dos leuccitos circulantes so clulas desprovidas de capacidade fagocitria e podem ser divididos em dois grupos: Linfcitos B Os linfcitos B se originam e amadurecem na medula ssea. Durante seu amadurecimento, essas clulas produzem milhares de imunoglobulinas (anticorpos) que so inseridas na sua membrana plasmtica, permanecendo com seus stios de ligao expostos na superfcie externa da clula. Quando esses anticorpos membranares entram em contato com os seus antgenos, o linfcito B ativado, sofrendo mitoses e dando origem a dois tipos celulares: os plasmcitos e as clulas de memria (linfcito B de memria). Linfcitos T Os linfcitos T so produzidos na medula ssea, mas terminam seu processo de amadurecimento no timo, da a origem de seu nome: linfcitos T. Quando estas clulas concluem seu amadurecimento no timo, elas se diferenciam em trs tipos celulares:
linfcito T helper (auxiliar): essas clulas secretam fatores
que estimulam a ao de outros linfcitos T e B;
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linfcito T supressor : libera substncias que reduzem a ao
de linfcitos T e B. Desempenha papel fundamental na supresso da resposta aos antgenos do prprio indivduo (doenas autoimunolgicas);
linfcito T citotxico: essa clula age diretamente sobre clu-
las estranhas, como, por exemplo, clulas transplantadas, e sobre clulas infectadas por vrus. Atuam de duas formas: secretando protenas chamadas perforinas, que formam orifcios na membrana das clulas atacadas, provocando sua lise; ou liberando substncias que induzem as clulas-alvo apoptose12. Alguns autores relatam ainda a existncia de um terceiro grupo de linfcitos, os linfcitos NK (natural killers) ou assassinos naturais. Esses linfcitos representam aproximadamente 10% dos linfcitos circulantes, e recebem o nome de NK porque atacam clulas cancergenas e infectadas por vrus sem a necessidade de um estmulo prvio. Em uma distenso sangunea, no possvel distinguir essas clulas.
Plaquetas
So fragmentos citoplasmticos pequenos (2 a 4 mm) e anucleados, derivados dos megacaricitos residentes da medula ssea e desempenham um importante papel na hemostasia 13, promovendo a coagulao do sangue e ajudando na reparao de danos na parede dos vasos, evitando processos hemorrgicos.
A apoptose um tipo de morte celular que possui importante papel durante o processo de diferenciao, crescimento e desenvolvimento dos tecidos adultos normais e patolgicos. Fisiologicamente, a apoptose um dos participantes ativos da homeostase, controlando o equilbrio entre a proliferao e a degenerao celular, ajudando na manuteno do tamanho dos tecidos e rgos. erroneamente conhecida como morte celular programada, de vez que a definio correta morte celular no seguida de autlise. 13 Hemostasia um conjunto de mecanismos que o organismo emprega para coibir hemorragias, dizendo respeito s rotinas de coagulao sangunea e reparao de vasos.
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3.6. Tecido hematopoitico
O tecido hematopoitico uma variedade do tecido conjuntivo relacionado produo dos elementos figurados (hemcias, leuccitos e plaquetas), e proporciona um microambiente tissular propcio a esse processo.
Medula ssea
A medula ssea (do grego myelon = medula) a cavidade ssea que aloja um tecido delicado e gelatinoso, rico em vrios vasos sanguneos e uma delicada rede de fibras reticulares. A medula ssea aloja o tecido hematopoitico.
Clulas-tronco, clulas progenitoras e clulas precursoras
As clulas mais importantes do tecido hematopoitico so as clulastronco pluripotentes, capazes de originar todas as clulas sanguneas. As clulas-tronco pluripotentes tm a importante caracterstica de se autorrenovar. Ao se dividirem, essas clulas do origem a duas clulas-filhas, sendo que somente uma delas vai continuar se desenvolvendo, permanecendo a outra clula-filha como uma clula-tronco de reserva, tornando seu estoque praticamente inesgotvel. Ao contrrio do que se acreditava inicialmente, as clulas-tronco da medula ssea tm uma capacidade de diferenciao celular que no se restringe s clulas sanguneas. Inicialmente, as pesquisas se restringiam utilizao de clulas-tronco embrionrias, mas os estudos revelam a obteno de clulastronco de um indivduo adulto. Depois de retiradas da medula ssea, as clulas-tronco so mantidas em um meio de cultura no qual tm sua diferenciao direcionada, havendo a produo de clulas especializadas de um tecido especfico que se deseje transplantar. Essas clulas so, ento, utilizadas para substituir clulas afetadas por processos patolgicos. Embora o tema ainda seja controverso e impregna-
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do de problemas de carter tico, j h experincias bem-sucedidas na reparao de tecidos nervosos e cardacos, dentre outros.
Tecido 4. Tecido ner voso
O tecido nervoso tem sua origem do ectoderma, mais especificamente no neuroectoderma, e forma o sistema nervoso. Esse sistema responsvel pelo bom funcionamento interno do organismo (sistema neurovegetativo) e por mediar sua relao com o meio ambiente (sistema nervoso cerebroespinhal). O tecido nervoso constitudo por clulas especializadas chamadas neurnios, responsveis por definir a caracterstica fundamental desse sistema, e por outras clulas que do suporte ao neurnio, as clulas da neuroglia ou neuroglia ou glia. A especializao celular consiste na capacidade de receber informaes externas ou internas e convert-las em impulsos eltricos que sero transmitidos por redes de comunicao integradas e complexas. O sistema nervoso pode ser dividido anatomicamente em sistema nervoso central (SNC) e sistema nervoso perifrico (SNP).
4.1. Neurnios
Os neurnios tambm so chamados de clulas nervosas, e representam as unidades funcionais do tecido nervoso. Seu nmero no sistema nervoso humano aproxima-se da ordem de grandeza de 1010. Funcionalmente, os neurnios so classificados em trs tipos principais: neurnios sensoriais, responsveis por transportar os impulsos das terminaes nervosas para o SNC; neurnios motores, que transportam o impulso do SNC em direo s clulas efetoras; e os neurnios que formam uma extensa rede intermediria que liga os neurnios sensoriais aos neurnios motores, chamados interneurnios14. Grande parte dos neurnios existente no corpo faz parte desta rede intermediria.
Os interneurnios podem ser chamados ainda de neurnios centrais, neurnios intercalados, neurnios intermedirios, dentre outros.
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Algumas caractersticas estruturais so comuns a todos os neurnios, sendo possvel identificar trs regies morfolgicas com funes especficas: dendritos, corpo celular ou pericrio e axnio. O corpo celular, tambm conhecido como pericrio, contm o ncleo e grande parte das organelas da clula, apresentando regies basfilas denominadas corpsculos de Nissl (Figura 12). Do corpo celular partem prolongamentos que podem ser os dendritos ou o axnio. De acordo com o nmero desses prolongamentos, poderemos classificar os neurnios como multipolares (apresentam um axnio e dois ou mais dendritos), bipolares (um axnio e um dendrito), ou unipolares (um axnio que se divide em dois ramos em uma regio prxima ao corpo celular) (Figura 12). Figura 12. Neurnio.
Sinapse
Representa o local de comunicao entre dois neurnios. Na sinapse qumica, h uma proximidade entre o boto terminal do axnio de um neurnio
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(chamado de boto pr-sinptico) e o dendrito de outro neurnio (chamado boto ps-sinptico), sem que haja contato fsico entre esses dois elementos. O espao entre os dois neurnios chamado fenda sinptica. O boto prsinptico contm mediadores qumicos (neurotransmissores) em seu interior, armazenados em vesculas sinpticas, que sero liberados na fenda sinptica provocando o estmulo do neurnio seguinte. O impulso nervoso, ao chegar ao boto sinptico, provoca a entrada de clcio, fazendo com que as vesculas sinpticas fundam-se membrana pr-sinptica, liberando os transmissores para o espao extracelular. Alguns transmissores, como a acetilcolina (ACh), noradrenalina (NA), dopamina (DA) e serotonina foram identificados. A acetilcolina, por exemplo, o transmissor que funciona entre o neurnio e o msculo estriado esqueltico. O efeito do transmissor rapidamente interrompido aps ter sido liberado na fenda sinptica (Figura 13). Figura 13. Representao de uma sinapse neural, demonstrando as vesculas repletas de neurotransmissores que so liberados na fenda sinptica, ligandose aos receptores da membrana ps-sinptica e dando continuidade ao impulso nervoso.
4.2. Neuroglia
A neuroglia atua na estruturao do SNC e conhecida como clulas da glia ou neuroglia. So identificados trs principais tipos celulares: astrcitos, oligodendrcitos e microglia.
Microglia
So os macrfagos do SNC, responsveis pela remoo de restos celulares durante o desenvolvimento normal do sistema nervoso e pela fagocitose de outras substncias estranhas que possam aparecer no SNC. So clulas ricas em lisossomos e apresentam retculo endoplasmtico rugoso bem desenvolvido.
Astrcitos
So as maiores clulas da neuroglia. Dividem-se em dois tipos: protoplasmticos (predominantes na substncia cinzenta) e fibrosos (predominantes na substncia branca). Essas clulas apresentam numerosas projees citoplasmticas que envolvem grande parte dos vasos sanguneos (chamadas ps-vasculares) e se expandem em direo aos neurnios (ps-terminais). Participam do processo de regulao do transporte de substncias para os neurnios do SNC, contribuindo para a formao da barreira hematoenceflica.
Oligodendrcitos
Esse tipo celular o responsvel pela formao da fibra nervosa do SNC. Seus prolongamentos so capazes de envolver os prolongamentos dos neurnios, podendo formar a bainha de mielina de vrios neurnios ao mesmo tempo.
Clulas de Schwann
So as clulas responsveis pela formao da fibra nervosa no SNP. As clulas de Schwann podem se enrolar em volta do axnio seguidas vezes, formando a bainha de mielina. So necessrias vrias clulas de Schwann para envolver um axnio.
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Epndima
Geralmente classificada como constituinte da neuroglia, forma o revestimento dos ventrculos e do canal espinhal (cavidades repletas de lquido). Em muitos locais do encfalo, o revestimento ependimrio modificado de modo a permitir a produo do lquido cefalorraquidiano a partir das alas de capilares adjacentes. A unio dessas alas com as clulas ependimrias modificadas chamada plexo coroide.
Conduo do impulso nervoso
As clulas do nosso corpo, principalmente as clulas do tecido nervoso, apresentam um potencial eltrico na sua membrana plasmtica. Esse potencial eltrico confere uma carga positiva na face externa da membrana plasmtica e uma carga negativa na face interna. Essa polarizao da membrana se deve s variaes de concentraes de ons entre o meio intra e extracelular. Essa diferena mantida pelo funcionamento da bomba de Na+ e K+, graas presena de ATPases na membrana que liberam energia para o transporte dos ons. Em uma condio de repouso, a concentrao externa de Na+ maior do que a interna e a concentrao interna de K+ maior do que a externa. Quando um neurnio estimulado com determinada intensidade, h uma modificao do funcionamento da bomba inica. O estmulo provoca um aumento da permeabilidade da membrana plasmtica do neurnio ao on sdio, levando entrada deste on no citoplasma. Essa entrada de ons sdio provoca uma inverso local da polaridade da membrana: a face interna da membrana passa a ter carga positiva, e a face externa, carga negativa. Essa inverso de polaridade se propaga pela membrana da clula nervosa, normalmente dos dendritos ao axnio, sendo que as regies iniciais tendem a voltar a seu estado inicial de polarizao pela ao da bomba de Na+ e K+.
Nas fibras nervosas que possuem bainha de mielina, o impulso adquire uma caracterstica distinta de conduo saltatria. A bainha de mielina no contnua em todo o axnio. Alguns pontos entre as clulas formadoras da mielina ficam sem mielina, sendo estes locais chamados ndulo ou n de Ranvier. A presena desses ns torna a conduo do impulso mais rpida, visto que a onda de despolarizao salta de um n para o outro (a bainha de mielina funciona como um isolante). A onda de despolarizao, ao chegar ao boto pr-sinptico, provoca a fuso das vesculas, que contm os transmissores, membrana plasmtica. Os transmissores so liberados na fenda sinptica e, ao entrar em contato com os receptores presentes na membrana do boto ps-sinptico, provocam uma nova onda de despolarizao no neurnio seguinte.
Tecido 5. Tecido muscular
O tecido muscular formado por clulas especializadas cuja funo a contrao. Essas clulas so tambm chamadas fibras musculares, e so encontradas agrupadas em massas macroscpicas denominadas msculos, que so as estruturas ativas do aparelho locomotor, enquanto os ossos so as estruturas passivas. Os tecidos musculares podem ser classificados em: tecidos musculares estriados, que podem ser esquelticos ou cardacos, e tecidos musculares lisos.
5.1. Tecido muscular estriado esqueltico
O tecido muscular estriado esqueltico constitui a maior parte da musculatura dos vertebrados e recobre totalmente o esqueleto, estando inserido nos ossos (Figuras 14 e 15). Os msculos esquelticos so de contrao voluntria e se formam pela fuso de clulas precursoras (mioblastos), originando uma clula cilndrica ex-
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tremamente longa (atingindo vrios centmetros), com muitos ncleos perifricos, e com estriaes transversais. O citoplasma das fibras musculares esquelticas encontra-se repleto por miofibrilas, possuindo retculo sarcoplasmtico, mitocndrias e outras organelas. As miofibrilas so estruturas cilndricas que se estruturam formando sarcmeros, que so as unidades funcionais (contrteis) do msculo esqueltico. O alinhamento dos sarcmeros responsvel pelas estriaes transversais presentes nos msculos estriados. Os sarcmeros das miofibrilas so compostos de miofilamentos que vo gerar a contrao muscular. Esses filamentos contrteis so formados por um conjunto de protenas, e podem ser:
Miofilamentos finos de actina
So compostos por actina, tropomiosina e tropomina. A actina que constitui filamentos chamada actina F (filamentosa) e constituda por monmeros de actina G (globosa). A actina globosa possui duas polaridades, que vo orientar a formao do filamento proteico. A tropomiosina formada por duas cadeias polipeptdicas enroladas em alfa-hlice, que vo ocupar o sulco formado pelos filamentos de actina F. Cada molcula de tropomiosina se estende por 7 monmeros de actina e se liga a um complexo troponina. A troponina um complexo formado por trs protenas: TnI, TnC e TnT. A troponina T se liga molcula de tropomiosina; a troponina I responsvel por inibir a ligao da miosina com a actina; e a troponina C se liga aos ons de clcio.
Miofilamentos grossos de miosina
Esses filamentos so espessos e podem ser subdivididos em duas estruturas essenciais. A poro mais alongada, que compe a cauda da molcula de
miosina, d estruturao ao miofilamento de miosina de uma forma geral e chamada meromiosina leve. Na extremidade dessa poro alongada, encontra-se uma cabea, semelhante extremidade de um taco de golfe, que recebe o nome de meromiosina pesada, juntamente com um discreto pescoo. A meromiosina pesada possui atividade ATPsica e responsvel pela interao com os filamentos de actina. Nos sarcmeros, esses miofilamentos esto organizados de forma apropriada, que compe reas claras e escuras que se intercalam, formando todo um conjunto de bandas (I, A, H) e de linhas (Z e M) que, ao se repetirem por toda a extenso da fibra muscular, so responsveis pela imagem das estriaes transversais visualizadas ao microscpio de luz. Figura 14. Msculo estriado esqueltico (corte longitudinal). Figura 15. Msculo estriado Esqueltico (corte transversal).
5.2. Tecido muscular estriado cardaco
O msculo cardaco um msculo de contrao involuntria e, assim como o esqueltico, constitudo por fibras que apresentam estrias transversais, denotando a organizao dos seus miofilamentos em sarcmeros (Figuras 16 e 17).
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As clulas cardacas so envoltas por uma delicada camada de tecido conjuntivo, e suas clulas so alongadas, mas no tanto quanto as esquelticas, e ramificadas, com um ou dois ncleos centrais. Unindo duas clulas cardacas, h complexos juncionais especializados chamados discos intercalares. Os discos intercalares so visualizados ao microscpio de luz como uma linha mais escura, na forma de uma reta ou em degraus, e so compostos por junes de adeso, desmossomos e junes comunicantes. So estruturas caractersticas do tecido muscular cardaco. Figura 16. Msculo estriado cardaco (corte longitudinal). Figura 17. Msculo estriado cardaco (corte transversal).
5.3. Msculo liso
As clulas do msculo liso so alongadas e fusiformes, com um nico ncleo oval e central. So clulas de contrao involuntria, presentes na parede de vrios rgos, como, por exemplo, a via digestria, na qual so responsveis pelos movimentos peristlticos (Figura 18). As clulas musculares lisas so envoltas por uma lmina basal e uma fina rede de fibras reticulares, que recebe a denominao lmina externa. Como nos outros tipos de tecido muscular, os seus elementos contrteis so os miofilamentos de actina e miosina. A diferena reside no fato de esses miofilamentos no estarem dispostos na forma de sarcmeros, mas de forma aleatria. Assim, no h estriaes transversais em sua estrutura. Alm
disso, os filamentos de actina so formados somente de molculas de actina e tropomiosina. O clcio utilizado na contrao muscular desse tecido armazenado no interior da clula, em vesculas denominadas cavolas. Esse tipo de msculo recebe inervaes simpticas e parassimpticas (que so antagnicas), mas no h estruturas parecidas com a placa motora. As fibras nervosas liberam neurotransmissores (acetilcolina e noradrenalina) no espao intercelular que se difundem, alcanando e despolarizando as clulas musculares. Quando despolarizadas, as cavolas liberam o clcio e se inicia a contrao dos miofilamentos. Figura 18. Msculo liso (corte longitudinal).
Referncias Bibliogrficas
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Para saber mais

GARTNER, L. P.; HIATT, J. L. Tratado de histologia em cores. 3. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2007. JUNQUEIRA, L. C.; CARNEIRO, J. Histologia bsica. 10. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2004. KIERSZERBAUM, A. L. Histologia e biologia celular. Rio de Janeiro: Elsevier, 2004. LULLMANN RAUNCH, R. Histologia: entenda, aprenda, consulte. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2006. YOUNG, B. et al. Wheater histologia funcional. 5. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2007.
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Captulo 3
Tcnicas histolgicas
Luzia Ftima Gonalves Caputo Lycia de Brito Gitirana Pedro Paulo de Abreu Manso
A histologia a cincia que estuda as clulas no contexto da estrutura tecidual e a inter-relao delas com os constituintes da matriz extracelular. A histotecnologia proporciona o entendimento dos fundamentos tcnicos para a anlise dos elementos teciduais, normais ou patolgicos, isto , suas clulas e os elementos da matriz extracelular, abrangendo diversas tcnicas histoqumicas. Os procedimentos tcnicos aplicados na histotecnologia incluem tcnicas citoqumicas, histoqumicas, imuno-histoqumicas, voltadas para a pesquisa cientfica e para o diagnstico patolgico, alm de anlises em nvel de microscopia eletrnica. Neste captulo, sero realizadas consideraes somente sobre as tcnicas histolgicas voltadas para a anlise histoqumica e imunohistoqumicas dos tecidos. A tcnica histolgica representa um conjunto de procedimentos tcnicos que, inicialmente, se difundiu entre os diversos profissionais das cincias naturais, como os botnicos e zoologistas, sendo empregada tambm pelos anatomistas e histologistas da poca. Geralmente, os estudiosos utilizavam um
microscpio simples para descrever os tecidos; porm, somente duzentos anos aps a descoberta do microscpio, a utilizao da tcnica histolgica foi utilizada como ferramenta para diagnstico histopatolgico. Por volta de 1828, Rudolph Virchow, mdico alemo e antropologista, utilizou a anlise histopatolgica como ferramenta bsica e essencial em qualquer laboratrio de histologia e/ou anatomia patolgica para elaborar as bases da patologia celular. Histotecnologista, ou histotcnico, a designao conferida ao profissional responsvel por executar a tcnica histolgica para atuar em instituies de sade, instituies voltadas pesquisa cientfica e ao controle de qualidade, normalmente em laboratrios de histo ou anatomopatologia. Sua funo, alm de ser essencial aos servios de sade, pelo apoio ao diagnstico e ao tratamento de pacientes, est tambm localizada de forma central no moderno paradigma mdico anatomoclnico. Os procedimentos utilizados para se obterem amostras de tecido ou preparados histolgicos retirados de um organismo para exame microscpico incluem: coleta do material, fixao, clivagem, processamento, incluso, microtomia (corte) e colorao. No caso de tecidos calcificados, o material descalcificado aps a fixao e, em seguida, realizam-se os outros procedimentos, os quais discutiremos um a um. Vale a pena ressaltar a importncia do planejamento para a execuo de qualquer procedimento que envolva a tcnica histolgica, pois tal planejamento facilita e evita acontecimentos indesejados durante a realizao de qualquer etapa desse processo. De forma geral, a organizao um dos principais fatores para se criar um ambiente seguro para o desempenho do trabalho. Um laboratrio limpo e organizado fundamental para se desenvolver um bom trabalho, ao contrrio de um que apresente bancada entulhada por materiais e sem espao adequado para a realizao dos procedimentos. Deve-se evitar tambm empilhar caixas e deixar coisas pelo cho, obstruindo ou dificultando o trnsito dos trabalhadores no laboratrio.
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1. Coleta, fixao e clivagem

A . Coleta
Consiste em remover amostras de tecido de um determinado organismo. Essa coleta pode ser feita quando o organismo ainda est vivo, por meio de bipsia ou durante uma cirurgia, ou mesmo post mortem, durante a realizao de necropsia de animais ou seres humanos. Quando a coleta realizada para diagnstico de determinada enfermidade, o material originado de necropsia ou bipsia deve ser previamente analisado por um patologista, o qual fornecer o laudo macroscpico, ressaltando aspectos macroscpicos da pea anatmica, como cor, tamanho e aparncia do rgo analisado. Durante a coleta, tambm devemos respeitar algumas regras que so fundamentais para a boa qualidade final da amostra, que sero abordadas mais adiante. Aps a coleta, o material deve ser registrado em um livro prprio de protocolo, para registro. Por meio desse registro, o material ser identificado por um nmero, que o acompanhar durante todos os procedimentos da tcnica histolgica. Em instituies credenciadas para realizar procedimentos histopatolgicos, o material obtido cirurgicamente deve ser acompanhado de uma ficha com o pedido da anlise histopatolgica, contendo a identificao do rgo e as datas da fixao e de entrada do material no laboratrio. Essa ficha tcnica dever conter a identificao do paciente (nome, sexo, cor, idade, estado civil, nacionalidade, naturalidade e profisso) e, no caso de paciente de rede hospitalar, devero ser informados sua qualificao (registro ou nmero do leito), registro ambulatorial, ou consultrio particular, identificao do mdico responsvel, data da interveno cirrgica, descrio da bipsia, morte ou necropsia, e outros dados que o mdico julgar importantes, que auxiliaro o histopatologista no diagnstico.
Para material proveniente de trabalhos experimentais com animais em instituies de pesquisa credenciadas, o registro dever ser feito aps a eutansia, em livro prprio. No livro de registro experimental devem constar a identificao do laboratrio, a data da eutansia, os rgos colhidos, o tipo de procedimento realizado com o animal experimental (por exemplo, infeco), o ttulo do projeto e as observaes necessrias para avaliao do pesquisador ou tecnologista. Atualmente, deve-se realizar tambm o registro no comit de tica da instituio, que aprovar a realizao da pesquisa, fornecendo o nmero de protocolo. Esse nmero importante, pois deve ser informado ao se elaborar um trabalho cientfico, seja uma dissertao de mestrado, tese de doutorado, publicao em revista indexada, ou outro meio de divulgao cientfica. Tratando-se de animal experimental nativo, originrio diretamente do meio ambiente, o pesquisador deve submeter o seu projeto ao Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renovveis (Ibama) a fim de obter uma autorizao para coleta, sem a qual poder estar sujeito a sanes da legislao vigente. Sem esses registros, o material no poder ser manipulado no laboratrio, podendo o responsvel pela coleta responder a processo na Justia por desrespeito s leis vigentes no territrio nacional. Notas de biossegurana Todo material biolgico coletado para anlise potencialmente infectante. Assim, deve-se ter muito cuidado durante a coleta e a manipulao dos espcimes, utilizando sempre os equipamentos de proteo individual (EPI). imprescindvel, durante os procedimentos de coleta, o uso de luvas, jaleco, mscara e culos de proteo. Voc deve ainda procurar se informar na instituio sobre qual a poltica de descarte de material infectado. Nunca descarte material biolgico ou seus derivados em lixo comum.
B. Fixao
Voc alguma vez refletiu sobre o que acontece quando esquecemos um pedao de carne fora da geladeira? Por que a carne apodrece? O que, realmente, acontece com esse material? Ao se remover qualquer material (rgo ou tecido) de um organismo aps a sua morte, esse material inicia um processo de autlise, ou seja, por no receber o suprimento necessrio de oxignio e de substncias essenciais ao seu funcionamento, comea a haver acmulo de dixido de carbono nos tecidos e, em suas clulas, inicia-se o processo autoltico, no qual enzimas lisossomais atuam no citoplasma da prpria clula. Ao se colocar um pedao de carne na geladeira, esse processo atrasado; porm, fora da geladeira a autlise acelerada. Assim, ao se analisar as estruturas teciduais de um determinado rgo ao microscpio, precisa-se preservar os tecidos, sendo imprescindvel a realizao do processo de fixao. A fixao uma das etapas mais importantes da tcnica histolgica, pois visa interromper o metabolismo celular, estabilizando as estruturas e os componentes bioqumicos intra e extracelulares, preservando e conservando os elementos teciduais, alm de permitir a penetrao de outras substncias subsequentes fixao. Diversos protocolos de fixao e tipos de fixadores so citados na literatura tcnica; porm, nenhum desses procedimentos de fixao reconhecido como perfeito. Alguns fixadores se revelam excelentes para determinadas estruturas tissulares, enquanto outros so preferenciais para as clulas ou mesmo excelentes para anlise da bioqumica tecidual. Alm disso, h, tambm, fixadores indicados para a preservao da antigenicidade dos elementos teciduais que sero analisados pela imuno-histoqumica, em contraste com aqueles que no preservam as molculas antignicas. Porm, no existe um fixador ideal que
alcance todos os objetivos da fixao, mas deve-se investigar qual o fixador mais apropriado para o tipo de material a ser analisado. Por essa razo, devese consultar a literatura cientfica antes de se realizar qualquer tipo de experimento ou interveno cirrgica. Basicamente, existem dois tipos de fixao: a fsica e a qumica. De fato, sempre se utiliza uma associao dos dois tipos de fixao, pois mesmo a fixao qumica sempre pode sofrer a influncia de um fator fsico ambiental, como a temperatura. Outros fatores fsicos podem influenciar na fixao, como as ondas eletromagnticas (micro-ondas) e a agitao molecular (ultrassom). A fixao qumica obtida quando se utilizam substncias qumicas capazes de formar reaes com os stios das biomolculas, estabilizando-as e impedindo a alterao tecidual, tanto qumica quanto fsica. Inicialmente, os fixadores eram divididos em duas classes: (1) fixadores coagulantes ou desnaturantes, que precipitam as protenas dos tecidos. Esses fixadores tambm so chamados de fixadores no aditivos, pois no se ligam s protenas; (2) fixadores no coagulantes ou aditivos, que se ligam s protenas, precipitando-as. Sabe-se pouco sobre os efeitos dos fixadores qumicos; porm, na tcnica histolgica se utiliza uma ou mais substncias qumicas, denominadas lquidos ou misturas fixadoras, reunindo vrias substncias numa tentativa de superar as desvantagens de uma determinada substncia pela vantagem de outra substncia adicionada mistura. Tais misturas so capazes de agir sobre os tecidos de forma a buscar a melhor preservao dos elementos teciduais. A escolha de um fixador depende da natureza do processo patolgico presente no tecido, da estrutura celular e/ou tecidual, ou, ento, da natureza bioqumica do elemento que se deseja preservar. Por essas razes, o histotcnico deve conhecer os diversos tipos de fixadores e saber qual a compatibilidade do fixador com os diversos mtodos de colorao, com a propriedade antignica
do elemento tecidual, visando adequar o tipo de fixador com a propriedade dos vrios tipos de tecidos. Essas informaes so importantes para auxiliar o pesquisador ou o patologista. Atualmente, com frequncia se utiliza a classificao de fixadores descrita por Leong (1996), que teve como base a classificao desenvolvida por Hopwood (1977), sem muitas alteraes. Leong classificou as substncias fixadoras da seguinte maneira:
Fixadores aldedos: formaldedo, glutaraldedo e paraformaldedo co-
mercial.
Agentes oxidantes: tetrxido de smio, dicromato de potssio,
permanganato de potssio e cido crmico.

Agentes desnaturantes ou coagulantes de protenas: metanol, etanol,
acetona e cido actico.

Mecanismo desconhecido: cloreto de mercrio, cido pcrico e sais
de zinco.
Combinao de reagentes: tetrxido de smio e glutaraldedo, tetrxido
de smio e iodeto de zinco, glutaraldedo e carbodiamida e formaldedo com glutaraldedo.

Fixao a seco: carbowax 6000 (20% de polivinil lcool ou 20%
de polietileno glicol) ou fixao no vapor.

Micro-ondas: fixao pelas ondas eletromagnticas com ou sem a
utilizao de agentes fixadores. Ser dada maior ateno aos fixadores aldedos, pois estes so fixadores base de aldedos de amplo uso nos laboratrios de anatomia patolgica e de histologia. Os fixadores aldedos comumente utilizados so o formaldedo, o glutaraldedo, e o paraformaldedo, que o prprio formaldedo na sua forma
pura polimerizada. Esses fixadores formam ligaes cruzadas com as protenas tissulares, tornando-as insolveis em forma de um gel. Dentre os fixadores aldedos, o formaldedo comercial o mais usado na rotina histolgica devido ao seu baixo custo financeiro, alm de ser de fcil preparo. Contudo, algumas consideraes se fazem necessrias. O formaldedo comercial, um gs incolor, comercialmente fornecido em soluo na concentrao de 37% ou 40%. Ao se preparar uma soluo base de formaldedo comercial a 10%, de fato a soluo estar a 3,7% ou 4%; apesar disso, convencionou-se chamar essa soluo de formalina, ou formaldedo a 10%. Outro ponto importante a se mencionar que o formaldedo, na presena de gua, encontra-se na sua forma monomrica. J o paraformaldedo, por ser livre de metanol, muito utilizado para a fixao de tecidos a serem analisados pela microscopia eletrnica, pois o metanol pode ocasionar grandes prejuzos, interferindo nas anlises ultraestruturais. Porm, o paraformaldedo comercial tem sido recomendado para anlise imuno-histoqumica. Na realidade, o formaldedo contm polmeros de paraformaldedo comercial, mas que s sero hidrolisados quando diludos em gua. Quando o formaldedo exposto luz, isto , ao oxignio atmosfrico e tecidual, ocorre a oxidao do formaldedo, formando cido frmico. O cido frmico pode se precipitar nos tecidos sob a forma de um pigmento de colorao marrom, sendo considerado um artefato. Para se evitar a formao desse precipitado, deve-se preparar o fixador em solues tamponadas, ou, ento, adicionar carbonato de clcio (giz) para neutralizar a ao do pH da soluo. Contudo, o giz s recomendado em ltimo caso, pois poder deixar reas de pseudocalcificao tecidual. A seguir, encontram-se alguns dos fixadores aldedos e suas principais caractersticas:
Formalina 10%
Formaldedo comercial .......................................100 mL gua destilada ................................................900 mL Caractersticas:

soluo hipotnica (clulas intumescidas); pode levar deposio de pigmento formlico; baixo custo; fixa bem as protenas.
Tempo de fixao: 24-48 horas. Lavagem: gua corrente por 1 ou 2 horas. Tratamento prvio dos cortes para a retirada do pigmento formlico
Desparafinizar e hidratar as lminas at a gua destilada. Imergir os cortes em uma soluo saturada de cido pcrico em etanol
95% por 24 horas.

Lavar as lminas em gua corrente at desaparecer a cor amarela do
cido pcrico.
Seguir com o protocolo da colorao desejada.
Notas de biossegurana Ao manipular formaldedo, ou solues contendo essa substncia, deve-se fazer uso de luvas, mscara com filtro prprio para vapores orgnicos, em local arejado e com exausto. O preparo de solues fixadoras deve ser feito em capela de exausto. Por serem muito volteis e sensveis luz, as solues contendo formaldedo devem ser guardadas ao abrigo da luz em vidro mbar firmemente fechado. O formaldedo txico quando ingerido, inalado ou em
contato com a pele. A inalao deste composto pode causar irritao nos olhos, nas mucosas e no trato respiratrio superior. Em altas concentraes, pode causar bronquite, pneumonia ou laringite. Este composto classificado como carcinognico e teratognico. Nunca descarte solues contendo formaldedo ou outras solues fixadoras em esgoto sanitrio convencional; procure saber a poltica de descarte de produtos txicos de sua instituio.
Formol-salino
Formaldedo comercial........................................100 mL gua destilada................................................900 mL Cloreto de sdio...................................................9 g Caractersticas:

soluo isotnica; pode levar deposio de pigmento formalnico; indicado para algumas reaes histoqumicas.
Tempo de fixao: 24 a 48 horas. Lavagem: gua corrente por 1 a 2 horas. Indicado para algumas reaes histoqumicas.
Formalina tamponada de Carson ou formalina em tampo Millonig
Formaldedo comercial ........................................100 mL gua destilada.................................................900 mL Fosfato de sdio monobsico.................................18,6 g Hidrxido de sdio..............................................4,2 g Caractersticas:
utilizar soluo isotnica em pH 7,2 - 7,4 (310 mOsm);
indicado para a microscopia eletrnica e microscopia de luz; provoca menor extrao de elementos celulares; microtomia sofrvel de tecidos com muito sangue; no interfere na maioria das coloraes; fixa muito bem a maioria dos tecidos; preserva a imunorreatividade de hormnios gastrintestinais, quan-
do preparado com paraformaldedo comercial no lugar do formaldedo comercial. Tempo de fixao: 24 a 72 horas. Lavagem: gua corrente por 1 a 2 horas.
Formalina-alcolica
Formaldedo comercial........................................100 mL lcool 95%...................................................900 mL Caractersticas:

utilizada para a observao de minerais (cobre, magnsio, ferro
e clcio); indicada para tecido nervoso, parasitas, glicognio, amiloide e mucossubstncias. Tempo de fixao: 24 a 48 horas. Lavagem: lcool 95% por 1 hora iniciando a desidratao.
Formalina neutra tamponada 10%
Formaldedo comercial........................................100 mL gua destilada.................................................900 mL Fosfato de sdio monobsico.....................................4 g Fosfato de sdio dibsico.......................................6,5 g
Caractersticas:
soluo hipotnica (clulas intumescidas); aproximadamente 165 mOsm; pH 6,8; indicada para clulas pancreticas, bactrias, alguns tipos de
carboidratos, clulas do tecido conjuntivo, fungos, minerais, tecido nervoso, pigmentos e glndulas. Tempo de fixao: 24-72 horas. Lavagem: gua corrente por 1 ou 2 horas.
AFA ou FAA lcool - formalina - cido actico:
Etanol (95 - 100%)..........................................85 mL Formaldedo comercial..........................................10 mL cido actico glacial............................................5 mL Caractersticas:

um fixador de rpida penetrao; preserva relativamente bem a morfologia, cidos nucleicos e
carboidratos;
os lipdeos no so preservados; misturar no momento do uso; muito utilizado para fixar helmintos.
Tempo de fixao: 4 a 48 horas em tecidos e 10 a 30 minutos para esfregaos e/ou distenses. Lavagem: direto para o lcool 95% do processador.
Vrios so os fatores que influenciam no processo da fixao, interferindo diretamente na preservao tecidual e, em ltima instncia, no tecido que se deseja observar. Assim, deve-se analisar criteriosamente o protocolo de fixao para identificar os fatores que podem influenciar diretamente na fixao do tecido a ser analisado e consequentemente interferir na preservao tecidual. Esses fatores so:
temperatura; espessura do tecido; penetrao; tempo de fixao; escolha do fixador; relao volume do fixador tamanho do espcime; estocagem apropriada; pH do fixador; osmolaridade da soluo fixadora; adio de sais na mistura; concentrao dos fixadores.
C. Clivagem
A clivagem consiste em reduzir as dimenses dos fragmentos dos tecidos coletados. Dependendo do tipo de fixador empregado, a clivagem poder ocorrer em at algumas horas aps a fixao. Na clivagem ideal, os fragmentos devem atingir cerca de 3 mm de espessura; porm, dependendo do tipo de rgo, esse fragmento pode chegar a mais do que 5 mm (Figuras 1 e 2).
Figura 1. Clivagem de coluna verte- Figura 2. Clivagem com 3mm de bral de camundongos Swiss webster. espessura.
A reduo das dimenses do fragmento facilita a penetrao dos fixadores e a difuso dos reagentes durante as demais etapas do processamento dos tecidos. Para uma boa anlise histolgica, devemos respeitar algumas regras durante a coleta, a fixao e a clivagem:
fixar o tecido logo aps a coleta da amostra; retirar, primeiramente, os rgos conhecidamente com alto metabolis-
mo, pois so os primeiros a sofrer autlise;

nunca comprimir o material a ser fixado com pina ou qualquer outro
instrumental, pois a fora imprimida pode causar distoro da estrutura tecidual;

para se obter uma boa fixao de rgos encapsulados, a cpsula deve
ser removida;
os fragmentos devem possuir preferencialmente 3 mm de espessura,
pois geralmente os fixadores no penetram mais do que isto em tempo hbil de evitar a autlise.
para se obterem fatias delgadas de rgos compactos, como fgado,
bao, rins, entre outros, coloque-os sobre uma placa de cortia ou placa de Petri, previamente revestida com parafina, e com uma gilete nova e afiada proceda confeco dos fragmentos;
como os fragmentos frequentemente se deformam durante a fixao,
conveniente que, aps essa etapa, sejam novamente clivados com gilete, de modo que cada fragmento apresente uma superfcie lisa de corte que servir no somente de orientao ao tcnico durante o processo de incluso, mas tambm auxiliar a etapa subsequente, ao se desbastar o bloco;
usar, no mnimo, vinte vezes o volume de fixador em relao ao
volume dos fragmentos a serem fixados. Agitar, suave e periodicamente, os fragmentos dos rgos durante a fixao do material para que o fixador se misture uniformemente no frasco;
os frascos utilizados para a fixao devem ter boca larga, pois, alm de
facilitar o acesso aos fragmentos, ou mesmo aos rgos inteiros, esses costumam aumentar seu volume aps a fixao;
nunca coloque o material a ser fixado em um frasco vazio, pois este
pode se aderir superfcie do vidro, impedindo que o fixador penetre na rea em contato com o vidro;
acondicionar os tecidos clivados em cassetes histolgicos identificados
(Figuras 3 e 4).
Figura 3. Espcime clivado e acondicionado em cassetes histolgicos.
Figura 4. Cassete identificado pronto para o processamento.
Notas de biossegurana Durante o procedimento de clivagem do material, tome muito cuidado com as navalhas e giletes utilizadas. O material perfurocortante, bem como os restos de material biolgico, devem ser descartados em lixo prprio.
2. Descalcificao
Em muitos tecidos, verifica-se a deposio de sais minerais, como clcio e fosfato. Por exemplo, o tecido sseo uma especializao do tecido conjuntivo, sendo rgido e inflexvel devido presena de cristais de hidroxiapatita em sua matriz extracelular. Em microscopia de luz, existem dois procedimentos tcnicos que auxiliam o estudo do tecido sseo: (1) a descalcificao, que remove a poro mineral e analisa somente os constituintes orgnicos do tecido sseo; e (2) o desgaste, que permite analisar os componentes inorgnicos do tecido. Comentaremos neste captulo somente o procedimento da descalcificao, que visa retirada dos componentes inorgnicos, como fosfato de clcio presente em tecidos sseos, em tumores sseos ou em determinadas patologias.
A descalcificao, por remover os sais de clcio, se faz necessria para tecidos mineralizados, pois os cristais de clcio destroem o fio da navalha, criando dentes que impedem a confeco de bons cortes e levam formao de artefatos tcnicos, impedindo a anlise histolgica adequada. A escolha do mtodo de descalcificao depende da urgncia, do grau de mineralizao, do interesse da investigao, das tcnicas de colorao que se pretende empregar e do tipo de fixador utilizado. Quanto mais rpida for a ao de um descalcificador, pior ser a preservao morfolgica do tecido.
A prtica da descalcificao
Aps a coleta o tecido, este deve ser fixado, lavado para retirar o excesso de fixador e, s ento, submetido descalcificao. A descalcificao pode ser realizada por mtodos qumicos e fsicos. Os mtodos qumicos utilizam solues descalcificadoras em pH cido, solues quelantes e meios de troca inica. Os mtodos fsicos esto sempre associados a descalcificao qumica, englobando a dissociao eletroltica e submisso do material contido em solues descalcificadoras, ao ultrassom e s micro-ondas, que aceleram o processo de descalcificao.
Descalcificao qumica
A. Descalcificao por cidos Os descalcificadores cidos possuem a propriedade de solubilizar sais minerais. Na matriz inorgnica dos tecidos mineralizados, ocorrem principalmente sais de fosfato e de carbonato, que so pouco solveis na gua. Esse mtodo possui a vantagem de ser simples; porm, recomenda-se fazer um banho neutralizante com hidrxido de amnia ou oxalato de amnia ou sdio aps a descalcificao.
A desvantagem desse mtodo a ocorrncia de dilatao e hidrlise da matriz ssea e destruio de enzimas, cidos nucleicos e polissacardeos. A soluo descalcificadora cida age removendo o clcio dos sais de carbonato ou fosfato presentes no osso, efetuando uma troca inica que resulta na formao de um sal de clcio solvel. Algumas das solues descalcificadoras constituem-se de cidos orgnicos ou inorgnicos, que sero citados a seguir. Existe um grande nmero de agentes descalcificadores cidos, incluindo cidos fracos ou fortes, que podem ser aquosos ou alcolicos, diludos ou no em agentes fixadores.
cidos fortes - possuem maior poder descalcificante, causando dano
aos tecidos, principalmente aos ncleos que so hidrolisados, o que prejudica a utilizao posterior de corantes nucleares. Esse tipo de descalcificador empregado para anlises urgentes; para material no urgente, aconselham-se agentes quelantes pelos motivos que sero descritos mais adiante. cido ntrico (HNO3) - no causa o intumescimento dos tecidos e proporciona maior nitidez nas coloraes. Geralmente utilizado em concentraes de 5% a 10%, no se devendo expor o tecido a esta soluo por mais de 48 horas. um descalcificador rpido muito prejudicial ao tecido. cido clordrico (HCl) - um dos cidos de ao rpida mais utilizados. Geralmente usado em soluo tampo, como, por exemplo, o sulfato de sdio a 5% ou 10%, ou, ainda, diludo em lcool. cido ntrico aquoso a 5%: cido ntrico.........................................................5 mL gua destilada......................................................95 mL
cido ntrico aquoso a 10%: cido ntrico........................................................10 mL gua destilada......................................................90 mL Formalina - cido ntrico: Formaldedo.........................................................10 mL gua destilada......................................................80 mL cido ntrico........................................................10 mL Fluido de Perennyi: cido ntrico 10%................................................40 mL Etanol absoluto.....................................................30 mL cido crmico 0,5%.............................................30 mL
cidos fracos - os cidos mais usados nas misturas descalcificadoras
so o cido actico, cido pcrico e cido frmico. Os cidos actico e pcrico tambm so muito utilizados em misturas fixadoras, fixando ao mesmo tempo em que descalcificam os tecidos pouco mineralizados, como os tecidos embrionrios. Dentre os cidos, o cido frmico o mais utilizado na soluo de 5% a 10 %. cido frmico (HCOOH) - pode ser utilizado em soluo a 5% aquosa ou alcolica, ou em mistura fixadora com o formol 10% a 20%. Geralmente usado em solues tampes, como o tampo citrato de sdio, que proporciona uma melhor colorao em relao ao mtodo com cido ntrico. cido frmico a 5%: cido frmico 90%.................................................5 mL gua destilada......................................................95 mL
cido frmico a 5%: cido frmico 90%.................................................5 mL gua destilada......................................................95 mL Formalina cido frmico: cido frmico 90%...............................................10 mL Formaldedo comercial...............................................5 mL gua destilada......................................................85 mL Mistura descalcificadora cido frmico-clordrico: Soluo A cido clordrico 8%: cido clordrico concentrado .......................40 mL gua destilada..........................460 mL Soluo B cido frmico 8%: cido frmico......................................................40 mL gua destilada....................................................460 mL Soluo de uso: (preparar antes de usar): Soluo A.........................................................500 mL Soluo B..........................................................500 mL cido pcrico (C6H2(NO2)3OH) - esse cido age muito lentamente e utilizado principalmente em soluo aquosa saturada para descalcificar tecidos embrionrios. Os tecidos devem ser lavados em lcool 70% aps a descalcificao para remover o precipitado amarelo. Procedimentos gerais para a descalcificao por misturas cidas: 1- A pea a ser descalcificada no deve possuir mais do que 5 mm de espessura. Esta deve ser clivada para isso.
2- O volume da mistura descalcificadora deve ser de dez a vinte vezes as dimenses da pea a ser descalcificada. 3- O material a ser descalcificado deve estar suspenso na mistura descalcificadora, pois o clcio, ao sair do tecido, se deposita no fundo do frasco (Figura 5). 4- A mistura descalcificadora deve ser substituda a cada 24 horas. O tempo de descalcificao depender das dimenses da pea e do tipo de soluo descalcificadora. 5- Ao trmino da descalcificao, deve-se neutralizar, os tecidos com uma soluo alcalina de sulfato de sdio (Na 2SO4) a 5% por 24 horas. 6- Lavar com vrios banhos de gua por um perodo de 48 horas. 7- Seguir a rotina de processamento histolgico.
Figura 5. Suspenso dos tecidos durante a descalcificao.
B. Descalcificao por resinas de troca inica
Essa resina promove a acelerao do processo de descalcificao pela rpida troca inica entre o cido frmico e os fosfatos ou carbonatos de clcio tecidual, proporcionando, alm da rapidez, boa preservao dos detalhes
celulares, com qualidade superior aos mtodos de descalcificao por cidos. Essa resina pode ser reaproveitada. Resina : WIN 3000 (resina de troca inica).............................100 g cido frmico em soluo aquosa a 10% ...................800 mL
Figura 6. Resina de troca inica.
C. Mtodos histoqumicos
So mtodos escolhidos quando se deseja preservar enzimas (fosfatase alcalina e desidrogenases), cidos nucleicos e polissacardeos (glicognio) presentes no tecido sseo. Os mtodos habituais que utilizam descalcificadores cidos no permitem a anlise dessas molculas e substncias. Os mtodos histoqumicos incluem dois procedimentos para a descalcificao.
Mistura de tampes - nesse procedimento, os sais de clcio so
removidos do osso, quando imersos em soluo tampo de citrato com pH 4,5. Uma desvantagem desse mtodo a inativao reversvel da fosfatase alcalina, que se torna ativa aps a neutralizao com a soluo de sdio barbital. Procedimento para a descalcificao: 1- Fixar os tecidos em lcool 80% de 24 a 48 horas. 2- Descalcificar com a soluo tampo (4C) o tempo de descalcificao varia de acordo com o tamanho da pea e seu grau de mineralizao. 3- Lavar em gua corrente e depois em gua destilada. 4- Neutralizar em soluo de sdio barbital a 37C por 6 horas. 5- Lavar em gua corrente por 6 horas. Tampo cido ctrico-citrato (pH 4,5): cido ctrico 1N...................................................50 mL Citrato de amnio 1N..............................................50 mL Sulfato de zinco 1%.................................................2 mL Clorofrmio........................................................0,1 mL
Agentes quelantes - so compostos orgnicos que se ligam ao on
clcio (metal, ver tabela peridica) formando um metal quelado, por exemplo, sequestrante ou versene (cido etilenediaminetetractico ou EDTA). Esse mtodo bem lento, sem dano ao tecido. Assim, como as misturas de tampes, ele inativa a fosfatase alcalina, que reativada aps um banho de 2 a 6 horas em soluo de cloreto de magnsio 6%. A descalcificao por agentes quelantes no produz artefatos durante a maioria das coloraes histolgicas, diferente da descalcificao por cidos, que gera artefatos quase irreversveis.
Descalcificantes quelantes (EDTA) EDTA neutro: Sal de EDTA dissdico............................................250 g gua destilada.................................................1.750 mL A soluo fica esbranquiada e deve ser neutralizada (pH=7,0) pela adio de aproximadamente 25g de hidrxido de sdio. Hilleman e EDTA de Lee: Sal de EDTA dissdico.............................................5,5 g gua destilada......................................................90 mL Formoldedo comercial.............................................10 mL Soluo descalcificadora EDTA em Tampo Fosfato 0,1M: 1) Tampo fosfato 0,1 M para o preparo final da soluo descalcificadora de EDTA: Tampo fosfato 0,1 M (pH=7,0): Soluo A: Fosfato monobsico de sdio.........................................13,7g gua destilada..............................................................1 L Soluo B: Fosfato dibsico de sdio..............................................35,8g gua destilada..............................................................1 L Para 1 litro coloca-se em um bquer 750 mL da soluo B e adicionase gota a gota a soluo A at o pH atingir o pH 7,0.
Soluo de uso do descalcificador EDTA em tampo fosfato 0,1 M: EDTA....................................................................100 g Tampo fosfato 0,1 M (soluo 1)........... .................1000 mL Acertar o pH do EDTA para 7,0 com hidrxido de sdio 10 M Procedimento: 1- Suspender o espcime no lquido (Figura 5) descalcificador, com o volume igual ou superior a vinte vezes o volume da pea. 2- Trocar a soluo descalcificadora diariamente. Se possvel, manter o frasco em agitao. 3- Testar aps duas a trs semanas, para ver se j ocorreu a descalcificao. 4- Lavar em gua por algumas horas. 5- Proceder ao processamento histolgico.
Descalcificao fsica
A. Descalcificao eletroltica ou ionizao eltrica Esse mtodo permite a formao de um campo eltrico entre dois eletrodos, fazendo os ons de clcio migrarem rapidamente do osso (anodo) para o eletrodo de carbonato (catodo). Os radicais cidos migram para o anodo. um mtodo rpido; porm, a temperatura no deve exceder 45oC. Aps a descalcificao, recomenda-se a neutralizao das peas, com soluo sulfato de sdio (Na2SO4) a 5% por 24 horas, para evitar a formao de artefatos durante a colorao. Aps a neutralizao, as peas devem ser lavadas em vrios banhos de gua por no mximo 48 horas.
Soluo descalcificadora eletroltica: cido frmico a 90% ..........................................100 mL cido clordrico....................................................80 mL gua destilada....................................................820 mL
Figura 7. Descalcificao eletroltica.
B. Descalcificao com auxlio das micro-ondas O efeito benfico do calor foi reconhecido antes da era das microondas e foi primeiramente utilizado durante o procedimento de fixao por Ehrlich (1898) para acelerar a fixao qumica por meio de calor externo. As micro-ondas penetram vrios centmetros para dentro dos tecidos biolgicos, e o calor produzido pode ser controlado pela potncia e o tempo de exposio. O calor o principal responsvel pelos efeitos produzidos pelas micro-ondas, assim como a agitao molecular e o fluxo eletromagntico, acelerando o processo de descalcificao. Durante o aquecimento, a energia termal aumenta a dinmica molecular, na qual a agitao molecular induzida pela oscilao do campo eletromagntico aumentar a coliso de molculas, acelerando as reaes qumicas. Esse mtodo reduz o tempo de descalcificao; o que normalmente levaria dias, nesse mtodo levar somente algumas horas.
Deve-se imergir a pea na mistura descalcificadora de escolha e irradiar as micro-ondas. C. Descalcificao com auxlio do ultrassom Assim como as micro-ondas, o ultrassom acelera o processo de descalcificao, promovendo a agitao molecular, com a vantagem de no elevar a temperatura, mantendo as estruturas celulares. Como possvel saber se a pea est totalmente descalcificada? Existem mtodos fsicos e qumicos que permitem controlar o momento de finalizao da descalcificao. Mtodos fsicos
Manipulao do operador: tenta-se dobrar a pea ou inserir
uma agulha bem fina e verificar, assim, o grau de mineralizao.

Teste radiolgico: o raio-X o mtodo mais sensvel e confivel
para acompanhar a descalcificao. Mtodos qumicos

Teste do oxalato de amnia: esse mtodo detecta a presena
de clcio no lquido descalcificador, indicando se a descalcificao est completa ou no. Teste do oxalato de Amnia / Hidrxido de Amnia: Solues estoque: Soluo A soluo estoque de hidrxido de amnia 5%: Hidrxido de amnia 28%.....................................5 mL gua destilada..................................................95 mL
Soluo B estoque de oxalato de amnia 5%: Oxalato de amnia...............................................5 mL gua destilada..................................................95 mL Soluo de uso de oxalato de amnia / hidrxido de amnia Soluo A soluo estoque de hidrxido de amnia 5% - 5 mL Soluo B soluo estoque de oxalato de amnia 5% - 5 mL A soluo deve ser preparada no momento do uso. Procedimento: 1- retirar 5 mL de lquido descalcificador do fundo do frasco que em se encontra a pea; 2- colocar em um tubo Falcon de 15 mL; 3- adicionar ao tubo 10 mL da soluo de uso de oxalato de amnia-hidrxido de amnia; 4- misturar bem e deixar repousar em p por 12 horas; 5- se a descalcificao for completa, o lquido se manter lmpido; caso contrrio, haver precipitao do clcio; 6- esse processo deve ser repetido at que o lquido descalcificante se encontre lmpido por dois dias. Muitos inconvenientes podem ser gerados durante o processo de descalcificao e, para minimiz-los, devemos tomar alguns cuidados Regras gerais para uma boa descalcificao:
somente descalcificar tecidos muito bem fixados; reduzir ao mximo o tamanho da pea a ser descalcificada,
reduzindo assim o tempo de descalcificao;
a lavagem do material essencial antes da descalcificao e
antes do processamento subsequente;

renovar o descalcificador diariamente, pois esse vai perdendo
sua concentrao original;

o volume do lquido descalcificador deve ser no mnimo vinte
vezes o tamanho da pea;

verificar constantemente se a descalcificao foi finalizada; neutralizar sempre os tecidos aps a descalcificao por substn-
cias cidas. Notas de biossegurana Ao manipular solues cidas e agentes quelantes, deve-se fazer uso de luvas especficas para manipulao qumica, de mscara com filtro prprio para vapores cidos e orgnicos, e deve-se faz-lo em local arejado e com exausto. O preparo dessas solues deve ser feito em capela de exausto. Deve-se, previamente, consultar as fichas de emergncia qumica das solues cidas e quelantes antes da sua manipulao. A inalao destes compostos pode causar irritao e queimaduras. Nunca descarte solues cidas em esgoto sanitrio convencional, procure saber a poltica de descarte de produtos txicos de sua instituio.
Processamento 3. Processamento
O princpio do processamento histolgico consiste na difuso de reagentes para o interior dos tecidos e na remoo do lquido tecidual que, aps a fixao do material, o prprio fixador empregado. O processamento tecidual tambm torna os fragmentos rgidos capazes de proporcionar o seccionamento de fatias finas e delicadas para a observao ao microscpio.
Diversas substncias podem ser utilizadas como meio de incluso; porm, no processamento convencional, comumente se utiliza a parafina. O processamento para incluso de material em parafina passa por trs etapas: desidratao, clarificao e impregnao.
A. Desidratao
A desidratao consiste na remoo da gua dos tecidos, pois as substncias previamente utilizadas para incluso em parafina no se combinam homogeneamente com a gua. Vrios so os agentes desidratantes. A substncia utilizada na rotina histolgica o lcool etlico, por produzir bons resultados e possuir baixo custo. Contudo, outros agentes desidratantes tambm so eficientes, variando apenas o tempo de desidratao.
B. Clarificao ou diafanizao
A clarificao visa remover completamente o lcool do interior dos tecidos, preparando-os para as etapas subsequentes. A remoo do lcool de extrema importncia, pois a parafina no se mistura homogeneamente com o lcool. Dessa forma, fundamental a completa remoo do lcool para que a parafina possa penetrar completamente no interior dos tecidos. Para remover o lcool e preparar o tecido para a penetrao da parafina utiliza-se, nessa etapa, o xilol. Conforme o xilol penetra o tecido, em substituio ao lcool, o material se torna mais claro, transparente. Por essa razo, essa etapa denominada clarificao.
C. Infiltrao em parafina
A infiltrao dos elementos teciduais em parafina importante, pois a parafina tambm o meio de incluso tecidual. Para a infiltrao, ela deve ter
sido previamente aquecida, pois a parafina lquida somente em temperatura entre 56C a 60C, sendo slida temperatura ambiente. Os tecidos tambm podem ser infiltrados por outros meios de incluso, necessitando de processamentos especiais dependendo do meio de incluso. Meios de incluso como polietilenoglicol (carbowax), resinas hidroflicas e hidrfobas, gelatina, dentre outros, funcionam como meios alternativos de incluso dependendo do objetivo da anlise. O processamento dos tecidos possui variveis que podem afetar consideravelmente os resultados do processo histolgico. Dentre as variveis, temos: condies de operao (manual ou equipamentos automtico), temperatura, caractersticas e concentrao dos reagentes utilizados e as propriedades qumicas dos tecidos.
Processamento manual (Figura 9)
Limitaremos aqui a descrio para material destinado a incluso em parafina. Desidratao Para a desidratao adequada, necessrio que o volume do lcool seja vinte vezes o volume da amostra. Contudo, sendo a gua mais densa do que o lcool, ela tende a se localizar no fundo do frasco aps a sua retirada do tecido, exatamente onde a amostra se encontra (Figura 8). Para que a desidratao seja satisfatria e a gua se acumule no fundo do frasco, recomenda-se:
agitar constantemente o recipiente, para que a gua se misture
ao lcool;
realizar vrias trocas de lcool, pois a gua ser eliminada com o
lcool desprezado;
usar recipientes de fundo largo para diminuir o nvel de gua; nunca aquecer o lcool, pois, alm de ser perigoso, o meio
ficar hidratado mais facilmente.
Figura 8. Material sendo desidratado e clarificado.
Clarificao Apesar de as substncias diafanizadoras serem insolveis em gua e solveis no lcool, que removido da pea durante a clarificao, deve-se tomar algumas precaues:
agitar o frasco para melhorar a difuso (sada do lcool e
entrada do xilol); antigamente, esse procedimento seria reprovado, pois como o lcool menos denso do que a gua, ele ficaria na superfcie do frasco e no estaria em contato com a pea (Figura 8);
proceder, no mnimo, a duas trocas com a substncia clarificadora; no deixar o material por muito tempo em xilol, pois ele resseca
muito o material, interferindo na sua qualidade.
Impregnao A impregnao deve ser realizada em estufa a 60oC. Os fragmentos sero transportados de uma parafina a outra em intervalos de tempo predeterminados. No se deve realizar somente uma passagem pela parafina, pois ser insuficiente para remover todo o xilol dos tecidos. Contudo, recomenda-se nunca deixar o material permanecer na parafina por muito tempo, pois como a parafina somente lquida em temperatura alta, o calor em um longo perodo de tempo poder causar grande dano ao tecido. Figura 9. Processamento manual de tecidos.
Processamento automtico
Existem dois tipos de equipamentos automticos (processadores) acessveis no mercado e que so tambm chamados histotcnicos ou autotcnicos. Um tipo de processador o carrossel (Figura 10), mais tradicional e de baixo custo, no qual os cassetes contendo os fragmentos so colocados em uma cesta que transportada mecanicamente de forma a imergir os cassetes em cada reagente. Outro tipo possui uma cmara fechada, na qual
os reagentes so transferidos de recipiente a recipiente e, esses processadores automticos, chamados processadores com transferncia de fluidos. Ambos os equipamentos possuem doze estgios de processamento. Alguns processadores esto acoplados a um sistema de vcuo (Figura 11) que, no do tipo carrossel, est no ltimo banho de parafina. Nos processadores com transferncia de fluidos, o vcuo pode ser includo em todos os banhos do processo. Todo o processamento ocorre em vcuo, revelando significativa melhoria dos resultados em perodos de tempo reduzido, em comparao aos resultados obtidos no processamento sem vcuo. importante salientar que os recipientes com parafina para infiltrao possuem termostatos que controlam a temperatura ideal de infiltrao. Alm disso, todos os processadores possuem agitao automtica. O trabalho com processadores automticos mais confivel, pois no ocorre falha humana durante o processamento. O tcnico somente deve programar o aparelho e trocar os reagentes para obter um bom processamento do material. O protocolo de execuo tambm elaborado pelo prprio tcnico e pode ser alterado a qualquer momento de forma simples e rpida. Geralmente, os aparelhos so programados para trabalhar durante toda a noite e, no dia seguinte pela manh, o material estar pronto para ser includo. Outro fato considerado quando se quer ganhar tempo na rotina laboratorial, pois se pode programar o equipamento para trabalhar durante feriados e finais de semana.
Figura 10. Processador de tecidos automtico.
Figura 11. Sistema de vcuo.
Protocolos de processamento Os protocolos de processamento variam de acordo com:

as dimenses dos fragmentos do material a ser processado; tipo de reagentes utilizados; tipo do espcime biolgico (material humano, de rato, de
camundongo, entre outros);

tipo de tecido; processamento automtico ou manual; presena de vcuo.
Citaremos um dos protocolos utilizados para processamento de tecidos clivados com 3mm de espessura: Passo 1 2 3 4 Estgio Desidratao Desidratao Desidratao Desidratao Reagente lcool 70 % lcool 80 % lcool 90 % lcool 95 % Durao 1h 1h 1h 1h
5 6 7 8 9 10 11 12
Desidratao Desidratao Desidratao Desidratao Clarificao Clarificao Impregnao Impregnao
lcool 100 % lcool 100% lcool 100% lcool 100% Xilol I Xilol II Parafina I Parafina II
1h 1h 1h 1h 1h 1h 1h 2h
Fatores que influenciam no processamento

Temperatura; Vcuo; Agitao.
Notas de biossegurana Todo material utilizado no processamento de tecidos altamente inflamvel. Use luvas, jaleco e mscara com filtro de proteo contra vapores orgnicos. Durante a manipulao dos reagentes, evite contato com o lquido e o vapor de xilol. Este elemento txico para as vias areas. Quando inalado por tempo prolongado, pode causar a morte. Em caso de incndio, extinguir com espuma, p qumico seco ou dixido de carbono. O vapor de xilol mais pesado do que o ar, exigindo capela com exausto inferior. No descarte os resduos do processamento em esgoto sanitrio comum, procure saber em sua instituio qual a poltica de descarte de substncias qumicas.
4. Incluso
A incluso se baseia em colocar, com o auxlio de uma pina previamente aquecida, os tecidos que foram previamente infiltrados em parafina no interior de um molde que j contm parafina lquida com a superfcie a ser seccionada (a ser cortada ao micrtomo) para baixo (Figuras 11, 12, 13 e 14). Os fragmentos devem ser colocados na parafina enquanto aquecidos, evitando-se a formao de bolhas de ar em torno deles. Aps o resfriamento, os blocos de parafina com o material includo so obtidos. Para se realizar uma boa incluso, necessrio que o fragmento esteja completamente desidratado, clarificado e corretamente impregnado. Quando se observa que uma dessas etapas no foi corretamente efetuada (observando reas opacas ou esbranquiadas no material), deve-se, nesse caso, retroceder o processamento executando-o da seguinte forma:
remover a parafina de infiltrao com vrios banhos do agente
clarificador (xilol);
aps a completa remoo da parafina, proceder remoo do xilol,
passando o fragmento por vrias trocas do agente desidratante (lcool), ou mesmo gua, caso o tecido no tenha sido desidratado corretamente;
em seguida, desidratar e clarificar novamente; infiltrar e incluir o material novamente em parafina.
importante que logo aps o trmino da infiltrao seja efetuada a incluso, evitando que o material se torne quebradio e retrado pelo efeito da temperatura da parafina aquecida.
Figura 12. Central de incluso.
Figura 13. Incluso do material.
Figura 14. Colorao do suporte com identificao do tecido.
Figura 15. Blocos prontos para a microtomia.
Em alguns laboratrios de histologia, observa-se que o tcnico remove os fragmentos da parafina de infiltrao e deixa-os esfriar at o momento da incluso. Esse comportamento est totalmente errado. O fragmento, ao ser novamente submetido ao da temperatura elevada (56-58oC), pode ter sua textura consideravelmente prejudicada pelo calor. Assim, devemos incluir o fragmento logo aps o trmino da infiltrao. A temperatura da parafina de incluso pode estar cerca de 5C acima do ponto de fuso da parafina. Essa temperatura necessria para que possamos manusear o fragmento dentro do molde, que por vezes metlico e esfria rapidamente. No mercado existem aparelhos que possuem dispositivos que auxiliam no processo de incluso, como tanques de acondicionamento da
amostra. Nesses equipamentos, o termostato permite o controle mais preciso da temperatura. As centrais de incluso (Figura12) possuem normalmente duas placas, uma aquecedora para efetuar a incluso, e outra refrigerada para resfriar os moldes com as amostras includas. Essas centrais tambm possuem um local para aquecimento das pinas que sero utilizadas durante a incluso. Esses aparelhos facilitam o procedimento da incluso, principalmente por manterem a mesma temperatura de infiltrao em todos os tanques e placas, diminuindo consideravelmente o tempo gasto com a incluso propriamente dita. Dependendo do fabricante, alguns produtos, ao serem adicionados parafina de incluso, alteram a sua consistncia, tornado-a mais macia ou mais densa. A mudana de consistncia deve ser avaliada, pois sua consistncia um fator importante na microtomia. Dentre as substncias que podem ser adicionadas parafina, tm-se: cera de abelha, estearina, cera de carnaba, dietileno glicol, dentre outras. Outro fato a ser considerado o uso de cassetes durante o procedimento at a incluso. Os cassetes de plstico so aconselhados, pois permitem escrever, a lpis, o nmero de registro do material. Os cassetes tambm so importantes para a microtomia, pois podem ser adaptados ao micrtomo. Procedimentos para incluso (Figuras 13, 14, 15,16 e 17)
Abrir o cassete e verificar o nmero de fragmentos contidos no
cassete.
Selecionar o molde a ser utilizado de acordo com as dimenses dos
fragmentos a serem includos de maneira a sobrar cerca de 2 mm de parafina nas margens do bloco.
Preencher o molde com parafina lquida pr-aquecida. Com o auxlio de uma pina, selecionar o fragmento, sem deix-lo
esfriar, e coloc-lo no molde preenchido previamente com parafina.
Colocar a base do cassete, ou suportes, sobre o molde de maneira
que a parafina entre em contato com o cassete. Se para a incluso no se utilizar o cassete, deve-se utilizar um papel para escrever a identificao do bloco.
Levar o molde com o material includo para a placa resfriada. Quando o molde comear a suar, o momento certo de retirar o
bloco do molde. Figura 16. Procedimento de incluso. Figura 17. Molde com material que foi includo.
Orientao dos fragmentos A orientao dos fragmentos de rgos no molde um processo importante na confeco dos cortes e anlise dos tecidos. Por exemplo, rgos tubulares, como intestinos, devem ser includos no plano transversal; fragmentos de msculos tambm devem ser includos, considerando-se seus planos longitudinais e transversais. Ao se incluir um fragmento de pele, deve-se considerar a anlise de suas estruturas bsicas, isto , a epiderme e a derme. Pequenos fragmentos de tecidos podem ser includos paralelamente, enquanto fragmentos alongados so orientados longitudinalmente. Para melhor compreenso do sentido desses materiais durante a incluso, sugere-se que o tcnico procure atualizar seu conhecimento bsico sobre a
histologia, consultando a literatura especializada ou buscando orientao com o chefe ou pesquisador do setor. Notas de biossegurana A parafina altamente inflamvel, mantenha esta substncia longe de chamas. Evite queimaduras, pois as placas e pinas utilizadas neste procedimento so aquecidas. A incluso deve ser realizada em local arejado ou com exausto. Os vapores de parafina so txicos s vias respiratrias.
5. Microtomia
Para permitir a anlise dos tecidos ao microscpio de luz, eles devem ser seccionados em fatias bem finas e uniformes. A espessura ideal varia de acordo com o objetivo de estudo; recomenda-se a espessura de 4 a 6 mm na rotina dos laboratrios. O instrumento capaz de confeccionar cortes com tal preciso o micrtomo (Figura 18), sendo constitudo por trs partes: corpo, porta-bloco e porta-objeto. Considera-se, ainda, que em alguns modelos possua duas manivelas, uma manivela de ajuste e outra de corte. Existem dois tipos de micrtomos: do tipo rotatrio, tambm conhecido como do tipo Minot, em que o material, no porta-objeto, vai de encontro navalha que est imvel no porta-navalha; e o do tipo corredia, que avana o porta-navalha e vai de encontro ao porta-objeto onde se encontra a amostra. Encontram-se venda no mercado diversos modelos dos dois tipos de micrtomo, podendo ser automticos ou manuais. Muitos micrtomos foram desenvolvidos para confeccionar cortes a partir de blocos de parafina, outros, para realizar cortes congelados, e h ainda aqueles micrtomos especficos para a microscopia eletrnica, chamados ultramicrtomos, capazes de confeccionar cortes ultrafinos. A ttulo de conhecimento geral, iremos descrever alguns destes modelos.
Figura 18. Micrtomo.
Micrtomos
Micrtomo rotativo ou modelo Minot: so instrumentos peque-
nos e mais utilizados para microscopia de luz para tecidos includos em parafina.
Criostato: utilizado para confeccionar cortes de tecidos que foram
congelados. Esse equipamento consiste de um micrtomo rotatrio acondicionado dentro de uma cmara frigorfica com temperatura abaixo de 20 oC (Figura 19). Figura 19. Criostato.
Micrtomo de corredia: indicado quando os blocos contm frag-
mentos grandes, podendo ser utilizado para bloco de gelatina ou parafina. um micrtomo muito pesado, o que evita qualquer tipo de vibrao mecnica. Muito utilizado para a confeco de cortes de tecido nervoso.
Micrtomo de congelao: esse tipo de micrtomo usado para
cortes de material fresco congelado. O sistema desse micrtomo igual ao do micrtomo de corredia, em que a navalha que se move em direo amostra, que permanece imvel. equipado com um cilindro de dixido de carbono lquido que congela as amostras de tecidos e a navalha. Esse tipo de micrtomo muito utilizado em centros cirrgicos para um diagnstico rpido.
Ultramicrtomo: utilizado para confeccionar cortes de material includo
em resinas acrlicas ou epoxi. Esse equipamento permite seces semifinas (com espessura em micrmetros) de pequenas amostras para microscopia de luz, e ultrafinas (com espessura em nanmetros) em microscopia eletrnica. O ultramicrtomo vem adaptado com suporte para navalhas de vidro para a confeco de cortes semifinos, e suportes para facas de diamante ou safira, utilizadas para confeccionar cortes ultrafinos. um micrtomo automtico que possui um controle de operao mecnica.
Micrtomo do tipo serra: um micrtomo especial utilizado para
cortar ossos calcificados, vidros ou cermicas. As amostras includas em resinas so movidas contra uma serra de diamante.
Micrtomo vibratrio: utilizado para fazer seces de tecidos frescos
de material no fixado, ou tecidos moles; tambm utilizado para a obteno de cortes de tecidos vegetais. O nome do micrtomo deriva do fato de ele possuir um sistema de alta vibrao da navalha para cortar o tecido. Diferentes graus de vibraes podem ser produzidos para cortar os tecidos de diferentes densidades.
Notas de biossegurana Utilize luvas ao cortar em criostatos, e lembre-se de que no caso de material congelado, os espcimes no esto fixados.
Navalhas (ou facas)
Existe uma variedade de navalhas disponveis no mercado, variando de qualidade conforme o grau de dureza do material, o meio de incluso ou o tipo de micrtomo.
Navalhas de ao: so fabricadas com ao de alta qualidade. A super-
fcie de corte do ao no deve possuir impurezas e nem ser revestida por substncias anticorrosivas. Essas navalhas so tradicionalmente usadas para microtomia de material includo em parafina.
Navalhas de ao para criostato: so navalhas mais resistentes e total-
mente livres de impurezas, contendo ainda 12% a 15% de material cromado ou de teflon, pois no oxidam na presena de gua e oferecem maior durabilidade.
Navalhas descartveis: possuem adaptadores prprios, alm de produ-
zirem cortes de alta qualidade por no comprimirem os tecidos e permitirem cortes sequenciais, denominados cortes em fita. Essas navalhas so confeccionadas em platina ou material cromado para prolongar o uso do gume ou fio da navalha muito afiado. Para confeco de cortes includos em parafina, so comercializadas navalhas descartveis de alto e baixo perfis; as navalhas de alto perfil servem para microtomia de tecidos mais slidos, enquanto as de baixo perfil servem para cortar tecidos mais delicados. As navalhas descartveis so recomendadas por possurem custo menor em relao s de ao, alm de dispensarem a utilizao de equipamentos, como afiadores automticos, que so muito caros. Assim, representam economia de tempo para o tcnico, que no mais precisar amolar suas navalhas.
Existem tambm navalhas descartveis de tungstnio para a execuo de cortes de rgos ou osso inclusos em resinas acrlicas. Execuo dos cortes Com o auxlio de uma navalha bem afiada, um micrtomo bem aferido e um bloco contendo material condizentemente includo, possvel iniciar a microtomia. Material e equipamento necessrio:
micrtomo; pina histolgica com ponta curva; banho-maria; cuba com gelo; pincel (opcional); gaze; bloco de tecido; navalha bem afiada; suporte para lminas; lminas com adesivo; placa aquecedora (opcional); estufa a 58oC.
Procedimento para a microtomia (Figuras 20, 21, 22 e 23)

1- Fixar o bloco no micrtomo. 2- Colocar o maior eixo do bloco verticalmente ao fio (gume) da navalha. Se o rgo possuir cpsula, essa deve ficar no lado superior do bloco. 3- Acertar o bloco para que a sua superfcie fique paralela navalha.
4- Colocar no micrtomo uma navalha j utilizada (velha) para desbastar o bloco (retirar o excesso de parafina at se alcanar o material). 5- Aparar o bloco (desbastar). 6- Substituir navalha velha por nova e afiada. 7- Resfriar o bloco para endurecer mais a parafina e umedecer a superfcie do tecido. Pode-se utilizar um cubo de gelo, o qual deve ter a superfcie lisa para entrar em contato com a superfcie do material. 8- Secar a navalha e o bloco com cuidado para no atingir o fio da navalha nem causar ranhuras. 9- Efetuar a microtomia propriamente dita, obtendo os cortes com o auxlio de uma pina, a qual auxilia na manipulao da fita formada. 10- Retirar a fita do micrtomo, com o auxlio da pina, e transport-la para o banho-maria, para realizar a distenso dos cortes. A temperatura do banho-maria deve estar em torno de 40oC para que os cortes se distendam sobre a superfcie da gua, evitando-se a formao de pregas. Pode-se, tambm, aps a execuo dos cortes, coloc-los em banho-maria em temperatura ambiente e distend-los em placa aquecedora com a temperatura em torno de 40 oC a 45 oC. 11- Se o tecido formar dobras, ainda no banho-maria, elas devem ser removidas com o auxlio de uma pina curva, pois tais dobras interferem na anlise histolgica. 12- Coletar o corte com lmina limpa e adesivada. 13- Transferir a lmina com o corte para uma placa aquecedora. 14- Levar a lmina estufa aquecida a 60 oC para retirar o excesso de parafina e melhorar a adeso do corte a lmina.
Figura 20. Microtomia de tecidos.
Figura 21. Distenso dos cortes em banho-maria.
Figura 22. Coleta ou pescagem dos cortes.
Figura 23. Lminas em um suporte para secar.
Preparo prvio das lminas As lminas devem ser muito bem limpas e desengorduradas para que os cortes no se desprendam da lmina durante as etapas subsequentes.
Marcao: as lminas devem ser identificadas com o nmero de
registro correspondente ao bloco, o que pode ser feito com lpis de diamante (permanente) ou lpis dermogrfico. Adesivos Geralmente, como os cortes podem se soltar das lminas durante a colorao, para evitar que se desprendam podem-se usar adesivos colocados antes da microtomia nas lminas lavadas e secas.
Os adesivos mais usados so:

albumina de Mayer; gelatina; celoidina polylisina (para imuno-histoqumica); silano (para tcnicas imuno-histoqumicas, hibridizao in situ e
PCR). Problemas que podem ocorrer durante a microtomia A maioria dos artefatos observados nos cortes causada por problemas com a navalha durante a microtomia ou durante o processamento. Vamos listar alguns dos problemas: Problemas Principais causas 1. A navalha e o bloco no esto paralelos 2. O bloco de forma irregular de paredes no paralelas 1. Fitas de cortes curvas ou 3. Borda de corte da navalha irregulares irregular 4. Parafina misturada no homogeneamente ou impura 1. Faca mal afiada 2. Faca ou bloco quente 2. Cortes comprimidos, irregulares 3. ngulo irregular da navalha ou pregueados 4. Parafuso do micrtomo solto 3. Fragmentao dos cortes ou rasgados 1. Incluso imperfeita 2. Parafina quente demais durante a infiltrao ou incluso
4. Arranhaduras nos cortes ou cortes divididos em segmentos
5. Os cortes que se aderem no bloco ao subir o brao do micrtomo
6. Espessura desigual no mesmo corte, lembrando veneziana
7. Enrolamento dos cortes
8. Fragmentao do tecido durante a microtomia ou separao do tecido do bloco de parafina
1. Parafina suja (no filtrada durante a incluso) 2. Sujeira no molde de incluso 3. Sujeira no bloco ou na navalha 4. Dente na faca 1. ngulo da navalha grande demais 2. Borda da faca suja 3. Faca sem fio 4. Borda do bloco suja de parafina 1.Tecido duro demais 2. Parafuso solto 3. Bancada do micrtomo com vibrao 4.Tecido queimado durante a infiltrao ou incluso 1. Parafina muito dura 2. Navalha cega 3. ngulo incorreto da navalha 1. O lcool ou o clarificador no foram completamente removidos 2. Parafina de infiltrao ou incluso muito quente 3. Excessiva clarificao do tecido 4. A infiltrao foi insuficiente 1. Bloco grande demais 2. Parafusos soltos 3. ngulo da faca pequeno demais
9. Cortes aparecem alternadamente finos e grossos
Notas de biossegurana Uma causa frequente de acidente em laboratrios de histotcnica a falta de ateno na manipulao de navalhas durante a confeco do corte. A microtomia deve ser realizada em local calmo, onde o tcnico possa se concentrar exclusivamente no seu trabalho. Muito cuidado ao descartar as navalhas. Utilize sempre caixas de descarte especial para perfurocortantes. Lembre-se de que os funcionrios do setor de limpeza podem se acidentar com navalhas descartadas indevidamente.
6. Colorao dos tecidos
A utilizao de corantes fundamental para visualizar os tecidos ao microscpio de luz. Aps a microtomia, as clulas e o material extracelular so habitualmente transparentes e os corantes melhoram a visualizao das estruturas teciduais. Os corantes aplicados para corar tecidos que foram previamente fixados so chamados corantes no vitais, como a hematoxilina, eosina, fucsina, entre outros. Podemos tambm corar clulas em cultura ou clulas de organismos ainda vivos; nesse caso, necessria a utilizao de corantes chamados vitais, que no causam danos s clulas e tambm no interferem no metabolismo celular. Dentre eles, temos: o azul de tripan, verde janus B, vermelho tripan, azul de metileno, vermelho neutro, entre outros. Para compreender os conceitos bsicos sobre coloraes, devemos conhecer algumas definies importantes.
O que so corantes?
Os corantes (Figura 24) so compostos orgnicos, aromticos e ionizveis, fundamentalmente baseados na estrutura do benzeno. Contudo, esses corantes
so incolores e necessitam da adio de novos grupos qumicos sua estrutura chamados cromforos (C=O cetona, C=N carboamnico, N=N azoico, N=O nitroso, NO2 nitro e C=C etileno). Quanto mais cromforos em um corante, mais intensa ser a sua cor. A unio do cromforo aos compostos aromticos constitui os cromgenos, compostos benznicos contendo grupamentos cromforos. Para que o corante se ligue especificamente aos elementos tissulares, necessrio que um grupo auxiliar do corante, denominado auxocromo, se ligue ao cromgeno. O auxocromo determina o carter cido ou bsico do corante. As aminas bsicas (-NH2) e os grupos hidroxila cidos (-OH) so exemplos de auxocromos. Simplificando: Corantes so compostos orgnicos aromticos formados pelo cromgeno e auxocromo e coram seletivamente os componentes teciduais, como as clulas e a matriz extracelular. De acordo com a carga inica, os corantes podem ser cidos, bsicos ou neutros.
Corantes cidos: possuem auxocromo aninico (carga eltrica negativa
(-)), com afinidade por componentes bsicos do tecido (catinico (+)). As estruturas coradas pelos corantes cidos so chamadas acidfilas, como, por exemplo, o citoplasma e matriz extracelular. Um exemplo de corante cido a eosina.
Corantes bsicos: possuem auxocromo catinico (+) com afinidade
por componentes cidos dos tecidos (aninico (-)). As estruturas coradas pelos corantes bsicos so chamadas basfilas, como o ncleo. A hematoxilina um exemplo clssico de corante bsico.
Figura 24. Esquema da associao do corante com os tecidos.
Os corantes podem ser naturais ou sintticos (artificiais), sendo tambm chamados corantes biolgicos, por revelar estruturas biolgicas dos tecidos.
Naturais: hematoxilina, ndigo, orcena, brasilina, entre outros. Artificiais: so aqueles derivados do benzeno.
As coloraes podem ser classificadas segundo a ao do corante, o tempo de colorao e a sua cromatizao. Para compreender essa caracterizao, necessrio conhecer a definio de dois termos da tcnica histolgica: o mordente e a diferenciao. Mordente: um elemento, metal ou ons de metal, que se liga covalentemente ao corante e facilita a ligao do corante ao tecido. O mordente empregado para reforar a ao dos corantes e tornar as coloraes mais seletivas, podendo ser usado antes, durante (adicionado soluo corante) ou aps a utilizao do corante.
Diferenciao: esse termo se refere remoo do excesso de corante do tecido, descorando seletivamente determinada estrutura e melhorando a sua visualizao. As coloraes podem ainda se caracterizar segundo a: A. Ao
Diretas: quando o corante penetra no interior dos tecidos sem trata-
mento intermedirio com mordente.

Indiretas: quando necessrio um tratamento intermedirio com
uma soluo mordente para o corante se ligar ao tecido durante a colorao. B. Tempo
Progressiva: a colorao feita gradualmente sem a necessidade de se
proceder sua diferenciao, isto , que seja retirado o excesso do corante.

Regressiva: hipercora-se o tecido e posteriormente remove-se seu
excesso pela diferenciao para melhor visualizao dos elementos teciduais. B. Cromatizao Depende da quantidade de corantes utilizados durante a execuo de uma determinada tcnica de colorao.
Monocrmica = 1 cor. Bicrmica = 2 cores. Tricrmica = 3 cores. Policrmica = mais de 3 cores.
Aps os comentrios apresentados, deve-se ainda aprofundar alguns conhecimentos sobre a colorao. Aps a microtomia, o preparado histolgico est pronto para ser corado. Deve-se, inicialmente, utilizar uma colorao que proporcione uma viso geral de todo o tecido de modo a permitir a identificao dos elementos teciduais, propiciando o diagnstico histolgico. A colorao pela hematoxilina (H) e pela eosina (E) cumpre muito bem esse papel. Nessa colorao, os ncleos so corados pela hematoxina, sendo evidenciados em roxo, enquanto o citoplasma e os espaos intercelulares so corados pela eosina, sendo visualizados em rosa. Havendo a necessidade de se identificar certos elementos teciduais especficos, empregam-se tcnicas histoqumicas especiais. H diversos mtodos especiais de colorao que propiciam uma melhor identificao de determinados componentes teciduais. Por exemplo, a colorao pelo mtodo tricomtico de Masson, que utiliza corantes especiais, permite evidenciar tecido muscular e fibras colgenas; a colorao pela resorcina fucsina de Weigert demonstra fibras do sistema elstico; o azul de toluidina em pH cido uma colorao especfica para mastcitos. Outros mtodos utilizados para identificao de elementos teciduais podem utilizar sais pesados a base de prata metlica e no corantes. Nessa categoria podem-se citar o mtodo da reticulina de Gomori, que identifica especificamente as fibras reticulares do tecido conjuntivo, sendo o mtodo de Grocott especfico para fungos, e o mtodo de PAMS, especfico para membrana basal. Em determinadas coloraes histoqumicas, certas substncias, ao se combinarem com o tecido, formam uma nova substncia, e essa ligao pode ser irreversvel. Essa a base da colorao com o azul da Prssia (ou Perls) e do mtodo que utiliza o cido peridico associado ao reativo de Schiff (PAS). Na colorao com o azul da Prssia, devido ao do cido clordrico, o ferro
conjugado s protenas ionizado e evidenciado aps reao com o ferrocianeto de potssio. O resultado dessa reao produz um precipitado azul e insolvel de ferrocianeto frrico. Na reao do mtodo do PAS, o cido peridico oxida os grupos hidroxila vicinal dos hidratos de carbono do glicognio, mucoprotenas e glicoprotenas, os quais so convertidos a grupamentos aldedicos, de modo que a cadeia polissacardica se transforma numa cadeia polialdedica. Os compostos aldedos se combinam com o reagente de Schiff, que incolor, e esse complexo formado revela-se como um composto colorido. As coloraes histolgicas de rotina e especiais, quando surgiram na patologia clssica, constituram uma grande revoluo e avano na metodologia de estudo da clula, fornecendo subsdios importantes para a anlise dos tecidos, e representam o ponto de partida para o uso de tcnicas mais modernas incorporadas rotina de investigao. A seguir, encontram-se algumas sugestes de tcnicas histoqumicas. Para evidenciar Ncleo e citoplasma Melancitos Clulas do tecido nervoso Secrees celulares Mastcitos e eosinfilos Clulas HE, Feulgen, Papanicolau, Shorr, Giemsa, azul de toluidina, metil green-pironina Fontana-Masson Violeta cresil, azul de toluidina, Golgi (Prata) PAS, PAS alcian blue pH 1,0 ou 2,5 AB-safranina, Geimsa, azul de toluidina, sirius red em pH 10,2
Para evidenciar Glicoprotenas neutras Proteoglicanos Glicoprotenas no colagenosas Elementos fibrosos base de colgenos Fibras do sistema elstico
Elementos da matriz extracelular PAS PAS-alcian blue em pH 1,0 ou pH2,5 PAMS, reticulina Tricomtica de Masson, tricomtica de Gomori, picrossirius red Resorcina fucsina de Weirgert
Para evidenciar Tecido conjuntivo
Tecidos especficos Tricomtica de Masson, tricomtica de Gomori, Goldner, picrossirius red, reticulina de Gomori Giemsa, reticulina de Gomori Sudan black Coloraes tricromticas, azul de toluidina Coloraes tricromticas, PAS alcian blue em pH1,0 ou pH 2,5
Tecido linfoide e mieloide Tecido adiposo Tecido muscular Tecido cartilagionoso
Para evidenciar Fungos de forma geral
Micro-organismos Grocott e PAS Warthin-Starry, Giemsa Mtodo de Fite, Wade, Kinyoun Giemsa, HE, leishman, PAS, hematoxilina frrica, Feulgen HE HE Mucicarmin, PAS, prata metenamina
Treponema pallidun, Leptospira, Helicobacter pylori Mycobacterium leprae Giardia lamblia, Entamoebahistolytica, Trichomonas vaginalis
Helmintos Incluses virais Criptococcus
Consideraes importantes
Geralmente as estruturas teciduais so visualizadas na mesma cor, ou muito semelhante em tom ao do corante utilizado. Essa propriedade conhecida como ortocromasia. Porm, em alguns casos, certos elementos teciduais, ao serem visualizados aps a sua interao com o corante, exibem uma cor distinta do corante. Esse fenmeno designado metacromasia. Algumas tcnicas de colorao podem demonstrar a metacromasia, como a colorao pelo azul de toluidina em condies especficas, que evidencia em magenta os grnulos dos mastcitos e os proteoglicanos da matriz cartilaginosa.
Procedimentos gerais para coloraes
Antes de iniciar qualquer colorao, devemos nos lembrar de que, aps a microtomia, os cortes dos tecidos esto impregnados pela parafina, que precisa ser removida para que os corantes penetrem e se combinem com os elementos teciduais. O procedimento geral para qualquer colorao o seguinte:
Desparafinizao: visa retirada da parafina dos cortes aps a microtomia.
Esse procedimento realizado com o auxlio do xilol, a mesma substncia utilizada para a clarificao dos tecidos durante o processamento para a confeco do bloco contendo o fragmento do material a ser analisado.
Hidratao: realizada por meio de sequncias alcolicas em concen-
traes decrescentes, ou seja, lcool 100%, 95%, 80%, 70%, at a gua destilada. Cabe ressaltar que a maioria dos corantes se encontra diluda em gua, devendo o ltimo banho ser com gua. Porm, quando se utiliza um corante alcolico, deve-se interromper a hidratao em lcool 70%.
Colorao: a imerso propriamente dita dos cortes no corante,
favorecendo a combinao de suas estruturas com o corante para posterior visualizao em microscpio de luz.
Desidratao: retira a gua do tecido, pois os meios de selagem no
so miscveis em gua, e so necessrios para a confeco dos preparados histolgicos permanentes. Assim, utiliza-se com concentraes alcolicas crescentes: lcool 70%, 80%, 95% e 100%.
Clarificao: utiliza-se o xilol como lquido intermedirio entre o lcool
e o meio de selagem.
Selagem ou montagem da lmina propriamente dita: a etapa final da
preparao da lmina para anlise ao microscpio de luz. Essa etapa consta em cobrir o tecido com uma lamnula de vidro, usando uma substncia para fixar a lmina lamnula (selagem).
Protocolos de colorao para os tecidos
Colorao pela hematoxilina mayer e eosina-floxina
Solues: A) Hematoxilina de Mayer (Mayer, 1903): Hematoxilina.........................................................1 g gua destilada..............................................1000 mL Iodato de sdio................................................. 0,2 g Almen de amnia ou potssio................................. 50 g cido ctrico.........................................................1 g Hidrato de cloral..................................................50 g Dissolver a hematoxilina na gua destilada agitando (aquecer um pouco at 60 C). Acrescentar o iodato de sdio e o almen. Agitar at dissolver totalmente. Adicionar, ento, o cido ctrico e o hidrato de cloral. Deixar agitando para que todos os componentes se dissolvam totalmente. A cor final do corante vermelho-violeta. O corante estar pronto para o uso imediato e poder ser usado por cerca seis meses (no mximo), sem que ocorra o amadurecimento exagerado. Nota tcnica: existem vrios tipos distintos de solues para o preparo da hematoxilina, como a de Mayer, Harris, Delafield e Erlich. Esses tipos de solues variam de acordo com o tempo de colorao, aplicao e composio qumica do corante. A hematoxilina de Harris muito utilizada nos laboratrios de anatomia patolgica por produzir bons resultados com um tempo curto de colorao. A hematoxilina de Mayer apresenta bons resultados, porm com um tempo maior de colorao. As hematoxilinas de Erlich e
Delafield so empregadas em tecidos sseos que sofrero a ao por descalcificadores contendo cidos fortes. A seguir, sero descritos os mtodos de colorao pela hematoxilina e eosina, utilizando a hematoxilina de Mayer e a de Harris. B) Eosina-floxina: 1- Soluo estoque de eosina 1% em gua destilada. 2- Soluo estoque de floxina 1% em gua destilada. 3- Soluo de uso de eosina-floxina: Eosina 1% (soluo estoque 1)............................100 mL Floxina 1% (soluo estoque 2).............................10 mL lcool etlico 95%...........................................780 mL cido actico glacial PA........................................ 4 mL Procedimento: 1- Desparafinizar e hidratar as lminas at a gua destilada. 2- Corar com a hematoxilina de Mayer durante 20 minutos 1. 3- Lavar em gua corrente durante 25 minutos. 4- Comear a desidratao com lcool 70% durante 1 minutos. 5- Corar pela eosina-floxina durante 2 minutos. 6- Lavar rapidamente em lcool 95%. 7- Desidratar em 3 banhos de lcool absoluto por 1 minuto cada. 8- Clarificar em 3 banhos de xilol e selar. Resultados: ncleos em azul e citoplasma em vrias tonalidades de rosa.
Recomendamos fazer um teste prvio, pois, conforme o material, esse tempo poder ser reduzido e ainda se obterem bons resultados.
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Notas de biossegurana Ateno, pois o xilol e o lcool so altamente inflamveis. Use luvas nitrlicas, jaleco e mscara com filtro de proteo contra vapores orgnicos. Durante a manipulao dos reagentes, evite contato com o lquido e o vapor de xilol. Esse elemento txico para as vias areas e, quando inalado por tempo prolongado, pode causar a morte. Em caso de incndio, extinguir com espuma, p qumico seco ou dixido de carbono. O vapor de xilol mais pesado do que o ar, exigindo capela com exausto inferior.
Colorao pela hematoxilina de Harris e eosina-floxina
Solues: A) cido-lcool a 1%: cido clordrico (HCl)..........................................1 mL Etanol a 70%...................................................99 mL B) gua amoniacal: Hidrxido de amnio (NHOH)..........................2 a 4 mL gua destilada......................................800 a 1000 mL C) Carbonato de ltio saturado: Carbonato de ltio (LiCO)...................................1,54 g gua destilada................................................100 mL D) Eosina-floxina (ver o mtodo de hematoxilina de Mayer e esosinafloxina)
E) Hematoxilina de Harris (Harris, 1900): Hematoxilina .....................................................5,0 g Etanol a 100%..............................................50,0 mL Almen de potssio ou de amnio...........................100 g gua destilada..............................................1.000 mL xido mercrio (p vermelho) (HgO)......................2,5 g Dissolva o almen em gua destilada com o auxlio de uma placa aquecedora e um agitador magntico em um recipiente. Dissolva a hematoxilina no lcool temperatura ambiente, em recipiente separado. Lentamente, misture as duas solues aquecendo em placa aquecedora, at entrar em ebulio. Retire da fonte de calor e, com cuidado, acrescente lentamente o xido mercrio, que faz com que a soluo entre rapidamente em ebulio, podendo transbordar do recipiente. Retorne a soluo para a fonte de calor at que adquira a cor prpura-escura. Esfrie, e a soluo estar pronta. Para o uso: Acrescente 20 mL de cido actico glacial para intensificar a colorao dos ncleos. Filtre sempre antes de cada uso. Procedimento: 1- Desparafinizar e hidratar os cortes at a gua destilada. 2- Corar com soluo recm-filtrada de hematoxilina de Harris por 6 a 10 minutos2.
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3- Lavar em gua de torneira por 5 minutos. 4- Diferenciar em lcool-cido, com 1 ou 2 mergulhos. 5- Lavar rapidamente em gua de torneira. 6- Colocar em soluo fraca de gua amoniacal ou de carbonato de ltio saturada at que os cortes fiquem azul-brilhantes. 7- Lavar completamente em gua de torneira por 10 minutos. 8- Colocar em lcool etlico a 80% por 1 a 2 minutos. 9- Contracorar em soluo de eosina-floxina por 2 minutos3. 10- Desidratar a partir do lcool 95%. 11- Desidratar com 3 banhos de lcool absoluto. 12- Clarificar em 3 banhos de xilol e selar. Resultados: Ncleos..............................................................azul Citoplasma...........................................rseo a vermelho Demais estruturas tissulares.........................rseo a vermelho Nota de biossegurana: O xido mercrio txico, venenoso e combustvel (oxidante).
Mtodo de colorao pelo Giemsa de Lennert (Lennert, 1978)
Solues: A) cido actico 0,5%. B) lcool isoproplico.

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C) lcool etlico 95%. D) Xilol E) Soluo de Giemsa: Giemsa Merck em soluo estoque..........................20 mL gua destilada..................................................80 mL Procedimento: 1- Desparafinizar e hidratar as lminas at a gua destilada. 2- Corar utilizando a soluo de uso de Giemsa por 1 hora. 3- Diferenciar em cido actico 0,5% - 3 mergulhos 4- Continuar a diferenciao em lcool etlico 95%, olhando sempre ao microscpio (o tempo varia de acordo com o tipo e espessura do tecido). 5- Desidratar em lcool isoproplico - 3 banhos, de 3 minutos cada. 6- Clarificar em xilol e selar. Nota: A soluo de Giemsa descora com o tempo; aconselha-se examin-la e fotograf-la o mais rpido possvel. Resultados: Citoplasma..........................................................rosa Ncleos.............................................................azul Hemcias.......................................................vermelho
Grnulos de mastcitos.......................................prpura Bctrias..............................................................azul Parasitas da malria..................................................azul
Mtodo do cido peridico + reativo de Schiff (PAS)
(McManus, 1946) Solues: A) cido Peridico 0,5%. B) Reagente de Schiff: Fucsina bsica........................................................1 g Metabissulfito de sdio ou bissulfito de sdio..................2 g gua destilada.................................................200 mL cido clordrico 1 N..........................................20 mL Procedimento: 1- Dissolver em 200 mL de gua destilada quente, 1 g de fucsina bsica. 2- Deixar entrar em ebulio. 3- Esfriar at 50 C. 4- Adicionar 2 g de metabissulfito ou dissulfito ou bissulfito de sdio anidro. 5- Filtrar. 6- Colocar uma pitada de metabissulfito de sdio anidro e em seguida adicionar 20 mL de cido clordrico 1 N. 7- Agitar, esfriar e guardar na geladeira em frasco mbar ou envolvido em papel alumnio.
8- No dia seguinte, colocar uma pitada de carvo ativado e filtrar. O filtrado deve ficar branco ou cor-de-palha; caso contrrio, deve-se colocar mais uma pitada de metabissulfito de sdio anidro e filtrar novamente. C) Soluo sulfurosa: Soluo estoque: Metabisssulfito de potssio ou bissulfito de potssio...10 g gua destilada................................................200 mL cido clordrico 1 N..........................................10 mL Soluo de uso: Soluo estoque..........................................................6 mL gua destilada........................................................114 mL Procedimento: 1- Desparafinizar e hidratar os cortes at a gua destilada. 2- Colocar as lminas na soluo de cido peridico 1% por 15 minutos. 3- Lavar em gua destilada por 5 minutos. 4- Corar pelo Schiff (guardado na geladeira e no escuro 4), por 15 minutos temperatura ambiente. 5- Colocar em trs trocas de soluo sulfurosa de uso durante 5 minutos cada e desprezar aps o uso.
Envolver o vidro com papel alumnio.
6- Lavar em gua destilada por 4 minutos. 7- Corar pela hematoxilina de Mayer durante 10 minutos. 8- Lavar em gua corrente durante 5 minutos. 9- Desidratar, clarificar e selar. Resultados: Membrana basal, mesngio, fibrina, muco, amiloide, coloide, de colorao rsea a vermelho prpura.
Mtodo de Gomori para fibras reticulares (Gomori, 1937)
Solues: A) Soluo de permanganato de potssio 1%. B) Soluo de cido oxlico 3%. C) Soluo de almen de ferro 2%. D) Soluo de nitrato de prata amoniacal de uso: Nitrato de prata 10% (aquoso).............................20 mL Hidrxido de potssio 10% (aquoso)........................5 mL Hidrxido de amnia 28% (aquoso): adicionar aos poucos, gotejando at que o precipitado marrom desaparea, sempre agitando. A soluo se tornar transparente. Acrescentar ento 3 gotas de nitrato de prata 10%, agitando. Acrescentar gua destilada na proporo de 1:1. Acrescentar finalmente 25 mL de gua.
E) Formaldedo 10%: (1 parte de formaldedo comercial + 3 partes de gua destilada) F) Cloreto de ouro 1%. G) Tiossulfato de sdio 5%. Observao: Os cortes devem ser aderidos em lminas quimicamente limpas e desengorduradas, com uma fina camada de albumina de Mayer. Procedimento: 1- Desparafinizar e hidratar os cortes at a gua destilada. 2- Mergulhar em soluo de permanganato de potssio 1% por 1 minuto. 3- Lavar em gua destilada por 2 minutos. 4- Descorar pelo cido oxlico 3% por 3 minutos. 5- Lavar em gua corrente por 3 minutos. 6- Colocar as lminas no almen de ferro 2% ou sulfato de ferro e alumnio por 1 minuto. 7- Lavar em gua destilada por 2 minutos. 8- Soluo de nitrato de prata amoniacal (soluo de uso) por 1 minuto. 9- Lavar em gua destilada por 5 minutos. 10- Formaldedo 10% por 3 minutos. 11- gua corrente por 5 minutos.
12- Soluo de cloreto de ouro 1% por 10 minutos. 13- Lavar em gua destilada por 2 minutos. 14- Tiossulfato de sdio 5% por 1 minuto. 15- Lavar em gua corrente por 2 minutos. 16- Desidratar, clarificar e selar. Resultado: Fibras reticulares ...........................negro. Mtodo de colorao tricromtica de Masson (Masson, 1929) Solues: A) Soluo aquosa, saturada, de cido pcrico: cido pcrico.....................................................1,2 g gua destilada.................................................100 mL B) Soluo fixadora de Bouin: Soluo aquosa, saturada, de cido pcrico ...750 mL Formalina (37-40%)..........................................250 mL cido actico, glacial...........................................50 mL C) Soluo de uso de hematoxilina frrica de Weigert: Misturar, em partes iguais, as solues estoques A e B (100 mL da soluo A + 100 mL da soluo B). Soluo estoque 1: Hematoxilina, cristais................................................1 g Etanol, 95%..................................................100 mL
Soluo estoque 2: Cloreto frrico (FeCl ), 29%..................................4 mL gua destilada..................................................95 mL cido clordrico concentrado (HCl)............................1 mL D) Soluo de fucsina cida - Biebrich Scarlet: Biebrich Scarlet (C.I. 26905), soluo aquosa a 1%....90 mL Fucsina cida (C.I. 42685), soluo aquosa a 1%.......10 mL cido actico glacial.............................................1 mL E) Soluo de cido fosfotngstico - fosfomolbdico: cido fosfotngstico................................................5 g cido fosfomolbdico..............................................5 g gua destilada..................................................200 mL F) Soluo de azul de anilina: Azul de anilina....................................................2,5 g cido actico glacial..............................................2 mL gua destilada.................................................100 mL G) Soluo de cido actico glacial a 1%: Procedimento: 1- Desparafinizar e hidratar at a gua destilada. 2- Colocar no lquido de Bouin por 1 hora a 56 oC ou
temperatura ambiente, por uma noite, se os cortes foram fixados em formalina. Essa etapa no necessria se a fixao for feita no lquido de Bouin. 3- Deixar esfriar por 10 minutos. 4- Lavar em gua corrente at que os cortes fiquem claros. Em seguida, enxaguar em gua destilada. 5- Corar na soluo de hematoxilina frrica de Weigert por 10 minutos. 6- Lavar em gua corrente por 10 minutos. Aps, enxaguar em gua destilada. 7- Corar em soluo aquosa de Biebrich Scarlet a 1% por 5 minutos. 8- Enxaguar em gua destilada. 9- Colocar na soluo de cido fosfotngstico-fosfomolbdico por 10 a 30 minutos. 10- Corrar em soluo de azul de anilina por 15 a 30 minutos. 11- Enxaguar em gua destilada. 12- Diferenciar na soluo aquosa de cido actico a 1%, por 3 a 5 minutos. 13- Desidratar a partir do etanol a 95%, clarificar com xilol e selar. Resultados: Ncleos............................................................preto Msculo, citoplasma, queratina..............................vermelho Colgeno.............................................................azul
Mtodo de Weigert (Weigert, 1898)
Solues: A) Resorcina fucsina de Weigert: Fucsina bsica........................................................2 g Resorcina.............................................................4 g gua destilada................................................200 mL Cloreto frrico 30 %.........................................25 mL Dissolver 2 g de Fucsina bsica e 4 g de Resorcina em 200 mL de gua destilada em ebulio. Adicionar 25 mL de cloreto frrico a 30%, deixando ferver por mais 5 minutos. Filtrar e desprezar o filtrado. O precipitado que ficou no papel de filtro deve ser dissolvido em 200 mL de etanol 90% aquecido. Aps esfriar, completar para 200 mL com etanol 90% e juntar 4 mL de cido clordrico concentrado. O corante deve ser guardado na geladeira, pois o lcool pode evaporar com o calor. B) Soluo de persulfato de potssio 10% ou monopersulfato de potssio 10% ou oxona 10% C) Soluo de Van Gieson: Fucsina cida, soluo aquosa a 1%...........................5 mL cido pcrico, soluo saturada aquosa (21 g para 1 L de gua) ..................................100 mL cido clordrico concentrado................................0,25 mL
Procedimento: 1- Desparafinizar e hidratar os cortes at o lcool 70%. 2- Oxidar pela oxona 10% (desprezar aps o uso). 3- Corar pela resorcina-fucsina durante 1 hora. 4- Passar por 3 banhos de lcool 95% (em borris), para retirar o excesso de corante por alguns segundos em cada banho. 5- Lavar em gua destilada. 6- Contracorar ou no com a soluo de Van Gieson 7- Desidratar rapidamente em 3 banhos de lcool absoluto (em borris). 8- Clarificar em 3 banhos de 3 minutos de xilol. Resultados: Fibras elsticas ......................................... marrom-avermelhado.
Mtodo da prata metenamina de Grocott (Grocott, 1955)
Solues: A) Soluo de cido crmico (trixido de cromo) a 4%. B) Soluo de nitrato de prata a 5%. C) Soluo de metenamina (hexametilenotetramina) a 3%. D) Soluo de brax a 5%.
E) Soluo estoque de nitrato de prata-metenamina: Soluo de nitrato de prata a 5%.............................5 mL Soluo de metenamina a 3%..............................100 mL F) Soluo de trabalho de nitrato de prata-metenamina: Soluo estoque de nitrato de prata-metenamina...........25 mL gua destilada..................................................25 mL Soluo de brax a 5%.........................................2 mL Prepare no momento de usar. No use se ficar turva. G) Soluo de bissulfito de sdio ou metabissulfito de sdio a 1%: Prepare no momento de usar. H) Soluo de cloreto de ouro a 0,1%. I) Soluo de tiossulfato de sdio (hipossulfato de sdio) a 5%. J) Soluo estoque de light green a 0,2%:
Light green SF yellow.......................0,2 g

gua destilada.................................................100 mL Aps misturar, acrescente 0,2 mL cido actico glacial. K) Soluo de uso de light green: Soluo estoque de light green ...............................10 mL gua destilada...................................................50 mL
Procedimento: 1- Desparafinizar e hidratar os cortes at a gua destilada. 2- Oxidar pela soluo de trixido de cromo a 4%, preparada no momento de usar, e deixar por 1 hora. 3- Lavar em gua de torneira por poucos segundos. 4- Colocar na soluo de bissulfito de sdio a 1% por 1 minuto. 5- Lavar em gua corrente por 5 a 10 minutos. 6- Enxaguar em gua destilada; 3 trocas. 7- Colocar os preparados na soluo de trabalho de nitrato de prata-metenamina, preparada no momento de usar, e deixar na estufa a 58C - 60C, por 50 a 60 minutos. 8- Enxaguar em gua destilada vrias vezes. 9- Colocar na soluo de cloreto de ouro a 0,1% e deixar por 2 a 5 minutos. 10- Enxaguar em gua destilada. 11- Colocar na soluo de tiossulfato de sdio a 5%, e deixar por 2 a 5 minutos. 12- Lavar em gua de torneira. 13- Contracorar na soluo de trabalho de light green por 30 a 45 segundos (esse tempo pode variar). 14- Desidratar, clarificar e selar. Resultados: Fungos ............................nitidamente delineados em preto Mucina.....................................................cinza-escuro Parte interna de miclios e hifas.....................rosa-acinzentado Fundo..............................................................verde
Mtodo de Warthin-Starry (Kerr, 1938)
Solues: A) cido ctrico 1%. B) Soluo de gua acidulada: gua tridestilada deionizada...............................1000 mL Acrescentar a soluo de cido ctrico a 1%, o suficiente para alcanar o pH 4,0. C) Soluo impregnante de nitrato de prata a 1%: Nitrato de prata.....................................................1 g gua acidulada................................................100 mL D) Soluo de nitrato de prata 2% para revelao: Nitrato de prata.....................................................2 g gua acidulada................................................100 mL E) Soluo de hidroquinona a 0,15%: Hidroquinona cristalina qualidade fotogrfica...............0,15 g gua acidulada...............................................100 mL F) Soluo de gelatina a 5%: Gelatina pura......................................................10 g gua acidulada................................................200 mL
Conservar as solues de nitrato de prata 2%, gelatina 5% e hidroquinona 0,15% em frascos de Erlenmayer de 50 mL, em banho-maria 54 C, at preparar a soluo G: G) Soluo reveladora: Nitrato de prata 2%..........................................1,5 mL Gelatina 5%..................................................3,75 mL Hidroquinona 0,15%........................................2,0 mL Misturar num pequeno bquer os ingredientes acima na ordem descrita, assegurando-se que a mistura do nitrato de prata e gelatina esteja totalmente completa. Aps isso, adicionar a hidroquinona. Preparar a soluo somente na hora de usar. Procedimento: 1- Desparafinizar e hidratar os cortes at a gua destilada. 2- Impregnar pela soluo de nitrato de prata a 1%, por 30 minutos em banho-maria pr-aquecido 43 oC. 3- Preparar a soluo reveladora. Usar a soluo imediatamente aps colocar a hidroquinona. 4- Recobrir os cortes com a soluo reveladora, preparada no momento do uso. Os cortes tornam-se marrons-claros ou amarelos. Controlar ao microscpio. As espiroquetas aparecem em negro com fundo amarelo ou marrom-claro. 5- Lavar rapidamente em gua morna comum (56oC). 6- Mergulhar em gua destilada. 7- Desidratar a partir do lcool 95%, clarificar e selar.
Resultados: Espiroquetas, corpos de Donovani...negro Colorao de fundo....................de amarelo a marrom-claro Referncias: C. H. Bridges e L. G. Luna estudaram vrias modificaes da tcnica, que se encontra publicada em Lab. Invest.,1957.
Sirius red em pH 10,2 (Bogomoletz,1980; Luque,1989)
Soluo: A) Soluo de sirius red em pH 10,2:
Sirius red ou direct red 80......................................0,5g

gua destilada..................................................45 mL lcool absoluto.................................................50 mL
Adicionar NaOH 0,1N, at atingir o pH 10,2. Deixar repousar por 2 horas. Gotejar lentamente o cloreto de sdio 20% em baixo de luz
forte at aparecer o precipitado.

Deixar repousar durante a noite sob luz forte e filtrar na manh
seguinte. Esta soluo dura um ms temperatura ambiente; mas pode durar mais, caso fique na geladeira. Aps um ms, aumentar o tempo de colorao.
Procedimento: 1- Desparafinizar e hidratar os cortes at a gua destilada. 2- Corar por 5 minutos pela hematoxilina de Mayer. 3- Lavar em gua corrente por 5 minutos. 4- Lavar em gua destilada por 2 minutos. 5- Passar pelo lcool 70% por 3 minutos. 6- Corar pela soluo de sirius red pH 10,2 por 1 hora ou mais. 7- Lavar em gua corrente por 10 minutos. 8- Desidratar, clarificar e selar. Resultados: Grnulos do eosinfilos......................................vermelho Ncleos..............................................................azul
Mtodo de Fite (Fite, 1947)
Solues: A) Vaselina terebentina: Terebentina......................................................70 mL Vaselina...........................................................30 mL ou Soluo de leo de Anilina - Xilol: leo de anilina..................................................30 mL Xilol..............................................................70 mL
B) Soluo de carbol-fucsina de Ziehl-Neelsen: Fenol, cristais fundidos........................................2,5 mL Etanol absoluto...................................................5 mL Fucsina bsica.....................................................0,5 g gua destilada..................................................50 mL Primeiro, deve-se dissolver a fucsina bsica no etanol, juntar o fenol e, por ltimo, adicionar a gua destilada. Esta soluo deve ser filtrada. C) Soluo de lcool-cido a 1%: cido clordrico..................................................1 mL lcool etlico (etanol) a 70%................................99 mL D) Soluo estoque de azul de metileno: Azul de metileno.................................................1,4 g Etanol a 95%.................................................100 mL E) Soluo de trabalho de azul de metileno: Soluo estoque de azul de metileno........................10 mL gua destilada...................................................90 mL cido actico glacial............................................0,5 mL Procedimento: 1- Desparafinizar as lminas em 2 trocas, de 10 minutos cada, em soluo de vaselina terebentina ou leo de anilina xilol em estufa 60oC. Lembrar-se de que essas solues devem estar a 60oC antes de imergir as lminas.
2- Deixar os cortes secarem ao ar por 15 minutos. O filme de leo remanescente prevenir a retrao e os danos aos cortes. 3- Corar na soluo filtrada de carbol-fucsina de Ziehl-Neelsen por 30 minutos. 4- Lavar em gua de torneira por 10 minutos. 5- Diferenciar os cortes na soluo de lcool-cido a 1% at que fiquem rosa-plidos. 6- Lavar em gua corrente por 3 minutos. 7- Contracorar com a soluo de trabalho de azul de metileno por 30 segundos a 1 minuto. 8- Enxaguar, em gua de torneira, o excesso de soluo de trabalho de azul de metileno. 9- Desidratar os cortes rapidamente, em 2 trocas cada, em etanol a 95% e etanol absoluto. 10- Clarificar em xilol; 2 trocas de 2 minutos cada. 11- Selar. Resultados: Bacilos da lepra e outros cido resistentes...............vermelho. Fundo....................................................... azul-plido.
Mtodo do mucicarmim (Southgate, 1927)
Solues: A) Soluo estoque mucicarmim de Southgate: Carmim...............................................................1 g Hidrxido de alumnio.............................................1 g
Etanol a 50%........................................................100 mL Cloreto de alumnio, anidro..............................................5 g Faa essa soluo em banho-maria. Quando frio, filtre. B) Soluo de trabalho de mucicarmim de Southgate: Soluo-estoque de mucicarmim de Southgate...............10 mL gua destilada..................................................90 mL C) Soluo de trabalho de hematoxilina frrica de Weigert: Partes iguais das solues estoque A e B (100 mL de A + 100 mL de B). Ver o mtodo de colorao pela tricromtica de Masson. D) Soluo de amarelo metanil a 0,25%: Amarelo metanil.......................................................0,25 g gua destilada........................................................100 mL cido actico glacial................................................0,25 mL Procedimento: 1- Desparafinizar e hidratar at a gua destilada. 2- Deixar na soluo de trabalho de hematoxilina frrica de Weigert por 7 minutos. 3- Lavar em gua corrente de torneira por 10 minutos. 4- Corar na soluo de trabalho de mucicarmim de Southgate por 30 minutos e descart-la aps o uso. 5- Enxaguar rapidamente em gua destilada.
6- Contracorar na soluo de amarelo metanil por 1 minuto. 7- Desidratar a partir do etanol 95%. 8- Clarificar e selar. Resultados: Mucina......................................................rosa-escuro Cpsula de Cryptoccocus sp............................ rosa-escuro Ncleos............................................................preto Fundo............................................................amarelo Mtodo de Feulgen para DNA (Feulgen e Rossenbeck, 1924) Solues: A) cido clordrico 1N: cido clordrico................................................8,3 mL gua destilada...............................................91,7 mL B) Metabissulfito de sdio 0,5%. C) Reagente leuco fucsina de Schiff (ver mtodo do cido peridico + reativo de Schiff (PAS)). Procedimento: 1- Desparafinizar e hidratar dos cortes at a gua destilada. 2- Lavar os cortes em cido clordrico 1N em temperatura ambiente.
3- Transferir para o cido clordrico 1N pr-aquecido, a 60oC para hidrolisar os cortes. O tempo de hidrlise depende do fixador utilizado:
Formaldedo = de 8 a 12 minutos. Bouin = de 5 a 8 minutos. Helly = em torno de 5 minutos.
4- Transferir para a soluo o reagente leuco fucsina de Schiff durante 45 minutos. 5- Lavar em 3 banhos de metabissulfito de sdio 0,5%, de 2 minutos. 6- opcional contracorar com light green 1% durante 1 minuto. 7- Desidratar, clarear e montar. Resultados: DNA.................................................. vermelho-prpura Citoplasma.........................................................verde
Mtodo de Colorao pelo alcian blue em pH 2,5
(Lev. e Spicer, 1964). Solues: A) Soluo de cido actico glacial a 3%. B) Soluo de alcian blue:
alcian blue, 8GX.................1 g

Soluo de cido actico a 3%............................100 mL
C) Soluo de nuclear fast red (kernechtrot):
Nuclear fast red (kernechtrot) ................0,1 g

Soluo de sulfato de alumnio a 5% .....................100 mL Aquea a soluo lentamente, at ferver. Esfriar e filtrar. Acrescente timol para preservar. Procedimento: 1- Desparafinizar e hidratar at gua destilada. 2- Colocar em soluo de cido actico glacial a 3% e deixar por 3 minutos. 3- Corar na soluo de alcian blue por 30 minutos. 4- Lavar em gua corrente por 10 minutos. 5- Enxaguar em gua destilada. 6- Contracorar com a soluo de nuclear fast red filtrada por 5 minutos. 7- Lavar em gua corrente por 1 minuto. 8- Desidratar, clarificar e selar. Resultados: Mucossubstncias cidas sulfatadas e carboxiladas......... azul escuro Ncleos................................................vermelho a rosa Citoplasma...................................................rosa-plido
Mtodo de colorao pelo alcian blue, pH 1,0
(Lev e Spicer, 1964) Solues: A) Soluo de cido clordrico 1N: cido clordrico..............................................83,5 mL gua destilada..............................................916,5 mL B) Soluo de cido clordrico 0,1 N: Soluo de cido clordrico 1N..............................10 mL gua destilada..................................................90 mL C) Soluo de alcian blue:
Alcian blue, 8GX...................1 g

Soluo de cido clordrico 0,1 N........................100 mL Procedimento: 1- Desparafinizar e hidratar as lminas at gua destilada. 2- Colocar na soluo cido clordrico 0,1N e deixar por 3 minutos. 3- Corar pela soluo de alcian blue por 30 minutos. 4- Retirar o excesso de corante com papel de filtro. No enxaguar em gua. 5- Desidratar, clarificar e selar. Resultados: Mucossubstncias sulfatadas .....................................azul-escuro
Notas de biossegurana Ao manipular vrios produtos qumicos para os mtodos de colorao, use mscara com filtro prprio para vapores orgnicos, em local arejado e com exausto. O preparo dessas solues deve ser feito em capela de exausto, evitando sempre o contato com a pele ou a vias respiratrias. Observe a ficha de segurana de cada produto qumico utilizado para os mtodos de colorao, muitos so danosos sade se inalados, engolidos, ou se entrarem em contato com a pele. Nunca descarte as solues corantes ou qualquer soluo preparada para o desenvolvimento das coloraes em esgoto sanitrio convencional, procure saber a poltica de descarte de produtos txicos de sua instituio.
7. Tcnicas imuno-histoqumicas
Os corantes auxiliam o estudo histolgico das caractersticas qumicas teciduais e, no caso de algumas coloraes especiais, destacam regies especficas do tecido ou at mesmo classes de protenas. Contudo, para se identificar alguns elementos teciduais, em situaes normais ou patolgicas, preciso reconhecer certas protenas especficas, o que no possvel por meio das tcnicas histoqumicas. Para tal, recomenda-se a utilizao de mtodos imunohistoqumicos, que, como o prprio nome sugere, renem conhecimentos prprios da imunologia, histologia e qumica. A imuno-histoqumica se baseia na capacidade de certas substncias com afinidade especfica para determinados elementos, isto , anticorpos. Os anticorpos, ao reconhecerem especificamente uma protena-alvo, possibilitam a identificao molecular de elementos teciduais com observao nos diferentes tipos de microscpio. A imuno-histoqumica tem diversas aplicaes como mtodo de auxlio ao diagnstico de doenas inflamatrias, infecciosas e neoplasias, alm de ser utilizada para determinar fatores preditivos e prognsticos no cncer.
O que so anticorpos?
Os anticorpos (Ac) ou imunoglobulinas (Ig) so um grupo especial de glicoprotenas produzidas naturalmente por clulas do sistema imunolgico de diversas espcies animais e so classificados em cinco isotipos (tipos de imunoglobulinas): IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. O antgeno uma substncia que, em condies apropriadas, capaz de estimular a produo de um determinado anticorpo. Quando um antgeno originrio, por exemplo, de bactrias, fungos, vacinas, penetra no organismo, ele reconhecido como elemento estranho, desencadeando uma srie de eventos, como a produo de anticorpos que reconhecero especificamente esse antgeno. O reconhecimento do antgeno pelo anticorpo ocorre de duas formas: qumica, pela afinidade entre essas molculas; e estrutural, pois os anticorpos possuem uma estrutura tridimensional que se adapta perfeitamente estrutura do antgeno, realizando uma ligao designada chave-fechadura. Ao se introduzir um antgeno especfico em um animal, este reagir contra esse antgeno e, aps um determinado tempo, ser possvel isolar anticorpos que reconheam o antgeno do soro desse animal. Os anticorpos so utilizados para determinar a presena desse antgeno em um tecido de outro animal. Atualmente, os anticorpos comercializados por grandes empresas so obtidos a partir de diferentes animais, como, por exemplo: camundongo, rato, coelho, macaco, porco, dentre outros, utilizando metodologias avanadas.
Aplicabilidade do uso de anticorpos
Os anticorpos podem ser utilizados em clulas em cultura, ou em cortes histolgicos de tecidos processados segundo a tcnica de incluso em parafina, em cortes obtidos pelo mtodo de congelao ou ainda includo em resina.
importante notar que, independentemente do mtodo de processamento histolgico, deve-se ter o cuidado de preservar o antgeno no tecido, evitando modificaes na sua conformao tridimensional ou na composio qumica. A preservao adequada dos antgenos depende de uma boa fixao e de um bom processamento. O fixador utilizado em imuno-histoqumica deve ser capaz de preservar tanto a morfologia tecidual quanto o antgeno, alm de impedir sua extrao e deslocamento durante o processamento do material. No existe o fixador ideal; porm, deve-se conhecer o mecanismo de ao tecidual de cada soluo fixadora para escolher o mtodo de fixao mais adequado. O formol, assim como os demais fixadores aldedicos, ao estabelecer ligaes cruzadas com as protenas teciduais, torna as protenas insolveis na forma de um gel. Essas ligaes formam uma malha que pode impedir a ligao do anticorpo ao antgeno tecidual, alm de mudar a configurao tridimensional dos antgenos. Quanto maior o tempo de fixao, isto , o tempo em que um determinado tecido submetido ao fixador, mais pontes sero formadas. Por essa razo, importante controlar o tempo de fixao necessrio para preservar as estruturas teciduais. Para haver reao entre o antgeno e o anticorpo em materiais fixados por aldedos, necessrio desmascarar os antgenos, desfazendo as pontes intermoleculares formadas durante a fixao. Com esse objetivo, utiliza-se um procedimento denominado recuperao antignica. Existem diversos mecanismos para se recuperar os antgenos em um tecido. A escolha do mtodo ideal depende do tipo de tecido a ser analisado e da prtica do laboratrio. Os principais mtodos de recuperao antignica so:
Mtodo enzimtico, empregando-se enzimas como a tripsina ou pepsina.
Mtodo fsico-qumico por aquecimento, utilizando-se panela de pres-
so, panela a vapor, banho-maria e micro-ondas, devendo o material ser imerso em uma soluo de tampo citrato ou tris-EDTA.
Mtodo fsico-qumico por sonicao5, isto , realiza-se a sonicao
em tampo citrato ou tampo tris-EDTA. A reao imuno-histoqumica deve ocorrer em temperatura e pH controlados. Por essa razo, as lminas devem ser mantidas em estufa ou geladeira durante o procedimento e os cortes cobertos por uma soluo tamponada. Temperaturas elevadas aceleram a reao entre antgeno e anticorpo, embora diminuam a especificidade do anticorpo ao antgeno. Temperaturas mais baixas diminuem a velocidade da reao, aumentando tal especificidade. Geralmente, na rotina laboratorial, utilizam-se estufas reguladas a 37C em um tempo de reao de 1 hora, ou geladeira a 4C em um tempo de reao de um dia para o outro (over night). A reao imuno-histoqumica tambm pode variar dependendo do pH do meio em que a reao ocorre. Assim, utiliza-se uma soluo de tampo fosfato (PBS) ou tampo tris (TBS) em pH 7,0 para recobrir os cortes durante as lavagens ou para diluir as demais solues. Tampo fosfato (PBS) pH 7,2 0,1M: Fosfato de sdio, dibsico (Na2HPO4), anidro..................1,48 g Fosfato de sdio, monobsico (NaH2PO4), anidro..............0,43 g Cloreto de sdio (NaCl)..............................................7,2 g gua destilada......................................................1000 mL
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Sonicao o procedimento que utiliza a energia das ondas sonoras, mais comumente o ultrassom, aplicado sobre determinados sistemas qumicos.
Outro fator que influencia a reao a concentrao do anticorpo. Os anticorpos devem estar diludos em uma concentrao que permita o reconhecimento do antgeno pelo seu respectivo anticorpo, sem haver perda de sua especificidade. Para se encontrar a diluio ideal de cada anticorpo, deve-se proceder a um teste utilizando-se um controle positivo, isto , um material que se tenha conhecimento prvio da sua positividade ao anticorpo que se deseja testar. Assim, usam-se diversas diluies at se encontrar a diluio onde a marcao seja bem evidente e no haja reao inespecfica de modo a mascarar a reao. Para visualizar a reao, os anticorpos devem estar marcados com alguma substncia capaz de exibir cor. Em geral, utiliza-se um anticorpo associado a enzimas que, em etapa posterior, reagiro com substncias cromgenas, ou anticorpos diretamente associados a fluorforos, radioistopos ou ouro coloidal. A tcnica enzimtica mais usual na rotina laboratorial utiliza vrias substncias. Inicialmente, empregam-se anticorpos associados a uma vitamina chamada biotina (anticorpo biotinilado). Esse anticorpo reage com a estreptavidina, uma protena que possui quatro stios de ligao. A estreptavidina que se encontra complexada a trs molculas de biotina ligadas enzima peroxidase reconhecer, atravs de um stio vazio, a biotina presente no anticorpo secundrio. A peroxidase reage com o perxido de hidrognio na presena de 3,3-diaminobenzidina (DAB), que funciona como um doador de eltrons para a reao. O DAB reduzido se precipita no local da reao, sendo o produto dessa reao visualizado como um precipitado castanho (Figuras 25 e 26).
Figura 25. Repesentao da tcnica imuno-histoqumica indireta. O antgeno presente no tecido reconhecido pelo anticorpo primrio. Um anticorpo secundrio biotinilado se liga ao anticorpo primrio. A estreptavidina se ligar por meio do seu stio livre biotina, que est associada a peroxidase. Uma soluo contendo perxido de hidrognio reage com a peroxidase na presena do DAB, formando um precipitado insolvel castanho no local da reao.
H2O2+DAB H2O2+DAB
Figura 26. Tcnica imuno-histoqumica indireta utilizando o mtodo de estreptavidina biotina-peroxidase revelada por DAB.(A) Marcao nuclear identificando o receptor de progesterona. (B) Marcao citoplasmtica identificando a desmina.
Existem outros mtodos enzimticos, assim como outros cromgenos, que so relatados em literatura mais especfica. Pode-se tambm utilizar anticorpos associados a fluorforos. As primeiras tcnicas imuno-histoqumicas descritas utilizavam fluorforos associados a anticorpos como marcadores, e so utilizadas at hoje. Diversas substncias so utilizadas com este propsito, como FITC (isotiocianto de florescena), TRICT (isotiocianato de tetrarodamina), Alexa 488, Cy5, dentre outras, mas necessitam de um microscpio de fluorescncia para visualizar a reao, o que torna por vezes esta tcnica mais onerosa. Normalmente, os anticorpos que fazem ligao com os antgenos teciduais (anticorpos primrios) no esto associados a enzimas ou fluorforos. Dessa forma, para visualiz-los, utilizam-se anticorpos secundrios complexados peroxidase ou a fluorforos. Assim, denomina-se esse mtodo como mtodo indireto. Contudo, h anticorpos primrios comerciais j associados com enzimas, e, por essa razo, chama-se esse tipo de reao mtodo direto. A marcao direta diminui o risco de reaes inespecficas pela diminuio de etapas, em contraste com reaes indiretas, que amplificam o sinal facilitando a identificao dos antgenos. Mesmo com o cuidado na escolha da concentrao adequada dos anticorpos e na manuteno da temperatura e do pH, podem ocorrer reaes inespecficas com componentes teciduais carregados eletricamente ou com receptores de imunoglobulinas teciduais. Podemos eliminar essa marcao recobrindo esses stios inespecficos antes da reao com uma soluo contendo albumina e um soro. Soluo de bloqueio de stios inespecficos : PBS....................................................................200 mL Leite em p desnatado....................................................5 g Filtrar a soluo.
Soluo de uso: Filtrado de leite 2,5%...............................................100 mL Albumina bovina.........................................................2,0 g Soro fetal bovino........................................................8 mL Guardar soluo em geladeira. Outro elemento capaz de causar reaes inespecficas a peroxidase endgena tecidual. Esse problema s ocorre quando o mtodo escolhido o enzimtico, pois o substrato cromgeno reagir tanto com a peroxidase ligada ao anticorpo da reao quanto com a peroxidase tecidual. Nesse caso, devemos inibir a ao da enzima, utilizando uma soluo de perxido de hidrognio (H2O2) 3%. Para garantir a sua qualidade, sempre importante incluir um controle positivo e controle negativo da reao. O controle positivo obtido com um material que sabidamente possui o antgeno analisado. Esse material permitir confirmar, por sua marcao positiva, a qualidade da reao, caso as lminas testadas forem negativas. O controle negativo feito omitindo-se o anticorpo primrio nas lminas testadas, ou utilizando o mesmo isotipo do mesmo animal no qual foi produzido o anticorpo primrio. Assim, com esses cuidados, o resultado da reao permite garantir que as demais etapas da reao no esto reconhecendo inespecificamente nenhum componente tecidual. A seguir, segue uma sugesto de protocolo de reao indireta para material includo em parafina. Nesse procedimento, utiliza-se a panela de presso como equipamento para auxiliar na etapa de recuperao antignica e um anticorpo secundrio biotinilado, isto , associado biotina.
Protocolo: 1- Aps confeccionar os cortes e aderi-los em lminas previamente tratadas com adesivo, deixar o corte aderir lmina por um dia em estufa 37 oC. 2- Desparafinizar e hidratar as lminas, deixando-as por 5 minutos em cada banho nas respectivas solues (ver pretapa da colorao). 3- Colocar cerca de 2 litros de tampo citrato em pH 6,0 em uma panela de presso. Deixar esquentar e, quando o tampo estiver fervendo, colocar as lminas imersas no tampo e fechar a panela. Quando a panela comear a apitar, deixar por mais 1 minuto e apagar o fogo. Aliviar a presso pela vlvula de segurana da panela e deixar a panela destampada para esfriar um pouco a soluo (cerca de 10 minutos). Aps esse tempo, lavar os cortes em gua corrente por mais 10 minutos. 4- Lavar as lminas por 10 minutos em PBS (tampo fosfato de sdio 0,1M em pH 7,2) trocando o tampo por duas vezes. 5- Incubar com anticorpo primrio de um dia para o outro ( over night) em geladeira a 4C. Cobrir os cortes delicadamente com o anticorpo, mantendo as lminas em cmara mida. 6- Lavar as lminas em PBS em trs banhos consecutivos de 5 minutos. 7- Incubar as lminas por 20 minutos em uma soluo de perxido de hidrognio 3% em PBS. 8- Lavar as lminas em PBS em trs banhos consecutivos de 5 minutos.
9- Incubar com anticorpo secundrio biotinilado por 1 hora em estufa a 37C. Cobrir os cortes delicadamente com o anticorpo, mantendo as lminas em cmara mida. 10- Lavar as lminas em PBS em 3 banhos consecutivos de 5 minutos. 11- Incubar com a estreptavidina-peroxidase por 30 minutos em cmara mida, em temperatura ambiente. 12- Lavar as lminas em PBS em 3 banhos consecutivos de 5 minutos. 13- Incubar as lminas em uma soluo contendo 10mg de DAB diludos em 10 mL de PBS e cerca de 150 mL de perxido de hidrognio 3%. Controlar o tempo de reao ao microscpio, observando o precipitado castanho se formar nos locais onde o anticorpo reagiu. Essa reao pode durar em torno de 3 minutos. 14- Lavar as lminas em gua por 5 minutos. 15- Contracorar as lminas em hematoxilina diluda por 30 segundos. 16- Lavar as lminas em gua corrente por 5 minutos. 17- Desidratar, clarificar e montar. Importante: nunca deixe secar os cortes durante a reao imuno-histoqumica! Notas de biossegurana Durante o procedimento, tomar os cuidados citados anteriormente para o manuseio do xilol e do lcool. Manusear a panela de presso com cuidado para evitar queimaduras ou exploses. Como o DAB um produto altamente txico e tem potencial carcinognico por exposio prolongada, evite respirar o p seco e o contato com a pele ou mucosas e sempre utilize luvas
e jaleco durante a manipulao. Esse elemento tambm txico para o meio ambiente, despreze a soluo de DAB num frasco plstico e adicione 10 mL de hipoclorito de sdio para cada 100 mL dessa soluo. Procure saber a poltica de descarte de substncias prejudiciais ao meio ambiente de sua instituio.
8. Meios de selagem
Os meios de selagem, comumente chamados montagem, podem ser permanentes ou provisrios. Os meios permanentes so meios resinosos e hidrofbicos, sendo necessria a completa remoo da gua do interior dos tecidos pela desidratao e pela clarificao com o diluente do meio de selagem. Os meios provisrios so meios hidroflicos e no necessitam da remoo da gua dos tecidos, sendo os preparados descartados aps a observao ao microscpio. Meios de selagem hidrofbicos e permanentes Esses meios podem ser sintticos, como o DPX e o Entelan, ou naturais, como o blsamo do Canad ou a goma de Damar. Existem vrios protocolos para diluio desses meios. Citaremos apenas o da goma de Damar. Goma de Damar.................................................200 g Xilol.............................................................100 mL Misturar, e esperar dissolver. Acrescentar mais goma ou xilol caso se queira uma textura mais ou menos viscosa.
Meios de selagem hidroflicos ou provisrios
Esses meios so utilizados quando os corantes aplicados perdem a sua capacidade tintorial, ou mesmo quando o contedo de determinadas estruturas teciduais se altera quando os tecidos so submetidos a desidratao ou aos meios de selagem que tem o xilol como diluente. A seguir, citamos um dos meios de selagem hidroflicos mais utilizados, a gelatina - glicerina, por ser de baixo custo e de fcil aplicao. Gelatina............................................................10 g gua destilada..................................................60 mL Aquea at que a gelatina esteja dissolvida. Acrescente, depois, 70 mL de glicerina.
9. Artefatos de tcnica
So alteraes das imagens de tecidos quando os preparados histolgicos so observados ao microscpio. Isso pode ocorrer devido a manipulaes fsicas ou qumicas durante as etapas da tcnica histolgica. Os artefatos, por exemplo, podem ser ocasionados por:
dente na navalha de corte, causando fendas; talco na luva utilizada pelo tcnico; precipitado de corantes ou mesmo pigmentos que se depositaram
sobre o tecido;
retrao ou intumescimento tecidual provocado por algum componen-
te qumico do fixador;
autlise associada proliferao bacteriana devido demora em se
fixar o material;
fragmentao e/ou rachadura do tecido provocada por elevao da
temperatura da parafina durante o processamento.
dobras no tecido formadas durante a microtomia; bolhas provocadas durante a selagem da lamnula sobre o preparado
histolgico.
Referncias bibliogrficas
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Captulo 4
Tcnicas citolgicas
Luzia Ftima Gonalves Caputo Ester Maria Mota Lycia de Brito Gitirana
A tcnica citolgica tambm faz parte da histotecnologia e possui grande importncia no diagnstico de algumas doenas que acometem os seres humanos e os animais. Essa uma ferramenta fundamental no diagnstico de tumores, funo hormonal e infeces parasitrias. O exame colpocitolgico, conhecido como Papanicolaou, utilizado para detectar, nas mulheres, tumores de colo de tero. Seu idealizador, dr. George N. Papanicolaou, estabeleceu em 1942 os conceitos bsicos de interpretao citolgica e criou um mtodo de colorao citolgica que utilizado, universalmente, at hoje. A citopatologia analisa as clulas individualizadas, descamadas, expelidas ou retiradas da superfcie de rgos de diferentes partes do organismo. Como os materiais biolgicos apresentam diferentes caractersticas, devido s distintas formas de organizao e composio, a coleta do material destinado anlise citolgica constitui uma etapa fundamental nesse processo. H mtodos especficos para coleta de materiais distintos. Alm disso, nessa fase, so definidos os tipos de procedimentos mais adequados anlise dos preparados citolgicos.
Algumas etapas da tcnica citolgica so semelhantes s da tcnica histolgica, mas com peculiaridades prprias, podendo tambm haver considerveis interferncias na qualidade final do diagnstico, como coleta do material, fixao, processamento, colorao e leitura das lminas citolgicas.
1. Coleta de material
A origem das amostras dos preparados histolgicos vem de fragmentos de tecidos oriundos de necrpsias e bipsias. Nos preparados citolgicos, essa origem um pouco mais diversificada, proveniente de lquidos orgnicos (urina, lquor, lquido asctico, pericrdico, sinovial), punes aspirativas por agulha fina (pulmo, mama, tireoide, linfonodos, dentre outros), secrees (escarro, abscesso e fstula), lavados cavitrios (brnquicos e broncoalveolares, vesiculares) e raspados (cervicovaginal, ocular). Segundo suas caractersticas, as amostras so divididas em trs grupos, e chegam ao laboratrio para anlise da seguinte forma: Classificao da amostra Disteno celular (esfregao) Mtodo de coleta Raspagem swab (Figura 11) Origem da amostra Colpocitologia Olhos Lavado brnquico Leses cutneas Bipsias Peas cirrgicas Puno aspirativa Sangue Lavado brnquico Lquor espinhal
Imprint ou decalque
Tcnicas Citolgicas | 191
Amostras pastosas
Expectorao Puno ou drenagem
Escarro (Figura 6) Abscessos Massas necrticas Urina Lquido sinovial Lquido peritoneal ou asctico Lquido pleural Lquido peritoneal ou asctico Lquido pericrdico
Amostras lquidas
Espontnea ou por cateter Escovao Escovao ou lavado
Puno
Lavado brnquico alveolar Lavado vesical Lquido estomacal Lavado brnquico Lquido sinovial
A natureza da amostra (lquida, pastosa ou slida) ir definir a forma de coleta e preparo do material segundo as etapas da tcnica citolgica escolhida. Distenso celular (esfregao),(Figuras 1, 3, 8, 9, 10 e 11): feita ao se distender sobre uma lmina de vidro uma leve camada de fluidos corpreos para o exame ao microscpio. Lavado: o material colhido com o auxlio de um cateter de instilao para lavagem, contendo soluo salina, de uma cavidade do organismo. Exemplos: lavado broncoalveolar (LBA), brnquico (LB), peritoneal, entre outros. Geralmente os lavados se apresentam pouco celulares.
Escovados (Figuras 1, 2, 3 e 4): o material colhido por esfoliao da superfcie de mucosas, utilizando-se uma escova. O material obtido pode ser distendido sobre a superfcie de uma lmina de vidro, ou cortando-se a cabea da escova e imergindo-a em soluo salina ou em lquido conservante apropriado, procedendo-se em seguida citologia de lquidos. Impresses teciduais (imprint) (Figura 5): denomina-se impresses teciduais o procedimento em que se coloca a rea lesionada do tecido em contato com a superfcie de uma lmina de vidro lisa, de forma semelhante ao procedimento para se obter impresso digital. As clulas superficiais da leso passam para a superfcie da lmina de vidro e podem ser observadas ao microscpio. Esse procedimento tambm denominado citologia de decalque. Figura 1. Coletores para citologia esfoliativa. Figura 2. Escovado cervicovaginal.
Figura 3. Disteno citolgica pela esptula de Ayre.
Figura 4. Fixao de escovado citolgico.
Figura 5. Impresso tecidual em lminas (imprint).
Figura 6. Escarro espontneo ou induzido para coleta de material.
2. Fixao das amostras
O principal objetivo da fixao preservar a morfologia celular e a composio qumica das clulas aps a sua retirada do organismo.
Tipos de fixao
A. Fixao seca Esse tipo de fixao utilizado quando se realiza a colorao de MayGrnwald-Giemsa, pois o metanol presente na soluo corante age como fixador. o tipo de fixao utilizada para distenso de clulas sanguneas, imprint de bao, gnglios linfticos, entre outros. B. Fixao por revestimento usada na obteno dos esfregaos citolgicos. Os fixadores so constitudos de polietilenoglicol (Carbowax) e lcool, comercialmente vendidos na forma lquida ou em spray. As amostras so fixadas pelo gotejamento do fixador ou pela pulverizao do aerossol das embalagens em spray (Figura 7), sendo secas temperatura ambiente, pois o lcool fixa e evapora, enquanto o polietilenoglicol forma uma pelcula que protege e preserva a amostra. Existem vrios protocolos para este tipo de fixador; citaremos um dentre os vrios que existem na literatura.
Carbowax em etanol 95% Etanol 95%.............................................................95 mL Polietilenoglicol 4000......................................................5g Lembrar: antes de corar as amostras fixadas em Carbowax, banh-las em etanol 95% por 10 minutos para remover a pelcula de polietilenoglicol. Figura 7. Fixao por revestimento.
C. Fixao por lquidos fixadores O fixador citolgico universal o etanol 95%, um agente coagulante, que penetra na clula desidratando-a e intensificando a diferenciao nuclear e citoplasmtica aps a colorao. Outros fixadores, como o Carnoy, metanol, lcool isoproplico 80%, etanol 50%, lquido de Bouin, dentre outros, tambm podem ser utilizados como fixadores celulares, variando a escolha e o tempo de fixao de acordo com natureza da amostra.
Processamento 3. Processamento das amostras
O acondicionamento do material essencial para evitar a perda de contedo. A identificao da amostra e o preenchimento correto da ficha de solicitao mdica (contendo o nome do paciente, idade, data da coleta, natureza da amostra e sua localizao, tipo de exame requerido, dados clni-
cos, nome do mdico requisitante e telefone) so informaes relevantes para evitar o extravio do material. O processamento da amostra requer procedimentos especficos de acordo com a natureza do material a ser analisado. Descreveremos aqui alguns desses procedimentos. A. Distenso celular (Figuras 1, 3, 8, 9, 10 e 11): geralmente, a distenso chega ao laboratrio pronta, tendo sido manipulada pelo clnico ou cirurgio e fixada em etanol 95%. Na maioria das vezes, quando a distenso chega seca, o material destinado colorao pelo mtodo de May-GrnwaldGiemsa e, dependendo da amostra, pode-se ou no fixar pelo metanol durante cinco minutos. Deve-se preparar esse tipo de amostra de modo a formar uma fina camada de clulas, permitindo assim melhor diferenciao celular. Distenses espessas produzem artefatos e hipercoram as clulas dificultando sua anlise. Figura 8. Distenso celular. Figura 9. Distenso aps bipsia por agulha.
Figura 10. Formas de distenso celular. Figura 11. Distenso celular por swab.
Forma espiral Forma ondulada
Forma em distenso
Forma de espalhamento
B. Amostras pastosas: devem ser analisadas antes de processadas para a anlise. Coloca-se o material em uma placa de Petri com fundo escuro e selecionam-se as regies mais densas, escuras e/ou sanguinolentas. Essas reas so colocadas sobre lminas de vidro para distender, obtendo-se uma camada de clulas (distenso celular) e fixando o material imediatamente em etanol 95% (Figura 8). C. Amostras lquidas: so as amostras que possuem maior diversidade de procedimentos, dependendo do tipo de amostra. Citaremos aqui os mais utilizados: Lquidos, como urina, lavados, derrames de cavidades e lquido sinovial podem ser pr-fixados em etanol 50%, ou enviados imediatamente ao laboratrio aps a coleta, podendo ser tambm conservados a 4C at o envio. O uso de anticoagulantes deve ser avaliado de acordo com o tipo de material coletado. As amostras lquidas subdividem-se em dois grupos:
Transudatos: so pouco celulares e de cor clara. Exsudatos: so ricos celularmente, escuros, de natureza neoplsica ou
inflamatria. Estas amostras podem ser processadas de acordo com sua riqueza celular, por meio da centrifugao (Figura12) ou citocentrifugao (Figuras 13 e 14). Centrifugao preferida quando o material se apresenta hipercelular. Procedimento: 1- Colocar o lquido em tubos Falcon com tampa. 2- Centrifugar a 1.500 rpm por 10 minutos. 3- Descartar o sobrenadante. 4- Aspirar o sedimento com pipeta Pasteur. 5- Colocar o sedimento em lminas limpas e desengorduradas e proceder distenso celular.
6- Deixar secar ao ar e /ou fixar em lcool 95% imediatamente; a secagem ao ar necessria se o mtodo de colorao for o May-Grnwald-Giemsa. Observao: As amostras podero vir em tubos com anticoagulante ou no. Figura 12. Procedimento para centrifugao
Citocentrifugao Possibilita a anlise citolgica de lquidos com baixssima densidade celular (hipocelulares). Esse mtodo necessrio para concentrar as clulas em suspenso, que com a centrifugao se depositam diretamente sobre uma regio das lminas de vidro, perfazendo um dimetro de 5 mm, enquanto o meio de suspenso absorvido por papel absorvente prprio.
Figura 13. Utenslios para citocentrifugao.
Vantagens: Requer pouco volume (0,1 a 0,5 mL por lmina). Alta confiabilidade do resultado: as clulas da amostra sero depositadas numa regio pequena da lmina medindo 5 mm de dimetro. Procedimento:
1- Pipetar 0,5 mL da amostra no citofunil, previamente
acoplado ao citoclipe, lmina e ao papel absorvente.

2- Centrifugar a 1.200 rpm por 10 minutos. 3- Retirar o conjunto e desacoplar a lmina. 4- Deixar secar ao ar e/ou fixar em lcool 95% imediatamen-
te. Se o mtodo de colorao for o May-Grnwald-Giemsa, deixar secar ao ar.
Figura 14. Procedimento para citocentrifugao.
D. Bloco celular ou cell block (Figura 14) um procedimento que rene as tcnicas citopatolgicas e histopatolgicas e utilizado quando se deseja obter uma alta concentrao celular, complementando o diagnstico, com a vantagem de aproveitar todo o sedimento da amostra, alm de permitir a armazenagem desse sedimento para futuras anlises, se necessrio. Essa tcnica empregada em citodiagnstico de amostra lquida ou pastosa, quando h dificuldade para fechar diagnstico de tumores pouco diferenciados.
Fixao vrios so os fixadores utilizados para o cell-block, alguns inclusive adicionam corantes para facilitar a visualizao da amostra durante e aps o processamento. Destacamos alguns fixadores a seguir:
Formalina 10%:
Formaldedo comercial..........................................100 mL gua destilada ..................................................900mL

Formol-Salina:
Formaldedo comercial.........................................100 mL gua destilada..................................................900 mL Cloreto de sdio (NaCl).........................................9 g

AFA ou FAA lcool - formalina - cido actico (muito
utilizado para cell-block): Etanol (95 - 100%)..........................................85 mL Formaldedo comercial .........................................10 mL cido actico glacial.............................................5 mL
Carnoy:
lcool etlico absoluto.........................................60 mL Clorofrmio.......................................................30 mL cido actico glacial............................................10 mL

Lquido de Bouin:
Soluo saturada de cido pcrico (aquosa).................75 mL Formaldedo comercial...........................................25 mL cido actico glacial.............. ...............................5 mL Tempo de fixao: 4-24 horas. (para linfoma deve-se deixar de 48-72 horas).
Tratamento prvio dos cortes para a remoo do cido pcrico: 1- Desparafinizar e hidratar at o lcool 95%. 2- Colocar as lminas em uma soluo de lcool 70% saturado com carbonato de ltio durante 5 minutos. 3- Lavar em gua corrente durante 3 minutos. 4- Lavar em gua destilada durante 5 minutos. E. B-5 ou formalina tamponada sublimada: Muito utilizada para amostras contendo sangue. Soluo estoque: Cloreto de mercrio (HgCl2).........................................12 g Acetato de sdio (CH3COONa) .................................2,5 g gua destilada........................................................200 mL Soluo de uso (preparar somente antes do uso): Soluo estoque de B-5..............................................20 mL Formaldedo comercial...................................................2 mL Tratamento prvio dos cortes para remoo de pigmento de mercrio: 1- Desparafinizar e hidratar os cortes 2- Imergir durante 5 minutos na soluo de lugol sob agitao. 3- Lavar em gua. 4- Colocar as lminas em tiossulfato de sdio 5% por 1 minuto ou at a completa remoo da cor amarela do Iodo. 5- Lavar em gua corrente durante 5 minutos.
Soluo de lugol: Iodo (I2)...........................................................2,5 g lcool 70%....................................................500 mL Procedimento para cell-block:

1- Centrifugar as amostras por 10 minutos a 1.000 rpm. 2- Desprezar o sobrenadante, retirar o sedimento e fixar as amos-
tras de 5 minutos a 1 hora o tempo de fixao pode variar de acordo com o fixador e a quantidade da amostra. Proceder fixao colocando o sedimento no lquido fixador que se encontra em frasco apropriado para sedimentao.
3- Centrifugar novamente por 2 minutos na mesma rotao, reti-
rar o fixador e manter o sedimento formando um pellet.

4- Iniciar a desidratao com etanol 80% e seguir com um banho
de etanol 95% e dois banhos de etanol 100%. O tempo de desidratao tambm varia de acordo com a quantidade da amostra, podendo variar de 5 minutos at 1 hora em cada banho. Centrifugar durante poucos minutos em cada banho. Obs. Esta etapa e as seguintes podem ser realizadas no processador automtico de tecidos, desde que o pellet da amostra se encontre envolto em papel de filtro, evitando a perda do material durante o processamento.
5- Clarificar em dois banhos de xilol, variando de 5 a 15 minu-
tos. Centrifugar ao final por poucos minutos para formar o pellet. Obs. Para retirar o xilol, deve-se descartar o sobrenadante e secar o pellet com papel absorvente.
6- Fazer dois banhos, de 15 minutos a 1 hora, em parafina
fundida na estufa; o tempo varia de acordo com o tamanho do pellet formado.

7- Esfriar e retirar o pellet impregnado pela parafina. 8- Montar um bloco de parafina. 9- Seccionar o bloco em micrtomo e corar pelo mtodo desejado.
Figura 15. Processamento manual para cell-block (esquema adaptado do original do Dr. N. Fukushima, Doai Memorial Hospital, Tquio).
4. Coloraes citolgicas
A qualidade da colorao citolgica est diretamente relacionada s caractersticas tintoriais dos corantes, ao processamento da amostra (espessura dos esfregaos) e fixao. Esses cuidados devem ser observados para se evitar artefatos e dificuldade de anlise do material. Muitas coloraes histolgicas podem ser empregadas na citologia, algumas das quais com pequenas modificaes. Os mtodos mais empregados
so o mucicarmin de Mayer, May-Gruenwald-Giemsa, hematoxilina e eosina, cido peridico Schiff (PAS), Grocott, Shorr, entre outros. Porm, o mtodo de Papanicolaou (Pap) o mais difundido e empregado, pela grande demanda diagnstica, e por ser a colorao comumente aplicada s amostras colpocitolgicas para diagnstico de cncer ginecolgico. O mtodo de Papanicolaou utiliza um conjunto de corantes e tem como objetivo a evidenciao das variaes na morfologia e dos graus de maturidade e de atividade metablica celular. Esse mtodo se baseia nas aes de um corante bsico (com afinidade pelo ncleo das clulas: a hematoxilina), um corante cido (que se combina com o citoplasma das clulas queratinizadas: orange G) e um corante policromtico (que oferece tonalidades de cores diferentes no citoplasma das clulas: EA-65). Este mtodo abrange cinco etapas:
Hidratao: esta etapa requer a reposio gradual da gua das clulas
por meio de banhos alcolicos de concentraes decrescentes at a gua destilada.

Colorao nuclear: as clulas hidratadas podem agora receber um
corante aquoso para corar os ncleos (hematoxilina de Harris).

Desidratao: para receber corantes alcolicos citoplasmticos, deve-
mos agora retirar a gua das clulas com banhos alcolicos de concentraes crescentes.
Colorao citoplasmtica: nesta etapa, o citoplasma das clulas cora-
do pelos corantes orange G e EA-65, de modo a diferenciar com diversas tonalidades o citoplasma das clulas de acordo com a sua maturidade e metabolismo.
Desidratao, clarificao e selagem: a gua agora deve ser retirada com
concentraes alcolicas crescentes, clarificadas e seladas com meios permanentes hidrofbicos.
Descreveremos a seguir os mtodos mais empregados. Outros mtodos esto descritos na literatura recomendada.
A. Mtodo de Papanicolaou (Papanicolaou, 1942)
Solues:
Hematoxilina de Harris (Harris, 1900)
Hematoxilina.......................................................5,0 g Etanol 100%.................................................50,0 mL Almen de potssio [KAl(SO4)2]................100 g gua destilada...............................................1.000 mL xido de mercrio (HgO p vermelho)..................2,5 g Dissolva o almen em gua destilada com o auxlio de uma placa aquecedora e um agitador magntico em um recipiente com capacidade para 2.000 mL, para evitar que derrame quando a soluo entrar em ebulio. Misture a hematoxilina no lcool temperatura ambiente em outro recipiente separado. Lentamente, combine as duas solues aquecendo em placa aquecedora, at entrar em ebulio. Retire da fonte de calor e acrescente lentamente o xido mercrio, com cuidado, pois o xido reage com a soluo fazendo-a entrar rapidamente em ebulio, podendo sair, inclusive, do recipiente. Retorne a soluo para a fonte de calor at que tome a tonalidade prpuro-escura. Esfrie, e a soluo estar pronta. Para uso: Acrescente 20 mL de cido actico glacial para intensificar a colorao dos ncleos. Filtre sempre antes de cada uso.
cido-lcool a 1%:
cido clordrico (HCl)..........................................1 mL Etanol 70%.................................................... 99 mL

gua amoniacal:
Hidrxido de amnio (NH OH)........................2 a 4 mL gua destilada.....................................800 a 1.000 mL

Corante orange G:
Soluo estoque de orange G 10%: Orange G..........................................................10 g gua destilada.................................................100 mL Soluo de uso do orange G : Soluo estoque................................................20 mL cido fosfotngstico[H3P(W3O10)4]......................0,15 g Etanol 95%...................................................980 mL
Corante EA-65:
Solues estoque eosina Y a 20%: Eosina Y............................................................20 g gua destilada................................................100 mL Soluo estoque light-green SF a 3%:
Light-green SF.....................3 g
gua destilada................................................100 mL
Soluo de uso do EA-65: Soluo estoque de eosina Y.................................20 mL Soluo estoque de light-green SF...........................10 mL cido fosfotngstico [H3P(W3O10)4].........................2 g Etanol 95%...................................................700 mL Metanol absoluto.............................................250 mL cido actico glacial...........................................20 mL Mtodo 1- Etanol 80%......................................5-10 mergulhos 2- Etanol 70%.......................................5-10 mergulhos 3- Etanol 50%.......................................5-10 mergulhos 4- gua destilada I..................................5-10 mergulhos 5- gua destilada II.................................5-10 mergulhos 6- Hematoxilina de Harris ...............................1-5minutos 7- gua destilada....................................5-10 mergulhos 8- Diferenciar em lcool-cido..........................3 mergulhos 9- gua destilada.....................................5-10 mergulhos 10- Banho de gua amoniacal..........................5 mergulhos 11- gua destilada...................................5-10 mergulhos 12- Etanol 50%.....................................5-10 mergulhos 13- Etanol 70% ....................................5-10 mergulhos 14- Etanol 95%...................................5 a 10 mergulhos 15- Orange G, soluo de trabalho.......................1 minuto 16- Etanol 95%..... ...............................5-10 mergulhos
17- Etanol 95%....................................5-10 mergulhos 18- Etanol 95%.....................................5-10 mergulhos 19- Eosina-EA65, soluo de trabalho..................5 minutos 20- Etanol 95%.....................................5-10 mergulhos 21- Etanol 95%......................................5-10 mergulhos 22- Etanol 95%.....................................5-10 mergulhos 23- Etanol 100% I ................................5-10 mergulhos 24- Etanol 100% II ...............................5-10 mergulhos 25- Etanol 100% III ...............................5-10 mergulhos 26- Xilol I............................................5-10 mergulhos 27- Xilol II............................................5-10 mergulhos 28- Xilol III...........................................5-10 mergulhos 29- Selar em meio hidrfobo. Resultado: Clulas escamosas maduras...............................rseo-avermelhada Nuclolo..................................................vermelho-arroxeado Clulas metabolicamente ativas............................... verde-azulado Citoplasma queratinizado................................ laranja ou amarelo
B. Mtodo de May-Grnwald-Giemsa
Esse mtodo de colorao aplicado em distenses para a anlise de elementos figurados do sangue perifrico, medula ssea, ou elementos celulares colhidos por puno, esfoliao, imprint de tecidos ou concentrado de lquidos celulares, por meio de dois corantes.
Solues:
Soluo estoque de May-Grnwald (vendida comercialmente arti-
go Merck 1524).
Soluo estoque de Giemsa (vendida comercialmente artigo Merck
9204).
Tampo Sorensen pH 6,8. Soluo A - fosfato de sdio monobsico (NaH2PO4) 0,2 M:
NaH2PO4...............................................27,8 g gua destilada.......................................1.000 mL

Soluo B - fosfato de sdio dibsico (Na2HPO-4. H2O ) 0,2 M:
Na2HPO-4. H2O....................................28,39 g gua destilada ......................................1.000 mL

Soluo de uso:
Soluo A Soluo B pH final 6,8 51 mL 49 mL 100 mL
Soluo de uso de May-Grnwald:
Soluo estoque de May-Grnwald.........................25 mL Tampo Sorensen pH 6,8...................................190 mL
Soluo de uso de Giemsa:
Soluo estoque de Giemsa...................................25 mL Tampo Sorensen pH 6,8...................................190 mL Nota: As concentraes finais das solues de uso de May-Grnwald e Giemsa podem ser ajustadas se necessrio. Elas sempre devem ser preparadas antes de usar e desprezadas aps o uso. Mtodo: 1- Fixar em metanol por 15 minutos. 2- Corar pela soluo de uso de May-Grnwald por 5 minutos. 3- Escorrer o corante da lmina. 4- Corar pela soluo de trabalho de Giemsa por 10 minutos. 5- Lavar em tampo Sorensen pH 6,8. 6- Deixar secar temperatura ambiente. 7- Clarificar com xilol. 8- Selar com meio hidrofbico. Resultados: Ncleos dos leuccitos...........................................azul-plido Citoplasma........................................azul muito claro ou incolor Granulaes neutrfilas........................................vermelho-claro Granulaes basfilas..............................................azul-escuro Eosinfilos e eritrcitos..................................vermelho-alaranjado.
Mtodo de Shorr
Este mtodo de colorao possui resultados semelhantes ao mtodo de Papanicolaou, sendo aplicado como seu substituto em vrios laboratrios de citopatologia. Solues: Soluo corante de Shorr Biebrich Scarlet ..................................................5,0 g Orange G ou II..................................................2,5 g
Fast Green........................................................1,0 g
cido fosfomolbdico H3P(Mo3O10)4.......................5,0 g cido fosfotngstico [H3P(W3O10)4].......................5,0 g cido Actico Glacial.........................................10 mL Etanol 50 %...............................................1.000 mL Mtodo: 1- Etanol 80%......................................5-10 mergulhos 2- Etanol 70%......................................5-10 mergulhos 3- Etanol 50%.......................................5-10 mergulhos 4- gua destilada.....................................5-10 mergulhos 5- gua destilada....................................5-10 mergulhos 6- Hematoxilina de Harris...............................1-5 minutos 7- gua destilada....................................5-10 mergulhos 8- Diferenciar em lcool-cido..........................3 mergulhos. 9- gua destilada.....................................5-10 mergulhos 10- Banho de gua amoniacal..........................5 mergulhos
11- gua destilada..................................5-10 mergulhos 12- Etanol 50%.....................................5-10 mergulhos 13- Etanol 60%.....................................5-10 mergulhos 14- Corante de Shorr......................................6 minutos 15- Etanol 95% I...................................5-10 mergulhos 16- Etanol 95% II..................................5-10 mergulhos 17- Etanol 95% III..................................5-10 mergulhos 18- Etanol 100%...................................5-10 mergulhos 19- Etanol 100%...................................5-10 mergulhos 20- Etanol 100%...................................5-10 mergulhos 21- Xilol I.............................................5-10 mergulhos 22- Xilol II............................................5-10 mergulhos 23- Xilol III...........................................5-10 mergulhos Resultados Clulas eosinoflicas...........................citoplasma vermelho / laranja Clulas basoflicas.............................citoplasma azul / esverdeado Ncleos.......................................azul / violeta escuro / marrom
Referncias Bibliogrficas
CAPUTO, L. F. G. Manual da disciplina de histotecnologia do curso tcnico de Pesquisa em Biologia Parasitria do Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro: Fiocruz, 2008. 112 p. COPETTI, N. Manual de tcnicas citolgicas da Faculdade de Medicina da UFRGS. Porto Alegre: UFRGS, 2004. 31 p. HARRIS , H. F. On the Rapid Conversion of Haematoxylin into Haematein in Staining Reactions. J. Appl. Microsc, v. 3, p. 777-780, 1900. PAPANICOLAOU, G. N. A New Procedure for Staining Vaginal Smear. Science, n. 95, p. 438-439, 1942.
Para saber mais:

JUNQUEIRA , C. U.; JUNQUEIRA , L. M. M. S. Tcnicas bsicas de citologia e histologia. So Paulo: Santos, 1983. 123 p. LOWE, J. Histotechnology Technical Methods: Stain for Air Dried Cytology Preparations. Disponvel em : http://www.nottingham.ac.uk/pathology/protocols/mgg.html. Acesso em: 20 jul. 2009. MICHALANY, J. Tcnica histolgica em anatomia patolgica. 3. ed. So Paulo: EPU, 1981. 295 p. OLIVEIRA, M. L. C. S.; MOTA, A. R. C.; VIERO, R. M. Citotecnologia manual de normas tcnicas. So Paulo: Faculdade de Medicina de Botucatu (Unesp), Laboratrio de Citologia, Departamento de Patologia, 2000. 24 p. PROPHET, E. B. et al. Laboratory Methods in Histotechnology. Washington, D.C.: Armed Forces Institute of Pathology, 1992 . 279 p. WOODS, A. E.; ELLIS, R. C. Laboratory Histopathology A Complete Reference. Nova York: Churchill Livingstone, 1994. v. 2.
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Captulo 5
Cultivo celular
Emanuele Amorim Alves Anna Christina Rosa Guimares
1 . Histrico de desenvolvimento da tecnologia de cultura de tecidos 1.1. Histrico da cultura de clulas
O cultivo de clulas se iniciou no princpio do sculo XX com Harrison, em 1907, e Carrel, em 1912. Essa tcnica foi desenvolvida como um mtodo para estudar o comportamento de clulas animais fora do organismo, em um meio ambiente controlado. Essa tcnica ainda uma importante ferramenta de pesquisa nos laboratrios do mundo inteiro. Os primeiros experimentos consistiam em cultivo de tecidos fragmentados mecanicamente em frascos contendo fluidos dos animais de onde provinham os tecidos. Devido a essa forma de cultivo, durante mais de 50 anos essa tcnica foi chamada cultivo de tecidos do ingls tissue culture , sendo esse termo atualmente usado genericamente para denominar tanto o cultivo de clulas quanto o de tecidos e de rgos.
Harrison foi um pioneiro no uso de cultura de clulas. Na poca, ainda havia dvidas da dinmica do desenvolvimento do tecido nervoso, pois somente observaes microscpicas no forneciam informaes sobre esse processo. Harrison queria provar que as fibras nervosas eram formadas a partir de clulas nervosas. Para isso ele necessitou observar essas clulas fora do organismo para comprovar sua teoria. Mas como seria possvel um tecido viver fora do organismo original? Harrison levou em considerao as necessidades bsicas de uma clula e desenvolveu um experimento no qual ele mimetizou tais condies. Assim, ele dissecou o tubo medular de um embrio de sapo e o mergulhou em sua linfa fresca. Esta linfa em instantes se coagulou e, logo em seguida, Harrison selou o frasco com parafina, observando a sua preparao ao microscpio todos os dias. Uma das vantagens desse experimento era a falta de necessidade de controle de temperatura, j que os anfbios so animais cuja temperatura varia com a temperatura ambiente. Harrison teve o cuidado de manter as condies asspticas, e suas consideraes sobre a possibilidade de se manter in vitro clulas vivas por mais de uma semana foram um marco para a cultura de clulas. Com esse experimento, Harrison confirmou a sua hiptese, provando que as fibras nervosas so formadas a partir das clulas nervosas. Com isso, muitos outros cientistas passaram a se interessar por esse modelo de experimento, introduzindo o uso de cultura de clulas em suas pesquisas. Em 1912, Alexis Carrel, utilizando informaes obtidas nas observaes de Harrison, desenvolveu um modelo a partir de clulas cardacas de embrio de galinha para o cultivo. Seus experimentos foram muito importantes, pois com Carrel descobriu-se a necessidade da troca de fonte de nutrientes contidos nos frascos. Essa renovao constante de nutrientes em cultivo permitiu que as clulas pudessem ser cultivadas por perodos ainda maiores do que os utilizados por Harrison. Em 1951, George Gey cultivou clulas de tecido tumoral humano estabelecendo a linhagem HeLa, utilizada at hoje em todo o mundo. O fato
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de que tumores humanos poderiam dar origem a clulas contnuas em linhagem aumentou o interesse pelo cultivo de tecidos. O avano na cultura de clulas ocorreu, em grande parte, por intermdio dos experimentos de Hayflick e Moorhead, em 1961, considerados clssicos, nos quais eles utilizaram clulas de vida finita. Em 1962, Nakamura e colaboradores, no Japo, estabeleceram a linhagem VERO, oriunda de rim de macaco-verde africano (Cercopithecus aethiops). Essa clula uma das poucas, na atualidade, aprovadas para uso em produo de vacinas pela Organizao Mundial da Saude (OMS), o que a torna um excelente modelo de pesquisas para o desenvolvimento de novas vacinas. Muitas outras linhagens foram estabelecidas pelos pesquisadores. Atualmente, a cultura de clulas no se limita ao estudo do comportamento de determinado tecido ou clula in vitro. Seu uso se estende medicina, pois clulas em cultivo tm importante papel no tratamento de doenas degenerativas. Para a terapia celular, as pesquisas com clulas-tronco so um marco nessa rea que, de ferramenta para outros estudos, tornou-se a protagonista do desenvolvimento tecnolgico mundial.
1.2. Tipos de culturas
Clulas em cultivo so um modelo de funo fisiolgica muito contraditrio, devido perda de caractersticas que ocorre durante o seu desenvolvimento em cultura. A proliferao in vitro difere daquela in vivo. Assim, por mais prximo que esse modelo esteja da realidade, o processo in vitro ainda causa problemas para o desenvolvimento celular. Sua adeso clula clula e clula matriz reduzida, no possui as caractersticas (heterogeneidade e arquitetura tridimensional) de um tecido in vivo, uma vez que seu meio nutricional e hormonal est modificado. Clulas que, num momento anterior, cresciam tridimensionalmente agora se encontram em um meio que favorece o espalhamento, a migrao e a proliferao de clulas no especializadas que expressem diferentes funes. A
escolha do meio ideal um caminho a se seguir para a obteno de uma cultura que expresse uma funo especfica. Apesar disso, ainda existem muitas vantagens no uso de cultura de clulas como modelo experimental. O controle do ambiente, a homogeneidade da amostra, quando comparada ao uso de animais em experimentos, e a economia so as principais vantagens dessa tcnica. Atualmente, com a implementao das Comisses de tica de Uso de Animais em Pesquisa (CEUA), a cultura de clulas o principal modelo alternativo para a substituio dos animais em experimentos de pesquisa.
1.2.1. Clulas primrias, clulas estabelecidas e clulas transformadas
Uma cultura primria estabelecida a partir do crescimento de clulas oriundas de um fragmento de tecido obtido por desagregao mecnica ou enzimtica. As clulas que conseguirem sobreviver ao processo de desagregao e aderirem garrafa formaro a primeira monocamada de clulas daquele tecido. Essas clulas possuem as caractersticas do tecido de origem, podem crescer em cultura por um determinado perodo de tempo e so denominadas clulas primrias. Essa forma de cultivo a mais utilizada para estudar o comportamento de determinada clula in vitro devido presena de suas caractersticas genotpicas e fenotpicas. As clulas primrias que conseguem manter suas caractersticas originais possuem um tempo de vida curto. No organismo, a morte celular um mecanismo para renovao tecidual. Essa morte programada e no causa danos. Esse processo denominado apoptose. Na apoptose, a clula no rompida, ela simplesmente se autodigere, formando botes apoptticos que so degradados. medida que a cultura repicada, as clulas com uma maior capacidade de proliferao iro predominar na garrafa de cultivo em detrimento das clulas que no se adaptaram bem ao cultivo ou que, devido a traumas do processo de desagregao, no possuem uma taxa normal de proliferao.
Essas clulas ainda no perderam as caractersticas do tecido de origem, mas possuem alta proliferao. Esse tipo de clula chamado linhagem celular contnua, e muito utilizado em pesquisa, pois pode ser mantido em cultura por um grande perodo de tempo (quando comparado s clulas primrias) e ainda guarda grande parte das caractersticas do tecido original. Muitas linhagens celulares contnuas podem ser propagadas sem perder suas caractersticas por at oitenta passagens, alm de serem euploides, ou seja, possuem um nmero de cromossomos mltiplo do nmero original da espcie. Essas clulas so muito utilizadas em pesquisa e na produo de vacinas, como o caso da linhagem MRC-5, oriunda de tecido de pulmo de feto humano e utilizada na produo da vacina de rubola. No momento em que as caractersticas genticas das clulas so modificadas, elas deixam de ser semelhantes morfologica e geneticamente ao tecido original e so ento chamadas clulas transformadas. Tais clulas podem ser transformadas em cultura utilizando-se substncias qumicas, vrus ou agentes fsicos como a luz ultravioleta. A transformao celular uma alterao gentica que permite mutaes em genes responsveis pelo controle do ciclo celular (proto-oncogenes e genes supressores de tumor). A mutao pode resultar de uma superexpresso de proto-oncogenes ou da inativao de genes supressores de tumor. O principal reflexo dessa mutao a presena da telomerase ativa. Durante a diviso, a clula perde um pedao da poro final de seus cromossomos o telmero. Esse processo um tipo de controle para que a clula, ao checar se h possibilidade de diviso (check point), realize apoptose ao perceber que seu DNA est danificado a ponto de alterar alguma transcrio. A telomerase repe o telmero perdido permitindo que a clula se divida indefinidamente sem que perca um pedao de seu DNA codante. A proliferao exacerbada est diretamente ligada ao processo de transformao.
As clulas transformadas tambm podem ser obtidas diretamente de tecidos j mutados, como o caso de tecidos tumorais. O exemplo mais famoso desse tipo de clula so as clulas HeLa oriundas de um tumor de crvice uterina humana. As clulas HeLa so clulas gentica e morfologicamente diferentes do tecido original, e no possuem dependncia de ancoragem nem inibio por contato, alm de serem capazes de proliferar infinitamente quando em cultura. Essas clulas so muito utilizadas em estudos de citotoxicidade, controle de qualidade, entre outros. As clulas transformadas no so ainda amplamente utilizadas na produo de vacinas, em face do risco de o DNA alterado dessa clula alterar o DNA do indivduo que fez uso dessa vacina. A nica clula transformada usada na fabricao de vacinas a clula VERO. Porm, existem controles rgidos quanto quantidade de DNA celular residual presente em cada vial1 da vacina. A OMS estabelece um limite de 10 ng de DNA por vial.
1.2.2. Clulas aderentes e clulas no aderentes
As clulas em cultura possuem, inicialmente, caractersticas semelhantes aos seus tecidos de origem. Assim, clulas provenientes de tecidos epiteliais tero uma maior dependncia de interao clula clula, enquanto clulas hematopoiticas no necessitam de nenhuma interao. As clulas cultivadas podem apresentar dois aspectos distintos, isto , podem ser aderentes ou no aderentes, o que significa dizer que algumas clulas podero se ligar ao fundo da garrafa de cultura enquanto outras ficaro em suspenso no meio. As clulas aderentes so oriundas de tecidos duros e, por isso, so dependentes de ancoragem, ou seja, necessitam de adeso a uma superfcie de contato para que possam iniciar a sua proliferao. Para as clulas aderentes, as garrafas de cultura devem possuir uma carga negativa. Essa
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Frasco de vidro com volume variado utilizado no armazenamento de produtos biolgicos.
carga medeia a produo de protenas de adeso e proteoglicanos que iro iniciar o processo de adeso da clula superfcie da garrafa. a matriz extracelular que interage com a carga negativa da garrafa e, ento, as clulas se ligam matriz por receptores especficos. Nas clulas epiteliais ainda h a interao clula clula mediada por molculas de adeso clula clula (CAMs) e pelas caderinas (dependentes de Ca+2). Quando em cultura, as clulas aderentes se espalham por todo o fundo da garrafa formando o que chamado monocamada celular. As clulas no aderentes podem ser cultivadas em suspenso no meio e so derivadas de tecidos que no necessitam de ancoragem para proliferar e sobreviver. Essa capacidade est restrita s clulas hematopoiticas, s linhagens transformadas ou s clulas de tecido tumoral. Figura 1. Linhagem MA 104 (rim de macaco-verde africano). Linhagem aderente. Figura 2. Linhagem MM6 (monoctica leucmica humana). Linhagem no aderente.
Fonte: Fotos cedidas pelo Setor de Cultura de Clulas do Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Sade (INCQS), Fiocruz.
2. Biossegurana aplicada a laboratrios de cultivo celular
Como em qualquer atividade laboratorial, antes do incio do cultivo celular, deve-se planejar o trabalho a ser realizado de modo a execut-lo com segurana. Deve ser preparado um procedimento com as especificaes das atividades realizadas e todo pessoal deve ser orientado sobre os possveis riscos e para a necessidade de seguir as especificaes de cada rotina de trabalho, os procedimentos de biossegurana e prticas de segurana. H, pelo menos, 24 casos documentados de infeco em funcionrios de laboratrio que manipulam culturas de clulas primrias (por exemplo, clulas de macaco Rhesus) nos ltimos 30 anos. Embora um nmero limitado de infeces adquiridas em laboratrios tenha sido relatado como resultado da manipulao de clulas humanas e de outros primatas, h um risco significativamente maior em adquirir uma infeco pelo HIV ou pelo HBV por meio da exposio ao sangue humano e a outros lquidos corporais. Os riscos potenciais associados s clulas e tecidos humanos incluem os patgenos do sangue HBV e HIV, bem como agentes presentes nos tecidos humanos, como Mycobacterium tuberculosis, que pode estar presente nos tecidos pulmonares. Outros riscos potenciais aos trabalhadores so representados pelo uso de clulas transformadas por agentes virais, como o SV-40, assim como as clulas que carregam material gentico viral. As clulas humanas tumorognicas tambm podem oferecer riscos potenciais como resultado de uma autoinoculao. Alm do risco biolgico, um laboratrio de cultivo celular possui os riscos:
qumicos lquidos combustveis, corantes txicos (azul de Tripan,
MTT, bis-benzimida), gases txicos;

fsicos calor, radiao, vibrao e frio. 2.1. Barreiras de conteno no trabalho em cultura de clulas
Antes de iniciar os procedimentos de manipulao, o pesquisador, ou tcnico, deve usar guarda-p limpo ou descartvel, gorro, mscara cirrgica e sapatilha, como conteno primria. Lavar as mos e a parte anterior do antebrao com gua e sabo, preferencialmente antissptico, realizar antissepsia das mos com lcool 70% (v/v) e calar luvas cirrgicas. Tais procedimentos so muito importantes para a manipulao de clulas. O profissional no deve usar anis, pulseiras, relgios ou outros ornamentos durante as manipulaes. Clulas animais devem ser manipuladas usando-se as prticas e a conteno do nvel de biossegurana 2. O trabalho deve ser realizado em cabine de segurana biolgica, e todo o material dever ser descontaminado antes do descarte. A conteno secundria obtida mediante a combinao de elementos relacionados infraestrutura laboratorial.
2.2. Infraestrutura laboratorial
A organizao de um laboratrio voltado pesquisa com clulas depende da sua finalidade e do nmero de pessoas que nele vo trabalhar. De maneira geral, o laboratrio necessita dos seguintes espaos:
rea para lavagem e esterilizao; rea para preparo de meios; rea para incubao e observao das culturas; rea para manipulao assptica das culturas.
As diversas reas devem estar funcionalmente distribudas, facilitando o deslocamento de pessoal e o fluxo de materiais, com a menor circulao possvel nas reas de manipulao assptica das culturas. A rea destinada a manipulaes, onde se localizam as cabines de fluxo, deve ser preferencialmente fechada e muito limpa. Deve-se trabalhar com avental limpo, exclusivo para uso nessa sala. A superfcie das bancadas deve ser impermevel gua e resistente a cidos, lcalis, solventes orgnicos e a calor moderado. As instalaes devem ser desenhadas de modo a permitir espaos entre as bancadas, equipamentos e cabines, que devem permitir fcil limpeza. Os equipamentos necessrios tambm dependem das finalidades do laboratrio. Em geral, o laboratrio necessita de:
estufa incubadora com atmosfera de CO2; autoclave; deionizador de gua; estufa para secagem de material; cabine de segurana biolgica (cmara de fluxo de ar laminar estril); medidor de pH; balana analtica; geladeira; freezer; microscpio invertido; agitador magntico; centrfuga refrigerada; banho-maria; bomba de vcuo.
Para trabalhos com culturas de clulas, inmeros instrumentos so necessrios, tais como: cmara para contagem, pipetador automtico, micropipetas, estante para tubos, alm de uma variedade de vidrarias e reagentes necessrios para preparo de meios de cultura e solues. As salas devem ser sinalizadas com smbolo universal de risco biolgico, com acesso restrito equipe tcnica de apoio.
2.3. Limpeza, desinfeco e esterilizao
A superfcie da rea de trabalho deve sempre ser limpa, utilizando-se lcool a 70% (v/v), uma vez por dia ou aps cada atividade. O lcool etlico a 70% (v/v) um excelente desinfetante por sua ao de limpeza ou detergente, sendo eficaz tambm na reduo da flora bacteriana da pele. Suas propriedades desidratante e desnaturante de protenas podem ser responsveis por sua ao antimicrobiana. A gua sanitria comercial (2% a 5% de cloro) , tambm, um bom desinfetante quando diluda de 5 a 10 vezes, por ser um agente oxidante e agir sobre os constituintes da membrana, levando os microrganismos morte. Todo material aquecido no banho-maria, como meios de cultura e solues, deve ter processo prvio de assepsia antes de sua introduo na cabine de segurana biolgica. Deve-se, ao retirar o material do banho-maria, remover o excesso de umidade com auxlio de uma gaze e posterior limpeza com lcool 70% (v/v). Antes de se iniciarem os procedimentos, a cmara interna do fluxo deve ser limpa com gaze embebida em lcool etlico 70% (v/v). O fluxo de ar, assim como a lmpada de ultravioleta devem ser ligados trinta minutos antes do uso. Todo material deve ser limpo com lcool etlico a 70% (v/v) antes de ser introduzido na cmara. Aps o trmino dos procedimentos, deve-se realizar a limpeza da cmara interna, removendo possveis sujidades. Manter o intervalo
de pelo menos vinte minutos, com o fluxo de ar e a lmpada de ultravioleta ligados, antes de iniciar outro procedimento ou encerrar as atividades. Realizar avaliao e monitoramento ambiental da cabine pelo mtodo de exposio de placas, tal como descrito no item controle microbiolgico de ambientes e processos.
2.4. Controle microbiolgico de ambientes e processos
O trabalho com cultivos celulares exige uma srie de cuidados para se reduzirem os riscos de contaminao. As tcnicas asspticas reduzem a probabilidade de infeco, sendo importante que sejam mantidas a todo momento: antes, durante e ao trmino do experimento. A necessidade de manuteno da assepsia inclui uma srie de procedimentos que vo desde a esterilizao dos meios de cultura e instrumentos, at a adoo de quarentena para os cultivos novos. Isso porque as clulas so cultivadas em meios ricos em nutrientes e a possibilidade de ocorrer propagao de microrganismos contaminantes alta. As culturas, assim como todos os resduos da manipulao, devem ser descontaminadas, antes do descarte, em autoclave durante uma hora a 121C. Culturas contaminadas no devem ser abertas para lavagem antes da descontaminao. Esse material deve ser retirado do laboratrio imediatamente em recipientes rgidos e prova de vazamentos. Deve-se controlar a temperatura e a umidade para evitar o crescimento de microrganismos no ambiente. A climatizao de uma sala de 15m 2 (45m3) pode ser feita por um aparelho de ar condicionado de 15.000 BTUs, levando-se em conta que existe o aquecimento produzido pelos equipamentos. O monitoramento microbiolgico da sala, bem como das cabines de segurana biolgica para o cultivo de clulas, pode ser realizado pela pesquisa de microrganismos, como fungos e bactrias. Um procedimento rotineiro indicado para controle ambiental o mtodo de exposio de placas com meios
nutritivos gar casena de soja (trypticase soy agar-TSA) e gar sabouraud 4% de glicose (Sab4). O laboratrio deve possuir um programa rotineiro adequado de controle de insetos e roedores. Todas as reas que permitam ventilao devero conter barreiras fsicas para impedir a passagem de insetos ou outros animais.
3. Tcnicas/conceitos para cultivo celular 3.1. Lavagem e preparo do material para cultura de clulas
A vidraria utilizada para cultura de clulas deve ser exclusiva e processada separadamente das demais. A vidraria deve ser lavada imergindo-a em gua com detergente neutro a 5%, durante 12 horas, e enxaguando-a 3 a 4 vezes em gua comum, e 2 a 3 vezes em gua destilada. O material limpo deve apresentar uma pelcula uniforme de lquido nas paredes aps o ltimo enxgue. Caso no haja a formao desta pelcula, o material dever ser submetido a novo processo de lavagem, pois significa que h traos de gordura ou qualquer sujidade no material. Frascos muitos sujos, com resduos aderidos, devem ser lavados com soluo sulfocrmica (soluo de bicromato de potssio a 3% em cido sulfrico concentrado1:9), que requer muito cuidado no uso devido presena do cromo IV (Cr+4). Muitos materiais necessitam de uma lavagem prvia, sob agitao durante 5 a 10 minutos, em soluo detergente. A secagem do material deve ocorrer em estufa de secagem a 120C, por aproximadamente 6 horas. O material limpo e seco no deve conter qualquer tipo de resduo, mancha, colorao e/ou opacidade; caso contrrio, o material deve ser submetido a um novo processo de lavagem. A montagem e embalo podem ser realizados com envelopes e/ou bolsas prprios para esterilizao, ou ainda material do tipo no tecido. Deve ser evitado o uso de papel Kraft por gerar aerossis.
A esterilizao da vidraria em geral realizada por autoclavao sob presso a 121C por 20 minutos. Outros materiais podem ser esterilizados por mais tempo se necessrio. Toda vidraria estril tambm deve ser mantida livre de poeira em armrios bem fechados. Pipetas graduadas e tubos de centrfuga so preferencialmente descartveis.
3.2. Manuteno das culturas: propagao e criopreservao
3.2.1. Propagao celular
Para manter as clulas em cultura necessrio utilizar tcnicas bsicas que evitem a morte celular dentro da garrafa de cultivo. As clulas normalmente possuem inibio por contato e, quando em uma garrafa de cultivo, se a quantidade de clulas exceder um nmero tal que impossibilite o crescimento normal da monocamada, as clulas se inibiro e haver morte. Assim, extremamente importante que se retire quantidades de clulas periodicamente da garrafa de modo a manter a populao sempre com um nmero ideal. O processo de renovao de clulas de uma garrafa para outra chamado passagem. O nmero de passagens se refere ao nmero de vezes que essa cultura foi subcultivada. Muitas linhagens contnuas so capazes de manter as caractersticas iniciais do tecido original com algumas passagens, enquanto as clulas transformadas no mantm as caractersticas originais e so capazes de permanecer em cultura por um grande nmero passagens (chegando at virtualmente ao infinito nmero de passagens). Para as clulas no aderentes, o procedimento de passagem se assemelha a uma diluio e basta retirar clulas da garrafa de cultivo, adicionando novo meio ao seu lugar. Isso ocorre porque estas clulas se encontram em suspenso no meio, sendo possvel retir-las sem que seja necessrio um procedimento especfico.
As clulas aderentes possuem um mtodo especfico para efetuar a sua passagem, por se encontrarem aderidas ao fundo da garrafa de cultivo. Para que as clulas aderentes possam se ligar ao fundo da garrafa necessrio que o fundo tenha uma carga negativa. Superfcies como vidro e metal, que possuem uma carga lquida negativa, so excelentes superfcies para a adeso celular. Plsticos so muito utilizados em cultivo celular, mas para que o plstico desenvolva carga negativa necessrio um tratamento prvio com agentes qumicos, como agentes oxidantes, ou fsicos, como a luz ultravioleta e a radiao. A carga negativa necessria, pois a adeso celular ocorre por meio de foras eletrostticas e da interao dessas cargas com glicoprotenas de adeso e com ctions divalentes, como Ca+2 e Mg+2. Esta interao, ento, desencadeia uma sinalizao intracitoplasmtica que acarretar na produo e liberao de protenas da matriz extracelular pela prpria clula, onde a clula ir aderir, espraiar e iniciar sua proliferao. A matriz extracelular de um tecido uma mistura complexa de protenas, glicoprotenas, lipdeos, glicolipdeos e mucopolissacardeos. As macromolculas que constituem a matriz so secretadas por clulas locais, especialmente fibroblastos. Essa matriz contm trs importantes protenas fibrosas colgeno, elastina e fibronectina contidas em um gel hidratado formado por uma rede de cadeias de glicosaminoglicanos. Todas essas macromolculas so secretadas localmente por clulas em contato com a matriz. Linhagens macrofgicas so uma exceo, pois sua adeso mediada por proteoglicanos, um processo diferente do descrito.
Figura 3. Adeso celular medida por protenas de adeso.
Os mtodos de dissociao celular so classificados em mecnicos ou enzimticos. No mecnico ocorre a desagregao da monocamada fisicamente com a ajuda do rubber policeman, um dispositivo semelhante a um rodo estril que retira as clulas do fundo da garrafa de cultivo. Na desagregao enzimtica ocorre a digesto das protenas de adeso por proteases especficas ou no. A dissociao de tecidos envolve a dissociao da matriz e a quebra dos contatos clula clula, sem comprometer a membrana ou danificar a superfcie celular. A dissociao mecnica utilizada principalmente para clulas macrofgicas devido sua adeso diferenciada. Esse mtodo consiste na retirada das clulas por meio de agentes fsicos, o que muito danoso para as culturas. A dissociao enzimtica uma das principais aplicaes das enzimas na cultura de clulas. Proteases so necessrias para romper a matriz extracelular e, assim, obter clulas individualizadas com a finalidade de transferir as culturas para um novo substrato. A enzima proteoltica inespecfica mais utilizada a tripsina, que hidrolisa cadeias polipeptdicas nos radicais lisil-arginil formando
terminaes de clivagem, ster e amida. Essa reao desestrutura a matriz, impossibilitando a ligao dos receptores da superfcie celular, ligados ao citoesqueleto e matriz, obrigando as clulas a rearrajarem seu citoesqueleto. Devido inespecificidade da enzima, no se deve deixar a clula muito tempo em sua presena, para no haver lise celular.
3.2.2. Congelamento
Na natureza muito comum que os indivduos se adaptem cada vez mais ao meio ambiente por meio de mutaes genticas. Esse procedimento evolutivo descrito por Darwin ocorre em todos os seres vivos e no seria diferente pensar que tambm ocorreria em clulas cultivadas. A partir do momento em que uma clula se encontra em uma cultura primria ocorrem adaptaes para o seu estabelecimento como uma linhagem. Clulas em cultura por longos perodos acabam perdendo suas caractersticas fenotpicas, pois aps vrias divises, h grande probabilidade de ocorrerem alteraes demasiadas em seu DNA. Manter clulas congeladas significa atrasar, em anos, quaisquer alteraes que poderiam ocorrer quando em cultura. Tais alteraes so dispensveis para os laboratrios de cultura de clulas e os grandes bancos mundiais fornecedores de linhagens. As clulas em cultura geralmente so congeladas em nitrognio lquido em uma temperatura de -196C. Nessa temperatura, todas as reaes bioqumicas nas clulas ficam paralisadas impedindo qualquer alterao na cultura criopreservada. O procedimento mais utilizado no congelamento celular o lento. Nesse processo h diminuio da temperatura, vagarosamente acarretando a solidificao da gua que se encontra no meio de cultura. Isso aumenta a concentrao de soluto fora da clula e faz com que a gua saia atravs do processo de osmose. A sada da gua da clula faz com que ela murche.
Assim, medida que a gua sai, ela se congela no exterior, deixando a clula desidratada. Nesse processo, a gua do meio externo congelada formando cristais que podem se reorganizar no exterior da clula. A formao de cristais e reorganizao dentro da clula leva ao rompimento da membrana celular, matando as clulas. Isso impedido com o processo lento de congelamento. Figura 4. Esquema do congelamento lento.
Quando o congelamento lento, a viabilidade das clulas descongeladas maior do que a das congeladas pelo mtodo rpido, ou seja, quando imersas diretamente no nitrognio lquido. Mesmo controlando-se a velocidade de congelamento em 1 a 2C por minuto e tendo o cuidado com a formao dos cristais, a clula sofrer muitos danos nesse processo. Assim, para aumentar a viabilidade celular, utilizam-se crioprotetores. Crioprotetores so substncias que, sob diferentes mecanismos moleculares, tornam a membrana das clulas protegidas dos cristais. Os crioprotetores mais utilizados so o glicerol e o dimetilsufrido (DMSO). O efeito protetor do glicerol se relaciona com a sua capacidade de ligao com a gua e sua baixa dissociao com sais, diminuindo a osmolaridade
do meio de congelamento. Alm disso, suas hidroxilas so capazes de se ligar aos oxignios do grupo fosfato dos fosfolipdeos de membrana, estabilizandoa no momento do congelamento. O DMSO uma molcula sem carga real, mas que possui um momento dipolar. Sua ao est relacionada interao da molcula com as membranas fosfolipdicas e com o ambiente externo membrana. Assim, durante um congelamento, a molcula impede fases de transmisso dos lipdeos de membrana que chegam a promover a fuso de vrias membranas. Tanto o DMSO quanto o glicerol so txicos para as clulas e devem ser utilizados somente no momento do congelamento, sendo indispensvel a sua retirada do meio aps o descongelamento da cultura.
3.2.3. Descongelamento celular
O descongelamento geralmente ocorre de forma rpida. Simplesmente retira-se a ampola do tanque de nitrognio lquido e coloca-se ela em gua a 37 C imediatamente. Figura 5. Esquema de descongelamento lento.
Apesar de todo o cuidado durante o congelamento, o processo de criopreservao danoso para as clulas e, portanto, aps o seu congelamento as clulas devem ser colocadas em meio de cultivo com uma concentrao de 20% de soro fetal bovino. As clulas aderentes devem ser lavadas aps 24 horas de adeso para a retirada de clulas mortas. Os procedimentos de congelamento e descongelamento so os mesmos para as clulas aderentes e para as no aderentes.
3.3. Quantificao celular
Quando se trabalha com experimentos que necessitam do uso de clulas em cultura necessria a avaliao constante das clulas. Umas das formas de se avaliar o crescimento celular utilizando-se mtodos de quantificao celular. Quantificar uma cultura significa dizer quantas clulas se encontram em determinada garrafa de cultivo. A quantificao utilizada para definir a viabilidade celular, as condies de crescimento e o incio de experimentos nos quais o nmero de clulas utilizado deve ser preciso. Existem duas maneiras de se quantificar clulas em cultura. Na forma direta, conta-se diretamente o nmero de clulas presente na garrafa de cultivo; a forma indireta feita por meio da quantificao de determinadas estruturas celulares, como protenas, ou pela medio do metabolismo celular. Como forma de quantificao direta, o mtodo mais utilizado a contagem em cmara de Neubauer. No mtodo indireto existem muitas tcnicas baseadas no metabolismo celular ou at mesmo na dosagem de macromolculas presentes na clula, como as protenas ou o DNA. Para a contagem em cmara de Neubauer, as clulas devem estar totalmente individualizadas. Para clulas aderentes, necessrio fazer uma tripsinizao prvia, o que no feito no caso de clulas no aderentes.
A cmara de Neubauer uma lmina de vidro com divises que auxiliam na contagem, possuindo 9 quadrados que medem 1 mm2 de rea. O esquema de uma cmara ao microscpio tico se encontra na Figura 6. Somente os quatro quadrados externos so utilizados na contagem de clulas animais. Cada quadrado externo formado por mais 16 quadrados menores que auxiliam a contagem. Figura 6. Esquema da cmara de Neubauer.
Para a contagem, necessrio colocar uma lamnula de vidro sobre a cmara, que servir para conter a suspenso celular. O espao formado entre a lamnula e a cmara de 0,1 mm. Dessa forma, o volume determinado por cada quadrado equivalente a 0,1 mm3. As clulas contadas em um quadrado contidas em 1 mL equivalem ao valor de clulas contado multiplicado por 104 (fator de correo da cmara). O nmero de clulas por mL de uma suspenso quando contado em cmara de Neubauer obtido pela equao:
Q1+Q2+Q3+Q4 4 X104 X faror de diluio=n de clulas / mL
Para no ocorrer a contagem de uma clula mais de uma vez, deve-se fazer uma marcao em forma de L nos quadrados, para que, ao aparecerem clulas em cima das linhas, se contem somente as que estiverem sobre a marcao. Para a anlise de viabilidade celular utiliza-se o corante azul de Trypan, que no atravessa membranas ntegras. Assim, clulas vivas no permitem a passagem do corante e, logo, no adquirem nenhuma colorao. Como as clulas mortas tm suas membranas danificadas, ocorre o fluxo de corante para o interior da clula fornecendo uma colorao azul. Entre os mtodos de contagem indireta mais utilizados esto o teste de brometo 3 - [4,5-dimetil-tiazol - 2-il] - 2,5 - difenil-tetrazlio (MTT) e o ensaio de colorao por Coomassie Brillant Blue R-250 (CBBR 250). A colorao por CCBR-250 se baseia na capacidade do corante de corar protenas celulares. Assim, faz-se uma curva padro com concentraes celulares conhecidas e tambm as leituras das amostras de cultura. Para isso, deve-se corar a cultura e depois eluir a soluo corante, sendo lida em espectrofotmetro. O ensaio do MTT se baseia na reduo do MTT, um sal tetrazlico, pela desidrogenase mitocondrial de clulas viveis para formar como produto o azul de Formazan. O ensaio mede a respirao celular, que proporcional quantidade de Formazan produzida, e ao nmero de clulas viveis em cultura. A vantagem desse mtodo a contagem somente do nmero das clulas viveis, o que no ocorre com o mtodo de CBBR 250.
3.4. Conceitos bsicos e controle da qualidade de cultivos celulares
Para a caracterizao de clulas em cultivo necessria a observao de vrios aspectos, como a descrio do histrico da clula, incluindo sua origem (rgo, tecido, idade, sexo e espcie do doador), e a metodologia utilizada para obt-la, histrico de passagens, meios de cultura usados e passagem em animais.
Testes como cariotipagem, anlise de isoenzimas e DNA fingerprinting (impresso digital gentica) servem como identificadores da espcie da linhagem celular, alm de indicarem se h contaminao daquela cultura por outra clula humana ou animal. importante enfatizar que a autenticao celular uma parte essencial no controle de qualidade de um cultivo, tanto para fins de pesquisa quanto para fins comerciais, devendo ser uma preocupao contnua e importante para qualquer laboratrio de cultura de clulas. Alm de identific-la, importante avaliar se a clula est contaminada por fungos, bactrias, micoplasmas ou vrus.
3.4.1. Cariotipagem
A anlise cromossmica de uma clula um dos principais critrios utilizados na identificao de uma linhagem, pois relaciona a linhagem em cultivo a uma determinada espcie e sexo. O mtodo de cariotipagem um exame citogentico que verifica o estado do caritipo das clulas. Sua anlise feita por meio de vrias coloraes que evidenciam partes dos cromossomos. Por meio de anlises visuais destes cromossomos e com auxlio de atlas de caritipos possvel associar determinado mapa cromossomial de uma linhagem a uma espcie e ao sexo do indivduo. Para a cariotipagem, necessria a interrupo da proliferao celular das clulas em cultivo no momento da metfase utilizando-se a colchicina. A colchicina uma substncia que inibe a polimerizao das protenas do fuso mittico, parando a diviso celular em metfase, fase em que os cromossomos se encontram mais condensados, facilitando a sua observao ao microscpio e a anlise do caritipo. A cariotipagem ainda permite verificar se a clula normal ou transformada, j que o perfil gentico de uma clula transformada muito alterado quando comparado ao perfil gentico do indivduo de origem.
3.4.2. Anlise de isoenzimas
O termo isoenzima define um grupo de vrias formas moleculares da mesma enzima originrio de uma espcie, resultante da presena de mais de um gene codificando cada uma das enzimas. Assim, para utilizar isoenzimas como forma de identificao celular, devese obter um perfil enzimtico chamado zimograma, no qual as enzimas correm em um gel de eletroforese e seu perfil de corrida avaliado por tcnicas histoqumicas. Diferenas na mobilidade de isoenzimas em um campo eltrico resultam de diferenas em nvel de sequncias de DNA, que codificam tais enzimas, e de sua estrutura molecular. Assim, se os padres de bandas de dois indivduos diferem, assume-se que estas diferenas tenham base gentica e sejam herdveis. A anlise de isoenzimas em culturas de clulas de tecido humano pode ser utilizada para a identificao entre dois indivduos, devido ao polimorfismo do genoma humano, pois cada indivduo ter o seu prprio perfil isoenzimtico. As principais enzimas utilizadas na caracterizao de clulas humanas em cultura so a purina nucleosdeo fosforilase (NP), a glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD) e a lactato desidrogenase (LDH).
3.4.3. DNA fingerprinting
O DNA contm regies que no so aparentemente transcritas. A funo dessas regies ainda no est descrita, mas acredita-se que existam regies que possam ser utilizadas pelo DNA, caso houvesse algum tipo de evoluo do indivduo. Essas regies no so conservadas e possuem uma alta variabilidade entre os indivduos, podendo ser utilizadas como marcadores de identificao individual, pois so especficas de um determinado indivduo e diferem entre si na mesma espcie.
Enzimas de restries so utilizadas para cortar segmentos que podem ser hibridizados com sondas e analisados por eletroforese. O perfil obtido especfico de um indivduo, assim como sua impresso digital. Devido especificidade dessa tcnica, idealizada por Jeffreys e colaboradores em 1985. Ela foi denominada DNA fingerprinting e atualmente a principal ferramenta utilizada para a identificao exata e precisa de determinada linhagem celular. uma tcnica muito utilizada para detectar a contaminao cruzada entre duas clulas em cultura.
3.5. Ciclo celular e fases de crescimento celular
3.5.1. Ciclo celular
A anlise do ciclo celular o primeiro passo para a compreenso das vias de ativao e proliferao das clulas, sendo necessrio o conhecimento das fases do ciclo celular. A sequncia ordenada de eventos, durante a qual o DNA replicado e protenas so sintetizadas e depois dividem a clula em duas, constitui um ciclo conhecido como ciclo celular. O ciclo celular eucaritico tradicionalmente compreendido em dois perodos principais: a interfase e a mitose (M). Um ciclo de 16 horas em clulas de mamfero em cultura dividido nos perodos (G 1, S, G2 interfase): G1(durao de 5 horas): crescimento e preparao para a replicao dos cromossomos; S (durao de 7 horas): sntese de DNA (replicao); G2 (durao de 3 horas): preparao para a diviso mittica; M (durao de uma hora): separao das cromtides e constituio de dois ncleos idnticos.
Aps a mitose as clulas filhas podem:

iniciar nova fase de sntese aps uma fase ps-mittica de durao
normal; ou
entrar numa fase ps-mittica prolongada permanecendo num estado
de quiescncia e, se devidamente estimuladas, podem mais tarde ingressar em ciclo no fim de G1. A regulao adequada do ciclo celular, com o controle correto da sntese de substncias reguladoras (ciclinas dependentes de quixases - CDK) e inibidoras (inibidores de CDK), fundamental para o desenvolvimento normal dos organismos multicelulares. Uma falha nesse controle pode acarretar uma superproduo desnecessria de clulas, frequentemente com resultados malficos, como a formao de tumores (cncer). A dinmica do processo de diviso celular muito complexa. Ela ocorre por meio de uma srie de eventos e processos nucleares e citoplasmticos de forma coordenada e possui mecanismos de controle rigoroso envolvendo genes e protenas regulatrias que atuam em diferentes etapas do ciclo celular. Em cultura, as clulas de uma populao normalmente apresentam-se em diferentes fases de ciclo celular. Se todas as clulas de determinada populao estivessem na mesma etapa do ciclo celular, essa populao estaria em sincronismo celular. Uma variedade de tcnicas e substncias pode sincronizar clulas em fases especficas do ciclo celular. Por exemplo, o arraste reversvel de clulas em G1 pode ser obtido com a deduo de soro ou aminocido isoleucina; e o inibidor de microtbulos, o nocodazol, empregado para sincronizar clulas na mitose.
Figura 7. Grfico da quantidade de DNA variando ao longo do ciclo celular.
3.5.2. Fases do crescimento celular
Clulas normais em cultura possuem um padro de crescimento representado por uma curva sigmoidal (Figura 8) denominada curva de crescimento. Essa curva reflete as fases de adaptao das clulas s condies ambientais, disponibilidade de nutrientes e ao suporte de ancoragem necessrios para promover a produo de novas clulas. A determinao da curva de crescimento importante para a caracterizao de uma cultura de clulas. A biologia celular modifica-se em cada fase da curva, sendo importante o controle do estgio em que as clulas sero coletadas, quando ser realizado o repique da cultura, ou quando novos nutrientes sero adicionados.
Figura 8. Curva de crescimento celular padro de clulas normais
A curva de crescimento de clulas em cultura dividida nas seguintes fases de crescimento: Fase lag perodo de adaptao no qual no ocorre proliferao aps adio das clulas ao meio de cultivo. A durao da fase lag depende da densidade celular e do estgio de crescimento da cultura, podendo se estender de horas a alguns dias. Nesse perodo h produo de protenas estruturais e enzimas, com aumento na sntese de DNA. Nesse perodo ocorre intensa atividade metablica. cao celular mxima e constante. a fase de maior viabilidade e atividade metablica das clulas e, por isso, o melhor perodo para estudo e experimentao. Nesta fase determinado o tempo de duplicao, sendo a velocidade de proliferao caracterstica para cada linhagem.
Fase log fase logartmica ou exponencial, perodo no qual a multipli-
nmero de morte celular tende a ser equivalente ao nmero de clulas novas, e a atividade metablica decresce. Para algumas linhagens, a fase estacionria pode ser estendida se o meio for renovado.
Fase estacionria ou plateau a velocidade de crescimento diminui, o
Fase de declnio ou morte celular h reduo drstica do nmero de
clulas e o nmero de clulas mortas excede o de clulas novas. A construo da curva de crescimento importante para a manuteno da rotina e para saber o nmero de clulas depois de determinado o intervalo de tempo. Permite a caracterizao de certos parmetros prprios de uma populao sob determinadas condies de cultivo. Linhagens primrias e permanentes possuem curvas de crescimento diferentes; as linhagens permanentes podem ser mantidas indefinidamente, enquanto as linhagens primrias morrem aps algumas geraes.
3.6. Principais agentes contaminantes em cultura de clulas
Manter a assepsia em cultura algo muito difcil. O material esterilizado erroneamente, a manipulao sem cuidado e, principalmente, a falta de higiene e de vestimenta correta dos manipuladores podem causar contaminao de uma cultura. Bactrias, fungos, leveduras e micoplasmas so os principais contaminantes das culturas celulares. Em casos de contaminao, importante avaliar onde a clula foi cultivada, quais os meios e solues utilizados e qual tcnico fez a manipulao. Isso impede que, em caso de contaminao pontual, esta se espalhe para outras culturas do laboratrio, alm permitir a investigao dos principais motivos da contaminao, a fim de elimin-la.
3.6.1. Contaminao bacteriana
As bactrias so organismos procariontes com capacidade de proliferao muito rpida e que, na maioria das vezes, conseguem crescer em qualquer condio. Elas esto presentes no ar, nas superfcies, no trato digestivo humano etc.
Uma contaminao bacteriana na cultura inviabiliza a sua utilizao, visto que elas competem pelos nutrientes do meio fazendo com que as clulas morram pela falta de alimento. Alm disso, metabolizam o meio de forma a torn-lo excessivamente cido para determinadas linhagens. As bactrias, por crescerem muito mais rpido que as clulas animais em cultura, especialmente em meios muito ricos, como os de cultivo de clulas animais, tm sua visualizao ao microscpio tico facilitada, e a contaminao facilmente detectada. Para isso, necessrio que o cultivo ocorra em meio livre de antibiticos, para no haver mascaramento do crescimento da contaminao em cultura. A esterilidade deve ser garantida pela qualidade das solues e do material utilizado e pelo bom treinamento dos tcnicos.
3.6.2. Contaminao por micoplasma
Micoplasmas so contaminantes comuns de culturas de clulas, microorganismos procariotos desprovidos de parede celular que possuem uma membrana lipdica em bicamadas, imperceptveis na visualizao por microscpio tico invertido. De difcil localizao por se aderir membrana da clula, o micoplasma prejudicial, pois retira do meio os nutrientes necessrios, em particular a arginina. O metabolismo dos micoplasmas , em parte, dependente do metabolismo celular. Para detectar micoplasmas, pode-se utilizar o teste de colorao fluorescente Hoescht 33258, que cora DNA. Assim, ao observarmos uma cultura contaminada em microscopia de fluorescncia possvel visualizar o ncleo da clula e o seu contorno, que formado pelo material gentico dos micoplasmas aderidos membrana. Contaminar uma cultura com micoplasmas muito fcil, pois eles se encontram na via respiratria humana; porm, a descontaminao envolve a
utilizao de antibiticos, como ciprofloxacin e kanamicina associada tetraciclina, extremamente prejudiciais clula, e, havendo posterior febre, com o aumento da temperatura de 37 C para 41 C. Isso diminui o nmero de clulas viveis, e o processo nem sempre um sucesso.
3.6.3. Contaminao por leveduras
Leveduras so fungos unicelulares muito comuns em cultura. Caracterizam-se por serem menores do que as clulas animais. Multiplicam-se principalmente por brotamento, formando na cultura estruturas caractersticas na forma de esferas menores anexadas a esferas maiores.
4. Meios de cultura e solues utilizadas em cultivos celulares
Os meios nutritivos (meios de cultura ou de cultivo) utilizados para a cultura de clulas, tecidos e rgos fornecem as substncias essenciais para o crescimento e controlam o crescimento in vitro. As mesmas vias metablicas e bioqumicas bsicas no organismo so consideradas nas clulas cultivadas. Complementando as substncias biossintetizadas pelas clulas, vrios compostos orgnicos so adicionados ao meio para suprir as necessidades metablicas, energticas e estruturais especficas das clulas. Sendo assim, os meios de cultura devem apresentar em sua formulao sais minerais, hidratos de carbono, aminocidos, vitaminas, protenas, peptdeos, lipdeos e cidos graxos (ver Tabela 1). Costuma-se adicionar tambm soros, tampes, antibiticos e indicadores de pH. Os meios de cultivo foram estabelecidos a partir de 1950, com vrias formulaes de meios que proporcionassem o crescimento celular in vitro. Os meios de cultura, tais como o meio 199 de Morgan e colaboradores de 1950, o meio CMRL, de Parker e colaboradores de 1957, e os meios basais de Eagle de 1955 e 1959, so utilizados hoje.
Foram elaborados, tambm a partir de 1950, alguns meios de cultura mais complexos, com o intuito de eliminar a utilizao de fluidos animais, como o meio NCTC 109, desenvolvido por Evans e colaboradores a partir 1956. Esses meios livres de soro devem fornecer todos os fatores que as clulas em cultura necessitam, tais como: metais trao, vrios suplementos e fatores de crescimento, insulina, transferrina, hormnios, dentre outros. A exigncia desses fatores e a complexidade do meio variam de acordo com o tipo celular a que se destina e, por ser altamente especfico, em muitos casos precisa ser adaptado para cada tipo celular. Devido sua complexidade, esses meios so muito dispendiosos, e utilizados apenas para fins especficos. Tabela 1. Tabela de componentes bsicos de um meio tpico.
protenas (necessrias em meios sem soro quimicamente definidos)
aminocidos vitaminas
sais
outros
Arginina Cistina Glutamina Histidina Isoleucina Leucina Lisina Metionina Fenilalanina Treonina Triptofano Tirosina Valina
Biotina Colina Folato Nicotinamida Pantotenato Piridoxal Tiamina Riboflavina
Glicose Penicilina KCl Estreptomicina Vermelho de NaH2PO4 fenol Soro NaHCO3 CaCl2 MgCl2
NaCl
Insulina Transferrina Factores especficos de crescimento
Para escolher o meio de cultivo adequado ao de uma determinada linhagem, consulta-se primeiro a literatura e as referncias de bancos oficiais. No sistema de cultivo de clulas, importante o controle do pH timo (7,0-7,6), utilizando para isso tampo e o suplemento do meio de cultivo que resiste s variaes do pH, principalmente na fase lag do crescimento celular. Na fase lag do crescimento celular, ou em baixa densidade celular, a tenso de CO2 deve ser mantida para controle do pH e, por isso, as culturas so mantidas em atmosfera de 5-10% de CO2. Para compensar a diminuio do pH gerado pelos metablitos do consumo da glicose, h a suplementao do meio com bicarbonato de sdio e manuteno do nvel de CO2. O CO2 dissolvido em equilbrio com ons bicarbonato gera um sistema de tamponamento no meio, como mostra a equao abaixo: H2O + CO2 + NaHCO3 H+ + Na+ + 2HCO3-
O composto HEPES (N-(2-hidroxietil) piperazina-N-(2-cido etanosulfnico) e outros tampes orgnicos podem ser utilizados em culturas em que o tampo bicarbonato no adequado. A sensibilidade da cultura pelo tampo varia, podendo at ser txica para as clulas. Portanto, deve-se ser criterioso na escolha do melhor tampo e da sua concentrao. Antibiticos e fungicidas so utilizados nos meios nutritivos para controle da contaminao microbiolgica. Com essa finalidade, os compostos mais utilizados so a gentamicina, a estreptomicina, a penicilina e a anfotericina. importante rotular, imediatamente, qualquer reagente ou soluo preparada com etiquetas com as seguintes informaes: nome da soluo preparada, lote, data do preparo, prazo de validade, nome dos tcnicos responsveis e temperatura de estocagem. A temperatura adequada para os meios de cultura de +4-8 C.
4.1. Controle da qualidade da gua e reagentes
A gua o componente predominante na preparao dos meios e solues, mas uma fonte potencial de impurezas que podem afetar o crescimento de culturas in vitro. Para evitar contaminao por compostos orgnicos volteis, que permanecem aps a destilao e que inibem o crescimento das culturas, deve-se utilizar gua classificada como ultrapura, que consiste num sistema de purificao por filtrao com carvo ativo, colunas de troca inica e filtros de acetato de celulose. Embora de custo elevado, a gua produzida com alto grau de pureza. No entanto, a gua deionizada pode ser aplicada para o preparo da maioria das solues. Devem-se utilizar substncias testadas para culturas de clulas e com alto grau de pureza. No rtulo, sempre que possvel, deve constar o nmero do lote, o prazo de validade e as condies de estocagem. Deve-se utilizar tripsina na diluio 1:250, obtida de pncreas suno e testada em cultura de clulas. A L-glutamina um aminocido essencial e suplemento fundamental dos meios de cultura. Como a L-glutamina degradada a 36,5 oC, ela deve ser adicionada a meios de cultura suplementados a mais de 15 dias.
4.2. Soro fetal
Apesar da sua constituio qumica, os meios de cultivo so usualmente suplementados com 5% a 20% de soro, pois as clulas em cultura tambm necessitam de fatores de crescimento, hormnios, protenas e peptdeos, nucleosdeos, lipdeos e inibidores que podem ser supridos por esse fluido animal. Deve-se utilizar um soro fetal certificado, estril, inativado a 56 oC por 30 minutos, livre de micoplasmas e sem endotoxinas. Atualmente, os soros esto disponveis comercialmente e os mais utilizados em cultivos celulares so os soros de origem bovina, de cavalo e humano. O soro obtido do plasma,
sob condies asspticas e estreis, por puno cardaca ou venosa. A coleta, a manipulao, o processamento e a estocagem so realizados visando-se manter as propriedades e qualidades do soro. A escolha do soro depende de requisitos de cada tipo celular, e um dos mais utilizados o soro fetal bovino. No caso do soro fetal bovino, cada procedimento corresponde a uma partida, ou lote diferente. As variaes qualitativas e quantitativas dos componentes do soro podem interferir no crescimento das clulas em cultura. Dessa forma, a capacidade de possibilitar o crescimento celular deve ser avaliada para cada lote de soro adquirido. Cada lote deve ter um certificado com todos os dados dos testes bioqumicos e microbiolgicos realizados, devendo ser testados para deteco de bactrias, fungos, Mycoplasma e agentes virais.
4.3. Sistema de filtrao
Para substncias orgnicas que no resistem ao processo de esterilizao por autoclave, convm dispor-se de dispositivo para filtrao por membranas. Algumas substncias orgnicas so degradadas pelo calor, sendo lbeis autoclavao, precisando ser esterilizadas com um filtro especial de acetato de celulose com porosidade inferior a 0,22 mm. Uma reao que pode ocorrer durante a autoclavao a caramelizao (reao entre acares e aminocidos) e a hidrlise da sacarose. Essas reaes se intensificam com o aumento do tempo da autoclavao. Assim, utiliza-se o processo de filtrao, que consiste na passagem de lquido por membrana filtrante com pequenos poros que impedem a passagem de microrganismos. Filtros reutilizveis podem ser esterilizados por autoclavao, sendo os descartveis tambm muito utilizados e, apesar de mais caros, o processo mais rpido e mais seguro.
A maioria das solues estreis de uso em cultura de clulas preparada por filtrao em membrana esterilizante de 0,22 m. Contudo, algumas solues podem ser esterilizadas por autoclavao a 121oC por 15 minutos. Utilizam-se tambm membranas de 0,45 m, como pr-filtro para clarificar solues menos lmpidas. Em cmara de fluxo laminar, a filtragem realizada com um sistema para filtrao sob presso com filtro de 0,22 mm em volumes maiores que 10 L; para volumes entre 0,1 e 10 L esterilizam-se em sistema de filtrao a vcuo com filtro de 0,22 mm e, para at 100 mL, sistema de filtrao por seringa com filtro de 0,20 mm. Aps a realizao da filtrao, fundamental testar o material filtrado para verificar a eficincia do procedimento, por meio da realizao de teste de esterilidade por inoculao direta do filtrado em meio de cultivo.
5. Aplicaes dos cultivos celulares 5.1. Produo de imunolgicos
Existem muitas aplicaes para a cultura de clulas. As primeiras aplicaes se relacionam com a produo de anticorpos monoclonais. Os anticorpos monoclonais tm sua maior aplicao nos imunoensaios, como o ELISA. Alm disso, esses anticorpos tambm so muito utilizados associados a marcadores radioativos em imunocintilografia. Os anticorpos monoclonais so produzidos em clulas denominadas hibridomas, que resultam da fuso de clulas de mieloma murino com linfcitos B produtores de um determinado anticorpo. As clulas do hibridoma so imortais e produzem anticorpos, assim como a sua precursora. Vrias protenas diferentes de anticorpos comercializadas so produzidas a partir de cultura de clulas. Eritropoietina humana, fator VIII para hemofilia, dentre outras, so produzidas em clulas cultivadas, pois necessi-
tam de maquinrio complexo para a sua produo que no encontrado em clulas procariontes. Uma aplicao importante da cultura de clulas em imunobiolgicos se relaciona com a produo de vacinas. Para crescimento viral, necessrio o seu cultivo em clulas, pois os vrus se replicam em hospedeiros. A vacina de sarampo produzida em culturas primrias de fibroblastos de embrio de galinha, enquanto a vacina de poliomelite, fabricada na Frana, em clulas de rim de macaco-verde africano (cercopithecus aethiops). Um dos grandes desafios da atualidade a produo de vacinas em clulas de linhagens transformadas sem afetar o indivduo que ir utiliz-las. Essas pesquisas esto em desenvolvimento e, em muitos casos, j esto sendo aplicadas. No Brasil, ainda no existem vacinas fabricadas em clulas transformadas, mas a clula Vero alvo de pesquisas de muitas instituies.
5.2. Virologia
Na virologia, a cultura de clulas muito utilizada para a obteno viral. Como os vrus necessitam de hospedeiros, na cultura de clulas que possvel cultiv-los. A cultura de clulas permite o isolamento do vrus para avaliar o seu efeito em determinados tipos celulares, alm de verificar quais clulas so suscetveis a determinados vrus.
5.3. Terapia celular
O termo terapia celular identifica uma tcnica com o objetivo de restabelecer a funo ou a estrutura de um tecido por meio da utilizao de clulas, e vem sendo utilizada no caso de traumas, doenas degenerativas ou agresses aos tecidos do corpo. Para a terapia celular, necessrio ressaltar a importncia do conhecimento da clula em seu ambiente original, pois informaes sobre a estrutura do
microambiente celular so necessrias para a reproduo desses elementos em cultura. Na bioengenharia, a estrutura tecidual reproduzida o mais fiel possvel quela do tecido original, tanto em contedo de material presente quanto como ao comportamento das clulas presentes. Dessa forma, seria possvel a substituio dos tecidos danificados por novos tecidos formados em cultura, substituindo-se aquele que sofreu algum dano em determinado momento da vida do indivduo. Uma aplicabilidade da bioengenharia obteno de clulas do prprio paciente para o cultivo e formao de tecido. Esse tecido cultivado em laboratrio, acrescido de fatores e do microambiente necessrio diferenciao e formao tridimensional da clula, mimetizando o tecido original que, aps um determinado perodo, reimplantado no paciente, substituindo o tecido lesado. Outro avano na terapia celular o uso de clulas-tronco no tratamento de doenas degenerativas. Clulas-tronco possuem alta capacidade de diferenciao e de proliferao sendo possvel formar a partir delas clulas diferenciadas que exeram funes especficas. As clulas-tronco podem ser de origem embrionria (clulas-tronco embrionrias) ou de tecidos adultos (clulas-tronco adultas). As clulastronco embrionrias tm alta capacidade de replicao e de diferenciao; no embrio todo o organismo complexo ser formado a partir destas clulas. As clulas-tronco adultas so clulas de proliferao modulada, quiescentes, que se mobilizam para estabelecer a reposio de clulas que morreram ou que se ativam e proliferam intensamente no momento necessrio regenerao de um tecido danificado.
Para saber mais:
MORAES, A. M.; AUGUSTO, E. F. P CASTILHO, L. R. Tecnologia do cultivo de .; clulas animais: de biofrmacos terapia gnica. So Paulo: Rocca, 2007. 503 p.
| 253
MANUTENO de linhagens de clulas animais. In: FUNDAO OSWALDO CRUZ. Manual da qualidade. Rio de Janeiro: INCQS/Fiocruz, 2008. PERES, C. M.; CURI, R. Como cultivar clulas. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2005. 283 p. FRESHNEY, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. 4. ed. Nova York: Wiley-Liss, 1994. 397 p. VREMEULEN, K. The Cell Cycle: A Review of Regulation, Deregulation and Therapeutic Targents in Cancer. Cell Proliferation, n. 36, p. 131-149, 2003.

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Um sonho quase realizado

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Um Sonho Quase Realizado | 17

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Biologia Celular e Ultraestrutura

2.1. Membrana celular

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Biologia Celular e Ultraestrutura

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2.4. Retculo endoplasmtico

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2.5. Complexo de Golgi

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Biologia Celular e Ultraestrutura | 37

3.1.2. Colorao com Giemsa

fosfato 0,2M soluo de uso filtrado), por 15 minutos em temperatura ambiente;

Preparao do tampo fosfato 0,2M:

38 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

3.2. Protocolo de marcao do retculo endoplasmtico

Biologia Celular e Ultraestrutura

3.3. Protocolo para marcadores seletivos de mitocndria

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Biologia Celular e Ultraestrutura

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Znula de ocluso: localizada na poro apical das clulas epiteliais,

funo aumentar a adesividade intercelular.

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altas, achatadas como ladrilhos e com o ncleo redondo ou alongado e central.

Figura 1A. Epitlio pavimentoso. EP epitlio, MB membrana basal, TC tecido conjuntivo.

Epitlios cbicos (Figura 1B): clulas com altura e largura equivalen-

Epitlios cilndricos (Figura 1C): tambm chamados de prismticos

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Figura 1C: Epitlio cilndrico. EP epitlio, MB membrana basal, TC tecido conjuntivo.

Epitlio especial ou de transio: clulas epiteliais cuja forma varia

2.2. Epitlios glandulares

Os epitlios glandulares podem ser classificados de acordo com diversos aspectos:

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Glndulas mercrinas, holcrinas e apcrinas (Figura 6)

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extracelular das cartilagens, formando fibrilas e atuando como molas biomecnicas.