PRCTICA # 8 INTERPRETACIN DE LA REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA OBJETIVO: Determinar la importancia de la reaccin en cadena de la polimerasa y de esta manera mediante pruebas

por ayuda de la tcnica de electroforesis interpretar esta reaccin y sus caractersticas. INTRODUCCIN La reaccin en cadena de la polimerasa, ya ms conocida como PCR, es una tcnica que permite replicar entre cientos de miles y millones de veces, en el transcurrir de pocas horas e in vitro, pequeas cantidades de ADN. Uno de los aportes fundamentales de esta metodologa a la investigacin bsica en biologa molecular consiste, precisamente, en la rapidez y eficiencia mediante las cuales se realiza una tarea que antes requera largas y tediosas Jornadas. El producto que se obtiene al finalizar la reaccin -una gran cantidad de un fragmento gnico con alto grado de pureza- favorece la tarea de los investigadores empeados en ampliar nuestros conocimientos sobre la estructura y funcin de los genes. Por su alta sensibilidad, esta tcnica permite identificar un gen a partir de un solo cabello, una clula somtica o un espermatozoide. Ha facilitado, y en muchos casos hecho posible, la tarea de identificacin de personas, por ejemplo de hijos de desaparecidos, mediante el anlisis de muestras del nio y de su abuela materna. Entre las aplicaciones mdicas de la PCR cabe destacar su aporte al desarrollo de nuevas estrategias de diagnstico. Permite detectar agentes infecciosos como los virus de las hepatitis B y C o regiones del genoma del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV). Ha sido aplicada, por ejemplo, para diagnosticar la presencia o ausencia de HIV en recin nacidos de madres seropositivas, pues la existencia de anticuerpos maternos impide obtener resultados confiables, con los mtodos convencionales, durante el primer ao de vida. Tambin ha facilitado el diagnstico de enfermedades tales como las hemofilias A y B, la distrofia muscular y la fibrosis qustica, e hizo posible reconocer mutaciones de genes vinculadas con enfermedades oncolgicas. Su sensibilidad permite detectar poblaciones residuales de clulas cancerosas en pacientes sometidos a quimioterapia y de este modo se ha podido determinar, con una antelacin en extremo valiosa, un nuevo avance de la enfermedad. Existen ya modos de evaluar a travs de la PCR el riesgo de padecer dolencias tales como diabetes de tipo I y la enfermedad celaca. Los genes son porciones de cido desoxirribonucleico (ADN) que tienen la informacin necesaria para la fabricacin de los cidos ribonucleicos (ARN) y, en ltima instancia, a travs de stos, de las protenas: el ARN "copia" el mensaje contenido en el ADN y a partir de l da lugar a la correcta formacin de la cadena o secuencia de aminocidos que constituyen las protenas. Todos los genes estn compuestos por la misma materia prima: una sucesin de nucletidos. Cada nucletido est formado por un grupo fosfato, un azcar con cinco carbonos (la desoxirribosa) y una de las siguientes bases nitrogenadas: adenina, timina, guanina o citosina. Los genes no se distinguen unos de otros por tener una composicin fisicoqumica muy diferente, sino por el orden o secuencia en la que estas cuatro bases se disponen a lo largo de la molcula de ADN. El hecho de que los genes no se distingan por su composicin fisicoqumica hace prcticamente imposible aislarlos mediante el empleo de mtodos bioqumicos de fraccionamiento del tipo de los usados para purificar protenas como son, por ejemplo, la cromatografa, la electroforesis o la ultracentrifugacin. Por otra parte, cada gen es una unidad de informacin sin solucin de continuidad respecto del resto del ADN en el que est inmerso. Esto significa que a todo gen lo preceden y suceden otras secuencias de ADN que, en general, no tienen relacin con l. El gen que codifica para la insulina, por ejemplo, tiene una "longitud" de 1.700 bases y su masa representa slo la dos millonsima parte del ADN contenido en el ncleo de una clula humana. Hasta mediados de la dcada del ochenta, la nica estrategia posible para aislar un gen y obtener grandes cantidades del mismo en estado puro era el "clonado molecular". Este mtodo se basa en la introduccin de fragmentos de ADN, uno de los cuales contendr el gen de inters, en vectores. stos son molculas de ADN (plsmidos o ADN de bacterifagos) capaces tanto de transportar fragmentos ajenos a su estructura original como de multiplicarlos dentro de bacterias. Si se conoce un pequeo tramo de la secuencia de aminocidos de una protena cuyo gen se desea "clonar" (multiplicar), se pueden

disear mtodos para identificar qu bacterias llevan el vector que transporta dicho gen. Este reconocimiento tambin se puede realizar si se dispone de un anticuerpo contra la protena resultante del gen que se desea clonar. En este caso se reconoce la bacteria portadora porque fabrica la protena codificada por el fragmento de inters, la cual se une especficamente al anticuerpo. Una vez aislado el gen no slo resulta posible determinar con exactitud su secuencia de bases o analizar en detalle la informacin de la que es portador, sino que tambin se puede estudiar su expresin (la manera en que dirige la sntesis de la protena correspondiente) en distintos organismos y tipos celulares, introducido en clulas en cultivo o en animales de experimentacin, etctera. Estas tcnicas, ya clsicas, han permitido el aislamiento y caracterizacin de decenas de miles de genes de microorganismos, animales y plantas, lo que provoc un cambio cualitativo en la comprensin del funcionamiento de la clula. En 1986, K. Mullis, un investigador de la Corporacin Cetus, invent un mtodo para lograr la multiplicacin in vitro de fragmentos definidos de ADN sin necesidad de recurrir a los vectores y su replicacin en bacterias. Este mtodo revolucionara en corto tiempo el conjunto de tcnicas de la biologa molecular. Su uso se extendi rpidamente a miles de laboratorios, no slo de investigacin bsica, sino tambin de diagnstico clnico. Se trata de la reaccin en cadena de la polimerasa, ya muy conocida como PCR, siglas provenientes del ingls Polymerase Chain Reaction. LA TECNICA PCR Esta tcnica permite multiplicar ("amplificar" es, en realidad, el trmino que se ha impuesto) pequeas cantidades de ADN entre cientos de miles y millones de veces. El tramo destinado a reproducirse puede tener desde cincuenta hasta ms de dos mil nucletidos de longitud. El segmento de ADN que sirve de molde no requiere estar necesariamente en estado puro, sino que puede ser parte de mezclas complejas. Puede ser, por ejemplo, ADN nuclear total. El mtodo se basa, en su forma ms simple en la realizacin de tres reacciones sucesivas llevadas a cabo a distintas temperaturas. Estas reacciones se repiten cclicamente entre veinte y cuarenta veces . La muestra se calienta, en el primer paso, hasta lograr la separacin de las dos cadenas que constituyen el ADN, hecho que se conoce como "desnaturalizacin". En el segundo paso, la temperatura se reduce para permitir el "apareamiento" de cada una de dos cadenas cortas de nucletidos (oligonucleridos) con cada una de las hebras separadas del ADN molde. Se trata de segmentos de ADN de cadena simple, sintetizados en el laboratorio y diseados de manera tal que permiten definir los lmites del tramo de ADN que se desea replicar. Obviamente, para que se pueda producir el apareamiento, cada uno de estos oligonucletidos, a los que se denomina "iniciadores" o primers, debe ser complementario del tramo al que tienen que unirse en las cadenas separadas del ADN molde. En tercer lugar, una enzima ADN polimerasa extiende los primers, en el espacio comprendido entre ambos, sintetizando las secuencias complementarias de las hebras del ADN molde. Para ello, la ADN polimerasa usa desoxidonuclesidos trifosfato (dNTPs) agregados a la mezcla de reaccin. La temperatura a la que se realiza el tercer paso est condicionada por aqulla a la cual "trabaja" la enzima ADN polimerasa. Al cabo del primer ciclo de tres reacciones (desnaturalizacin, apareamiento, extensin) el tramo de ADN elegido se ha duplicado y el doble de su cantidad original se encuentra disponible para ser nuevamente replicado en un segundo ciclo. El resultado de la aplicacin de numerosos ciclos "en cadena" da lugar a la amplificacin geomtrica del segmento de ADN delimitado por los primers. Para replicar el ADN, la tcnica PCR hizo uso, en un principio, de la ADN polimerasa de la bacteria Escherichia coli. Pero esta enzima resulta desactivada debido a la alta temperatura requerida para desnaturalizarla doble cadena del ADN, por lo cual deba agregarse enzima fresca al comenzar el tercer paso de cada ciclo. Este inconveniente fue solucionado de manera ingeniosa cuando se la reemplaz por su equivalente de la bacteria "termfila" Thermus aquaticus. En efecto, la ADN polimerasa de este microrganismo, denominada Taq polimerasa, acta eficientemente entre los 75 C y los 80 C y resiste ms de dos horas a 93 C. De esta manera es posible mezclar todos los componentes de la PCR al comenzar el primer ciclo y la reaccin en cadena puede llevarse a cabo mediante equipos automatizados que realizarn los ciclos trmicos programados. Todo esto no hace ms que confirmar la creciente popularidad de la PCR entre investigadores, mdicos y bioqumicos clnicos. Una vez finalizada la reaccin se habr logrado fabricar, en pocas horas, gran cantidad de un fragmento gnico con un alto grado de pureza. Obtener el mismo resultado utilizando las tcnicas clsicas de clonado llevara varios das de tedioso trabajo. Por otra parte, la tcnica PCR es el mtodo de deteccin de secuencias de ADN ms sensible conocido hasta la fecha: mediante ella resulta posible identificar un gen a partir de un solo cabello, una clula somtica o un espermatozoide. Es, por lo tanto, un instrumento extremadamente valioso para establecer, por ejemplo, lazos de parentesco

Para lograr la duplicacin de un tramo de ADN, cada ciclo de la tcnica PCR incluye tres etapas: a) desnaturalizacin, durante la cual se separan las dos hebras constituyentes del ADN; b) apareamiento de los "iniciadores" o primers del tramo a replicar; c) extensin de las cadenas de primers gracias a la accin de una enzima ADN polimerasa. La repeticin de los ciclos permite multiplicar geomtricamente los tramos de ADN elegidos.

EL ANLISIS DE LAS MUESTRAS El hecho de que las molculas de ADN obtenidas al finalizar la reaccin en cadena correspondan efectivamente al fragmento de inters queda asegurado por la intervencin de los primers que definen los extremos "derecho" e "izquierdo" de ese fragmento. As, una vez que la reaccin a finalizado, el tamao del fragmento multiplicado puede determinarse sometiendo los productos de la reaccin a una electroforesis en gel de agaroza o poliacrilamida, es decir, a un proceso de separacin por difusin bajo la accin de un campo elctrico. Por otra parte, la identidad del producto puede ser confirmada mediante hibridacin (unin complementaria) con una sonda marcada radiactivamente, cuya secuencia de bases est contenida en el fragmento de inters. En este caso se procede as: el ADN fraccionado por electroforesis es desnaturalizado y luego transferido a una membrana de nitrocelulosa o nylon, que acta como soporte slido (Southern blot), y luego es puesto en contacto con la sonda, que se unir al fragmento buscado ya que ha sido preparada de modo tal que resulta ser complementaria del mismo. Tambin es posible colocar el ADN directamente en la membrana en forma de pequeas manchas (dot blot) para su posterior hibridacin con la sonda. La localizacin de las sondas radiactivas se logra, en ambos casos, mediante autorradiografas.

Tres formas de analizar los fragmentos de ADN amplificados mediante la tcnica PCR. A: visualizacin directa. Las muestras colocadas sobre un gel y sometidas a la accin de un campo elctrico (electroforesis) migran de una manera caracterstica que se puede visualizar por tincin (coloreado) del ADN. (Carriles 1-8: productos de distintas PCRs; carril M: marcadores de ADN de tamao conocido.) B: Southern blot. El ADN es desnaturalizado (separacin de sus hebras constituyentes) y transferido a una membrana de nitrocelulosa o nylon para luego incubar la hibridacin (unin) con una sonda radiactiva. sta quedar fijada donde se encuentre el tramo de ADN de inters y su presencia se revelar a travs de una autorradiografa (placa fotogrfica sensible a la emisin radiactiva de la sonda). C: dot blot. Mtodo anlogo al anterior, pero practicado sobre una siembra en forma de manchas de los fragmentos de ADN a analizar previamente desnaturalizados.

Una estrategia distinta para confirmar la identidad del fragmento replicado consiste en realizar dos reacciones de PCR consecutivas. Al finalizar la primera, una alcuota de la misma es sometida nuevamente al proceso de multiplicacin tras haber colocado dos primers internos. Mediante el empleo de esta metodologa, conocida como nested PCR (PCR anidada), la filiacin de los fragmentos obtenidos queda confirmada por el hecho de que poseen tamaos previsibles.

En algunos casos, los productos amplificados poseen secuencias que son reconocidas y clivadas por ciertas enzimas llamadas en donucleasas de restriccin. La determinacin del tamao al que quedan reducidos los fragmentos al ser puestos en contacto con la enzima de restriccin adecuada indica que nos encontramos ante los segmentos de inters. Para disear los primers que hacen posible replicar un fragmento de ADN mediante la tcnica PCR es necesario conocer, en la mayora de los casos, la secuencia de bases total o parcial de dicho fragmento. Por esta razn, aunque la PCR supera en sensibilidad y rapidez a las tcnicas de clonado y de secuenciacin convencionales, no se puede prescindir de la informacin brindada por las mismas. PROBLEMAS DE LA TCNICA PCR Uno de los problemas ms evidentes que presenta esta tcnica, sobre todo cuando se la utiliza cono herramienta de diagnstico, es la posible generacin de resultados falsamente positivos. Podra llegar a indicar, por ejemplo, la presencia de secuencias virales en personas no infectadas. Esto es consecuencia de la extrema sensibilidad del mtodo. Los falsos positivos pueden generarse por contaminacin de una muestra a partir de una nica molcula de ADN proveniente de otra muestra. Esta molcula ser amplificada en la PCR y aparecer como una banda en el caso de electroforesis en gel o como una respuesta positiva en una hibridacin con una sonda radiactiva. La causa ms frecuente de falsos positivos es el "arrastre" de secuencias de ADN amplificadas en reacciones previas. Tales secuencias pueden estar presentes en los equipos de laboratorio y en los reactivos, pudiendo esparcirse por medio de aerosoles. Frente a esto, los expertos recomiendan la realizacin de controles negativos mltiples (reacciones de amplificacin con todos los reactivos, excepto el ADN molde), adems del uso de tcnicas de esterilidad y de micropipetas que eviten la generacin de aerosoles como precaucin para prevenir la contaminacin de las muestras. MATERIAL

Micropipetas Puntas para micropipetas Tubos eppendoff con muestras de PCR ( amplificadores de PCR)

REACTIVOS ter

Agua destilada. EtOH Bromuro de Etidio Agar Amplisize Agarose (BIO RAD) Amortiguador TBE Buffer de corrimiento Buffer de carga EQUIPO Cmara de electroforesis Matriz o molde de agarosa PROCEDIMIENTO Electroforesis en gel de agarosa para la visualizar el material gentico 1. Preparar 10 ml de EtOH al 75% y 100 ml de agarosa al 10 % (aadindole 10 ml de Bromuro de Etidio) Precaucin: El bromuro de etilo es un carcingeno y debe manejarse con cuidado. Hay que evitar que se derrame la disolucin o tener contacto directo con esta. La punta que contiene bromuro de etidio debe ser descartada en un recipiente especial para descartar material contaminado con bromuro de etidio 2. Preparar la cmara de electroforesis: a) Disolver la agarosa en 30 ml de amortiguador TBE 0.5x.

b)

Calentar por 45s, luego se agita con movimientos circulares hasta que se disuelvan todas las partculas de agarosa translcidas. Se debe tener precaucin con los recipientes calientes ya que pueden causar quemaduras.

c) d) e) f) g) h)

El soporte para chorrear el gel debe estar limpio y seco, se ajusta en el molde portagel o tabla niveladora y se colocan los peines que generarn los pozos para aplicar las muestras Cuando la agarosa alcanza los 5060 C aproximadamente se vierte en el centro de la bandeja para gel evitando la formacin de burbujas. Se deja reposar, el gel tarda de 2040 minutos para solidificar a temperatura ambiente. Una vez solidificado el gel se quitan los peines, sujetndolo con ambas manos y jalando cuidadosamente hacia arriba. Posteriormente se traslada el soporte para el gel hasta la cmara de electroforesis, colocando los pozos mas cercanos al borde hacia el polo negativo (de color negro) debido a que las muestras migrarn hacia el nodo (de color rojo) durante la electroforesis Se agrega TBE hasta sumergir el gel unos 2 a 6 mm.

3.- Observar el material preparado de PCR en la cmara de electroforesis

Colocar 5 l de muestra y 5 l de colorante en cmara de electroforesis

Hacer pasar a 100 Volts el gel Se observa en la cmara de UV RESULTADOS

Como se puede observar en las fotografas algunos de los amplificadores avanzaron ms que los otros, esto dependiendo de los pares de bases que contenan, es decir, a mayor nmero de pares de bases que contendiera la muestra, era mayor su avance por la cmara de electroforesis, esto debido a los pesos moleculares de cada muestra y como ya sabemos las muestras de mayor peso molecular tendan a avanzar ms hacia el polo positivo de la cmara de electroforesis y las de menor tamao se retendrn en el polo negativo. DISCUSIN DE RESULTADOS No se realiz en el laboratorio la tcnica de PCR en el laboratorio debido a la falta del material y los equipos necesarios, sin embargo se realiz la investigacin sobre el tema para lograr comprenderlo de manera ms adecuada. De esta manera se determin que para realizar la reaccin en cadena de la polimerasa se toma un DNA molde y el fundamento se basa en 3 pasos en base a las propiedades del DNA, pero fundamentalmente los pasos comprenden:

1)

Desnaturalizacin: La cual consiste en que se rompen los puentes de hidrgeno y se separan las cadenas (por temperatura de 90-96C) 2) Alineamiento: Es la temperatura necesaria para que el primer (pequea secuencia de oligonucletidos que flanquean la regin de inters y por complementariedad de DNA se pega a la cadena que esta desnaturalizada) se alinee, renaturalice y se una a su molde para que se vuelvan a formar los puentes de hidrgeno; el alineamiento es especfico dependiendo de la secuencia del primer y la temperatura depende de los puentes de hidrgeno ( a mayores puentes de hidrgeno, mayor temperatura). 3) Extensin: La polimerasa se activa, toma los nucletidos y forma la nueva cadena, esto ya que la polimerasa solo reconoce dobles cadenas y se posiciona en ellas para replicar DNA secuestrando DNTPs (ologonucleotidos o dinucleotidos trifosfatos para formar nuevas cadenas MP) y forman la nueva cadena;

para esto se requiere de un cofactor como el MgCl2 y con cantidad suficiente se activa la polimerasa, para esto se requiere de una temperatura de extensin de 70.72C (que es la temperatura necesaria para que la polimerasa lleve a cabo su funcin) para que este activo el cofactor y estos pasos se realizan en un termociclador. Estos 3 pasos se generan muchas veces hasta que se obtienen los resultados deseados para analizar posteriormente la muestra. Para detener esta secuenciacin se utilizan didesoxicitocinas trifosfatos y de esta manera ya no se puede polimerizar ms. Para leer las secuencias resultantes, estas se leen de abajo para arriba dependiendo de cmo se obtengan, es decir en secuencias con sentido y antisentido (complementaria). CONCLUSIONES: La Reaccin en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en ingls, es una tcnica de biologa molecular, cuyo objetivo es obtener un gran numero de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mnimo, en teora, de una nica copia de ese fragmento. Esta tcnica sirve para amplificar ADN. Tras la amplificacin, resulta mucho ms sencillo identificar con una muy alta probabilidad virus y/o bacterias causante de una enfermedad, identificar personas (cadveres, criminales...) o hacer investigacin cientfica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificacin han hecho que se convierta en una tcnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo. Esta tcnica se fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, y usa ciclos de alta y baja temperatura para separar las hebras de ADN recin formadas entre s tras cada fase de replicacin y, a continuacin, dejar que vuelvan a unirse a polimerasas para que vuelvan a duplicarlas. En general la tcnica de PCR es bsicamente una tcnica de amplificacin de DNA, por medio de una reaccin in Vitro por medio de un molde de DNA que se amplifica muchas veces. Y sirve para el diagnstico molecular, es decir, para saber el estado de un gen y tiene como objetivo identificar las secuencias gnicas, esto sobretodo tiene aplicacin para diagnosticar enfermedades y para ampliar nuestros conocimientos sobre la estructura y funcin de los genes.. REFERENCIAS http://www.cienciahoy.org.ar/hoy23/reaccion1.htm EINSTEIN, B.I.,1990, "The polymerase chain reaction. A new method for using molecular genetics for medical diagnosis", en New English Journal of Medicine, enero 18. HANDYSIDE,A., KONTOGIANNI,E.H.,HARDY,K. y WINSTON,R.M.L., 1990, "Pregnancies from biopsed human preimplantation embryos sexed by Y-specific DNA amplification", en Nature, vol. 344, pgs.768-770. MULLIS. K. B..1990,"The unusual origin of the poly merase chain reaction en Scientific American" vol. 262, pgs. 56-65. WATSON,J.D.,GILMAN,M.,WITKOWSKI, J y ZOLLER. M.,1992, Recombinant DNA, 2da Edicin. Scientific American Books Freeman New York.