COMBINATII COMPLEXE ALE CUPRULUI FOLOSITE CA MODEL PENTRU SUPEROXID DISMUTAZA

BUCURESTI

2012

CUPRINS
Partea I: Studiu bibliografic 1. Generalitati...................................................................................................................... 3

2. Raspandire si rol in organism.. 3 3. Specii reactive de oxygen 4 4. Superoxid dismutaza cu Cu si Zn 5. Factorii implicati in reglarea SOD ................................................................................. 7 8

6. Actiuni terapeutice 8 7. Medicamente ce contin SOD........................................................................................... 8. Modele pentru superoxid dismutaza ca agenti terapeutici utilizati pentru reglarea metabolismului anionului superoxid..................................................................................... 11 Partea a II-a: Partea experimentala-Sinteza combinatiei complexe a Cu (II) cu ligandul hexaazamacrociclic rezultat prin condensarea etilendiaminei cu 3-amino-4H-1,2,4-triazolul si formaldehida ca model pentru SOD 1. Mod de lucru...................................................................................................................... 12 2. Rezultate si discutii............................................................................................................ 12 2.1. Spectre IR....................................................................................................................... 12 2.2. Spectre UV-VIS............................................................................................................. Concluzii............................................................................................................................... Bibliografie........................................................................................................................... Anexe 2 13 15 16 9

PARTEA I: STUDIU BIBLIOGRAFIC

1. GENERALITATI Enzimele (din limba greac - zymosis - ferment) sunt proteine sau proteide fr de care celule vii nu pot nfptui reacii complexe ntr-un timp scurt, la temperatura mediului nconjurtor. Ele sunt substane care catalizeaz reaciile biochimice din organism, avnd un rol esenial n biosinteza i degradarea substanelor din materia vie, ntlnindu-se n toate organismele animale, vegetale i n microorganisme, mai fiind denumite din aceast cauz biocatalizatori. Fr enzime, procesele biochimice s-ar desfura cu viteze foarte mici. Rolul in organism: descompunerea moleculelor mari, accelereaz procesele metabolice, coordoneaz unele etape ale ciclului metabolic. SOD este o enzima care catalizeaza transformarea anionului superoxid in oxigen molecular si peroxid de hidrogen, fiind un mecanism biologic primar de aparare impotriva superoxidului. Anionul superoxid este una dintre cele mai reactive specii de oxigen si este produs diferite procese endogene normale, inclusiv in auto-oxidarea hemoglobinei, in

hidroxilarea oxidazei microzomale cu functii mixte sau in procesul de fagocitoza granulocitara. De aici reiese rolul deosebit pe care aceasta enzima il are in organism.

2. RASPANDIRE SI ROL IN ORGANISM Superoxid dismutazele au rol vital in apararea celulelor impotriva radicalului superoxid, factor important al distrugerilor provocate de radiatii, inflamatii si de promovare a tumorilor. Superoxid dismutaza a fost descoperita de ctre Irwin Fridovich i Joe McCord si se gaseste atat in regnul vegetal, animal, cat si in microorganisme: eritrocite; ficat; E. Coli si alte bacterii; la plantele superioare (mitocondrii si peroxizomi); Ficatul uman contine cantitati importante de SOD. Din punct de vedere biochimic, la mamifere exista doua izoenzime ale SOD: CuZnSOD care contine cupru si zinc , localizata in compartimentul citozolic si MnSOD, localizata in matricea mitocondriala.

A C I UN E A

S UPE R OX I D DI S M UT AZ E I

( SOD )

N OR GA N I S M :

1. mpiedica producerea agenilor liberi nocivi 2. antioxidant natural 3. eficient n cazul bolilor cronice 4. apar organismul mpotriva impactului radicalilor liberi 5. ncetinete mbtrnirea i apra mpotriva radiaiilor UV 6. ajut n strile de convalescen i mpotriva dependenei de droguri 7. confer protecie mpotriva radiaiilor solare, poluare i pentru utilizatorii de calculatoare 8. combate radicalii liberi i substanele cancerigene 4

Superoxid dismutaza are largi utilizari in industria farmaceutica si cosmetica, pentru prepararea de produse care au rolul de a reduce efectul negativ al radicalilor liberi din organism.

3. SPECII REACTIVE DE OXIGEN Energia necesara organismelor nefotosintetice se obtine prin reducerea enzimatica a moleculei de dioxigen. La unele organisme unicelulare se intalneste procesul simplu de difuzie, dar acesta nu este suficient de rapid pentru a suplini necesarul pentru fiecare celula a unui organism pluricelular. Prin urmare, s-au dezvoltat proteine ca hemoglobina si mioglobina pentru a lega, transporta, stoca si elibera O2 si pentru a ajuta la livrarea rapida a acestuia la celule. Dioxigenul reprezinta de asemenea sursa de atomi de oxigen pentru un numar mare de enzime care catalizeaza transformarea speciilor organice. Desi mediul din interiorul celulelor vii are caracter puternic reducator si combinatiile oxigenului cu multe dintre componentele vitale ale celulei sunt instabile termodinamic, multe reactii ale O2 au energii de activare foarte mari in absenta catalizatorilor sau initiatorilor de tip radicali liberi si astfel acestea contribuie in mica masura la consumarea oxigenului; altfel, celula ar arde si viata aeroba ar fi imposibila. Totusi, exista cantitati nesemnificative de produsi formati din reactii necatalizate si enzimatice ale O2 care conduc, in celulele aerobe, la forma partial reduse ale acestuia, superoxidul(O2-) si peroxidul de hidrogen(H2O2), care impreuna cu speciile provenite din acestea prin reactii ulterioare(radicalul hidroxil si peroxonitritul ONOO-), sunt denumite specii reactive ale oxigenului (SRO). Radicalii hidroxil reprezinta una dintre cele mai reactive SRO si se pot genera din reactia peroxidului de hidrogen cu ioni metalici cu caracter reducator ca Fe2+ si Cu+, reactii cunoscute sub denumirea de chima lui Fenton. Formarea acestor radicali presupune aparitia unor intermediari oxo sau hidroxo cu valenta mare, (FeIV=O)2+ sau (CuIII-O)2+ care impreuna pot initia autooxidarea lipidelor prin intermediul radicalilor liberi si pot distruge peroteinele, acizii nucleici, carbohidratii si alte molecule organice cand aceste specii sunt generate in vecinatatea acestora. Peroxidul de hidrogen este un agent oxidant puternic din punct de vedere termodinamic, dar reactiile la care participa se desfasoara cu viteza mai mica in absenta catalizatorilor. Urmele 5

de ioni metalici redox activi pot cataliza astfel de reactii, deoarece peroxidul de hidrogen poate functiona atat ca oxidant cat si ca reducator; in aceste reactii se pot genera de asemenea radicali hidroxil ca intermediari. Se cunosc 4 tipuri de degradari oxidative produse de SRO: Degradarile oxidative specifice unui anumit situs care implica generarea catalizata de catre ionii metalici a radicalilor hidroxil din peroxidul de hidrogen ce determina modificarea bazelor sau distrugerea monocatenara a ADN-ului; Peroxidarea lipidelor care duce la distrugerea membranelor si generarea unor produsi toxici ca malondialdehida (MDA) si 4-hidroxi-2-nonenal (HNE) ce reactioneaza cu alte componente ale celulei; Distrugerea proteinelor ca rezultat al oxidarii directe de catre SRO sau reactii cu produsii de metabolizare ai lipidelor MDA si HNE; Reactia directa a superoxidului cu clusteri Fe-S aflati in pozitii expuse care produce dezasamblarea totala sau partiala a acestora, inactivarea proteinei si eliberarea Fe care poate cataliza generarea unei cantitati mai mari de radicali hidroxil in locatii specifice. Enzimele cu proprietati antioxidante (de tip catalaze si peroxidaze in cazul peroxidului de hidrogen si superoxid dismutaze sau superoxid reductaze in cazul anionului superoxid) si moleculele cu masa moleculara mica cu proprietati antioxidante apara organismul de aceste specii. In compartimentele apoase ale organitelor se gasesc catalaze, peroxidaze, ascorbatul si glutationul, iar in cele lipidice vitamina E si coenzima Q. Mitocondria contine Mn-SOD si glutation peroxidaza; citoplasma contine Cu, Zn-SOD. Deoarece agentii reducatori cei mai cunoscuti (ascorbat si glutation) transfera unul sau 2 electroni, mecanismul cel mai intalnit pentru reactia de reducere necatalizata a O2 este cel ce conduce la O2-, care dupa formare disproportioneaza rapid in solutie apoasa (cu exceptia valorlor foarte mari de pH) cu formarea peroxidului de hidrogen si O2. Radicalii liberi anorganici (O2-, HO. , NO) sunt specii foarte reactive cu un electron necuplat ceea ce ii transforma in agenti deosebit de instabili si periculosi din punct de vedere biochimic. Activitatea radicalilor liberi a fost descrisa ca un fel de iradiere interna care ataca si distruge celulele si tesuturile, provocand diverse simptome, precum

ridarea pielii, pete pigmentare, cataracta, artrita, ingrosarea arterelor, bolile de inima, glaucomul, boala Alzheimer, pierderea memoriei, apoplexie, senilitate etc. Radicalii liberi produsi de propriul organism joaca un rol important in sistemul de aparare celulara, distrugand bacteriile si virusurile, descompunand poluantii chimici si neutralizand toxinele.

Efectele potential daunatoare ale radicalilor sunt tinute sub control de enzimele cu rol antioxidant, desi in prezent exista multe surse noi, artificiale (radiatiile nucleare, razele X, microundele, metalele grele existente in apa potabila, smogul, aditivii alimentari, fumul de tigara, gazele de esapament, mai ales cele cu continut de Pb, uleiuri vegetale hidrogenate) de radicali liberi pe care organismul inarmat cu propriile arme nu mai reuseste sa le controleze. Organismul uman dispune de antioxidanti naturali (complex de enzime, vitamine, metale si aminoacizi) care identifica radicalii liberi si ii canalizeaza spre molecule antioxidante care ii vor neutraliza; ca si componente ale acestor sisteme antioxidante naturale sunt mentionate: ceruloplasmina, peroxidaza, superoxid-dismutaza, vitaminele E si C si beta-carotenul.

In general, exista 3 tipuri de superoxid dismutaze, fiecare avand un ion metalic diferit in situsul catalitic: superoxid dismutaza ce contine Cu si Zn (Cu, Zn-SOD); superoxid dismutaza ce contine Mn (Mn-SOD); superoxid dismutaza ce contine Fe (Fe-SOD); o forma a enzimei cu Ni (Ni-SOD), descoperita recent. 4. SUPEROXID DISMUTAZA CU CU SI ZN Superoxid dismutaza cu Cu si Zn (Cu, Zn-SOD) este intalnita in majoritatea celulelr eucariote si in multe celule procariote. A fost izolata din drojdii, fungi, plante superioare, hematii si ficatul mamiferelor. Situsul de coordinare al Cu, Zn-SOD este format din 6 resturi histidinice si un rest aspartat. Din punct de vedere al structurii proteice, cele cateva deosebiri importante sunt localizate in apropierea ionului de Cu, care formeaza 3 legaturi coordinative in Cu(I), Zn-SOD si 5 legaturi coordinative in Cu (II), Zn-SOD. In Cu (I), Zn-SOD, Cu monovalent este coordinat la 3 resturi histidinice, intr-un aranjament aproape plan trigonal, in timp ce Zn (II) este coordinat la 3 resturi histidinice si la o grupare carboxilat de la un rest de tip aspartat. In Cu (II), Zn-SOD cea mai mare parte din structura enzimei, precum si a situsului cu Zn si a pozitiei celor 3 histidine legate de Cu sunt foarte putin modificate fata de forma redusa a enzimei. 5. FACTORII IMPLICATI IN REGLAREA SOD Factorii implicati in reglarea SOD sunt complecsi :

 O2, are un efect inductiv asupra SOD, demonstrat clar la bacterii aerobe; continutul ridicat in SOD determina radiorezistenta la bacteria Micrococcus radiodurans; tumorile localizate la nivelul unor organe interne si supuse tratamentului cu antibiotice antraciclinice isi maresc continutul in CuZnSOD, deoarece aceste medicamente actioneaza prin eliberarea de O2-* si H2O2 ; incarcarea cu Cu, induce cresterea activitatii Cu-Zn-SOD si scaderea nivelului de GSH; in plus, cresterea continutului de Cu in ficat determina si cresterea peroxidarii lipidelor. 6. ACTIUNI TERAPEUTICE SOD este recomandat in: - reducerea stresului oxidativ implicat in producerea a peste 60 de afectiuni; stresul oxidativ reprezinta o acumulare exagerata de radicali liberi in organism manifestata printr-un dezechilibru intre speciile reactive de oxigen si capacitatea antioxidanta a organismului. - detoxifiere: sustine mecanismele fazei II de detoxifiere prin glucuronidare in care toxinele exogene si endogene sunt eliminate din organism (calciu d-glucarat reduce actiunea enzimei beta-glucuronidaza care interfereaza procesul de glucuronidare). - toate tipurile de cancer, chimio si radioterapie (sustine functia hematopoetica a maduvei osoase). - afectiuni hepatice de etiologie virala, alcoolica, autoimuna (antiviral, antiinflamator, antifibrozant). - dezechilibre ale sistemului imunitar prin efect imunomodulator. - rectocolita ulcero-hemoragica, boala Crohn, inflamatii digestive. - reumatism, poliartrita reumatoida, spondilita anchilozanta si sindrom Reiter, gonartroza, tendinite. - astm bronsic de etiologie infectioasa, rino-sinuzite, bronsite cronice, bronsiectazii, emfizem pulmonar. - meningite, meningoencefalite acute. - SLA, bolile Alzheimer, Parkinson, epilepsie, migrene, tulburari de memorie si de concentrare mentala. - neuropatie diabetica, retinopatie, sechele AVC, contuzii, vene varicoase, flebite, leziuni endoteliale (mentine structura si functionalitatea sistemului circulator, mbunatateste fluxul sanguin). 9

- repigmentarea zonelor afectate in vitiligo si in hipopigmentatii idiopatice, post-inflamatorii, pitiriazice. - cataracta, glaucom, degenerescenta maculara. - refacerea organismului dupa boli cronice, interventii chirurgicale. - infectii bacteriene, virale, dureri post-herpetice. - alergii (prin efect antihistaminic). 7. MEDICAMENTE CE CONTIN SOD 1. SOD natural este un preparat enzimatic de origine vegetala, obtinut prin extractie din orz verde.

Indicatii: pe baza continutului in substante cu activitate de epurare a radicalilor toxici de oxigen si substante biostimulatoare, preparatul este indicat ca antiinflamator, detoxifiant, hepatoprotector, radioprotector, imunostimulator, energizant si fortifiant al organismului in conditii de stres fizic si psihic. Preparatul are activitate de epurare a radicalilor toxici de oxigen, continand: substante cu activitate enzimatica de tip superoxid dismutaza, catalaza, peroxidaze etc., substante antilipoperoxidante, biostimulatori diferiti, precum si o serie de substante cu actiune energizanta ca oligoelemente (sodiu, potasiu, calciu, magneziu, fier, cupru, fosfor, mangan, zinc), aminoacizi esentiali. Mod de administrare: Adulti: ca antiinflamator si hepatoprotector: se vor administra, per oral, timp de 30 zile, cate 2 fiole pe zi (dimineata si seara); ca radioprotector: se vor administra, per oral, cate 2 fiole pe zi, pe tot intervalul iradierii; ca energizant si in profilaxia proceselor de imbatranire: se va administra, per oral, cate 1 fiola zilnic, timp de 90 zile. 10

Copii: ca energizant, in imunodepresii, in diverse procese inflamatorii, in dermatoze: se va administra, per oral, cate 1 fiola pe zi, timp de 30 zile. Produsul SOD natural se administreaza numai pe cale orala (se va bea); produsul nu este injectabil. 2. S.O.D. 2000 Plus esential in rezistenta celulara impotriva stresului oxidativ. recomandat in toate tipurile de cancer.

Ingredient activ

Cantitat e

Complex de Superoxid dismutaza (SOD): SOD (2000 unitati 400 mg McCord/Fridovich, Glutation Peroxidaza), Catalaza Amestec din: rozmarin (frunza), ceai verde (extract din frunza), calciu, 70 mg acid elagic, struguri (extract din seminte)

8. MODELE PENTRU SUPEROXID DISMUTAZA CA AGENTI TERAPEUTICI UTILIZATI PENTRU REGLAREA METABOLISMULUI ANIONULUI SUPEROXID Compusii sintetici cu activitate similara cu cea a enzimei (modele pentru SOD) se pot utiliza ca medicamente pentru prevenirea sau tratamentul afectiunilor legate de superproductia de superoxid. Combinatiile complexe ale Cu, Mn, Fe si Ni pot cataliza disproportionarea O 2- si unii compusi de acest tip pot fi considerati sinzeme (analogi sintetici) pentru SOD, prezentand activitate catalitica apropiata de cea a enzimei.

11

Ionii de Cu hidratati sunt aproape la fel de activi ca si Cu, Zn-SOD, insa prezinta toxicitate, motiv pentru care se prefera combinatii complexe ale Mn(II) cu liganzi de tip chelat. Aceste modele pentru SOD pot funiza un tratament protectiv prin atasarea covalenta la dispozitive medicale confectionate din polietilena, platina sau otel inoxidabil.

PARTEA A II-A: PARTEA EXPERIMENTALA-Sinteza combinatiei

complexe a Cu (II) cu ligandul hexaazamacrociclic rezultat prin condensarea etilendiaminei cu 3-amino-4H-1,2,4-triazolul si formaldehida ca model pentru SOD Pentru organismele deficitare in SOD se incearca administrarea unor compusi naturali care sa preia functiile acestora si care trebuie sa aiba activitate catalitica asemanatoare cu enzimele de tip SOD. In acest scop sunt studiate combinatii complexe ale Cu (II) si s-a observat activitate de tip SOD pentru combinatii complexe cu liganzi polidentati cu atomi de azot ca atomi donori. Un astfel de compus cu activitate promitatoare este combinatia complexa cu ligandul hexaazamacrociclic rezultat prin condensarea o-fenilendiaminei cu 3-amino-4H-1,2,4triazolul si formaldehida in prezenta Cu (II). 12

1. Mod de lucru Intr-un balon cu fund rotund se prepara o solutie prin dizolvarea a 0,341 g CuCl22H2O si 0,432 g 0-fenilendiamina in 25 ml alcool etilic. Se adauga o,336 g 3-amino-4H-1,2,4-triazol, 2 ml formaldehida (37%) si se refluxeaza timp de 90 minute. Masa de reactie se raceste la temperatura camerei. Precipitatul verde brun format se filtreaza pe palnie Bchner, se spala cu cateva portiuni mici de alcoool etilic si se usuca la temperatura camerei. Daca solutia ramane limpede se lasa la evaporare lenta la temperatura camerei intr-un pahar Berzelius. 2. Rezultate si discutii 2.1 Spectre IR Pentru a stabili modul de coordinare al ligandului la ionul Cu (II) s-au nregistrat spectrele IR pe domeniul 4000-400 cm-1, att pentru combinatia complexa ct i pentru compusi. Spectrele IR pentru combinatia complexa, pentru o-fenilendiamina, 3-amino-4H-1,2,4triazol sunt redate in anexa 1, anexa 2, anexa 3. 3-AMINO-4H-1,2,4-TRIAZOL In domeniul 3400-2700 cm-1 se observa mai multe picuri de intensitate relativ apropiata, predominand insa primul pic situat la 3412 cm-1. La aproximativ 3300 cm-1, sunt prezente vibratii de intindere C-H (compusi aromatici, dar si aldehide intre 3030 si 2730 cm-1). De asemenea, sunt prezente vibratii de intindere N-H (amine si amide primare si secundare la aproximativ 3400-3300 cm-1), dar si vibratii de intindere O-H (compusi chelati la 3200-2700 cm-1). Pe de alta parte, intre domeniile 1640 si 730 cm-1 se observa o multitudine de picuri, cel mai evident fiind primul pic, de la 1643 (vibratii de intindere C=C, alchene izolate monosubstituite-vinil). In acest caz, sunt evidentiate vibratii de curbura N-H (amine primare si secundare1640-1540 cm-1), C-H, vibratii de intindere C-Cl (800-600 cm-1). Cu TF1 In acest spectru este evidentiata prezenta unui pic intens la 3400 cm-1 in care exista vibratii de intindere N-H (amine primare, secundare). La 1621 se observa un pic corespunzator unei amide primare, in timp ce picul alaturat mai pronuntat (1539 cm-1) poate sa apartina

13

gruparii cetona. Dupa 1400 cm-1 pot exista vibratii de curbare C-H, vibratii de intindere C-O si carbon-halogen. O-fenilendiamina La aproximativ 3300 cm-1 se pot observa 2 picuri foarte apropiate,de intensitate similara, ce corespund unor compusi aromatici cu amine in componenta. Urmatoarele 2 picuri (in jur de 3200 si 3100) pot sa corespunda unor amide, dar si unor compusi chelati cu vibratie de intindere O-H. La 3030 cm-1 exista un pic putin intens corespunzator aldehidelor. La 1630 si 1590 sunt 2 picuri asemanatoare ce indica prezenta gruparii amino, amida si aromatica. Picul de la 1500 se afla printre cele mai intense, ceea ce confirma prezenta nucleului aromatic, la fel si cel mai putin intens de la 1458 cm-1. Cel mai intens pic se gaseste la 750 cm-1, ce afirma prezenta compusilor de natura aromatica.
Cumulnd datele spectrale IR se poate formula concluzia c ligandul are un comportament tetradentat, coordinndu-se prin atomul de azot la ionul de Cu (II).

2.2 Spectre UV-VIS Se observa aproape de absorbanta 1 o crestere usoara si un maxim la 265 nm, dupa care o scadere treptata, insotita de un alt maxim la 365 nm. Urmeaza apoi o scadere mai abrupta pana la 695 nm, aproape de A=0.5 si din nou o scadere constanta. Ligandul are o stereochimie plan patrata.

14

Figura 1 Spectul UV-VIS al combinatiei complexe a Cu (II) utilizata ca model pentru superoxid dismutaza Stabilitatea mare a ligandului este data de formarea a 4 cicluri chelate, de 5/6 atomi de azot. De asemenea caracterul de clasa a ofera stabilitate suplimentara. Compusul este solubil in apa, datorita faptului ca este polar, ionic cu diferente intre raza anionului si raza cationului, deci se poate administra atat pe cale orala, cat si injectabil. Prezinta liposolubilitate mica, rezulta ca nu poate ajunge in celula prin difuzue pasiva, dar poate intra prin canalele ionice.

15

CONCLUZII Superoxid dismutazele au rol vital in apararea celulelor impotriva radicalului superoxid, factor important al distrugerilor provocate de radiatii, inflamatii si de promovare a tumorilor. S-a sintetizat combinatia complexa a Cu (II) cu ligandul hexaazamacrociclic rezultat prin condensarea o-fenilendiaminei cu 3-amino-4H-1,2,4-triazolul si formaldehida si s-a caracterizat din punct de vedere structural, al stabilitatii si solubilitatii. Ligandul este tetradentat, cu stereochimie plan patrata, prezinta stabilitate mare si solubilitate mica. Prin trecerea din stare de oxidare I la II si invers, ionul de Cu poate sa catalizeze atat reducerea cat si oxidarea O2- similar cu sistemele naturale de tip SOD. In timpul acestor procese, oxigenul este coordinat la ionul de Cu rezulta ca combinatia complexa obtinuta are capacitatea de a coordina acest anion pentru ca este nesaturata coordinativ.

16

BIBLIOGRAFIE 1. G.Neamtu, Gh. Campeanu, C.Socaciu, Biochimie vegetala, Editura Didactica si Pedagogica, Bucuresti 2. Mariana Ttucu, I. Bolocan-viau, J. Neamu, O.Croitoru, Alice Sandra Buteic, Combinaii complexe ale ionilor Co(II), Ni(II), Cu(II) cu fenil 2-piridil ceton n prezena anionilor azotat, Craiova Medicala, 2006 3. D. Marinescu, R. Olar si M. Badea, Compusi coordinativi naturali, Editura Universitatii din Bucuresti, 2009, 157-172. 4. S. Baker, J. Nicklin, N. Khan si R Killington, Microbiology (Third Edition), Ed. Taylor & Francis, New York, 2006. 5. Serrano Martinez, M. I. Fortea, F.M. Del Amor si E. Nunez-Delicado, Food Chem., 107 (2008) 193. 6. D. F. Shriver, P.W. Atkins si C. H. Langford, Inorganic Chemistry (Editia IV), Oxford University Press, Oxford, Melbourne, Tokyo, 1992. 7. Sigel, H. Sigel si colab., Metal ions in biological systems Metal ions ans their complexes in medication (vol. 41), Ed. Marcel Dekker, INC., New York, Basel, Switzerland, 2004. 8. D.L. Sorkin si A.F. Miller, Biochemistry 34 (1997) 4916. 9. A.M. Stolyenberg si J.S. Summers, Inorg. chem., 39 (2000) 1518. 10. K.M. Yoo, C.H. Lee, H. Lee, B. Moon si C.Y. Lee, Food Chem., 106 (2008) 929 11. L.P. Liang si M. Patel, J. Neurochem., 90 (2004) 1076. 12. H.R. Ibrahim, Md. Imranul Hoq si T. Aoki, Int. J. Biol. Macromol., 41 (2007) 631 13. P.L Fox, Biometals, 16 (2003) 9. 14. N.M. Gilesa, G.I. Gilesa, J.E. Holleyb, N.J. Gutowskib si C. Jacob, Biochem. Pharmacol., 66 (2003) 2021. 15. http://ro.wikipedia.org 16. http://www.doctor.info.ro/sisteme_antioxidante.html

17