Thèse Laurus Nobilis

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE
MINISTERE DE LENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA

RECHERCHE SCIENTIFIQUE
UNIVERSITE EL HADJ LAKHDAR BATNA
MEMOIRE
Prsent la Facult des Sciences
Dpartement de Biologie
Pour lobtention du Diplme de
MAGISTER
En Biochimie Applique
par :
YAKHLEF Ghania
THEME
ETUDE DE LACTIVITE BIOLOGIQUE DES EXTRAITS
DE FEUILLES DE Thymus vulgaris L. ET Laurus nobilis L.
Devant le Jury :
M
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YAHIA Mouloud
M
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LAROUI Salah
M
me
HAMBABA Leila
M
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ZALLAGUI Amar
M.C. lUniversit de Batna
M.C. lUniversit dOum El-Bouaghi
Prsident
Rapporteur
Examinatrice
Examinateur
Anne Universitaire : 2009-2010
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Remerciement
Avant toute chose, je remercie Dieu, le tout puissant, pour mavoir donne la force et
la patience.
Jexprime dabord mes profonds remerciements et ma vive connaissance M
r
LAROUI
Salah, Matre de confrences la facult de mdecine, Universit de Batna pour avoir
encadr et dirig ce travail avec une grande rigueur scientifique, sa disponibilit, ses
conseils et la confiance quil maccord mont permet de raliser ce travail.
Jadresse mes sincres remerciements M
r
YAHIA Mouloud, Matre de confrences
l'Universit de Batna davoir accept de prsider le jury.
Jexprime mes vifs remerciements M
me
ROUABAH-HAMBABA LEILA, Matre de
confrences lUniversit de Batna pour sa prcieuse aide et ses conseils, et pour
lhonneur quelle nous a fait en acceptant dexaminer ce mmoire.
Je tiens galement adresser mes vifs remerciements M
r
ZALLAGUI Amar, Matre
de confrences lUniversit dOum El-Bouaghi pour lhonneur quil nous a fait en
acceptant de faire partie de jury.
Je tiens exprimer galement ma profonde reconnaissance M
r
ABDEDDAIM
Mohamed Matre assistant-charg de cours l'universit de Batna pour sa contribution
la ralisation de ce travail et ses prcieux conseils quil trouve ici mes sincres
remerciements
A M
r
ABERKANE Mohamad Chrif, Matre de Confrences l'universit de Batna, et
M
r
AYACHI Ammar Matre assistant l'universit de Batna Qui m'ont accueilli au
sein du leurs Laboratoires :
Laboratoire de chimie et phytochimie
Laboratoire de microbiologie et immunologie
et qui ont mis ma disposition les condition matrielles ncessaires pour la ralisation
de ce travail tout au long la priode de recherche quils ici mon respect et
reconnaissance.
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Liste des abrviations
AAR : Activit antioxydante relative
ANOVA : Analyse de variance
APR : Pouvoir antiradicalaire
ATCC : American type culture collection
BHT : Butylated hydroxytoluen
BAW : n-Butanol/Acide actique/eau
BCB : -carotene bleaching test
CCM : Chromatographie sur couche mince
DMSO : Dimthylsulfoxyde
DPPH : 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl
EAq : Extrait aqueux
EDCM : Extrait dichloromthanique
EEP : Extrait ther de ptrole
EMeOH : Extrait mthanolique
HPLC: Chromatographie liquide haute performance
IC
50
: Concentration inhibitrice 50%
Rf : Rapport frontal
ROS : Reactive oxygen species
TEAC : Trolox Equivalent Antioxidant Capacity
T
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: Temps de rtention
UV : Ultrat violet
g EqACmg : Microgramme dquivalent acide gallique par milligramme dextrait
g EqQmg d'ext : Microgramme dquivalent querctine par milligramme dextrait.
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Copyright(C) by Foxit Software Company,2005-2008
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Liste des figures
Fig. 01: Aspect morphologique de Thymus vulgaris.......................................................................2
Fig. 02 : Aspect morphologique de Laurus nobilis....................................10
Fig. 03 : Structure de base des flavonodes...................................................................................17
Fig. 04 : Structure de base des flavones.........................................................................................18
Fig. 05 : Structure de base des flavonols.......................................................................................18
Fig. 06 : Structure de base des flavanones....................................................................................19
Fig. 07 : Structure de base des flavanols.......................................................................................19
Fig. 08 : Structure de base des chalcones......................................................................................20
Fig. 09 : Structure de base des anthocyanidines............................................................................20
Fig. 10: Ltape cl de la formation des flavonodes....................................................................20
Fig. 11: Voie de biosynthse des flavonodes...............................................................................21
Fig. 12: Pigeage des ROS (R
) par les flavonodes......................................................................23

Fig. 13: Flavonodes et leurs sites proposs pour la chlation des ions mtalliques.....................24
Fig. 14: Comparaison entre deux pentahydroxyphnols...................................................24
Fig. 15: Valeurs de TEAC montrant limportance du groupement catchol au niveau du cycle B
pour lactivit antioxydante des flavonols.....................................................................................25
Fig. 16: Elments essentiels pour l'activit anti-oxydante des flavonodes..................................25
Fig. 17: Inhibition de la lipoxygnases et de la cyclo-oxygnases sous laction de diffrents
flavonodes............27
Fig. 18: Origine des diffrentes espces ractives de loxygne impliqus en biologie...............28
Fig. 19: les systmes de dfense contre les radicaux libres...........................................................31
Fig. 20: Aspect morphologique des micro-organismes tudis....................................................34
Fig. 21: Schma de macration par leau distille.........................................................................36
Fig. 22: Schma dextraction par les solvants organiques............................................................37
Fig. 23: Forme libre et rduite du DPPH......................................................................................46
Fig. 24: Teneur en humidit des feuilles sches des deux plantes mdicinales.............................48
Fig. 25: Chromatogrammes rsultant de lanalyse des extraits bruts apolaires.........54
Fig. 26: Chromatogrammes rsultant de lanalyse des extraits Bruts MeOH...............................54
Fig. 27: Chromatogrammes dHPLC des extraits de Thymus vulgaris........................................57
Fig. 28: Chromatogrammes dHPLC des extraits de Laurus nobilis....................................58
Fig. 29: Droite dtalonnage des flavonodes................................................................................59
Fig. 30: Droite dtalonnage des polyphnols...................................60
Fig. 31: Activit de la nystatine sur la levure C. albicans.............................................................61
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Fig. 32: Effet inhibiteur dose dpendant de nos extraits..............................................................62
Fig. 33: Exemples de leffet des extraits de feuilles de Thymus vulgaris sur la croissance
microbienne...................................................................................................................................66
Fig. 34: Exemples de leffet des extraits de feuilles de Laurus nobilis sur la croissance
microbienne...................................................................................................................................66
Fig. 35: Cintique de linhibition du blanchissement de la -carotne par 250 g/ml des extraits
des feuilles de Thymus vulgaris.....70
Fig. 36: Cintique de linhibition du blanchissement de la -carotne par 250 g/ml des extraits
des feuilles de Laurus nobilis....70
Fig. 37: Courbe de corrlation entre lactivit antioxydante des extraits polaires et leur teneur en
flavonodes.72
Fig. 38: Rsultats du test antioxydant des extraits apolaires sur CCM aprs rvlation au
DPPH.73
Fig. 39: Rsultats du test antioxydant des extraits polaires sur CCM aprs rvlation au
DPPH.....75
Fig. 40: Courbe de corrlation entre lactivit anti-radicalaire des extraits polaires et leur teneur
en polyphnols...76
Fig. 41: Activit antioxydante des diffrents extraits de Laurus nobilis...77
Fig. 42: Activit antioxydante des diffrents extraits de Thymus vulgaris....77
Fig. 43: Activit antioxydante des diffrents Standards....77
Fig. 44 : Chromatogrammes des diffrents standards utiliss dans lHPLC (Annexes)
Fig. 45 : Influence du solvant DMSO sur la croissance des microorganismes (Annexes)
Fig. 46 : Pied coulisse automatique utilis dans les mesures des diamtres des zones
dinhibitions (Annexes)
Fig. 47 : CMI de lEEP de Thymus vulgaris sur la souche S. aureus. (Annexes)
Fig. 48 : Activit d'inhibition de dcoloration de la -carotne (Annexes)
Fig. 49 : Activit anti-radicalaire (APR) des extraits bruts (Annexes)
Fig. 50 : Activit anti-radicalaire (APR) des diffrents tmoins (Annexes)
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Liste des tableaux
Tableau 01 : Classification botanique de Thymus vulgaris.............................2
Tableau 02 : Le contenu de polyphnols dans linfusion aqueuse du Thymus vulgaris..................3
Tableau 03 : Les flavonoides trouvs dans les feuilles de Thymus vulgaris L............................4
Tableau 04: Classification botanique de Laurus nobilis................................................................9
Tableau 05: Aspects, couleurs et rendements des extraits des feuilles de Thymus vulgaris et
Laurus nobilis...................................................49
Tableau 06: Les composs que pourraient contenir les diffrents extraits prpars.....................50
Tableau 07: Rsultats des ractions de caractrisation des flavonodes dans nos extraits....50
Tableau 08: Rsultats de la sparation par CCM des extraits apolaires.......................................52
Tableau 09: Rsultats de la sparation par CCM des extraits polaires..........................................53
Tableau 10: Temps de rtention des diffrents tmoins obtenus par la sparation avec HPLC....55
Tableau 11: Rsultats de lHPLC des diffrents extraits...55
Tableau 12: Teneurs en polyphnols totaux et en flavonodes dans les extraits...57
Tableau 13: Antibiogramme des germes tudis en prsence des diffrents Antibiotiques..61
Tableau 14 Activit antimicrobienne des extraits bruts des plantes de ltude.............................64
Tableau 15 : Concentrations minimales inhibitrices des diffrents extraits..68
Tableau 16: Le pouvoir anti-radicalaire des extraits bruts et du control positif .......................71
Tableau 17: IC50 et puissance anti-radicalaire (APR) des extraits bruts et des standards............75
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SOMMAIRE
INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
I. LA PLANTE Thymus vulgaris L. ........................................................................................ 1
I.1. Gnralits ............................................................................................................... .1
I.2. Origine et distribution de la plante .................................................................................. 1
I.3. Place de la plante dans la systmatique .......................................................................... 2
I.4. Description botanique de la plante .................................................................................. 2
I.5. Composition chimique .................................................................................................... 3
I.6. Utilisations des feuilles de Thymus vulgaris .................................................................... 4
I.7. Proprits pharmacologiques et recherche en cours ......................................................... 5
II. LA PLANTE Laurus nobilis L. .......................................................................................... 9
II.1. Gnralits ................................................................................................................... 9
II.2. Origine et distribution de la plante ................................................................................. 9
II.3. Place dans la systmatique ............................................................................................ 9
II.4. Description botanique de la plante ............................................................................... 10
II.5. Composition chimique ................................................................................................ 10
II.6. Utilisations des feuilles de Laurus nobilis.................................................................... 11
II.7. Proprits pharmacologiques et recherche en cours ..................................................... 11
III. LES FLAVONOIDES .................................................................................................... 16
III.1. Vue densemble sur les polyphnols........................................................................... 16
III.2. Gnralits sur les flavonodes ................................................................................... 16
III. 3. Structure chimique et classification ........................................................................... 17
III.4. Biosynthse des flavonodes ...................................................................................... 20
III.5. Localisation et distrubution des flavonodes ............................................................... 21
III.6. Biodisponibilit des flavonodes....................................................................................22
III.7. Activits biologiques des flavonodes... ..................................... ..22
IV. RAPPELS SUR LES ACTIVITES ETUDIEES........29
IV.1. Activit antioxydante.....29
IV.2. Activit antimicrobienne........32
DEUXIEME PARTIE : ETUDE EXPERIMENTALE
I. MATERIEL ET METHODES ........................................................................................... 35
I.1. Matriel vgtal ............................................................................................................ 35
I.2. Dtermination de la teneur en eau ................................................................................. 35
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I.3. Prparation des extraits ................................................................................................. 36
I.4. Dtermination du rendement ......................................................................................... 37
I.5. Etude phytochimique des extraits ................................................................................. 37
I.5.1. Analyse qualitative .................................................................................................. 37
I.5.1.1. Essais de caractrisation en tube ......................................................................... 38
I.5.1.2. Essais de caractrisation par CCM ...................................................................... 38
I.5.1.3. Essais de caractrisation par HPLC ..................................................................... 39
I.5.2. Analyse quantitative ................................................................................................ 40
I.5.2.1. Dosage des polyphnols totaux ........................................................................... 40
I.5.2.2.Dosage des flavonodes ........................................................................................ 41
I.6. Tests des effets biologiques .......................................................................................... 42
I.6.1. Tests de l'activit antimicrobienne ........................................................................... 42
I.6.1.1. Mthode de diffusion partir dun disque solide ................................................ 43
I.6.1.2. Mthode des microdilutions en milieu solide ...................................................... 44
I.6.2. Tests d'activit antioxydante .................................................................................... 44
I.6.2.1. Mthode de blanchissement de la -carotne ....................................................... 44
I.6.2.2. Mthode de rduction du radical libre DPPH ..................................................... 45
II. RESULTAS ET DISCUSSION ........................................................................................ 48
II.1. Le taux d'humidit ...................................................................................................... 48
II.2. L'extraction ................................................................................................................. 48
II.3. Rsultats de l'etude phytochimique .................................................................. 50
II.3.1..Rsultats de l'analyse qualitative ............................................................................. 50
II.3.2. Rsultats de l'analyse quantitative ........................................................................... 58
II.4. Rsultats des tests des effets biologiques ................................................................. 61
II.4.1. Rsultats du test du pouvoir antimicrobien ...................................................... 61
II.4.2. Rsultats du test du pouvoir antioxydant ......................................................... 69
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES
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Introduction
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I N T R O D U C T I O N
Lutilisation des plantes aromatiques par lhomme est une pratique antique (Majinda et al.,
2001). De nos jours la majorit des habitants du globe terrestre utilisent de trs nombreuses
plantes, compte tenu de leurs proprits aromatiques, comme source dassaisonnement ou
comme remde en mdecine traditionnelle. Cependant, cette utilisation ne se base sur aucun
critre scientifique, elle tient compte simplement des observations au cours des sicles.
Actuellement, plusieurs questions sont souleves concernant la scurit des produits
chimiques synthtiques utiliss en mdecine ou dans lindustrie alimentaire. En effet, la
peroxydation des lipides produites au cours des processus de fabrication et de stockage des
aliments sous laction des radicaux libres de loxygne (ROS) conduit la perte de la qualit et
de la scurit des aliments. Les antioxydants de synthse gnralement utiliss en industrie
alimentaire pour retarder loxydation des lipides se sont avrs responsables deffets
indsirables. De plus, lusage excessif dagents antibactriens chimiques dans la mdication
humaine ainsi que dans llevage animal conduit lapparition de souches bactriennes
rsistantes (Mau et al., 2004).
Les extraits bruts des plantes commencent avoir beaucoup dintrt comme source
potentielle de molcules naturelles bioactives. Ils font lobjet dtude pour leur ventuelle
utilisation comme alternative pour le traitement des maladies infectieuses et pour la protection
des aliments contre loxydation.
Ce travail vise tudier lactivit antimicrobienne et antioxydante des extraits bruts de deux
plantes aromatiques, Thymus vulgaris L. et Laurus nobilis L., qui appartiennent respectivement
la famille des lamiaces et des lauraces. Elles sont parmi les familles de plantes les plus
utilises comme source mondiale dpices et dextraits qualit mdicale intressante.
La slection de ces plantes sest fonde sur les critres suivants : sont parmi les plus
populaires plantes aromatiques utilises dans le monde entier, leur utilisation frquente par nos
populations dans le domaine culinaire et celui de la mdecine traditionnelle, cot du fait que
leurs huiles essentielles sont utilises dans les industries alimentaires, pharmaceutique et
cosmtique, leur efficacit dans le traitement symptomatique de troubles de lappareil digestif
suprieur reconnue traditionnellement, elles reprsentent rcemment un sujet de recherche
scientifique intressant.
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Notre travail sera rparti en deux parties :
- une partie relative ltude bibliographique des deux plantes, des flavonodes et des
activits recherches.
- Une autre partie rserve ltude exprimentale subdivise en deux chapitres : lun
Prsente les mthodes et les techniques utilises pour la ralisation de ce travail et
lautre consacr la prsentation et la discussion des rsultats obtenus.
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Etude Bibliographique
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PARTIE BIBLIOGRAPHIQUE : LA PLANTE Thymus vulgaris
1
I. LA PLANTE Thymus vulgaris L.
I. 1 GENERALITES
Le genre Thymus est un des 220 genres les plus diversifis de la famille des labies, avec
pour centre de diversit la partie occidentale du bassin mditerranen (Morales, 2002). Comme
beaucoup de labies elles sont connues pour leurs huiles essentielles aromatiques. Lespce la
plus connue est sans conteste Thymus vulgaris L. localement connu zaatar. En franais et
anglais par exemple, on emploie frquemment le nom du genre (thym et thyme
respectivement) pour dsigner lespce Thymus vulgaris (Amiot, 2005).
Le nom Thymus drive du mot grec thymos qui signifie parfumer cause de lodeur
agrable que la plante dgage (Pariente, 2001). Lespce Thymus vulgaris est un lment
caractristique de la flore mditerranenne, connu surtout pour ses qualits aromatiques, elle a
aussi de trs nombreuses proprits mdicinales (Iserin, 2001).
Il existe une variation de la production des composs secondaires chez certaines espces
vgtales que lon appelle polymorphisme chimique. Cette variation peut tre quantitative ou
qualitative. Un grand nombre despces possdent des individus dont les composs secondaires
varient quantitativement dun individu un autre. Par contre, les exemples de variation
qualitative, c'est--dire lexistence de chmotypes au sens strict dont les individus peuvent porter
des molcules de nature chimique diffrentes les un des autres, sont moins frquents. Cest
notamment le cas de Thymus vulgaris qui exprime six formes de chmotypes diffrents, chaque
chmotype est nomm suivant le composant principal de son huile essentielle (exemples : thymol
(T), carvacrol (C),). (Amiot, 2005).
I.2. ORIGINE ET DISTRIBUTION DE LA PLANTE
Thymus vulgaris L. est indigne de lEurope du sud, on le rencontre depuis la moiti
orientale de la pninsule ibrique jusquau sud-est de lItalie, en passant par la faade
mditerranenne franaise (zcan et Chalchat, 2004 ; Amiot, 2005). Il est maintenant cultiv
partout dans le monde comme th, pice et plante mdicinale (Kitajima et al., 2004).
Le Thymus vulgaris se prsente toujours dans un tat sauvage en plaines et collines, comme
la lavande, le romarin, la sauge et beaucoup dautres plantes sauvages (Kaloustian et al., 2003).
Cette plante spontane pousse abondamment dans les lieux arides, caillouteux et ensoleills des
bords de la mer la montagne (Poletti, 1988).
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I.3. PLACE DANS LA SYSTEMATIQUE
Ce classement se rfre la classification botanique antrieure (Morales, 2002) synthtise
dans le tableau 1.
Tableau 1 : Classification botanique de Thymus vulgaris
Rgne Plantes
Sous rgne Plantes vasculaires
embranchement Spermaphytes
Sous embranchement Angiospermes
Classe Dicotyldones
Sous classe Dialyptales
Ordre Labiales
Famille Lamiaces
Genre Thymus
Espce Thymus vulgaris L.
I.4. DESCRIPTION BOTANIQUE DE LA PLANTE
Thymus vulgaris L. est un arbuste aromatique tiges ramifies, pouvant atteindre 40 cm de
hauteur.
Il possde de petites feuilles recourbes sur les bords de couleur vert foncs, et qui sont
recouvertes de poils et de glandes (appels trichomes). Les trichomes contiennent lhuile
essentielle majoritairement compose de monoterpnes. Ses petites fleurs zygomorphes sont
Fleur
Plante entire
Fruit
Feuille
Fig. 1 : Aspects morphologiques de Thymus vulgaris L.
(Iserin, 2001)
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regroupes en glomrules et leur couleur varie du blanc au violet en passant par le rose. Thymus
vulgaris est dailleurs caractris par un polymorphisme floral qui a t au moins aussi tudi
que son polymorphisme chimique (Bruneton, 1999 ; Morales, 2002) (Fig. 1).
I.5. COMPOSITION CHIMIQUE
De nombreuses tudes ont rvl que les parties ariennes de Thymus vulgaris sont trs
riches en plusieurs constituants dont la teneur varie selon la variabilit des conditions
gographiques, climatiques, de schage, de stockage et des mthodes dtudes (extraction et
dtection). Lhybridation facile de lespce mne une grande variabilit intraspcifique, qui
affecte lhomognit du rendement dextrait et sa composition en produits chimique (Balladin
et Headley, 1999 ; Amiot, 2005).
La teneur en huile essentielle de la plante varie de 5 25 ml/Kg et sa composition fluctue
selon le chmotype considr (Bruneton, 1999) ; lhuile essentielle de Thymus vulgaris a t
analyse en utilisant la chromatographie en phase gazeuse (CPG) couple une spectromtrie de
masse (SM), 30 composs ont t identifis et caractriss, les plus abondant sont
respectivement : thymol (44,4 - 58,1 %), p-cymene (9,1 - 18,5 %), -terpinne (6,9 - 18,0 %),
carvacrol (2,4 - 4,2 %), linalol (4,0 6,2 %). La caractristique dhuile essentielle de Thymus
vulgaris tait sa teneur leve du thymol (Guilln et Manzanos, 1998 ; Balladin et Headley,
1999 ; Hudaib et al., 2002 ; Bouhdid et al., 2006).
Le contenu phnolique total, flavonoides, catchine, et anthocyanine dans linfusion
aqueuses prpare du thymus vulgaris a t dtermin par des mthodes spectrophotomtriques
(Kuliic et al., 2006). Le tableau 2, ci-dessous rsume les rsultats.
Tableau 2 : Teneur en polyphnols (en g EAG/mg dextrait) dans linfusion aqueuse du
Thymus vulgaris (Kuliic et al., 2006)
Plante Phnols totaux Flavonodes Non- flavonodes Catchines Anthocyanines
Thymus
vulgaris
33.3 25.0 8. 3 1.2 6.7
La mthodologie habituelle pour tudier les drivs flavonoidiques dans les plantes implique
les extractions successives employant plus dun solvant, plusieurs tapes de fractionnement et
diffrentes techniques de chromatographie pour extraire, sparer, isoler, purer et identifier les
composs dintrt. Le tableau 3 numre les flavonoides trouves dans les feuilles Thymus
vulgaris L., par plusieurs auteurs, en utilisant la mthodologie ci-dessus mentionn.
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De nombreuses tudes ont confirm que les espces qui appartiennes la famille des
Lamiaceae sont une bonne source dacide rosmarinique, lidentification des composs
polyphnoliques dans linfusion aqueuse de Thymus vulgaris par analyse HPLC a montr une
prsence dominante dacide rosmarinique (17,45 mg/g = 1,7 % de la masse sche de Thymus
vulgaris) et un autre compos significatif est leriocitrin (1,96 mg/g ) (Kulii et al., 2006).
Dautres composants ont t dtects seulement en traces, lacide cafique (0,02 mg/g) et
lacide p-hydroxybenzoique. La composition en vitamines a t dtermine et rvle la prsence
de la vitamine E (-tocophrol) (4,4 mg/Kg) (Guilln et Manzanos, 1998 ; Kuliic et al., 2006).
Tableau 3 : Les flavonoides trouvs par plusieurs auteurs dans les feuilles
de Thymus vulgaris L.
Flavonodes Rfrences
- Cirsilineol (5,4-dihydroxy-6,7,3-trimethoxyflavone)
- Thymonine (5,6,4 - trihydroxy-7,8,3-trimethoxyflavone)
- Eriodictyol (5,7,3,4-tetrahydroxyflavone)
- Sideritoflavone (5,3,4-trihydroxy- 6,7,8- trimethoxyflavone)
- 5-Desmethylnobiletine (5-hydroxy-6,7,8,3,4-pentamethoxyflavone)
- Apignine (5,7,4-trihydroxyflavone)
- Lutoline (5,7,3,4-tetrahydroxyflavone)
- Xanthomicrol (5,4-dihydroxy-6,7,8-trimethoxyflavone)
- 5-Desmethylsinensetine (5-hydroxy-6,7,3,4-tetramethoxyflavone)
- Quercetine (3,5,7,3,4-pentahydrxyflavone)
Adzet et al., 1988
Morimitsu et al., 1995
Adzet et al., 1988
Adzet et al., 1988
Guilln et Manzanos, 1998
Adzet et al., 1988
Adzet et al., 1988
Kuliic et al., 2006
Adzet et al., 1988
Kuliic et al., 2006
Kuliic et al., 2006
I.6. UTILISATION DES FEUILLES DE Thymus vulgaris
Thymus vulgaris est une des plus populaires plantes aromatiques utilises dans le monde
entier, ces applications sont trs vastes et touchent le domaine alimentaire et celui de la mdecine
traditionnelle (Adwan et al., 2006). De plus son huile essentielle est utilise dans les industries
alimentaire, pharmaceutique et cosmtique (Jordn et al., 2006).
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Lpice Thymus vulgaris est intensivement cultiv en Europe et aux Etats-Unis pour lusage
culinaire dans lassaisonnement des poissons, volailles, des potages et des lgumes (zcan et
Chalchat, 2004).
La feuille et la sommit fleurie de Thymus vulgaris sont traditionnellement utilises par voie
orale dans le traitement symptomatique de troubles digestifs tels que : ballonnement
pigastrique, lenteur la digestion, ructation, flatulence ainsi que dans le traitement
symptomatique de la toux et de la bronchite (Bruneton, 1999). Sa feuille est numre dans la
pharmacope de fines herbes allemande et britannique a t employe en tant que
branchospasmolytique, expectorant et antibactrien. On dit que la tisane des feuille de Thymus
vulgaris favorise le repos et le sommeil (Kitajima et al., 2004).
En usage local, elles sont traditionnellement utilises en cas de nez bouch, de rhume, pour le
traitement des petites plaies aprs lavage abondant, pour soulager les piqres dinsectes et les
douleurs rhumatismales, en bain de bouche pour lhygine buccale (Poletti, 1988 ; Brunton,
1999) ainsi comme additif de bain prpar par dcoction qui stimule lcoulement de sang vers la
surface du corps humain, soulageant de ce fait la dpression nerveuse (zcan et Chalchat, 2004).
Lhuile essentielle de cette plante entre dans les formulations de diverses spcialits :
pommades antiseptiques et cicatrisantes, sirops pour traitement des affections des voies
respiratoires, prparation pour inhalation (Bruneton, 1999).
I.7. PROPRIETES PHARMACOLOGIQUES ET RECHERCHE EN COURS
Les proprits pharmacologiques de la plante Thymus vulgaris et de ses diffrents extraits, en
particulier lhuile essentielle et lextrait aqueux, ont tait bien tudi. En plus de leurs
nombreuses utilisations traditionnelles, la plante et ses extraits ont trouv de nombreuses
applications industrielles (principalement comme additifs alimentaires) et mdicinales (Hudaib
et al, 2002).
Les recherches actuelles ralises sur les effets des extraits de cette plante sur diffrents
systmes in vitro et in vivo ont ressorti plusieurs effets de grande importance pour la mdecine,
la pharmacie et lindustrie moderne, parmi les quelles on cite les plus importants :
a) Effets antioxydants
Thymus vulgaris L.se situait parmi les fines herbes sches contenant les plus grandes capacits
antioxydantes. Diffrents composs du thym lui permettent de possder un tel statut, comme les
phnols (thymol et carvacrol), les flavonoides, lacide rosmarinique, lacide cafique et la
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vitamine E (Kulii et al., 2006 ; Guilln et Manzanos, 1998). Ces constituants inhibent la
peroxydation lipidique induite in vitro au niveau des mitochondries et des microsomes. Ils
inhibent galement partiellement la production de lanion superoxyde (Bruneton, 1999).
Des recherches menes dans les annes 1990 en cosse ont tabli les vertus potentielles de la
plante et de son huile essentielle, en prvention du vieillissement. Des tudes rcentes indiquent
que Thymus vulgaris est un puissant antioxydant et assure des doses leves dacides gras
essentiels dans le cerveau (Iserin, 2001).
Lhuile essentielle de Thymus vulgaris a t teste pour son activit antioxydante par deux
mthodes diffrentes : la technique de dcoloration de la carotne et le test du DPPH
(Diphenylpicrylhydrazyl). Les rsultats obtenus montrent que lhuile de Thymus vulgaris
tmoigne dune grande activit antioxydante in vitro (Bouhdid et al. 2006).
A cot de lhuile, qui a t largement tudie pour ses proprits antioxydantes, lextrait
aqueux des feuilles de Thymus vulgaris a prsent une activit antioxydante importante, et les
caractristiques antioxydantes observes ntaient pas entirement lies la teneur en phnols de
lhuile essentielle dans nimporte quelle mthode analytique, mais vraisemblablement fortement
dpendantes de lacide rosmarinique, compos phnolique principal dans lextrait aqueux de
Thymus vulgaris (Thuille et al., 2003).
b) Effets antimicrobiens
Lhuile essentielle de thym, riche en phnols, est doue de proprits antibactriennes
facilement mises en vidence in vitro (Bruneton, 1999). Lhuile essentielle de trois plantes dont
Thymus vulgaris a t teste, par Bouhdid et ses collaborateurs (2006), pour leur activit
antibactrienne, lhuile de Thymus vulgaris tmoigne dune activit antibactrienne intressante
sur les bactries gram positives comme sur les bactries gram ngatives. En effet, L-
monocytognes, souche hautement pathogne, prsente une sensibilit leve cette huile.
Des rsultats similaires ont t obtenus par Ettayebi et ses collaborateurs (2000), qui ont
montr que lactivit de lhuile du thym a t plus efficace contre les bactries gram positive (S.
aureus, S. pyognes et S. pneumoniae) que contre les gram ngative (E.coli et autre). Dautre
part ces mmes auteurs ont trouv que cette grande activit de lhuile essentielle de Thymus
vulgaris est relie au thymol qui est majoritaire de cette huile.
Lactivit antibactrienne de 11 huiles essentielles de plantes aromatiques contre la souche
bactrienne Bacillus cereus INRA L2104, microbe pathogne dvelopp en bouillon de carotte
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16 C, a t tudie. Une inhibition totale de la croissance des spores bactriennes a t observe
pour lagent antimicrobien Thymus vulgaris (Valero et Salmern, 2003).
En outre, lextrait organique entier de Thymus vulgaris est avr tre actif contre diffrentes
souches bactriennes, alors que lextrait aqueux indiquait la meilleure activit contre
Helicobacter pylori (H. pylori) avec une concentration minimale inhibitrice (CMI) de 3,5 mg/ml
(Tabak et al., 1996 ; Iserin, 2001). Lactivit amliore de lextrait alcoolique du thym compare
laqueux peut tre explique par la prsence du thymol, un phnol alkylique qui cause la
perforation des membranes bactriennes et le flux rapide des composants cytosoliques (Thuille et
al., 2003).
De mme, lextrait actonique de Thymus vulgaris a montr une activit inhibitrice une
concentration de 0.5 mg/ml contre la Mycobacterium tuberculosis (Lall et Meyer, 1999).
Lextrait hydrosol (extrait aqueux sans huile essentielle) de Thymus vulgaris a t examin
pour ses effets inhibiteurs contre quatre bactries pathognes (Escherichia coli, E. coli O157:H7,
Staphylococcus aureus et Yersinia enterocolitica). Bas sur les rsultats de cette tude, les
hydrosols de thym ont sembl empcher la croissance des quatre microbes pathognes examins.
Les hydrosols de thym concentration de 50 75ml/100ml taient compltement prohibitif sur
la croissance bactrienne dans la culture de bouillon. Les rsultats de cette tude ont confirm la
possibilit d'employer des hydrosols de thym dans la conservation des aliments et des boissons.
Ces hydrosols peuvent tre utiliss dans diffrentes concentrations pour stocker et protger les
produits alimentaires contre les microbes pathognes (Sadi, 2003).
En plus de lactivit antibactrienne, des tudes (ralises in vitro et in vitro) ont prouv que
l'huile essentielle (surtout le thymol) de Thymus vulgaris possde des proprits antifongiques
contre un certain nombre de myctes. Reddy et ses collgues (1998), dans leur tude, ont montr
le potentiel antifongique lev de lhuile volatile de Thymus vulgaris comme agents protecteurs
des fruits de fraise (Fragaria ananassa) contre la dtrioration cause par les myctes Botrytis
cinerea et Rhizopus stolonijer. Une tude similaire ralise par Giordani et ses collaborateurs
(2008), qui ont examin les huiles essentielles de quelques plantes aromatiques dont Thymus
vulgaris pour leurs effets antifongiques contre une espce de levure Candida albicans par la
dtermination de leurs CMI (3.71 g/ml).
c) Effet spasmolytique :
Lactivit spasmolytique de Thymus vulgaris est le plus souvent attribue aux phnols de
lhuile essentielle. Beer et ses collaborateurs (2007) dans leur tude ont montr que leffet
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spasmolytique du thymol est enregistr la concentration de10
-6
M. A la concentration de 10
-4
M
le thymol inhibe 100% lactivit contractile spontane des muscles lisses de lestomac du
cobaye et 10
-5
M rduit les effets de lactyle choline 35%. Ils supposent que le thymol a un
effet analgsique par son action sur les rcepteurs
2
adrnergique des cellules de nerf.
Par ailleurs, Lemli et Van Den Brouke (Bruneton, 1999) ont montr que si les phnols de
lhuile essentielle de Thymus vulgaris sopposent effectivement aux contractions provoques sur
les muscles lisses du cobaye par lhistamine, lactyle choline ou dautres ractifs, leur
concentration dans les prparations aqueuses de la drogue est insuffisante pour justifier leur
activit. Ces auteurs ont montr que lactivit spasmolytique de ces prparations est lie la
prsence des polymthoxyflavones.
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PARTIE BIBLIOGRAPHIQUE : LA PLANTE Laurus nobilis
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II. LA PLANTE Laurus nobilis L.
II.1. GENERALITES
Laurus nobilis L., membre de la famille des lauraces qui renferme 32 genres et environ
2000-2500 espces (Barla et al., 2007). Laurus, nom latin, dorigine celte qui veut dire toujours
vert allusion au feuillage persistant de la plante (Pariente, 2001).
Les feuilles sont largement appliques et connues comme assaisonnement et herbe mdicinale
depuis les priodes antique grec et romain (Demir et al., 2004). Il est intressant de noter que
cette herbe qui tait pendant longtemps employe dans la nourriture comme condiment et en
mdecine traditionnelle a, en fait, des proprits qui peuvent suggrer de nouvelle application
(Ferreira et al., 2006).
II.2. ORIGINE ET DISTRIBUTION DE LA PLANTE
Originaire du bassin mditerranen, Laurus nobilis pousse dans les lieux humides et
ombrags, mais galement dans les jardins, o elle est cultive comme condiment (Iserin, 2001).
Actuellement, la plante est largement cultive dans beaucoup de pays comme plante ornementale
et pour la production commerciale tels que la Turquie, lAlgrie, la France, la Grce, le Maroc,
lAmrique centrale et les Etats-Unis Mridionaux (Demir et al., 2004; Barla et al., 2007).
II.3. PLACE DANS LA SYSTEMATIQUE
Ce classement se rfre la classification botanique antrieure (Quezel et santa, 1962)
synthtise dans le tableau 4.
Tableau 4 : Classification botanique de Laurus nobilis L.
Rgne Plantes
Sous rgne Plantes vasculaires
embranchement Spermaphytes
Sous embranchement Angiospermes
Classe Dicotyldones
Sous classe Dialyptales
Ordre Laurales
Famille Lauraces
Genre Laurus
Espce Laurus nobilis L.
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II.4. DESCRIPTION BOTANIQUE DE LA PLANTE
Laurus nobilis, Arbuste ou arbre aromatique de 2 10m de haut tige droite grise dans sa
partie basse et verte en haut. Ses feuilles sont alterns, coriaces, lgrement ondules sur les
bords, longues de 16 cm sur 8 cm de large, persistantes vert fonc et glacs sur leur face
suprieure et plus pale en dessous. Les fleurs sont dioques (petites fleurs mles et femelles sur
des pieds spars), jaunes, groupes par 4 5 en petites ombelles. Le fruit est une petite baie
ovode de 2cm de longueur sur 1cm de largeur, noir verniss maturit (Iserin, 2001 ; Demir et
al., 2004 ; Beloued 2005).
II.5. COMPOSITION CHIMIQUE
De nombreuses tudes ont t ralises pour la dtermination de la composition chimique des
feuilles de Laurus nobilis et plusieurs ont prouv la richesse de ses feuilles en substances
actives. Par hydrodistillation les feuilles fournissent environ 10-30 ml/Kg (1-3%) dhuile
essentielle (Bruneton 1999, Demir et al., 2004) dont les constituants majoritaires inclut : cinol,
et pinne, sabinne, linalol, eugnol, terpinol, plus dautres esters et terpenoides, mais dont
les proportions varient selon lorigine gographique (Iserin 2001 ; Sayyah et al.,2002 ; Demir et
al., 2004).
Les feuilles de Laurus nobilis contiennent aussi des flavonodes polaires (drives
glycosyles de querctine, kaempferol et de catchine) et apolaires (quatre drivs acyls de
kaempferol) (Fiorini et al., 1998 ; Kivak et Mert, 2002), sesquiterpnes lactones, alcalodes
Fleur
Fruit
Feuille
Rameau
Fig. 2 : Aspect morphologique de Laurus nobilis
Beloued (2005).
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disoquinoline (Kivak et Mert, 2002 ; Simi et al., 2003 ), en plus Demo et al. (1998) et Gmez-
Coronado et al. (2004) ont montr la richesse de ses feuilles en vitamine E.
II.6. UTILISATION DES FEUILLES DE Laurus nobilis
Les feuilles de Laurus nobilis sont parmi les assaisonnements les plus connus dans tous les
pays, elles sont gnralement utilises comme pice valable en culinaire (en potages, ragots,
sauce,) et aromatisant en industrie alimentaire. Cette plante a aussi des applications
importantes en mdecine traditionnelle et reprsente rcemment un sujet de recherche
scientifique intressant (Sini et al., 2003), le laurier est principalement utilis, par voie orale,
dans le traitement symptomatique des troubles de lappareil digestif suprieur tels que le
ballonnement pigastrique, lenteur de la digestion, ructations et flatulence (Iserin, 2001).
Lextrait aqueux est utilis dans la mdecine traditionnelle turque en tant quanti-
hmorrodal, antirhumatismal, diurtique et comme un antidote dans des morsures de serpent et
pour le traitement du mal destomac (Kivak et Mert, 2002).
Dans la mdecine traditionnelle iranienne, les feuilles de cette plante ont t employes pour
traiter lpilepsie et le parkinsonisme (Aqili Khorasani, 1992).
Lhuile essentielle obtenue des feuilles de cette plante a t employe pour le soulagement
dhmorrodes et des douleurs rhumatismales (Sayyah et al., 2002). En outre, lhuile essentielle
est employe par lindustrie cosmtique en parfumerie et dans la fabrication des savons. Elle
compte parmi les meilleurs moyens dloigner les insectes gnants (Demir et al., 2004 ; Beloued,
2005).
II.7. PROPRIETES PHARMACOLOGIQUES ET RECHERCHE EN COURS
a) Effets antioxydants
Lactivit antioxydante des extraits mthanolique (bruts et dgraisss) des feuilles, dcorce et
des fruits de Laurus nobilis ont t tudis au niveau de la peroxydation de lipide (LP) dans les
liposomes, induite par le systme Fe
+2
/ ascorbate et mesur spectrophotomtriquement 533
nm. Les rsultats ont montr que tous les extraits de recherche possdaient une activit
antioxydante. Lextrait dgraiss des feuilles montre une inhibition plus leve du LP que
lextrait brut et que tous les autres extraits et le maximum de son activit (68,4%) a t atteint
avec une plus petite quantit (2,0 mg) (Simi et al., 2003).
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Ferreira et al. (2006) ont tudi lactivit antioxydante de trois extraits (huile essentielle,
extrait thanolique et dcoction) de dix espces de plantes mdicinales dont Laurus nobilis, cette
espce a montr des valeurs leves pour lactivit antioxydante pour chacun des trois extraits et
elle est plus haute pour les extraits polaires. Dans le laurier, lisoquercitrin et les glycosides
flavonol peuvent expliquer lactivit exhibe.
Dans une autre tude, Demo et al. (1998) ont dmontr la prsence des tocophrols (vitamine
E), principalement la - tocophrol, dans les feuilles de Laurus nobilis obtenue dans la fraction
apolaire par extraction hexane. Dans cette tude on rapporte que le contenu tocophrol est
strictement corrl avec lactivit antioxydante de lextrait hexane des feuilles.
Ces rsultats prliminaires ont confirm que lutilisation traditionnelle des feuilles de Laurus
nobilis dans lindustrie alimentaire est relie non seulement lodeur et larome plaisant, mais
probablement aussi a des possibilits prservatives des substances prsentes dans les feuilles et
dautres pices de cette plante.
b) Effets fumignes et insecticide
Rcemment, il ya un intrt croissant pour lutilisation probable des extraits de plantes
comme solution de rechange aux insecticides synthtiques.
Treize huiles essentielles dont ceux de Laurus nobilis ont t examines sous leurs formes de
vapeur contre une espce dinsectes attaquant les produits stocks, Acanthoscelides obtectus
(bruche du haricot). Les rsultats ont indiqus que lhuile essentielle des feuilles de Laurus
nobilis a une action rpulsive, rduit la fcondit, diminue la couvaison dufs, augmente la
mortalit larvaire de nouveau-n et influence dfavorablement lapparition de progniture
(Papachristos et Stamopoulos, 2002).
Une tude similaire a t ralise par Erler et ses collaborateurs (2006), o lhuile essentielle
extraite partir du feuillage frais de Laurus nobilis a t examine pour son activit rpulsive
contre les femelles adultes dune espce de moustique (Culex pipiens), cette huile a montr un
degr de rpulsion intressant contre ces parasites vecteurs de plusieurs maladies comme la
malaria, fivre jaune, dengue, encphaliteetc.
De mme, lactivit fumigne de certains composs qui se produisent naturellement dans les
huiles essentielles des plantes aromatiques dont cinol, eugnol et linalol, composs principales
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de lhuile essentielle de Laurus nobilis, a t valuer contre trois espces dinsectes parasites des
produits entreposs (Sitophilus oryzae, Rhyzopertha dominica et Tribolium castaneum).
Lactivit insecticide a chang avec lespce dinsecte, le compos et le temps dexposition.
Les rsultats ont prouv que ces composs peuvent convenir comme fumigne en raison de leur
volatilit leve, efficacit et leur sret (non toxique aux humais) (Rozman et al., 2007).
c) Effet anticonvulsive
Lhuile essentielle des feuilles de Laurus nobilis a t value pour lactivit anticonvulsive
contre des saisies exprimentales, lhuile a protg des souris contre des convulsions toniques,
induites par lectrochoc maximal et particulirement par pentylnettrazol. Aux doses
danticonvulsivant, lhuile essentielle a produit la sdation et relchement du cur. Les
composants responsables de cet effet peuvent tre le cinol, eugnol et le mthyle eugnol mais
dautres tudes sont exiges avant que toutes conclusions puissent tre tires (Sayyah et al.,
2002).
d) Effet cytotoxique
Les extraits n-hexane, thanol et aqueux des feuilles de Laurus nobilis ont t tests pour
leurs proprits cytotoxiques en utilisant lessai biologique de crevette de saumure (Artemia
salina). Seul lextrait n-hexane exhib une activit cytotoxique contre la crevette de saumure
mme si on lavrait moins active que lumbelliferone et la colchicine. Dans le criblage
phytochimique tous les extraits ont donn des rsultats positifs pour les sesquiterpnes, les
extraits thanol et aqueux pour les alcalodes mais seulement lextrait n-hexane tait positif pour
les flavonodes et la vitamine E. En conclusion, les glycosides flavonol pourraient tre des
principes actifs responsables de lactivit cytotoxique observe (Kivak et Mert, 2002).
Dautres tudes ont ralis lisolement et lidentification des composs des feuilles et des
fruits de Laurus nobilis supposs tre cytotoxique. Ils ont isols six sesquiterpnes lactone
connue et un nouveau sesquiterpne le lauroxepine, ces substances actives se sont avres
fortement cytotoxiques contre la ligne cellulaire ovarienne cancreuse A2780. (Fang et
al.2005 ; Barla et al., 2007).
e) Effet gastroprotectif
Une seule tude a t ralise ce sujet par Grbz et autre (2002) o cinq plantes
aromatiques dont Laurus nobilis, sont employes traditionnellement en Turquie pour traiter le
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mal destomac. Ils ont t choisis pour dterminer leur pouvoir anti-ulcrogne. Une dcoction et
un extrait mthanol ont t prpars partir des fruits de Laurier pour dterminer leurs effets sur
un modle dulcre gastrique induit par lthanol chez des rats. Les expriences
pharmacologiques et les techniques histopathologiques ont clairement montr que ces extraits
donns oralement ont significativement protg lestomac contre ce modle dulcre. Cette tude
doit tre continue pour l'isolement des constituants actifs et pour rvler leur mode d'activit.
f) Effet inhibiteur dabsorption dalcool
Lextrait mthanolique des feuilles de Laurus nobilis a efficacement empch llvation du
taux dthanol dans le sang chez un rat charg dthanol. Sept sesquiterpnes actifs ont t isols
en tant quinhibiteurs dabsorption dalcool. La partie active dans ces sesquiterpnes sest avr
la partie -mthylne--butyrolactone qui tait essentielle pour montrer la suppression de
labsorption dthanol. En outre, le retard de vider gastrique t prsum impliqu
partiellement dans leur effet inhibiteur (Matsuda et al.1999 ; Yoshikawa et al., 2000). Ces
sesquiterpnes ont non seulement un effet prventif efficace pour la toxicit aigu dalcool mais
peuvent galement aider des patients viter labus dalcool (Yoshikawa et al., 2000).
g) Effet curatif de blessures
Leffet curatif de blessures de lhuile de feuille de Laurus nobilis a t examin par Khalil et
ses collaborateurs (2007). Une blessure en pleine paisseur a t faite dans le secteur dorsal des
souris Mus musculus. Les blessures ont t traites quatre fois avec la prparation dhuile
pendant deux jours successifs. Cette opration est rpte pendant plusieurs jours avec 12 h
dintervalle. Aprs 16 jours, les blessures ont t visuellement observes, photographiquement
document et le secteur de blessure a t mesur. Aprs le 16
ime
jour, les animaux ont t
sacrifis et lhistologie du secteur de blessure est examine. Lhuile de Laurus nobilis a montre
une bonne activit curative de blessures.
h) Effet inhibiteur denzyme
Ferreira et ses collaborateurs (2006) ont tudi leffet de lhuile essentielle, lextrait thanol et
la dcoction des feuilles de Laurus nobilis sur lactivit de lactylcholinestrase (AChE),
enzyme qui catalyse lhydrolyse de lactylcholine donnant la choline et lactyle. La fraction
thanol a montr une valeur leve dinhibition dAChE de 64% (1g/ml), donc la plante Laurus
nobilis peut aider trait ou soulager des patients souffrant de la maladie dAlzheimer, puisque
les drogues approuves pour la thrapie de cette maladie agissent en contrecarrant le dficit
dactylcholine.
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i) Effet antimicrobien
Des huiles essentielles de plusieurs plantes ont t values pour leur potentiel dans le control
du mycte aflatoxinognique Aspergillus parasiticus CFR 223 et de la production daflatoxine.
Lhuile des feuilles de laurier a stimule in vitro la croissance des mycliums du mycte mais a
rduit la concentration de son aflatoxine de 55.21% (Atanda et al. 2007).
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PARTIE BIBLIOGRAPHIQUE : LES FLAVONODES
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III. LES FLAVONODES
III.1. VUE DENSEMBLE SUR LES POLYPHENOLS
Les polyphnols sont des phytomicronutriments synthtiss par les vgtaux et qui
appartiennent leur mtabolisme secondaire. Ils participent la dfense des plantes contres les
agressions environnementales (Gee et Johnson, 2001).
Les polyphnols, qui forment une immense famille de plus de 8000 composs naturels, sont
diviss en plusieurs catgories : les flavonodes qui reprsentent plus de la moiti des
polyphnols ; les tanins qui sont des produits de la polymrisation des flavonodes ; les acides
phnoliques, les coumarines, les lignanes et dautres classes existent en nombres considrables
(Dacosta, 2003).
De nombreuses tudes sont en faveur dun impact positif de leur consommation sur la sant.
En effet, les polyphnols pourraient permettre de prvenir de nombreuses pathologies comme le
cancer (Brown et al., 1998) , les maladies dgnratives et cardio-vasculaires (Paganga et al.,
1999). Un encouragement la consommation daliments dorigine vgtale richent en
polyphnols constitue dsormais une des principales recommandations en sant publique. Parmi
les antioxydants vgtaux, les polyphnols apparaissent parmi les plus efficaces quant leurs
effets protecteurs dans lorganisme (Gee et Johnson, 2001).
Llment structural fondamental qui caractrise les composs phnoliques est la prsence
dau moins un noyau benznique auquel est directement li au moins un groupement hydroxyle
ainsi que des groupes fonctionnels (ester, mthyle ester, glycoside) (Bruneton, 1999). Les
composs phnoliques sont commodment classs selon le nombre datomes de carbone dans le
squelette de base (Dacosta, 2003).
Notre intrt est essentiellement focalis sur les flavonodes, substances que nous avons pu
identifier dans tous nos extraits bruts et qui en particulier savrent des composants phnoliques
sur possdant une action biologique trs diversifie.
III.2. GENERALITES SUR LES FLAVONODES :
Le terme flavonode provenant du latin "flavus", signifiant "jaune", dsigne une trs large
gamme de composs naturels appartenant la famille des polyphnols. Ils sont considrs
comme des pigments quasi universels des vgtaux. Ce groupe comprend comme son nom
lindique des composs jaunes mais aussi dautres couleurs ou incolores. Structuralement, les
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flavonodes se rpartissent en plusieurs classes de molcules. En effet plus de 6500 structures ont
t identifies (Bruneton, 1999 ; Harborne et Williams, 2000).
III.3. STRUCTURE CHIMIQUE ET CLASSIFICATION :
Leur structure de base est celle dun diphnylpropane 15 atome de carbone (C
6
-C
3
-C
6
)
constitu de deux noyaux aromatiques (ou anneaux), que dsignent les lettres A et B, relis par
un htrocycle oxygn, que dsigne la lettre C (Harborne et Williams, 2000) comme le montre
la figure 3.
Fig. 3 : Structure de base des flavonodes.
On remarquera quafin de distinguer les positions sur lanneau A et celles sur lanneau B, la
nomenclature normalise appose ces dernires le symbole ' (prime). Lhtrocycle C est
attach au noyau B par une liaison carbone-carbone. De faon gnrale, les flavonodes peuvent
tre hydroxyls en position 3, 5, 7, 3, 4, 5et/ou 6. Un ou plusieurs de ces groupes hydroxyles
sont frquemment mthyls, actyls, ou sulfats (Bruneton, 1999).
Ils existent soit ltat libre (dans ce cas ils sont dits aglycones ou gnines), soit sous forme
de C- ou O- glycosides, ce qui tend les rendre hydrosolubles (ils sont alors lis des sucres tels
que le glucose, le rhamnose, larabinose, le plus souvent aux positions 3 et 7). Ils peuvent en
outre tre des monomres ou des oligomres (Dacosta, 2003).
Les flavonodes se diffrencient par le degr doxydation de lhtrocycle C et par les modes
dhydroxylation des anneaux A et B. Dans toutes les classes de flavonodes mentionnes ci-
dessous, la biosynthse justifie la prsence frquente dau moins trois hydroxyles phnoliques en
C-5, C-7 et C-4 de la gnine ; cependant, lun dentre eux peut tre absent. Six grandes classes
de flavonodes peuvent tre mentionnes. Les flavones et les flavonols sont les composs
flavonodiques les plus rpandus, alors que les flavanones, les flavanols, les chalcones et les
anthocyanidines sont considrs comme des flavonodes minoritaires en raison de leur
distribution naturelle restreinte (Bruneton, 1999 ; Harborne et Williams, 2000 ; Havsteen, 2002 ;
Dacosta, 2003) :
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1. les flavones :
Le noyau flavone driv du noyau flavane de base (dont la structure est constitue de deux
noyaux aromatiques (noyaux A et B) et dun htrocycle oxygn (cycle C) par la fixation la
position 4 dun atome doxygne reli au carbone par une double liaison.
Les principaux flavones sont lapignine et la lutoline. Elles ont dans la majorit des cas la
forme de glycosides.
Fig. 4 : Structure de base des flavones.
2. les flavonols :
Les flavonols se distinguent des flavones par la prsence dun groupement OH en position C-
3. En plus de ce radical OH, les diverses molcules de flavonols en comprennent deux, trois,
quatre ou cinq autres. Les flavonols sont beaucoup plus abondants dans le rgne vgtal que les
flavones et leurs concentrations sont plus leves. Les principaux sont la querctine, kaempfrol
et myrictine.
Fig. 5 : Structure de base des flavonols.
3. les flavanones :
Ces molcules sont caractrises par labsence de double liaison en 2, 3 et par la prsence
dun centre dasymtrie. Elles existent sous forme libre ou sous formes glycosyles. Sous forme
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libre, les carbones en position 5 et 7 sur le cycle A peuvent tre hydroxyles ou mthoxyles. Le
cycle B peut aussi tre substitu en position 3, 4, 5 et 6. La principale flavanone est : La
naringnine.
Fig. 6 : Structure de base des flavanones.
4. Les flavanols :
Ils se distinguent des flavanones par labsence la position 4 dun atome doxygne reli au
carbone par une double liaison la plus rencontr est la catchine.
Fig. 7 : Structure de base des flavanols.
5. les chalcones :
Les chalcones et par dfaut les dihydrochalcones sont uniques au sein de la famille des
flavonodes. Dpourvus du cycle C central, les deux cycles A et B sont relis par une chane
tricarbone ctonique , insature (sature dans le cas des dihydrochalcones). Les cycles A et
B sont quivalents aux cycles A et B des autres flavonodes mais leurs numrotations sont
inverses. Les plus abondants sont : butine et phlortine.
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Fig. 8 : Structure de base des chalcones.
6. Les anthocyanidines :
Les anthocyanidines ne possdent pas de groupe OH la position 4 et ont une double liaison
entre les positions 3 et 4. Les plus importants sont : plargonidine, cyanidine et ponidine.
Fig. 9 : Structure de base des anthocyanidines.
III.4. BIOSYNTHESE DES FLAVONOIDES :
Tous les flavonoides ont une origine biosynthtique commune et, de ce fait, possdent le
mme lment structural de base, savoir lenchanement phnyl-2 chromane.
Ltape cl de la formation des flavonoides est la condensation, catalyse par la chalcone
synthase, dune unit phnyle propanode (4-coumaroyl-CoA) avec trois units malonyl-CoA, la
structure de base en C-15 sous forme dune chalcone soit 4,2,4,6-tetrahydroxychalcone
(Bruneton, 1999) Fig. 10.
Fig. 10 : Ltape cl de la formation des flavonodes (Bruneton, 1999).
Cette chalcone est lintermdiaire caractristique de la synthse des divers flavonodes. Elle
est en quilibre avec les flavonodes. Cet quilibre tant contrl par une enzyme la chalcone
isomrase , cette dernire induit une fermeture strospcifique du cycle conduisant une
flavanone. Il est le prcurseur de toutes les classes de flavonoides comme le montre la Fig. 11
(Remesy et al., 1996).
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Fig. 11 : Voie de biosynthse des flavonodes (Remesy et al., 1996)
III.5. LOCALISATION ET DISTRIBUTION DES FLAVONOIDES :
Les flavonodes sont largement rencontrs dans le rgne vgtal. On signale environ 2% de la
proportion du carbone photosynthtique global incorpor dans la biosynthse flavonique. Ils sont
cependant rares chez les vgtaux infrieurs. De plus, leur localisation au sein de la plante est
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caractristique. En effet, les flavonodes sont omniprsents dans les organes ariens jeunes o ils
sont localiss dans les tissus superficiels (Remesy et al., 1996).
Au niveau cellulaire, on a observ que les flavonodes, sous forme dhtrosides, sont dissous
dans le suc vacuolaire ou localiss dans les chloroplastes et les membranes des vgtaux.
Lorsque les flavonodes sont prsents dans la cuticule foliaire, il sagit presque toujours de
gnines libres dont la lipophilie est accrue par la mthylation partielle ou totale des groupes
hydroxyles (Brunton, 1993).
En dfinitive, les flavonodes possdent une large rpartition dans le monde vgtal. Ils sont
largement abondants dans les lgumes feuilles (salade, choux, pinards, etc.), ainsi que dans les
tguments externes des fruits. On les trouve principalement dans les agrumes : citrons, orange,
pamplemousses et dans une moindre mesure : abricots, cerises, mres, raisins, papayes, tomates
et sarrasin. On en trouve galement en quantit importante dans nombreuses plantes mdicinales
et trs spcifiquement dans les herbes aromatiques comme le thym, le persil, le romarin et le
cleri (Bronner et Beecher, 1995 ; Remesy et al, 1996).
III.6. BIODISPONIBILITE DES FLAVONOIDES
Les effets sant des flavonodes ne dpendent pas seulement de leurs niveaux de
consommation mais aussi de leur biodisponibilit. Peu dtudes systmatiques ont t menes sur
la pharmacocintique des flavonodes chez lhomme. Toutefois, daprs des expriences menes
sur des flavonodes provenant de lalimentation, il apparat que seuls les flavonodes sous forme de
gnines (ou aglycones) sont susceptibles dtre absorbs. Lhydrolyse des liaisons htrosidiques (reliant
la gnine la chane sucre) nintervient que dans le clon o les micro-organismes dgradent
simultanment les flavonodes dorigine alimentaire. Le foie est largement impliqu dans le mtabolisme
des flavonodes absorbs (Hollman et Katan, 1998 ; Walle, 2004).
Une meilleure connaissance de la biodisponibilit des flavonodes est indispensable pour
expliquer leurs effets protecteurs sur la sant.
III.7. ACTIVITES BIOLOGIQUES DES FLAVONOIDES
De nos jours, les proprits thrapeutiques des flavonodes sont largement tudies dans le
domaine mdical o on leur reconnat des activits biologiques et pharmaceutiques.
a. Effets antioxydants
Les flavonodes sont reconnus pour leurs nombreuses activits biologiques, ces activits sont
attribues en partie aux proprits anti-oxydantes de ces composs naturels. Les flavonodes sont
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susceptibles de ragir avec la plupart des espces ractives oxygnes (Fuhrman et al., 1995).
Laction antioxydante de ces phytonutriments ne sexerce pas seulement par linhibition et la
dsactivation des radicaux libres, elle se manifeste aussi par la neutralisation denzymes
oxydantes et par la chlation des traces dions mtalliques responsables de la production de ROS
(Halliwell, 1994 ; Cotelle, 2001).
A cause de leurs faibles potentiels redox, les flavonodes (Fl-OH) sont thermodynamiquement
capables de rduire les radicaux libres oxydants (R
), comme le superoxyde, le peroxyle,

lalkoxyle et lhydroxyle, par transfert dhydrogne et le radical flavonoxy (FL-O) qui en rsulte
peut ragir avec un autre radical pour former une structure quinone stable (Jovanovic et al.,
1998) :
Fig. 12 : Pigeage des ROS (R
) par les flavonodes.

Dautres tudes ont montr que les flavonodes sont des bons inhibiteurs denzymes
responsables de la production des radicaux libres comme la xanthine oxydase qui est une source
biologique importante du radical superoxyde (Hansaki et al., 1994 ; Cos et al., 1998). Les
flavonodes sont aussi considrs comme de bons chlateurs dions mtalliques (Brown et al.,
1998 ; Dacosta, 2003), comme les ions du fer (Fe2+) et du cuivre (Cu+) qui sont essentiels pour
certaines fonctions physiologiques, mais ils sont aussi responsables de la production du radical
hydroxyle par la rduction du peroxyde d hydrogne selon la raction suivante:
La querctine est la plus active des flavonodes tudis. La Fig. 13 rsume les sites essentiels
pour la chlation des ions mtalliques : (a) un noyau catchol sur le cycle B, (b) les groupes 3-
hydroxyle et 4-oxo du cycle C, et (c) les groupes 4-oxo et 5-hydroxyle entre les cycles A et C
(Van Acker et al., 1996).
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Fig. 13 : Flavonodes et leurs sites proposs pour la chlation
des ions mtalliques (Men+) (D aprs Van Acker et al., 1996)
Plusieurs travaux dcrivent les relations structures-activits des flavonodes (Rice-Evans et
al., 1996 ; Van Acker et al., 1996 ; Harborne et Williams 2000 ; woodman et al. 2005). Ces
travaux permettent de connatre les activits anti-oxydantes de ces molcules en fonction de leurs
caractristiques structurales. En fait, leur activit antiradicalaire ncessite:
a- Les molcules possdant une double liaison entre les carbones C
2
et C
3
et un groupement
carbonyle en C
4
sont les flavonodes dont les activits anti-oxydantes sont les plus
marques, ainsi lactivit de la querctine (un flavonol) est deux fois plus leve que celle
de la catchine (un flavan-3-ol). Ceci est d au fait que la querctine possde une double
liaison C2-C3 et une fonction 4-oxo (Van Acker et al., 1996 ; Harborne et Williams
2000).
Figure 14 : Comparaison entre deux pentahydroxyphnols
(Harborne et Williams 2000).
b- La structure ortho-diphnolique du cycle B (=les groupements hydroxyles en position C
3-
C
4
) ainsi quun nombre important de rsidus hydroxyles augmenteraient le potentiel
antioxydant des flavonodes possdant un htrocycle satur (Fuhrman et al., 1995 ;
woodman et al. 2005 ). Rice-Evans et ses collaborateurs (1996) ont dvelopp un test
bas sur la capacit dun antioxydant piger le radical cation chromophore, lactivit
des flavonodes est compare avec celle du Trolox (une forme soluble de l-tocophrol),
et exprime en TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity). Il est noter que plus la
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valeur de TEAC est leve plus la molcule est active. Les rsultats de cette tude ont
montr que la morine avec deux groupements hydroxyles en mta et le kaempfrol avec
un seul groupement hydroxyle sont moins actifs que la querctine (deux groupements
hydroxyle en ortho) (Fig. 15).
Fig. 15 : Valeurs de TEAC montrant limportance du groupement catchol au
niveau du cycle B pour lactivit antioxydante des flavonols (Rice-Evans, 1996).
c- Les flavonodes inactivent et stabilisent les radicaux libres grce leur groupement
hydroxyle (C3-OH) fortement ractif. Rice-Evans et ses collaborateurs (1996) ont
dmontr limportance ce dernier. En effet, La glycosylation du groupe 3-OH de la
querctine (cas de la rutine) ou sa suppression (cas de la lutoline) diminue lactivit anti-
oxydante.
En analysant tous ces rsultats concernant la capacit des flavonodes piger les radicaux
libres on peut conclure que la querctine satisfait tous ces critres, elle drive du motif
flavonol, sa structure particulire lui confre les caractristiques les plus souvent mises en avant
dans lactivit dun flavonode. Elle est le compos le plus actif de la famille des flavonodes
(Rice-Evans et al., 1996).
Fig. 16 : Elments essentiels pour l'activit anti-oxydante
des flavonodes (Rice-Evans et al., 1996).
b. Effets antimicrobiens
Les proprits antimicrobiennes des flavonodes vis--vis de diffrents micro-organismes
pathognes ont t mises en vidence (Jassim et Naji, 2003 ; Taguri et al., 2004 ; Takahashi et
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al., 2004 ; Yadava et Tiwari, 2005). Les extraits de plantes et beaucoup d'autres prparations
phytochimiques riches en flavonodes ont t rapports possder une activit antimicrobienne
(Tereschuk et al., 1997 ; Essawi et Srour, 2000). Beaucoup de groupes de recherche ont franchi
une tape plus loin, ils ont isol et identifi la structure des flavonodes qui possdent l'activit
antimicrobienne ou ont mesur l'activit des flavonodes disponibles dans le commerce (Sakar
1992 ; Kono et al., 1994 ; Verma et al. 1997 ; Hamilton-Miller et Shah, 2000).
Les proprits antibactriennes de propolis ont t attribues sa teneur leve en flavonodes
(Grange et Davey, 1990). Sato et ses collaborateurs (1995), ont dmontr leffet bactricide de
diffrentes flavanones sur un staphylococcus aureus. Une tude plus rcente a montr le pouvoir
antibactrien dun flavonode glycoside contre des souches de bactries gram (+) et gram (-)
(Harikrishna et al., 2004),
En raison de la capacit rpandue des flavonodes d'inhib la germination des spores
pathognes des plantes, on leur a propos pour l'usage contre les microbes fongiques pathognes
de l'homme (Harborne et Williams, 2000). Deux nouveaux flavonodes, un flavone et un
flavanone, respectivement isols des fruits de Terminalia bellerica et de l'arbuste Eysenhardtia
texana ont t montr comme possder l'activit contre le microbe pathogne opportuniste
Candida albicans (Valsaraj et al., 1997 ; Wachter 1999). Deux autres flavones isols de la
plante Artemisia giraldi ont tait rapports exhib une activit contre lespce Aspergillus flavus,
une espce de mycte qui cause la maladie envahissante chez les patients immunosuppressifs
(Zheng, 1996). Galangin, un flavonol gnralement trouv dans des chantillons de propolis a
t montr avoir l'activit inhibitrice contre Aspergillus tamarii, A. flavus, Cladosporium
sphaerospermum, Penicillium digitatum et Penicillium italicum (Afolayan et Meyer, 1997).
Des travaux ont mis en vidence un impact des flavonodes sur le rtrovirus HIV responsable
du syndrome dimmunodficience acquise (SIDA). Rcemment, des chercheurs ont montr que
les flavonodes pouvaient avoir une action plus slective en interagissant avec une glycoprotine
de surface du virus HIV, empchant ainsi la liaison du virus la cellule hte (Mahmood et al.,
1993).
Le mcanisme des effets antimicrobiens des flavonodes est sans doute trs complexe. Parmi
les hypothses avances, on va citer :
- Inhibition de la synthse d'acide nuclique (Hilliard, 1995),
- Inhibition des fonctions de la membrane cytoplasmique (Tsuchiya et Iinuma, 2000),
- Squestration de substrat ncessaire la croissance microbienne,
- Inhibition du mtabolisme nergtique microbien (Haraguchi et al., 1998).
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c. effets anti-inflammatoires
Sous laction de la cyclooxygnase et la lipooxygnase, lacide arachidonique (acide gras
C20 : 4) se mtabolise respectivement en prostaglandines + thromboxane et en leucotrines,
molcules fortement impliques dans le processus inflammatoires. In vitro, plusieurs flavonodes
sont capables de modifier le mtabolisme de lacide arachidonique plaquettaire (Middleton,
1998 ; Pelzer et al., 1998 ; Yeon, 2001). Ils ont mme report que les effets de la querctine et la
myrictine sont dose-dpendants. A de fortes concentrations, ils inhibent la cyclooxygnase et la
lipooxygnase. Cependant de faibles concentrations, seule la lipooxygnase est affecte. En
outre, dautres flavonodes tels que la lutoline, la morine, lapignine et la chrysine agissent
principalement sur lactivit de la cyclooxygnase (Laughton, 1991 ; Read, 1995 ; Snchez de
Medina et al., 2002).
Fig. 17 : Inhibition de la lipoxygnases et de la cyclo-oxygnases
sous laction de diffrents flavonodes.
d. Effets protecteurs vasculaires
Les flavonodes agissent sur les vaisseaux sanguins pour le maintien dune permabilit vasculaire
normale (Youdim, 2002). Deux flavonoides, lhespridine et lhesprtine (connus sous le terme
citroflavonoides) exercent des proprits vasorelaxantes (Orallo et al., 2004). Dautres
flavonoides, la querctine et la silybine, sont responsables dune augmentation de la rsistance
des capilaires. Cette activit serait en rapport avec les effets de certains flavonoides sur les
plaquettes, les leucocytes et sur les enzymes intervenant dans la coagulation sanguine (Stoclet et
al., 2004).
e. effets antiallergiques
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Les flavonodes sont galement connus pour leurs effets antiallergiques. Ces effets sont
attribus leur influence sur la production de lhistamine. En effet, les flavonodes inhibent les
enzymes, telles que lAMP cyclique phosphodiesterase et ATPase Ca
++
-dpendante,
responsables de la libration de lhistamine partir des mastocytes et des basophiles. Par
exemple, lATPase Ca
++
-dpendante dgrade lATP produisant ainsi de lnergie afin de faciliter
labsorption du calcium par les membranes cellulaires, ce qui favorise la libration de
lhistamine stocke dans les vsicules (Yamamura et al., 1998).
En outre, la querctine exerce un puissant effet inhibiteur, de la libration dhistamine partir
des mastocytes, suprieur celui du cromoglycate de sodium utilis comme mdicament en
empchant la libration de lhistamine et dautres substances endognes qui causent lasthme
(Formica et Regelson, 1995).
f. Autres effets biologiques
Les flavonodes sont capables de moduler le fonctionnement du systme immunitaire, mais
leur action est complexe et demeure encore mal lucid. A doses leves, les flavones et
flavonols sont de puissants inhibiteurs de la prolifration des lymphocytes B et T, mais,
concentrations plus faibles, ils pourraient agir comme immunostimulants chez les sujets
immunodprims (Namgoong et al., 1994 ; Middleton, 1998).
Les flavonodes peuvent prvenir le diabte ou au mois le rduire en inhibant lenzyme aldose
rductase. Une tude rcente montre que la myrictine possde un effet hypoglycmiant chez des
animaux diabtiques (Ong et Khoo, 2000).
Les flavonodes ont t galement tudies pour leurs proprits anti-tumorales (Birt et al., 2001).
Parmi les flavonodes naturels anticancreux, la catchine tmoigne dune activit remarquable (Bracke,
1991).
Les flavonodes sont capables de protger la muqueuse gastrique contre divers agents
ulcrognes. La naringine et la querctine exercent galement une activit anti-ulcrogne mise
en vidence chez le rat dont lulcre gastrique a t induit par lthanol (Martin et al., 1994).
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PARTIE BIBLIOGRAPHIQUE : RAPPELS SUR LES ACTIVITES ETUDIES
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IV. RAPPELS SUR LES ACTIVITES ETUDIEES
IV.1. ACTIVIT ANTIOXYDANTES
IV.1.1. Introduction
Il existe de nos jours un intrt croissant vis--vis de la biologie des radicaux libres. Ce nest
pas seulement d leur rle dans des phnomnes aigus tels que le traumatisme ou lischmie,
mais aussi leur implication dans de nombreuses pathologies chroniques associes au
vieillissement tels que le cancer, les maladies cardiovasculaires et inflammatoires et la
dgnrescence du systme immunitaire (Guinebert, 2005).
IV.1.2. Quest-ce quun radical libre ?
Les radicaux libres sont des atomes ou des molcules portant un lectron non appari. Cette
proprit rend ces lments trs ractifs du fait de la tendance de cet lectron se r-apparier,
dstabilisant ainsi dautres molcules. Les molcules ainsi transformes deviennent leur tour
dautres radicaux libres et initient ainsi une raction en chane. Cest typiquement ce qui se passe
lors de la peroxydation lipidique (Dacosta, 2003 ; Vansant, 2004).
Parmi toutes les espces radicalaires susceptibles de se former dans les cellules, il convient de
distinguer un ensemble restreint de composs radicalaires qui jouent un rle particulier en
physiologie et que nous appellerons radicaux libres primaires, qui drivent directement de
loxygne. Les autres radicaux libres, dits radicaux secondaires [Radical peroxyle (ROO
),
Radical alkoxyle (RO
)], se forment par raction de ces radicaux primaires sur les composs
biochimiques de la cellule (Novelli, 1997).
L'ensemble des radicaux libres primaires est souvent appel espces ractives de l'oxygne
(ROS). Cette appellation nest pas restrictive. Elle inclut les radicaux libres de loxygne
proprement dit [radical superoxyde (O
2
), radical hydroxyl (OH
), monoxyde dazote (NO
)],
mais aussi certains drivs oxygns ractifs non radicalaires dont la toxicit est importante
[l'oxygne singulet (
1
O
2
), peroxyde dhydrogne (H
2
O
2
), peroxynitrite (ONOO )] (Dacosta,
2003 ; Favier, 2003). La fig. 18 rsume lorigine des diffrentes espces ractives de loxygne
impliqus en biologie.
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Fig. 18 : Origine des diffrentes espces ractives de loxygne
impliques en biologie (Favier, 2003).
IV.1.3. Les antioxydants
Les antioxydants sont des substances capables de neutraliser ou de rduire les dommages
causs par les radicaux libres dans lorganisme et permettent de maintenir au niveau de la cellule
des concentrations non cytotoxiques de ROS (Vansant, 2004).
Notre organisme ragit donc de faon constante cette production permanente de radicaux
libres et on distingue au niveau des cellules deux lignes de dfense ingalement puissantes pour
dtoxifier la cellule (Favier, 2003).
a- Les antioxydants primaires :
La cellule est pourvue denzymes antioxydantes qui sont des systmes de dfense trs
efficaces puisque les enzymes ont la proprit de pouvoir raliser un travail de faon
permanente. Cette ligne de dfense (Fig. 19) est constitue de superoxyde dismutase (SOD), de
catalase et de peroxydase (glutathion et ascorbate) (Lehucher-Michel, 2001).
Ces enzymes antioxydantes permettent llimination des radicaux libres primaires, selon les
ractions suivantes :
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O + O
2
H
2
O
2
+ 2 GSH 2 H
2
O + GSSG
glutathione peroxydase
catalase
superoxyde dismutase
De ce fait elles prviennent la formation de radicaux libres organiques partir des lipides
membranaires notamment et contribuent donc la protection des membranes de la peroxydation
lipidique (Dacosta, 2003).
b- Les antioxydants secondaires :
Ce sont des molcules exognes. Contrairement aux enzymes antioxydantes, une molcule
dantioxydant pige un seul radical libre. Pour pouvoir fonctionner nouveau, cette molcule
dantioxydant doit donc tre rgnre par dautres systmes (Dacosta, 2003).
Fig. 19 : les systmes de dfense contre les radicaux libres.
Plusieurs substances peuvent agir en tant qu'antioxydants in vivo ont tait proposs. Elles
incluent : la vitamine E, l'acide ascorbique, la -carotne, les flavonodes, les composs
phnoliques,etc. Elles peuvent stabiliser les membranes en diminuant leur permabilit et elles
ont galement une capacit de lier les acides gras libres (Kohen et Nyska, 2002).
IV.1.4. Balance Oxydants /Antioxydants et stress oxydant
Les ROS ont des rles physiologiques trs importants en agissant, faibles concentrations,
sur la rgulation des rponses biologiques, la transduction du signal et autres voies de
signalisation (Favier, 2003).
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Dans lensemble de nos tissus sains, les dfenses antioxydantes sont capables de faire face et
dtruire les radicaux produits en excs. On dit que la balance Oxydants /Antioxydants est en
quilibre. Mais dans certaines situations, en raison dune surproduction radicalaire (tabac, alcool,
pollution, ) ou dune diminution des capacits antioxydantes (insuffisance dapports des
micronutriments antioxydants, inactivation enzymatiques) un dsquilibre entre production de
radicaux libres et systme de dfense est lorigine dun tat redox altr de la cellule appel stress
oxydatif (Sohal, 2002).
Le stress oxydant est responsable du dommage cellulaire li au vieillissement, aux maladies
cardio-vasculaires, au cancer et la plupart des maladies dgnratives. Pour enrayer le stress
oxydant, il faut donc aider la cellule et lorganisme par lapport dantioxydants secondaires
(vitamine C, E, carotnodes, polyphnols.) (Kohen et Nyska, 2002).
IV.2. ACTIVIT ANTIMICROBIENNE
IV.2.1. Introduction
Ds la naissance l'homme se trouve en contact avec des micro-organismes qui vont
progressivement coloniser son revtement cutano-muqueux. Pour rsister ces micro-
organismes de nombreux moyens sont mis en jeu. On peut schmatiquement en distinguer 3
groupes : les barrires anatomiques, les mcanismes de rsistance naturelle (ou inns) et
l'immunit acquise (Kaufmann, 1997).
IV.2.2. Les principales substances antimicrobiennes
a- Les antibiotiques
Les antibiotiques, au sens strict, sont des produits labors par des micro-organismes, mais on
inclut gnralement parmi eux les drivs semi-synthtiques et les produits entirement
synthtiques. La thrapeutique des infections bactriennes se base principalement sur lusage des
antibiotiques qui inhibent slectivement certaines voies mtaboliques des bactries, sans exercer
habituellement d'effets toxiques pour les organismes suprieurs. Cette proprit les distingue des
antiseptiques (Bergogne-Berezin et Dellamonica, 1995).
. La prescription grande chelle et parfois inapproprie de ces agents a entran la slection
de souches multi-rsistantes do limportance dorienter les recherches vers de nouvelles voies
et surtout vers les vgtaux qui ont toujours constitu une source dinspiration de nouveaux
mdicaments (Billing et Sherman, 1998).
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b- Les huiles essentielles
Produites comme mtabolites secondaires par les plantes aromatiques, les huiles essentielles
sont toujours utilises comme substances aromatisantes et parfumantes en parfumerie, industries
alimentaire et cosmtique et comme agents antimicrobiens en mdecine populaire, en
aromathrapie et en industrie alimentaire (Baudoux, 2000). Diffrentes tudes rcentes ont
confirm, in vitro, lactivit antimicrobienne de diverses huiles essentielles (Hili et al., 1997 ;
Billing et Sherman, 1998).
Lactivit antimicrobienne des huiles essentielles est principalement fonction de leur
composition chimique, en particulier de leurs composs volatils majeurs. En effet, lactivit
antimicrobienne remarquable de lhuile essentielle de Thymus vulgaris est en relation avec sa
teneur leve en thymol (un compos phnolique) qui est rput avoir une trs grande action
antimicrobienne (Ettayebi et al., 2000 ; Ultee et al., 2000 ; Friedman et al., 2002 ; Chun et al.,
2005).
IV.2.3. Les bactries tudies
a- Staphylococcus aureus
Les staphylocoques sont des cocci Gram positif qui tendent se grouper en amas. Une
espce, Staphylococcus aureus (staphylocoque dor), tient une place trs importante dans les
infections communautaires et nosocomiales (Chambers, 1997).
b- Escherichia coli
Escherichia coli (bacille Gram ngatif), commensal du tube digestif, est la bactrie la plus
frquemment implique dans les infections urinaires. Elle peut aussi provoquer des diarrhes par
des mcanismes trs divers, ainsi que diverses infections communautaires ou nosocomiales
(Nataro et Kaper, 1998).
c- Pseudomonas aeruginosa
Un certain nombre de bacilles Gram ngatif de l'environnement se comportent comme des
bactries opportunistes et sont souvent l'origine d infections nosocomiales. Il s'agit souvent de
bactries rsistantes de nombreux antibiotiques. Une des plus redoutables est Pseudomonas
aeruginosa (Philippon, 1995).
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d- Salmonella typhimurium
Salmonella (bacille Gram ngatif) est la premire cause de toxi-infections alimentaires
collectives bactrienne dans le monde, elle est lune des proccupations majeures des
laboratoires de contrle de qualit alimentaire. S. Typhimurium est largement rpandue dans les
diffrents rservoirs animaux (porcs, bovins, volailles) et dans certaines denres destines
lhomme (Medjbar, 2008).
IV.2.4. La levure Candida albicans
Les levures sont typiquement unicellulaires, quoique trs souvent les cellules restent colles
les unes aux autres aprs la division cellulaire (fig. 20) (Fuerst, 1976).
Candida albicans est la seule levure prise dans notre tude. Elle est principalement lorigine
de la candidose dissmine. Cest un champignon frquemment retrouv au niveau de la bouche
et du tractus gastro-intestinal de plusieurs personnes normales. Parmi les conditions favorisant
une infection candida, notons le diabte, la grossesse, les antibiotiques, les cortico- strodes et
toute maladie pouvant affecter ltat gnral dun individu. La nystatine (Mycostatin) est trs
efficace dans le contrle des infections muco-cutanes (Pieri et Kirkiacharian, 1992).
Fig. 20 : Aspect morphologique des micro-organismes
tudis (Pieri et Kirkiacharian, 1992)
(a) : S. aureus ; (b) : E. coli ; (c) : P. aeruginosa ; (d) : C. albicans.
a
b
d c
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Matriel et Mthodes
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PARTIE EXPERIMENTALE : MATERIEL ET METHODES
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I. MATERIEL ET METHODES
I.1. Matriel vgtale
Les feuilles (sches) des deux espces de plantes Thymus vulgaris L. et Laurus nobilis L. ont
t achetes au march local de Batna (Rahba), en fvrier 2007. Lidentification botanique des
deux espces a t ralise par D
r
OUDJEIH B., laboratoire de botanique, dpartement
dagronomie, universit EL-Hadj Lakhdar, Batna.
Les feuilles ont t nettoyes, laves avec de leau du robinet et sches lombre. Elles ont
t ensuite peses, broyes grossirement et rcupres dans des sacs propres.
I.2. Dtermination de la teneur en eau
Le taux dhumidit, dans nos chantillons (la poudre des feuilles sches de nos plantes), t
dtermin par le procd de dessiccation une temprature de 105 C dans une tuve isotherme
ventile la pression atmosphrique jusqu' lobtention dun poids constant (Linden et Lorient,
1994).
Considrons :
x Poids de lchantillon ;
y Poids de lchantillon aprs dshydratation ;
I% Taux dhumidit exprim en pourcentage ;
I% =
x - y
x
100 ;
Pour plusieurs mesures, on calcule lhumidit moyenne :
I% ( moy. ) = I
1
% + I
2
% + . + I
n
% / n ;
n Nombre totale dchantillon ;
Moy. : Moyenne ;
I
1
% Humidit de lchantillon N 1;
I
n
% Humidit de lchantillon N n.
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I.3. Prparation des extraits
I.3.1. Extraction par les solvants organiques polarit croissante
Lextraction est effectue par puisement successive du matriel vgtal, en utilisant trois
solvants polarit croissante : ther de ptrole (EP), dichloromthane (DCM) et mthanol
(MeOH), mthode dcrite par Biallo et al. (2004). La quantit de solvant doit tre approprie la
quantit de matire vgtale dont nous disposons (dans notre cas, 2 L de solvant pour 200 g de
drogue). Lextraction est effectue sous agitation continue et temprature ambiante durant 24
heures. Aprs filtration, le rsidu est ensuite concentr par vaporation rotative dans un
Rotavapeur (BCHI) la fig. 22 illustre les tapes suivies dans cette extraction.
Fig. 22 : Schma dextraction par les solvants organiques des poudres
de feuilles de Thymus vulgaris et Laurus nobilis.
I.3.2. Extraction par macration leau
La poudre de feuilles (200 g) de chacune des deux espces slectionnes est mise macrer
temprature ambiante dans leau distille (2 L) pendant 24 heures. Aprs dcantation du
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mlange, lextrait hydrique est rcupr par filtration sur papier Wattman. Le filtrat obtenu est
immdiatement congel 4 C puis lyophilis dans un lyophilisateur. Les lyophilisats ont t
rcuprs dans des flacons en verre hermtiquement ferm et conserv 4 C jusqu leur
utilisation o ils sont reconstitu avec de leau distille aux concentrations voulues.
Fig. 21 : Schma de macration par leau distille des poudres
de feuilles de Thymus vulgaris et Laurus nobilis.
La srie dextraction permet dobtenir quatre extraits bruts : un extrait aqueux (Aq) et trois
extraits organique : extrait ther de ptrole (EP), extrait dichloromthane (DCM) et extrait
mthanolique (MeOH). Les extraits secs sont conservs 4C jusqu utilisation.
I.4. Dtermination du rendement
Le poids en extraits secs est dtermin par la diffrence entre le poids du ballon plein (aprs
limination du solvant par vaporation rotatif) et le poids du ballon vide.
I.5. Etude phytochimique des extraits
Dans le but de caractriser les extraits prpars partir des feuilles de Thymus vulgaris et
Laurus nobilis, des analyses qualitatives et quantitatives ont t effectues.
I.5.1. Analyses qualitatives
Cette tude permet de mettre en vidence la prsence de quelques groupes chimiques
(polyphnols, flavonodes) dans nos extraits. Les essais de caractrisation en tube permettent une
recherche grossire des composants chimiques; les rsultats peuvent tre difficilement
interprtables. La CCM et lHPLC confirme les tests en tube.
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I.5.1.1. Essais de caractrisation en tube
La raison principale pour le choix de ces substances (flavonodes) rside dans le fait que la
majorit des effets pharmacologiques des plantes leur sont attribus.
Mthode :
La prsence ou labsence des flavonodes dans un extrait peut tre mise en vidence par un
test simple et rapide appel " raction de Shinoda" (Lock et al., 2006). Le test consiste ajouter
1ml de lextrait, quelques gouttes dHCl concentr (2N) et environ 0,5g de magnsium
mtallique. Laisser agir 3 min et regarder le changement de couleur. La prsence de flavonodes
est confirme par la coloration rouge, orange, rose ou rouge violac.
I.5.1.2. Essais de caractrisation par chromatographie sur couche mince (CCM)
Lanalyse des extraits bruts par chromatographie sur couche mince (CCM, TLC en anglais)
nous permet dans un premier temps davoir une ide sur les diffrentes classes de composs
contenus dans les extraits tests.
Principe :
La CCM est une technique analytique simple, rapide et peu coteuse, utilise au cours de la
sparation et de lidentification des mtabolites. Elle repose principalement sur les phnomnes
dadsorption et de partage, o les molcules sparer sadsorbent la surface dun support
(phase stationnaire) et seront entraines travers ce dernier par un luant (phase mobile), donc la
sparation est fonction des diffrences dadsorption des composants de lchantillon sur la phase
stationnaire et des diffrences de leur solubilit dans la phase mobile (Braithwaite et Smith,
1999).
Mthode :
Les analyses sont effectues en phase normale, avec des plaques de silice (Silicagel 60 F
254,
de
0,25 mm dpaisseur) dposes sur feuille d'aluminium, ce qui constitue la phase stationnaire.
Sur les plaques prpares, on a dpos 10 l de chaque extrait (100 mg/ml) et standard (5 mg/ml)
et les plaques sont ensuite introduites dans des cuves conventionnelles en verre pralablement
sature par la phase mobile, qui peut tre gnralement un mlange binaire ou ternaire de
solvants, selon le type de sparation recherche. Dans notre cas, deux systmes de solvants ont
t utiliss (Biallo et al., 2004) :
Ether de ptrole - Actate dthyle (80 : 20 V/V) pour les extraits apolaire (EP et DCM) ;
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n-Butanol - Acide actique - Eau (60 : 15 : 25 V/V/V) pour les extraits MeOH et Aq ;
Aprs dveloppement, les plaques CCM sont sches, observes sous lampe UV 254 nm et 366
nm, pulvrises par un mlange vanilline sulfurique, puis sches 60C pendant 5 minutes fin
de rvler les spots issus de la sparation.
A 254 nm, les tches sont encercles en trait plein et 366 nm, elles sont encercles en
pointills, se sont les substances UV actives. La vanilline sulfurique (ractif de Godin) est un
ractif spectre large permet de caractriser des terpenodes, des drivs de type phnylpropanes
et des phnols. Elle est forme dun mlange (V/V) dune solution thanolique dacide
sulfurique (V/V) et dune solution thanolique de vanilline 1%.
Les R
f
sont compars ceux des tmoins disponibles facilitant ainsi lidentification de quelques
constituants des diffrents extraits. La valeur du R
f
est dfinie comme suit :

: Distance entre lorigine et la tche du produit aprs lution.
s
: Distance entre lorigine et le font du solvant aprs lution.
Chaque substance a t identifie par sa fluorescence sous UV, par son rapport frontal (R
f
)
dans un systme de solvant prcis et par sa couleur aprs rvlation avec le ractif de la vanilline
sulfurique.
I.5.1.3. Essais de caractrisation par chromatographie liquide haute performance
La technique de sparation la plus apprcie en analyse phytochimique est la chromatographie
liquide haute performance (pression), abrge HPLC (CLHP en franais).
Principe :
La mthode de sparation quelle utilise fait appel aux mmes lments de base que ceux
employs pour la chromatographie classique sur colonne, soit un ou plusieurs solvants et une
colonne remplie avec une phase stationnaire, mais avec un appareillage plus sophistiqu. La
grande diffrence par rapport la chromatographie classique rside dans la dure dlution. Cette
vitesse est obtenue par lapplication dune pression leve grce une pompe qui maintient
constant le dbit de lluent, elle se distingue galement de la chromatographie classique par
lutilisation dun dtecteur dont le message est enregistr puis exploit par un dtecteur reli au
systme (Braithwaite et Smith, 1999).
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Mode opratoire :
Les analyses ont t ralises laide dun chromatographe HPLC-RP-C18, quip
dlments suivants :
- une colonne (dune longueur de 125 mm et dun diamtre interne de 4,6 mm) contenant
la phase stationnaire apolaire (phase inverse), cette dernire est constitue de silice
modifi chimiquement par greffage de rsidus (C-18), ces colonnes en phase inverse
permettent la sparation des composs polaires, solubles dans leau ou dans les mlanges
hydro-alcooliques ;
- un systme de pompage, Pompe: VARIAN 9010, pour dplacer la phase mobile haute
pression (plusieurs dizaines de bars) ;
- un injecteur : VARIAN 9100, pour introduire lchantillon, dans le systme haute
pression ;
- un dtecteur monochrome: VARIAN 9065 ;
- un logiciel informatique permettant de visualiser les signaux enregistrs par le dtecteur.
Les conditions opratoires sont les suivantes:
Dbit: 0,5 ml/min ;
Pression de travail : 100-150 bars ;
Volume dinjection: 30 l ;
Longueur donde: 254 nm ;
Concentration de lchantillon: 15 mg/ml ;
Temps danalyse : 15 min ;
Phase mobile est de composition constante (mode isocratique), elle est compose dun mlange
mthanol - eau (60 : 40 V/V) (Kuntie et al., 2007).
Dfrentes substances sont identifies dans nos extraits par comparaison des
chromatogrammes des standards avec ceux des chantillons.
I.5.2. Analyses quantitatives
I.5.2.1. Dosage des polyphnols totaux
Le dosage des polyphnols totaux dans les extraits de feuilles de Thymus vulgaris et Laurus
nobilis a t effectu spectrophotomtriquement selon la mthode au ractif de Folin Ciocalteu
(Singleton et al., 1999).
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Principe :
Ce dosage est bas sur la quantification de la concentration totale de groupements hydroxyles
prsents dans l'extrait. Le ractif de Folin-Ciocalteau consiste en une solution jaune acide
contenant un complexe polymrique d'ions (htropolyacides). En milieu alcalin, le ractif de
Folin-Ciocalteau, oxyde les phnols en ions phnolates et rduit partiellement ses
htropolyacides, d'o la formation d'un complexe bleu. (Daels-rakotoarison, 1999).
Mode opratoire :
A 0.2 ml dextrait (prpar dans leau distille avec les dilutions convenables) est ajout 0.8
ml de la solution de Na2CO3 (75 mg/ ml deau distille), aprs agitation, 1ml de la solution de
Folin Ciocalteu (dilu dix fois dans leau distille) est ajout lensemble, aprs 2 h
dincubation la temprature du laboratoire, labsorbance est lue 765 nm contre un blanc sans
extrait.
Le taux de polyphnols totaux dans nos extraits, a t calcul partir dune courbe dtalonnage
linaire (y = ox + b) , tablie avec des concentrations prcises dacide gallique (0-200 pgml),
comme standard de rfrence, dans les mmes conditions que lchantillon. Les rsultats sont
exprims en microgramme dquivalent dacide gallique par milligramme dextrait de feuilles en
poudre (pg EqA0mg) .
I.5.2.2. Dosage des flavonodes
La mthode du trichlorure daluminium (Yi et al., 2007) est employe pour dterminer la
teneur en flavonodes totaux dans les diffrents extraits de feuilles de Thymus vulgaris et Laurus
nobilis. 1 ml de lchantillon (prpar dans le mthanol avec les dilutions convenables) est ajout
1ml de la solution dAlCl
3
(2% dans le mthanol), le mlange est vigoureusement agit. Aprs
10 min dincubation, labsorbance est lue 430 nm.
Une courbe dtalonnage (y = ox +b) tablie par la querctine (0-40g/ ml ) , ralise dans
les mmes conditions opratoires que les chantillons, servira la quantification des flavonodes.
La teneur en flavonodes est exprime en microgramme dquivalent de querctine par
milligramme dextrait ( g qQ/ mg dext ) .
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I.6. Tests des effets biologiques
I.6.1. Tests dactivit antimicrobienne
a- Les souches microbiennes testes
Les germes qui ont t tests pour dceler lactivit antimicrobienne des extraits Thymus
vulgaris et Laurus nobilis sont les suivants :
- Trois souches de collection internationale ATCC (American type culture collection) :
Staphylococcus aureus ATCC 25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 et
Escherichia coli ATCC 25922 ;
- Trois souches cliniques isoles de patients hospitaliss (au Centre Hospitalier
Universitaire de Batna "CHU") pour des infections urinaires : Staphylococcus aureus,
Pseudomonas aeruginosa et Escherichia coli ;
- Une bactrie aviaire isole localement de poulets souffrants dune gastro-entrite
dorigine microbienne : Salmonella typhimirium ;
- Nous avons utilis un seul type de levure de rfrence, savoir Candida albicans ATCC
2071.
- Ils ont tous t fournis par le laboratoire de microbiologie et immunologie, facult des
sciences, dpartement de vtrinaire, universit EL-Hadj Lakhdar -Batna.
b- Conservation des souches
Les souches sont conserves 5C dans des tubes striles contenant 10 ml de milieu de
culture inclin (glose nutritive).
c- Les milieux de culture
Les milieux de culture utiliss pour la ralisation des tests antimicrobiens sont les suivants :
- La glose nutritive pour lisolement et lentretien des souches bactriennes ;
- La glose Mueller Hinton pour ltude de la sensibilit des bactries aux diffrents
extraits de plantes ;
- La glose Sabouraud pour lisolement et lentretien de la levure et ltude de sa
sensibilit aux extraits.
d- Prparation des prcultures
Les souches microbiennes tester ont t cultives dans des boites de ptrie contenant de la
glose nutritive. Aprs 18h dincubation 37C, des suspensions microbiennes dune densit
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optique de 1 McFarlend ont t prpares, pour chaque microorganisme, dans 10 ml deau
distille strile.
e- Essais antimicrobiens
Deux mthodes diffrentes sont employes pour lvaluation de leffet antimicrobien des
diffrents extraits bruts des feuilles de Thymus vulgaris et Laurus nobilis : la mthode de
diffusion partir dun disque de papier (Essawi et Srour, 2000) qui permet la mise en vidence
de lactivit antimicrobienne des diffrents extraits et la mthode des microdilutions (Billerbeck
et al., 2002) qui a pour objectif la dtermination des CMIs (concentrations minimales
inhibitrices) partir d'une gamme de concentrations de produit dans le milieu de culture.
I.6.1.1. Mthode de diffusion partir dun disque solide
La mthode de diffusion partir dun disque solide a t utilise pour mettre en vidence
lactivit antimicrobienne des germes pathognes vis--vis des antibiotiques et des extraits bruts.
a. Test de sensibilit aux antibiotiques : antibiogramme
Ce test a t ralis pour tudier lantibiogramme standard des germes utiliss et le comparer
avec leffet de nos extraits bruts. Les disques dantibiotiques sont dposs la surface d'un
milieu glos, pralablement ensemenc avec une culture pure de la souche tudier. La
sensibilit des bactries aux antibiotiques est apprcie selon le mme protocole quavec les
disques de papiers imprgns dextrait.
On a utilis cinq antibiotiques diffrents [ampicilline (AMP), cfotaxime (CTX), ofloxacine
(OFX), ticarciline (TE) et spiramycine (SP)] et un antifongique (nystatine). Le choix a t fait
en fonction de la disponibilit.
b. Test de sensibilit aux extraits bruts des plantes : antibioaromatogramme
Les diffrents extraits organiques des deux plantes sont solubiliss dans le DMSO et les
extraits aqueux sont dissouts dans leau distille strile. La glose approprie est coule dans des
boites de ptri de 90 mm de diamtre et inocule avec une suspension microbienne pure
fraichement prpare. Deux boites sont utilises pour chaque souche. Un disque de papier
Whatman strile de 6 mm de diamtre est imbib de 30l dextrait (reconstitu selon la
concentration voulue) puis dpos la surface de la glose ensemence, lensemble est incub
pendant 24 heures 34C. Ds l'application des disques imprgn lextrait diffuse de manire
uniforme et aprs 24 heures dincubation, la prsence autour des disques dune zone dinhibition
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circulaire dans laquelle il ny a pas de croissance de micro-organismes dnote la sensibilit de
ceux-ci a` cet extrait. Plus la zone dinhibition est grande, plus le germe est sensible. Le
screening antimicrobien a t effectu avec 3 types de concentrations pour chaque extrait (1g/ml,
0,5 g/ml et 0,25 g/ml).
I.6.1.2. Mthode des microdilutions en milieu solide
Cette mthode permet la dtermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) partir
d'une gamme de concentrations dextrait dans le milieu de culture. D'aprs la mthode de
Benjilali et al. (1986), rapporte par Billerbeck et al. (2002), une solution-mre de chaque extrait
(dune concentration finale de 10 % = 0.1 g/ml) est obtenue en DMSO, puis une srie de
dilutions de raison gomtrique 2 est ralise extemporanment en DMSO, partir de la
solution-mre ; 2 ml de chaque dilution sont alors incorpors 38 ml de milieu MH (bactries)
ou de Sabouraud (levure), maintenu en surfusion. Les mlanges sont immdiatement repartis
dans deux botes de ptri raison de 20 ml de milieu par bote. La gamme de concentrations
finales ainsi obtenue correspond 0.5 - 0.25 - 0.125 - 0.0625 - 0.0312 - 0.0156 - 0.0078 - 0.0039
- 0.0019 et 0.0010 %. Aprs solidification, l'inoculation des gloses, contenant lextrait ou non
(tmoin) est effectue en surface, sous forme de dpts de 1 l (raliss l'aide d'une
micropipette).
Pour les bactries, la CMI a t dtermine seulement pour les extraits les plus actifs
constats lors de ltude en milieu solide (dont les diamtres dinhibition sont 20 mm), dans
une bote contenant le produit dans le milieu MH plusieurs dpt ont t effectus (une
concentration dextrait pour toutes les souches). Pour la levure, un seul dpt est ralis par bote
contenant lextrait dans le milieu Sabouraud. Des tmoins de croissance et de strilit du milieu
sont raliss pour chaque souche et chaque srie d'essais. Tous les essais sont raliss deux fois.
Aprs incubation 35C pendant six jours, la croissance est compare celle du tmoin. La CMI
est dfinie comme la plus petite concentration dextrait pour laquelle aucune croissance n'est
visible comparativement au tmoin sans extrait.
I.6.2. Tests dactivit antioxydante
I.6.2.1. Mthode de blanchissement de la -carotne
Principe :
Ce test mesure l'activit antioxydante envers l'acide linolique relativement la -carotne.
Cette dernire n'est pas due tre affecte la prsence d'un antioxydant fort. Dans ce cas la
solution restera avec la mme couleur initial se qui signifie que la -carotne n'tait pas
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ncessaire pour empcher l'oxydation de l'acide linolique car la prsence dun antioxydant dans
l'extrait pouvait faire ainsi (Tepe et al., 2005).
Mode opratoire :
La mthode dcrite par Tepe et ces collaborateurs (2005) a t employe avec une lgre
modification. Une mulsion -carotne/acide linolique a t prpare par solubilisation de 2 mg
de -carotne dans 1 ml de chloroforme, ensuite 25 l de lacide linolique et 200 mg de tween
40 sont additionns. Le chloroforme est compltement vapor au rotavapeur et 100 ml deau
oxygne sont ajouts, lmulsion rsultante est vigoureusement agite.
2,5 ml du mlange prcdent, 350 l de chaque extrait ont t ajouts ( une concentration
de 2 mg/ml dans le mthanol sauf lextrait aqueux dans leau distille), trois rptitions ont t
effectues pour chaque extrait. Les tubes essai ont t incubs en obscurit la temprature du
laboratoire. Deux tubes contrle ont t aussi prpars avec la mme procdure, lun contenant
un antioxydant de rfrence BHT (contrle positif) et l'autre sans antioxydant (contrle ngatif)
o lchantillon est remplac par 350l de mthanol.
La cintique de dcoloration de lmulsion en prsence et en absence dantioxydant est suivie
490 nm des intervalles de temps rguliers pendant 48heures. Lactivit antioxydante relative
des extraits (AAR) est calcule selon lquation suivante :
AAR% = [Abs
48h
(chantillon)/Abs
48h
(BHT)] x 100.
I.6.2.2. Mthode de rduction du radical libre DPPH :
Principe :
Le DPPH (fig. 23) est un radical stable et il prsente en solution une absorption
caractristique 517 nm qui lui confre une coloration violette. Cette couleur disparat
rapidement lorsque le DPPH est rduit par un capteur de radicaux libres. On peut rsumer cette
raction par lquation suivante :
O (AH)
n
reprsente un compos capable de cder un hydrogne au radical DPPH
.
(violet) pour
le transformer en molcule DPPH-H (Brand-Williams et al., 1995).
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Fig. 23 : Forme libre et rduite du DPPH (Brand-Williams et al., 1995).
Mode opratoire :
La mthode au DPPH est ralise par deux techniques diffrentes :
a. Test anti-radicalaire contre le DPPH sur plaques CCM
Nous avons utilis la mthode mise au point par Takao et ses collaborateurs (1994). Sur
plaques de Silicagel 60 F
254
(Merck) possdant un support en aluminium, nous avons dpos 10
l de chaque solution dextrait la concentration de 10 mg/ml. La plaque a t place dans une
cuve chromatographie contenant les systmes de solvant suivant :
- Ether de ptrole - Actate dthyle (80 : 20 V/V) pour les extraits apolaire (EP et DCM).
- n-Butanol - Acide actique - Eau (60 : 15 : 25 V/V/V) pour les extraits polaires (MeOH et Aq).
Aprs migration, les chromatogrammes ont t schs, puis rvls laide dune solution de
DPPH (2mg/ml dans le mthanol). Les constituants de lextrait prsentant une activit antiradicalaire
apparaissent sous forme de spots de couleur Jaune-blanc sur fond violet.
b. Test anti-radicalaire contre le DPPH mesur au spectrophotomtre
La mthode dcrite par Tepe et autres (2005) a t employe. Diffrentes concentrations
comprises entre 0-50 mg/ml des chantillons tudis (les diffrents extraits) et des tmoins (acide
ascorbique et BHT des antioxydants de rfrence ; querctine et rutine substance pure ).
Une solution de DPPH a t prpare par solubilisation de 3 mg de DPPH dans 100 ml de
mthanol, 50 l de solution chantillons et tmoins sont ajoutes 2 ml de la solution de DPPH,
aprs incubation de 30 min en obscurit la temprature ambiante, les absorbances sont
mesures 517 nm contre le blanc correspondant. Lactivit antioxydante est estime selon
lquation suivante :
% dactivit antioxydante = [Abs contrle-Abs chantillon / Abs contrle] x 100.
Les rsultats ont t exprims par la moyenne de deux mesures spars cart type. Le
paramtre IC
50
(concentration quivalente 50% de DPPH perdu) est dfini comme tant la
concentration du substrat qui cause la perte de 50% de l'activit de DPPH (couleur).
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Etude statistique
Les analyses de la variance ont t ralises par le logiciel statistique GraphPad Prism V 5,00.
Quelques expriences ont t faites en double et dautres en triple, les rsultats ont t prsents
par la moyenne avec son cart type (n= 2 ou 3) pour chaque cas.
La diffrence entre les extraits et les contrles et la dtermination des taux de signification
sont effectus par test ANOVA suivi du test Tukey. Les diffrences ont t considres
significatives P < 0,05.
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Rsultats et Discussion
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PARTIE EXPERIMENTALE : RESULTATS ET DISCUSSION
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II. RESULTATS ET DISCUSSION
II.1. Le taux dhumidit
Les vgtaux sont riches en eau, les plantes fraches renferment 60 80 % deau. Pour assurer
une bonne conservation, la teneur en eau doit tre infrieure ou gale 10 % (Paris et Moyse,
1965). Nous avons utilis la mthode pondrale pour dterminer la teneur en eau dans la poudre
des feuilles sches de nos plantes. Cest la dtermination de la perte de masse par dessiccation
ltuve.
Les rsultats de cette analyse ont rvl un taux dhumidit infrieure 10% pour les deux
plantes Thymus vulgaris et Laurus nobilis (fig. 24), les proportions sont respectivement de 9.40
% ( 0.03) et 6.79 % ( 0.18). La teneur en eau, infrieure 10% confre notre poudre une
meilleure conservation long terme.
Fig. 24 : Teneur en humidit des feuilles sches
des deux plantes mdicinales.
II.2. Lextraction
Pour l'obtention des diffrents extraits de la poudre de feuilles des deux plantes Thymus
vulgaris et Laurus nobilis, nous avons ralis des extractions aqueuses (avec leau distille) et
organiques par la mthode de Biallo et al. (2004) (avec des solvants polarit croissante : EP,
DCM et MeOH).
Cette extraction a permis dobtenir quatre extraits bruts pour chaque plante : lextrait aqueux
(EAq), lextrait ther de ptrole (EEP), lextrait dichloromthane (EDCM) et lextrait mthanol
(EMeOH). Le calcul des rendements par rapport au poids total de la poudre de feuilles montrent
que les deux plantes ont donn des masses en extraits sec suprieurs 1 g / 100 g de plante en
poudre. Du point de vue rentabilit en poids, les extraits polaires (MeOH et Aq) ont donn les
proportions les plus leves en comparaison avec les extraits apolaires (EP et DCM) ; cela peut
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sexpliquer par le fait que lEP et le DCM sont des solvants organiques apolaires trs volatils et
juste utiliss pour dgraisser les drogues.
Lextrait MeOH de Laurus nobilis reprsente le rendement le plus lev (21.94 %) suiv de
lEAq de Thymus vulgaris (20.05 %), lEEP de Thymus vulgaris a le plus faible rendement avec
1.94 %. Le rendement des extractions, laspect et la couleur des extraits sont reports dans le
tableau ci-dessous.
Tableau 5 : Aspects, couleurs et rendements des extraits
de feuilles de Thymus vulgaris et Laurus nobilis
Plante Extrait Aspect Couleur Rendement (%)
Thymus
vulgaris
EP Pte huileuse Vert fonc 1.94
DCM Pteux Noire 2.73
MeOH Pte collante Noire 6.24
Aq Poudre Marron fonc 20.05
Laurus
nobilis
EP Huileux Vert 4.59
DCM Pteux Noire 2.96
MeOH Pte collante verdtre 21.94
Aq Poudre Jaune 15.2
Lutilisation de solvants polarits diffrentes permet de sparer les composs de la poudre
de feuilles selon leur degr de solubilit dans le solvant dextraction et donc permet de sparer
ses flavonodes selon leur degr de glycosylation (flavonodes aglycones, mono, di et tri-
glycosyls) (Tableau 6). Cette mthode dextraction mene temprature ambiante permet
dextraire le maximum de composs et de prvenir leur dnaturation ou modification probable
dues aux tempratures leves utilises dans dautres mthodes dextraction.
Il est difficile de comparer les rsultats avec ceux de la bibliographie, le rendement nest que
relatif et dpend de la mthode et des conditions dans lesquelles lextraction a t effectue. La
mthode dextraction affecte galement tout le contenu total en phnols et flavonodes et
lactivit antioxydante (Lee et al., 2003).
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Tableau 6 : Les composs que pourraient contenir les diffrents
extraits prpars (Daprs Ciulei, 1981).
Extraits Constituants probables
EP
Cires, chlorophylle, lipides, acides gras, strols, triterpnes,
carotnodes, huiles essentielles, flavonodes aglycones hautement
mthoxyls, coumarines.
DCM
Terpnodes, polyphnols aglycones (flavonodes, coumarines,
tanins, anthracenosides), chlorophylle.
MeOH
Flavonodes et coumarines glycosyls, flavonodes sulfats,
alcalodes, acides amins, tanins, acides phnoliques, triterpnes et
strols glycosyls.
Aq
Flavonodes, aminoacides, terpnes, cires, tanins.
II.3. Rsultats de ltude phytochimique
II.3.1. Rsultats de lanalyse qualitative
II.3.1.1. Ractions de caractrisation
Le test de recherche des flavonodes dans les diffrents extraits de Thymus vulgaris et Laurus
nobilis a donner des ractions positives. Les rsultats de cette tude phytochimique sont reports
dans le tableau 7.
Tableau 7 : Rsultats des ractions de caractrisation des
flavonodes dans nos extraits
Plante Extrait Flavonodes
Thymus
vulgaris
EP + + +
DCM + + + +
MeOH + + +
Aq + +
Laurus
nobilis
EP +
DCM + + + +
MeOH + + +
Aq +
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Ces rsultats sont confirms par la CCM, lHPLC et le dosage colorimtrique par
spectrophotomtre.
II.3.1.2. Chromatographie sur couche mince
Pour une caractrisation partielle des diffrents extraits de feuilles de Thymus vulgaris et
Laurus nobilis, une chromatographie sur couches minces (CCM) a t ralise suivant la
mthode de (Biallo et al., 2004). Les systmes solvants utiliss :
- Ether de ptrole - Actate dthyle (80 : 20 V/V) pour les extraits apolaires (EP et DCM) ;
- n-Butanol - Acide actique - Eau (60 : 15 : 25 V/V/V) pour les extraits polaires (MeOH et Aq) ;
ont permis davoir une bonne sparation et une visibilit acceptable des spots, (Fig. 25 et 26).
Les extraits Aq ont t limins du fait quils donnent une tche diffuse massive d la phase
mobile utilise, inadquate pour la sparation des composs trs polaires.
Les tmoins utiliss dans cette analyse nont pas migrs avec le systme de solvant apolaire et
par consquent on ne peut pas comparer leurs Rf avec ceux des extraits apolaires (EP et DCM)
puisque ils ont migr dans deux systmes de sparation diffrents.
Les rsultats de la chromatographie sur couche mince de tous nos extraits sont rsums dans
les tableaux 8 et 9. Il sagit des informations sur les facteurs de rtention des constituants
chimiques, leur comportement la lumire UV ( 254nm et 366nm), et leur coloration aprs
rvlation avec le ractif de Godin.
La majorit des spots observs avec lextrait EP se retrouvent au niveau de lextrait DCM et
cela pour les deux plantes tudies. (Fig. 25).
Les extraits apolaires (EP et DCM) des feuilles des deux plantes (Thymus vulgaris et Laurus
nobilis) ont montr aprs observation lUV (254 et 366 nm) et rvlation par le ractif de
Godin une richesse en constituants chimiques. A 254 nm, la majorit des spots apparaissent
sombres. A 366 nm, les spots apparaissent en vert et en jaune. Aprs rvlation par le Godin, la
majorit des spots apparaissent en bleu sombre, signalons la prsence des spots franches de
couleur violet fonc, rose et vert-bleu. Tout ce nombre de spots lev et de couleurs varis constitue
une indication sur la prsence de plusieurs types de substances chimiques. Selon Bruneton (1993),
la fluorescence 366 nm pourrait indiquer la prsence des coumarines, des strols ou des
triterpnes et jaune intense au Godin pourraient tre des flavonodes.
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Les solvants ther de ptrole et dichloromthane sont apolaires et sont gnralement utiliss
pour dgraisser la drogue. A lil nu, les taches Rf gal 0.02, 0.07, 0.18 et 0.87 apparaissent
vertes. Les colorations vertes de certaines taches loeil nu des extraits ther de ptrole et
dichloromthane sont typiques des chlorophylles.
La tache Rf = 0.28 dans les extraits EP et DCM a une fluorescence verte 366 nm et se
colore en jaune intense aprs rvlation au Godin. Cette coloration serait une indication sur la
prsence de flavonodes (Andersen et Markham, 2006).
Tableau 8 : Rsultats de la sparation par CCM des extraits apolaires (EP et DCM) des
feuilles de Thymus vulgaris et Laurus nobilis dans le systme solvant :
Ether de ptrole - Actate dthyle (80 : 20).
EXTRAIT NSpot Rf
Observation
254 nm
Fluorescence
366 nm
Godin
EP (Tv)
EP
1
EP
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EP
3
EP
4
EP
5
EP
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0.02
0.18
0.28
0.55
0.65
0.87
-
-
-
-
Visible
Visible
Jauntre
Vert
Vert
Jaune
-
-
-
-
Jaune fonc
Rose
-
-
DCM(Tv)
DCM
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DCM
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DCM
3
DCM
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DCM
5
DCM
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DCM
7
0.02
0.18
0.28
0.55
0.61
0.65
0.87
-
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-
Visible
Visible
Visible
Jauntre
Vert
Vert
Jaune
-
-
-
-
-
Jaune fonc
Rose
Bleu sombre
-
-
EP (Ln)
EP
1
EP
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EP
3
EP
4
EP
5
EP
6
EP
7
EP
8
0.02
0.07
0.09
0.11
0.28
0.29
0.49
0.87
-
Visible
-
Visible
-
Visible
Visible
Visible
Jauntre
Vert clair
-
-
Vert
-
-
Jaune
-
-
Bleu sombre
-
Jaune fonc
-
Violet fonc
Bleu sombre
DCM(Ln)
DCM
1
DCM
2
DCM
3
DCM
4
DCM
5
DCM
6
DCM
7
DCM
8
DCM
9
DCM
10
DCM
11
0.04
0.06
0.09
0.11
0.28
0.49
0.55
0.62
0.68
0.82
0.87
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Visible
-
Visible
-
-
Visible
Visible
Visible
Visible
Visible
Vert clair
-
-
-
Vert sombre
-
-
-
-
-
Jaune
-
-
Bleu sombre
-
Jaune fonc
Violet fonc
-
-
-
-
Bleu sombre
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Par calcul des rapports frontaux des extraits MeOH et leur comparaison avec ceux des
tmoins (Tableau 9) les composs suivants ont t identifis :
- La rutine et la querctine dans lextrait MeOH de Thymus vulgaris ;
- La catchine dans lextrait MeOH de Laurus nobilis.
Les diffrences de couleurs entre les spots issus de la sparation des extraits et leurs tmoins
correspondants peuvent tre expliques par le fait quun compos, prsent dans un mlange
complexe (extrait), acquire des proprits diffrentes de celles du mme compos pur. Ces
rsultats restent tout de mme prliminaires.
Tableau 9 : Rsultats de la sparation par CCM des extraits polaires (MeOH et Aq) des
feuilles de Thymus vulgaris et Laurus nobilis dans le systme solvant :
B.A.W. (60 : 15 : 25)
Extraits /
Tmoins
NSpot Rf
Observati
on 254
nm
Fluorescence
366 nm
Godin
Rutine
Ac gallique
Ac tannique
Querctine
Catchine
0.60
0.83
0.87
0.93
0.95
-
-
-
-
-
Brun
Bleu clair
Bleu
Brun
Bleu clair
Jaune fonc
Rose clair
Rose clair
Jaune marron
Rose fonc
MeOH (Tv)
MeOH
1
MeOH
2
MeOH
3
MeOH
4
MeOH
5
MeOH
6
MeOH
7
0.14
0.42
0.54
0.60
0.68
0.81
0.93
-
-
-
-
-
Visible
-
-
Bleutre
-
Bleutre
Bleutre
Vert clair
Orange
Marron sombre
-
Violet
-
-
-
Vert
MeOH (Ln)
MeOH
1
MeOH
2
MeOH
3
0.54
0.68
0.95
Visible
Visible
Visible
Bleutre
Orange
Brun
-
-
Orange
La CCM nous a permis de contrler la qualit de nos diffrents extraits, mme si elle nest pas
suffisante pour identifier un constituant prcis, elle nous a permis dobtenir des renseignements
utiles sur les lments constitutifs de nos extraits (fluorescence, coloration, facteur de
rtention...).
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54
Fig. 25 : Photos des chromatogrammes rsultant de lanalyse des extraits
bruts apolaires par CCM (dans le systme solvant :
Ether de ptrole - Actate dthyle80 : 20).
Fig. 26 : Photos des chromatogrammes rsultant de lanalyse des extraits
Bruts MeOH par CCM (dans le systme solvant : BAW 60 : 15 : 25).
II.3.1.3. Rsultats de caractrisation par HPLC
Les rsultats de l'analyse HPLC-RP-C18 des extraits de feuilles des deux plantes aromatiques
sont prsents dans le tableau 11. Les chromatogrammes de cette analyse HPLC sont prsents
dans les fig. 27 et 28. Comme peut tre observ (suivant le nombre de pics sur les
chromatogrammes), Les extraits apolaires (EP et DCM) sont plus riches en substances chimiques
que les extraits polaires (MeOH et Aq) et cela confirme les rsultats obtenus par CCM.
Six composs phnoliques purs (Ac gallique, Ac tannique, Ac cafique, catchine, rutine,
querctine) ont t utiliss dans lanalyse HPLC comme tmoins. Leurs chromatogrammes sont
reprsents dans la fig. 44 (Annexe) et leurs temps de rtentions (Tr) dans le tableau ci-suivant.
a : chromatogramme photographi aprs rvlation avec le ractif de Godin.
b : chromatogramme photographi sous lampe UV 366 nm.
c : chromatogramme photographi sous lampe UV 254 nm.
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55
Tableau 10 : Temps de rtention des diffrents tmoins polyphnoliques
obtenus par la sparation avec HPLC
Standards Tr (min)
Ac gallique 1.67
Ac tannique 1.64
Ac cafique 1.96
Catchine 1.77
Rutine 3.37
Querctine 6.74
Tableau 11 : Rsultats de lHPLC des diffrents extraits de feuilles
de Thymus vulgaris et Laurus nobilis
LHPLC a permis didentifier cinq polyphnols dans les extraits de feuilles de Thymus
vulgaris parmi les six tudis, savoir : lAc gallique dans lextrait EP, lAc cafique et la
querctine dans lextrait DCM, la rutine dans lextrait MeOH et la catchine dans lextrait Aq.
De nombreuses tudes se sont intresses lidentification des composs polyphnoliques
dans les extraits de Thymus vulgaris par analyse HPLC (Morimitsu et al., 1995 ; Guilln et
Manzanos, 1998 ; Kuliic et al., 2006) (voir la partie bibliographique). Ces tudes ne sont pas
tout--fait en accord les un aux autres et de mme nos rsultats. Thymus vulgaris est une plante
mdicinale active, elle reprsente un polymorphisme chimique remarquable. Dans la mme
espce, le contenu biochimique de ces extraits diffrents de manire significative selon o et
dans quelles conditions la plante a fait sa croissance. La prsence et la concentration de certains
constituants chimiques fluctuent galement selon la saison et la maturation de la plante (Amiot,
2005).
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56
Deux polyphnols seulement ont t identifis dans les extraits polaires de Laurus nobilis,
savoir : lAc tannique dans les extraits MeOH et Aq et la rutine dans lextrait Aq. Alors
quaucun des six polyphnols tudi na t identifi dans les extraits apolaires. Trs peu de
recherches se sont intresses aux flavonodes des feuilles de Laurus nobilis. Kivak et Mert
(2002) ont pu identifier des flavonodes polaires (drives glycosyles de querctine, kaempferol
et de catchine) et apolaires (quatre drivs acyls de kaempferol).
Ces rsultats ne correspondent pas ceux trouv pour la CCM, sauf celui de la rutine
identifie dans lextrait MeOH de Thymus vulgaris. Cela confirme que la CCM est insuffisante
pour identifier un constituant prcis, mais elle permet de donn des informations globale sur nos
extraits.
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57
Fig. 27 : Chromatogrammes dHPLC des extraits de Thymus vulgaris organiss selon leur
polarit croissante [(A) : EP ; (B) : DCM ; (C) : MeOH ; (D) : Aq].
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58
Fig. 28 : Chromatogrammes dHPLC des extraits de Laurus nobilis
organiss selon leur polarit croissante.
II.3.2. Rsultats de lanalyse quantitative
II.3.2.1. Dosage des polyphnols totaux et des flavonodes
Ltude quantitative des extraits bruts, prpars partir des feuilles de Thymus vulgaris et
Laurus nobilis, au moyen des dosages spectrophotomtriques avaient pour objectif la
dtermination de la teneur des polyphnols totaux et des flavonodes. La raison principale pour le
choix de ces substances rside dans le fait que la majorit des effets pharmacologiques des
plantes leur sont attribus. Deux droites dtalonnages (fig. 29 et 30) ont t traces pour cette
objectif qui sont ralises avec des solutions dtalons diffrentes concentrations.
Les quantits des polyphnols et des flavonodes correspondantes ont t rapportes en
microgramme dquivalents de ltalon utilis par milligramme dextrait (g EE/mg dextrait) et
dtermins par lquation de type : y = a x +b.
Le dosage des polyphnols totaux a t effectu selon la mthode au ractif de Folin
Ciocalteu (Singleton et al., 1999). Lacide gallique a t utilis comme talon (Fig. 29). Le
dosage des flavonodes a t ralis selon la mthode au trichlorure daluminium (Yi et al., 2007)
et ltalon t la querctine (Fig. 30). Les rsultats sont reprsents dans le tableau 12.
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Tableau 12 : Teneurs en polyphnols totaux et en flavonodes dans
les extrais des feuilles de Thymus vulgaris et Laurus nobilis.
Plante
Extrait
Teneur en
polyphnols
Teneur en
flavonodes
Thymus
vulgaris
EP
DCM
MeOH
Aq
79.27 6.05
218.09 38.37
165.45 32.14
67.63 5.73
9.83 1.03
14.60 3.14
7.68 0.86
1.20 0.07
Laurus
nobilis
EP
DCM
MeOH
Aq
33.18 0.65
40.63 3.02
166.81 8.69
129.09 7.50
0.77 0.13
14.45 4.15
4.75 0.21
0.14 0.02
Les valeurs reprsentent la moyenne de 2 3 mesures SD.
Suivant le tableau ci dessus, les teneurs en polyphnols enregistrs en quivalent dacide
gallique en g par mg dextrait, montre des proportions allant de 6.7 21.8 % de poudre de
Thymus vulgaris et de 3.3 16.6 % de poudre de Laurus nobilis.
Concernant la teneur en flavonodes, les rsultats sont exprims en quivalent querctine en
g par mg dextrait et les proportions vont de 0.1 1.4 % pour les extraits de Thymus vulgaris et
de 0.0 1.4 % pour les extraits de Laurus nobilis.
Fig. 29 : Droite dtalonnage des flavonodes (moyenne SD de trois mesures).
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60
Fig. 30 : Droite dtalonnage des polyphnoles (moyenne SD de trois mesures).
Lextrait DCM de Thymus vulgaris reprsente la teneur la plus lev en polyphnols, ce
rsultat confirme la grande richesse des feuilles de Thymus vulgaris en substances
polyphnoliques. Lextrait EP de Laurus nobilis reprsente la fraction la plus pauvre en
polyphnols avec 3.3 %. Alors quen contenu flavonodique, lextrait DCM de Thymus vulgaris
ainsi que celui de Laurus nobilis ont les teneurs les plus importantes. Les teneurs les plus basses
ont t obtenues avec lextrait aqueux de Laurus nobilis avec une proportion de 0.01%.
Kuliic et ses collaborateurs (2006) ont dtermin, par des mthodes spectrophotomtriques,
le contenu en polyphnols totaux et en flavonodes dans linfusion aqueuse prpare des feuilles
de thymus vulgaris. La teneur en polyphnols dans cette extrait est de 33.3 g EAG/mg dextrait,
la comparaison entre la teneur en polyphnols trouve dans le macr aqueux des feuilles de
thymus vulgaris (prsente tude) et celle de linfusion aqueuse des feuilles de la mme plante
tudie par Kuliic et ses collaborateurs nous a permis de dduire que la teneur en polyphnols
dans notre extrait est deux fois plus lev. Cet extrait est, en outre, plus pauvre en flavonodes
en comparaison linfusion aqueuse tudie par Kuliic et ses collaborateurs qui est de 25.0 g
EAG/mg dextrait. Il est important de souligner que lutilisation de plante dorigine
gographique et climatique distinctes ainsi que des mthodes dextraction et de dosage
diffrentes rduisent la fiabilit dune comparaison entre les deux tudes.
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II.4. Rsultats des tests des effets biologiques
II.4.1. Rsultats du test du pouvoir antimicrobien
II.4.1.1. Rsultats de lactivit antimicrobienne teste par la mthode de diffusion
partir dun disque solide
a. Sensibilit aux antibiotiques : antibiogramme
Lantibiogramme consiste rechercher la sensibilit des souches vis--vis des antibiotiques.
Le tableau ci-dessous reporte les valeurs en mm des zones dinhibitions atteintes avec les
diffrentes souches tudies.
Tableau 13 : Antibiogramme des germes tudis en prsence des diffrents
Antibiotiques (diamtre de la zone dinhibition en mm)
AMP CTX OFX TE SP
S. aureus ATCC
25923
25.08 0.90 36.65 0.58 37.33 1.12 14.33 0.00 12.67 0.15
S. aureus 8.0 0.10 33.00 0.86 22.11 3.46 12.05 0.05 12.00 0.00
E. coli
ATCC 25922
21.67 0.21 26.32 0.75 33.00 0.28 14.0 0.28 9.5 0.50
E. coli 7.0 0.00 22.00 0.29 21. 00 0.00 8.0 0.10 10.0 0.00
P. aeruginosa
ATCC 27853
6.33 0.57 20.43 0.11 18.5 0.00 7.5 0.86 7.33 0.10
P. aeruginosa 0 0.00 0 0.00 16.83 0.50 0 0.00 6.5 1.46
S. typhimirium 10.75 0.50 24 1.00 29.76 0.58 9.5 0.00 10.33 0.57
On observe que les diffrentes souches de bactries tudies ragissent diffremment aux
antibiotiques tests, mme sil sagit de deux souches dune mme espce bactrienne (exemple :
S. aureus ATCC 25923 et S. aureus clinique) ce qui montre le caractre mutagne de ces souches
qui leur permet dacqurir la rsistance aux antibiotiques. Parmi les souches tudies les
Pseudomonas se rvlent multirsistantes.
Fig. 31 : Activit de la nystatine sur la levure C. albicans ATCC 2071.
ATB
Souches
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62
Concernant la levure C. albicans, un seul antifongique (nystatine = Mycostatine) a t utilis
et la zone moyenne dinhibition est de 16.09 1.15 mm (fig. 31).
a. Sensibilit aux extraits bruts des plantes : test dinhibition
Les rsultats du test de sensibilit microbienne aux extraits (antibioaromatogrammes) sont
regroups dans le tableau 14. Les valeurs indiques sont les moyennes de deux mesures.
Laction bactriostatique se traduit par lapparition dune zone dinhibition autour du disque de
papier imprgn dextrait brut tudie. Le diamtre de la zone dinhibition diffre dune bactrie
une autre et dun extrait un autre. Comme cela a t rapport dans la littrature, nous avons
considr quun extrait a une action bactriostatique si son diamtre dinhibition est suprieur
12 mm (Sada, 2003).
Tous les extraits ont ragi positivement au moins sur une des souches microbiennes testes.
On remarque aussi que la plante Thymus vulgaris est doue de proprits antimicrobiennes trs
apprcies et cela justifie son utilisation dans le traitement traditionnelle comme un remde
antibactrien. En plus, la plante Laurus nobilis montre aussi une certains activit inhibitrice de
la croissance microbienne mais moins intressante.
Fig. 32 : Effet inhibiteur dose dpendant de nos extraits.
Le tableau 14 ainsi que la fig. 32 montrent clairement la diminution du diamtre des zones
dinhibition correspondant une diminution de la concentration de lextrait applique (1 g/ml,
0.5 g/ml et 0.25 g/ ml). On observe aussi de larges carts dans les diamtres des zones
dinhibitions obtenues, allant de 7 mm 64 mm.
Lactivit antimicrobienne des extraits de plantes est due aux diffrents agents chimiques
prsents dans ces extraits, y compris les huiles essentielles (en particulier thymol et carvacrol),
1 : 1 g/ml ; 2 : 0,5 g/ml ; 3 : 0,25 g/ml ; 4 : 0.125 g/ml ; 5 : 0.0625 g/ml.
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63
les flavonode et les triterpnodes ainsi que dautres composs de nature phnolique ou groupes
hydroxyle libres, qui sont classifis comme composs antibiotiques trs actifs (Rojas et al. 1992 ;
Marjorie, 1999). La variation de la composition chimique explique donc les variations observes
dans lactivit antimicrobienne des extraits dune mme plante ou de plantes diffrentes.
Lefficacit optimale dun extrait peut ne pas tre due un constituant actif principal, mais
laction combine (synergie) de diffrents composs lorigine de cet extrait (Essawi et Srour,
2000). Pour cela, la comparaison cas par cas de lactivit antimicrobienne de plusieurs extraits,
en se basant sur le dosage dun seul constituant actif (flavonodes dans notre cas), nous semble
inutile.
Nos extrais ont t tous trouv contenir une quantit de flavonode plus ou moins importante,
donc on peut dire que lactivit antimicrobienne de ces extraits est due, au moins partiellement,
la prsence de se type de composs chimiques actifs dans leur composition, surtout pour les
extraits polaires (MeOH et Aq).
Les extraits EP (apolaires) des deux plantes, malgr leurs teneurs trs faibles en flavonodes,
ils montrent une activit antimicrobienne remarquable (tableau 14). L'importante action
antimicrobienne dmontre par lextrait EP de Thymus vulgaris est en relation avec sa teneur
leve en huile essentielle qui contient un compos phnolique majoritaire thymol (51.25 %) et
un autre minoritaire carvacrol (3.3 %). Ces deux derniers sont rputs avoir une trs grande
action antimicrobienne (Ettayebi et al., 2000 ; Ultee et al., 2000 ; Friedman et al., 2002 ; Chun et
al., 2005), il cause la perforation de la membrane bactrienne et le flux rapide des composants
cytosoliques (Thuille et al., 2003 ; Shunying et al., 2005).
Lextrait EP de Thymus vulgaris est plus actif que celui de la plante Laurus nobilis, parce que
lhuile essentielle de cette dernire dont les constituants majoritaires inclut des alcools (cinol,
linalol, eugnol) est reconnus mois actif que celle de Thymus vulgaris (dont les constituants
principales : thymol et carvacrol) (Burt, 2004).
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Tableau 14 : Diamtre des zones dinhibition de la croissance microbienne par les diffrents extraits bruts tudies (en mm)
Les plantes Les extraits
Les
dilutions
(g/ml)
S. aureus
S. aureus
ATCC
25923
E. coli
E. coli
ATCC
25922
P.
Aeruginosa
P.
Aeruginosa
ATCC
27853
S.
typhimirium
C. Albicans
ATCC 2071
Thymus
vulgaris L
EP
42.19 1.57***
32.27 1.33
31.60 0.64
45.90 1.69***
39.07 1.50
33.14 0.87
33.64 1.08***
30.56 0.76
26.61 0.63
42.54 1.54***
36.68 0.96
32.03 0.66
15.72 0.43***
13.09 0.26
12.26 0.23
23.64 0.48***
20.56 0.36
16.61 0.33
32.10 0.56***
25.09 0.31
19.58 0.14
64.12 1.85***
34.90 0.96
29.26 0.27
DCM
37.65 1.27***
28.83 0.45
20.70 0.11
39.08 1.43***
36.56 1.07
23.38 0.40
28.30 0.36***
25.07 0.28
21.85 0.21
36.18 0.84***
32.67 0.69
12.34 026
14.65 0.50***
11.83 0.16
9.59 0.07
19.55 0.56***
16.45 0.43
13.00 0.13
28.79 0.76***
24.53 0.60
09.37 0.06
63.94 1.89***
32.30 0.65
27.23 0.36
MeOH
nd
38.05 0.88***
35.35 1.00
27.80 0.20
nd
34.35 1.21***
31.55 1.00
24.8 0.67
19.29 0.41***
15.83 0.26
15.55 0.17
nd
25.90 0.56***
19.92 0.37
09.07 0.11
00.00 0.00
00.00 0.00
00.00 0.00
Aq
nd
15.73 0.50***
13.70 0.46
13.26 0.41
00.00 0.00
00.00 0.00
00.00 0.00
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00.00 0.00
00.00 0.00
Laurus
nobilis L
EP
13.19 0.26
ns
12.08 0.16
11.26 0.05
16.14 0.69
ns
12.09 0.28
10.56 0.07
00.00 0.00
00.00 0.00
00.00 0.00
07.50 0.09 *
06.89 0.11
00.00 0.07
00.00 0.00
00.00 0.00
00.00 0.00
00.00 0.00
00.00 0.00
00.00 0.00
00.00 0.00
00.00 0.00
00.00 0.00
14.48 0.57
ns
09.82 0.41
09.17 0.06
DCM
17.24 0.33
ns
15.76 0.31
11.52 0.16
nd
12.41 0.39
ns
10.31 0.52
08.59 0.24
09.96 0.16
ns
08.70 0.18
07.46 0.05
00.00 0.00
00.00 0.00
00.00 0.00
09.36 0.16
ns
09.30 0.18
07.01 0.07
00.00 0.00
00.00 0.00
00.00 0.00
16.40 0. 33
ns
10.36 0.16
07.89 0.07
MeOH
21.15 0.50
ns
18.16 0.18
16.35 0.00
nd
11.64 0.45
ns
09.52 0.16
08.77 0.12
00.00 0.00
00.00 0.00
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00.00 0.00
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00.00 0.00
00.00 0.00
00.00 0.00
00.00 0.00
Aq
nd
16.50 0.00
ns
12.70 0.45
07.80 0.50
08.00 0.19
ns
06.15 0.02
00.00 0.00
00.00 0.00
00.00 0.00
00.00 0.00
00.00 0.00
00.00 0.00
00.00 0.00
00.00 0.00
00.00 0.00
00.00 0.00
00.00 0.00
00.00 0.00
00.00 0.00
00.00 0.00
00.00 0.00
00.00 0.00
1:1
1:2
1:4
1:1
1:2
1:4
1:1
1:2
1:4
1:1
1:2
1:4
1:1
1:2
1:4
1:1
1:2
1:4
1:1
1:2
1:4
1:1
1:2
1:4
nd : zone non dterminer.
Les comparaisons sont effectues entre le diamtre de la zone dinhibition de lantibiotique le plus actif pour chaque souche et celui obtenus par la concentration 1 : 1
(1g/ml) de chaque extrait brut. *** p0.001, **0.05, * 0.01, ns : non significatif.
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65
Les teneurs en flavonodes dans les extraits DCM des deux plantes tudies sont trs proches
(tableau 12), cependant, lactivit antimicrobienne de lextrait DCM de Thymus vulgaris est plus
importante. Cela peut tre explique par le fait que cet extrait peut contenir des traces de thymol
(puisque cest un extrait moyennement polaire) ou il contient en plus des flavonodes dautres
composs activit antimicrobienne.
Le tableau 13 montre que les diffrents antibiotiques possdent des effets distincts sur les
bactries testes. Ces effets sont significativement infrieur (P0.001) ceux des extraits EP et
DCM de Thymus vulgaris. Ces rsultats sont trs intressants puisquelles tmoignent dune trs
forte activit bactriostatique des extraits apolaires de Thymus vulgaris. Ces extraits agissent de
faon trs active sur lensemble des souches testes. Dans le cas de Candida albicans, levure
responsable de mycoses chez l'homme, les rsultats sont spectaculaires, il est vident que
Candida albicans est la plus sensible aux extraits EP et DCM de Thymus vulgaris. En revanche,
aucune activit anticandidosique (sur Candida albicans) na t observe avec les extraits
polaires (MeOH et Aq) des deux plantes.
Par ailleurs, nos rsultats montrent donc une grande variabilit des qualits bactriostatiques
des extraits vis--vis des diffrentes souches. Les deux souches de Staphylococcus aureus gram
positif sont plus sensibles que les autres souches bactriennes testes gram ngatif. La
rsistance de ces dernires nest pas surprenante, en fait, ces bactries possdent une rsistance
intrinsque aux agents biocides qui est en relation avec la nature de leurs membranes externes
composes de lipopolysaccharides qui forment une barrire impermable aux composs
hydrophobes. En prsence dagents permabilisants de la membrane externe, des substances
inactives contre ces bactries deviennent actives.
Les souches de Pseudomonas aeruginosa se rvlent les plus rsistantes, cela est lie sa
grande capacit de dvelopper des rsistances vis--vis de nombreux agents antimicrobiens, do
son implication frquente dans les infections hospitalires (Mann et al., 2000). Plusieurs auteurs
rapportent la faible sensibilit des souches de Pseudomonas aeruginosa vis--vis de lhuile
essentielle de Thymus vulgaris (Thuille et al., 2003 ; Bouhdid et al. 2006).
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66
Fig. 33 : Exemples de leffet des extraits de feuilles
de Thymus vulgaris sur la croissance microbienne.
Fig. 34 : Exemples de leffet des extraits de feuilles
de Laurus nobilis sur la croissance microbienne.
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67
Plusieurs tudes ont eu pour objet la dtermination du pouvoir antimicrobien de certaines
extraits de Thymus vulgaris, on cite celles de Tabak et ses assistants (1996), Ettayebi et ses
collaborateurs (2000), Thuille et autres (2003), Bouhdid et collgues (2006) et plusieurs autres
qui ont tous rvl une importante activit de ces extraits surtout les huiles essentielles. Nos
rsultats confirment ces travaux car les extraits de Thymus vulgaris sont les plus actifs sur
presque toutes les souches testes.
Par ailleurs, nous avons compar nos rsultats obtenus avec lextrait EP (extrait apolaire) de
Thymus vulgaris avec ceux de Bouhdid et ses collaborateurs (2006), qui ont tudi le pouvoir
antimicrobien de lhuile essentielle de Thymus vulgaris chmotypes thymol (36.58 %), sur
plusieurs souches, notamment P. aeruginosa, E. coli, et S. aureus ; ils ont obtenu les rsultats
suivants : 8.0 mm, 20.0 mm et 22.0 mm respectivement. Nos rsultats sont beaucoup plus levs
par rapport ces dernirs, cela est d plusieurs raison, premirement, leurs souches sont peut
tre plus rsistantes que les ntres ; deuximement, au fait que les chantillons de plante
(Thymus vulgaris) utiliss sont dorigin gographiques diffrentes, ce qui fait intervenir le
phnomne de polymorphisme chimique ; enfin, ces chercheurs ont utilis comme extrait lhuile
essentielle pure alors que notre extrait (EP) contient en plus de lhuile essentielle dautres
composs chimiques activit antimicrobienne (surtout les flavonodes apolaires) qui travaille
en synergie au sein de lextrait.
Nos rsultats obtenus avec les extraits polaires (MeOH et AQ) de Thymus vulgaris ont t
compar avec ceux de Essawi et Srour (2000), ces deux savants ont tudi lactivit
antibactrienne des extraits alcoolique et aqueux de Thymus vulgaris. Nous avons obtenu des
rsultats trs proches pour lextrait aqueux : S. aureus (13.5 mm), E. coli (0.0 mm), E. coli ATCC
(0.0 mm) et P. aeruginosa ATCC (0.0 mm) ; en revanche, ils ont enregistr une faible activit par
rapport nos rsultats pour lextrait alcoolique : S. aureus (26.0 mm), E. coli (18.5 mm), E. coli
ATCC (0.0 mm) et P. aeruginosa ATCC (0.0 mm), cela est d au fait que nous avons utilis des
mthodes dextraction diffrentes en plus des deux premires raisons cit ci-dessus.
Cependant, trs peu de recherches se sont intresses ltude de lactivit antimicrobienne
de Laurus nobilis. Une seule a t trouve en littrature ce sujet ralis par Atanda et ces
collgues (2007). Ils ont valu le potentiel de control des myctes aflatoxinogniques
(Aspergillus parasiticus CFR 223) et de la production daflatoxine par lhuile des feuilles de
laurier. Cette dernire a stimul in vitro la croissance des mycliums du mycte mais a rduit la
concentration de son aflatoxine de 55.21%.
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La sensibilit des souches mdicales, mme celles multi-rsistantes aux antibiotiques (P.
aeruginosa, tableau 13), aux extraits DCM et EP de Thymus vulgaris suggre leur possible
utilisation en thrapeutique comme alternative naturelle aux agents chimiothrapeutiques dont le
spectre daction est en rduction continue.
II.4.1.2. Rsultats de lactivit antimicrobienne teste par la mthode de microdilution
en milieu solide
Nous rapportons dans le tableau 15 les concentrations minimales inhibitrices (CMI) de nos
extraits les plus actifs constats lors de ltude en milieu solide, dont les diamtres dinhibition
sont 20 mm (choix arbitraire), qui sont obtenues par la mthode de microdilution en milieu
glos. Les CMI sont inversement proportionnelles aux diamtres des zones dinhibition,
obtenus avec la mthode de lantibioaromatogramme.
Tableau 15 : Concentrations minimales inhibitrices (CMI exprime en g/ml) des diffrents
extraits (dont les diamtres des zones dinhibitions sont 20mm) relatives aux bactries testes
Plante
S. aureus
S. aureus
ATCC
25923
E. coli
E. coli
ATCC
25922
S.
typhimirium
C. Albicans
ATCC 2071
Thymus
vulgaris
EP 156 156 2 500 156 2 500 < 10
DCM 312 312 5 000 625 5 000 39
MeOH
-
312
-
2 500 5 000
-
Laurus
nobilis
MeOH > 5 000 > 5 000
- - - -
Aligiannis et ses collaborateurs (2001) ont proposs une classification des extraits du matriel
vgtal sur la base des rsultats des CMI, comme suit : forte inhibition : CMI infrieure 500
g/ml ; inhibition modre : CMI varie de 600 g/ml 1 500 g/ml ; faible inhibition : CMI
suprieure 1 600 g/ml. Ainsi, selon cette classification, on constate une trs forte inhibition
avec lextrait EP de Thymus vulgaris sur les souches suivantes : C. Albicans, S. aureus, S. aureus
ATCC 25923 et E. coli respectivement, alors que lextrait DCM de la mme espce est trs
active sur la levure C. Albicans et les deux souches de staphylocoques.
Par ailleurs, lextrait MeOH de Laurus nobilis inhibe les staphylocoques (les bactries les plus
sensibles) des CMI nettement suprieurs celles obtenues avec les autres extraits de Thymus
vulgaris, CMI > 5 000 g/ml, donc possde la plus faible inhibition par rapport ces dernier.
Extraits
Souches
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Globalement lactivit antimicrobienne de Thymus vulgaris est plus importante que celle de
Laurus nobilis avec un spectre antimicrobien plus large et des doses plus faibles.
Nous avons compar nos rsultats avec ceux de Thuille et ses collaborateurs (2003), qui ont
dtermin les CMI dextrait mthanolique de Thymus vulgaris sur sept souches microbiennes,
notamment : S. aureus ATCC (2 500 g/ml), E. coli ATCC (> 5 000 g/ml). Ils ont enregistr
une faible activit par rapport nos souches.
II.4.2. Rsultat du test du pouvoir antioxydant
L'activit antioxydante in vitro de nos extraits a t value par deux mthodes diffrentes : la
technique de dcoloration de la -carotne et le test de DPPH.
II.4.2.1. Mthode de blanchissement de la -carotne (BCB)
Laptitude de nos extraits bruts inhiber la peroxydation des lipides a t value par la
technique de dcoloration de la -carotne, cette dernire est habituellement employe pour
estimer lactivit antioxydante des substances dans les mulsions, accompagne de l'oxydation
couple de la -carotne et de lacide linolique. Cette analyse n'a pas pu tre excute avec
l'extrait DCM d une couleur verte sombre et au prcipit form avec cet extrait des deux
plantes tudies.
Pour se renseigner sur la puissance de nos extraits ralentir la vitesse de loxydation des
lipides, nous avons ralis un suivi de la raction de loxydation de lacide linolique par mesure
de labaissement de labsorbance dans le temps, ce qui est bien montr dans les fig. 35 et 36. On
a remarqu exprimentalement, que labsorbance du mlange diminue vers une valeur plus
basse, mais cette diminution reste moins rapide par rapport celle de la solution control (-), et
devient stable dans un laps de temps assez prolong pour les mlanges qui contient un extrait
apolaire, ainsi la solution change de couleur instantanment du jaune au blanc. Ce qui nest pas
le cas avec un mlange qui contient un extrait polaire o la raction de loxydation se produit
dans un intervalle de temps plus court.
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Fig. 35 : Cintique de linhibition du blanchissement de la -carotne
par 250 g/ml des extraits des feuilles de Thymus vulgaris.
Fig. 36 : Cintique de linhibition du blanchissement de la -carotne
par 250 g/ml des extraits des feuilles de Laurus nobilis.
Le tableau 16 rapporte les valeurs moyennes de trois mesures dAAR% (coefficients
d'activit anti-radicalaire) SD calcules partir de la formule donne dans la partie matriel et
mthode, ces valeurs facilitent des comparaisons de l'activit relative des diffrents extraits, du
contrle positif (BHT) et du contrle ngatif.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 10 20 30 40 50 60
EP
M et
AQ
Cont r ol -
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
EP
M et
AQ
Cont r ol -
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Tableau 16 : Le pouvoir anti-radicalaire des extraits
bruts et du control positif
Extraits et Control AAR%
EP (Tv)
53.60 0.88***
MeOH (Tv)
38.40 1.28***
Aq (Tv)
34.20 3.30***
EP (Ln) 56.48 1,49***
MeOH (Ln) 37.03 0,92***
Aq (Ln) 34.02 0,92***
Control + (BHT) 99.10 0,60
ns
Control - 16.69 1,28***
Les valeurs sont une moyenne de trios mesures SD. Les comparaisons sont effectues entre lAAR% du control
+ (BHT) et celui des extraits bruts. *** p0.001, ns : non significatif.
Les rsultats montrent que loxydation de lacide linolique est efficacement inhibe par les
extraits tests. En effet, la capacit anti-radicalaire la plus leve est trouve pour les extraits EP
de Laurus nobilis et de Thymus vulgaris avec 56.48 et 53.60% dinhibition respectivement, une
activit qui reste significativement infrieure celle du BHT (99.10%, 0.001). Les autres
extraits montrent des activits voisines mineures.
Les extraits EP sont des fractions assez complexes dans leur composition et peuvent contenir
diffrents composs agissant indpendamment ou en synergie. Ces deux extraits forment une
bonne source dantioxydants vu que leur capacit dinhiber loxydation de lacide linolique
nest pas trs loin de celle du BHT, lun des antioxydants majeurs.
Les extraits polaires sont surtout riches en substances chimiques hydrosolubles, leur activit
antioxydante dmontre par cette mthode (BCB), peu quelle soit, est peut tre due surtout la
prsence des composs flavonodes prsents dans ces extrait, ce qui est confirm par la
corrlation linaire notable et significative observe (r=0.9827, p<0.01) entre leur teneur en
flavonodes et leur pouvoir antioxydant (fig. 37)
.
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Fig. 37 : Courbe de corrlation entre lactivit antioxydante
des extraits polaires et leur teneur en flavonodes.
Lactivit antioxydante exprime comme des valeurs d'AAR% diminues dans lordre
BHT > EP (Ln) > EP (Tv) > MeOH (Tv) > MeOH (Ln) > Aq (Tv) > Aq (Ln).
Kulic et ses collaborateurs (2006) ont trouv que malgr le fait que lacide ascorbique,
comme substance polaire, est un antioxydant bien connu, son activit antioxydante n'a pas t
avre par cette mthode.
Ceci peut tre expliqu par un phnomne nonc comme " paradoxe polaire " comme il est
dcrit par Frankel et ses collaborateurs (1994). Etant donn que le test de blanchissement de la -
carotne est similaire un systme dmulsion des lipides dans leau, Frankel et Meyer (2000)
ont propos que les antioxydants apolaires exposent des proprits antioxydantes plus
importantes car ils sont concentrs au sein de l'interface lipide-eau, permettant ainsi de prvenir
la formation de radicaux lipidiques et loxydation de la -carotne. Alors que les antioxydants
polaires restent dilus dans la phase aqueuse et sont ainsi moins efficaces dans la protection des
lipides.
Un extrait qui retarde ou inhibe le blanchissement du -carotne peut tre dcrit comme un
pigeur de radicaux libres et comme un antioxydant secondaire (Liyana-Pathirana et al., 2006).
Selon plusieurs auteurs, le test dinhibition de loxydation de lacide linolique couple celle
du -carotne, parait trs utile comme un modle mimtique de la peroxydation des lipides dans
les membranes biologiques (Ferreria et al., 2006).
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D'une faon gnrale, le comportement antioxydant des composs dans les mulsions n'a pas
encore t compltement expliqu (Schwarz, 2000). Les extraits bruts de notre tude, quon a
obtenus a partir des deux plantes Thymus vulgaris et Laurus nobilis, reprsentent un mlange de
composs diffrents, principalement apolaire pour les deux extraits EP et DCM et polaire pour
extraits MeOH et Aq, qui complique l'explication dtaille de leur activit antioxydante par cette
mthode.
II.4.2.2. Mthode de rduction du radical libre DPPH
a. Test anti-radicalaire contre le DPPH sur plaques CCM
Aprs rvlation par le DPPH, les extraits bruts et les tmoins (Rutine, Querctine, Acide
gallique et la Catchine), ont montr des zones dactivits franches contre le DPPH de couleur
jaune blanche sur un fond violet.
Les chromatogrammes des diffrents extraits apolaires rvls par une solution de DPPH,
prsentent quelques constituants activit anti-radicalaire qui apparaissent sous forme de spots
de couleur Jaune blanc sur fond violet. Ces constituants, capables de rduire le radical DPPH
oxydant, donnent des indications intressantes pour une activit anti-radicalaire des extraits. La
plus forte activit a t observe avec l'extrait DCM de Thymus vulgaris.
.
Fig. 38 : Rsultats du test antioxydant des extraits apolaires de Thymus vulgaris (a)
et Laurus nobilis (b) sur CCM aprs rvlation au DPPH.
1 : Extrait EP, 2 : Extrait DCM.
Lextrait MeOH des feuilles de Laurus nobilis a prsent la meilleure activit anti-radicalaire
avec une tche massive tendue le long du trajet de llution (Fig. 39) Ce rsultat tmoigne de sa
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richesse en substances chimiques hydrosolubles haute activit anti-radicalaire, cette activit peut
tre due surtout la prsence de composs polyphnoliques prsents en teneurs leve dans cet
extrait (tableau 12).
Lextrait MeOH de Thymus vulgaris montre aussi un pouvoir pigeur du radical DPPH
intressant mais moins important que celui de Laurus nobilis.
Fig. 39 : Rsultats du test antioxydant des extraits polaires de Thymus vulgaris (a)
et Laurus nobilis (b) sur CCM aprs rvlation au DPPH.
1 : Extrait MeOH, 2 : Rutine, 3 : Querctine, 4 : Acide gallique, 5 : Catchine, 6 : Extrait Aq.
Les chromatogrammes (Fig. 39) montrent galement la haute capacit de pigeage des
radicaux libres par les acides phnoliques (acide gallique) et les flavonodes (querctine, rutine,
catchine). Cependant, la diversit chimique des extraits MeOH de Thymus vulgaris et Laurus
nobilis inclut diffrents composs avec une capacit de donner un hydrogne ou un lectron.
Les extraits aqueux sont les moins actifs, avec des spots pas trs nets, surtout pour lextrait
Aq de Thymus vulgaris, cela cause de leurs teneurs faibles en composants actifs qui est peut
tre d la mthode dextraction (extraction par macration leau).
b. Test anti-radicalaire contre le DPPH mesur au spectrophotomtre
Contrairement la mthode de BCB, la mthode de DPPH est indpendante de la polarit de
substrat. Cette mthode est base sur la rduction dune solution alcoolique de DPPH en
prsence d'un antioxydant qui donne un hydrogne ou un lectron. la forme non radicalaire
DPPH-h est forme. Lvaluation de l'activit antioxydante des extraits bruts des plantes
aromatiques Thymus vulgaris et Laurus nobilis ont t fait en comparaison avec celle des
diffrents antioxydants : acide ascorbique, BHT, querctine et rutine (tableau 17).
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Tableau 17 : IC50 et puissance anti-radicalaire (APR)
des extraits bruts et des standards
Extraits et Standards IC
50
(g/ml) APR
EP (Tv) 88.00 2.876 0.01***
DCM (Tv) 43.19 1.149 0.02***
MeOH (Tv) 7.29 0.407 0.14***
Aq (Tv) 13.97 0.584 0.07***
EP (Ln) 94.44 5.502 0.01***
DCM (Ln) 189.42 8.591 0.005***
MeOH (Ln) 6.33 0.136 0.16***
Aq (Ln) 8.19 0.211 0.12***
Ac ascorbique 2.42 0.036 0.41***
BHT 6.18 0.412 0.16***
Querctine 0.50 0.011 2.00
ns
Rutine 1.08 0.112 0.93***
Les comparaisons sont effectues entre lAPR du standard le plus actif (Querctine) et celui des autre standards et
extraits bruts. *** p0.001, ns : non significatif.
Lactivit antioxydante de nos extraits est exprime en IC
50
(tableau 17), ce paramtre a t
employ par plusieurs groupes de chercheurs pour prsenter leurs rsultats, il dfini la
concentration efficace du substrat qui cause la perte de 50% de lactivit de DPPH (couleur). Ces
IC
50
sont dtermins graphiquement des deux tests spars, dont labscisse reprsente la
concentration de lextrait brut et lordonn lactivit antioxydante en pourcentage. La valeur de
chaque IC
50
exprime la concentration de lextrait exige pour rduire 50% de DPPH en solution.
Un autre paramtre exprime la puissance anti-radicalaire a t calcule partir du premier
paramtre not : "ARP" (pouvoir anti-radicalaire, gale 1/IC
50
). Les valeurs ARP de tous les
extraits sont significative. Plus ces valeurs ne tendent pas et sloignent du zro, plus la
puissance antioydante augmente. On peut dire que nos extraits prsentent une activit
antioxydante et que la capacit de piger le radical libre DPPH est puissante avec les
extraits polaires et modeste avec les extraits apolaires.
Comme figurant dans le tableau ci-dessus, la querctine est le pigeur du radical DPPH le
plus puissant parmi les quatre tmoins utiliss (suivez de la rutine), ce qui est confirm par la
bibliographie que les flavonodes sont des capteurs puissants de radicaux (Fuhrman et al., 1995 ;
Rice-Evans et ses collaborateurs 1996 ; Jovanovic et al., 1998 ).
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Tous les IC
50
sont trs basses, comprises entre 6 et 13 g/ml. Suivant ce paramtre, les
capacits de pigeage du radical sont classes dans lordre :
Querctine > Rutine > Ac ascorbique > BHT > MeOH (Ln) > MeOH (Tv) > Aq (Ln) > Aq (Tv) >
DCM (Tv) > EP (Tv) > EP (Ln) > DCM (Ln).
Nos extraits polaires surtout MeOH possdent des capacits de neutralisation du radical libre
DPPH intressantes, puisquils agissent faible dose, mais reste significativement infrieur
celle des tmoins. la querctine est 12 14 fois plus active (p0.001), la rutine est 6 7 fois plus
active (p0.01) et lacide ascorbique est 2 3 fois plus actif (p0.05) alors que le BHT montre
une activit analogue celle des deux extraits MeOH (ils sont statistiquement similaires).
Ces rsultats sont en accord avec ceux obtenus par le test ralis sur les plaques CCM. Cette
action rductrice peut tre explique par la prsence de taux relativement levs de polyphnols
dans ces deux extraits. Une corrlation linaire remarquable et significative a t observe
(r=0.9601, p<0.05) entre la teneur en polyphnols dans les extraits MeOH
Ln
, MeOH
Tv
, Aq
Ln
et
Aq
Tv
(respectivement) et leur pouvoir pigeur du DPPH (fig. 40)
.
Fig. 40 : Courbe de corrlation entre lactivit anti-radicalaire
des extraits polaires et leur teneur en polyphnols.
Le profil dactivit anti-radicalaire de chaque extrait test vis--vis du radical DPPH est
prsent dans les figures ci-dessous (Fig. 41, 42 et 43). Le pourcentage du DPPH rduit par les
diffrents antioxydants mesurs 517 nm, montre une augmentation rapide de ce dernier dans un
intervalle trs rduit de la dose de lextrait brut.
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Fig. 41 : Activit antioxydante des diffrents extraits de Laurus nobilis.
Fig. 42 : Activit antioxydante des diffrents extraits de Thymus vulgaris.
Fig. 43 : Activit antioxydante des diffrents Standards.
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La capacit antioxydante de lextrait EP estime par la technique DPPH est trs faible, cet
extrait qui est un excellent antioxydant dans le test de BCB a faiblement ragit dans cet essai. La
raction chimique dans la technique DPPH implique un transfert dlectrons dun donneur
(antioxydant) vers le radical libre DPPH et la rduction de ce dernier en DPPH-h. Benzie et Strain
(1996) ont considr lantioxydant comme toute molcule capable de rduire les espces
oxydantes qui peuvent endommager les structures biologiques. Ces auteurs ont donc interprt
lactivit antioxydante comme la capacit rductrice. Cependant, le pouvoir antioxydant dun
antioxydant nest pas ncessairement gal sa capacit de rduire le DPPH.
Les activits anti-radicalaires et antioxydantes dhuile essentielle de Thymus vulgaris ont t
tests par Bouhdid et ses collaborateurs (2006), par la technique de dcoloration de la carotne
et le test du DPPH, le pouvoir antioxydant manifest a t interprt par une action combine des
diffrents antioxydants endognes contenus dans lhuile. Le thymol compos majeur de lhuile
essentielle aussi bien que le carvacrol, sont de puissants agents rducteurs du radical DPPH et
inhibent la peroxydation lipidique (Brunton, 1999).
Ltude mene par Kulic et ses collaborateurs (2006) a montr quaussi lextrait aqueux des
feuilles de Thymus vulgaris en prsente une activit antioxydante importante. Dans cette extrait,
les polyphnols (surtout les flavonodes), lacide rosmarinique, lacide cafique et la vitamine E
peuvent expliquer lactivit exhibe (Guilln et Manzanos, 1998 ; Thuille et al., 2003 ; Kulii et
al., 2006).
Lactivit antioxydante des extraits mthanolique (bruts et dgraisss) des feuilles, dcorce et
des fruits de Laurus nobilis ont t tudis au niveau de la peroxydation de lipide (LP) dans les
liposomes. Les rsultats ont montr que tous les extraits de recherche prsentes une activit
antioxydante. Lextrait dgraiss des feuilles montr une inhibition plus leve du LP que
lextrait brut et que tous les autres extraits et le maximum de son activit (68,4%) a t atteint
avec une plus petite quantit (2,0 mg) (Simi et al., 2003).
Ferreira et ses collages (2006) ont tudi lactivit antioxydante de trois extraits (huile
essentielle, extrait thanolique et dcoction) de Laurus nobilis, cet espce montre des valeurs
leves pour lactivit antioxydante en chacun des trois extraits et elle est plus haute pour les
extraits polaires. Dans le laurier lisoquercitrine, les glycosides flavonol et la vitamine E peuvent
expliquer lactivit dmontre (Demo et al. 1998 ; Kivak et Mert, 2002 ; Simi et al., 2003 ).
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Conclusion et
Perspectives
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CONCLUSION ET PERSPECTIVES
De nos jours, lutilisation des plantes mdicinales en phytothrapie a reu un grand intrt
dans la recherche biomdicale et devient aussi importante que la chimiothrapie. Ce regain
dintrt vient dune part du fait que les plantes mdicinales reprsentent une source inpuisable
de substances et de composs naturels bioactifs et dautre part du besoin de la recherche dune
meilleure mdication par une thrapie plus douce sans effets secondaires.
Les extraits naturels issus des plantes contiennent une varit de composs phnoliques et des
huiles essentielles auxquelles on attribue un pouvoir inhibiteur des microorganismes et des
capacits antioxydantes.
Dans le prsent travail, on sest intress aux effets antimicrobiens et antioxydants des extraits
bruts (EP, DCM, MeOH et Aq) de feuilles de Thymus vulgaris et Laurus nobilis, plantes
largement utilises en mdecine traditionnelle travers le monde.
La dtermination des rendements en extraits bruts a montr une rentabilit importante en
extraits polaires (MeOH et Aq) chez les deux espces de plantes allant de 6.24 21.94 %, alors
quelle saffaiblit en passant aux extraits apolaires (EP, DCM), lextrait EP de Thymus vulgaris a
le plus faible rendement avec 1.94 %.
La prsence des flavonodes dans nos extraits est mise en vidence par un essai de
caractrisation en tube qui est confirm par CCM et HPLC. Cette dernire a permis
lidentification de cinq composs phnoliques dans les feuilles de Thymus vulgaris, savoir :
lAc gallique, lAc cafique, la querctine, la rutine et la catchine. Deux polyphnols seulement
ont t identifis dans les feuilles de Laurus nobilis : lAc tannique et la rutine.
Les extraits bruts de Thymus vulgaris et Laurus nobilis ont t tests in vitro, par la mthode
de diffusion partir dun disque solide, pour leur pouvoir inhibiteur contre un ensemble de
bactries pathognes : trois souches de collection internationale, trois souches cliniques isols de
patient hospitaliss, une bactrie aviaire isole localement de poulets malades et une seule espce
de levure C. albicans ATCC 2071. Les extraits ont rvl des activits antimicrobiennes
variables contre les diffrentes souches microbiennes testes. Les extraits EP et DCM de thymus
vulgaris ont tmoign une forte activit antimicrobienne mme vis--vis de souches
multirsistantes aux antibiotiques (P. aeruginosa). Leur effet inhibiteur sur la levure C. albicans
t spectaculaire, il est beaucoup plus important que celui de la nystatine (antifongique). Nous
avons conclu dans cette tude que les extraits de Laurus nobilis possdent une capacit
antimicrobienne mais faible en comparaison avec les extraits de Thymus vulgaris.
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Laptitude de nos extraits bruts inhiber la peroxydation des lipides in vitro a t value par
la technique de dcoloration de la -carotne, habituellement employe pour estimer lactivit
antioxydante des substances dans les mulsions. Les rsultats montrent que loxydation de
lacide linolique est efficacement inhibe par les extraits tests. En effet, la capacit anti-
radicalaire la plus leve des extraits est dmontrs avec les extraits EP de Laurus nobilis et de
Thymus vulgaris avec 56.48 et 53.60% dinhibition respectivement. Lactivit antioxydante
exprime comme des valeurs d'AAR% diminue dans lordre EP (Ln) > EP (Tv) > MeOH (Tv) >
MeOH (Ln) > Aq (Tv) > Aq (Ln).
L'activit antioxydante in vitro est aussi tudie avec la mthode de rduction du radical libre
1,1-diphenyl-2-picryl-hydrasyl (DPPH), cette mthode est indpendante de la polarit de
substrat. Les extraits polaires surtout MeOH possdent des capacits de neutralisation du radical
libre DPPH puissantes, puisquils agissent de faibles doses. Tous les IC
50
sont trs basses,
comprises entre 6 et 13 g/ml. Suivant ce paramtre, les capacits de pigeage du radical sont
classes dans lordre :
MeOH (Ln) > MeOH (Tv) > Aq (Ln) > Aq (Tv) > DCM (Tv) > EP (Tv) > EP (Ln) > DCM (Ln).
Contrairement ce qui est montr par le test dactivit antimicrobienne les extraits de Laurus
nobilis possdent un pouvoir antioxydant plus important en comparaison avec les extraits de
Thymus vulgaris.
Nos rsultats prliminaires montrent que tous les extraits bruts tests tmoignent dactivits
antimicrobiennes et antioxydantes in vitro. Dautres tudes approfondies sont ncessaires et se
rsument dans les points suivants :
1) Partant du fait quune substance pouvant tre trs active in vitro, peut perdre cette
activit une fois pntre dans le corps ; Une tude in vivo est souhaitable, pour
obtenir une vue globale sur lactivit antioxydante et antimicrobienne des extraits
tests.
2) Isolement et caractrisation des composs actifs dans les diffrents extraits par des
mthodes plus spcifiques
3) Evaluation dautres effets biologiques in vitro comme in vivo des extraits bruts et de
leurs composs actifs en utilisant diffrentes techniques.
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Rfrences
Bibliographiques
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Annexes
Fig. 44 : Chromatogrammes des diffrents standards utiliss dans lHPLC.
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Fig. 45 : Influence du solvant DMSO sur la croissance des microorganismes.
Fig. 46 : Pied coulisse automatique utilis dans les mesures
des diamtres des zones dinhibitions.
Fig. 47 : Photo montrant la CMI de lEEP de Thymus vulgaris
sur la souche S. aureus.
[C]
1
=0.0312 %
;
[C]
2
= 0.0156 %
;
[C]
3
= 0.0078 %; [C]
4
= 0.0039 %
;
[C]
5
= 0.0019 %
;
[C]
6
=0.0010 %.
[C]
1
[C]
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[C]
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[C]
5
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Fig. 48 :
Fig. 49 : Activit anti-radicalaire (APR) des extraits bruts de
Thymus vulgaris (a) et Laurus nobilis (b).
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Fig. 50 : Activit anti-radicalaire (APR) des diffrents tmoins.
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RESUME
Notre travail a port sur ltude des extraits bruts de feuilles de deux plantes aromatiques Thymus vulgaris (Lamiaceae)
et Laurus nobilis (Lauraceae). Lanalyse de ces extraits a rvle la prsence de quelques groupes chimiques (polyphnols
totaux) susceptibles dexprimer les activits recherches et leurs teneurs ont t dtermines par des mthodes
spectrophotomtriques.
Les extraits ont t galement soumis un criblage pour leur activit antimicrobienne possible in vitro, contre sept
souches de bactries pathogne et une seule espce de levure, en employant la mthode de diffusion partir dun disque
solide. Tous les extraits ont ragi positivement au moins sur une des souches microbiennes testes. Les extraits d'une mme
plante ont montr des activits diffrentes et les CMI ont t dtermine partir des extraits les plus actifs en milieu
glos, lextrait EP de Thymus vulgaris a tmoign dune forte activit antimicrobienne mme vis vis de souches
multirsistantes aux antibiotiques. Globalement lactivit antimicrobienne de Thymus vulgaris est plus importante que celle
de Laurus nobilis avec un spectre antimicrobien plus large et des doses plus faibles.
L'activit antioxydante in vitro a t tudie avec deux mthodes diffrentes : technique de rduction du radical libre
DPPH et le test de blanchissement de la -carotne. Les rsultats obtenus ont montr que les extraits peuvent agir en tant
que pigeurs de radicaux et montr une activit inhibitrice de peroxydation des lipides. Deux extraits semblent tre de bons
pigeurs de radicaux, les extraits MeOH de Laurus nobilis et de Thyms vulgaris. Alors que, les extrais EP des deux plantes
exprimant le pouvoir inhibiteur de peroxydation des lipides le plus important.
Mots cls: Thyms vulgaris ; Laurus nobilis ; Extraits bruts ; Activit antimicrobienne ; Pouvoir rducteur ; Activit Antioxydante.
SUMMARY
Our work focused on the study of the rough extracts of leaves of two aromatic plants Thymus vulgaris (Lamiaceae) and Laurus
nobilis (Lauraceae). The analysis of these extracts revealed the presence of some chemical groups (total polyphenols) likely to express
the activities required and their contents were given by spectrophotomtric methods.
The extracts were also subjected to a sifting for their possible antimicrobic activity in vitro against seven species of bacteria
pathogenic and only a yeast species by employing the method of diffusion starting from a disc solid. All the extracts reacted positively
at least on one of the microbial stocks tested. The extracts of same plants showed activities different. The CMI were determined starting
from the most active extracts in glose medium. Extract EP of Thymus vulgaris testified to a strong activity antimicrobic even with
respect to stocks multirsistant with antibiotics. Broadly the antimicrobic activity of Thymus vulgaris is more significant than that of
Laurus nobilis with an antimicrobic spectrum broader and with weaker amounts.
The in vitro antioxidant activity was investigated with two different methods : DPPH radical scavenging assay and -carotene
bleaching test. The obtained results showed that the extracts can act as radical scavengers and displayed a lipid peroxidation inhibitory
activity. Two extracts seem to be good trappers of radicals, the extracts MeOH of Thymus vulgaris and Laurus nobilis. Whereas, extract
them EP from the two plants expressing the most significant capacity inhibiting of peroxidation of the lipids.
Key words : Thymus vulgaris ; Laurus nobilis ; rough extracts ; Antimicrobic activity ; Reducing power ; Antioxidants activity.
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) par les flavonodes......................................................................23

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) par les flavonodes.

), radical hydroxyl (OH

), monoxyde dazote (NO

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