CUPRINS

INTRODUCERE ............................................................................................................................................... 2 MOTIVAREA ALEGERII ................................................................................................................................... 4 CAP I : ACIZII NUCLEICI STRUCTURA SI FUNCTII ......................................................................................... 5 1.1 Structura acizilor nucleici .................................................................................................................... 5 1.1.1 Structura primar ......................................................................................................................... 5 1.1.2. Structura secundar .................................................................................................................. 12 1.2. Proprietile, localizarea i funciile acizilor nucleici ............................................................... 15

CAP II: TRANSFERUL GENELOR LA PLANTE PRIN INTERMEDIUL VECTORILOR ............................................ 17 2.1. Transferul genelor n celulele vegetale prin utilizarea bacteriilor din genul Agrobacterium ......... 17 2.1.1 Particularitile bacteriilor din genul Agrobacterium ................................................................ 17 2.1.2. Mecanismul transferului ADN-T n celula vegetal ................................................................... 23 2.1.3. Integrarea ADN-T n genomul celulei vegetale.......................................................................... 26 2.2. Vectori de clonare pentru celula vegetal ....................................................................................... 28 2.2.1. Vectori plasmidiali ..................................................................................................................... 28 2.2.2. Vectori virali............................................................................................................................... 32 Concluzii ...................................................................................................................................................... 33 BIBLIOGRAFIE .............................................................................................................................................. 35

INTRODUCERE

ntr-o lume n care creterea populaiei este accelerat (se preconizeaz c pn n anul 2050 populaia globului va numra aproximativ 10 miliarde de locuitori), iar producia agricol crete ntr-un ritm mai lent este necesar gsirea unor soluii moderne prin care agricultura s asigure cantiti suficiente de hran, cu o calitate corespunztoare. Agriculturatradiional se confrunt n prezent cu o serie de limitri extrem de serioase: - limitri ce in de pia: n condiiile globalizrii, regulile unei piee libere ngrdesc politicile locale de preuri, acestea fiind dictate de tendinele i politicile internaionale - resursele naturale devin, din ce n ce mai mult, factori limitativi ai dezvolt rii agriculturii tradiionale datorit modificrilor climatice, a industrializrii i urbanizrii care determin deteriorri ale solului, apei i a calitii aerului. - resursele biologice (genetice) sunt, n mod inevitabil, limitate. Astfel, dei considerat la nceput foarte eficient, obinerea i eliberarea n mediu a plantelor ameliorate prin metode tradiionale a devenit extrem de nceat, nu fac fa cerinelor, iar numrul de nsuiri naturale care pot fi mbuntite prin aceste metode este foarte mic. Specialitii consider c pentru depirea acestor probleme, pe lng mbuntirea continu a practicii agricole, exist dou soluii: gsirea unor surse alternative de hran (de exemplu, valorificarea resurselor marine) sau ameliorarea plantelor prin metode biotehnologice (Altman, 1999). Cu toate c pentru unii oameni biotehnologia reprezint un domeniu oarecum controversat, prin integrarea metodelor biotehnologice cu metodele clasice de ameliorare (att la plante ct i la animale) se pot obine rezultate care s mul umeasc pe toat lumea, declanndu-se o adevrat revoluie verde n agricultur.
2

Prima generaie de cercetri n domeniul biotehnologiei vegetale a fost axat pe transferul de gene n plante de interes economic care s permit obinerea unor beneficii mai mari n urma cultivrii lor. De exemplu, au fost obinute plante rezistente la atacul unor insecte sau la aciunea unor erbicide ceea ce a condus la reducerea pierderilor datorate buruienilor sau duntorilor precum i a cantitilor de compui chimici aplicai culturilor de plante. Utilizarea plantelor transgenice, limitat iniial doar la loturi experimentale, s-a extins n ultimii ani la suprafee semnificative mai ales n SUA, Canada, Argentina, China i mai puin n Europa. Dei cercetrile privind introducerea de noi gene de interes la plante va continua, estede ateptat ca noua generaie de cercetri n domeniul biotehnologiilor vegetale s aib drept principal scop obinerea de plante transgenice sigure pentru utilizarea lor n alimentaia omului, cu rezisten la atacul fungilor astfel nct s nu se acumuleze compui toxici pentru om (compui de tipul aflatoxinelor), cu valoare nutritiv superioar (cum ar fi mbogirea lor n vitamine, n uleiuri sau proteine care nu s nu determine reacii alergice la persoanele sensibile) sau capabile s produc substane de interes medical (de exemplu vaccinuri comestibile). De asemenea, cercetrile privind obinerea i utilizarea plantelor transgenice trebuie s fie corelate cu studii care s lmureasc opinia public asupra beneficiilor i eventual a riscurilor pe care aceste plante i mai ales produsele alimentare derivate de la ele le presupun.

MOTIVAREA ALEGERII

Acizii nucleici pot fi impartiti in 2 mari clase, intre care exista diferente structurale si functionale: acidul ribonucleic (ARN) si acidul dezoxiribonucleic (ADN). ADN-ul apare n nucleele celulelor, iar ARN-ul se gaseste mai ales in plasma celulara. Ambele macromolecule prezinta din punct de vedere chimic o structura polinucleotidica, construita cu ajutorul legaturilor fosfodiesterice si avand in componenta pentoze facand din ADN si ARN molecule inrudite. Transferul de gene la plante a devenit posibil datorit descoperirii i a utilizriisistemului de transformare genetic prin intermediul bacteriilor din genul Agrobacterium (A.tumefaciens i A.rhizogenes). Rezultatele cercetrilor din domeniul geneticii vegetale, bazate n primul rnd pe folosirea plasmidelor Ti de la Agrobacterium tumefaciens, se constituie ntr-un material faptic deosebit de bogat. Astfel principala motivatie pentru care am ales tema proiectului este ca acizii nucleicii reprezinta moleculele care pastreaza, transporta si manipuleaza informatia in orice celula vie; codul de scriere a acestei informatii este universal valabil iar mecanismele biochimice implicate sunt pe de o parte complexe si pe de alta parte foarte precise, iar vectorii de clonare derivai de la plasmidele Ti, tehnicile de transformare genetic,structura i exprimarea genelor n plantele transgenice au determinat obinerea unor noi cunotine importante att pentru cercetarea fundamental, ct i pentru mbuntirea nsuirilor unor plante de cultur.

CAP I : ACIZII NUCLEICI STRUCTURA SI FUNCTII

1.1 Structura acizilor nucleici

1.1.1 Structura primar Acizii nucleici sunt polimeri ai nucleotidelor. Indiferent de tipul de care aparin (ARN sau ADN), molecula lor este constituit din lungi lanuri polinucleotidice, n care resturile de acid fosforic formeaz legturi diesterice cu cte dou molecule de pentoz la atomul C-3 din una i C-5 din cealalt. Astfel iau natere catene lungi n care resturile de acid fosforic alterneaz cu resturi pentozice la care, la atomii C-1 sunt legate baze azotate. Acest schelet este comun tuturor acizilor nucleici, cu deosebire c n ADN pentoza este dezoxiriboza, iar n ARN - riboza i a faptului c ADN conine adenin, guanin, citozin i timin, iar n ARN sunt prezente adenina, guanina, citozina i uracilul.ntr-un polinucleotid liniar exist legturi glicozidice care leag bazele azotate de pentoz, legturi esterice ntre pentoz i acidul fosforic i legturi diesterice ntre nucleotide. Toate aceste legturi simple, covalente, alctuiesc structura primar a acizilor nucleici, adic compoziia i secvena resturilor de nucleotide n lanul polinucleotidic al acizilor nucleici.Cu alte cuvinte, nivelul primar de organizare structural a ADN i ARN indic natura, proporia i secvena bazelor azotate ale nucleotidelor care constituie macromolecula lor. Pentru reprezentarea schematic a structurii primare se procedeaz astfel: orizontal se redau lanurile atomilor de carbon ai glucidelor cu bazele azotate legate n C-1, iar n diagonal legturile fosfat diesterice dintre atomul C-3 (n apropierea mijlocului liniei orizontale) i atomul C-5 (la captul urmtoarei orizontale).(Fig. 5.1. )
5'-P P P 5' P 5' 3' 3' 1' 1' 1' T C G 5'-P T C G 3'-OH

Fig. 5.1. Reprezentarea schematic a structurii primare a unui fragment de ADN

3'-OH

pTpCpG

Pentru polinucleotidele lungi se utilizeaz i o schem cu litere. Cu literele A, G, C, U i T se reprezint nucleozidele, iar grupa fosfat se reprezint cu litera p. Cnd aceasta se gsete la dreapta, esterific la C-3, cnd se gsete la stnga, la C-5. Astfel, n ApUp grupa fosfat esterific n C-3 adenozina i n C-5 uridina. Totodat, uridina este fosforilat i n C -3. Toate mononucleotidele sunt dispuse n molecula acidului nucleic ntr-o ordine strict determinat, specific polinucleotidului respectiv. Nu exist nici o ramificare a lanului. Fragmente ale lanurilor de ADN i ARN au un aspect caracteristic :

ADN
O

ARN
O CH3 N O H2C H H N N N NH2 N H O HN

n lant
O H2C H H O

HN O O H H

n lant

O O H

NH2 N N N

OH N

O P O H2C O HO H H H H O H HN O

O CH3 N

O P O H2C O HO H H H H O OH HN O

O P O H2C O HO H H H H O H HN

O N N N

O P O H2C O HO H H H H O OH HN

O N N N

H2N

H2N

O P O H2C O HO H H H H O H O

NH2 N N

O P O H2C O HO H H H H O OH O N

NH2

O P O H2C O HO H H H H

n lant

O P O H2C O HO H H H H O OH

n lant

Structura ADN - ului

ADN-ul reprezinta materialul genetic din care sunt alcatuite genele majoritatii organismelor si este localizat exclusiv in cromozom; fiecare cromozom contine cate o molecula de ADN. Rezulta din polimerizarea unor monomeri denumiti dezoxiribonucleotizi. Prezenta in cromozom a ADN-ului a fost relevata de chimistul german R.Feulgen, in 1924, prin utilizarea unui colorant vital -fuxina bazica- care coloreaza rosu-violaceu cromozomii; substanta din cromozomi, care reactioneaza specific cu colorantul, era ADN. James Watson si Francis Crick, au facut cunoscut un model al moleculei de ADN pentru care au primit Premiul Nobel (in 1962). Modelul se bazeaza pe combinarea a patru nucleotizi. Fiecare nucleotid consta dintr-un radical fosforic monoacid, o pentoza (dezoxiriboza) si o baza azotata (una din urmatoarele patru): adenina(A), guanina(G), -A si G sunt baze purinice- timina(T), citozina(C) - T si C sunt baze pirimidinice.

Combinatia dintre o baza si o pentoza se numeste dezoxiribonucleosid, iar combinatia celor trei componente dezoxiribonucleotid. ADN-ul ca si ARN-ul consta dintr-un lant lung de molecule de zahar, cu o nucleotida atasata-un inel de atomi de carbon si azot. ADN-ul prezinta doua lanturi lungi unite intr-o spirala, cu nucleotidele in interior, asa incat intreaga molecula gigantica are aspectul unei scari rasucite(v.anexa1). Secvente de trei nucleotide de pe lanturile ADN-ului formeaza un cod special care stabileste ordinea in care sunt legati aminoacizii pentru a forma molecule de proteine. Acesta este cunoscut sub numele de cod genetic. Unii aminoacizi sunt codificati prin mai mult de un triplet. Deoarece proteinele sunt moleculele de constructie ale organismului si, ca si enzimele, controlorii sai metabolici, codul ADN stabileste cum arata, creste si functioneaza corpul. In concluzie, ADN-ul este materialul genetic al corpului. Legatura dintre pentoza si una din bazele azotate este N-glucidica. La dezoxiribonucleosidele purinice legatura N-glucidica se formeaza intre pozitia N9 a heterociclului dublu purinic si pozitia C1 a pentozei, iar la nucleosidele pirimidinice legatura se realizeaza intre pozitia N3 a nucleului pirimidinic si pozitia C1 a pentozei. Aditionarea radicalului fosforic se realizeaza, obisnuit, prin intermediul pozitiei 5 a nucleosidului. Astfel rezulta nucleotizii, care sunt esteri ai acidului fosforic cu nucleosidele. Atat conectarea bazelor cu pentoza, cat si a nucleosidului cu acidul fosforic se realizeaza prin pierderea unei molecule de H2O. Fiecare radical fosforic al unui nucleotid poate, prin gruparile acid libere, sa se lege fie cu un radical fosforic, fie cu un alt nucleotid prin pozitia 3 a dezoxinucleosidului. In primul caz, dezoxinucleotizii pot aparea sub forma de monofosfat, difosfat sau trifosfat. In functie de numarul grupelor fosfat si de baza din constitutia nucleotidului, dezoxinucleotizii monofosfat se numesc: adenozin 5-fosfat (AMP), guanozin 5-fosfat (GMP), citidin 5-fosfat (CMP) si timidin 5-fosfat (TMP);dezoxinucleotizii difosfati: ADP, GDP, CDP si TDP, dezoxinucleotizii trifosfati:ATP, GTP, CTP si TTP. In al doilea caz, dezoxinucleotizii se leaga unul de altul prin legaturi fosfodiesterice astfel: primul nucleotid, prin grupul fosfat la nivelul unei grupari acid libere, se leaga de nucleotidul adiacent inferior prin pozitia 3, iar de nucleotidul adiacent superior prin pozitia 5 etc. In acest fel, intre nucleotizi se stabileste o legatura in zigzag. Se formeaza astfel un lant polidezoxiribonucleotidic cu o lungime variabila. Aceasta este stuctura primara a
8

ADN sau monocatenara. Obisnuit, molecula de ADN este constituita din doua lanturi polinucleotidice sau doua catene: aceasta este structura secundara. Analiza chimica a aratat ca exista o relatie de 1:1 intre adenina (o purina) si timina (o pirimidina) si intre citozina (o pirimidina) si guanina (o purina). O asemenea relatie nu exista intre cele doua purine sau intre cele doua pirimidine. Legatura dintre cele doua catene se realizeaza prin punti de hidrogen intre perechi de baze situate la acelasi nivel in cele doua catene: doua punti de hidrogen intre adenina si timina A=T si T=A si trei punti intre guanina si citozina. Faptul ca la acelasi nivel aditionarea radicalului fosforic la dezoxiriboza este diferita (intr-o catena la pozitia 3, iar in catena complementara la pozitia 5) a dus la concluzia ca cele doua catene sunt indreptate in directii opuse. Prin urmare cele doua catene complementare au o orientare spatiala inversa sau antiparalela. Studiul structurii moleculei de ADN a relevat faptul ca bazele azotate sunt asezate spre interior, perpendicular pe axa principala lunga, la o distanta una de alta de 3,4A. Deoarece unghiul intre doi nucleotizi apropiati ai aceleiasi catene este de 36o, structura se repeta la fiecare 10 nucleotizi, adica la 34A. Dubla spirala helicoidala coaxiala are un diametru de 20A. Molecula de ADN are dimensiuni foarte mari (fiind cea mai mare macromolecula biologica), cu o greutate moleculara care poate ajunge la 12 si 16*106. Majoritatea moleculelor de ADN au o rasucire a helixului la dreapta (forma B de ADN); exista insa si molecule cu o rasucire a helixului spre stanga: Z-ADN. Insusirea genetica continuta intr-o molecula de ADN aste determinata de insusirea perechilor de baze de-a lungul moleculei. Cum numarul secventelor posibile de baze este egal cu 4n, unde n este egal cu numarul de nucleotizi per catena, se ajunge la un numar astronomic de variante posibile de informatie genetica. In timpul replicarii cele doua catene ale moleculei de ADN se separa enzimatic, fapt ce permite sinteza unor catene complementare noi pe matricele reprezentate de cele doua monocatene vechi. Rezulta astfel doua bicatene de ADN identice. Bicatenele de ADN se pot separa -denatura- prin expunere la temperaturi apropiate de punctul de fierbere si la pH extrem (pH<3 si pH>10) si se pot combina -renatura- formand helice duble native prin expunerea monocatenelor complementare la temperatura de aproximativ 65oC.

Structura ARN - ului Complex macromolecular, structural si functional, similar in anumite privinte, ADN-ului. ARN-ul rezulta din polimerizarea unor ribonucleotizi, care determina formarea unor lanturi lungi, monocatenare (structura primara). Pe anumite portiuni monocatena de ARN se poate rasuci in jurul ei, determinand aparitia unei structuri duble intre secventele complementare de baze (structura secundara). Polimerizarea implica patru tipuri de ribonucleotizi legati impreuna prin legaturi fosfodiesterice in pozitiile 3-5. Componentul pentozic al ARN-ului este riboza, iar bazele azotate sunt: adenina, guanina, citozina si uracilul. Sunt doua clase de ARN si anume: ARN genetic care controleaza ereditatea la unii virusi, alta, ARN negenetic care este implicata in sinteza substantelor proteice(v. Sinteza proteinelor). ARN negenetic implicat in sinteza proteinelor sau ARN celular. Exista trei tipuri de acid ribonucleic celular prezente in toate celulele, si care, avand structuri si functii diferite , joaca un rol esential in biosinteza proteinelor. Aceste tipuri sunt : acidul ribonucleic mesager-mARN, acidul ribonucleic solubil sau de transfer-sARN sau tARN si acidul ribonucleic ribozomal-rARN(v.anexa2). In celule se gaseste o mare cantitate de rARN (80-90% din ARN-ul celular) o cantitate oarecare de sARN(10-15%) si o cantitate mica de mARN(mai putin de 5%). ARN mesager. mARN este sintetizat in timpul transcriptiei mesajului genetic de pe o catena de ADN si serveste ca tipar pentru sinteza proteinelor. A fost gasit in stransa legatura cu ADN-ul cromozomal. mARN are urmatoarele caracteristici: este foarte repede sintetizat, are o singura catena, complementara uneia dintre catenele ADN-ului propriu, la nivelul careia a fost sintetizat. In mARN mesajul este inscris codificat in codoni care contin triplete de baze azotate (ribonucleotizi). La capatul 3, moleculele de mARN contin o secventa de acid poliadenilic-poly-A (intre 7010

250 nucleotizi). Aceste cozi poly-A sunt adaugate posttranscriptional. Terminatia 5 a mARN-urilor sunt blocate prin aditia unor capete de m7 Gppp (7metilguanozine reziduale legate de mARN prin legaturi trifosfat). ARN solubil, de transfer sau adaptor. sARN-ul sau tARN-ul este similar ca structura cu orice acid ribonucleic. Este caracterizat printr-o slaba polimerizare , are rolul de a activa enzimele din citoplasma. Apoi reactioneaza cu aminoacizii specifici prin formarea gruparilor aminoacil-sARN- care sunt transferati la locul de biosinteza a proteinelor: complexe mARN-ribozomi sau poliribozomi. Anumite parti din catena de sARN, constituite din serii scurte de nucleotizi, reprezinta bazele complementare ale codului mARN pentru un aminoacid caracteristic. In asemenea portiuni reprezentate de tripleti de baze, denumite anticodoni, sARN-ul diferitelor specii este identic. Faptul ca in citoplasma exista toti sau aproape toti cei circa 20 de aminoacizi proteici, presupune ca trebuie sa existe un numar de minimum 20 de tipuri de sARN, cate unul pentru fiecare aminoacid (maximum 64, cati codoni se pot forma de cele patru baze azotate). Moleculele de sARN constau dintr-o singura catena, alcatuita din 75-80 de ribonucleotizi. La un capat al catenei (capatul 5) se gaseste acid guanilic (G), iar la capatul 3 se gaseste un triplet format din bazele CCA (citozina-citozina-adenina). Intre bratul scurt, cu G, si bratul lung la nivelul primului nucleotid C, se formeaza punti de hidrogen. Regiunile bicatenare includ trei bucle monocatenare intermediare. Regiunea de curbura a lantului polinucleotidic reprezinta celalalt capat al moleculei de sARN. Curbura este constituita dintr-un segment de trei nucleotizi necomplementari, deci legati prin punti hidrogenice. Acest triplet de baze a capatat denumirea de anticodon tocmai pentru a indica complementaritatea lui fata de codonii mARN. ARN ribozomal. Una din caracteristicile principale care deosebeste rARN de celelalte tipuri de ARN consta in aceea ca el apare intotdeauna legat de proteine. Lantul rARN-ului este constituit atat din portiuni monocatenare cat si din portiuni bicatenare helicoidale cu bucle monocatenare. In lantul polinucleotidic al rARNului raportul molar intre bazele azotate componente este in favoarea bazelor purinice. Astfel continutul in adenina/uracil=21:19, guanina/citozina=36:25, iar raportul general purine/pirimidine circa 1,3. Molecula de rARN are peste 1000 de nucleotizi.

11

1.1.2. Structura secundar Alturi de legturile simple, covalente, n moleculele acizilor nucleici exist legturi de hidrogen care joac un rol important n conformaia lor spaial. Structura secundar a fost propus iniial pentru ADN de ctre Watson i Crick n 1953, iar mai trziu (1963) i pentru ARN. La baza organizrii acestei structuri secundare stau urmtoarele reguli stabilite pe baza datelor experimentale privind compoziia chimic a ADN: 1) Coninutul molar de purine este egal cu coninutul molar de pirimidine, coninutul de adenin este egal cu coninutul de timin (A/T = 1), coninutul de guanin este egal cu cel de citozin (G/C = 1), iar suma cantitii de adenin i guanin este egal cu suma cantitii de citozin i timin: (A + G) = (C + T), sau (A + G) / (C + T) = 1; 2) Cantitatea de grupe 6-aminice care intr n compoziia bazelor azotate ale ADN (adenin i citozin) este egal cu cantitatea de grupe 6-cetonice ce exist n aceste baze (guanin i timin), prin urmare (G + T) = (A + C), sau (G + T) / (A + C) = 1. Aceste date, asociate cu studiile efectuate prin analize, au permis elaborarea unui model spaial al structurii secundare a ADN. n conformitate cu modelul elaborat, macromolecula de ADN este alctuit din dou lanuri polinucleotidice antiparalele sub form de spir, rsucite unul cu altul. Fiecare lan reprezint n sine un polinucleotid n care o legtur diesteric leag mononucleotidele una cu alta. n lungul axei fiecrui lan, la fiecare 0,34 nm se gsete un mononucleotid. Unghiul dintre nucleotidele alturate n fiecare lan este 36o. n lan, mononucleotidele sunt astfel dispuse nct bazele azotate se gsesc n interior, iar pentoza i acidul fosforic n afar. Cele dou lanuri paralele sunt nfurate n jurul unei axe comune i sunt legate unul de altul prin bazele lor azotate de-a lungul ntregii molecule de ADN, cu ajutorul legturilor de hidrogen care menin i stabilizeaz o arhitectur spaial. Legturile de hidrogen sunt ndreptate de la grupa 6-NH2 a adeninei ctre grupa 6=O a timinei, de la grupa 2 -NH2 a guaninei la grupa 2 =O a citozinei i de la grupa 6-NH2 a citozinei la grupa 6 =O a guaninei. (Figura 5.2.)

12

Fig. 5.2. Legturile de hidrogen dintre bazele azotate complementare din ADN

n acelai timp se formeaz legturi de hidrogen i cu participarea grupelor NH existente n 9 la guanin i 3 la timin. Ca urmare, adenina unui lan polinucleotidic se va uni ntotdeauna prin dou legturi de hidrogen cu timina celuilalt lan (AT) iar guanina va forma ntotdeauna trei legturi de hidrogen cu citozina (GC). Aceasta nsemn c succesiunea distribuiei (secvena) bazelor azotate n unul din cele dou lanuri poate fi oricare, dar succesiunea distribuiei bazelor azotate n cellalt lan trebuie s se gseasc n strns legtur cu succesiunea lor n primul lan. Perechile adenin- timin i guanin-citozin sunt complementare una fa de cealalt. Ca urmare, macromolecula de ADN este constituit din dou lanuri complementare ntre ele, adic este vorba de o deplin reflectare a secvenei nucleotidelor unui lan n secvena celuilalt.

13

5 P

3OH Schematic, un fragment al celor dou lanuri ale ADN se poate reda astfel:
5'(P)
3' (OH)

AGTCAAGTGGCC
TCAGTTCACCGG

3' (OH)

5' (P)

Sensul lanurilor n raport cu legturile dintre nucleotide este diferit, adic lanurile sunt antiparalele. Dac, de exemplu, n lanul de deasupra, legturile fosfodiesterice ntre A i G, G i T, T i C .a.m.d. sunt de tipul 53, n lanul inferior legturile fosfodiesterice ntre T i C, C i A, A i G .a.m.d., sunt de tipul 35. Ambele lanuri 5 P sunt spirale de dreapta, nfurate n jurul aceleiasi axe (Figura 5.3.) Diametrul helixului este de 2,0 nm, iar fiecare spir a acestuia conine 10 perechi de baze azotate.
Fig. 5.3. Modelul structurii spaiale dublu-elicoidale a moleculei de ADN

3OH

Orientarea antiparalel a celor dou catene reflect o polaritate opus datorit neidentitii grupelor terminale de la fiecare capt al dublului helix. Deoarece direcionarea unei catene este n sensul 35 i a celeilalte n sensul 53, grupele terminale ale celor dou catene vor fi 5(P) i 3(OH) spre un capt al lor i respectiv 3(OH) i 5(P) spre cellalt capt. Stabilitatea structurii spaiale a ADN este asigurat, pe lng legturile de hidrogen intercatenare, i prin caracterul polianionic al macromoleculei, caracter datorat disocierii grupelor OH ale radicalului acidului fosforic din fiecare mononucleotid. Ca polianion, ADN poate stabili interaciuni electrostatice cu proteine bazice (histone) care conin aminoacizi ncrcai electropozitiv (n nucleoproteide). Spre deosebire de ADN, majoritatea tipurilor de ARN au o structur monocatenar (fac excepie ARN al unor microorganisme i virusuri), ns mperecherea bazelor azotate poate avea loc i n acest caz. Firul de ARN se nfoar singur, formnd legturi de hidrogen ntre adenin - uracil i guanin - citozin. Molecula de ARN este capabil s-i modifice reversibil forma, dimensiunea, numrul legturilor de hidrogen n funcie de puterea ionic, pH-ul, temperatura soluiei etc..
14

Denaturarea ADN. n anumite condiii de temperatur, pH etc., se produce o distrugere a structurii secundare, adic a structurii dublu elicoidale a ADN. Acest fenomen poart denumirea de denaturare. Este caracteristic pentru acizii nucleici ca i pentru proteine i este nsoit de modificarea proprietilor lor. Denaturarea polinucleotidelor poate fi un proces reversibil. Experimentele au demonstrat c prin denaturarea diferitelor ADN din bacterii urmat de renaturarea lor, pot s ia natere molecule hibride de ADN, alctuite din fragmente ale moleculelor iniiale de ADN. Acest fenomen poart denumirea de hibridare molecular i st la baza ingineriei genetice, domeniu care are drept scop construirea n afara organismului a unor molecule recombinate de ADN cu anumite nsuiri biologice (ADN recombinat).

1.2. Proprietile, localizarea i funciile acizilor nucleici

Structura acizilor nucleici determin proprietile lor fizico-chimice i funcionale.Acizii nucleici sunt substane de culoare alb, cu aspect filiform, care se dizolv greu n ap cnd sunt n stare liber dar bine atunci cnd sunt sub form de sruri cu metale alcaline. De asemenea, se dizolv n soluii de sruri: ARN - n diluate, iar ADN - n mult mai concentrate. ARN nu este stabil n mediu alcalin. Masa molecular a ADN variaz de la 5105 pn la 2107 i mai mult, iar molecula sa este alctuit din mii de mononucleotide. Masa molecular a ARN este cuprins ntre 3104 pn la 2106, iar mononucleotidele dintr-o molecul sunt pn la 4-6 mii. Soluiile acizilor nucleici posed o mare viscozitate. Avnd un numr mare de sarcini negative, moleculele lor se deplaseaz n cmpul electric. O caracteristic a acizilor nucleici o constituie capacitatea lor de a absorbi lumina n zona radiaiilor ultraviolete la 260 nm. Preparatele de ADN izolate din diferite organisme se caracterizeaz printr-un raport cantitativ diferit ntre bazele azotate purinice i pirimidinice. Compoziia nucleotidic a ADN este caracteristic pentru un anumit organism, pentru o anumit specie biologic. Altfel vorbind, ADN are o specificitate de specie. Pe aceste proprieti ale acizilor nucleici au fost elaborate principiile genosistemicii organismelor vii. n diferite celule i esuturi ale unuia i aceluiai organism, ADN are o compoziie nucleotidic identic sau ntr-o mare msur foarte apropiat care nu este influenat nici de factorii fiziologici, nici de condiiile de mediu. Totui, la unele organisme coninutul diferitelor baze ce intr n ADN variaz n condiii largi. Indicele de variabilitate pentru o anumit specie se exprim prin raportul:
15

adenina timina guanina citozina

care a primit denumirea de coeficient de specificitate al acizilor nucleici. n limitele fiecrui tip de ADN exist o infinitate de posibiliti de variaie a gradului de predominare a uneia sau alteia din perechile de baze azotate (A + T i G + C). Aceasta creeaz posibilitatea existenei unei mari diversiti a ADN n lumea organismelor vii. Compoziia nucleotidic a ARN variaz cu mult mai puin dect cea a ADN. Specificitatea de specie a ARN const n diferita succesiune de distribuie a nucleotidelor n moleculele sale. ADN i ARN sunt localizai n diferite organite celulare. ADN se gsete preponderent n nucleul celular (n compoziia cromozomilor), ns un mic procent din cantitatea total de ADN din celul este concentrat n mitocondrii i cloroplastele vegetalelor. ARN se gsete att n nucleu ct i n citoplasm; deosebit de bogai n ARN sunt nucleolul i fraciunea ribozomal a microzomilor. n afar de aceasta, ARN se gsete n cromozomi i sub form solubil n lichidul citoplasmatic. n constituia virusurilor intr ARN (virusuri vegetale) i ADN (bacteriofagi, virusuri animale). Coninutul de ARN n celule nu se distinge nici prin uniformitate, nici prin stabilitate. n celulele acelor organe unde are loc o intens sintez a proteinelor, coninutul de ARN este de cteva ori mai mare dect cel de ADN. Particularitile funcionale ale ADN i ARN sunt strns legate de localizarea lor. ADN reprezint materialul de baz al genelor n care sub o form codificat, se pstreaz informaia genetic a organismului care se traduce prin biosinteza proteinelor. Dubla elice i complementaritatea structurii bicatenare constituie baza molecular a fenomenului de autoduplicare sau autoreplicare a ADN n momentul diviziunii celulare i explic faptul c ADN, prin structura sa, reprezint unicul substrat al ereditii. Prin mecanismul de replicare se asigur constana conservrii i transmiterii caracterelor ereditare, deoarece cele dou molecule fiice ale ADN nou sintetizate sunt perfect identice cu molecula mam de ADN. n felul acesta se asigur perpetuarea celulei prin procesul ADN ADN. ADN conine o vast cantitate de informaii i constituie baza molecular a conservrii i transmiterii din generaie n generaie a informaiei genetice. ARN are o alt funcie: de a informa citoplasma asupra caracteristicilor nscrise n codul genetic. Acest lucru se manifest, nainte de toate, n responsabilitatea ARN n sinteza proteinelor i specificitatea moleculelor ce se sintetizeaz. n celul exist trei specii moleculare distincte de ARN: mesager (m-ARN) sau informaional, ribozomal ( ARN) i de transfer ( t-ARN).

16

CAP II: TRANSFERUL GENELOR LA PLANTE PRIN INTERMEDIUL VECTORILOR

Transferul de gene la plante a devenit posibil datorit descoperirii i a utilizrii sistemului de transformare genetic prin intermediul bacteriilor din genul Agrobacterium (A.tumefaciens i A.rhizogenes). Rezultatele cercetrilor din domeniul geneticii vegetale, bazate n primul rnd pe folosirea plasmidelor Ti de la Agrobacterium tumefaciens, se constituie ntr-un material faptic deosebit de bogat. Vectorii de clonare derivai de la plasmidele Ti, tehnicile de transformare genetic, structura i exprimarea genelor n plantele transgenice au determinat obinerea unor noi cunotine importante att pentru cercetarea fundamental, ct i pentru mbuntirea nsuirilor unor plante de cultur.

2.1. Transferul genelor n celulele vegetale prin utilizarea bacteriilor din genul Agrobacterium
Pentru evidenierea particularitilor procesului de clonare n celulele vegetale vor fi prezentate n continuare unele aspecte legate de sistemul natural de transfer de gene prin intermediul bacteriilor din genul Agrobacterium precum i elementele specifice ale vectorilor de clonare i a markerilor de selecie pentru celulele vegetale. 2.1.1 Particularitile bacteriilor din genul Agrobacterium A.tumefaciens i A.rhizogenes sunt bacterii ce triesc n sol, ele fiind capabile de a produce boli unor specii de plante dicotiledonate i gimnosperme. S-a dovedit c tulpinile de A.tumefaciens determin apariia unor tumori de tip "crown gall" pe tulpinile rnite ale unor plante (n special la nivelul coletului), n timp ce tulpinile de A.rhizogenes induc formarea de rdcini adventive (de tip "hairy") la nivelul esuturilor vegetale rnite (Figura 1).

17

Figura 1. Tumori induse experimental la plante test prin infecie cu Agrobacterium tumefaciens. Modificrile morfogenetice determinate de infectarea plantelor cu tulpini de A.tumefaciens sau A.rhizogenes se datoreaz transferului unor gene de origine bacterian n celulele vegetale. Bacteriile din genul Agrobacterium prezint un sistem genetic organizat care permite introducerea de gene noi n celula vegetal, graie prezenei n celula lor a unei plasmide Ti ("tumor inducing") sau Ri ("root inducing"), ce reprezint factorul determinant al producerii tumorilor, respectiv rdcinilor anormale, la plante. Transferul unei poriuni din aceste plasmide n genomul celulei vegetale determin modificri funcionale, ce se concretizeaz prin apariia fenomenului tumoral. Aceste plasmide constituie, aadar, un sistem organizat i complex de transfer de informaie genetic natural n celula vegetal, fr influen asupra echilibrului ecologic. Cele mai multe studii referitoare la structura plasmidelor de la Agrobacterium au fost realizate cu plasmidele Ti, izolate din tulpini de A.tumefaciens. Acestea sunt de dimensiuni mari (peste 200 kb)(Van Larebecke i col., 1974), cu numr mic de copii/celul bacterian, transferabile dintr-o celul n alta, dar numai n condiii speciale. n principiu, plasmidele Ti conin mai multe regiuni, cu funcii distincte: regiunea ADN-T (coninnd genele de tumorigenez), regiunea de virulen (genele vir), regiunea de incompatibilitate (genele inc), regiunea ce controleaz transferul conjugativ al plasmidei(genele tra) etc, primele dou fiind ns cele mai importante celulelor vegetale. Agrobacterium tumefaciens poate transfera ADN-T diferitelor specii de plante chiar dac unele dintre acestea nu formez tumori (de la Riva i colab., 1998). Dei spectrul de gazde pentru aceast bacteriei este limitat la plantele dicotiledonate s-au obinut tulpini supervirulente, capabile s infecteze eficient i
18

celulele plantelor monocotiledonate (Potrykus i Spangenberg, 1995). S-a deschis, astfel, calea transformrii cerealelor i prin intermediul acestui vector bacterian. Eficiena transformrii celulei vegetale de ctre A. tumefaciens, variaz destul de mult n funcie de specie, genotip sau chiar de esutul int. Este foarte important, totodat, ca esutul supus transformrii s fie totipotent i deci s regenereze plante transformate genetic. De cele mai multe ori, ns, dintr-un esut doar un numr limitat de celule sunt totipotente i nu ntodeauna acestea sunt i cele transformate de agrobacterium. Pentru diferite specii de plante s-au identificat metode potrivite pentru transformarea eficient mediat de A. tumefaciens. Ca esuturi int pot fi utilizate: discuri sau fragmente foliare, fragmente de rdcini, hipocotile, peiol, cotiledoane sau semine ntregi. Primele plante transformate prin intermediul lui A. tumefaciens au fost regenerate n 1983 (Fraley i colab.,1983), succesele iniiale limitndu-se la solanacee, n particular la sistemul model tutunul (Nicotiana tabacum L.). In anii optzeci i nouzeci ai secolului douzeci, tot mai multe specii de plante au putut fi transformate prin intermediul vectorului A. tumefaciens, multe dintre ele specii cu o mare importan economic, cum ar fi: soia, bumbacul, orezul, ovzul, sorgul, trestia de zahr, grul i multe altele (Potrykus i Spangenberg, 1995; Songstad i colab., 1995; de la Riva i colab., 1998). Eficiena transformrii variaz foarte mult de la o specie la alta n funcie de: identificarea metodei optime de cultur a esutului int, condiiile de cultur a materiallului surs, sau sua bacterian utilizat. Aceti factori afecteaz i numrul de copii de ADN-T care se integreaz n genomul vegetal receptor. Predominant s-a constatat, la diferite specii de plante, integrarea unei singure copii de ADN-T. Mai recent, cercetrile au vizat descifrarea mecanismelor implicate n colonizarea esuturilor vegetale de ctre bacterii, relevndu-se noi detalii privind controlul genetic al virulenei bacteriene (de la Riva i colab., 1998). Agrobacterium rhizogenes a fost utilizat pentru prima oar pentru transformarea plantelor de tutun n anul 1977 (Ackermann, 1977). Aceast bacterie transfernd ADN-T de pe plamida Ri determin formarea rdcinilor firoase pe diferite organe ale plantelor, rdcini care pot purta gene de interes, dac acestea au fost integrate n ADN-T, respectiv pot regenera plante transformate genetic. O etap intermediar, n procesul de transformare mediat de A. rhizogenes, este cultura rdcinilor firoase care au capacitatea de a se alungi i ramifica. Astfel, prin cultura rdcinilor firoase se pot obine metabolii secundari sau pot fi realizate
19

studii fundamentale privind creterea i dezvoltarea rdcinilor. Acest sistem experimental este foarte potrivit i pentru analize biochimice, rdcinile prezentnd ci biochimice mai simple i, deci, mai uor de analizat. Rdcinile firoase pot fi cultivate uor, folosind un echipament simplu i ieftin iar, comparativ cu suspensiile celulare, celulele radiculare sunt stabile din punct de vedere genetic. Asemntor sistemului A. tumefaciens, bacteria A. rhizogenes poate co-tranfera ADN-T de pe plasmida Ri i un vector binar, de obicei o plasmid mai mic. Aceasta din urm poate purta n ADN-T o gen marker, de exemplu o gen care confer rezisten la un antibiotic, o gen raportoare - sau marker pentru vizualizare fenotipic i o gen cu importan economic. Avantajul acestui sistem este acela c cele dou tipuri de ADN-T, cel care determin dezvoltarea rdcinilor firoase, i ADN-T de pe vectorul binar, se integreaz de obicei pe cromozomi diferii n plantele transformate i deci, vor segrega independent n descenden. Un avantaj aparte al sistemului de transformare Ri este faptul c toate celulele vegetale care integreaz ADN-T de pe plasmida Ri pot fi uor identificate i selectate prin prezena fenotipului de rdcin firoas. Sistemul de transformare mediat de A. rhizogenes a fost aplicat unui mare numr de specii de plante (n jur de 200 nc n 1989 Tepfer 1989), dar asemntor sistemului A. tumefaciens rspunsul optim variaz n funcie de specie, genotip sau sua bacterian. Organele vegetale potrivite pentru transformarea cu A. rhizogenes sunt: fragmente de tulpin de la plante tinere, fragmente de peiol, fragmente foliare, segmente de hipocotile sau cotiledoane, sau fragmente ale unor organe de rezerv cum ar fi rdcinile de morcov sau tuberculii de cartof. Uneori astfel de explante prezint un rspuns polar, formnd rdcini firoase numai la una din extremele explantului, rdcini capabile s ignore fora gravitaional. Mai mult, exist date experimentale care sugereaz efectul de piticire a plantelor indus de una dintre genele de virulen, rolA, de la A. rhizogenes, efect cu importan practic mai ales pentru unele plante horticole (Curtis i colab., 1996) Regiunea de virulen cuprinde gene eseniale pentru transferul de ADN bacterian n celulele vegetale, fr a fi ns ele nsele transferate. Regiunea vir cuprinde un segment de aproximativ 30-40 kb (n funcie de tulpina bacterian), fiind format din mai mult de 20 gene organizate n cel puin 6 uniti transcripionale (operoni): virA (o gen), virB (11 gene), virC (2 gene), virD (4 gene), virE (2 gene) i virG (o gen)(Weising i Kahl, 1996). Dintre aceste
20

uniti transcripionale, virA, virB, virD i virG sunt eseniale pentru transferul ADN-T, iar virC i virE asigur o cretere a eficienei transferului (de la Riva i colab., 1998). Toi aceti operoni sunt indui n prezena celulelor vegetale rnite (care produc o serie de compui fenolici cu rol inductor), funciile lor fiind urmtoarele: - virA i virG codific proteine responsabile de recunoaterea celulelor vegetale rnite i de inducerea celorlalte funcii vir; - virC i vir D codific proteine ce asigur formarea unei copii de ADN-T monocatenar, transferabil n celula vegetal; - virD i virE codific proteine ce formeaz un complex mpreun cu ADNT ghidndu-l spre nucleul celulei vegetale; ele se pare c sunt implicate i n procesul de integrare al ADN-T n genomul noii gazde; - virB codific proteine care rspund de transportul complexului ADN-Tproteine prin membrana plasmatic bacterian. Studiile efectuate prin analiza heteroduplexurilor ADN ale regiunilor vir provenite de la diferite tipuri de plasmide Ti au evideniat o omologie extins a acestei regiuni, dei apar i unele mici zone neomoloage (care s-ar putea datora inseriilor sau deleiilor aprute n structura plasmidelor n cursul evoluiei). Spre exemplu, prin compararea regiunii vir a unei plasmide Ti nopalinice cu cea a uneia octopinice s-a observat ca exist unele deosebiri: prima nu prezint locusul virF, coninnd n schimb gena tsz, ceea ce d posibilitatea bacteriei s produc fitohormonul transzeatin. Aceast gen este localizat n cazul plasmidei Ti octopinice la nivelul extremitii stngi a regiunii, alturi de virA. Exprimarea genelor localizate n regiunea de virulen a plasmidelor Ti este inductibil, fiind reglat de aciunea unor factori din exterior. Experimental s-a demonstrat c,sub aciunea unor molecule semnal din exudatele plantelor sau la nivelul rnilor produse la plante, are loc o puternic activare a acestor gene. Aceste molecule semnal sunt compui fenolici, de tipul acetosiringonei sau a hidroxiacetosiringonei, care au aciune asupra genelor reglatoare virA i virG. Produii acestor gene sunt asemntori cu alte proteine membranare bacteriene cu rol n reglare (Env Z, Omp R etc). Alturi de genele vir plasmidiale au mai fost identificate unele gene, localizate la nivelul cromosomului bacterian, implicate, se pare, ntr-o mai mic msur n procesul de transformare genetic. Dintre aceste gene menionm: genele chvA i chvB implicate n sinteza i secreia 1,2 glucanului; gena chvE necesar pentru inducerea regiunii vir i pentru chemotactismul bacterian; locusul cel responsabil de sinteza fibrilelor de celuloz implicate n ataarea bacteriilor la celulele vegetale; gena pscA (exoC) implicat n sinteza glucanului ciclic
21

i a acidului succinoglicanic; locusul att implicat n sinteza unor proteine celulare de suprafa (Matthysse, 1987; Cangelosi i colab.,1991) Funciile de recunoatere i ataare a bacteriilor la peretele celulei vegetale nu sunt codificate de gene plasmidiale ci de gene cromosomale. Aceste gene determin, ntre altele, structura exopolizaharidelor de la suprafaa bacteriilor, implicate n procesele de recunoatere. Regiunea ADN-T reprezint o poriune din plasmida Ti (sau Ri) care este transferat n celula vegetal, integrndu-se stabil n genomul celular. Aceast regiune ADN-T (de la ADN transferat) are aproximativ 20-25 kb lungime (n funcie de tulpina bacterian gazd) i conine toate genele (oncogenele) care transferate n celula vegetal vor determina fenotipul caracteristic al celulelor transformate. Genele localizate pe ADN-T determin dou proprieti caracteristice pentru celulele vegetale tumorale: creterea pe medii de cultur n absena fitohormonilor; sinteza i secreia de opine, substane specifice pentru aceste tipuri de celule. Nester i colab. (1984) au reuit identificarea i cartarea a opt gene aflate la nivelul ADN-T: aux1, aux2, iaaM, iaaH, toate fiind implicate n codificarea sintezei de auxine, ipt ce codific sinteza de citochinine, ops ce determin sinteza opinelor de ctre celulele transformate (de exemplu, gene ocs sau nos, n funcie de tipul de plasmid Ti) i o a opta gen ce interacioneaz cu celelalte, mrind se pare, sensibilitatea celulelor transformate la auxin. De remarcat c, ADN-T coninut de toate plasmidele Ti naturale este flancat de scurte secvene de nucleotide, de aproximativ 25 pb, repetate direct, eseniale pentru procesul de transfer n celulele vegetale. Analiza acestor secvene terminale a artat c acestea sunt conservate la diferitele tulpini de Agrobacterium, ele fiind recunoscute de echipamentul enzimatic implicat n transferul ADN-T din celula bacterian n celula vegetal. n cazul plasmidelor Ri, analiza regiunii ADN-T a dovedit c aceasta conine o serie de gene, responsabile de fenotipul de tip "hairy" al esuturilor vegetale transformate. De remarcat c, genele ce se transfer n celulele vegetale sunt grupate la marginile regiunii ADN-T. Astfel, n partea stng a ADN-T sunt localizate genele rolA, B, C i D care sensibilizeaz celulele vegetale la aciunea auxinelor. S-a dovedit c, la anumite specii vegetale, simpla prezen a genelor rol, chiar n absena celorlalte gene din ADN-T, determin apariia fenotipului caracteristic ("hairy root"). n partea dreapt a ADN-T din plasmidele Ri se afl dou gene ce codific sinteza de auxine (acid indolilacetic) n celulele transformate; de asemenea, alturi de aceste gene se afl cele responsabile de sinteza unor opine (manopina i agropina)(Tepfer i Casse-Delbart, 1987). Plantele regenerate din esut vegetal transformat cu acest bacterie prezint un aspect modificat, comparativ cu plantele regenerate din esut normal (figura 2).
22

2.1.2. Mecanismul transferului ADN-T n celula vegetal Mecanismul mobilizrii i transferului ADN-T din celula bacterian n celula vegetal a fost intens studiat n ultimii ani fiind clarificate multe dintre etapele acestui proces. Cu toate acestea rmn de elucidat unele aspecte ale sale, mai ales cele ce au loc n celula vegetal.

Figura 2. Aspectul plantelor de tutun regenerate din esut vegetal transformat cu A. rhizogenes (poziiile 2 i 3) comparativ cu plantele normale (poziia 1).

Primele etape ale interaciunii dintre plante i celulele de Agrobacterium sunt urmtoarele: - celulele vegetale rnite elibereaz o serie de compui fenolici (cum este acetosiringona), aminoacizi sau glucide (acid D-galacturonic sau acid Dglucuronic), care servesc drept chemoatractani pentru agrobacterii; - recunoaterea celulelor rnite i ataarea bacteriilor la nivelul acestora ca urmare a exprimrii constitutive a genelor vir cromosomale, procesul fiind denumit colonizare bacterian; - inducerea funciilor vir plasmidiale i nceperea procesului de transfer al ADN-T. Procesul de transfer al ADN-T poate fi mprit n dou etape: una ce se desfoar n celula bacterian i o alta ce are loc n celula vegetal (Figura 3)

23

Figura 3. Etapele transferului natural ADN-T din celulele bacteriene n celulele vegetale rnite Etapa bacterian include toate evenimentele ce conduc la producerea i exportul ADNT, incepnd cu activarea funciilor vir plasmidiale de ctre compuii fenolici sau glucidici eliberai din celulele vegetale rnite. Primele gene vir ce intr n aciune sunt cele din operonii virA i virG, fiind sintetizate proteinele corespunztoare, VirA i VirG. Se pare c proteina VirA este produs ntr-o form inactiv ce este activat (fosforilat) de inductorii vegetali (compuii fenolici sau glucidici), ea prezentnd trei domenii funcionale: un domeniu periplasmic important pentru detectarea monoglucidelor inductoare i dou domenii transmembranare care recepioneaz i transmit semnalele inductoare. (Parkinson, 1993). La rndul su, proteina VirG este activat (fosforilat) de proteina VirA (Zambryski, 1988). Cele dou proteine interacioneaz i determin activarea celorlali operoni vir (virB, virC, virD, virE). De remarcat c, ADN-T conine toate genele onc necesare transformrii celulelor vegetale dar nici una dintre aceste gene nu este implicat n excizia i transferul ADN-T. In esen, pentru ca ADN-T s fie transferat este necesar prezena secvenelor marginale de 25 pb (notate de obicei TL sau T) i, cel puin n cazul unor anumite plasmide Ti, existena unui element suplimentar localizat n afara ADN-T (n partea dreapt). Acest element, denumit n limba englez "overdrive", stimuleaz procesul de transformare (are funcie de "enhancer"). Excizia ADN-T este iniiat de aciunea combinat a proteinelor VirD1 i VirD2, codificate de operonul virD precum i a proteinelor VirC1 i VirC2, codificate de operonul virC (Lessl i Lanka, 1994).

24

Dintre aceste proteine, rolul cel mai important l are proteina VirD2 care este o endonucleaz de restricie (situs-specific). Ea recunoate marginile ADN-T i le cliveaz (de obicei are loc mai nti secionarea uneia dintre catenele ADN-T la nivelul marginii din dreapta) genernd un segment de ADN monocatenar lung de aproximativ 20kb, simultan avnd loc sinteza catenei lips. Proteina VirD2 rmne ataat la nivelul captului 5' al ADN T monocatenar protejndu-l, probabil, de aciunea exonucleazelor. De asemenea, la ADN-T se ataeaz proteina VirE2 (aproximativ 600 molecule per ADN-T de 20kb) care, nu numai c protejeaz segmentul monocatenar ci l i convertete la o form corespunztoare pentru transport . Pentru a ajunge n nucleul celulei vegetale, complexul ADN-T-proteine (complex T de 2m traverseze cinci bariere majore: membrana plasmatic i spaiul periplasmic bacterian, peretele celular vegetal, plasmalema celulei vegetale i membrana nuclear. In etapa transportului prin membrana plasmatic bacterian sunt implicate cele 11 gene ale operonului virB dar mecanismul exact al acestui proces nu este nc elucidat. Rolul proteinelor este complex: pe de o parte, protejeaz ADN-T de atacul exonucleazelor i asigur transportul ntr-o form corespunztoare. De asemenea, se pare c proteinele Vir particip i la formarea unor pori la nivelul membranei plasmatice i a membranei externe a bacteriei. n ceea ce privete translocarea prin membrana plasmatic vegetal nu exist o explicaie satisfctoare. Se pare c proteina bacterian virE2 care nsoete complexul virD2 - ADN-T conine dou semnale pentru localizare nuclear (NLS = nuclear location signals) iar proteina virD2 prezint doar un singur asemenea semnal. La procesul de translocare ar mai participa i proteinele codificate de operonii suplimentari virF si virH al c rol ar fi legat de direcionarea complexului ADN-T spre nucleul celulei vegetale i de specificitatea de gazd a tulpinilor bacteriene implicate n procesul de transfer de ADN. Se consider doar c, odat ptruns n citoplasma celulelor vegetale, complexul T (ADN i proteine) este preluat de proteinele vegetale i transportat n nucleu, unde ADN-T este integrat n genom.

25

2.1.3. Integrarea ADN-T n genomul celulei vegetale Ultima etap a procesului de transformare genetic a plantelor este integrarea ADN-T n genomul celulei vegetale.Analiza genetic a plantelor transformate cu ajutorul bacteriilor din genul Agrobacterium a evideniat prezena uneia sau a mai multor copii ale ADN-T la nivelul unor cromosomi diferii. S-a dovedit c, cel puin pentru speciile studiate Crepis capillaris, Lycopersicon esculentum, Petunia hybrida, Nicotiana tabacum), nu exist o preferin pentru un anumit cromosom, procesul de integrare realizndu-se randomic. Spre exemplu, la Crepis capilaris s-a evideniat posibilitatea integrrii ADN-T n oricare dintre cele trei perechi de cromosomi, n timp ce la tomate au fost cartate apte segmente de ADN-T pe cinci cromosomi diferii. Date recente au evideniat c, dup integrare, ADN-T adopt trsturile cromatinei eucariote: formarea de nucleosomi i sensibilitatea la aciunea DN-azei I. Acest din urm aspect sugereaz o integrare preferenial la nivelul regiunilor din genomul vegetal care sunt transcrise (Kahl i col., 1987). Aceast observaie este susinut i de alte date experimentale. Astfel, prin clonarea la nivelul ADN-T a -glucuronidaz) lipsit de promotor, linkat cu o gen selectabil i utilizarea pentru transformare a acestui "construct"s-a reuit exprimarea eficient (n 30% din cazuri) a genelor clonate, dei acestea nu aveau promotor propriu. Explicaia acestor rezultate este aceea c integrarea a avut loc la nivelul unor regiuni active ale genomului vegetal (care sunt transcrise)(Cucu i colab., 1998). De asemenea, o serie de date experimentale au condus la concluzia c integrarea ADN-T are loc att la nivelul exonilor ct i la nivelul intronilor fr a fi observat vreo preferin pentru una sau alta dintre secvene. Mai mult, cercetri recente au artat c integrarea ADN-T s-ar realiza la nivelul unor "puncte fierbini" din genomul vegetal: la nivelul zonelor unde ADN a suferit unele modificri i unde este necesar intervenia enzimelor implicate n procesul reparator (Tinland, 1996). n ceea ce privete mecanismul molecular al integrrii ADN-T n genomul vegetal au fost elaborate mai multe modele. Spre deosebire de alte elemente genetice mobile cum sunt transpozonii sau retrovirusurile animale, ADN-T nu codific nici o protein care s fie implicat n integrarea sa n cromosomii vegetali. n acest fel, singurele proteine bacteriene care pot ajuta procesul de integrare sunt proteinele VirD2 i Vir E2. Deoarece proteina Vir D2este ataat covalent la captul 5' al ADN-T monocatenar, rolul su ar putea fi acela al protejrii secvenei terminale de 25 pb (marginea dreapt a ADN-T), necesar procesului de recunoatere i integrare. Este posibil ca legtura fosfotirozinic prin care Vir D2 este ataat la ADN-T s fie preferat de enzimele gazdei (cum ar fi ligaza) implicate n integrare.
26

Proteina Vir E2 (posibil i alte proteine) "acoper" molecula de ADN-T monocatenar dar eficiena procesului de integrare pare s fie independent de proteina Vir E2. Analizndu-se structura ADN-T integrat s-a evideniat faptul c, n prezena proteinei Vir E2, captul 3' al secvenei de interes prezint scurte deleii; n absena acestei proteine ADN-T sufer deleii majore. Aceste rezultate sugereaz faptul c proteina Vir E2 protejeaz ADN-T de aciunea nucleazelor plantei, ea nefiind implicat direct n procesul de integrare. n acest fel, se poate concluziona c, majoritatea enzimelor implicate n integrare sunt furnizate de ctre celula vegetal (ADN-polimeraza, ligaza, topoizomeraza, helicaza). Spre exemplu, pe baza experimentelor efectuate cu mutante de Arabidopsis thaliana hipersensibile la radiaii care erau incapabile de a realiza integrarea ADN-T, s-a putut evidenia rolul n integrare a proteinelor implicate n procesul reparator. Sintetiznd datele de pn acum se pot enuna cteva concluzii referitoare la procesul de integrare: - integrarea ADN-T nu este situs-specific i nu necesit prezena n ADN vegetal a unor secvene omoloage, fiind deci vorba de un proces de recombinare "nelegitim"; - integrarea ADN-T conduce la apariia unor mici deleii (13-73 pb) ale ADN vegetal, la nivelul situsului de inserie; - captul 3' al ADN-T este mai puin conservat, el suferind unele scurtri cu 3-100 nucleotide. Acest capt are o scurt regiune de omologie (cel puin 5 nucleotide) cu situsul la care va avea loc integrarea; - captul 5' al ADN-T monocatenar este mai puternic conservat n genomul celulei vegetale, iar regiunea de omologie cu situsul de inserie se reduce la o singur nucleotid; - asimetria dintre capetele ADN-T sugereaz c integrarea implic procese diferite. Recombinarea captului 3' presupune implicarea unei foarte scurte regiuni de omologie fiind asemntoare recombinrii plasmidiale din celulele animale, fiind n acest fel un exemplu de recombinare nelegitim tipic. n cazul captului 5', recombinarea sa presupune existena unui mecanism mult mai specific.

27

2.2. Vectori de clonare pentru celula vegetal

Pentru realizarea transferului eficient de gene n celulele vegetale int au fost construii vectori de clonare specifici, de obicei derivai de la plasmidele Ti sau Ri sau de la unele virusuri caracteristice unor specii vegetale. 2.2.1. Vectori plasmidiali Sistemul natural de transfer descris mai sus este impropriu pentru a fi utilizat, ca atare, n scopul ameliorrii plantelor. Pentru a putea fi aplicat, plasmidele Ti au fost modificate drastic, prin eliminarea genelor ce determin producerea tumorilor, prin meninerea i clonarea n alte plasmide, mai mici, doar a regiunilor marginale i a unor promotori ce sunt recunoscui de echipamentul de transcriere al celulelor vegetale. De asemenea, ntre extremitile ADN-T prelucrat, au fost introduse gene marker specifice (nptII, gus, cat, gfp) sub controlul unor promotori corespunztori (Pnos, P35S), obinndu-se vectori de clonare foarte eficieni. Pornindu-se de la constatarea c, pentru a se realiza transferul de material genetic n celula vegetal este suficient s existe extremitile de 25 pb ale ADN-T, au fost fcute diferite ncercri de nlocuire a genelor din interiorul ADN-T cu alte gene, de provenienstrin. Primele realizri n acest sens au fost cele privind obinerea unor vectori cointegrai. Acetia conin la nivelul regiunii ADN-T modificate a unei plasmide Ti o plasmid de la E.coli ce conine, la rndul ei, mai multe elemente genetice: originea replicrii (nefuncional n Agrobacterium), un marker de selecie pentru celulele bacteriene purttoare (de obicei rezistena la un anumit antibiotic) i gena (genele) strin clonat. Un asemenea vector de clonare duce ns la obinerea unui esut tumoral deoarece genele implicate n producerea fitohormonilor nu sunt inactivate. Existena acestor gene n stare activ mpiedic regenerarea de plante ntregi, sau dac ea se realizeaz eficiena este foarte redus iar plantele obinute prezint unele anomalii (Vatafu i colab., 1989). Pentru depirea acestui inconvenient s-au realizat plasmide Ti "dezarmate" (cum este, de exemplu, plasmida pGV3850) la nivelul crora regiunile interne ale ADN-T rspunztoare de oncogenez au fost eliminate. In plus, n locul acestora pot fi inserate alte secvene de ADN. De exemplu, clonarea la nivelul regiunii ADN- T dezarmate a plasmidei pBR322 permite, ulterior, co-integrarea la acest nivel a celor mai multe plasmide folosite n tehnicile de clonare n E.coli, printr-o singur treapt de recombinare (Figura 6).
28

Figura 6. Obinerea unei plasmide co-integrate, n care gena clonat iniial n pBR322 este introdus n pGV3850 (dup Schell i colab., 1985). O problem mai dificil este selecia celulelor vegetale transformate cu un asemenea tip de vectori. Genele de rezisten la antibiotice, provenite din transpozoni bacterieni, nu suntexprimate prin mecanismul de transcriere al celulelor vegetale. Pentru depirea acestui impas s-au construit gene himerice care combin un promotor al unei gene care este funcional n celula vegetal (cum ar fi promotorii genelor pentru sinteza nopalin-sintetazei sau octopinsintetazei, promotori virali de la CaMV etc) cu regiunea ce codific un marker de rezisten la un antibiotic i o secven de terminare a mesajului genetic, tot din ADN-T. Integrarea i exprimarea acestor gene himerice, dup transferul lor mediat de vectorii derivai de la plasmidele Ti, au permis selecia celulelor vegetale transformate pe medii de cultur ce conin antibioticul respectiv (de exemplu, kanamicin). Prin inserarea unor asemenea gene "marker" n vectori dezarmai a fost posibil transformarea celulelor vegetale, urmat de regenerarea unor plante n care se exprim gena respectiv. O alt strategie n transferul de gene n celula vegetal
29

o constituie utilizarea vectorilor "binari", n care regiunile vir i ADN-T (respectiv extremitile de 25 pb repetate direct) sunt separate fizic pe plasmide diferite. S-au obinut astfel sisteme de vectori binari ce constau dintr-o pereche de plasmide, ambele capabile de replicare n Agrobacterium: - o plasmid Ti modificat, dezarmat total (fr ADN-T) ce con ine genele vir; - o plasmid cu spectru larg de gazd (o plasmid de tip "navet", capabil de replicare n E.coli i n A.tumefaciens), ce conine gena ce trebuie introdus n celula vegetal, mpreun cu un marker de selecie pentru celulele vegetale transformate (Figura 7).

Figura 6. Obinerea unei plasmide co-integrate, n care gena clonat iniial n pBR322 este introdus n pGV3850 (dup Schell i colab., 1985). O problem mai dificil este selecia celulelor vegetale transformate cu un asemenea tip de vectori. Genele de rezisten la antibiotice, provenite din transpozoni bacterieni, nu sunt exprimate prin mecanismul de transcriere al celulelor vegetale. Pentru depirea acestui impas s-au construit gene himerice care combin un promotor al unei gene care este funcional n celula vegetal (cum ar fi promotorii genelor pentru sinteza nopalin-sintetazei sau octopinsintetazei, promotori virali de la CaMV etc) cu regiunea ce codific un marker de rezisten la un antibiotic i o secven de terminare a mesajului genetic, tot din ADN-T.
30

Integrarea i exprimarea acestor gene himerice, dup transferul lor mediat de vectorii derivai de la plasmidele Ti, au permis selecia celulelor vegetale transformate pe medii de cultur ce conin antibioticul respectiv (de exemplu, kanamicin). Prin inserarea unor asemenea gene "marker" n vectori dezarmai a fost posibil transformarea celulelor vegetale, urmat de regenerarea unor plante n care se exprim gena respectiv. O alt strategie n transferul de gene n celula vegetal o constituie utilizarea vectorilor"binari",n care regiunile vir i ADN-T (respectiv extremitile de 25 pb repetate direct) sunt separate fizic pe plasmidediferite. S-au obinut astfel sisteme de vectori binari ce constau dintr-o pereche de plasmide, ambele capabile de replicare n Agrobacterium: - o plasmid Ti modificat, dezarmat total (fr ADN-T) ce con ine genele vir; - o plasmid cu spectru larg de gazd (o plasmid de tip "navet", capabil de replicare n E.coli i n A.tumefaciens), ce conine gena ce trebuie introdus n celula vegetal, mpreun cu un marker de selecie pentru celulele vegetale transformate (Figura 7).

Figura 7. Tehnica utilizrii vectorilor binari (dup Tourte, 1998). Toate aceste gene sunt situate ntre extremitile unui ADN-T, sub controlul unor secvene promotor i terminator adecvate (Figura 8). De asemenea, aceasta plasmid mai conine un marker de selecie bacterian, funcii de replicare i, eventual, mobilizare prin conjugare.

31

Figura 8. Reprezentarea schematic a vectorului binar Bin19 (dup Tourte, 1998). 2.2.2. Vectori virali Dei se cunoate c Agrobacterium tumefaciens nu infecteaz monocotiledonatele (cu foarte rare excepii), prin prelucrarea plasmidei Ti a ADNT, n sensul introducerii ntre marginile acestei regiuni a genomului virusului variegrii porumbului, sau a CaMV, s-a reuit transferul respectivelor gene la cereale. Acest tip de infecie a primit denumirea de agroinfecie. n ultimii ani, pentru obinerea de plante transgenice au fost testai i vectori derivai de la diferite virusuri specifice plantelor. Dei la animale cei mai utilizai vectori sunt cei derivai de la retrovirusuri, la plante acest lucru nu s-a realizat pentru c virusurile ce infecteaz plantele sunt mai puin cunoscute la nivel molecular. Printre cele mai studiate virusuri vegetale se numr: virusul mozaicului conopidei (CaMV), virusul latent al maniocului (CLV), virutomatelor (TGMV) etc. Mai mult, dintre virusurile vegetale, asemntoare ca organizare retrovirusurilor animale, cel mai cunoscut este CaMV. Cu toate acestea, dei funciile genelor CaMV sunt asemntoare celor ale retrovirusurilor, spre deosebire de acestea, ele nu se integreaz n genomul celulei vegetale. Un alt exemplu este cel al virusului mozaicului tutunului (VMT), virus cu genom ARN, a crui lungime este 6,5kb, ce codific patru polipeptide: cele dou subuniti ale replicazei, o protein de nveli i o protein important n procesul de infecie al celulelor vegetale nvecinate. Genomul viral a fost prelucrat "in vitro", nlocuindu-se genele pentru proteinele capsidale cu gene marker a cror exprimare s-a urmrit la plantele inoculate. Dezavantajul const n faptul c se pot transfera doar fragmente de ADN cu dimensiuni mici. n orice caz, chiar i n absena unor vectori derivai de la virusuri, o serie de elemente virale sunt deja utilizate pentru construirea vectorilor de exprimare pentru celula vegetal.Este cazul promotorilor genelor pentru ARN 19S i 35S de la CaMV care sunt foarte eficieni,mai ales pentru cereale.

32

Concluzii
Acizii nucleici sunt polimeri ai nucleotidelor. Indiferent de tipul de care aparin (ARN sau ADN), molecula lor este constituit din lungi lanuri polinucleotidice, n care resturile de acid fosforic formeaz legturi diesterice cu cte dou molecule de pentoz la atomul C-3 din una i C-5 din cealalt. Astfel iau natere catene lungi n care resturile de acid fosforic alterneaz cu resturi pentozice la care, la atomii C-1 sunt legate baze azotate. Acest schelet este comun tuturor acizilor nucleici, cu deosebire c n ADN pentoza este dezoxiriboza, iar n ARN - riboza i a faptului c ADN conine adenin, guanin, citozin i timin, iar n ARN sunt prezente adenina, guanina, citozina i uracilul. ntr-un polinucleotid liniar exist legturi glicozidice care leag bazele azotate de pentoz, legturi esterice ntre pentoz i acidul fosforic i legturi diesterice ntre nucleotide. Toate aceste legturi simple, covalente, alctuiesc structura primar a acizilor nucleici, adic compoziia i secvena resturilor de nucleotide n lanul polinucleotidic al acizilor nucleici. Cu alte cuvinte, nivelul primar de organizare structural a ADN i ARN indic natura, proporia i secvena bazelor azotate ale nucleotidelor care constituie macromolecula lor. Alturi de legturile simple, covalente, n moleculele acizilor nucleici exist legturi de hidrogen care joac un rol important n conformaia lor spaial. Structura secundar a fost propus iniial pentru ADN de ctre i pentru ARN. La baza organizrii acestei structuri secundare stau urmtoarele reguli stabilite pe baza datelor experimentale privind compoziia chimic a ADN: 1) Coninutul molar de purine este egal cu coninutul molar de pirimidine, coninutul de adenin este egal cu coninutul de timin (A/T = 1), coninutul de guanin este egal cu cel de citozin (G/C = 1), iar suma cantitii de adenin i guanin este egal cu suma cantitii de citozin i timin: (A + G) = (C + T), sau (A + G) / (C + T) = 1; 2) Cantitatea de grupe 6-aminice care intr n compoziia bazelor azotate ale ADN (adenin i citozin) este egal cu cantitatea de grupe 6-cetonice ce exist n aceste baze (guanin i timin), prin urmare (G + T) = (A + C), sau (G + T) / (A + C) = 1. Particularitile funcionale ale ADN i ARN sunt strns legate de localizarea lor. ADN reprezint materialul de baz al genelor n care sub o form codificat, se pstreaz informaia genetic a organismului care se traduce prin
33

biosinteza proteinelor. Dubla elice i complementaritatea structurii bicatenare constituie baza molecular a fenomenului de autoduplicare sau autoreplicare a ADN n momentul diviziunii celulare i explic faptul c ADN, prin structura sa, reprezint unicul substrat al ereditii. ARN are o alt funcie: de a informa citoplasma asupra caracteristicilor nscrise n codul genetic. Acest lucru se manifest, nainte de toate, n responsabilitatea ARN n sinteza proteinelor i specificitatea moleculelor ce se sintetizeaz. n celul exist trei specii moleculare distincte de ARN: mesager (mARN) sau informaional, ribozomal (ARN) i de transfer (t-ARN). Transferul de gene la plante a devenit posibil datorit descoperirii i a utilizrii sistemului de transformare genetic prin intermediul bacteriilor din genul Agrobacterium (A.tumefaciens i A.rhizogenes). Rezultatele cercetrilor din domeniul geneticii vegetale, bazate n primul rnd pe folosirea plasmidelor Ti de la Agrobacterium tumefaciens, se constituie ntr-un material faptic deosebit de bogat. Vectorii de transfer derivai de la plasmidele Ti, tehnicile de transformare genetic, structura i exprimarea genelor n plantele transgenice au determinat obinerea unor noi cunotine importante att pentru cercetarea fundamental, ct i pentru mbuntirea nsuirilor unor plante de cultur. In concluzie acizii nucleici reprezinta moleculele care pastreaza, transporta si manipuleaza informatia in orice celula vie; iar mecanismele biochimice implicate sunt pe de o parte complexe si pe de alta parte foarte precise. Pot fi impartiti in 2 mari clase, intre care exista diferente structurale si functionale: acidul ribonucleic (ARN) si acidul dezoxiribonucleic (ADN). ADN-ul apare n nucleele celulelor, iar ARN-ul se gaseste mai ales in plasma celulara. Transferul de gene la plante a devenit posibil datorit descoperirii i a utilizrii sistemului de transformare genetic prin intermediul bacteriilor din genul Agrobacterium (A.tumefaciens i A.rhizogenes); plasmidele Ti de la Agrobacterium tumefaciens, se constituie ntr-un material faptic deosebit de bogat.

34

BIBLIOGRAFIE
Modificarea genetic a plantelor: Principii generale de realizare.Aplicaii i controverse; C. P. Cornea; Editura: Facultatea de Biotehnologii, Universitatea de tiine Agronomice i Medicin Veterinar Bucureti, B-dul Mrti 59, Romnia; Plantele transgenice: metode i strategii pentru aplicaii practice; GABRIELA ENEA; Institutul de Genetic, Departamentul Transgenez i Epigenetic, Aleea Portocalelor nr.1-3, Bucureti Genetica plantelor horticole; Teofil Craciun; Editura: AnticariatulTau.ro HAYMES, K.M., DAVIS T.M., 1998, Agrobacterium mediated transformation of alpineFragaria vesca and transformation of transgenes to R1 progeny, Plant.Cell.Rep, 17, 279283; de

35