Izolarea proteinelor vegetale din soia prin electroforeza

Deciu Valentinaa OvidiusUniversity, Department of Chemistry, 124 Mamaia Blvd, 900527, Constanta, Romania __________________________________________________________________________________________ _ Abstract Proteinele vegetale din soia se pot separa prin electroforez. Benzile corespunztoare proteinelor separate, sunt vizualizate prin colorare cu un colorant specific i printr-o scanare densiometric se obin indicaii despre cantitatea relativ a proteinelor din fiecare band separat. Cuvinte cheie: electroforeza, soia, proteine vegetale. __________________________________________________________________________________________ _ 1. Introducere Electroforeza proteinelor pe gel de agaroz este tehnica cea mai uoar i mai puin costisitoare, implicnd o cantitate limitat de materiale, un timp de lucru scurt i o reproductibilitate foarte bun. Separarea electroforetic a proteinelor serice prezint un interes major n testele clinice, datorit importantelor informaii pe care le ofer acestea n diverse afeciuni, precum i asupra modalitilor de tratare a acestora. Proteinele pot fi separate si purificate.Metodele de separare a proteinelor se bazeaza pe proprietatile acestora (sarcina,marime,solubilitate) care variaza de la o proteina la alta. Deoarece multe proteine se lipesc de alte biomolecule,ele pot fi separate si in baza proprietatilor de legare.Sursa proteinelor este in general tesut sau celule microbiene.Celula trebuie sparta si proteina trebuie eliberata intr-o solutie numita extract crud.Cromatografia prin schimb de ioni poate fi folosita pentru a separa proteinele cu sarcini diferite(similar aminoacizilor),asa cum alte metode cromatografice bazate pe alte proprietati pot fi folosite. Metodele noncromatografice include precipitarea selectiva a proteinelor cu sare,acid sau temperaturi ridicate.Pe langa cromatografie exista si metoda bazate pe migratie proteinelor incarcate intrun camp electric,proces numit electroforeza gel,fiind folosit in mod special ca metoda analitica. Avantajele acestei metode sunt vizualizarea proteinelor in timpul separarii permitand cercetatorului o estimare rapida a numarului de proteine intr-un amestec sau a gradului de pastrare a unui anumit preparat protoic. De asemenea,acesta permite determinarea unor proprietati cruciale ale proteinei ca punctul izoelectric si masa moleculara aproximativa. Proteina din soia contine un procent crescut (35%) din aminoacizii glutamina, lizina si altii din categoria celor cu catena ramificata, fata de proteine animale de inalta calitate, ca cele din zer, cazeina, oua si carne (de vaca). De asemenea, soia este bogata in arginina, un aminoacid cu implicatii in procesele imune. Proteinele din soia contin o cantitate destul de mica de metionina, un aminoacid esential, insa concentratele proteice din soia au fost ameliorate prin adaugare de metionina, ceea ce i-a determinat pe unii cercetatori sa compare valoarea nutritiva a suplimentelor din soia cu cele obtinute din lapte si oua. Cele mai multe controverse privind efectele concentratelor obtinute din soia s-au nascut pornind de la descoperirea izoflavonelor, in principal genisteina si daidzeina. Aceste izoflavone au un rol benefic asupra organimsului uman, atunci cand nu depasesc o anumita doza. Pricipalele efecte pozitive se refera la protectia impotriva bolilor
a

cardiovasculare si la scaderea incidentei catorva tipuri de cancer, in special cancerul de san si cel de prostata. Desi mecanismul protectiei impotriva aparitiei cancerului implica mai multe aspecte ale metabolizarii izoflavonelor, cei mai multi oameni de stiinta atribuie acest efect asemanarii intre structura izoflavonelor din soia si cea a estrogenilor. Acesta similitudine permite izoflavonelor sa dizlocuiasca estrogenii de pe receptorii celulari, astfel blocandule activitatea hormonala (mecanismul este similar cu cel al unor medicamente ca Nolvadex sau Tamoxifen care sunt utilizate de multi culturisti pentru a bloca conversia steroizilor anabolizanti in estrogeni, proces care poate duce la feminizare, in principal manifestata prin ginecomastie). 2. Experiment Profilele moleculare de greutate pentru fraciunile de proteine au fost stabilite cu ajutorul SDS-PAGE folosind metoda Laemmli (1970). Probe de proteine (1mgml) au fost pregtite ntr-un tampon care conine 62.5mM Tris-HCl (pH 6,8), 2% SDS, glicerol 10%, 5% 2-mercaptoetanol, iar 0,002% bromfenol. Probe de proteine (15ml), au fost ncrcate pe gel. Electroforeza SDS-PAGE a fost efectuata pe o placa cu gel si electrodul tampon (pH 8,6) a continut Tris 25mm, 192mm glicin i 0,1% SDS. Gelul de separare a fost de 12,5% acrilamid concentraie final n timp ce de stivuire gel a fost de 3% concentraie. Mic i mare gama de markeri moleculari de greutate (markeri Sigma, SigmaAldrich Co, Marea Britanie) au fost ncrcate n paralel cu probe (5 mm). Dup colorarea (albastru strlucitor R) i decolorarea gelurile au fost analizate cu ajutorul documentaiei sistemului SYNGENE Gel care utilizeaz un program software-Gene Tools, ambele furnizate de Genetic Research Instrumentation Ltd, (Braintree, CM7 8TF, Marea Britanie). Greutile aproximative moleculare i cantitile (%) de proteine din fiecare banda au fost stabilite cu ajutorul programului Gene Tools. 3. Rezultate si discutii Cinci fraciuni au fost colectate dup fracionare, dup cum urmeaz: R (0,1) i P (0,1), retentate i ptrunde prin Sepraphore III (0,1 mm) membrana,

respectiv, R (0,05) i P (0,05), retentate i ptrunde prin Celgard 3500 (0.05 0.02mm) membrana, respectiv, i RP (0.1-0.05), retentate pe Celgard 3500 (0.05x0,02 um), alimentat cu ptrund prin intermediul III Sepraphore (0.1mm) membran. Fraciunile de protein obinute au fost analizate pentru profilurile lor n materie de distribuie de ncrcare i de mrime (greutate molecular). Tehnica de electroforeza SDS-PAGE a fost folosita pentru a analiza distribuia dimensiunii fraciunilor n termeni de greutate molecular n timp ce IEF a fost folosit pentru a stabili distribuia incarcaturii pentru speciile moleculare n fraciuni proteice. Fig. 1 prezint profilurile SDS-PAGE pentru fraciunile alturi de cele pentru SPI convenional extras, extract brut, i proteine din zer de soia. Cantitile de proteine, n fiecare band de detectabile (exprimat ca procent din total de proteine, n toate benzile detectabile ntr-o anumit band), sunt rezumate n Tabelul 1. Extractul brut a avut unsprezece benzi detectabile, conform programului Gene Tools.. Acestea au fost situat la aproximativ 80, 76, 65, 50,1, 35, 33, 28.4, 22, 20, 14,6 i 3.6kDa.

Fig. 1. Profiluri SDS-PAGE pentru fractiunile separate: MH, gama mare de markeri moleculari de greutate;ML, gama redusa de markeri moleculari de greutate; Banda 1, extract crud; Banda 2, proteina izolata de soia conventionala [SPI]; Banda 3, retentate pe Sepraphore III (0.1 mm) membrana [R(0.1)]; Banda 4, (patrunde prin Sepraphore III (0.1 mm) membrana [P(0.1)]; Banda 5, retentate pe Celgard (0.050.02 mm) membrana [R(0.05)]; Banda

6, patrunde prin Celgard (0.050.02 mm) membrana [P(0.05)]; Banda 7, retentate pe Celgard (0.050.02 mm) membrana, hranita de Sepraphore III (0.1 mm) membrane patrunde [RP(0.10.05)]; W, proteina de soia din zer.

80, 76 i 50.1kDa, respectiv, (Iwabuchi & Yamauchi, 1987). Dou subuniti acide ale globulinei 11S sunt identificate la 35, i 33kDa, dou subuniti de baz ale globulinei 11S de la 22kDa (Kim, Park, si Rhee, 1990) i 20kDa (Nielson, 1985).

Unele dintre acestea pot fi identificate dup cum urmeaz: a,a si b de subuniti de globulina 7S la Tabelul 1 Profilele cu greutate molecular, cu procente de band corespunztoare pentru fraciunile de proteine separate Fraciunile k cu greutatea molecular (kDa)

CE, extract; SPI, proteina izolata de soia conventionala; R(0.1), retentate pe Sepraphore III (0.1 mm) membrana; P(0.1), patrunde pe Sepraphore III (0.1 mm) membrana; R(0.05), retentate pe Celgard (0.050.02 mm) membrana; P(0.05), patrunde pe Celgard (0.050.02 mm) membrana; RP(0.10.05), retentate pe Celgard (0.050.02 mm) membrana, hranita Sepraphore III (0.1 mm) membrana patrunde; W, soy whey (the supernatant after precipitation at pH 4.5). Ca o observaie general, cele mai importante componente n benzile de toate fraciunile sunt cele de la 20 i 35kDa urmat de 50.1kDa. ntr-adevr, cea mai mare fraciune, care reprezint peste 40% din totalul de semine de soia globulina, este globulina 11S. Profilul pentru SPI urmeaz ndeaproape pe cea a extractului brut, n benzile de componente principale, i astfel pentru c R (0,1), o diferen notabil fiind epuizarea din aceste fraciuni de benzi ntre 22 i 33kDa, care corespund n principal din 11S globulina. Aceste benzi sunt dotate cu mai proeminent n zerul de soia. Retentate membrana 0.1mm, arat creteri uoare n procente ale benzilor 80, 76, 50,1, 41 i 15.6kDa n timp ce cele pentru 20 i 14.6kDa sunt uor sczut. R retentate (0.05) arat o compoziie similar, n benzile de mare greutate moleculara de la 50.1, 65, 76 i 80kDa, dar a expus urme de 28,4 i 22kDa benzi, care nu au fost detectabile n SPI i R (0,1). Acesta prezint, de asemenea, o uoar cretere n banda de 20kDa. Cei doi ptrunde, P (0,1) i P (0,05) au avut diferene majore n compoziie comparativ cu SPI i cele dou retentates. Ei nu aveau att benzile de greutate molecular ridicat la 65, 76 i 80kDa i cele de la 35 i 41kDa. n plus, P (0,05), fracie lipseau, de asemenea, benzile de 22, 28,4 i 33kDa. Se afieaz toate acestea, creterile mari n benzile inferioare de greutate moleculara de la 3.6, 15.6, i 20kDa. P (0,1) prezentat benzi suplimentare, dar abia detectabil la 60, 28.4 i 22kDa, n timp ce 20 i 14.6kDa benzi au fost semnificativ crescut. Fracia intermediar, RP (0.1 - 0.05) nu are, de asemenea, benzile de greutate molecular ridicat la 65, 76, i 80kDa, dar a fost observat s fi mbogit n banda de 60-kDa, care este identificat a fi b-amilaz (Iwabuchi & Yamauchi , 1987). Benzile cu greutate molecular de la 3.6, 14.6, 15.6 i 20kDa sunt, de asemenea, a crescut n comparaie cu cele din celelalte dou retentates. Profilele IEF pentru fraciunile proteice, convenional izolat (SPI) i zer de soia sunt prezentate n Fig. 2. Nu au existat diferene notabile ntre profilele de SPI i a fractiei R (0,1). Acest lucru este cel mai probabil datorit faptului c aceast retentate cuprins de cea mai mare parte a proteinelor din materia prim (SPI), cu o transmisie a proteinelor de peste 12%. Cu toate acestea, permeatul P (0,1) au artat mbogire a speciilor cu

PI la aproximativ 4.6 i 4.7 i epuizarea acestor specii cu PI de mai sus 5.1. Aceeai tendin a fost observat pentru R (0.05) i (0,05) fraciunile P, cu excepia faptului c gradul de mbogire i de epuizare este mai mare n acest din urm caz. Fracia intermediara, RP (0.1 - 0.05), a prezentat o compoziie intermediar. PI 4.6 i 4.7 benzi s-au mbogit ntr-o msur mai mic n comparaie cu cele dou ptrunde n timp ce panoul de mai sus, cu PI 5.1 a fost uor fa de cele epuizate pentru cele dou rententates. Zer a fost dovedit a avea dou benzi de la pI 9,3 i 7,2, care nu sunt expuse de oricare din de alte fracii. Este, de asemenea, compus dintr-un grup de benzi ntre pI 4.0 i 5.1, cu o band puternic la IP 4.6.

ridicarea sau scaderea greutatii moleculare a proteinei cu diferite solubilitati, emulsifiere si proprietati de spumare .specii care prezint funcionalitate superioar au identificat in investigarea prorietatilor and a-7S subunits (80 and 76 kDa, respectively) a SPI Aceste fraciuni s-au dovedit a fi bogate in molecule cu puncte de izoelectric de mai sus 5.1. fraciunile cu IP cuprins ntre 5,1 i 4,5 prezenta cele mai sracafuncionalitate. Extracia convenional a SPI de precipitatile isoelectrice la ph de 4,5, nu se recupereaz de cele mai multe ori, deoarece globulina 11S ramane in solutie sub forma de supernatata, cum este redat in fig 6. Bibliografie * E-mail : valy_deciu@yahoo.com Michael J. Lewis, Some functional properties of fractionated soy protein isolates obtained by microfiltration, 2006. Xianghong Li, Yun Li, Yufei Hua, Aiyong Qiu, Cheng Yang, Steve Cui, Effect of concentration, ionic strength and freeze-drying on the heat-induced aggregation of soy proteins, 2007. Mashahiko Samoto, Motohiro Maebuchi, Chiaki Miyazaki, Hirofumi Kugitani, Mitsutaka Kohno, Motohiko Hirotsuka, Makoto Kito, Abundant proteins associated with lecithin in soy protein isolate, 2006.

[1]. Bernard E. Chove, Alistair S. Grandison,

[2].

[3].

Fig. 2. Profile IEF pentru fraciunile separate: proteine din soia conventional prescurtat spi; retentate R (0,1) pentru Sepraphore III (0,1 mm), cu membran, P (0,1), ptrunde prin Sepraphore III (0,1 mm), membrane; R (0,05), de la retentate Celgard (0,05 mm, 0,02 mm), cu membran, P (0,05), ptrunde prin Celgard (0,05 mm, 0,02 mm), cu membran; RP (0.1-0.05), retentate din Celgard (0,05 mm 0,02 mm) membran, alimentat cu Sepraphore III (0,1 mm), cu membran ptrund, W, proteina de soia din zer; M, pI markers. 4. Concluzii Folosind cele doua membrane in procesul microfiltarii pentru separarea de fractiuni distincte SPI , demonstrat pentru imbogatire si anume prin