O legatura critica intre receptori Toll-like 3 si interferoni de tip II, cai de semnalizare n imunitatea inascuta antivirala.

Receptorii Toll-like (TLRs) i RIG-I/MDA5 coopereaz n infeciile cu virusuri. Conventia a fost c activarea acestor ci de receptori de tip I evoc raspunsul IFN este importat rolul receptorilor Toll-like 3 (TLR3)-dependente de tip II, cale de semnalizare IFN n raspunsul imunitar antiviral innascut. In grupul Coxsackievirus serotipul B III (CVB3),este un membru al virusului pozitiv-catenar ARN a familiei Picornaviridae i cel mai rspndit virus asociat cu dilatarea cardiomiopatiei cronica . Deficitul de TLR3- la soareci prezint o vulnerabilitate la CVB3, nsoit de miocardita acuta, ntruct in expresia transgenica de TLR3 inregistreaza tipul I, chiar IFN insuficient la soareci , dar are rezistenta la CVB3 i alte tipuri de virusi, cu condiia ca interferoni de tipul II IFN in semnalizare rmne intact. Luate mpreun, rezultatele noastre indica o cooperare critic a RIG-I/MDA5- a IFN de tip I i-TLR3 de tip II. Sistemul imun innascut folosete un arsenal de dou clase de de acid nucleic-senzor,de molecule,de receptori mpotriva infeciilor virale, i anume, membrana-ligant areceptorilor Toll-like (TLRs) i receptori citosolilor,care includ acidul retinoic-inductibil, proteine de tip I (RIG-I), i diferenierea-melanom asociate genei 5 (MDA5) (1). Caracteristica de activare a acestor receptori este inducerea de tip I IFN (de tip I IFN sau IFN-/), o familie de citokine vitale pentru aprarea mpotriva viruilor (4 2) ntr-adevr, soareci cu deficit de IFN tip I semnalizeaza o scadere la diveri virui, fie in infectiile acute sau cronice , deoarece au defecte nimunitatea nnscut eficace i la raspunsul imunitar adaptativ(5,6) n schimb, RIG-I i MDA5 citosolice ARN detecteaza receptorii care funcioneaz n mai multe tipuri de celule pentru a induce tipul I de IFN prin recunoaterea ARN-ului dublu-catenar (dsRNA) (4, 8). DsARN este un activator proeminent a sistemului imun innascut i este materialul genetic transmisibil n anumite clase de virus sau de un produs de cei mai multi virusi ca parte a ciclului lor de via (9).

Receptorii citosolici RIG-am i MDA5 colaboreaza cu fiecare alt receptor pentru a evoca IFN I raspunsul imun innascut prin recunoaterea diferitelor elemente structurale care sunt derivate din dsARN viral (10, 11). n contextul activari de imunitate antiviral innascuta a dsRNA, este interesant ca TLR3 este, de asemenea, un receptor dsRNA de recunoatere, dar este localizate n membrana endosomala (12, 13). De asemenea, expresia nivelurile de RIG-I/MDA5 si TLR3 este stimulat de de tip I de IFN ,semnalizarea indic un sistem pozitiv de regulament, feedback-ul i cooperarea reciproc ntre aceste clase de receptori (8, 14, 15). Astfel, sistemul imunitar utilizeaz mai multe strategii pentru virusul derivat dsRNA pentru a asigura gazd raspunsuri imunitare in imunitatea antivirala innascuta Proprietile TLR3 sunt nc controversate (16, 17). In conformitate cu rapoartele anterioare, TLR3 contribuie la eliminarea viusurilor ARN specifice,cum ar fi virusul encephalomyocarditis (EMCV) (18), dar contribuia acesteia la distrugerea virusului gripal si virusului Was Nile n plus, exist dovezi c TLR3 este esenial pentru aprarea gazdei mpotriva infeciilor de anumite Virusuri ale ADN-ului. n acest studiu, vom folosi CVB3 ca un instrument cu care s ctige introspecie n interdependenele funcionale dintre TLR3 i RIG-I/MDA5. CVB3 este un membru irecuperabil pozitiv ARN-ul virusului familiei picornaviridae cauzeaza miocardita severa,pancreatita ,hepatita si meningita. n special, CVB3-mediat in miocardita e asociata cu cardiomiopatie dilatativa cronica si e o preocopare majora pentru sanatatea publica; pn n prezent nu e eficace pt o profilaxie sau tratament doar pt o rezolutie de infectie cu CVB 3. Ne arata ca soarecii cu deficit de TLR3 sunt mai vulnerabili la CVB3 n schimb, expresia transgenica de TLR3 reduce nivelul viremiei n stadiile incipiente ale infectiei i promoveaz supravieuirea soarecilor chiar i atunci cnd au trecut pe tipul I de IFN-semnal de deficit de fond (Ifnar1 /). Efectul protector al TLR3 mpotriva infeciei CVB3 isabrogated de tratament cu un anticorp mpotriva IFN-(numit de tip II, denumit n continuare importana unei TLR3 de tip II. Exista c TLR3-tip IFN pentru confort), subliniind astfel

II

,calea

de

semnalizare

IFN

de

asemenea,

dovezi contribuie,

la rspunsurile imune antivirale fa de alte tipuri de virusi a ARN-ului i ADN-ului. Cele dou clase clasic cunoscute de citokine cu activiti antivirale, de tip I i II, IFN, pot s coopereze funcional n ceea ce privete semnalizare TLR3-i RIG-I/MDA5-mediate, n timpul raspunsului imun antiviral innascut. TLR3 joaca un rol important impotriva CVB3. Pentru a supravieui, multe virusuri au evoluat strategii de a se sustrage de inducie genele IFN i / sau pentru a inhiba IFN cale de semnalizare (6, 29). n acest context, CVB3 are, de asemenea, un mecanism nc neclar, dar puternic pentru a atenua IFN inducie gena: Inducerea de IFNmRNA n macrofagele peritoneale a soarecelui (PEC), sau in fibroblaste embrionare a soarecelui (MEFs) asupra CVB3 infeciilor a fost de aproape nedetectabile, ntruct un eficient IFN-inducie a fost observat n celulele infectate cu virusul stomatitei veziculoase (VSV) sau virusul herpes simplex de tip I (HSV1). Pe de alt parte, inducerea de citokine, cum ar fi interleukina (IL) -1 i IL-12p35 a fost gsit n CVB3-infectate PEC la fel de eficient ca n CPMs infectate cu alte virusuri , sugernd lipsa de IFN tip I inducerea genei este seletiva. In special, CVB3 de replicare a fost mult mai eficient n TLR3(deficit de TLR3 dect n tipul slbatic, indicnd o contribuie important de activare CVB3-mediat a TLR3 la un rspuns antiviral. Activare de TLR3 , CVB3 a fost, de asemenea, evident de o depreciere sever n inducie a ARNm de citokine inflamatorii, IL-1, IL-12p35, i IL-12p40, n TLR3 . Aceste rezultate ne-a determinat s ne ntrebm dac TLR3 contribuie la apararea gazdei impotriva infectiei CVB3 in vivo, pe care a fost testata de ctre inocularea de tip slbatic i TLR3 / soareci cu 5 104 plaqueforming de uniti (PFU) de CVB3. Dezvoltarea Miocarditei n TLR3 / soareci infectati cu CVB3. Deoarece CVB3 este cea mai raspandita, virusul asociat cu cardiomiopatie dilatativ (27, 28), sa monitorizat cursul de histopatologice i replicarea viral n inimile soarecilor de tip slbatic i TLR3 / soareci in timpul infectiei CVB3 .

oareci au fost infectati cu 5 104 PFU de CVB3, i inimile au fost colectate i apoi examinate prin colorarea cu tricrom Masson. Seciuni din inima de soareci de tip salbatic au aratat focare mici mprtiate de infarct miocardic i leziuni perivasculare inflamatorii la 12 zile postinfectant (pi). n schimb,in sectiuni de inima la soareci TLR3 au artat numeroase leziuni miocardice. Pentru a compara gradul de rspndire a virusurilor n inimile acestor soareci, sa realizat o analiza imunohistochimic cu ajutorul anti-CVB3 anticorpi. In inimile soarecilor cu TLR3 s-au vazut numeroase focare miocardice pozitive CVB3dect inimile de tip slbatic de la animale postinfectate 9 zile . S-a examinat, de asemenea, expresia CVB3 pozitiv-irecuperabile ARN genomic in tesutul cardiac n timp real RT-PCR.

Inducerea de IFN de tip II i inflamatii prin TRIF.

TRIF-este o molecula adaptor critic necesar pentru receptorul de semnalizare TLR3 . Infectia cu CVB3 folosind molecula Trif / la soareci sa vazut o crestere de 10 ori a titrul virusului mai mare n serurile de soareci de tip salbatic, dup infectia cu CVB3 . n inimile soarecilor cu Trif induciea de IFN-i IL-12p40 a fost ablated, n timp ce IFN-mARN de inducie a fost de neschimbat . Aceste rezultate indic faptul c calea TLR3-TRIF contribuie la aprarea gazdei mpotriva infectiei cu CVB3 i, n acest caz, transmite semnale care duc la inducerea de IFN de tip II, si citokine inflamatorii, mai degrab dect de IFN tip I. Deoarece IL-12 este un stimulator bine-stabilit de IFN de tip II inducie, sa investigat dac urmtorul IFN tip II de inducie n CVB3 infectai inima a fost un efect indirect al IL-12 semnalizare prin analiza soarecilor cu deficit de dou ori n IL-12p35 i P40. Nu sa vazut nici o reducere substanial n abundena IFN-transcrieri n inimile de soareci cu deficit de dou ori dup infectia cu CVB3.

mpreun, aceste rezultate prezena unui TLR3-Si TRIF-dependent, Dar independenta, de tipul II de IFN cale de inducie in inimile CVB3-infectate.

indica IL-12-

Contribuia de TLR3 mpotriva CVB3 de infectare, n absena de tip I de IFN in semnalizare.

Rezultatele obtinute anterior mpreun cu rapoartele anterioare sugereaz faptul c sistemul imunitar innascut antiviral const n dou arme principale: un tip de citosolice, RIG-I/MDA5-activated in IFN rspuns i un tip de TLR3 activat II-IFN / in raspunsul citokinelor inflamatorii. Aceste dou componente ale imunitii probabil exercita funciile lor, prin cuplarea cu fiecare altul pentru un raspuns antiviral. TLR3 exprimat de gen era pe deplin funcionala n termenii si conditiile de inducie hiper de IL-12p40 de ctre un bine-stabilit agonist, poli (I: C) (fig. S2D, S2E). Aceast observaie a fost fcut cu dou linii independente transgenice, prin urmare, este puin probabil ca aceasta amplificare semnal se datoreaz inactivarii accidentale sau activare a locusului genei independent de gen integrata Cum era de asteptat, expresia transgenica de TLR3 puternic sensibilizata pentru soareci poli (I: c)-mediate de raspunsuri oc. Interesant, un ADN microarray analizat a artat c nu exist nici o cretere semnificativ a nivelului de de IFN de tip I in ARNm TLR3 Tg-PEC, dei sa observat o cretere foarte puternic n expresia de citokine inflamatorii, in ARNm. Aceste rezultate susin n continuare ideea c activarea caii TLR3 nu evoca un tip puternic de IFN. Pentru a examina contribuia caii TLR3 mai departe, sa trecut la soareci cu TLR3-Tg cu Ifnar1 / soareci (TLR3-Tg Ifnar1 / oareci), permind astfel obinerea in perspectiv mai mult n TLR3 de raspunsuri imune antivirale, n absena tipului I de IFN . Cum era de asteptat, celulele din TLR3-Tg Ifnar1 / soareci a exprimat niveluri foarte sczute de RIG-I, MDA5, i proteine kinaza R (PKR), dar a exprimat niveluri ridicate de TLR3. Examinarea histologic, de asemenea, a artat c infectia cu CVB3 a dus la formarea de aglomerri de CD11b hematopoietice CD45 la celulele din ficat de TLR3-Tg Ifnar1 / soareci

Interesant, aceste celule CD11b-au exprimat niveluri ridicate a tipului II de IFN i IL-12p40. Deoarece aceste fenomene nu au fost observate n Ifnar1 / soareci, deducem c mobilizarea rapid de celule CD11b n ficat i de producie de tip II IFN i a altor citokine depind de TLR3 a caii de semnalizare i de prevenire a daunei ficatului. IFN de tipul II, in crestere integrala in molecula efectoare de TLR3. In continuare sa evaluat genele care sunt reglementate de TLR3 n timpul infectiei CVB3 sa comparat ARNm din Ifnar1 / comparativ cu TLR3-Tg Ifnar1 / ficat, folosind microarrays ADN-ului i RT-PCR. Aceste rezultate sugereaza faptul ca IFN de tip II poate fi un ridicat critic efector ale TLR3 n ficat CVB3-infectate. Este, de asemenea, posibil ca chemokines revelate n gama noastr sunt critice pentru rspunsurile antivirale ctre celulele CD11b de recrutare. Importana IFN de tip II in semnalizare n rspunsul antiviral a fost apreciata de mai muli ani, desi putin se stie despre modul de raspuns a tipului II,de IFN ca este provocat in timpul infectiei virale. CONCLUZII n studiul de fa, s-au folosit soareci TLR3 si TLR3/-TG pt a examina contributia TLR3 la raspunsl imunun. Studiul nostru a relevat un rol critic a TLR3cale de semnalizare n protecia gazdei impotriva unui virus care determina cardiomiopatie dilatativa cronica ,o majora problema de sanatate. Studiul ridica, de asemenea, mai multe alte aspecte interesante. n primul TRIF, dei este cu siguran implicat, nu se tie ca la modul n care TLR3-TRIF rezultatele in inducerea de tip II IFN. rnd, prezent

Deoarece inimile de la soarecii cu deficit si de tip salbatic IL-12p35 si P40 nu au aratat nici o diferenta semnificativa in IFN ,sa dedus ca TLR3-TRIF ar putea induce IFN II,desi e necesar si o alta analiza. O alt problem este posibilitatea ca funcionarea TLR3 si a IFN de tip II in infectia virala poate arata specificitatea celulelor si organelor. Aceste rezultate sugereaz c pentru a monta un rspuns eficient antiviral mpotriva CVB3, oricare dintre cele dou cai ar putea fi eficace n ficat, n timp ce inducerea de tip I IFN este insuficienta in inma.

De asemenea, este demn de remarcat faptul c inducerea in vitro de tip II IFN mRNA de CVB3 infeciilor a fost de-abia detectabil n tipul slbatic Pecs, sub condiia la care citokine inflamatorii mRNAs au fost induse eficient (fig. 1B i datele nu sunt prezentate), dar a fost semnificativ indus n inim de ctre CVB3 infecie. Astfel, activarea precum i contribuiaTLR3-tip II IFN cale poate depinde de celule context, mecanism de care necesit o analiz suplimentar. MATERIALE SI METODE -Celule si soareci -infecti virale. CVB3 (Nancy tulpina), VSV, i HSV1 au fost pregtite aa cum este descris anterior. -Ser Biochimie. Serice ale ALT i AST au fost msurate la SRL, Inc -Analiza statistic. Diferenele dintre grupurile de control i experimentale au fost evaluate cu ajutorul testului t Student. Curbele de supravieuire au fost analizate cutestul log-rank. Testele statistice utilizate software-ul PRISM (Graphpad).