TEHNICI DE SEPARARE SI CONCENTRARE IN BIOTEHNOLOGII

2011 - 2012

ETAPELE SI CARACTERISTICILE PROCESELOR DE BIOSINTEZA

Ce inseamna biotehnologie?

TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA

Ce inseamna biotehnologie?
Biotehnologie = toate formele de cercetare biologic, fie c este vorb de fabricarea brnzei, obinerea berii sau tehnologia ADN-ului recombinat

TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA

Ce inseamna biotehnologie?
Biotehnologie = doar tehnici biologice moderne:
ADN recombinat, tehnologii de hibridizare, anticorpi monoclonali.

TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA

Ce inseamna biotehnologie?

TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA

DEFINITIA AMPLA
Biotehnologia = orice tehnic ce utilizeaz

organisme vii sau pri ale acestora pentru:

a elabora sau modifica produse, a mbunti plante sau animale, a dezvolta microrganisme cu utilizri

specifice.

TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA

DEFINITIA RESTRANSA
Biotehnologia = utilizarea industrial a ADN

recombinat, a fuziunii celulare i a noilor tehnici de bioprelucrare.

TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA

 Etimologie:

Bios = viata Tehnologie = technos (mestesug) + logos (stiinta)

Definitia Federatiei Europene de Biologie (1978): Utilizarea integrata a

biochimiei, microbiologiei si ingineriei in scopul obtinerii unei aplicatii tehnologice (industriale), cu ajutorul microorganismelor, culturilor de celule si a partilor componente ale acestora.
TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA
9

BIOTEHNOLOGIE

TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA

10

PROCESUL BIOTEHNOLOGIC (BIOPROCES)

Un proces biotehnologic (bioproces) necesit o abordare
pluridisciplinar, interdisciplinar.

TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA

11

PROCESUL BIOTEHNOLOGIC
Punerea la punct a unui bioproces industrial necesit o strns colaborare ntre specialiti din diverse domenii:
biochimie, genetica, enzimologie, microbiologie, inginerie biochimica.

TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA

12

Dezvoltarea proceselor biotehnologice

De la IDEE pana la transpunerea la SCARA INDUSTRIALA sunt necesare mai multe etape care necesita cunostinte din diverse domenii (INTERDISCIPLINARITATE) Ex: obtinerea unui produs (insulina) aplicand tehnica ADN recombinat

TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA

13

INGINERIE GENETICA

MICROBIOLOGIE INGINERIE DE PROCES (BIOINGINERIE)

TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA
14

REACTIE CHIMICA

REACTII BIOCHIMICE

Fenomene de transfer

Fenomene de transfer

PROCES CHIMIC PROCES BIOCHIMIC

TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA
15

 Procesul chimic: proces de baza in tehnologia chimica Procesul biochimic (biologic): proces de baza in biotehnologie Principalul scop al biotehnologiei: obtinerea de produse / servicii utile activitatii umane cu ajutorul organismelor vii.

TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA

16

CARACTERISTICILE BIOPROCESELOR PARTICULARITATI

1. Capaciti de producie foarte variate:
20 milioane t/an (etanol) mai puin de 20 kg/an (insulin, interferon, anticorpi monoclonali)

TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA

17

Produse majore obtinute prin biotehnologii

TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA

18

Produse majore obtinute prin biotehnologii

TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA

19

CARACTERISTICILE BIOPROCESELOR PARTICULARITATI

2. Produsele de biosintez se gsesc deseori ntr-o concentraie foarte sczut n masa de reacie evacuat din bioreactor (lichidul de fermentaie);

TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA

20

CARACTERISTICILE BIOPROCESELOR PARTICULARITATI

3. Separarea produsului se realizeaz n mai multe etape, acest lucru ducnd la creterea costurilor; costul separrii poate atinge n unele cazuri 90 % din costul total al procesului biotehnologic (tab. 1.2);

TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA

21

Costul separrii bioproduselor ca fraciune din costul total de producie

Sursa
Celule de biomas de drojdie Produse de mare tonaj Enzime extracelulare

Produsul
Proteine monocelulare, extract de drojdie Acid citric, lactic, malic Amilaze, proteaze Penicilin

Costul separrii (% din costul total)

5 10 50 10 20 50

Antibiotice Antibiotice noi Enzime/proteine intracelulare

Insulin, interferon

60
90

TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA

22

CARACTERISTICILE BIOPROCESELOR PARTICULARITATI

4. Lichidele de fermentaie au comportare de fluid nenewtonian abordare specific n proiectarea echipamentelor n care se realizeaz procese de transfer de impuls, cldur i mas;
TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA
23

CARACTERISTICILE BIOPROCESELOR PARTICULARITATI

5. Produsele de biosintez, n special cele cu mas molecular mare:
sunt labile termic i chimic, sunt sensibile la fore de forfecare i la tensiuni interfaciale ridicate;

Acest lucru face ca procedeele clasice de separare (distilarea, de exemplu) s nu poat fi utilizate;
TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA
24

CARACTERISTICILE BIOPROCESELOR PARTICULARITATI

6. n lichidele rezultate n bioprocese, alturi de produsul util exist o serie de compui secundari (impuriti) ale cror caracteristici fizice i chimice sunt similare cu ale produsului util; Asemnarea proprietilor face foarte dificil separarea;

TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA

25

CARACTERISTICILE BIOPROCESELOR PARTICULARITATI

7. Produsele de biosintez, n special cele cu mas molecular ridicat, prezint o mobilitate foarte redus.

TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA

26

SEPARAREA PRODUSELOR DE BIOSINTEZA

Concentraia produselor de biosintez poate varia pe o plaj foarte larg de valori:
sute de g/L (etanol, acid citric); mg/L (anticorpi recombinai); g/L (factorilor de coagulare ai sngelui).

TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA

27

SEPARAREA PRODUSELOR DE BIOSINTEZA

n cazul produselor aflate n concentraie ridicat izolarea/purificarea nu pune probleme deosebite, putndu-se realiza prin intermediul operaiilor unitare clasice utilizate n industriile de proces De ex., separarea i concentrarea etanolului prin distilare.
TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA
28

SEPARAREA PRODUSELOR DE BIOSINTEZA

n cazul produselor aflate n concentraii sczute, alturi de cantiti considerabile de impuriti (factori de snge, anticorpilor monoclonali sau proteine recombinate), separarea i purificarea este mult mai dificil i evident mai costisitoare.

TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA

29

SEPARAREA PRODUSELOR DE BIOSINTEZA

Exist o relaie direct ntre preul de vnzare al produselor de biosintez, pre care reflect costurile de producie, i concentraia bioprodusului n mediul de cultur (fig. 1.3).

TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA

30

TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA

31

TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA

32

PURITATEA PRODUSELOR DE BIOSINTEZA

Cerinele de puritate ale produselor de biosintez sunt diferite. n funcie de destinaia acestora este stabilit nivelul maxim acceptabil de impuriti, precum i natura acestora. Produsele terapeutice de uz uman vor avea cele mai mari exigene de puritate, n timp ce enzimele industriale se situeaz la polul opus (fig. 1.4).
TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA
33

Puritatea produselor de biosinteza

Diferite nivele de puritate sunt necesare pentru produse diferite.

TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA

34

Exemplu de reglementare a compoziiei unei proteine terapeutice recombinate

Puritate > 99 %

Agregate
Proteine din celula gazd Acizi nucleici (majoritar ADN) Endotoxine Virui Celule i particule

<1%
< 1 ppm < 100 pg per doz < 5 UE* per kg mas corporal > 12 log reducere nedectabile

Substana solubil
*UE = unitati de endotoxine

< 1 ppm

TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA

35

Puritatea produselor de biosinteza

Puritatea produsului:

masa de produs Puritate (masa de produs) (masa impuritati lor)

Activitatea specifica a produsului:

unitati de activitate biologica Activitatea specifica masa produsului

Randament:
masa de produs separata Randament masa de produs alimentata in proc. de sep.
TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA
36

FAZELE UNUI PROCES BIOTEHNOLOGIC

UPSTREAM PROCESSING DOWNSTREAM PROCESSING CAPTURAREA PRODUSULUI UTIL SEPARAREA PRODUSULUI UTIL PURIFICAREA PRODUSULUI UTIL Pregtirea mediului de cultur

BIOPROCES
Selecionarea microorganismelor

CONDIIONAREA PRODUSULUI

BIOPRODUS

AMBALARE

TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA

37

FAZELE UNUI PROCES BIOTEHNOLOGIC

Prelucrarea masei de reacie n aval de bioreactor este dictat de numeroi factori, doi dintre acetia fiind fundamentali:

natura produsului de biosintez obinut; faza n care se gsete acesta n urma procesului de biosintez.

n funcie de aceti factori, la care se adaug cerinele de puritate, se sintetizeaz schema tehnologic de separare care asigur obinerea produsului dorit n condiii de eficien economic (respectiv cu costuri totale minime).
TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA
38

SINTEZA SCHEMELOR TEHNOLOGICE DE PRELUCRARE N AVAL DE BIOREACTOR

(DOWNSTREAM PROCESSING)

 Elaborarea unei scheme de flux tehnologic pentru recuperarea i purificarea unui produs de biosintez este un proces creativ, bazat pe experiena i imaginaia inginerului de proces.

TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA

40

 Dei exist ncercri de transpunere a experienei acumulate n programe de calculator, sub forma sistemelor expert, majoritatea inginerilor cu experien se bazeaz pe cteva reguli de bun sim tehnic, cunoscute i ca reguli euristice.

TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA

41

REGULI EURISTICE
1.
2.

3.
4. 5.

Iniial se ndeprteaz impuritatea aflat n cantitatea cea mai mare; Iniial se ndeprteaz impuritatea cel mai uor de separat; Cea mai dificil i mai costisitoare separare se realizeaz la sfrit; Se alege acel proces de separare care face apel la diferena maxim ntre proprietatile produsului i proprietile impuritilor; Se aleg i se introduc alternativ n schema de separare procese care utilizeaz diferite fore motoare pentru realizarea separrii.
TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA
42

Produse de biosinteza
n funcie de dimensiuni i de masa molecular, produsele de biosintez pot fi:
molecule de mici dimensiuni (solveni organici, chimicale fine, antibiotice, hormoni, aminoacizi, vitamine), molecule de dimensiuni mari (proteine, polizaharide, acizi nucleici), produse particulate (celule, spori, lipozomi, particule subcelulare).
TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA
43

Categorii principale de produse de biosintez n funcie de mrimea acestora

Produsul Exemple Masa moleculara (Da) Raza tipica

Zaharuri Molecule mici Aminoacizi Vitamine Acizi organici Proteine

200 600 60 200 300 600 30 300 103 106

0,5 nm 0,5 nm 1 2 nm 0,5 nm 3 10 nm

Molecule mari

Polizaharide
Acizi nucleici Ribozomi Virui

104 107
103 1010

4 20 nm
2 1000 nm 25 nm 100 nm 1 m 4 m 10 m

Produse particulate

Bacterii Celule de drojdii Celule animale

TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA

44

Clasificarea produselor de biosintez n funcie de faza n care se gsesc

Tip de produs Exemple

Concentratie [g/L]

Extracelular Intracelular Celula nssi

alcooli, acizi organici aminoacizi, enzime, antibiotice proteine pe baz de ADN recombinat

100 20 10 30

drojdie de panificaie, proteine monocelulare

TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA

45

 Indiferent de faza n care se gsete produsul util, prima etap n prelucrarea n aval de bioreactor este separarea masei celulare de lichidul de fermentaie (se aplic regula euristic nr. 1: se

ndeprteaz impuritatea aflat n cantitatea cea mai mare)

SEPARATE THE BEST FROM THE REST

46

TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA

Prelucrarea ulterioar va merge pe una din cele trei ci redate n fig. 1.6, n funcie de faza n care se gsete produsul biosintetizat:
Supernatant RECUPERARE PURIFICARE PRODUS EXTRACELULAR

FERMENTARE

SEPARARE LICHID-SOLID PRODUS INTRACELULAR

RECUPERARE Celule DEZAGREGARE CELULE PRODUS CELULAR

PURIFICARE

RESTURI CELULARE
TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA
47

Biosepararea in patru etape (RIPP)

Bulion de fermentatie

Recuperare

Separare insolubile Izolare produs

Recovery

Izolare

Isolation

Purificare

Purificare primara Purificare avansata

TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA

Purification

Purificare avansata

Polishing
48

Obiective si operatii unitare tipice la biosepararea in patru etape (RIPP)

Treapta
Separare insolubile

Obiective
- ndeprtarea celulelor, resturilor celulare si a impurittilor insolubile - reducerea volumului de prelucrat - ndeprtarea componentelor cu proprietti diferite de ale produsului - reducerea volumului de prelucrat

Operatii unitare tipice

- filtrare - sedimentare - extractie - adsorbtie - extractie - adsorbtie - ultrafiltrare - precipitare - cromatografie - metode bazate pe afinitate - cristalizare fractionat - precipitare fractionat

Izolare produs

Purificare primar

- ndeprtarea componentelor cu proprietti similare cu ale produsului

Purificare avansat

- ndeprtarea lichidelor - trecerea produsului n form cristalin

- uscare - cristalizare
49

TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA

Structura generalizat a prelucrrii n aval de bioreactor

Pentru fiecare tip de produs (extracelular sau intracelular) exist mai multe alternative de prelucrare. Alegerea unei alternative de prelucrare i selectarea operaiei (operaiilor) unitare corespunztoare se face innd cont de:
proprietile produsului, proprietile impuritilor, proprietile microorganismelor, celulelor sau esuturilor productoare.
TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA

50

RECUPERARE INTERMEDIAR

Sinteza procesului tehnologic de separare va consta n alegerea succesiunii operaiilor n conformitate cu cele 5 reguli euristice prezentate anterior, pe baza structurii redate n fig. 1.7.

BIOREACTOR
Produse intracelulare Produse extracelulare

RECUPERARE PRIMAR

RECOLTARE CELULE

Centrifugare Microfiltrare Ultrafiltrare

NDEPRTARE BIOMAS

DEZAGREGARE CELULE

Omogenizare Mcinare cu bile oc osmotic

EXTRACIA PRODUSULUI

NDEPRTARE RESTURI CELULARE Centrifugare Microfiltrare Filtre la vid Filtre pres

Soluii apoase bifazice Solveni organici Adsorbie strat expandat Adsorbie discontinu Fluide supercritice Micele inverse Distilare extractiv

Filtrare la vid Centrifugare Microfiltrare Ultrafiltrare Filtre pres Filtre lumnare Flotaie

Corpi de incluziune
RENATURARE Dizolvare Rempturire

CONCENTRARE
Ultrafiltrare Evaporare Osmoz invers Precipitare Cristalizare Extracie Adsorbie Distilare

Se cere puritate ridicat

Se cere puritate sczut

PURIFICARE FINAL

PURIFICARE FINAL

DESHIDRATARE

(NDEPRTARE Pentru forma solid final

SOLVENT)

Cromatografie Diafiltrare Electrodializ Electroforez

Atomizare Congelare Uscare n tvi

TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA

51

RECUPERAREA PRIMAR
reprezint prima etap a procesului de prelucrare n aval de bioreactor; n aceast etap are loc o oarecare purificare i o reducere a volumului de material supus prelucrrii; alegerea cii de urmate depinde de locul n care se gsete produsul:
intracelular; extracelular.
TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA
52

TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA

53

RECUPERAREA INTERMEDIAR

are drept scop concentrarea i purificarea produsului reducerea volumului prin concentrare este n concordan cu regulile euristice 1 i 2
TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA
54

PURIFICAREA FINALA

ine cont de cerinele de puritate ale produsului obinut. De regul produsele farmaceutice (antibiotice, hormoni, etc.) necesit o puritate ridicat, n timp ce produsele industriale (enzime pentru detergeni, solveni, acizi organici, etc.) necesit o puritate relativ sczut, ce poate fi asigurat prin deshidratare sau, mai general, prin ndeprtarea solventului.
TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA
55

EXEMPLE DE SCHEME TEHNOLOGICE

Sinteza, separarea i purificarea unui compus extracelular, cu valoare relativ sczut i cerine de puritate obinuite acidul citric. Sinteza, separarea i purificarea unui compus intracelular, cu valoare ridicat i cerine calitative nalte insulina.

TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA

56

Biosinteza acidului citric

Etapa de fermentare Etapa de recuperare

Etapa de izolare

TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA

57

Etapa de recuperare primar Etapa de fermentare

Etapa de reacie

Etapa de purificare final

Biosinteza insulinei

TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA

58

CRITERII PRINCIPALE PENTRU O PRELUCRARE EFICIENT N AVAL DE BIOREACTOR

Inginerul de proces are de ales ntre diverse ci de prelucrare a masei de reacie. Pentru fiecare cale de prelucrare exist mai multe operaii unitare posibil de aplicat, iar fiecare operaie unitar se poate realiza n cteva tipuri de echipamente.
TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA
59

EXEMPLU
Separarea masei celulare de lichidul de fermentatie:
Sedimentare gravitationala; Sedimentare centrifugala; Filtrare; Microfiltrare.

Sedimentarea centrifugala:
Centrifuge tubulare; Centrifuge cu camere; Centrifuge cu cos neperforat; Centrifuge decantoare; Centrifuge cu talere:
Cu retinerea solidelor; Cu evacuarea solidelor.

TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA

60

ESTE UTIL DE TIUT:

Dac produsul are o valoare de piaa ridicat, gradul de recuperare trebuie s fie ct mai ridicat;
TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA
61

ESTE UTIL DE TIUT:

Echipamentele alese trebuie s aib o fiabilitate ct mai nalt;

TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA
62

ESTE UTIL DE TIUT:

Numrul etapelor de prelucrare trebuie redus la minimum, n acest mod scznd costurile de investiii i de exploatare; TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA

63

ESTE UTIL DE TIUT:

Procesul ales trebuie s asigure o reducere de volum considerabil de la bulionul de fermentare iniial pn la fluidul din faza final de recuperare a produsului: O reducere cu minimum trei ordine de mrime (1000 : 1) ar fi rezonabil;
TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA
64

ESTE UTIL DE TIUT:

Prelucrarea trebuie s conduca la un bulion epuizat final uor de reciclat, pentru a face posibil recuperarea nutrienilor neconsumai;
TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA
65

ESTE UTIL DE TIUT:

Prelucrarea n aval de bioreactor trebuie nceput imediat ce bulionul prsete seciunea de fermentare: orice ntrziere sau stocare necesit vase de stocare costisitoare, existnd i posibilitatea deteriorrii sau contaminrii produsului din bulion;
TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA

66

ESTE UTIL DE TIUT:

ntrucat n majoritatea proceselor biotehnologice concentraia produsului este sczut, costul pe unitate de volum de bulion procesat n recuperarea primar va avea o pondereTEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILAde producie. nsemnat n costul final

67

 Alegerea metodei de recuperare este influenat i de alte criterii, cum ar fi:

locul i starea n care se afl produsul, concentraia produsului, proprietile fizico-chimice ale produsului, aplicaiile acestuia, cerinele de minim puritate, caracteristicile fizico-chimice ale impuritilor, preul de pia al produsului, etc.

TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA

68

Categorii de produse de biosintez

Caracteristici Productie Valoare de pia Puritate cerut Costuri de separare Etape de separare Tehnologia de separare Produse low-tech mare (peste 1.104 kg/an) mic (sub 100 $/kg) mic (maximum 90 95 %) mici (sub 50% din costurile totale) puine clasic, fr probleme deosebite solventi (etanol, butanol, aceton) acizi organici aminoacizi proteine monocelulare enzime industriale antibiotice Produse high-tech mic (sub 1.104 kg/an) mare (peste 1000 $/kg) mare (uzual peste 99 %) mari (pn la 90% din costurile totale) numeroase sofisticat vitamine pigmenti enzime de diagnoz enzime terapeutice vaccinuri proteine terapeutice

Exemple

TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA

69

Produse LOW TECH

Separarea i purificarea acestor produse se poate realiza folosind o succesiune de operaii unitare clasice, cunoscute i aplicate frecvent n industriile de proces: filtrare, centrifugare, flotaie, extracie cu solveni, adsorbie, precipitare, evaporare, uscare, etc.
TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA
70

Produse HIGH TECH

Pentru separarea i purificarea acestor produse, operaiile unitare clasice nu sunt suficiente, fcndu-se apel la o serie de tehnici noi, de cele mai multe ori concepute iniial pentru operare la scar de laborator i ulterior transpuse la scar industrial: ultracentrifugare, dezagregare mecanic, precipitare fracionat, cromatografie n strat fix, ultrafiltrare, dializ, diafiltrare, osmoz invers, liofilizare, etc.
TEHNICI DE SEPARARE Lucian GAVRILA
71