Elemente de Toxicologie Medico-Legal

Motivaie In ultimii ani s-a observat o cretere enorm a interesului public pentru metodele i disciplinele criminalistice stimulat mai ales de rezolvarea unor cazuri penale spectaculoase. Publicul consider n general c medicii legiti sunt n fruntea luptei mpotriva urgiilor lumii moderne, cum ar fi terorismul internaional i traficul de droguri. Aceast lucrare de toxicologie medico-legal sau judiciar este consacrat, n principal analizei celor mai importante clase de droguri si otrvuri. Prin urmare, aici sunt tratate probleme reale i relativ recente ale toxicologiei medicolegale, cum ar fi analiza markerilor pentru alcool, toxicologia remediilor din plante i farmacogenomica aplicat n toxicologia medico-legal. Nu au fost uitate domeniile de interes mai puin recente, cum ar fi conducerea automobilelor i medicamentele, analiza unor substane neconvenionale, analiza cazurilor de dopaj i asigurarea calitii n analiza toxicologic. Un accent deosebit a fost pus pe screening-ul toxicologic. Scopul acestei lucrri este, de aceea, de a prezenta critic informaiile la zi referitoare la metodele de separare i analiz aplicate n diferite discipline ale tiinei criminalistice. O carte nu poate i nu ar trebui s nlocuiasc lucrrile tiinifice, n ceea ce privete profunzimea i clarificarea unei probleme specifice. Aceast carte a fost scris nu numai pentru criminaliti, ci i pentru publicul larg interesat de problemele medico-legale i, de asemenea, pentru ali colegi interesai, n special de aspectele de analiz a unor substane sau materiale toxice sau cu caracter de drog. Lucrarea ar trebui, totui, s prezinte problemele toxicologice relevante, n evoluia lor, importana potenial a domeniului i perspectivele de viitor. Studenii de la cursurile de masterat n criminalistic vor aprecia probabil aceast introducere n domeniul toxicologiei criminalistice i vor folosi lucrarea drept trambulin pentru realizarea unor cercetri de masterat i, n coninuare de doctorat. Structura general a acestui volum corespunde celor mai importante discipline criminalistice care aplic diferite metode de separare, i anume, toxicologia, chimia i serohematologia judiciar. Capitolele dedicate toxicologiei medico-legale sunt axate pe anumite clase de droguri ilicite i terapeutice i pe alte substane de interes criminalistic. De asemenea, unele probleme specifice toxicologiei medico-legale, cum ar fi medicamentele i conducerea autovehicolelor, controlul antidoping, asigurarea calitii n analiza criminalistic, separrile chirale i strategia general de analiz sunt discutate separat. n partea consacrat chimiei medico-legale, cele mai importante probleme sunt analiza explozivilor i a acceleratorilor de incendiu.

Procedurile analitice de screening sunt printre strategiile de baz ale toxicologiei criminalistice i sunt prezentate n detaliu n lucrare i se refer la cele mai importante metode cromatografice, cum ar fi GC, GC-MS, HPLC, LC-MS, CE i LC-ICPMS. n plus, n fiecare capitol sunt tratate anumite clase de droguri, iar metodele preliminare (n principal imunoteste) sunt prezentate mpreun cu metodele separare. In practica medico-legal, este imposibil s se separe metodele preliminare cum ar fi imunotestele de cele foarte sigure i confirmative cum sunt tehnicile cromatografice. Iai, 2011 Dr. Gabi Drochioiu, Facultatea de Chimie, Universitatea Al. I. Cuza Iai

Cuprins Introducere n toxicologia judiciar. Prezentarea domeniului. Doze toxice i stabilirea nocivitii Istoria toxicologiei judiciare. Investigarea decesului de ctre toxicologi. Tehnici analitice de laborator Materiale de analiz: snge, urin, alte fluide, materiale vegetale, prafuri i droguri. Analiza firului de par Otrvirea accidental. Moartea prin supradoz de droguri. Sinuciderea cu otrav Crima prin otrvire. Investigaia toxicologic a otrvirilor. Pregtirea probei judiciare pentru analiza fizico-chimic. Pregtirea probei pentru analiz. Detecia i clasificarea. Otravuri nevolatile Otrvirea cu metale. Gaze toxice. Diverse otrviri. Prelevarea de probe de la cadavre Toxicocinetica. Metabolizarea otrvurilor n corp. Absorbia distribuia i eliminarea Absorbia alcoolului, distribuia i eliminarea. Toxicodinamie Analiza toxicologic. Tehnici i strategii de sampling a probelor judiciare. Analiza fizicochimic. Metode de analiz n toxicologie. Electroforeza. Cromatografia n strat subire. Cromatografia de lichide de nalt performan. Cromatografia de gaze. Spectroscopia. Tehnici imunologice. Aplicaii. Otravirea cu pesticide Otravirea cu cianuri Alcaloizi & Substante cancerigene Problema alcoolului. Droguri Otravirea cu medicamente Interpretarea datelor toxicologice. Surse de eroare. Estimarea erorilor n analizele toxicologice. Incertitudini aferente msurtorilor analitice Caracterizarea msurtorilor i a rezultatelor. Interpretarea unui buletin de analiz fizico-chimic.
3

Studii de caz. Teste de culoare. Tehnici de microdifuziune. Probleme speciale Metodologia de lucru n toxicologia judiciar. Principalii compui investigai: alcoolul, otrvurile i drogurile. Mrturia toxicologului n instana de judecat. Analiza drogurilor i amestecurilor complexe de droguri prin GC-MS. Analiza contaminanilor prin tehnici de spectrofluorescen. Identificarea surselor cu potenial toxic. Studiul metaboliilor din sisteme biologice. Probleme teoretice speciale n toxicologia judiciar Concluziile cursului Bibliografie generala

Abrevieri 6-AM ACN APCI CE CE-MS CI CID CSF DAM DEA DHC DMOA EMIT EIA ESI FAB FID FPIA FITC GC HPLC

6-Acetilmorfin Acetonitril Ionizare la presiune atmosferic (Atmospheric pressure chemical ionization) Electroforez capilar Electroforez capilar- spectrometrie de mas Ionizare chimic Disociere indus de coliziune (Collision-induced dissociation) Fluid cerebrospinal Diacetilmorfine Dietilamin Dihidrocodeine Dimetiloctilamin Enzyme multiplied immunoassay technique Enzim-imunodeterminare Ionizare cu electropulverizare (Electrospray ionization) Fast atom bombardment Flame ionization detector Fluorescence polarization immunoassay Fluorescein isotiocianat Gas cromatografie Cromatografie de lichid de nalt performan (High-performance liquid
4

IDS LCMS LOD LOQ LSD M6G MDMA MEKC MeOH PTFE POD RIA RP SFE SPE SPME TEA TFA TLC TMCS TMS TSP QTOF

(chromatography) International Diagnostic Systems Corporation Lichid cromatografie cuplat cu mas spectrometrie Limit de detecie Limit cuantificare Dietilamida acidullui lisergic Morfin-6-glucuronida 3,4-Metilenedioximetamfetamin Cromatografie capilar prin electrocinetic micelar Metanol Politetrafluoroetilen Peroxidaz Radioimunodeterminare (Radioimmunoassay) Faz invers (Reversed phase) Supercritical fluid extraction Extracie n faz solid Microextracie n faz solid Trietilenamin Acid trifluoroacetic Cromatografie n strat subire (Thin-layer chromatography) Trimetilclorosilan Trimetilsilil Ionizare prin termospray Quadrupole-time-of flight

TOXICOLOGIA MEDICO-LEGAL SAU JUDICIAR (Forensic Toxicology)

Cap. I. Introducere n toxicologia judiciar. Prezentarea domeniului. Istoria toxicologiei judiciare. Investigarea decesului de ctre toxicologi. Probele de analiz. Cuprinsul capitolului: 1. Introducere 2. Istoria toxicologiei medico-legale 3. Decesele investigate de toxicologi 4. Analiza toxicologic 5. Laboratoarele de medicin legal 6. Interpretarea rezultatelor 7. Toxicologul ca martor expert 8. Intrebri i probleme 9. Bibliografie i note

1. Introducere n toxicologia judiciar Toxicologia medico-legal sau judiciar are drept obiect de activitate punerea n eviden a toxicilor i metaboliilor lor n organe, lichide biologice, corpuri delicte. Toxicologul analizeaz fluidele biologice i esuturile victimelor presupuse a fi fost otrvite accidental sau intenionat. Acesta are rolul de a dovedi crimele prin otrvire, stabilirea sinuciderilor i, mai recent, urmrete activitatea laboratoarelor clandestine de sintez a unor droguri. Toxicologia medico-legal reprezint aplicarea toxicologiei i a unor tiine nrudite, cum ar fi chimia analitic, farmacologia i chimia medical la investigarea decesului, otrvirii accidentale sau intenionate sau la depistarea drogurilor. Important este investigaia toxicologic, utilizarea metodelor i tehnicilor de lucru pentru obinerea i interpretarea rezultatelor i, mai puin, aspectul legal. Toxicologul judiciar este interesat de studiul urmelor de la scena unei crime, dovezile fizico-chimice, existena pulberilor, a urmelor i a oricrei substane chimice. Acesta determin ce substane chimice sunt prezente, n ce concentraie i care este efectul probabil asupra unei persoane. Deoarece determinarea unei substane ingerate este complicat de procesele de metabolizare i diluare n corp, este necesar s se studieze metabolizarea substanelor toxice n corp. Astfel, n cadrul cercetrilor criminalistice (mai precis de toxicologie medico-legal) se preleveaz i se analizeaz probe de urin, snge, pr, fluide orale, etc.
6

Recent, toxicologia ca tiin a cptat amploare, incluznd o gam larg de direcii de lucru, inclusiv evaluarea implicaiilor i riscurilor utilizrii produselor farmaceutice, a pesticidelor i a aditivilor alimentari, precum i studii de otrvire profesional, expunerea la poluarea mediului, efectele radiaiei, i n mod regretabil, rzboiul biologic i chimic. Cu toate acestea, toxicologul criminalist este cel care a deinut titlul de toxicolog pentru cea mai lung perioad de timp. Toxicologul criminalist este preocupat, n primul rnd, de detectarea i cuantificarea otrvurilor n esuturile i fluidele organismului obinute la autopsie sau ocazional, n snge, urin sau coninut gastric, obinute de la o persoan vie. Odat ce analiza este complet, toxicologul criminalist interpreteaz rezultatele din punct de vedere fiziologic i / sau al efectelor comportamentale ale otrvii asupra persoanei de la care s-a prelevat proba. n cazul esuturilor colectate la autopsie, rezultatele analitice pot dezvlui faptul c victima a murit prin otrvire. n organismele vii, prezena unui medicament sau drog ntr-o prob de snge sau urin poate explica coma, convulsiile sau un comportament neobinuit. Lucrarea de fa i propune s aduc n faa cititorilor cele mai importante descoperiri n domeniul amintit, s prezinte modul de folosire a tehnicilor de lucru n criminalistic i sdescrie modul de folosire a rezultatelor n instana de judecat. Sunt descrise pe larg majoritatea metodele utilizate, cu referire deosebit asupra celor utilizate la depistarea i determinarea cantitativ a drogurilor, alcoolului, otrvurilor, medicamentelor toxice n doze mari. Totui, din gama destul de vast a metodelor fizico-chimice pe care criminalistica le are la ndemn, n cadrul lucrrii vor fi menionate doar aspectele relevante, incluznd i exemple de aplicaii privind exploatarea metodelor moderne de analiz GC-MS i FT-IR. Se dau informaii asupra modalitilor actuale folosite n asigurarea controlului i calitii msurtorilor toxicologice cu aplicaii n criminalistic. Progresele tehnologiei tiinifice utilizate de ctre laboratoarele criminalistice moderne i a criminalitii necesit cunotine n domeniile tiinei naturale, de biologie, chimie, fizic i matematic. Aceste laboratoare, de obicei, necesit o diplom n una sau mai multe dintre aceste domenii pentru angajare la nivelul de baz. Multe persoane cu masterat i doctorat de sunt serologi, toxicologi i utilizatori de microscop. A crescut numrul colegiilor i universitilor care acord diplome universitare i postuniversitare n domeniul tiinei criminalistice, inclusiv a toxicologiei medico-legale. Criminalistul din laborator are o carier interesant, plin de realizri i acesta poate fi un absolvent de facultate care s-a specializat n una sau mai multe dintre tiinele naturale. 2. Prezentarea domeniului. Dozele toxice i stabilirea nocivitii Toxicologia judiciar se ocup cu detectarea substanelor toxice i a drogurilor n esuturile i fluidele corpului. Toxicologul analizeaz fluidele biologice i esuturile victimelor care se presupune c au fost otrvite accidental sau intenionat. Cunoaterea proprietilor otrvurilor este necesar pentru a nelege mecanismele de aciune toxic care conduc la leziuni biochimice sau la alterri histologice i pentru stabilirea metodologiei de analiz. De asemenea, izolarea, identificarea i dozarea toxicilor sunt necesare att pentru scopuri criminalistice, n caz de deces, dar i pentru supravegherea mediului (aer, ap, alimente), ct i pentru stabilirea circuitului toxicilor n organism.
7

Combaterea simptomelor de otrvire presupune tratarea lor, precum i elaborarea de msuri profilactice i stabilirea concentraiilor maxime admisibile. Otrvurile pot fi produse i de plante (alcaloizi, glicozizi), de animale (ptomaine, veninuri), de mucegaiuri (micotoxine), etc. Toxicologul, spre deosebire de chimistul criminalist, se ocup n primul rnd de materialele biologice i poate detecta otrvuri n snge, urina, lichidul cefalorahidian, coninutului gastric, bil, i esuturi. n trecut, omul a cunoscut intuitiv sau prin observaie proprietile toxice ale unor substane de origine mineral, vegetal sau animal. Aceste cunotine au fost aplicate mai trziu, dup ce omul a nceput s ucid animale, la fabricarea sgeilor otrvite (curara). Totodat, omul a utilizat antidoturi mpotriva otrvurilor de origine vegetal i animal (veninuri). 2.1 Noiunea de otrav Noiunea de toxic deriv din grecescul toxikon (otrav), care, dup Dioscoride (sec. I d. H.) deriv de la toxon(arc) i se refer la sgeile otrvite. Se mai afirm c toxikon provine de la egipteanul tako (distrugere, moarte). Dup Pliniu (sec. I d.H.), termenul toxicus deriv de la taxus, o specie de conifer ale crui fructe erau folosite la nveninarea sgeilor i despre care se tie astzi c i datoresc toxicitatea alcaloidului taxin. Cuvntul otrav provine de la verbul slav otraviti (a mhni, a tulbura sntatea sufleteasc). Termenul de otrav se refer numai la toxicul folosit n scop criminal. De asemenea, exist noiunea de venin, derivat de la venenum (otrav); n accepiunea modern, prin venin se nelege curent toxina elaborat de unele specii de animale. Noiunea de toxin se refer la substanele organice produse de organismele animale sau vegetale, capabile s genereze intoxicaii. n cadrul toxicologiei intr numai micotoxinele, nu i toxinele bacteriene i helmintice. Prin toxic, Galenus (sec. II d.H.) nelegea orice lucru care poate altera organismul nostru. n sec. VIII Jabir ibn Hayyan (Geber) ar fi artat c otrvurile i manifest aciunea nu numai prin natura lor, ci i prin locul i timpul utilizrii, forma otrvii, caracteristicile individuale ale omului. Paracelsus (1493-1541) introduce noiunea de doz. Orice substan care, atunci cnd este luat n cantitate suficient, cauzeaz probleme de sntate sau moartea poate fi considerat otrav. Expresia cheie n aceast definiie este "cantitate suficient". Paracelsus a observat nc n sec. al 16-lea c "Toate substanele sunt otrvuri; nu este nici una care s nu fie o otrav. Doza potrivit face diferena dintre o otrav i un remediu. Cantiti mici de arsenic, cianur i alte otrvuri pot fi ingerate fr a manifesta toxicitate aparent. In edictul dat de Ludovic al XIV-lea n 1682, referitor la afacerea otrvurilor, se arta c: Tot ceea ce provoac o moarte rapid sau afecteaz un timp sntatea omului, indiferent dac este vorba de un corp simplu sau compus, trebuie privit ca o otrav adevrat. Dup Ogier (1853-1913), toxicul sau otrava este orice substan a crei prezen n organism nu este nici normal, nici obinuit. Fabre i Truhaut consider c toxic este substana care, dup ptrunderea n organism n doz relativ ridicat (unic sau repetat la
8

intervale scurte) sau n doze mici (repetate timp ndelungat) determin, imediat sau dup o perioad de laten, n mod trector sau persistent, alterarea uneia sau mai multor funcii ale organismului, putnd duce la moarte. O concepie asemntoare ntlnim i unii autori arabi: Tot ceea ce se absoarbe scrie Al-Biruni (973-1048) n Cartea drogurilor se mparte n alimente i otrvuri, iar ntre cele dou categorii se situeaz medicamentele ele sunt vtmtoare n comparaie cu alimentele i curative n comparaie cu otrvurile, iar aciunea lor curativ se manifest numai atunci cnd sunt utilizate de un medic priceput i scrupulos. De aceea, ntre ele i alimente exist aa-numitele alimente medicamentoase, iar ntre ele i otrvuri, aa-numitele medicamente toxice. Relaia medicament-otrav este definit succint de Gerolamo Mercuriali (1530-1606): Otrava este un medicament mortal. 2.2 Grupe de otrvuri n investigarea unei otrviri, este necesar mai nti izolarea i identificarea otrvii de ctre toxicolog. Astfel, toxicologii criminaliti clasific otrvurile pe grupe, n funcie de metoda utilizat pentru a izola substanele din esuturile sau fluidele corpului. Grupa I: Gaze. Majoritatea gazelor de importan toxicologic nu sunt detectabile n probele prelevate pentru autopsie. Cu toate acestea, unele pot fi izolate din esutul pulmonar sau din snge prin procesele de aerare. De obicei, probe de aer sunt colectate de la locul faptei. Grupa II: Vapori de otrvuri volatile. Compuii din aceast grup sunt izolai prin distilare cu vapori. Proba (snge, urin sau omogenatul tisular) se aciduleaz cu acid clorhidric sau se alcalinizeaz cu oxid de magneziu solid. Un flux de abur este trecut peste eantion i otrvurile volatile sunt ndeprtate prin distilare ntr-un distilat apos. Otrvurile distilabile dintr-un mediu acid includ tetraclorura de carbon, cloroform, etanol, cianuri, metanol, fenoli, nitrobenzeni i fosfor galben. Otrvurile distilabile dintr-un mediu alcalin includ amfetaminele, anilina, meperidina, metadona i nicotina. Grupa III: Otrvuri metalice. Metalele sunt izolate din esut prin distrugerea tuturor compuilor organici coninui n esut. esutul poate fi distrus de cldura excesiv (incinerare uscat) sau prin fierbere cu acizi concentrai sau ageni oxidani puternici (incinerare umed). Pentru a identifica anumite otrvuri metalice rmase n cenu pot fi folosite diverse metode. Grupa IV: Otrvuri organice nonvolatile. Acest grup conine cele mai multe dintre medicamentele de interes pentru toxicologi astzi. Compuii din aceast grup sunt de obicei prezeni n esuturi numai n cantiti foarte mici. Unele medicamente (de exemplu, barbituricele) pot fi extrase direct din omogenatele tisulare, cu ajutorul solvenilor organici. Cu toate acestea, muli compui sunt adesea separai de cea mai mare parte a esutului matrice, prin prepararea unui filtrat de esut fr proteine. Acest filtrat este apoi supus la

extragerea selectiv cu solveni organici, n diferite condiii de aciditate. Folosind aceste tehnici, drogurile sunt clasificate n cinci subgrupuri. 1. Acizi tari (de exemplu, clorotiazide, salicilai) 2. Acizilor slabi (de exemplu, acetaminofen, barbiturice) 3. Neutre (de exemplu, meprobamate, metaprylon) 4. Baze (de exemplu, codein, fenotiazine, stricnin, chinin) 5. Amfoterice (de exemplu, hidromorfon, morfin) Grupa V: Otrvuri diverse. Aceast grup include toate otrvurile neclasificate n ultimele patru grupe. Substanele incluse n aceast grup sunt anioni anorganici (de exemplu, brom), ioni organici foarte uor solubili n ap (de exemplu, curara, fluoroacetat, paraquat) i compui organici insolubili n ap sau alcool. n general, trebuie folosite tehnici specifice pentru izolarea i identificarea acestor compui din probele biologice. n efectuarea unei analize, toxicologul are la dispoziie toate tehnicile moderne de chimie analitic. n cazul n care otrava care a provocat moartea este cunoscut, poate fi efectuat o anumit analiz; cu toate acestea, n cazul n care agentul nu este cunoscut, sau este suspectat prezena mai multor otrvuri, toxicologul trebuie s efectueze mai nti o serie de analize, pentru a determina care sunt substanele toxice prezente i apoi pentru a stabili prin analiz cantitativ, cantitatea din fiecare substan toxic prezent n diferite probe. Dei numeroase metode chimice sunt disponibile toxicologului, doar o parte dintre procedurile cele mai comune sunt discutate. Toate aceste metode pot fi aplicate la analiza calitativ (identificarea) i cantitativ (concentraie).

2.3 Otrav i medicament Multe dintre medicamentele utilizate n prezent au un potenial toxic. Asemnarea dintre toxic i medicament a fost observat nc din antichitate. Grecii foloseau termenul de pharmakon cu sensul att de medicament, ct i de otrav. Explicaia acestui comportament comun nu poate fi dat dac ne meninem n graniele biologiei moleculare actuale. ntr-o viziune structural-fenomenologic (Drgnescu, 1990), fiinele vii sunt considerate ca fenomene care se manifest pe structuri materiale i, de aceea, ele cuprind mai mult dect un singur nivel de organizare (structurare), cel molecular. Plantele manifest un nivel de organizare biostructural care, mpreun cu nivelul molecular coexistent, formeaz materia biosic (Macovschi, 1968, 1972). Nivelul de organizare biostructural confera plantelor i vieuitoarelor n general nsuirea de viu. Animalele mai prezint un altreilea nivel de structurare, cel psihostructural, suportul pe care se manifest n lumea nconjurtoare emoiile, sentimentele i tririle specifice animalelor dar i omului (Papacostea, 1979). Omul este posesorul unui al patrulea nivel, caracteristic autocontienei i gndirii abstracte (Macovschi, 1979). Aceste nivuri se afl ntr-o anumit armonie ntre ele ntr-un corp sntos, indiferent dac acesta este o plant, un animal sau un om. Perturbarea echilibrului dintre nivelurile de structurare specifice lumii
10

nconjurtoare poate conduce la starea de boal, iar n cazul intoxicaiilor, perturbarea echilibrului dintre niveluri poate fi provocat de o substan strin corpului. Alte substane permit reechilibrarea organismului viu. Att medicamentele, ct i toxicii sunt capabili s modifice acest echilibru. Deplasarea echilibrului, care se poate face ntr-un sens sau altul, poate determina vindecarea unei boli, o stare toxic sau chiar moartea organismului n cauz. Substanele proprii corpului, n general, nu afecteaz acest echilibru, iar alimentele, n doze normale, sunt transformate n substane proprii fr efecte toxice. 2.4 Tipuri de otrvuri. Intoxicaii i otrviri Otrvurile pot fi de origine mineral, vegetal sau sintetic. Dup constituie chimic sunt toxici anorganici, organici etc., iar dup comportarea analitic pot fi otrvuri sau toxici gazoi, volatili, minerali, organici nevolatili, acizi, baze, oxidani etc. Comportare fiziopatologic i separ ca toxici cu aciune asupra sistemului nervos central, sistemului nervos vegetativ, aparatului respirator, sistemului cardiovascular, sngelui i organelor hematopoietice. Otrvurile au multiple proveniene: toxici industriali, medicamente, plante toxice, pesticide, detergeni, materiale plastice, aditivi alimentari, toxine (zoo- i fitotoxine), substane toxice de lupt etc. Otrvirea sau intoxicarea este un rspuns al organismului fa de agresiunea toxic i depinde, n primul rnd, de o proprietate caracteristic a substanei toxicitatea. n raport cu originea factorilor care determin intoxicaiile, acestea se clasific n: Intoxicaile pot fi endogene (intoxicaii alimentare) sau exogene, provocate de toxicii ptruni n organism pe diferite ci; acestea fac obiectul toxicologiei. n clasa intoxicaiilor exogene se disting: Intoxicaiile intenionate (voluntare): crime, sinucideri, toxicomanii; Intoxicaiile accidentale: accidentele propriu-zise, medicamentoase, profesionale, alimentare. Crimele prin otrvire, n continu scdere, utilizeaz pesticide organofosforice, digitalice, taliu etc. Sinuciderile prin otrvire, n numr din ce n ce mai mare, se realizeaz prin medicamente (opiacee, psihotrope), apoi prin pesticide, monoxid de carbon, gaze naturale, alcaloizi, sod caustic etc. Toxicomania (gr. toxicon = otrav + mania = nebunie) este starea de intoxicaie, periodic sau cronic, determinat de consumarea repetat a unui drog, natural sau sintetic. Caracteristicile sale sunt dorina de nenvins sau necesitatea de a continua consumarea drogului i de a-l procura cu orice pre; tendina de a mri progresiv dozele, dependena de ordin psihic i, n general, dependena fizic fa de efectele drogului, cu apariia sindromului de abstinen la suprimarea lui, efecte nocive asupra individului, familiei i societii. Doparea nu este o intoxicaie propriu-zis, ci reprezint ntrebuinarea mijloacelor i substanelor naturale sau sintetice ( n special psihoanaleptice) capabile s mreasc performanele, n vederea unei competiii fizice sau intelectuale. n mod obinuit, senzaia de
11

oboseal dup un efort prelungit oblig subiectul s-i ntrerup activitatea. Substanele dopante nltur n mod artificial senzaia de oboseal i, implicit, elimin semnalul de alarm indicnd nevoia de odihn. Oboseala este ns numai mascat, necesitnd administrarea unei noi doze de substan dopant. Doparea aduce prejudicii eticii sportive, precum i integritii fizice i psihice a sportivilor. Intoxicaiile accidentale propriu-zise se datoreaz neateniei, netiinei sau imprudenei i sunt legate de pstrarea i folosirea improprie a pesticidelor, medicamentelor, substanelor chimice de uz casnic (sod caustic, detergeni, produse petroliere etc.), de defeciuni de tiraj ale sobelor (gaze naturale, crbune), de gazele de eapament ale automobilelor (n garaje). Intoxicaiile medicamentoase au loc prin: Eroarea medicului, prin prescrierea unor cantiti de substan activ care depete dozele maxime terapeutice, a medicamentelor coninnd un principiu activ comun (efect cumulativ) sau sediu comun de aciune (efect sinergic), a principiilor active care, prin asociere, conduc la efecte toxice sau la potenare exagerat etc Eroarea farmacistului, prin nedescifrarea corect a reetei, nesemnalrii erorii din reet, confuzie de substane, eliberarea unui preparat neomogen etc. Eroarea bolnavului prin supradozare, automedicaie, polipragmazie, confuzie de medicament sau de cale de administrare etc Intoxicaiile profesionale au loc n industria chimic, extractiv, agricultur, ateliere meteugreti etc. Aceste intoxicaii sunt produse de compuii unor metale i nemetale, pesticide, solveni organici, cancerigeni etc. Acest tip de intoxicaii face obiectul criminalisticii numai n caz de deces. n funcie de timpul instalrii intoxicaiei se cunosc: - Intoxicaia acut, toxicul fiind absorbit n doz relativ mare i unic sau n doze mai mici i repetate la intervale scurte, iar manifestrile toxice apar pe neateptate, sunt violente i pot fi urmate de moarte. Dup timpul de apariie i violena manifestrilor toxice, se disting: intoxicaia supraacut, acut i subacut; - Intoxicaia cronic numit i intoxicaia pe termen lung reprezint totalitatea efectelor toxice produse prin administrarea repetat a unui toxic n aceeai doz, pe o perioad mai mare parte din viaa omului. Leziunile biochimice i morfofuncionale apar lent, dar continuu. Intoxicaia pe termen lung prin absorbie repetat de doze mici are loc n cazul toxicilor cumulativi (metanol, digitalice, metale grele, fluor, derivai de arsen etc.) prin cumularea dozelor sau prin cumularea efectelor, n cazul substanelor cancerigene. Intoxicaia pe termen lung poate fi cauzat de o doz unic. Toxicitatea n form agravat se manifest, de pild i la cteva sptmni dup ingerarea unei doze unice de Paraquat. La fel se comport unele insecticide organofosforice cu aciune neurotrop ntrziat, nitrozaminele cancerigene etc. Intoxicaia acut reprezint totalitatea efectelor toxice produse prin administrarea unui toxic ntr-o singur doz, putnd provoca moartea a 50% din animalele dintr-un lot n decurs de 24-48 ore (sau pn la 15 zile pentru toxicii cu efect ntrziat).

12

Aprecierea toxicitii acute pe baz de DL50 are dezavantajul c nu ine seama de masa molecular, deoarece trebuie s se ia n considerare numrul de molecule implicate n mecanismele fiziopatologice. S-a introdus, de aceea, noiunea de potenial de toxicitate, pT = log [T]. Valoarea T se calculeaz dup valoarea DL50 i.p. la oareci i reprezint concentraia molar toxic a substanei, exprimat n moli/kg. Concentraia letal n atmosfer (CL) exprim toxicitatea acut a substanelor care ptrund pe cale respiratorie i are aceeai semnificaie ca i DL. Exprimarea sa se face astfel: masa/volum (g/v); volum/volum (v/v), ca procente de volum (% vol.), pri/milion (ppm), pri pe bilion (ppb; 1 ppm = 1000 ppb). Concentraiile maxime admise (CMA) sunt caracteristice fiecrei substane din mediul industrial sau comunal, pentru a evita apariia manifestrilor toxice. Ele reprezint concentraiile medii ale substanelor din aer, care, cu excepia cazurilor de hipersensibilitate, nu provoac, la nici unul din muncitorii expui n mod continuu nici un semn sau simptom de boal sau de condiie fizic rea, putnd fi pus n eviden prin cele mai sensibile teste acceptate pe scar internaional. 2.5 Doze toxice i doze letale Doza toxic se refer la cantitatea de substan capabil s determine efecte toxice. Aceasta reprezint cantitatea din substan care, introdus n organism, provoac un efect toxic determinat. De asemenea, la medicamente se disting doze terapeutice, toxice i letale. Modul de exprimare a dozei variaz: doz/kg mas corporal; doz/mas corporal global; doz/unitate de suprafa corporal; concentraie molar; unitate biologic etc. Pentru substanele care au ptruns n organism pe cale oral se face distincie ntre doza ingerat i doza absorbit. Doza letal (DL) exprim toxicitatea acut a substanelor care ptrund oral sau parenteral. Se exprim n mg/kg corp i se stabilete experimental pe loturi de animale. DL este urmat de un indice de la 1 la 100 exprimnd procentul de letalitate ntr-un timp dat. DL5 (DLM) este doza letal minim, DL50 (DML), doza medie letal, DL75 este doza fatal, iar DL100, doza maxim letal sau doza letal absolut. DLo , doza maxim tolerat (cnd se produc efecte toxice, dar nu letale) nu este o doz letal. n mod curent, pentru exprimarea toxicitii acute a unei substane se folosete noiunea DL50 (mg/kg corp), deoarece la aceast doz diferenele de reactivitate individual sunt mai reduse. Substanele toxice se clasific i se compar astfel n raport cu DL50 (conform cu scara toxicitii). Aprecierea toxicitii acute pe baz de DL50 are dezavantajul c nu ine seama de masa molecular, cu alte cuvinte trebuie s se ia n considerare numrul de molecule implicate n mecanismele fiziopatologice. S-a introdus, de aceea, noiunea de potenial de toxicitate, pT = log [T]. Valoarea T se calculeaz dup valoarea DL50 i.p. la oareci i reprezint concentraia molar toxic a substanei, exprimat n moli/kg.
13

Scara toxicitii (dup Hodge i Steaner) Calea de administrare Grupa toxicitii Gradul toxicitii DL50 cutanat iepuri, mg/kg DL50 (doz unic) oral obolan, mg/kg <1 Inhalare de vapori (4 ore) mortalitate 30-60% (obolan) ppm <10 Doza letal probabil la om (g) Substane

Extrem de toxic Foarte toxic Moderat toxic Slab toxic Practic netoxice Relativ fr toxicitate

<5

<0,065

Alcaloizi Organofosforice, organomercurice, As2O3, DNOC Metale grele Aditivi alimentari, Fe, Ni Arome alimentare, NaCl, acizi organici Substane alimentare

5-43

1-50

10-100

3 4

44-340 3502810 282022590

50-500 500-5000 500015000

100-1000 1000-10000 10000100000

31 570

1100

>22600

>15000

>100000

>1100

Concentraia letal n atmosfer (CL) exprim toxicitatea acut a substanelor care ptrund pe cale respiratorie i are aceeai semnificaie ca i DL. Exprimarea sa se face astfel: masa/volum (g/v); volum/volum (v/v), ca procente de volum (% vol.), pri/milion (ppm), pri pe bilion (ppb; 1 ppm = 1000 ppb). Concentraiile maxime admise (CMA) sunt caracteristice fiecrei substane din mediul industrial sau comunal, pentru a evita apariia manifestrilor toxice. Ele reprezint concentraiile medii ale substanelor din aer, care, cu excepia cazurilor de hipersensibilitate, nu provoac, la nici unul din subiecii expui n mod continuu nici un semn sau simptom de boal sau de condiie fizic rea, putnd fi pus n eviden prin cele mai sensibile teste acceptate pe scar internaional. n raport cu natura efectului toxic, substanele se mpart n mai multe grupe, mai importante fiind urmtoarele dou: - substane ale cror efecte principale se traduc prin fenomene de iritaie, sensibilizare sau intoxicaie acut, aprute imediat sau dup o faz de laten, n urma unei expuneri de
14

scurt durat la concentraii curente (oxizi de azot, formaldehid, halogeni, mercaptani etc.). n acest caz CMA sunt denumite valori plafon, care nu trebuie depite nici chiar timp de 1015 minute; - substane ale cror efecte principale se datoresc cumulrii lor, n urma expunerii repetate la concentraii curente (metale grele, solveni organici etc.). n acest caz, trebuie considerate drept CMA valorile medii integrate n raport cu timpul, corespunznd noiunii de praguri care nu pot fi depite. Ca urmare, aceste concentraii pot fi depite n timp i spaiu, ns este obligatoriu ca, nsumate, s se compenseze i astfel s nu depeasc CMA. De pild, pentru plumb, expunerea timp de o or la concentraii de opt ori mai mari dect concentraia medie admis nu prezint risc de intoxicaie dac n celelalte apte ore de munc plumbul este absent; dimpotriv, pentru solvenii liposolubili cu aciune narcotic (dicloretilen, CS2 etc.), valoarea medie admis nu poate fi dect foarte puin depit, pe o perioad extrem de scurt. Pentru amestecul de toxici exist dou modaliti de exprimare a CMA, n raport cu modul de dozare: - dac toxicii se dozeaz global, CMA se exprim n toxicul cel mai agresiv. De exemplu, la amestecul de HCl, H2SO4 i HNO3, rezultatul se exprim n mg H2SO4/m3 de aer (CMA = 1,5 mg/m3) fa de ceilali doi (CMA = 10 mg/m3). - dac toxicii se dozeaz individual, CMA se consider global depit chiar atunci cnd concentraiile individuale (C1, C2, C3) sunt mai mici dect CMA respective (CMA1, CMA2, CMA3), ns suma rapoartelor este egal sau mai mare dect unitatea: C1/CMA1 + C2/CMA2 + ..+ Cn/CMAn 1 De exemplu, la un amestec de aceton, alcool izopropilic, cloroform i alcool amilic, CMA global este depit de 1,5 ori, dei concentraiile fiecrui toxic n parte sunt inferioare CMA respective: 300/1500 + 240/600 + 80/200 + 125/250 = 1,5 > 1 Cnd suma rapoartelor este inferioar unitii, nu exist efect aditiv. Se consider c au efect sinergic de tip aditiv substanele toxice care au ca int a agresivitii lor acelai organ sau sistem al organismului ori care au acelai mecanism de aciune. n aceste locuri de munc aprecierea riscului, respectiv a nivelului noxelor n aer n raport cu concentraiile admisibile, se va face aplicnd urmtoarea formul: C1/CMA1 + C2/CMA2 + + Cn/CMAn < 1 (C1, C2, Cn = concentraiile determinate n aer pentru fiecare nox) (CMA1, CMA2, CMAn = concentraiile maxime admise pentru noxele respective). n Romnia, normele de protecia muncii stabilesc urmtoarele: - concentraia maxim admis este concentraia noxelor din zona de munc ce nu trebuie depit n nici un moment al zilei; - concentraia medie este concentraia noxelor rezultat dintr-un numr de determinri reprezentative pentru locul de munc ales i care nu trebuie depit pe durata unui schimb de lucru;

15

- n cazul medicamentelor se determin indicele terapeutic (IT) sau factorul relativ de securitate, prin raportarea dozei letale (DL50) la doza medie eficace (DE50) (cantitatea de substan capabil s determine efect terapeutic la 50% din subiecii folosii n experiment). Dac IT 10, utilizarea substanei n terapeutic nu prezint pericol la doze uzuale; pentru IT < 10 securitatea tratamentului este sczut. 3. Istoria toxicologiei medico-legale Printre primele cri referitoare la antidoturi se cunosc Theriaca i Alexipharmaca, scrise de Nicandru din Colofan (sec. II . H.). Maimonide, filozof i medic evreu, a scris n sec. XII, un Tratat despre otrvuri i antidoturile lor. Din secolul al XVIII-lea dateaz primele lucrri cu scop medico-legal despre otrvuri. Se cunosc astfel lucrri precum Asupra otrvirilor cu arsen; cercetarea i determinarea lui pentru justiie, elaborat de Hahnemann n 1786 i Proprietile otrvurilor, un capitol din primul tratat de medicin judiciar scris de Fodr (1798). Bazele toxicologiei ca tiin au fost puse de Orfila (1787-1853) prin tratatul su Toxicologia general (1814). Cu excepia cazului n care cel care s-a otrvit a fost prins n flagrant, n Evul Mediu nu exista nici o modalitate de a stabili c victima a murit otravit. La nceputul secolului al XVIII-lea, un medic olandez, Hermann Boerhoave, a emis ipoteza c ar putea produce diferite parfumuri otrvitoare. Apoi, Boerhave a fost primul care a sugerat o metod chimic ce dovedete prezena unei otrvi. n Evului Mediu, asasinii profesioniti i-au vndut serviciile att membrilor familiei regale ct i populaiei. Cele mai frecvente otrvuri au fost de origine vegetal (cum ar fi cucuta, aconite, belladonna) i metalele toxice (sruri de arsenic i mercur). n timpul Renaterii franceze i italiene, asasinatul politic prin otrvire a fost ridicat la rangul de art de ctre Papa Alexandru al VI-lea i Cesare Borgia. Primul succes n izolarea unei otrvi de tip alcaloidic a fost obinut n anul 1850 de ctre Jean Servials Stas, un chimist belgian, folosind o soluie de acid acetic n alcool etilic pentru a extrage nicotina din esuturile lui Gustave Fougnie, care fusese ucis. Modificat de chimistul german, Otto Friedrich, metoda Stas-Otto, folosit i astzi, a fost rapid aplicat la izolarea a numeroase otrvuri alcaloidice, inclusiv colchicina, coniina, morfina, narcotina i stricnina. Importante contribuii la dezvoltarea toxicologiei au adus Marsh care, n 1836, a elaborat o tehnic pentru decelarea arsenului i Orfila care a artat c toxicul trebuie cutat n diferite esuturi i organe. nainte de aceasta (1839), cercetrile se fceau numai n stomac, intestine i vomismente. Utilizarea de ctre criminali a arsenicului alb (trioxid de arsen) a devenit att de larg rspndit n rndul populaiei din Europa medieval nct otrava a dobndit numele de "pudr de motenire". Avnd n vedere aceast popularitate, este de mirare c prima izolare chimic i identificare a unei otravi n esuturile i fluidele organismului a avut n vedere arsenicul. n 1775, Karl Wilhelm Scheele, un celebru chimist suedez, a descoperit c arsenicul alb a fost convertit la acid arsenos cu ap de clor. Adaosul de zinc metalic a redus acidul arsenos la un gaz otravitor, arsine (AsH3). La nclzire uoar, gazul degajat conduce la
16

depunerea arsenicului metalic pe suprafaa unui vas rece. n 1821, Sevillas a utilizat descompunerea AsH3 n scopul detectrii unor cantiti mici de arsenic n coninutul stomacului i urin, n cazuri de intoxicaii. n 1836, James M. Marsh, un chimist de la British Royal Arsenal din Woolwich, s-a folosit de acest gaz (arsine) pentru a dezvolta prima metod fiabil de determinare a otrvii absorbite n esuturile i fluidele corpului, cum ar fi ficatul, rinichii i sngele. Cercetrile au fost dezvoltate n secolul trecut n direcia distrugerii materiei organice, izolrii i identificrii toxicilor din produsele biologice. S-au remarcat Fresenius, Babo, Stokes, Stas, Otto, Dragendorff, Tardieu, Roussin, Ogier etc. n secolul nostru, Kohn-Abrest, Fabre, Truhaut, Boudne, Jaulmes, Le Moan, Stepanov, vaicova, Clarke, Curry, Sunshine, Mller, Heindrycks, t. Minovici, Ioanid, Galea i alii au elaborat metode valoroase de toxicologie analitic. n anii 1800 am asistat la dezvoltarea toxicologiei medico-legale ca disciplin tiinific. n 1814, Mathieiv J. B. Orfila (1787-1853), "printele toxicologiei", publicat de Trait des Poisons - prima abordare sistemic a studiului naturii fiziologice i chimice a otrvurilor. Rolul lui Orfila ca martor expert n studierea multor crime celebre, n special prin aplicarea testului Marsh pentru arsenic n procesul otrvitorului Marie Lafarge, a strnit att interesul popular ct i tiinific n noua tiin. Ca decan al Facultii de Medicin de la Universitatea din Paris, Orfila a instruit muli studeni n toxicologie medico-legal. Primul succes n izolarea unei otrvi de tip alcaloid a fost obinut n 1850 de ctre Jean Servials Stas, un chimist belgian, folosind o soluie de acid acetic n alcool etilic pentru a extrage nicotina din esuturile lui Gustave Fougnie, care fusese ucis. Modificat de chimistul german, Otto Friedrich, metoda Stas-Otto a fost rapid aplicat la izolarea a numeroase otrvuri alcaloidice, inclusiv colchicina, conin, morfina, narcotina i stricnina; metoda este folosit i astzi. n a doua jumtate a secolului al XIX-lea, toxicologii europeni au fost n avangarda dezvoltrii i aplicrii tiinelor criminaliste. Procedurile au fost dezvoltate pentru a izola i a detecta alcaloizi, metale grele, i otrvuri volatile. Tot n secolul trecut s-au descoperit i cercetat compui de importan toxicologic i criminalistic: Sertrner (morfina, 1805), Pelletier i Caventou (mai muli alcaloizi, 18171820), Selmi i Gauthier (ptomaine, 1870-1872), Ogier (glicozizi cadaverici, 1891) etc. n secolul XX s-a dezvoltat biologia molecular care i-a pus amprenta i asupra studiilor de toxicologie medico-legal. n 1948, Druckrey, cercetnd dimetilaminoazobenzenul, descoper c exist un efect toxic independent de doz, cu alte cuvinte unii compui nu prezint doz minim nenociv. Dup 1960 s-a stabilit i faptul c nocivitatea se poate manifesta, n unele cazuri, la descendeni, chiar dac nu se evideniaz la organismul-receptor (Cotru, 1993). ncepnd cu anul 1958, cnd, pentru prima dat, Eugen Macovschi a demonstrat existena biostructurii, purttoarea nsuirilor viului, s-a pus cu totul altfel problema interaciunii toxic-organism viu. Astfel, toxicul acioneaz att asupra materiei moleculare incluse n biostructur i coexistent cu aceasta, ct i direct asupra biostructurii pe care o destram parial sau total provocnd procese morbide reversibile sau ireversibile. Cu alte cuvinte, este depit concepia strict molecular asupra viului, dei concepia biostructural
17

rmne tributar viziunii materialiste asupra realitii. Moartea organismului are loc, potrivit acestei concepii, n trepte, iar mecanismul aciunii toxicului implic n mai mare msur intervenia organismului vtmat. Cercetrile efectuate cu azid de sodiu i dinitrofenol, de pild, au artat c organismele tratate cu aceste substane reacioneaz la aciunea toxicilor prin eliberarea unei pri din apa inclus n biostructur, precum i a unora din componenii si moleculari. n America, Rudolph A. Witthaus, profesor de chimie la Universitatea Cornell Medical School, a avut multe contribuii n toxicologie i a atras atenia asupra noii tiine prin efectuarea de analize pentru New York City, n mai multe cazuri celebre de otrvire: crimele Helen Potts de ctre Carlyle Harris i Annie Sutherland de ctre Dr. Robert W. Buchanan, ambii au utilizat morfin. n 1911, Tracy C. Becker i profesorul Witthaus a editat o lucrare n patru volume pe tema jurisprudenei medicale, Medicin Legal i Toxicologie, primul manual standard de medicin legal publicat n SUA. n 1918, oraul New York s-a realizat un sistem de examinare medical, i numirea lui Dr. Alexandru O. Gettler ca toxicolog a marcat nceputul toxicologiei medico-legale moderne n America. Dei Dr. Gettler a avut multe contribuii n aceast tiin, probabil cea mai mare realizare a sa a fost formarea i orientarea pe care a dat-o viitorilor lideri n toxicologie medico-legal. Muli dintre asociaii lui au continuat aceast direcie n cadrul laboratoarelor de medicin-legal i sistemelor de examinare medical n marile centre urbane din ntreaga ar. n anul 1949 a fost nfiinat Academia American de tiine Medico-Legale, n scopul de a sprijini n continuare practica tuturor fazelor de medicin legal n SUA. Membrii seciei de toxicologie reprezint n marea lor majoritate toxicologi criminaliti care lucreaz n birourile de investigaii ale procuraturii. O serie de alte organizaii de criminalistic internaionale, naionale i locale, cum ar fi Societatea Toxicologilor Criminaliti i Asociaia Toxicologilor din California, ofera posibilitatea schimbrilor de experien tiinific referitoare la tehnici analitice i rapoarte de caz, care implic medicamente noi sau rar utilizate i otrvuri. Asociaia Internaional a Toxicologilor Criminaliti, fondat n 1963, cu peste 750 de membri din 45 de ri, permite cooperarea la nivel mondial n rezolvarea problemelor tehnice cu care se confrunt toxicologul. n 1975, a fost constituit Consiliul American de Toxicologie Criminalistic, n scopul de a examina i certifica toxicologii criminaliti. Unul dintre obiectivele sale declarate este "de a crea un sistem judiciar valabil, i unul public, un sistem practic i echitabil pentru identificarea cu uurin a acelor persoane care practic toxicologia medico-legal i care posed calificrile i competenele necesare". n general, aceste persoane autorizate de ctre Consiliu trebuie s fi obinut titlul de doctor, s aib cel puin 3 ani de experien profesional full-time, i s promoveze un examen scris. n prezent, doar circa 200 de toxicologi sunt certificai de ctre acest Consiliu. n ara noastr, primul toxicolog criminalist este considerat farmacistul i medicul C. Hepites care a avut, ncepnd cu anul 1833, un laborator de analize chimico-legale la Brila. Dup 1890 toxicologia a fost reprezentat de Mina Minovici, farmacist i medic, ntemeietorul Institutului de Medicin Legal din Bucureti. Fratele su, tefan Minovici, dei chimist, a reorganizat nvmntului farmaceutic i a ntemeiat Facultatea de Farmacie din
18

Bucureti (1923); a elaborat, printre altele, i un manual de toxicologie (1912). Printre colaboratorii i urmaii si au fost Bacovescu, Vintilescu, Deleanu, Ionescu-Matiu. n Transilvania, medicul, chimistul i farmacistul J. Orient a publicat numeroase lucrri de toxicologie. La Iai a activat n domeniul toxicologiei judiciare dr. Cotru. La Bucureti, N. I. Ioanid public n 1965 un manual de referin n domeniu: Toxicologie. La Cluj activeaz prof. V. Galea, autor a numeroase lucrri de toxicologie teoretic i practic. 4. Otrvirea i cercetarea criminalistic n general, cazurile de crim cu otrav sunt comise doar n cadrul unei familii sau ntr-un grup de aproapiai. n astfel de cazuri, asasinul folosete, n general, unele otrvuri care nu pot trezi suspiciuni datorit culorii, mirosului sau gustului acestora. Uneori se semnaleaz i omorul sau tentativa de omor prin folosirea de gaze toxice, de exemplu, cu monoxid de carbon. Confirmarea cazului de moarte prin otrvire se realizeaz prin colaborare ntre medicul legist i toxicolog. Rareori cercetarea la faa locului aduce dovezi fizice care indic faptul c moartea a fost cauzat de ingestia unor substane otrvitoare. Stabilirea cauzei decesului revine personalului medical calificat, medicului legist sau anatomopatologului, dar succesul sau eecul n a ajunge la o concluzie corect depinde frecvent de eforturile combinate ale anatomo-patologului i toxicologului criminalist. Otrvirea, ca i cauz a decesului, nu poate fi dovedit fr a analiz toxicologic care s demonstreze prezena otrvii n esuturile sau fluidele corporale ale decedatului. Cele mai multe droguri i otravuri nu produc leziuni caracteristice sau vizibile n esuturile corpului, iar prezena lor poate fi demonstrat doar prin metode chimice de izolare i identificare. n cazul n care analizele toxicologice sunt evitate, moartea poate fi atribuit otrvirii fr o dovad cert sau o moarte prin otrvire poate fi n mod eronat atribuit altor cauze. Grania dintre substanele otrvitoare i cele netoxice este greu de determinat. Unele substane prezente n produsele alimentare pot cauza moartea prin otrvire, atunci cnd sunt luate n cantiti mari. Astfel, exist un caz n care consumul de 13 de grame de sare de mas a provocat moartea a unui adult. Probele fizice aflate la locul crimei i examinarea sumar a decedatului pot indica uneori un caz de otrvire. Patologul poate recunoate efectele anumitor otrvuri la autopsie. Acizii tari i bazele pot provoca arsuri extinse n jurul gurii sau pe suprafaa corpului, cu distrugerea sever a esuturilor interne. Dovezi, cum ar fi droguri, narcotice, marcaje pe corp sau prezena acizilor sau a substanelor caustice pot conduce la ipoteza otrvirii. De asemenea, arsurile n jurul gurii i pe fa pot fi rezultatul consumului de acizi sau substane chimice caustice, cum ar fi acidul clorhidric, acidul sulfuric sau a leiei. Mirosurile de amoniac sau migdale amare pot indica anumite otrvuri. De pild, n intoxicaia cu cianur, faa este de culoare roiatic. Anumite medicamente, cum ar fi alcaloizii din opiu i nicotina pot cauza contracia pupilelor, n timp ce altele, cum ar fi atropina (belladonna) produc dilatarea.

19

Stricnina provoac convulsii, colurile gurii fiind ridicate, iar faa este rigidizat ntrun rnjet, n timp ce braele i picioarele sunt trase mpreun, pe cnd partea din spate este puternic ndoit napoi datorit contraciei muchilor. Dac moartea a survenit prin otravire subacut sau cronic cu arsenic, fecalele vor avea o consisten moale i, de multe ori, conin snge. O excreie mrit se gsete, de obicei, n etapele trzii ale intoxicaiei cu clorur mercuric sau cu sruri de plumb. Diferite materiale colorate aflate n vom pot indica tipul de otrvire. Astfel, culoarea maro asemntoare cu zaul de cafea indic o otrvire cu baze tari, cum ar fi de hidroxidul de sodiu sau potasiu; galbenul conduce la acid azotic i acizii cromului; albastru-verde la sulfat de cupru; negru, la acid sulfuric, iar culoare verde-maro sugereaz nghiirea de acid clorhidric. O vom cu miros ascuit indic o otrvire cu amoniac sau cu acid acetic. Intr-un caz de deces prin otrvire, numai o anchet la faa locului i audierea martorilor ar putea decide dac a fost un caz de crim, sinucidere sau accident. Autopsia poate stabili numai tipul i cantitatea de otrav utilizat. Cele mai cunoscute substane otrvitoare sunt: - Otrvurile lichide i gazoase. Cele mai cunoscute sunt monoxidul de carbon, acidul cianhidric, freonul, metanolul, toluenul, benzenul, gazolina i cloroformul. - Metalele grele i alte otrvuri anorganice. Compuii i srurile de antimoniu, arsenicul, bariul, cromul, plumbul, mercurul, taliul, precum i acizii i bazele anorganice puternice, cum ar fi acidul clorhidric, acidul azotic, acidul sulfuric, hidroxidul de sodiu, hidroxidul de potasiu i amoniacul. - Drogurile ilicite, medicamentele aflate n regim special i buturile spirtoase. Unele medicamente pot fi gsite n asociere cu altele asemenea sau cu alcool. Grupa de astfel de substane cuprinde alcoolul etilic, barbituricele, heroina, opiaceele sintetice, cum ar fi metadona, fenciclidin (phencyclidine, PCP), tranchilizantele minore, cum ar fi Valium, Librium, meprobamatul sau medicamentele cu regim special, atunci cnd sunt luate n exces. - Unele otrvuri animale i vegetale: atropin, cocaina, nicotina, scopolamina, stricnina i veninul de arpe. - Otrvuri bacteriene i intoxicaii alimentare (botulism). 4.1 Otrvirea accidental Cele mai multe intoxicaii accidentale au loc n cas. Copiii pot avea acces i chiar ingera medicamente, detergeni, pesticide i detergeni de uz casnic. Intoxicaia accidental la aduli este de obicei rezultatul etichetrii greite sau depozitrii unei substane toxice ntr-un alt recipient dect cel original. De cte ori nu, un recipient necorespunztor este o veche sticl de whisky! Arsenicul, buruienile otrvitoare, stricnina, cianurile, soluiile de curare, i numeroase alte otrvuri letale au fost cu nerabdare i din greeal bute din ulcioare de cidru i sticle de whisky vechi. Este cunoscut cazul n care un flacon deschis de cianur, aflat lng o cutie de zahr pe o mas de lucru la subsol, a fost folosit pentru a ndulci o ultim ceac de cafea.

20

Intoxicaiile accidentale pot aprea n industrie, ca urmare a neglijenei sau unor ntmplri nefericite, care expun lucrtorii la substane toxice. n timp ce posibilitatea de otrvire accidental n industrie este mare, standardele de siguran i reglementrile i disponibilitatea serviciilor medicale de urgen din prezent mpiedic industria s constituie sursa a multe intoxicaii fatale. 4.2. Decese cauzate de abuzul de droguri Drogurile sunt folosite n scopul schimbrii strii sufleteti sau inducerii unei stri de euforie reprezint sursa a numeroase intoxicaii. Abuzul de droguri poate implica utilizarea de droguri ilegale, cum ar fi heroina sau phencyclidina; consumul de droguri interzise sau controlate, cum ar fi cocaina, barbituricele i amfetamina sau utilizarea de produse chimice n alt mod dect cel prescris, deci contrar destinaiei lor - cum ar fi inhalarea de solveni i produse volatile. Dat fiind c dezvoltarea i glorificare a "culturii drogurilor" la mijlocul anilor 1960, decesele datorate de consumul de droguri ilicite sunt cele mai frecvente intoxicaii fatale investigate de ctre toxicologi, n special n zonele urbane mari. Tabelul urmtor prezint drogurile cel mai frecvent ntlnite n investigaiile de deces; de remarcat incidena ridicat a cocainei, alcoolului, heroinei i morfinei. ntr-un sens mai larg, abuzul de droguri poate include, de asemenea, utilizarea excesiv a substanelor legale, cum ar fi alcoolul i medicamentele pe baz de prescripie. Consumul de alcool este cea mai mare problem a drogurilor n SUA. Alcoolul joac un rol semnificativ n decesele violente. Din cele 40.000 de decese datorate accidentelor de main care au loc anual n SUA, 50% implic oferi consumatori de alcool, i 60% din pietonii ucii au concentraii semnificative de alcool din snge. Droguri frecvent ntlnite n cazurile cercetate medical, 1991a Nr. crt. Denumire drog Numr de menionri Procentb din total cazuri 45.75 3020 Cocain 1 36.90 2436 Alcool-n combinaie 2 35.30 2333 Heroin/Morfin 3 11.86 783 Codein 4 8.89 587 Diazepam 5 6.62 437 Amitriptilin 6 6.51 430 Metadon 7 5.74 379 Nortriptilin 8 4.92 325 d-Proxpoxifen 9 3.65 241 Difenhidramin 10 a Drug Abuse Warning Network, National Institute on Drug Abuse date din 27 orae b Procent din total cazuri poate depi 100%, deoarece un caz poate implica mai mult de un drog

21

Dintre adulii din mediul urban care au fost internai ntr-un spital, cu un os fracturat, 50% i-au fracturat osul n timpul sau dup consumul de alcool. Un nivel ridicat de alcool n snge se gsete la autopsie, n 35% din cazurile persoanelor care s-au sinucis i n 50% din toate victimele crimelor. De asemenea, muli oameni mor n fiecare an din cauze patologice, multe direct atribuite alcoolului sau complicaiilor altor cauze patologice, agravate de consumul de alcool. Alcoolul este o otrav cu autolimitare: de obicei, oamenii i pierd contiina nainte de a ingera o doz letal. Prin urmare, decesele prin supradozare, din cauza ingestiei de cantiti excesive de alcool sunt mai puin frecvente. Cu toate acestea, numeroase decese accidentale apar din ingestia simultan de medicamente puternice i alcool. 4.3 Sinuciderea cu otrav Metoda obinuit de deces prin otrvire este sinuciderea. n general, de dou ori mai muli brbai dect femei svresc cu succes o sinucidere. Cu toate acestea, de dou ori ca multe femei dect brbai ncearc s se sinucid cu otrav. Cel mai comun mijloc de sinucidere este monoxidul de carbon, un gaz generat de arderea incomplet a compuilor cu carbon. Gazele de eapament de la automobile conin o concentraie ridicat de monoxid de carbon. O metod obinuit folosit de ctre cei care se sinucid cu monoxid de carbon este lsarea unui motor de main pornit ntr-un garaj nchis. n timp ce arsenicul, cianura i alte otrvuri bine cunoscute pot fi uneori utilizate ca ageni de sinucidere, cele mai multe decese rezult ca urmare a consumului de medicamente. Persoanele care sufer de depresie i alte tulburri emoionale, de obicei, au la dispoziie medicamente puternice i, dac sunt luate n exces, pentru a combate simptome ale tulburrilor psihologice aceste droguri sunt letale. Astzi, cele mai multe sinucideri prin otrvire implic ingerarea mai multor medicamente, de obicei trei pn la apte medicamente diferite sunt ingerate odat. Prin analiza coninutului gastric i al intestinului, a urinei, a sngelui, a organelor principale ale corpului, toxicologul poate determina cantitatea minim a otrav ingerat. n sinucideri, rezultatele acestor analize demonstreaz c a fost ingerat o cantitate masiv; aceasta nseamn, dincolo de orice ndoial, c rposatul nu ar fi putut lua accidental o astfel de doz. 4.4 Otrvirea criminal Otrvirile accidentale i sinuciderile sunt comune astzi; crima prin otrvire este rar. Concluzia c o persoan a murit ca urmare a otrvirii de ctre un criminal este de multe ori cel mai dificil tip de investigaie pentru oamenii legii i experii medicali. n general, dovada de otrvire se obine din cunoaterea simptomelor manifestate de rposat nainte de moarte, examinarea postmortem a corpului de ctre anatomopatolog, i izolarea i identificarea otrvii de ctre toxicolog. Pentru urmrirea cu succes a unui suspect, oamenii legii trebuie s stabileasc c fptaul a avut acces la o surs de otrav, c suspectul a fost contient de efectele letale ale otrvii i c suspectul a avut posibilitatea de a administra otrava rposatului.

22

n cazul n care victima a fost consultat, nainte de moarte, de ctre un medic, medicul nu consider otrvirea ca o cauz a necazului pacientului. Numai n cazul n ocupaia pacientului l aduce n contact cu substane toxice (lucreaz ntr-o rafinrie, mediu chimic sau n topitorii; lucreaz la o ferm i utilizeaz pesticide i erbicide) va medicul suspecta o intoxicaie chimic. Crima prin otrvire apare cel mai frecvent n cadrul familiei, acas, iar medicul va suspecta rareori un so supravieuitor, soia, fiul sau fiica de otrvire a unui alt membru al familiei. De asemenea, exist rareori un simptom de otrvire care nu poate fi la fel de bine cauzate de boala. Vrsturile, diareea, colapsul rapid i pulsul slab, adic toate simptomele otrvirii cu arsenic pot fi, de asemenea, i cauza unui ulcer gastric perforat sau a unei inflamaii a pancreasului sau apendicelui. De asemenea, convulsiile cauzate att de stricnin ct i de tetanos. Pupilele contractate i narcoza pot fi cauzate de stupefiante sau de leziuni cerebrale. Cu toate acestea, exist circumstane care fac un diagnostic de otrvire aproape sigur. Debutul i evoluia simptomelor ctre o moarte rapid, imediat dupa servirea mesei sau dup consumarea unui pahar indic intoxicaii acute, deoarece intoxicaia alimentar bacterien are un debut ntrziat al simptomelor. Otrvurile metalice pot provoca deteriorarea sever a tractului gastro-intestinal, ficatul i rinichii. Fosforul, hidrocarburile clorurate i ciupercile otrvitoare cauzeaz degenerarea sever a ficatului. Cu toate acestea, cele mai multe otrvuri nu produc modificri observabile n esuturi, prin urmare, n multe cazuri de otrvire, evaluarea corpului de ctre anatomopatolog stabilete dac moartea s-a datorat unor cauze naturale sau unor leziuni traumatice i c nu exist nici o dovad pentru cauza de deces, cu excepia unei posibile otrviri. n majoritatea cazurilor, analiza toxicologic aduce dovezi pentru crima prin otrvire. 4.5 Dovezi circumstaniale de otrvire Ancheta toxicologic ale unei mori prin otrvire poate fi mprit n trei etape: 1. Obinerea studiilor de caz i a probelor (dovezilor) adecvate; 2. Analizele toxicologice; 3. Interpretarea rezultatelor analizelor. Stabilirea cauzei de deces drept otrvire se poate face numai prin autopsie i analiz chimic. ntr-un numr de cazuri de intoxicaii, aspectul persoanei decedate sau circumstane speciale n legtur cu moartea poate conduce la aflarea cauzei de deces. Trebuie, de asemenea, cutate, n primul rnd, la locul incidentului otrvurile reziduale, sub form de comprimate, pulbere, sau reziduuri n flacoanele de medicamente. De asemenea, se vor cuta ambalajele, prafurile, cutiile aruncate i alte recipiente (tuburi, fiole, flacoane). Toate indicile trebuie recuperate i ambalate separat, ntr-un tub sau plic. Atunci cnd persoana decedat se gsete n pat, trebuie examinat foarte atent lenjeria de pat deoarece poate conine otrav sub form de pulbere, dar i alte substane deversate, greu de detectat. n cazurile n care moartea nu se datoreaz otrvirii, toxicologul criminalist poate oferi, de cele mai multe ori, dovezi incontestabile cu privire la mprejurrile n care a avut loc
23

un deces. Comportamentul de conducere haotic a victimelor accidentelor auto este adesea explicat prin prezena alcoolului n snge sau esuturi. Medicamentele psihoactive, cele care afecteaz comportamentul, joac adesea un rol semnificativ n mprejurri asociate cu moartea subit sau violent. Detectarea alcoolului, a narcoticelor, a halucinogenelor sau a altor medicamente pot susine depoziiile martorilor cu privire la comportamentul agresiv, incoerent, sau iraional al rposatului n momentul unui incident fatal. n schimb, rezultatele toxicologice negative pot spulbera suspiciunea consumului de droguri a rposatului. Concluziile negative sunt, de asemenea, semnificative la persoanele care sunt n mod regulat sub tratament pentru a controla condiiile patologice. n cazul epilepticilor, concentraiile sczute sau negative de droguri pot indica faptul c rposatul nu i-a luat medicamentele n modul prescris i ca urmare, au suferit un atac de apoplexie fatal. 4.6 Metode de analiz criminalistic a opioidelor Utilizarea unor metode de separare pentru izolarea, identificarea i analiza cantitativ a opiaceelor naturale i sintetice prezint un larg interes pentru criminaliti (Bogusz, 2008). Strict vorbind, termenul de opiaceu se refer la produsele derivate din opiu de mac. Atenia criminalitilor se concentreaz pe derivai de morfin i opiacee sintetice sau semisintetice, cu aciune agonal (agonistic) la receptorii opioizi OP1 (d), OP2 (k) sau OP3 (m). Pentru aciunea opiaceelor asupra receptorilor opioizi pot fi consultate i alte lucrri (Kilpatrick & Smith, 2005; Dhawan et al., 1996). Aici ne intereseaz mai ales aplicaiile analizei medicolegale, dedicat n principal probelor biologice. Aceste aplicaii cuprind metodele de detectare a opiaceelor n probele non-biologice i biologice; izolarea de opioide din matrici biologice diferite; analiza constituienilor opiului de mac n materiale vegetale i n fluidele organismului; separarea i detectarea heroinei i metaboliilor sau a congenerilor si n preparate ilicite de droguri sau medicamente, precum i n fluidele organismului; analiza morfinei i a altor opiacee naturale i sintetice n fluidele organismului i n organe. In acest scop sunt necesare tehnici de separare relevante: cromatografia n strat subire (TLC), gazcromatografia (GC), cromatografia de lichid de nalt performan (HPLC) i electroforeza capilar (CE), combinate cu diferite metode de detecie. Testele preliminare trebuie s prezinte o specificitate larg de grup i, eventual, o sensibilitate ridicat, n timp ce specificitatea absolut nu este necesar. O identificare fr echivoc i determinarea cantitativ sunt de obicei efectuate n etapa de confirmare a analizei. Deoarece un rezultat negativ la un test preliminar este de obicei decisiv, nu se iau n considerare rezultatele fals negative. 4.7 Metode preliminare utilizate la depistarea drogurilor n strad Dispozitivele de testare folosite curent sunt simple i robuste i se bazeaz de regul pe reacii de culoare bine-cunoscute. Testele preliminare se execut, de obicei, de ctre poliiti sau vamei. Sarcina principal a acestor teste este selecia probelor sau a materialelor suspecte pentru examinarea lor ulterioar cu metode confirmatorii. Narcopouchs, de pild, reprezint un kit de teste de culoare pentru detectarea opiaceelor, amfetaminei, cocainei, barbituricelor,
24

canabinoizilor i a dietilamidei acidului lisergic (LSD) n probe colectate pe strad (ODV Inc, Paris, ME, SUA). Acest test folosete reacii de culoare cu mai muli reactivi, cum ar fi reactivii Marquis, Meyer, Mecke, Ehrlich, Fast Blue B i Koppanyi. Intreaga procedur se realizeaz n cutii de plastic prin care se poate vedea reacia de culoare. Kit-ul Herosols (Mistral Detection Ltd., Jerusalem, Israel) const dintr-un reactiv pentru pulverizare i hrtia special de testare. Astfel, pielea suspectului este tears/tamponat cu o bucic de hrtie, pe care este apoi pulverizat Herosol. O culoare violet indic prezena heroinei. Un test similar pentru heroin, numit Detect NowTM este oferit de Test Medical Symptoms@Home, Inc. i a fost comercializat prin intermediul internetului ca un test simplu pentru prinii care doresc s verifice dac copiii lor consum droguri. NIK (Public Safety Inc., Armor Holding, Jacksonville, FL, USA) reprezint un alt kit ce cuprinde fiole pentru principalele clase de droguri printre care opiacee/amfetamine, heroin/opiu. Drug Wipe i Drug Wipe II (Securetec AG, Germany) sunt concepute ca teste imunochimice pentru detectarea drogurilor pe suprafee diferite, de exemplu, n bagaje, paapoarte, valut, i, de asemenea, pe piele, pe limb sau n transpiraie. Limita de detecie pentru opiacee este de 25 ng de echivalent morfin. Cu un cititor portabil se poate efectua determinarea cantitativ colorimetric. 4.8 Metode folosite pentru fluidele biologice Metodele preliminare utilizate pentru fluide biologice pot fi mprite n teste on-site i teste de laborator. Totui, testele preliminare pot fi folosite nu doar n scopuri judiciare sau preventive, de exemplu, n scanarea angajailor, dar i ca o procedur de diagnosticare n intoxicaii acute suspecte. n testele on site (la faa locului) aplicate ntr-o secie de urgen, confirmarea analizelor nu este ntotdeauna de maxim importan. Rezultatul pozitiv al unui test preliminar de opiacee ntr-un caz de supradoz cu heroin reprezint un indiciu pentru administrarea unui antagonist al opiaceelor, de exemplu, naloxon, n loc s se atepte rezultatele analizei confirmatorii. Aceast practic nu se limiteaz numai la domeniul sntii publice; distribuirea de naloxon pentru administrare acas dependenilor de ctre membrii familiei este o nou abordare n combaterea efectelor drogurilor, care este testat n SUA, Germania i Regatul Unit (Sporer, 2003). Teste pe teren Aceste teste sunt utilizate pe scar larg pentru grupuri sociale foarte diferite, incluznd oferii de automobile, criminalii din pucrii, militarii, sportivii, angajaii din industria petrolier, etc. Se pot testa astfel i indivizii din zonele ndeprtate. Cel mai important aspect este posibilitatea de a folosi de eantionare non-invazive. Din acest motiv, testele pe saliv sau transpiraie au devenit deosebit de atractive n locul celor pe urin sau snge (Jenkins & Goldberger, 2002). S-a realizat o astfel de evaluare utiliznd cinci dispozitive de testare a drogurilor pe teren, i anume, AccuSign, Rapid Drug Screen, TesT-Cup-5, TesTstik i Triage. Au fost colectate i testate patru sute de probelor de urin, iar rezultatele pozitive au fost confirmate folosind cromatografia de gaz cuplat cu spectrometria de mas (GC-MS), pentru morfin i
25

codeina sau prin lichid cromatografie-spectrometrie de mas (LC-MS), pentru hidrocodona i hidromorfon (Crouch et al. [5] ). A fost observat numai un rezultat fals-negativ. Rata de rezultate fals-pozitive a fost sub 0,25% pentru toate dispozitivele de testare utilizate. Gronholm i Lillsunde [6] au evaluat opt dispozitivele de teren pentru depistarea de opiacee i alte droguri n urin i prin analiza fluidelor orale. Rezultatele testelor pot fi vzute n Tabelul 1. Un alt sistem pentru analiza drogurilor la faa locului, ORALscreen System, a dat rezultate concordante cu cele din laborator chiar dup 2-3 zile de la consumul de droguri (Barrett et al. [9]).

Teste pentru detecia pe teren a opiaceelor n fluidele corpului (dup Bogusz, 2008). Limita de Materialul Dispozitivul Productor Calibrare detecie biologic de testare (ng/ml) analizat 300 Morfin www.pbmc.com AccuSign Urin TM Morfin Instant-View Morphine www.alcopro.com Urin 300 www.rochediagnostics.com Morfin ONTRAK TesTcup 300 Urin www.rochediagnostics.com Morfin ONTRAK TesTStik 300 Urin Morfin www.bioscaninc.com Rapid Drug Screen 300 Urin Morfin www.dadebehring.com Syva RapidTest 300 Urin Morfin www.biosite.com Triage DOA 300 Urin Morfin www.cozart.co.uk Cozart RapiScan 10 Saliv Testele de laborator Testele de laborator sunt utilizate n situaiile n care numrul de probe examinate este destul de ridicat, de exemplu, n screening-ul de droguri n cazul angajailor sau a personalului militar. Aceste teste sunt de regul bazate pe principiul testelor imunologice i se refer nu numai la opiacee, dar i la ali compui, cum ar fi amfetaminele, cocaina, benzodiazepinele, barbituricele, canabinoizii i metadona. Toate kit-urile detecteaz o gam larg de opiacee, inclusiv cu morfina i glucuronoconjugaii si, codeina, opiaceele semisintetice, cum ar fi dihydrocodeine (DHC) sau hidrocodona. Excepie face metoda CEDIA 6-AM (dezvoltat de Microgenics, Fremont, CA, USA), care este selectiv pentru 6-monoacetylmorphine (metabolitul primar al heroinei). George i Parmar [10] au analizat 1100 probe de urin cu CEDIA 6-AM i nu au reuit s confirme 21 din 282 de probe pozitive, care au fost identificate cu ajutorul GC-MS. Performana testului CEDIA 6-AM de la Microgenics a fost, de asemenea, evaluat (Holler et al. [11]) pe un total de 37713 probe de urin de la de membri serviciului militar activ. Trei soldai au fost depistai pozitiv, la o limit 10 ng/ml, iar una dintre cele trei probe a fost confirmat pozitiv i prin GC-MS, n timp ce celelalte dou eantioane nu au fost confirmate la limita de detecie (LOD) de 2,1 ng/ml. n plus, 87 probe

26

de urin uman cunoscute pentru coninutul lor de 6-AM (prin GC-MS) au fost re-analizate cu ajutorul testului CEDIA 6-AM cnd s-au obinut rezultate pozitive. Unele teste preliminare au fost adaptate pentru probele postmortem. Astfel, a fost aplicat testul ELISA pentru screening n cazul abuzului de droguri utiliznd pentru analiz omogenatele tisulare i sngele colectate postmortem (Moore et al. [17]).Testul pentru morfin a fost foarte specific pentru morfina liber, dar mai puin sensibil dect screening-ul celorlalte opiacee. Acesta din urm a fost recomandat pentru screening-ul specimenelor postmortem. Cnd s-a evaluat testul ELISA comercial pentru screening-ul opiaceelor i benzodiazepinei n probe de snge postmortem, n raport cu tehnica GC-MS, s-a gsit o sensibilitate de 95% i o specificitate de 92% fa de GC-MS (Kemp et al. [18]). Limita de detecie a fost 20 g/l echivalent morfin. Utilizarea la scar larg i importana testului antidrog a creat o pia ilegal pentru proceduri i produse care promit s ''bat'' testele. n afar de diluarea urinei prin consum excesiv de alcool sau substituirea probelor, mai muli productori ofer diferite kit-uri (seturi) i reactivi, care pot fi adugate n urin, pentru a evita detectarea drogurilor. Ca o contramsur la falsificare, pot fi aplicate urmtoarele etape: msurarea temperaturii, greutii specifice, pH-ului i coninutului de creatinin n urin, precum i utilizarea de teste chimice specifice pentru depistarea adaosurilor de compui chimici. Cody i colaboratorii si [21,22] a examinat influena falsificatorului Stealth asupra detectabilitii morfinei sau codeinei n probele de urin. Stealth conine peroxidaz i peroxid i este considerat de productor ca nedetectabil prin teste de depistare a falsificrii. S-a demonstrat c probele cu concentraii sczute de morfin i codein (2,5 g / l urin) dau un rspuns negativ att la examinarea imunochimic i prin GC-MS, n timp ce parametrii tipici ai urinei au rmas neschimbai. Microgenics a dezvoltat un test special numit Sample Check care detecteaz orice interferen posibil cu testul CEDIA n caz de alterarea eantionului. Acest test nlocuiete un grup complex de teste de alterare. 5. Studii de caz i probe Astzi, sunt uor accesibili publicului mii de compui care sunt letali dac sunt ingerai, injectai sau inhalai. Toxicologul are doar o cantitate limitat de materiale pe care s efectueze analizele; prin urmare, este imperios necesar ca, nainte de a ncepe analizele s obin ct mai multe informaii posibil cu privire la mprejurrile cazului. nainte de nceperea analizei, toxicologul trebuie s ia n considerare mai muli factori: cantitatea de prob disponibil, natura otrvii cutate i posibila biotransformare a otrvii. Pentru c lucreaz cu o cantitate limitat de prob, toxicologul trebuie s elaboreze o metod analitic, ce va permite detectarea unui numr ct mai mare de compui. Toxicologul trebuie s in cont de vrst, sex, greutate, istoricul medical i ocupaia rposatului, precum i de orice tratamente au fost administrate nainte de moarte, constatrile preliminare ale autopsiei, medicamentele care au fost la ndemna rposatului, precum i intervalul de timp dintre debutul simptomelor i moarte. ntr-un an, laboratorul de toxicologie afiliat cabinetului unui medic legist va efectua analize asupra esuturilor pentru diverse otrvuri, cum ar fi diverse medicamente (analgezice, antidepresive, hipnotice, tranchilizante),
27

consumului de droguri (halucinogene, narcotice, stimulente), produse comerciale (antigel, produse de aerosoli, insecticide, rodenticide, plante toxice), i gaze (monoxid de carbon, cianur). Evident, posibila identificare a otrvii nainte de analiz ar ajuta foarte mult. Colectarea probelor pentru analizele toxicologice este de obicei efectuat de ctre patolog la autopsie. Sunt necesare mostre din numeroase fluide ale corpului i organe, deoarece drogurile i otrvurile au afiniti diferite pentru esuturile organismului (a se vedea tabelul urmtor). Drogurile i otrvurile nu sunt distribuite uniform n tot organismul, iar toxicologul, de obicei, analizeaz mai nti organele care sunt predispuse a avea cele mai mari concentraii de droguri (vezi figura urmtoare). Pentru analiza toxicologic detaliat este necesar o cantitate mare din fiecare mostr, deoarece o procedur prin care se extrage i se identific un compus sau clas de compui poate fi ineficient n extragerea sau identificarea altora.

30 25 Cocaina, mg/kg 20 15 10 5 0
Cr ei er In im a Ri ni ch i Fi ca Pl t am an i Sp lin a M T e us c h su ta i d Co ipo s rp vi tro s
28

n colectarea probelor, patologul eticheteaz fiecare recipient cu data i ora autopsiei, numele rposatului, numrul probei i semntura patologului. Toxicologul, la primirea probelor, d patologului o dovad scris i depoziteaz probele ntr-un frigider ncuiat pn la momentul analizei. Aceast procedur ofer un traseu adecvat probelor, care permit toxicologului s introduc rezultatele sale n orice procedur juridic decurge din cazul analizat. Probele ar trebui s fie colectate nainte de mblsmare, deoarece acest proces poate distruge sau dilua otrvurile prezente i poate face imposibil detectarea acestora. De exemplu, cianura este distrus de procesul de mblsmare. nvers, alcoolul metilic sau cel etilic poate fi o component a unui fluid mblsmare, dnd astfel o indicaie fals despre ceea ce a but rposatul nainte de moarte.

Sa ng e

Distributia cocainei in caz de injectie fatala cu cocaina (dupa Poklis et al. 1985)

Bi la

Probele colectate la autopsie pentru analize toxicologice Proba esut adipos Bil Snge Creier Rinichi Ficat Plmn Coninut stomacal i intestinal Urin Umoare vitroas Cantitate 200 g ct este disponibil 15 ml 500 g un organ ntreg 500 g un organ ntreg ct este disponibil ct este disponibil ct este disponibil Toxicul urmrit Insecticide, Tiopental Codein, Morfin Clcooli, monoxid de carbon Otrvuri volatile Metale grele Cei mai muli toxici Metadon, gaze, inhalante Toi toxicii luai oral Cei mai muli toxici Digoxin, electrolii, glucoz

Se prezint o schem de izolare a otrvurilor cnd compusul cutat nu este cunoscut. n cazurile care implic administrarea oral a unei otrvi, este analizat n primul rnd coninutul gastro-intestinal, deoarece cantiti mari de otrav rezidual neabsorbit pot fi prezente.
Prob tocat de esut Acidifiere & distilare cu vapori Distilat Test pentru Compui volatili
Teste de culoare, GLC

Alcalinizare & extract organic Extract apos

Acidifiere, extracie cu solvent organic

Reziduu
Teste pt metale, Spectroscopie

Extract organic
Extragere cu acid

Organic

Apos
Se arunc

Extr. apos

Extract organic
Evaporare

Reziduu conine droguri acide

TLC, GLC, HPLC, GC/MS

Alcalinizare, extracie cu solvent organic

Organic Reziduu conine droguri bazice

Apos
Se arunc

Reziduu conine droguri neutre

TLC, GLC, HPLC, GC/MS

Schema de izolare a otrvurilor din probele aduse la laborator

29

n continuare poate fi analizat urina, deoarece rinichii sunt organe principale de excreie pentru cele mai multe otrvuri i concentraii mari de substane toxice sunt adesea prezente n urin. Dup absorbia de la nivelul tractului gastro-intestinal, drogurile sau otrvurile sunt primele transportate la ficat, nainte de a intra n circulaia general sistemic, i prin urmare, prima analiz a unui organ intern este realizat asupra ficatului. Dac o anumit otrav este suspect sau cunoscut a fi implicat ntr-o moarte, toxicologul alege pentru primele analize aceste esuturi i fluide n care otrava se afl concentrat. Biotransformarea sau metabolizarea sunt termeni echivaleni folosii pentru a indica procesul de conversie al unei substane chimice strine n organism, la un produs chimic diferit din punct de vedere structural. Noul compus este numit metabolit. Biotransformarea unui medicament sau a unei otrvi, de obicei, dar nu ntotdeauna, conduce la formarea unei substane inactive punct de vedere fiziologic, care este mai uor de eliminat din organism dect compusul de plecare.
OCH3 O C O N CH3 C O O C OCH3 O C O

NH Norcocaina

Cocaina

OH O H3C N OH C OCH3 N CH3 O C O C

Esterul metilic al ecgoninei Benzoilecgonina

Metabolizarea cocainei in corp

Figura de mai sus prezint biotransformarea cocainei. Metaboliii pot fi fiziologic activi sau inactivi i netoxici, mai puin toxici sau mai toxic dect compusul de plecare. Cocaina ilustreaz acest proces prin transformarea la norcocain, care este fiziologic activ, n timp ce benzoilecgonina i metilecgonina nu au nici o aciune fiziologic. Astfel, toxicologul trebuie neleag aceste reacii de biotransformare. n unele cazuri, metaboliii sunt singurele dovezi c un medicament sau o otrav a fost administrat. Dovezi ale consumului de heroin sau cocain sunt date de prezena metaboliilor respectivi, morfin i benzoilecgonina. Toxicologul trebuie s fie contient de modificrile chimice obinuite care apar n timpul descompunerii unui corp. Autopsia sau analiza toxicologic ar trebui s fie nceput ct mai curnd posibil dup moarte, nainte ca procesele naturale de descompunere s distrug o otrav prezent iniial la momentul morii ori s produc substane sau compui chimici cu
30

proprieti fizice similare cu cele ale otrvurilor frecvent ntlnite. De exemplu, n timpul descompunerii, fenilalanin, un aminoacid prezent n mod normal n organism, este transformat n feniletilamin, care are proprieti chimice i fizice foarte asemntoare cu amfetamina. Coninutul de alcool etilic i cianur din snge poate fi sczut sau crescut n funcie de gradul de putrefacie i activitatea microbian. Cu toate acestea, multe otrvuri, cum ar fi arsenicul, barbituricele, mercurul i stricnina, pot fi detectabile nc muli ani dup moarte. Un caz neobinuit de analiz post mortem a unei intoxicate cu heroin a artat concentraii mari de morfin, codein 6-monoacetylmorphine (6-MAM) i cofein (Joynt & Mikhael, 1985). Femeia nghiise mai multe prezervative cu o pulbere alb care s-a golit coninutul lor n stomac dup ce s-au spart, apoi scurgerile au ajuns n peritoneu printr-o ruptur in peretele stomacului. Concentraiile sanguine au fost: morfin, 120 mg / L; codeina, 1,7 mg / L; i cafein, 400 mg / L. Fenacetina este un analgezic utilizat cu precdere ca analgezic i antipiretic. Un studiu epidemiologic a aratat c.folosirea excesiv, pe termen lung a fenacetinei este asociat cu creterea riscului de cancer al tractului urinar. Efectul carcinogen al fenacetinei a fost observat i n testele fcute pe animale. Fenacetina devine un metabolit mutagen prin hidroxilare la atomul de azot, cu formare de N-hidroxi-fenacetin ce produce cancer al tractului urinar.
NHCOCH3 deetilare NHCOCH3

OCH2CH3 fenacetina

OH acetaminofen

HO N

COCH3 NCOCH3

OCH2CH3 N-hidril-fenacetina (metabolit mutagenic-carcinogen al tractului urinar)

O metabolit hepatotoxic-cauzeaza necroza celulei hepatice

6. Interpretarea rezultatelor Odat ce analiza probelor este finalizat, toxicologul trebuie s interpreteze concluziile asupra efectelor fiziologice ale substanelor toxice gsite, n funcie de concentraia determinat i
31

dac acestea au putut provoca moartea victimei. Conteaz calea de administrare, indiferent dac toxicul prezent este sau nu n concentraie suficient pentru a provoca moartea sau modifica comportamentul victimei astfel nct s contribuie la moartea sa. Evaluarea rezultatelor analitice din punct de vedere fiziologic este de multe ori problema cea mai dificil cu care se confrunt toxicologul criminalist. La determinarea modului de administrare, toxicologul ia n considerare rezultatele analizei diferitelor probe. Ca regul general, cele mai mari concentraii de toxic vor fi gsite la locul faptei. Prin urmare, prezena unor cantiti mari de droguri sau otrvuri n tractul gastro-intestinal i ficat indic administrarea oral, n timp ce concentraii mai mari n plmni, n comparaie cu alte organe viscerale indic inhalare. Concentraii mari de toxic n esuturile din jurul unui loc de injectare vor indica efectuarea recent a unei injecii intramusculare. Injectarea intravenoas introduce un medicament sau drog direct n circulaia sistemic, evitnd astfel efectul iniial de concentrare n ficat. O examinare a concentraiei relative a medicamentelor (Fortral) n mai multe esuturi poate indica mai degrab o injecie intravenoas, dect o administrare pe cale oral (Figura x).

Fortral, mg/kg corp

ier re C

t ica F

i ich n Ri

Distribuia medicamentului opioid Fortral n diferite organe. Prezena unui material toxic n tractul gastro-intestinal, indiferent de cantitate, nu reprezint o dovad suficient pentru a stabili dac acest toxic este cauza decesului. Toxicologul trebuie s demonstreze c absorbia de toxicului a avut loc i c a fost transportat prin intermediul circulaiei generale ctre organul n cauz, unde aceasta a avut un efect fatal. Acest lucru este stabilit prin analiza sngelui i a esuturilor. O excepie de la regul este dat de substanele chimice puternic corozive, care i exercit efectele nocive direct asupra esuturilor, prin distrugerea acestora, provocnd astfel hemoragie i oc. Exemple relevante ar fi acizii clorhidric i sulfuric concentrai, leia i fenolul. Rezultatele analizei de urin sunt adesea nesemnificative n determinarea efectelor fiziologice ale unui agent toxic. n general, aceste rezultate stabilesc numai dac nainte de colectarea probei toxicul a fost prezent n organism. Corelarea valorilor obinute n analiza urinei cu efectele fiziologice este nesemnificativ, din cauza diverilor factori care influeneaz viteza de excreie a anumitor compui i a volumului de urin.
32

Efectele fiziologice ale celor mai multe droguri i otrvuri se coreleaz cu concentraia acestora n snge i stabilesc dac absorbia a avut loc. Prin urmare, concentraiile sanguine sunt adesea cei mai buni indicatori de toxicitate; n consecin, sngele este una din cele mai valoroase probe pentru toxicolog. Pentru a interpreta corect concentraiile din snge sau din esuturi, toxicologul trebuie s ia n considerare toi factorii care influeneaz obinerea unei concentraii date a toxicului ntr-o prob. Interpretarea valorilor analizei sngelui sau esutului poate fi mprit n trei categorii: (1) normal sau terapeutic, (2) toxic i (3) letal. O valoare normal este atunci cnd concentraia unei substane gsite la majoritatea populaiei i care nu are niciun efect toxic asupra organismului. De exemplu, cianura este de obicei, uor de identificat ca produs chimic extrem de otrvitor, cu toate acestea, cantitile nensemnate de cianur sunt generate n urma ingestiei anumitor alimente. De asemenea, cantiti mici de cianur sunt generate i absorbite n timpul fumatului. Prin urmare, cantiti mici de cianur sunt prezente n mod normal n organism, iar concentraiile sczute sunt tolerate fr a fi toxice. Multe metale grele i metaloide, cum ar fi plumbul, mercurul i arsenul, care nu sunt eseniale pentru funcionarea normal a corpului, sunt prezente la majoritatea populaiei, datorit contaminrii din mediu. O valoare terapeutic este acea concentraie a unui compus care produce efecte terapeutice - cantitatea de medicament necesar i suficient pentru a trata o afeciune medical, dar nu suficient pentru a provoca toxicitate. O valoare toxic este acea concentraie a unui compus care este asociat cu efectele nocive, care pot pune sau nu viaa n pericol. O valoare letal este acea concentraie a unui toxic care are ca efect sau reprezint chiar cauza decesului i este stabilit n mod constant drept cauza morii, n cazuri bine documentate i investigate. n anumite cazuri, toxicologul poate face diferena ntre o intoxicaie acut i o intoxicaie cronic. De exemplu, prul este proba preferat pentru diagnosticul de expunere cronic la arsenic. Analiza secvenial a unor seciuni de pr poate indica modelul de expunere la arsenic. Arsenicul care circul prin snge este depus n foliculul pilos, unde este prins de keratin i transportat pn n foliculul de pr n cretere. Celulele germinative ale prului sunt n echilibru relativ strns cu arsenic circulant. Deoarece concentraiile de arsenic din snge cresc sau scad, la fel se ntmpl i cu cantitatea de arsenic depus n firele de pr cretere. Prul crete cu aproximativ 0.4 - 0.5 mm / zi sau 12,5 mm pe lun. Prin urmare, analiza unor segmente de 1.0 cm sau mai mici ofer un model lunar de expunere. Coninutul normal de arsenic de pr variaz n funcie de factori nutriionali, de mediu i fiziologici. Cu toate acestea, limita maxim la persoane care nu sunt expuse la arsenic este de aproximativ 5 ppm. Odat ce un individ este ndeprtat de sursa de expunere la arsenic, valorile acestuia n pr revin la normal n cteva sptmni. Profilul arsenicului n prul victimei unei crime, prezentat n figura xx, indic otravirea cronic cu arsenic. Ucigaul a pregtit mesele victimei din ultimele 2 luni din viaa sa. Victima a fost n spital, din a treia pn n a cincea lun nainte de moarte, iar cu ucigaul nainte i dup aceast dat. Factorii care pot influena rspunsul unui individ la o concentraie toxic dat sunt vrsta, sexul, greutatea corporal, maturitatea, starea de nutriie, aspectele genetice i imunologice. De asemenea, existena unei boli sau afectarea unui anumit organ, dar i activitatea sistemului nervos central (depresie, stres, etc) trebuie luate n considerare. Un
33

factor suplimentar care complic adesea interpretarea este fenomenul farmacologic de "toleran". Tolerana este o stare de receptivitate sczut la un toxic ca rezultat al expunerii nainte de aceasta, o perioad lung de timp, la un compus asemntor. Exist o serie de mecanisme fiziologice pentru dezvoltarea toleranei. Adaptarea celular este ns cea mai problematic pentru toxicolog.

100 Arsenic, ppm

50

10

14

17

20

22

24

27

30

33

36

Saptamni pna la moarte

Distribuia arsenicului n pr n caz de otrvire criminal.

Adaptarea celular este o form de toleran n care sunt necesare concentraii tot mai mari n snge sau esuturi dintr-un medicament pentru a obine rspunsul farmacologic dorit. De pild, persoanele dependente de narcotice pot lua n mod regulat doze de metadon, care pentru ei nu produc deprimarea sistemului nervos central, n timp ce aceeai doz, poate provoca moartea cuiva care nu primete n mod regulat opiacee. Factorii care influeneaz concentraia din snge sau esut dat dup administrarea unui toxic sunt legai att de natura compusului, ct i de structura biologic a individului. Compoziia chimic i caracteristicile fizice ale unui material modific adesea toxicitatea sa. De exemplu, srurile sau clorhidraii anumitor metale sunt mult mai solubile n tractul gastro-intestinal i, prin urmare, absorbite mai rapid dect sulfurile lor. n general, cu ct se absoarbe mai repede un compus, cu att este mai mare concentraia sa n snge. Preparatele farmaceutice pot fi formulate n aa fel nct, n urma ingestiei orale, medicamentul s fie absorbit fie rapid fie extrem de lent. Factorii biologici ce afecteaz n primul rnd concentraia n snge a unui toxic sunt legarea sa de proteinele din esuturi i viteza sa de biotransformare. Viteza de biotransformare a unei substane este controlat genetic i este adesea supus unor variaii individuale semnificative. n cazul n care mai multe persoane primesc aceeai doz de drog sau medicament raportat la greutatea corporal, concentraia acestuia n snge poate varia foarte mult de la o persoan la
34

alta din cauza diferenelor dintre vitezele lor de biotransformare a respectivelor substane. De pild, Rasputin a fost otrvit cu cianur de potasiu, ns a rezistat dozei administrate n cafea. Ucigaii si au recurs la mpucarea acestuia. Datorit sntaii sale excepionale au fost necesare mai multe gloane pentru a-l rpune. In ceea ce privete cianura utilizat, unii toxicologi consider c administrarea sa n cafea ar fi determinat o reacie a ionului cian cu gruparea carbonil din molecula zahrului, cu formarea unei cianhidrine mai puin toxice. Toxicii sunt eliminai din organism pe diferite ci. Gazele, cum ar fi monoxidul de carbon, sunt eliminate prin plmni o dat cu aerul expirat. Altele, cum ar fi metalele toxice, DDT i morfina, sunt eliminate n principal prin bil i, apoi, fecale. Cu toate c acestea sunt cele mai importante ci de excreie, multe otrvuri sunt eliminate n toate secreiile organismului (transpiraie, lapte i lacrimi). Calea principal de ndeprtare a celor mai muli toxici este eliminarea prin urin. Viteza de eliminare a toxicilor prin urin afecteaz foarte mult cantitatea prezent n snge sau esuturi la un moment dat. Cu toate acestea, excreia urinar este foarte variabil i depinde de volumul i aciditatea urinei. Teoretic, prin schimbarea aciditii urinii cu numai o unitate de pH, este posibil s se produc o modificare de zece ori a vitezei de eliminare a medicamentelor slab acide sau alcaline. Numai dup trecerea n revist a istoricului de caz, lund n considerare toi factorii de toxicitate mai sus menionai, precum i distribuia i biotransformarea i compararea rezultatelor analitice cu cazuri similare raportate n literatura de specialitate sau n cazuri similare din propria sa experien, toxicologul poate trece la interpretarea final a unui caz. 7. Laboratoarele de medicin legal Laboratoarele de medicin legal sau criminalistice se ocup cu examinarea dovezilor de la locul faptei (care sunt legate de crim, victime i suspeci). Constatrile tiinifice de laborator sunt coroborate cu alte devezi pentru pregtirea urmririi penale i realizarea procedurilor juridice sau a procesului penal. Progresele n tehnologia tiinific a condus la realizarea laboratoarelor de criminalistic moderne ce necesit cunotine n domeniile tiinei naturale cum ar fi biologia, chimia, fizica, i matematica. Angajarea n aceste laboratoare necesit, de obicei, o diplom n una sau mai multe din aceste domenii de activitate. Multe persoane cu masterat i doctorat sunt serologi, toxicologi i specialiti n microscopie. A crescut numrul de colegii i universiti care acord grade universitare i postuniversitare n domeniul criminalisticii, inclusiv n toxicologia medico-legal. Laboratoarele de criminalistic ofer o carier interesant i plin de realizri n domeniul tiinei criminalistice unui absolvent de facultate specializat n una sau mai multe tiine naturale. Dovezi fizice examinate n laboratoare pot fi utilizate n cadrul anchetelor criminalistice n urmtoarele domenii semnificative, cum ar fi 1) definirea elementului crimei (aduce dovada c o infraciune a fost comis, cum ar fi identificarea i cuantificare a unui medicament sau substan controlat sau determinarea cantitii de alcool n snge a unei persoane suspectate de conducere n stare de ebrietate); 2) furnizarea cilor de investigaie pentru realizarea unui caz (exemplu, identificarea unei substane n urina unei victime violat i care a fost drogat cu -hidroxibutirat); 3) legarea de scena crimei a suspectului sau victimei (studiul dovezilor fizice, cum ar fi de pr, snge, sperm i amprentele digitale); 4)
35

infirmarea unui alibi sau a unei declaraii prin studiul probelor care difereniaz o sinucidere de o crim (declaraia ucigaului poate fi contrazis de reproducerea unor elemente din actul crimei n laborator); 5) identificarea suspectului, prin compararea amprentelor sau profilare ADN-ului i nu numai; 6) inducerea declaraiei de mrturisire a suspectului (cum ar fi identificarea otrvii n casa ucigaului i a victimei, dovada de cumprare sau procurare a otrvii); 7) exonerarea unui nevinovat (dac nu se gsesc fluidele sale la locul faptei). Laboratoarele de medicin legal sau de criminalistic variaz n dimensiune i dotare. In SUA, de pild, funcioneaz laboratoarele de medicin legal n diferite regiuni ale rii cu specialiti diferite. Laborator FBI, n Washington, DC, este cel mai recunoscut laborator de acest gen. Drug Enforcement Administration (DEA) are laboratoare pentru analiza drogurilor i medicamentelor ilicite, iar Biroul ATF (alcool, tutun, arme de foc) ajut anchetele penale care implic incendii i explozii, precum i cele legate de arme de foc, alcool i tutun. Armata SUA dispune de un laborator de criminalistic n Georgia, precum i altele n Frankfurt, Germania i Japonia. Multe agenii implicate n aplicarea legii se bazeaz pe laboratoare similare la nivel local sau de stat. Birourile medicilor legiti au, de obicei, anexe cu instalaii de laborator. 7.1 Seciuni tipice ale laboratorului criminalistic Laboratoarele de medicin legal ofer servicii multidisciplinare care sunt mprite n seciuni bazate pe tipurile de probe fizice examinate. Unele dintre seciuni au nevoie de echipamente specializate i instrumente sau instruirea personalului, n timp ce alte seciuni pot avea instrumente n comun. Criminalitii se pot roti pe seciunile laboratorului n funcie de formarea lor, experien i calificare. n funcie de mrimea i volumul de munc al unei seciuni anumite, unele dintre seciuni pot fi combinate sau subdivizate.
Forensic laboratories are also maintained at colleges and universities, as well as in the private sector. Forensic laboratories may be full service or specialize in one or more areas. For example, the FBI laboratory and most state laboratories are considered full-service operations, whereas many medical examiners office laboratories concentrate on forensic toxicology or the analysis of body tissues and fluids for drugs, poisons, and other toxic substances. Private forensic laboratories such as National Medical Services, Inc., in Willow Grove, Pennsylvania, offer services in forensic toxicology and criminalistics. Some of the private forensic laboratories are completely specialized in an area of forensic science. The McCrone Research Institute in Chicago, Illinois, performs microscopic analysis of particulate matter, and Cellmark Diagnostics in Germantown, Maryland, provides DNA analysis of blood and other body materials. Whether the forensic or crime laboratory exists in the public or private sector, it should demonstrate a high level of quality control and reproducibility of results through participation in blind testing of samples. Laboratory certification or accreditation is available through organizations such as the Association of Crime Laboratory Directors (ACLD).

Laboratoarele medico-legale sunt, de asemenea, meninute la colegii i universiti, precum i n sectorul privat. Laboratoarele de medicin legal poate fi full service sau se specializeze n una sau mai multe zone. De exemplu, laboratorul FBI i cele mai multe laboratoare de stat sunt considerate operaiuni de full-service, n timp ce multe laboratoare examinator medical de birou se concentreze asupra toxicologiei medico-legale sau analiza tesuturile organismului si fluide pentru droguri, otrvuri, i alte substane toxice. Privat
36

laboratoarele medico-legale, cum ar fi National servicii medicale, Inc, n Willow Grove, Pennsylvania, ofera servicii n toxicologie medico-legal i criminalistic. Unele dintre laboratoare private de specialitate medico-legale sunt complet ntr-un domeniu al tiinei criminalistice. McCrone Institutul de Cercetare n Chicago, Illinois, efectueaz analiza microscopic de pulberi n suspensie, i Cellmark Diagnostics n Germantown, Maryland, ofer o analiz ADN a sngelui i a altor materiale corpului. Dac criminalistice de laborator sau crim exist n sectorul public sau privat, ar trebui s demonstreze un nivel ridicat de control al calitii i reproductibilitatea rezultatelor prin participarea la testarea orb de probe. Laborator de certificare sau acreditare este disponibil prin intermediul unor organizaii precum Asociaia de Crime Directorilor de laborator (ACLD). 7.2 Toxicologie i identificarea drogurilor Secia de laborator destinat toxicologiei i identificrii drogurilor utilizeaz tehnici moderne de chimie criminalistic i de instrumentale pentru a izola, a identifica, de multe ori a cuantifica alcoolul, drogurile, otrvurile i alte materiale toxice. Materialele prezentate pentru analiz pot consta din cantiti mari de droguri ilicite cum ar fi marijuana, heroina, LSD, cocain care trebuie s fie cntrite cu precizie, analizate i de multe ori quantificate pentru a se stabili gradul de abatere de la lege. Alte materiale lichide, solide sau gazoase pot fi trimise pentru analiz pentru a determina prezena oricrui element toxic sau otrvitor. Multe laboratoare de criminalistic analizeaz snge pentru alcool i / sau coninut de droguri. In cazurile de conducere n stare de ebrietate sau sub influena unor droguri sau medicamente, din care a rezultat moartea respectivei persoane, se efectueaz determinarea alcoolului i drogurilor din esuturile organismului i fluidelor sale pentru determinarea cauzei de deces n legtur cu medicul legist. 7.3 Serologia Serologia medico-legal se ocup cu analiza, identificarea i individualizarea fluidelor i esuturilor corporale, secreiilor i excreiilor. Sngele, sperma, saliva sunt tipurile cele mai frecvent ntlnite de probe, dar ocazional probe cum ar fi transpiraia, urina, coninutul gastric, i fecalele pot fi examinate n scop de caracterizare. Dovezi fizice de acest tip sunt, de obicei, trimise la laborator n form de pete uscate pe haine sau alte materiale recuperate de la locul faptei, de la victim sau suspect. Eantioanele de control formate din zone curate de pe suprafaa din care au fost obinute petele suspecte trebuie s fie incluse n analize. Probele standard cunoscute constnd din sngele victimei i / sau suspectului sunt, de asemenea, utilizate n scopuri comparative. 7.4 Materialele examinate de toxicologul criminalist 7.4.1 Colectarea probelor Calitatea de probelor fizice depinde de buna observare, documentare, de colectare, conservarea, ambalarea acestora la locul crimei, precum i a celor ce provin de la victim i suspect. Acest lucru solicit calificare i meticulozitate de la anchetatori i patologi la locul crimei, precum i utilizarea metodelor tiinifice sofisticate n laborator. Acest lucru este
37

realizat prin instruirea corespunztoare i experien de anchetatori scena crimei i patologi medico-legale, precum i oameni de tiin medico-legal sau criminaliti angajate n domeniul examinrii tiinifice a probelor fizice n laborator. Este necesar s se cunoasc poziia probelor fizice de la scena crimei nainte de colectare i de ambalare. Aceasta se realizeaz de obicei prin fotografie, note scrise i diagrame. Colectarea probelor fizice impune o atenie deosebit asupra tipului de dovezi ntlnite i ambalarea lor corespunztoare. Dovezile nu trebuie s se modifice, denatureze sau s fie contaminate nainte de analiz. Elementele colectate trebuie marcate cu un numr secvenial, n funcie de locul unde au fost descoperite, notnd ora i data i parafarea acestor informaii de ctre persoana care a colectat probele. Materiale cu risc biologic, cum ar fi sngele i fluidele corpului, ar trebui plasate n containere marcate n mod clar. Laboratoarele criminalistice au protocoale de colectare a probelor i ambalare care trebuie respectate cu strictee. De exemplu, materialele ptate de snge, cum ar fi hainele sau lenjeria de pat ar trebui s fie bine uscate la aer, nainte de ambalare. Aceasta evit activitatea bacterian care ar putea mpiedica analizele ulterioare. Sunt necesare containere speciale pentru colectarea de particulele sub form de urm, din prob, pentru a evita pierderea i contaminarea. O bun comunicare ntre laborator i tehnicienii de la scena crimei este esenial ca s se asigure c procedurile corespunztoare sunt respectate. 7.4.2 Tipuri de dovezi fizice Dovezile fizice pot exista n aproape orice form sau dimensiune, n funcie de natura i mediul nconjurtor al evenimentului penal. Acesta poate exista la locul crimei sau a fost transferat ntre victim i agresor, precum i n orice alt loc, n funcie de activitile persoanelor implicate. Examinarea i analiza probelor fizice de ctre criminalist presupune identificarea fizic sau chimic a materialelor cu cel mai nalt grad de certitudine tiinific posibil cu tehnologia actual. De exemplu, identificarea i determinarea cantitii de substan prezent n probe reprezint obiective ale analizei alcoolului i drogurilor ilicite. Se stabilesc elementele infraciunii n cazurile de conducere a automobilului n stare de ebrietate sau n cele care implic deinerea sau vnzarea de substane cu regim special. Uneori se compar probe extrem de diferite ntre ele pentru a se realiza contextul unei infraciuni sau crime. Astfel, de pild, tabloul unui jaf n care un grup de indivizi au lovit un paznic de noapte i au sustras apoi cereale dintr-o magazie poate fi redat att de declaraia respectivului paznic, de urmele lsate de infractori pe teren, de analiza cromatografic a seminelor de cereale pentru a stabili dac cele sustrase sunt identice cu cele din magazie, etc. O astfel de comparaie implic potrivire fizic fragmentelor de obiecte gsite la faa locului sau n curtea infractorilor, stabilirea tipului de autoturism implicat, existena urmelor de sticl sau haine, toate sub forma unui joc puzzle. Unele probe sub form de urm, cum ar fi firele de pr i fibrele, necesit un studiu comparativ microscopic. Un exemplu de suficien n actul de justiie l constituie rezolvarea unui caz numai pe baza mrturiei fptuitorului. Este o greeal imens aceast atitudine, deoarece un individ poate lua asupra sa fapta altei persoane (so-soie, mam-fiu, etc.), iar alte persoane pot fi obligate la mrturie mincinoas. De aceea, refacerea ntregului tablou pe baz de dovezi tiinifice poate conduce la un act de justiie
38

corect. Criminalistul poate s prezinte i probabilitatea c dovada adus de el este corect i incrimineaz infractorul sau criminalul. Astfel, analiza ADN-ului conduce la o identificare a suspectului cu o probabilitate mai mare de 99,99%.
8. Tipurilor comune de dovezi fizice

Fluidele din organism, cum ar fi sngele, sperma, saliva, sub form lichid sau uscat sunt adesea prezente pe esturi, haine sau alte obiecte. Aceste materiale biologice sunt frecvent colectate pe crpe sau tampoane sterile de la locul crimei sau de la persoanele implicate pentru identificri prin tehnici serologice sau profil ADN. Identificarea unor tipuri de snge la locul unei crime violente i pe hainele victimelor i suspecilor permite lmurirea evenimentului. Alte excreii ale corpului, cum ar fi urina, transpiraia i fecalele pot fi identificate n diferite pete sau materiale. Identificarea de snge sau material seminal pe uscat, materiale colorate i individualizare ulterioare, precum i fa de persoanele cunoscute pentru includerea sau excluderea sunt funciile majore ale serologist. Se procedeaz la identificarea sngelui cu un test chimic ce utilizeaz anumite metale i peroxidaze de plante pentru a indica posibila prezen de snge. Alte teste pentru snge includ fenolftaleina, care produce o culoare luminoas de culoare roz, n prezena sngelui i verde leucomalachite, care produce o culoare albastru-verde n prezena acestuia. Luminolul este un alt tip de test prezumtiv pentru snge, care este frecvent utilizat la locul crimei pentru a localiza urmele de snge n zonele care au fost splate sau de snge nu este altfel vizibil cu ochiul liber. n aceste cazuri, luminolul se pulverizeaz pe suprafeele cu posibile urme de snge i se observ n ntuneric o luminiscen chimic alb-albastruie care poate indica prezena sngelui. Acest tip de luminescen poate fi fotografiat pentru a fi inclus ca dovad n actul de justiie. Daca testul este negativ, se consider c sngele nu este prezent n eantion. Dac testele sunt pozitive, se trece la confirmare i identificarea speciilor (origine uman i animal). Acest lucru este realizat cu anticorpi specifici, care vor reaciona cu materialul suspect. Proceduri serologice convenionale pentru individualizarea sngelui, precum i a materialului seminal includ caracterizarea proteinelor polimorfe i a markerilor genetici. Aceste proceduri sunt mai rar utilizate de cnd cu apariia tehnicilor ADN. esuturile organismului pot fi prelevate pentru analize toxicologice din organele recoltate la autopsie, mpreun cu snge, urin i coninutul stomacal. Drogurile i substanele cu regim special sunt recoltate sau confiscate pentru identificare i cntrire; acestea pot fi materii prime vegetale, pulberi, tablete, capsule sau alte preparate.

39

Unele dintre capsulele i tabletele confiscate conin LSD (dietilamida acidului lisergic. Materialele explozive i lichidele inflamabile, materialul solid sau resturile arse pentru identificarea de accelerants i reziduuri explozive sunt de interes criminalistic general, mai puin interesnd toxicologul. Acelai lucru se poate afirma despre armele de foc, proiectilele sau gloanele gsite la locul unei crime, etc. Se pot colecta probe de sticl, acestea putnd fi importante pentru nelegerea direciei unui glonte. Pentru toxicolog ns pot fi interesante firele de pr colectate de la scena crimei, victim sau suspect pentru determinarea identificarea speciilor (animale sau umane), ras, i partea corpului de origine. Dac este uman, caracteristicile morfologice ale prul pot fi utilizate pentru a include sau exclude un suspect. De asemenea, este posibil s se determine dac prul a fost zdrobit, tiat, ars, scos cu fora sau czut n mod natural. In firul de pr pot fi identificate metalele grele, arsenul etc. Dac numrul firelor este foarte mic, atunci determinrile toxicologice sunt mai dificil de realizat. Uleiurile i produsele cosmetice transportate de la obiecte la persoane fizice posed compoziii unice ce pot fi folosite pentru comparaie i identificare. Toxicologul poate utiliza astfel de date pentru precizarea persoanei la care s-au descoperit droguri sau otrvuri. Solurile i mineralele, lemnul, vegetaia i altele pot permite identificarea i stabilirea sursei sau locaiei posibile care poate fi asociat cu un suspect sau victim. 9. Analiza de urme Principalul instrument pentru analiza urmelor este microscopul. Un stereo microscop de putere medie care mrete, de obicei, n intervalul 40-50 este utilizat pentru scanarea i sortarea multe tipuri de dovezi fizice, cum ar fi hainele i pentru colectarea de urme materiale. Microscopul cu mrire de pn la 1000 este utilizat pentru analiza i compararea firelor de pr, fibreloe, solului, produselor cosmetice, particulelor de praf i de reziduuri, precum i o gam larg de pulberi n suspensie. Un microscop cu lumin polarizat este utilizat pentru observarea proprietilor optice i morfologia materialelor. Un microscop de comparaie este utilizat pentru vizualizarea side-by-side a probelor, cel mai frecvent firele de pr i fibre. Acesta reprezint de fapt dou microscoape conectate printr-o prism cunoscut ca punte de comparaie. Acest lucru permite mprirea cmpului vizual al fiecrui microscop ntr-un semicerc, astfel nct cele dou eantioane pot fi vizualizate simultan.
40

Analiza de urme a probelor poate permite identificarea vopselelor, sticlelor, uleiurilor i o serie de compui organici folosind teste microchimice i instrumentale. Exemple de instrumente utilizate n acest sens sunt GC-MS i tehnicile de analiz organic elementar, inclusiv IR, difractie de raze X i fluorescen, spectrofotofluorometrie i microscopie electronica de baleiaj (SEM). Microscopul electronic de baleiaj cu o rezoluie bun i mrire de pn la 100.000 este, de asemenea, utilizat pentru examinarea probelor de particule din mpucare, recuperate din minile persoanelor suspectate de folosire recent a unei arme sau de a se fi aflat n imediata apropiere a descrcrii unei arme de foc. Bibliografie selectiv 1. Poklis, A. Forensic toxicology. In Introduction to forensic sciences. 2nd Ed., (W. G. Eckert,Editor) CRC Press, Boca Raton New York London Tokyo, 1997, pp. 116-141. 2. Cravey, R. H., Baselt, R. C. Introduction to Forensic Toxicology. Biomedical Publications, Davis, CA, 1981. 3. Ellenhorn, M. J., Barcelous, D. G. Medical toxicology, diagnosis and treatment of human poisonin., Elsevier Science Publishing, New York, 1988. 4. Eckert, W. G., James, S. H. The role of the forensic laboratory. In Introduction to forensic sciences. 2nd Ed., (W. G. Eckert, Editor) CRC Press, Boca Raton New York London Tokyo, 1997, pp. 43-65. 5. R. C. Baselt and R. H. Cravey, Disposition of toxic drugs and chemicals in man. Yearbook Medical Publishers, 3rd ed., Chicago, IL, 1990. 6. Clarkes isolation and identification of drugs in pharmaceuticals, body fluids and postmortem material. 2nd ed., A. C. Moffat, Senior Ed., Pharmaceutical Press, London, England, 1986. 7. Curry, A. S. Poison Detection In Human Organs, 4th ed., Charles Thomas Publisher, Springfield, IL, 1988. 8. Joynt, B. P., Mikhael, N. Z. Sudden death of a heroin body packer. J. Anal. Toxicol., 9, 238-240, 1985.

41

Elemente de Toxicologie Medico-Legal

Cap. II. Analiza toxicologic. Tehnici i strategii de sampling a probelor judiciare. Analiza fizico-chimic. Metode de analiz n toxicologie. Electroforeza. Cromatografia n strat subire. Cromatografia de lichide de nalt performan. Cromatografia de gaze. Spectroscopia. Tehnici imunologice. Aplicaii.

Analiza toxicologic n investigarea unei otrviri, pentru toxicolog este necesar mai nti izolarea i identificarea otrvii. Prin urmare, toxicologii criminaliti clasific otrvurile pe grupe, n funcie de metoda utilizat pentru a izola substanele din esuturile sau fluidele corpului. nainte de a ncepe analiza, toxicologul trebuie s ia n considerare mai muli factori: cantitatea de prob disponibil, natura otrvii cutate i posibila biotransformare a otrvii. Pentru c lucreaz cu o cantitate limitat de prob, toxicologul trebuie s elaboreze o metod analitic, ce va permite detectarea numr ct mai mare de compui. Testul de culoare Un test de culoare este o procedur chimic n care substana de testat reacioneaz cu un reactiv care produce o schimbare acestuia, producnd astfel o culoare observabil sau schimbarea culorii. Testele de culoare pot fi folosite pentru a determina prezena anumitor compui sau a unei clase generale de compui. Procedurile sunt, de obicei, rapide i uor de realizat. Cel mai folositor dintre testele de culoare n toxicologie este depistarea rapid a probelor de urin, deoarece urina poate fi analizat n mod direct, fr proceduri de extracie consumatoare de timp. Un exemplu de test de culoare este "testul lui Trinder " pentru detectarea salicilailor n snge sau urin. Un reactiv de azotat de fier i clorur de mercur se amestec cu 1 ml de snge sau urin; n cazul n care sunt prezeni salicilaii se observ o culoare violet. Ca i n toate celelalte teste toxicologice, prezena de salicilai trebuie s fie confirmat i de o alt metod de analiz. Se observ un test Trinder pozitiv pentru acidul salicilic (un metabolit al aspirinei), salicilamidei i salicilatului de metil. Un test fals-pozitiv, care conduce la obinerea unei culori atunci cnd nu este prezent salicilatul, poate fi observat la urina pacienilor cu diabet zaharat excreting acid acetoacetic i la pacienii tratai cu doze mari de medicamente terapeutice fenotiazinice. toxicolog trebuie s fie contieni de limitrile de el efectueaz teste i, n special sursele de reacii fals-pozitive. Testul de microdifuziune Analiza microdifuziune este utilizat pentru izolarea rapid i detectarea de otrvuri volatile.
42

Un aparat simplu microdifuziune const dintr-un vas de porelan mic cu dou compartimente separate, un interior bine inconjurat de un exterior bine formate ntre periferie a peretelui de compartimentul interior i peretele superior din afara vasului. bine exterior este celula proba, la care o cantitate mic, 1-5 ml, de snge, urin, esut sau omogenatul se adaug. Pentru interior si un "absorbant", se adaug. absorbant este un reactiv sau solvent, n special substane volatile care se va dizolva imediat. Dup eantion i absorbant se adaug la celula corespunztoare, vasul este sigilat cu un material izolant vscoase i acoper cu o plac de sticl rodat. Daca este permis s stea la temperatura camerei sau usor incalzite, otrava volatile va difuza din eantion n atmosfer a vasului i s fie prinse de soluia absorbant, care adesea este un reactiv de culoare. Pe msur ce otrava este eliberat din eantion, toxicologul poate observa formarea unei coloraii sau schimbarea culorii din vasul din interior absorbant. Numeroase otrvuri volatile i gaze pot fi detectate prin tehnici de microdifuzie; acestea includ acetaldehid, monoxid de carbon, cianur etanol, fluor, hidrocarburi halogenate i metanol. Cromatografia Cromatografia este o tehnica de separare. componente ale unui amestec de prob sunt distribuite ntre dou faze, dintre care una este staionar n timp ce a doua, faza mobil, percoleaz printr-o matrice sau pe suprafaa fazei fixe. Componentele unui amestec prezint diferite grade de afinitate pentru fiecare faz, iar cnd acestea sunt transportate de faza mobil, are loc o migrare difereniat. Unele componente sunt reinute pe faza staionar mai mult dect altele, producndu-se o separare a compuilor din acel amestec. Reinerea unei componente de ctre faza staionar depinde de mai muli factori, inclusiv natura chimic i fizic a fazelor fixe i mobile, precum i de condiiile experimentale, cum ar fi temperatura sau presiunea. De aceea, substanele folosite drept standarde de referin se cromatografiaz n aceleai condiii ca substanele necunoscute. Aceti compui sunt identificai provizoriu prin compararea factorului lor de retenie n faz staionar cu acela al standardelor de referin. n continuare, dup cromatografie, identitatea compuii respectivi trebuie identificai i prin alte metode de analiz, cum ar fi spectrometria de mas. Din multele tipuri de analize cromatografice, trei sunt mai frecvent aplicate de toxicologi. Acestea sunt cromatografia n strat subire (TLC), cromatografie de gaz-lichid (GLC) i cromatografia lichid de nalt performan (HPLC). Cromatografie n strat subire. n TLC, faza staionar este un "strat subire" a unui gel absorbant, de obicei silice (bioxid de siliciu), care se intinde pe un suport solid, cum ar fi o plac de sticl. Extractele concentrate din probele prelevate, mpreun cu mostrele (standardele) de droguri sunt aplicate sub form de serie de puncte de-a lungul parii de jos a plcii cromatografice i lsate s se usuce. Placa este apoi plasat ntr-un vas cromatografic nchis (de form paralelipipedic), n care stratul absorbant de silicagel sau oxid de aluminiu de pe sticl intr n contact cu faza mobil (soluia de developare) sub punctele de substane aplicate.
43

Pentru identificarea unei substane se folosete un standard, adic substana cutat, de exemplu un drog (heroin, LSD, cocain) sau un medicament, care se spoteaz pe linia de start (de exemplu n poziia 4 din figura de mai jos). Proba de analizat (de pild urin, extract din firul de pr, etc) se spoteaz n celelalte poziii pe linia de start. Dup migrarea solventului, care poate fi o soluie ce conine solveni diferii (ap: alcool butilic: acid acetic; ap: aceton: amoniac, etc.) pe plac pn n apropierea marginii de sus a plcii de silicagel depus pe aluminiu, se traseaz cu creionul, ca i n cazul liniei de start, locul unde a ajuns solventul (frontul solventului, Fs). Se usuc placa la aer sau prin suflare cu aer cald de la un usctor de pr, se developeaz substanele de pe plac cu un reactiv potrivit, se usuc din nou pentru a obine pete stabile i se msoar factorul de retenie, Rf. Se pot vizualiza substanele de pe plac prin iluminarea acesteia cu lumin ultraviolet, dac placa are adugat o substan fluorescent. In acest caz se marcheaz substanele cu un creion. Rf este de regul o caracteristic a unei substane ntr-un amestec de developare anumit. Totui, este bine s se introduc i un standard. Rf se calculeaz astfel: se mparte distana parcurs de o anumit substan de la linia de start la distana parcurs de frontul solventului de la linia de start.

Frontul solventului (cu creionul) Ali compui

Standard Spoturi de amestec Compus identificat Linia de start (cu creionul)

Spot de standard
Tehnica TLC: Plac din aluminiu cu silicagel pe care migreaz diverse substane ce sunt identificate apoi prin Rf (factorul de retenie). De exemplu, n extractele de urin pentru depistarea drogurilor, toxicologul spray-iaz cromatograma cu ninhidrin care produce o culoare roie sau roz cu amine primare, cum ar fi amfetamin sau efedrin. Apoi, el poate aplica etanol n acid sulfuric, care produce o serie de pete viu colorate n roz, portocaliu, albastru sau verzi dac sunt prezente tranchilizante fenotiazinice i metabolii ai acestora. Placa poate fi n continuare pulverizat cu iodoplatinat, care reacioneaz cu toate baze azotate.
44

Exist numeroi reactivi pentru TLC, dar toxicologul trebuie s fie ghidat de natura chimic a compuilor pe care dorete s-i identifice. n cazul n care un compus din extract migreaz la aceeai distan i reacioneaz la spray-urile aplicate n acelai mod ca drogul de referin, toxicologul va ncerca identificarea compusului printr-un alt test chimic. Cromatografia de gaz-lichid n GLC, faza mobil este un gaz purttor inert (de exemplu, heliu, azot), care curge printr-o coloan umplut cu un suport solid acoperit cu faz lichid staionar sau peste un strat lichid aflat pe pereii coloanelor capilare nguste. Mai multe tipuri de materiale lichide sunt folosite n aceast tehnic i se folosesc n funcie de natura compui sau grupe de compui care trebuie separai i identificai. Probele extrase sunt vaporizat i transporatate de gaz prin coloan. Deoarece compuii sunt eluai de pe coloan, acetia sunt transportai de gaz la un detector, care produce un semnal electric care este amplificat i afisat pe un nregistrator. Migrarea unui compus prin coloan este exprimat prin timpul de retenie (Rt), care este definit ca intervalul de timp scurs ntre injectarea probei i detectarea compusului. Timpul de retenie ofer o ncercare de identificare a compusului, iar intensitatea semnalui la nregistrator poate fi folosit pentru determinarea cantitativ a compusului prezent n prob. Un compus de referin se cromatografiaz n aceleai condiii ca i compuii cutai, care produce un semnal (vrf, peak) la acelai timp. nlimea semnalului i aria dsa sunt direct proporionale cu concentraia drogurilor prezente Cromatografia de gaz este deosebit de adecvat pentru analiza substanelor volatile, cum ar fi alcoolii.

Cromatograma de gaz a unui amestec de alcooli:

A Metanol; B Aceton; C Etanol; D Izopropanol; E Butanol.

Cromatografia de lichid de nalt performan n HPLC, faza mobil este un lichid care curge printr-o coloan umplut cu faza staionar solid, sub presiune continu. Sunt folosite umeroase tipuri de materiale staionare, iar
45

toxicologul poate folosi aproape orice fel de amestecuri de solveni sau numeroase amestecuri apoase ca faza lichid. Se pot imagina proceduri specifice pentru separarea compuilor care nu sunt uor de separat prin alte metode cromatografice. Metoda este adecvat n special pentru compuii sensibili la cldur, care se pot descompune atunci cnd se volatilizeaz n GLC. Ca i n cazul GLC, medicamente eluate sunt identificate prin Rt lor, iar semnalele la detector sunt proporionale cu concentraia de droguri prezente n eantion. Spectroscopia Spectroscopia se refer la absorbia sau producerea de energie radiant. Absorbia radiaiei este o caracteristic a tuturor moleculelor, cu toate acestea, dar lungimea de und a radiaiei absorbite poate varia de la raze X prin ultraviolete, vizibile i infra-rou pn la frecvenele microundelor i undelor radio. Interaciunea unui compus chimic cu radiaia depinde de structura molecular i lungimea de und a radiaiei. Absorbia radiaiei de ctre un compus n raport cu lungimea de und a radiaiei reprezint un spectru de absorbie i este o caracteristic a compusului. Specificitatea spectrului este legat de regiunea de absorbie. De exemplu, numeroi compui chimici au spectre n ultraviolet identice (200-350 nm), n timp ce spectrul de infra-rou (2.8 25 m) este extrem de specific, fiind amprenta compusului dat. De asemenea, exist o relaie direct ntre intensitatea absorbiei energiei radiante i cantitatea de material absorbant prezent. Acest lucru se aplic la absorbia oricrei forme de energie radiant, de la raze X la undele radio. Prin alegerea experimental lungimea de und a absorbiei maxime, poate fi determinat concentraia unui compus dintr-un eantion.

Diverse tipuri de spectrofotometre utilizate n laboratoarele de toxicologie medico-legal Spectrofotometrul este folosit pentru a msura absorbia de energie radiant i const dintr-o surs de radiaie, o celul pentru prob prin care trece radiaia i un detector pentru msurarea absorbiei radiaiei. lungimi de und mai aplic la analiza toxicologice sunt ultraviolete, vizibile, i infra-rou. instrumentele comerciale utilizate pentru msurarea absorbiei de aceste forme de lumina poate varia de la simple colorimetre, utilizat pentru a msura de absorbie n spectrul vizibil, pentru a spectrofotometre extrem de sofisticat care utilizeaz lumina monocromatica si electronice sensibile pentru a detecta, amplifica, i niveluri sczute record de radiatii. n timp ce diverse forme de analiz spectroscopice pot fi
46

aplicate pentru a analiza toxicologie medico-legale, numai spectrofotometria n ultraviolet va fi discutat aici. Absorbia radiaiei ultraviolete (UV) poate duce la tranziiile electronice n moleculele organice, provocnd promovarea electronilor de pe orbitalele cu energie minim (starea fundamental) pe orbite de mare energie. Lungimea de und a maximului de absorbie va depinde de gruprile chimice prezente n molecul, de natura solventului n care compusul este dizolvat, de pH-ul i temperatura soluiei. Soluiile apoase i alcoolice sunt cele mai utilizate de toxicologi. Trasarea grafic a absorbanei unui compus n raport cu lungimea de und (210-350 nm) reprezint spectrul de absorbie n ultraviolet. Majoritatea medicamentelor de interes toxicologice absorb lumina din regiunea ultraviolet. Spectrul UV este caracteristic unui compus, n condiii experimentale i poate fi utilizat pentru identificarea prezenei unui anumit medicament. Cu toate acestea, identificarea nu este univoc deoarece numeroi compusi pot prezenta acelai spectrul UV. De exemplu, amfetamina, efedrina, metamfetamina, feniletilamina, propoxifenul i multe alte medicamente posed maxime de absorbie n UV, n soluie acid la 263, 257 i 252 nm. Se prefer acum separarea compuilor prin HPLC i apoi nregistrarea spectrului UV pe msur ce drogurile izolate elueaz de pe coloan. Concentraia medicamentului poate fi determinat prin compararea intensitii absorbiei la lungimea de und unde absorbia este maxim cu concentraii de standarde de droguri pure analizate n aceleai condiii experimentale. Spectrometria de mas n spectrometria de mas, un compus este bombardat cu un fascicul de electroni care produce fragmentarea moleculei cu formare de fragmente ionizate pozitiv i cu mase moleculare diferite. Dintr-o molecul dat se obin numai anumite fragmente i masele acestora formeaz un spectru caracteristic acelei substane. Acest lucru este posibil deoarece molecula ncrcat electric nu are toate legturile identice i cele mai slabe se vor rupe mai uor. Fragmentele ncarcate electric sunt separate i detectate n funcie de masele lor atomice. Spectrul de mas indic proporia fiecrui fragment (abundena relativ) la un raport mas-supra-sarcin specific. n condiii experimentale, fragmentarea moleculelor complexe conduce la un spectru caracteristic datorit faptului c fragmentarea este extrem de specific i permite adesea o identificare fr echivoc. Izolarea opiaceelor din probele biologice Extracia cu solvent. Extracia cu solvent a fost utilizat de decenii pe scar larg pentru izolarea de opioide din probele nebiologice, plante i umane. Recent, a fost descris microextracia n faz lichid (LPME) de Rasmussen i colaboratorii [23], precum i de grupul Ugland [24].

47

Exemple de determinri toxicologice DETERMINAREA TOXICILOR MINERALI METODE GENERALE DE IZOLARE (MINERALIZAREA) Toxicitatea molecular i toxicitatea atomic Aa cum s-a artat la capitolele despre toxici gzoi i volatili, dinte care o mare parte sunt compui organici efectul lor toxic se datorete moleculei ntregi sau unor funcii prezente n molecul i nu elementelor componente. Toxicitatea benzenului este determinat de molecula ntreag C6H6 i nu de atomul de C i H; toxicitatea nitroderivailor se datorete funciei NO2, respectivCN etc. Acest gen de toxicitate este denumit toxicitate molecular. Dinpotriv, n cazul toxicilor minerali, toxicitatea este conferit de elementul mineral di diferii compui: - cation : As3+; As5+; Hg2+; Mn2+; Ba2+; Tl+, etc.; - anion : Fe - sare : Hg(CN)2 . Pb3(AsO5)2 etc.; - acizi i baze tari: H2SO4; NaOH etc. La cele ma multe cazuri, toxicitatea se datorete deci, nu moleculei ntregi, ci elementuliu mineral. De exemplu, n compuii de arsen, unde acesta se afl, fie sub form de cationi (As3+ sau As5+), fie sub form de anioni As---- toxicitatea, de diferite intensiti, este conferit de elementul arsen. Este aa numita toxicitate atomic (Fabre). Ea se manifest numai n cazul substsnelor solubile i ionizabile (BaCl2) sun toxici puternici, iar srurile insolubile (BaSO4, BaCO3) sunt netoxice.Totui BaCO3 poate fi solubilizat n organism de ctre HCl din sucul gastric, trecnd n BaCl2, ionizabil i deci toxic. Prin urmare, n cazul intoxicaiei cu compui ai metalelor toxice, trebuie s se cerceteze n primul rnd cationul (As, Hg, Pb; etc.). Este ns necesar uneori s se precizeze i natura anionului, care poate avea o toxicitate proprie : de exemplu Hg(CN)2 este toxic att datorit Hg2+ ct i CN-. n intoxicaiile cu acizi i baze, se cerceteaz direct prezena acestora. n practic, toxicologul este solicitat s separe, s indentifice i s dozeze toxicii minerali din diverse produse. Izolarea toxicilor minerali (sruri metalice, acizi, baze). n organism toxicii minerali pot exista sub form ionic dau de combinaii complexe (ptoteinai ai metalelor grele) puin sau de loc ionizabile. Compuii ionizabili pot fi uor oui n eviden n maceratul apos al produsului de analizat(organe,etc), pe cnd combinaiile proteice alemetalelor grele neionizabile nu pot fi depistate direct. n acest cazse impunerea distrugerea materiei organice pentru a "demasca" toxicul,eliminnd aciuneaeliminnd aciuneaturbatoare a substanelor proteice i ionizndu-l din nou. Rezult deci c toxicii minerali pot fi separai din produsele organice pe dou ci. - compuii ionizabili (acizi, baze, sruri) nu necesit distrugerea materiei organice i sunt separai prin: antrenare cu vapori, dializ, electrodializ, ultrafiltrare prin membran poroas:,

48

- compuii nionizabili (compui ai metalelor grele) reclam distrugerea materiei organice, pe cale uscat sau umed. Teste preliminare n toate cazurile se recomand folosirea iniial, a unor teste preliminare de orientare. Testul celmai folosit este testul Reinsch : podusul de analizat se trateaz cu HCl 10% pentru descompunerea proteinailor metalelor grele i obinerea clorurilor ionizabile. Se menine se menine produsul timp de 1 or pe B.M., apoi se filtreaz prin tifon. Se introduce n lichid o srm de cupru decapat )degresat n alcool, eteri apoi tratat cu HCl sau HNO3 i n final splat cu ap distilat. ionii metalelor mai slab electropozitive (As, Hg, Sb) se vot depune pe srm sub forma unor pete. O tehnic mbuntit este folosirea mai multor lame din diferite metale (zinc, fier, cupru i platin); dup culoarea petei depuse pe una din lame, se deduce, cu oarecare siguran , metalulcare se afl n produsul de analizat. Dstrugerea materiei organice i izolarea toxicilor minerali Operaia de distrugere a materiei organice se realizeaz pe cale uscat sau umed. n raport cucondiiile de lucru, didtrugerea poate fi complet sau parial, pentru a permite desfacerarea ionic a toxicului din complexul organomineral iniial. La alegerea modului de distrugere trebuie s se in sema de: - obonerea unei mineraliti sastifctoare; - evitarea pierdereii de toxic prin volatilizare (Hg, F), deflagrare, absorbie, etc. - evitarea unei tehnici laborioase sau costisitoare; - evitarea folosirii reactivilor n cantiti mari (pentru a nu dilua produsul de analizat, n care deja toxicul se afl n cantiti mai mici, dispersat ntr-o mai mare de produs); - n cazul distrugerii cu clor, este obligatorie ndeprtarea alcoolului, pentru a nu se produce explozie; n acest scop, produsul se alcalinizeaz uor cu Na2CO2 i se nclzete pe B.M. la 40-50; - evitarea transformrii toxicului n produi nedecelabili (de exemplu trecerea fosfatului i hipofosfitului n acid fosforic); - Folosirea reactivilor puri i a sticlriei neutre, pentru a nu introduce n analiz, pe aceast cale, elemente cercetate (AS, Pb, etc.) Pentru distrugere, metalele se pregtesc n modul urmtor: - produsele solide (alimente plante) se mrunesc i se omoginizeaz; - produsele lichide (urin, etc.) n volume mari, se alcalinizeaz i se concentreaz pe B.M. (n cazul distrugerii sulfonitrice); - materialul n cantitate mare(viscose 300-500 g; fin 100 g) se poate distruge n poriuni mici, ce se reunesc apoi pentru analiza final. Principalele metode de distrugere a materiei organice n analiz toxicologic se poate reprezenta schematic astfel: 1. calcinare direct (simpl) 2. calcinare cu adaos de oxidant i substane poroase a) azotat de potasiu (Orfila)
49

I. Calcinare (incinerare)

II. Oxidare umed

b) oxid de magneziu (Geneuil) c) oxi i azot de magneziu 3. calcinarea cu carbonat i azotat de sodiu 4. calcinarea n curent de oxigen (cu recuperarea metalelor volatile) 1. distrugerea cu clor nativ(aciunea litic a Clorului) HClO3 + Cl 2. distrugerea n mediu H2SO4, singur cu adausuri (carbonizare sulfuric) a) H2SO4 (Flandin-Danger) b) H2SO4 + HNO3 c) H2SO4 + HNO3 + H2O2 (Truffert) d) H2SO4 + HNO3 + HClO4 (Kahane) e) H2SO4 + NH4NO3 (Stepanov)

I. Distrugerea prin calcinare Fiecare din metodele de distrugere uscat are avantajele i dezavantajele ei. 1. Calcinarea direct permite: - obinerea unei cenui fr materie reziduu organic, n care metalul se gsete n cea mai mare parte sub form de carbonat; - Concentraia maxim a toxicului; n schimb: n schimb operaia este laborioas i de lung durat, necesitnd uscarea prealabil; - are loc pierdere de toxic, att prin umflare i debordare, ct i mai ales prin volatilizarea metalelor (Hg, Zn, Cd), a oxizilor metalici (As) sau a srurilor, n special cloruri (Sb,As); - distrugerea este incomplet atunci cnd crbunele este inclus n topirea carbonailor alcalini. Pentru minimalizarea acestor inconveniente, calcinarea se face n prezen de oxidant i alcalinizant. 2. Calcinarea cu adaus de oxidani (I SUBSTANE POROASE): nc Orfila a folosit ca oxidant azotatul de potasiu. Prin acest mod, faza reductoare, n care compuii sunt redui la metal (uneori volatili) este micorat la maximum. Totui rmne pericolul pierderii de toxic prin deflagare (crbunele mpreun cu azotatul de potasiu formeaz un amestec exploziv). Mai trziu Gneuil a adugat ca oxidant i n acelai timp alcalinizant, oxidul de magneziu; acetia dei este oxidant alb, confer porozitate mase de calcinat, uurnd oxidarea cu oxigen atmosferic. n plus, scade temperatura de combustie, minimaliznd pierderile, mai ales c metalele oxiacide (As) trec sub form de sruri nevolatile. Metoda a fost mbuntit ulterior de Marthul i Kohn-Abrest, care au adugat o surs de oxigen: azotatul de potasiu. 3. Calcinarea cu carbon i azotat de sodiu constituie o alt variant a calcinrii.

50

4. Calcinarea n curent de oxigen: dei asigur o distrugere mai rapid, poate produce pierderi de toxic, de aceea trebuie utilizat o aparatur special pentru recuperarea minerali volatilizai. Indiferent de variant, calcinarea este exclus pentru cercetarea mercurului. II. Distrugere pe cal umed Se realizeaz, fie cu clor nscnd, fie cu acizi oxigenai (H2SO4 , HNO3), cu sau fr adaus de ali oxidani (H2O2, HClO4, etc.). 1. Distrugere cu clor nscnd Metoda propus de Dufles i Millon (1838), Abreu (1844), a fost perfecionat de Jaquelin (1845). Frsenius i Bobo (1844), Abreu (1849), Ogier (1891) i mai trziu Stepanov. Principiul metodei Distrugerea materiei organice se realizeaz prin aciunea clorului liber (n stare nscnd), care rezult prin descompunerea cloratului de potasiu n reacia cu acidul clorhidric concentrat. Corul reacioneaz cu apa formnd acid hipocloros, care d natere la oxigen printr-o reacie al crei echilibru este deplasat spre dreapta (n sensul formrii oxigenului) n prezena substanei organice, acceptor de oxigen. Au loc reaciile: KClO3 + 6HCl = 3 Cl2 + KCl + 3 H2O 2Cl + H2O = HOCl + HCl 2HOCl 2[O] + 2HCl HCl nu trebuie s fie mai concentrat de 12%, pentru c n cazul As s-ar forma AsCl3, uor volatill. Agentul oxidant al materiei organice este oxigenul care la natere prin descompunerea acidului hipocloros. 1.a. Varianta Feresenius Bobo. Tehnica de lucru Materialul de analizat (100 500 g) cntrii i msurai fin se introduce ntr-un balon Wurtz. Dac proba biologic este lichid se concentreaz pe B.M. Dac proba conine alcool etilic, se supune evaporrii pentru ndeprtarea acestuia, deoarece clorul n prezen de alcool etilic produce explozie. n balonul Wurtz se adaug peste produsul de analizat 10 15 ml ap distilat i KClO3 cristale n cantitate de 1/10 fa de greutatea probei supuse analzei. Se monteaz balonul pe o baie de ap cu temperatura de 50 - 70C. Balonului se adapteaz o plnie de separaie prin care se introduce acid clorhidric conc., n poriuni mici la intervale de 15 minute (50 100 ml acid clorhidric conc.). Tubul lateral al balonului este introdus ntr-un vas spltor coninnd 20 30 ml soluie NaOH 10% sau ap distilat pentru captarea excesului de clor i a compuilor volatili care ar lua natere din aciunea clorului asupra arsenilui (AsCl3) (fig. 19). Fig. 19. Operaiunea de distrugere a materiei organice se consider terminat cnd tot materialul a fost digerat i lichidul are o culoare verde glbuie datorit clorului n exces, n general pe suprafaa lichidului plutete un strat glbui de grsime.
51

1. b. Varianta Ogier Toxicologul francez Ogier aduce mbuntiri metodei Feresenius Bobo. Modificarea adus de Ogier const n trecerea unui curent de HCl gazos peste materialul de analizat amestecat cu KClO3. Metoda are avantajul c timpul de distrugere este redus la maximum 1 or pentru o cantitate de 1000 1500 g organe, ns pretinde prezena cercettorului care conduce operaiunea. Tehnica de lucru Materialul biologic cntrit i mrunit se aduce n balonul de distrugere A (fig. 20), se adaug ap pn la volumul final de 1000 1500 ml, apoi clorat de potasiu n poriunea de 1 : 10 fa de greutatea materialului biologic. Fig. 20 n balon se adapeaz un dop rodat cu dou tuburi: pentru unul din tuburi, care ajung pn la fundul balonului A; se introduc HCl gazos, prin cellalt, introdus ntr-un cilindru cu ap (B), se culeg poriunele volatile i excesul de clor. n balonul B se afl HCl concentrat peste care se las s picure H2SO4 concentrat, prin plnia C. Balonul se nclzete i HCl gazos trece n vasul spltor C, ce conine HCl, apoi ajunge la robinetul cu trei ci K, prin care este dirijat, fie n balonul de distrugere A, Fie n vasul spltor F (atunci cnd reacia din balonul A este prea intens). Distrugerea materiei organice (cu excepia grsimilor i glucidelor) este terminat n cca. 30 minute. 1.c. Varianta Stepanov. Organele sunt introduse ntr-un balon Pirex, nchis cu un dop prin care trece un tub n spiral, cu rol de refrigerent (fig.21). Peste organe se adaug HCl, att ct este necesar pentru ca n final concentraia s nu depeasc 12%, apoi se adaug mici cantiti de KClO3 (procedeu iniiat (Feresenius Bobo). Fig. 21. Instalaia se monteaz pe baia de ap. Se continu introducerea de clorat de potasiu, pn ce culoarea lichidului rmne galben deschis verzui, cnd distrugerea se consider terminat. n toate cele trei variante, mineralizarea se consider terminat cnd masa din balon devine un lichid floconos, galben verzui. Se filtreaz, se dilueaz cu ap 1 : 1 i se concentreaz pe baia de ap. Se trateaz mineralizantul cu NaHSO3 cristale sau se barboteaz SO2 pentru eliminarea excesului de clor. NaHSO3 + Cl2 + H2SO4 = 2 NaCl + H2SO4 Excesul de clor mpedic precipitarea sulfurilor H2S (acesta ar fi oxidat la sulf). Cl2 + SO2 = 2 HCl + S Bioxidul de sulf (sau NaHSO3 ) n plus reduce i compuii de As5+ la compuii As3+, mai uor de depistat. As5+ + S2- = S + As3+ Lichidul se rcete, cnd apare la suprafa apare un strat de grsime, ia la fund se depune un sediment verzui, format de esut conjunctiv nesolubilizat, o parte di grsimi i bariul sub
52

form de BaSO4, nu ns i clorurile insolubile de Pb i Ag i nici sulfaii de Pb i Sr, cci mediul puternic acid asigur solubilitatea cantitilor mici ale acestor sruri. Se filtreaz pe hrtie de filtru. Toxicii n raport cu natura lor se af fie dizolvai n lichidul de mineralizare, fie depui n sediment sau inclui n stadiu de grsime de unde trebuie extrai. Avantajele metodei de distrugere cu clor nscnd: - distrugerea se realizeaz rapid i destul de economic. Dezavantajele: - nu se distruge totalitatea materiei organice; totui se obine ionizarea tuturor materialelor, inclusiv a celor legate iniial n compui organici; - o parte metale rmn insolubilizate pe filtru (BaSO4 i urme de PbSO4 i AgCl) Determinarea hidrogenului sulfurat A. Izolare Hidrogenul sulfurat se izoleaz din aerul zonelor de munc i din aerul comunal prin barbotare n soluii absorbante. B. Identificare 1. Hrtia de filtru mbibat cu acetat de plumb se nnegrete n prezena H2S deoarece se formeaz sulfura de plumb. 2. Hrtia de filtru se mbib n acetat de cadmiu se nglbenete n prezena H2S deoarece se formeaz sulfura de cadmiu. 3. Hrtia de filtru iod amidonat (albastr ) este decolorat de H2S n urma reducerei ionului la I-. H2S + I2 = 2HI + S C. Dosare Metoda Stan i colaboratorii. Principiul metodei : Hidrogenul sulfurat reduce ionul fier (III)la fier (II), iar acesta reacioneaz cu , - dipiridil formnd un complex rou care se detrmin specrofotometric la 520 nm. 2 NH4[Fe(SO4)2] + H2S 2 FeSO4 + (NH4)2SO4 + H2SO4 + S 2 Fe3+ + S2- 2 Fe2+ + S0 2+ FeSo4 + 3 SO4 2- N
N N
Fe N

3.Reactivi R1. Soluie apoas 0,30% de sulfat dublu de fier (III) i amoniu. R2. Soluiile , - dipiridil 0,020 g , - dipiridil se introduc ntr-un balon cotat 100 ml, se adaug 5ml alcool metilic i se completeaz cu ap distilat la semn. R3. Soluia absorbant: 1 ml R1 se amestec cu 2 ml R2 i se adug 2 ml ap distilat. R4. Soluia etalon : 0,2305 g sulfat dublu de fier (II) i amoniu sare (Mohr) se adaug n balon cotat de 100 ml, se adaug 3 picturi de acid sulfuric conc. i se completeaz la semn
53

cu ap distilat. Din aceast soluie se iau 2 ml i se completeaz cu ap distilat la 100 ml. 1ml = 1o g H2S. Modul de lucru ntr-un microabsorbitor se aduc 5 ml soluie absorbant (R3) i se aspir aerul de cercetat cu debit de 0,5 litri /min, notndu-se volumul de aer recoltat. Recoltarea se face pn la o coloraie roie vizibil, este bine s se fac fa de un etalon care conine 20-25 g H2S pn cnd coloraia probei este aproximativ comparabil cu cea a etalonului. Coninutul vasului de absorbie se aduce cantitativ ntr-o eprubet gradat de 10 ml (prin splturi repetate cu cantiti mici de ap) i apoi se completeaz cu ap distilat la 10 ml. Aceasta constituie proba de analizat. Paralel cu pregtirea probei de analizat se prepar o scar etalon. n eprubete gradate de 20ml se aduc: 0,5; 1,0; 2,0; 2,5 ml soluie etalon, corespunztor concentraiilor de 5, 10, 15, 20, 25 g H2S i apoi se completeaz cu ap distilat la 8,0 ml dup care se adaugn fiecare eprubet cte 2,0 ml , - dipiridil 0,2%. n acelai timp se prepar i un martor al reactivilor. Eprubeta 1 2 3 0.5 1.0 1.5 5 10 15 7.5 7.0 6.5 2.0 Agitare 15 repaus

Reactivi(ml) Sol. Etalon(10 g H2S/ ml) Conc. g. Ap distilat ,- dipiridil 0,2 %

4 2.0 20 6.0 -

5 2.5 25 5.5 -

6 8.0 2.0

Dup un repaus de 15 minute se determin densitatea optic a probi de analizat i a scrii etalon la 520 nm, n cuva de 1 cm, fa de un martop, cu extinciile scrii etalon se taseaz curba de etalonare. Valoarea densitii optice a probei de analizat se raporteaz la curbade etalonare i deafl cantitatea de H2S. Calculul mg H2S/ mc aer = C/V n care: C = g H2S din proba de analizat V= volumul de aer recoltat, exprimat n litri DETERMINAREA OXIDULUI DE CARBON Oxidul de carbon din aer Indentificare Hrtia mbibat cu clorur paladoas este nnegrit de CO. Pentru mrirea sensibilitii reaciei, aerul se aspir cu ajutorul pniei Palmer (sau a dispozitivului similar) n care se gsete fixat n hrtie mbibat cu Pd Cl2. Reacia este inerferat de H2S. Formarea carboxihemoglobinei aerul este barbotat prin snge diluat 1/100 i se cerceteaz apariia benzlor caracteristice CoHb (vezi metoda spectroscopic n snge).
54

Dozare Metodele se refer la determinarea oxidului de carbon (CO), gazos din aerul zonelor de muncsau aerul communal. Metoda spectrofotometric (cu clorur paladoas). Principiu: Oxidul de carbon reduce clorura paladoas la paladiu metallic. Deoarece n metod se folosete un exces de clorur paladoas, acasta d cu iodura de potasiu, iodur paladoas, roie colorimetrabil. Cantitatea de CO intrat n reacie se obine prin diferen: PdCl2 + CO + H2O = Pd + 2HCl + CO2 PdCl2 + KI = PdI2 + 2KCl Sensibilitatea metodei este de 1 mg/ml. Metoda nu este specific, fiind inerferat de toi reductorii din aer (H2S, SO2, aldehide, pulbere diverse). Reactivi Corura paladoas, p.a. soluie 0,1% : se usuc clorura paladoas ntr-o etuv la 105C, timp de o or i se las nexicator la ntuneric pn a doua zi. Se cntresc o,5 g PdCl2 i se introduce ntr-un Erlenmeyer, peste care se adaug 150ml ap distilat i 2,5 ml HCl concentrate. Soluia se nclzete pe baie de ap pn la dizolvarea complet a PdCl2. Dup rcire soluia se tranzvazeaz ntr-un balon cotat de 500 ml i se completeaz la semn cu ap distilat. Se pstreaz n flacoane brune la rece. 1ml = 1 mg PdCl2. Iodur de potasiu, soluia 20%, preparat extemporaneu. Recoltarea probelor. Dac n aerul de analize nu se gsesc i alte gaze reductoare care s interfereze reacia dintre CO i PdCl2, ca H2S, SO2, aldehide etc., recoltarea aerului se face prin dislocuire de ap sau cu vas vidat. n cazul prezenei acestor gaze, pentru eliminarea lor, se spal n prealabil, trecndu-l prin dou absorbitoare montate la tubul de intrare a aerului n vasul de recoltare cu dubla tubulatur coninnd primul 20 ml NaOH 10% i al doilea 20 ml acetat de plumb (Fig.13.) Volumul minim de aer pentru o prob este de 1 litru. Modul de lucru Vasele cu aerul recoltat se rcesc, fie la ghea, pentru a secontracta aerul din interior. Se introduce apoi prin plnioar 2 ml soluie de clorur paladoas exact msurai. Se separ plnioara de 3 ori cu cte 1-2 ml ap care se introduc tot n vas. Este de menionat c introducerea soluiei de PdCl2 i a apei trebuie fcut cu atenie pentru a nu introduce aer din exterior de aceea, se las totdeauna n pnioar puin soluie sau ap ca supap de siguran. Vasul de recoltat se las s stea la ntuneric pn a doua zi (sau minimum 4 ore) agitndu-se din cnd n cnd.

55

Dac n vas s-a format o oglind de paladiu metallic i soluia este complet decolorate ceea ce denot reducerea complet a PdCl2 se mai adaug 1 ml soluie PdCl2 i se las din nou n repaus 4 ore. Dup acest timp se scoate dopul vasului i se filtreaz coninutul ntr-un balon cotat de 100ml. Vasul i plnioara se spal cu 50 ml ap care se trece cantitativ tot n balonulcotat. Se adaug apoi 15 ml soluie KI 20% tot prin filtru i se completeaz balonul cotat, splndu-se filtrul cu ap, la semn. Se msoar extincia la un spectrofotometru de tip Sprkol, la = 500 nm, n cuva de 1 cm, fa de o prob martor. Curba de standerdizare se face ntre 1 i 2 mg PdCl2, prin puncte din 0,5 n 0,5 mg, n condiiile descries mai sus. Cu extinciile obinute se construete curba standar sau se calculeaz factorul de pant. Balon cotat (100 ml) 1 2 3 4 0.5 1.0 1.5 2.0 0.5 1.0 1.5 2.0 15 la 100 agitare

Reactivi(ml) Sol. PdCl2(1 mg / ml) Conc. mg. KI 20% Ap distilat = 500 nm

5 (M) -

Calculul Rezultatele se exprim n mg Co/m3 aer. Se calculeaz excesul de clorur paldoas, valoarea a n care: a = mg PdCl2 ne reacionat (excesul); E = extracia citit = factorul de pant. Se calculeaz apoi cantitatea de Co care a redus clorura paladoas: n care: n = cantitatea de PdCl2 folosit iniial; V = volumul de aer recoltat n litri; 1 mg PdCl2 este redus de 0,1261 ml CO (la 0 i 760 mm presiune); 0,1261 ml CO= 0,1 mg CO. Observaii: Recoltarea probelor de aer se poate efectua i prin aspirarea aerului ntr-un balon vidat care conine o fiol de 2 ml PdCl2 i care dup recoltate se sparge prin agitarea flaconului, punndu-se astfel reactivul n contact cu aerului recoltat, apoi se continu analiza ca mai sus. Normele republican n vigoare fiind pentru oxidul de carbon CMA = 30 mg/mc aer. Oxidul de carbon din snge
56

Metoda spectroscopic Principiu: Oxihemoglobina i carboxihemoglobina dau spectre de absorbie, constituite fiecare din cte dou benzi asemntoare, ns uor deplasate una fa de alta. Prin tratarea cu un reductor - -hidrosulfit, polisulfur, clorur stanoas, etc.-numai HbO2 este redus la Hb, fapt constatat prin dispariia celor dou benzi caracteristice ale HbO2 i apariia benzii de absorbie a Hb. n acelai condiii, HbCO i pstreaz cele dou benzi. Modul de lucru Se face diluie 1% din snge, cu ap distilat i se divide n dou poriuni, care se examineaz la spectroscop. Prima poriune, examinat ca atare la spectroscop, prezint un spectru caracteristic pentru oxihemoglobin i anume, dou benzi ntunecate: prima band, mai ngust, n zona galben, la 750m la dreapta liniei D a lui Frauenhofer (85-90 gradaii micrometrice): a doua band, mai lung, n zona verde, la 538 m, la stnga liniei E a lui Frauenhofer (95-105 gradaii micrometrice). A doua poriune de lichid este tratat cu cteva picturi de polisulfur de amoniu 10% sau cteva cristale de hidrosulfit i dup cteva minute este examinat spectroscopic: apare spectrul caracteristic hemoglobinei reduse, deoarece HbO2 a cedat oxigenul reductorului. Spectrul este format dintr-o singur band ntunecat (banda Stokes) ale crei margini nu sunt perfect delimitate, amplasat ntre liniile D i E al lui Frauenhofer. Dac sngele conine oxid de carbon se observ la spectroscop dou benzi asemntoare celor ale HbO2, ns uor deplasate n domeniul verde. La tratarea cu un reductor, aceste dou benzi nu dispar spre a se forma banda Stokes i aceast comportare este caracteristic carboxihemoglobinei (Fig.14.)

Fig.14. Spectre de absorbie ale HbO2 Hb, CoHb, MetHb, i a derivailor lor. Oxihemoblina, hemoglobina i carboxihemoglobina pot fi decelate numai n sngele proaspt. Metoda spectroscopic prezint o mare sensibilitate i este indicat pentru identificarea sigur a oxidului de carbon, cu condiia ca sngele s nu fie putrefiat i s conin minimum 3 val.???? ml snge. 2. Metoda Wolf Metoda se bazeaz pe proprietatea HbCO2 dea coagula complet la pH = 5,0 5,1 i t = 55C, lichidul rmnnd incolor. n aceste condiii, COHb nu coaguleaz i lichidul rmne colorat. Soluia tampon pH = 5,0 5,1 : se ia un volum soluie acid acetic 5N (300 g %) i 3 volume de soluie de CH3COONa.3H2O 3N (408 g %0). Se dilueaz 1 ml snge cu 4 ml ap distilat i se filtreaz. La 1 ml filtrat se adaug 4 ml soluie tampon, se omogenizeaz, se nchide eprubeta i de menine 5 minute pe baie de ap la 55C.

57

n aceste condiii HbO2 coaguleaz complet, iar lichidul rmne incolor dac nu conine COHb; n caz contrar, lichidul este roz. Se verific spectroscopic natura culorii roii, prin poziia benzilor, nainte i dup reducere hidrosulfit. Metoda pateu fi utilizat i pentru dozare. Determinarea carboxihemoglobinei Principiu: CO legat de Hb n complexul COHb este eliberat din complex la tratarea sngelui cu un hemolizant (saponin, digitoxin) i un oxidant (fericianur de potasiu): COHb Hbi +CO Operaia se execut ntr-o celul de microdifuzare n care se gsete o cantitate cunoscut de clorur paladoas, redus stochiometric de CO eliberat din snge, ceea ce permite calcularea CO prin dozarea excesului de clorur paladoas i indirect carboxihemoglobina corespunztoare. Metoda se preteaz numai pentru sngele proaspt. n condiiile normale (n atmosfera obinuit a oraelor) se gsesc n snge pn la 1,5% COHb lanefumtori i pn la 8 10% COHb la fumtori. Simptome clinice de intoxicaie apar n general cnd proporia de COHb din snge depesc 15%. Reactivi i aparatur 1. Clorura paladoas (PdCl2) soluie standard 1 ml = 1,0 mh PdCl2. Se dizolv 0,1000g clorur paladoas n 0,5 ml HCl d = 1,19 i 5ml ap, nclzind n baia la fierbere pn la dizolvare complet. Se trece cantitativ soluia ntr-un balon cotat de 100ml i se adduce la semn cu ap distilat. Soluia se conserv la ntuneric i la rece. 2. Hemolizant fericianur: se dizolv 1 g fericianur de potasiu 1 g saponin n 100 ml ap. Se prepar extemporeneu. 3. . Iodur de potasiu, soluie 20%. Se prepar extempreneau. 4. 4.Celula microdifuzie. Este un recipient de sticl cu dou compartimente: unul central, cilindric (C) i altul periferic, inelar (B). Celula se nchide ermetic cu o plac de sticl lefuit (celula Conway) sau cu un dop lefuit (celula Menziceanu) (Fig.15.).

Fig.15. Celula Menzicescu Recoltarea probelor Se recolteaz 2-5 ml snge venes ntr-un tub mic (care s se umple complet cu snge) coninnd 10 mg oxalat de potasiu pulbere i o bil de sticl. Se astup tubul cu un dop de cauciuc sau plastic, fr a include aer i se omogenizeaz rsturnnd tubul de 10-15 ori, fr a scurta. Probele asfel pregtite pot fi pstrate la rece pn la 24 ore fr pierdere de COhb. Difuzia Se pipeteaz exact 1,0 ml clorur paladoas standard n compartimentul central al celulei i 5 ml hemolizat-fericianur n compartimentul periferic. Se pipeteaz n compartimentul
58

periferic exact 1,0 ml snge bine omogenizat i se nchide imediat celula. Capsula sau dopul se ung cu vaselin sau, preferabil cu past de silicon. Se amestec lichidul din compartimentul periferic, rotind cu precauie celula inut orizontal (s nu teac lichid dintr-un compartiment ntr-altul). Se las celula la ntuneric pn a doua zi sau minimum 6 ore. Dozarea spectrofotometric Se deschide celula i se pipeteaz cu grij lichidul din compartimentul central, trecndu-l ntr-un balon cotat de 50 ml, printr-un filtru mic. Se spal compartimentul central de 5-6 ori cu cte 1 ml ap (luat cu aceiai pipet) care se trece tot n balon, prin acelai filtru. Se adaug n balon 10 ml iodur de potasiu i de aduce la semn cu ap. Se execut aceleai operaii pentru celula - standard. Se msoar extincia probelor (Ep) i a standardului (Es) la = 500 nm n cuva 1 cm, n compensaie cu o prob coninnd 10 ml KI 20% la 50 ml ap. Cacul 1 mg PdCl2 este redus de 0,1261 ml CO, degajat din =,=941 g COHb. Notnd cu Ep extincia probei i cu Es extincia standardului, clorur paladoas redus este: ,,n mg PdCl2 redus = Ea Eb / Ea Proba fiind de 1 ml snge, coinutul de CO n ml/100 ml snge este: ml CO/100 ml snge = n . 0,1261 . 100 E COHb/100 ml snge = n . 0,0941 . 100 Pentru exprimarea rezultatelor n COHb din hemoglobina total, se determin, din aceiai recoltare de snge, hemoglobina total i de face raportul: COHb din Hb total =(gCOHb/100ml snge/ g din Hb total /100 ml snge)x100 Determinarea spectrofotometric a hemoglobinei totale Metoda se refer la determinarea hemoglobinei totale din probe de snge. Principiu: hemoglobina se transform n cianohemoglobin stabil i cu coeficient molar de extincie specific. Concentraia hemoglobinei se obine prin msurarea extinciei la = 540 nm a unei soluii de hemoglobin transformat n cianohemoglobin. Valorile totale sunt: Pentru brbai : 14 - 16,5 g hemoglobin/100 ml snge. Pentru femei : 13 16 g hemoglobin/100 ml snge.

Reactivi: 1. Soluia Drabkin. Se dizolv succesiv: 0,05 g cianur de potasiu, 0,2 g fericianur de potasiu i 0,14 g fosfat monosodic (Kh2PO4) n 100 ml ap. Se adaug 0,5 g saponin i se amestec. Soluia se conserv indefinit, n sticle brune i la rece. Modul de lucru

59

Se msoar ntr-o eprubet exact 5,0 ml soluie Drabkin. Se introduce 0,02 ml snge congelat, cu ajutorul pipetei de hemoglobin, splnd pipeta de 3 ori cu soluia din eprubet. Se amestec fr a scutura. Se poate lucra i msurnd 0,2 ml snge n balon cotat de 50 ml, aducnd la semn cu soluie Drabkin. Se msoar dup 10 minute, n cuva de 1 cm, n compensaie cu soluia Drabkin. Calculul Greutatea molecular a hemoglobinei fiind de 16114, iar coeficientul de extincie molar la 540 nm, K540 = 11 . 10-3, se deduce: g Hb total/100 ml snge = E540 x 16114/11000 x 10-1 x 5.02/ 0.02 Efectund calculul numeric, rezult c: g Hb total/100 ml snge = E540 . 36,8 Dac de lucreaz cu 0,2 ml snge, diluat la50 ml cu soluie Dranbkin, formula devine: g Hb total/100 ml snge = E540 . 36,8 Observaii: 1. Determinarea COHb i Hb toate se efectueaz din aceeai prob de snge. 2. Determinarea nu se poate dup proba de snge dac este coagulat. Interpretarea rezultatelor Se consider intoxicaie cronic oxicarbonemie peste 1 ml/ 100 ml snge (la analize repetate) i intoxicaie acut, la valori peste 3 ml/100 ml snge; n comele oxicarbonice se regsesc 6 ml CO /100 m l snge (rezultatele sunt valabile numai dac s-a fcut dozarea n primele 3 ore de la intoxicare).
DETERMINAREA SULFURII DE CARBON A. Izolare - din aer: se barboteaz aerul n soluii alcolice de amine secundare (dietilamina sau piperidina): - din alimente: organe, etc. prin antrenare de vapori de ap, sau preferabil, cu un curent de aer i fixare n soluie alcoolic de amine secundare, sau alcool rcit ci ghea. B. Identificare 1. Reacia xantogenailor: la 2 ml distilat se adaug 2-5 picturi soluie alcoolic de KOH 15% i se nclzete uor; se aciduleaz slab cu acid acetic 1% i se trateaz cu 2-3 picturi sulfat de cupru 5%. Se formeaz iniial un precipitat negru de xantogenat cupric, care trece prin dismutaie n xantogenat cupros, galben: 2C2H5-OH + 2CS2 2 + CuSO4 2 C2H5 O C S Cu 2 C S C2H5 O galben Cu negru C2H5 O C S 2 2 S S S 2. Reacia cu amine secundare (alifatice sau piperidin): la 2 ml distilat se adaug 2-5 picturi de soluie alcoolic de amin secundar 2% i 2-5 picturi acetat de cupru 0,05%, cnd apare un precipitat galben de ditiocarbonat de cupru: a) dietilamina

C2H5 O C SK S +

C2H5 O C S Cu 2 S

C2H5 N 2

C SH S

60

(C2H5)2NH + CS2

+ (C2H5)2NH

C2H5 N 2

+ Cu(CH3COOH)2 + 2CH3COOH + 2NH(C2H5)2 C2H5 N C S Cu b) cu piperidina 2 2 S C5H11N + CS2 + Cu (CH3-COO)2 + C5H10 N C SH C5H10 N 2CH3COOH S

C S S

N C2H5

C S 2Cu S

3. Reacia de formare a sulfocianurii ferice: 3-4 ml distilat se nclzete pe baia de ap cu un exces de soluie alcoolic de amoniac, apoi se evapor la sicitate. Se reia reziduul cu puin ap distilat, se aciduleaz cu HCl i se filtreaz pentru a ndeprta sulful depus din descompunerea H2S. Filtratul se trateaz cu FeCl3 2%, cnd apare coloraia roie snge de Fe(SCN)3: S=C=S + HNH2 + H2S S C SH HS C SH N C SH

NH2
3N + C SH 3NH3 3

NH

+ SNH4 N C FeCl3 Fe(SCN)3 + 3 NH4Cl

8. DETERMINAREA AMINELOR 8.1. AMINA A. Izolare: - din aer: se barboteaz aerul prin acid sulfuric 0,01 N sau ap bidistilat; - din produse biologice: antrenare cu vapori de ap, urmat sau nu de extragere cu solvent organic. B. Identificare a. Reacia izonitrilului (reacia Hoffman): la 1 ml lichid se adaug 0,1 ml soluie alcoolic de KOH 10% i 2 picturi de CHCl3; la fierbere se dezvolt miros neplcut de izonitril (fenilcarbilamin): C6H5NH2 + 3 KOH + CHCl3 b. Reacia noveinei: 1 ml lichid este tratat cu 1 ml hipoclorit de sodiu 10%; apare o coloraie albastr, ce vireaz ncet la rou murdar: 4 + HOCl
N HN
+

ClNH2

NH2

c. Reacia Jacquemin: la 1 ml lichid se adaug 1 ml fenol 1% i 0,5 ml hipoclorit de sodiu 10%, cnd apare o coloraie albastr, datorit formrii fenilchinoniminei (v. "fenolul"). C. Dozare Metoda spectrofotometric pentru anilin (Metoda Alexeeva) Metoda se refer la determinarea anilinei : C6H5-NH2: vapori din aerul zonelor de munc. Principiu. Anilina n prezena fenolului i a cloraminei sau hipocloritului de sodiu ca oxidant, d o coloraie albastr, prin formare de idofenoli, colorimetrabil reacia Jacquemin). Sensibilitatea metodei este de 0,5g.ml. Metoda nu este specific, deoarece interfer i alte amine aromatice (toluidin, paraamisidin, parafenilendiamin) ca i amoniacul.

61

+ 3 NaClO

NH2
+3 NaCl + 2 H2O

OH

OH

Reactivi 1. soluie absorbant: ap bidistilat 2. Cloramina T: CH3-C6H4 - SO2N(Na)Cl . 3H2O, soluie 4% (proaspt preparat). 3. Fenol, soluie 3%. 4. Hidroxid de sodiu, soluie 2%. 5. Standard stoc: se cntresc ntr-un balon cotat de 25 ml, n H2SO4 0,01 N: o cantitate de anilin pur (1 -2 picturi), astfel ca s se obin o soluie de ordinul a 0,1mg/ml. 6. Standard de lucru: o parte alcoolic din standardul stoc se dilueaz H2SO4 0,01 N pentru a obine o soluie n care 1 ml -10 g anilin. Recoltarea probelor Se aspir minimum 2 litri aer, cu un debit de 0,2 litri/minut, prin dou microabsorbitoare montate n serie, coninnd cte 2 ml soluie absorbant. n afar de microabsorbitoare destinate recoltrii de probe, se prevd nc dou microabsorbitoare cu cte 2 ml soluie absorbant, care se transport n teren, fr a aspira aer prin ele, constituind probele martor. Modul de lucru Coninutul fiecrui microabsorbitor se transvazeaz separat n cte o eprubet gradat, completnduse la 5 ml cu soluie absorbant. Se adaug 1 ml cloramina T 4% se agit, se las n repaus 2 minute, apoi se adaug 1 ml soluie fenol i 0,5 ml soluie NaOH 2%. n mod similar se prelucreaz i probele martor. Se msoar extincia, dup 15 20 minute, la spectrofotometrul Spekol, la = 615 nm n cuva de 1 cm, n compensaie cu proba martor. Curba de standardizare se face ntre 5 i 25g anilin, prin puncte din5 n 5, n condiiile descrise mai sus. Cu extinciile obinute se construiete curba standard sau se calculeaz factorul de pant. Valorile extinciilor pentru probe se raporteaz la curba standard, obinndu-se concentraiile C1 i C2 a anilinei, n g din cele dou microsorbitoare. Eprubeta 1 2 0.5 1.0 5 10 4.5 4.0 0.5 agitare 1.0 agitare 0.5 agitare Repaus 10-15 minute

Reactivi(ml) Standard de lucru(10 g / ml) Conc.g Ap bidistilat Cloramin T 4% Fenol 3 % NaOH 2 %

3 1.5 15 3.5

4 2.0 20 3.0

5 2.5 25 2.5

6 5.0

62

Cap. III Analiza firului de pr 1. Introducere Urina a devenit proba cea mai acceptat pentru detectarea consumului de droguri. Popularitatea utilizrii acestui material pentru depistarea drogurilor se leag de faptul c, spre deosebire de snge, prelevarea probei de urin nu are nevoie de supraveghere medical. Cu toate acestea, pentru a se asigura c proba de urin este autentic, ea este adesea necesar s se respecte subiectul productoare de specimen. Aceast nclcare a vieii private poate cauza jena la unii indivizi i ca rezultat rezistenta la participarea la un program de testare de droguri. Deoarece majoritatea consumului de droguri sunt eliminate din organism n termen de dou la trei zile dup utilizare, urin. Analiza este, de asemenea, limitat n capacitatea sa de a detecta expunerea la medicament. n cazul n care se tie c un ecran de droguri va fi necesare pe o anumit zi, ca o condiie de angajare, de exemplu, abstinenta cteva zile "nainte de urina fiind colectate vor duce la utilizatorul de droguri merge nedetectate. Este din cauza acestor probleme asociate cu analiza urinei ca exemplarele alternative au fost investigate pentru potenialul lor de indicatori fiabili ai expunerii la medicament. Pn n prezent, matricea cele mai promitoare pentru detectarea consumului de droguri pare a fi de pr. 2. Consideraii generale despre pr Acesta a fost cunoscut de zeci de ani, care urma a metalelor n organism se acumuleaz n pr i pot fi detectate sptmni sau chiar luni dup expunerea iniial. Numeroase articole au fost publicate descriu detectare de metale grele n pr, i o parte din aceast activitate vor fi discutate mai trziu de la un istoric perspectiv. Investigaiile mai recente s-au concentrat pe utilizarea de pr ca un eantion de detectare a farmaceutice i consumului de droguri. pregtirea probei i tehnici analitice au fost dezvoltate i rafinate pentru a permite o analiz pentru o serie de medicamente n ct mai puin cteva miligrame de pr. n teorie, analiza de pr consumului de droguri, ofera mai multe avantaje fa de utilizarea a corpului fluide. Un eantion de par pot fi colectate fr a fi nevoie de faciliti speciale sau echipamente, sau medical personal instruit. Colectarea unei probe mici de pr este relativ non-invaziv i, spre deosebire de urin, acest eantion nu poate fi uor modificat prin diluare sau utilizarea altor medicamente nainte de test.

63

Figure 5.1 Accumulation of drugs in urine and in hair as a function of time (Baumgartner et al.,1989) Acumularea de droguri n urin i n pr ca o funcie de timp (Baumgartner et al., 1989) Stabilitatea de droguri n pr matrice a fost ilustrat ntr-un caz, srbtorit n care cocain i metaboliii si, benzoylecgonine i ester metilic ecgonine, au fost gsite n probe de pr de la vechi rozatoare peruvian frunze de coca datnd de la AD 100 (Springfield et al, 1993). Odat colectate, proba de pr nu are nevoie de cerine speciale de pstrare i ocup mult mai puin spaiu de stocare de probe de urina. Deoarece parul creste la aproximativ 1 cm / lun, proba ofer o nregistrare pe termen lung de droguri utilizare, chiar si cu parul relativ scurt, care deine mai multe sptmni sau chiar luni de informaii (Figura 5.1). Abstinenta de la utilizarea de droguri pentru cteva zile, nu se va evita, prin urmare, de detectare. n general, este recomandat ca firele de pr 5-10 fi folosite pentru analiz, dei publicaii recente descrie utilizarea de ct de puin 5-10 mg de pr i barb, chiar achii au fost folosite cu succes. Majoritatea lucrtorilor au descris vrful, sau coroana, a capului ca fiind proba cea mai uniform a pr pentru analiz, dei par din alte zone ale corpului a fost folosit. n timp ce trage de par va avea ca rezultat n eantion mai reprezentativ, acest lucru este evident, dureros pentru subiect i majoritatea mostrelor sunt colectate de tiere. Ar trebui subliniat faptul c prul trebuie s fie tiat ct mai aproape de scalp este posibil, n scopul de a a obine creterea economic cea mai recent. Modelul, n general, propuse pentru a explica ncorporarea de medicamente n pr este una n care medicamentele intra parul prin difuziune pasiv din sange in celule n cretere de la baza foliculului pilos (Figura 5.2). Pr uman creste in cicluri, cunoscut sub numele de anagen, catagen si telogen faze (BOST, 1993). Anagen este faza de crestere, o durat de doi la
64

trei ani, iar rata de cretere este n general, 0.3-0.4 mm / zi sau 0.9 - 1.2 cm / luna. n timpul acestei faze, alimentarea cu snge capilar n jurul folicul furnizeaz nutrieni i ofer, de asemenea, orice materiale strine care ar putea fi n snge, cum ar fi droguri sau metale. Aceste urme compui deveni ncorporat n firul de par i sunt transportate pe toata lungimea ei ca parul creste. faza catagen este o tranziie ntre activ creterii economice i o faz de odihn. rdcina firului de pr devine keratinizate, formnd un capt club, i ncepe s se despart de bec sau papila foliculului de par. parul apoi se duce ntr-o faz de cretere nu-cunoscut sub numele de telogen. Acest lucru dureaz dou-trei luni nainte de cretere a firului de par un nou ncepe s apar n papilei dermice. Aa cum se creste, parul vechi vor fi forat s ias. ai multe descoperiri recente, totui, sugereaz c drogurile pot intra de pr de la multe site-uri prin diferite mecanisme i momente diferite ale cresterii firului de par. Henderson (1993) propune un model mai complex de ncorporare de droguri n pr:

Figure 5.2 Diagram of a hair follicle (Harkey, 1993) timpul de formare a arborelui n timpul difuzie din snge la folicul activ n cretere dup formarea prin secretii ale glandelor sebacee i apocrine dup ce prul a reieit din piele, din mediul extern. Ptsch et al. (1997) au propus un concept biochimice pentru ncorporarea endogen de droguri molecule care ajut s explice unele dintre contradiciile aparente i inconsecvene n pr de droguri de cercetare. Acest model se bazeaz pe principiile biologice de transport prin membranele celulare i biotransformare, i consider c efectul de afinitate melanina de droguri.

65

Ptsch i Moeller (1996), n studierea adoptarea de Rodamin B n pr, au artat penetrare s fie mult mai mare de soluie apoas dect din metanol / etanol solvent. Ei au propus c Rodamin B este un model potrivit pentru studierea adoptarea de droguri de baz din mediul extern. Efectul tratamentului cosmetic cu privire la interpretarea de droguri endogene a fost studiat de ctre Skopp et Al. (1997). Ei au ajuns la concluzia c istoria cosmetice a unui eantion de pr ar trebui s fie luate n considerare, dar c efectul de tratamente cosmetice, cum ar fi albit sau perming pe untul endogen-exogene a fost mic. Drogurile pot fi transferate la parul de la mai multe compartimente de corp situat n esuturile nconjurtoare foliculului pilos (Figura 5.3). Aceste mecanisme ar putea fi, de asemenea, de consumul de droguri specifice, crescnd probabilitatea de detectare a anumitor medicamente n timp ce alii mai greu de detectat. O mai precis nelegere de ncorporare de droguri n prul este critic pentru interpretare. Criticii de analiz de pr pentru medicamente susin c exist prea multe ntrebri fr rspuns n ceea ce privete fiabilitatea tehnicii pentru a fi acceptat ca o metod de rutin pentru testarea de droguri. Dei aceast tehnic este n faz incipient i sub rezerva o anumit sum de critici, utilizarea de pr ca un eantion de examinare toxicologic medico-legal nu este deloc nou. detectare de metale grele otrvuri i contaminani din mediul nconjurtor n pr uman a fost bine documentate de mai muli ani.

Figure 5.3 Proposed multi-compartment model for drug incorporation into hair (Henderson, 1993) A propus modelul multi-compartiment pentru ncorporarea de droguri n pr (Henderson, 1993)

66

nainte de a discuta meritele relative ale analizei pr de droguri, poate ar trebui s ne examineze ceea ce a fost deja stabilite cu privire la depunerea de metale grele n aceast prob. Multe dintre aspecte, cum ar fi vrsta, sexul, starea boal i contaminare, care pot avea o influen asupra ncorporarea de medicamente n pr, au fost deja considerate ca fiind influeneaz ncorporarea metale grele n acest specimen. 3. Studii supra metalelor grele Utilizarea probelor de pr matern ca mijloc de estimare a expunerii ftului la metalele toxice a fost descris de ctre Marsh et al. (1981) ntr-un studiu pe 84 mame irakiene i pe copiii lor, care au fost expui la metilmercur n timpul sarcinii. Metilmercurul a fost ingerat ca fungicid, iar concentraiile maxime ale mercurului n prul matern par a fi legate de frecvena simptomelor de toxicitate la mame n timpul sarcinii i la efectele neurologice la sugari. O relaia doz-rspuns ntre snge i esuturi acumularea de pr de cobalt a fost demonstrat, de asemenea la obolani (Nation et al, 1983.). Adult obolani hrnii raiile zilnice ale Chow laborator dantelat cu clorur de cobalt au fost testate pentru comportamentale efectele i aceste efecte au fost corelate cu nivelurile de cobalt determinat prin absorbie atomic. Analize relevat un efect doz-rspuns n ceea ce privete acumularea de esut cobalt n snge, esuturi diferite i pr. Un studiu ulterior comparat concentraiile de pr i efectele comportamentale de nichel la obolani (Nation et al, 1985).. obolanii masculi aduli au fost hrnite 0, 10, sau 20 mg Ni / kg greutate corp prin intermediul unui raia alimentar zilnic de 10 g. Urmtoarele 14 zile de expunere, animalele au fost instruii ntr-o perioad de 61 de zile pentru a-prghie de pres pentru alimente n timp ce continu s experien doze zilnice de nichel. Cei obolanii tratai cu 20 mg / kg Ni leverpressed la o rat semnificativ mai mic dect controalele. Absorbie atomic analiza spectrofotometric scos la iveal o acumulare doz-rspuns de nichel n rinichi, dar analizele de alte probe, inclusiv parul nu a prezentat acumulri diferenial agent. O lips similar de coresponden ntre snge i nivelurile de pr de plumb a fost raportat de Grandjean (1984). O femeie care a fost otrvit cu rea intenie de ctre doze frecvent pe cale oral de nitrat de plumb pe parcursul unei perioade lungi de timp nu a fost diagnosticat ca atare pn la aproximativ cinci luni de la primele simptome au aprut. Analiza de par luate la dou niveluri diferite ori a fost folosit ca prob n instan. Concentraiile de pr duce expuse schimbri rapide i normalizat la scurt timp dup tratament chelator a fost instituit. Aceast constatare sugereaz c nivelul de plumb prul poate reflect un nivel de absorbie curent, mai degrab dect de coninut de plumb din snge integral, care, n acest caz, schimbat mult mai lent. Alte dovezi de lipsa de corelare ntre concentraiilor de plumb n snge i prul a fost gsit ntr-un studiu de pr lucrtorilor expui la un nivel ridicat de plumb din aer. n ciuda niveluri extrem de ridicate plumb din snge i intoxicaie sever plumb clinice, concentraiile de plumb n pr au fost relativ sczut. Prul s-a dovedit a fi nepotrivit pentru determinarea aluminiului cu scopul de a estimarea funciei renale (de-Wolff, 1985). Mai multe boli legate de dializ pot fi atribuite la o ar crete povara corp din aluminiu. Determinarea acestui metal n eantioanele clinice este, prin urmare, de
67

mare ajutor n diagnosticul, tratamentul i prevenirea intoxicaie aluminiu. de-Wolff, cu toate acestea, artat c exist multe capcane n estimarea de aluminiu n fluide biologice, i recomand ca aceste teste de performan ar trebui s fie limitat la laboratoare specializate particip la un program de evaluare extern a calitii. Lipsa de corelaie ntre expunerea i concentraiile de aluminiu par a determinat de-Wolff s se constate c parului pare a fi de nici un folos pentru evaluarea poverii corp de aluminiu n fiecare pacient n parte. Dei prul i ale cilor urinare concentraii de zinc s-au dovedit a fi sczut la copii de statur, sau prelungit dup infecie respiratorie superioar, analiza de par pentru zinc asemenea, sa constatat nu fi de ncredere pentru diagnosticarea unor astfel de condiii, din cauza variabilitii excesiv n indivizi (van Wouwe et al., 1986). Singura observatie care ar putea fi fcut a fost c, n comparaie cu controale, zinc pr a fost sczut n mod semnificativ dup infecie respiratorie i de nalt n statura mica. Posibilitatea ca interaciunea dintre diferii compui n corpul subiectului poate influena ncorporarea unui medicament n prul a fost ridicat. Preocupri similare pe interaciunea dintre metalele toxice dietetice i urme au fost investigate la obolani (Elsenhans et al, 1987.). Expunerea la metalele toxice i esenial este considerat a fi reflectate de metal concentraiile corespunztoare n esuturi. Cu toate acestea, acesti compusi pot influena reciproc n ceea ce privete pstrarea lor n organism. n scopul pentru a testa aceast ipotez, un regim alimentar de baz, care conine 20 ppm fiecare din cele patru metale toxice (arsenic, cadmiu, nichel i plumb) i cantiti adecvate de metale eseniale a fost alimentat la obolani timp de dou sptmni. Test grupuri a primit dieta de baz, cu concentraii crescnde, unul din metale toxice (pn la 90 ppm arsenic, 180 ppm cadmiu, nichel 365 ppm, plumb i 394 ppm). Arsenic, cadmiu, nichel, plumb, cupru, fier, mangan i zinc au fost determinate prin spectroscopie de emisie atomic n ficat, rinichi, intestin, creier, muchi, oase, piele, snge i pr. O relaie liniar ntre alimentaie i de concentrare esuturi a fost observat pentru arsenic i nichel n rinichi, de cadmiu n ficat, i pentru plumb n oase. n alte esuturi saturaie a fost observat. n timp ce interaciunile cadmiu-fier au fost cele mai multe comune din esuturi, alte interaciuni au fost detectate doar n esuturile specifice, de exemplu: arseniccupru n rinichi, cadmiu-zinc n ficat, i-mangan arsenic, cadmiu, mangan sau cupru-nichel n intestinului. Creteri de plumb i cadmiu renale intestinal de nichel dietetice, i o scdere n os arsenic de plumb dietetice, au fost mai pronunate interaciunile dintre metalele toxice. Rezultatele a demonstrat c organe-int poteniale pentru evaluarea expunerii metal trebuie s fie atent analizate pentru a interveni interaciunile metal-metal. Este posibil ca interaciuni similare dintre dietetice elemente i / sau a produselor farmaceutice cu medicamente de abuzuri pot influena absorbia i acumularea acesteia din urm n prul unui individ. O asemenea interaciune ar fi un factor suplimentar de fi luate n considerare n interpretarea de concentraii de droguri n pr. Un obiectiv principal al acestei societi este de a asigura calitatea n testarea de pr, i, n acest scop de membrii societate au fost activ n dezvoltarea interlaboratoare testele de control al calitii (Kintz i Cirimele, 1997; Sachs, 1997). Rezultatele acestor teste indic faptul c locul de munc mult nc trebuie s fie fcut pentru a mbunti fiabilitatea i
68

coerena metodelor de ncercare i protocoale. Nu este mult s fie pozitiv despre n msurile luate de societate. Poate c n anii care vin este posibil s se adopte un mod mai puin abordare prudent i mai pozitiv la utilizarea de pr ca un mijloc de analiz a drogurilor. References ANON., 1990, Drug free workplace conference: speaker rebuts common drug testing myths and severely criticizes hair testing. Forensic Drug Abuse Advisor, 2, 8184. ANON., 1997, Society of Hair Testing. Forens. Sci. Int., 84, 36. BALABANOVA, S., ARNOLD, P.J., LUCKOW, V., BRUNNER, H. and WOLF, H.U., 1989, Tetrahydrocannabinols in hair of hashish smokers. Z.Rechtsmed., 102, 503508. BALABANOVA, S. and HOMOKI, J.Z., 1987, Determination of cocaine in human hair by gas chromatography/mass spectrometry. Z.Rechtsmed., 98, 235240. BAUMGARTNER, A.M., JONES, P.F., BAUMGARTNER, W.A. and BLACK, C.T., 1979, Radioimmunoassay of hair for determining opiate abuse histories. J.Nucl. Med., 20, 748752. BAUMGARTNER, A.M., JONES, P.F. and BLACK, C.T., 1981, Detection of phencyclidine in hair. J.Forens. Sci., 26, 576581. BAUMGARTNER, W.A. and HILL, V.A., 1993, Sample preparation techniques. Forens. Sci. Int., 63, 121135. BAUMGARTNER, W.A., HILL, V.A. and BLAHD, W.H., 1989, Hair analysis for drugs of abuse. J.Forens. Sci., 34, 14331453. BLANK, D.L. and KIDWELL, D.A., 1993, External contamination of hair by cocaine; an issue in forensic interpretation. Forens. Sci. Int., 63, 145156. BOST, R.O., 1993, Hair analysisperspectives and limits of a proposed forensic method of proof: a review. Forens. Sci. Int., 63, 3142. CHEN, G.J., PILLAI, R., ERICKSON, J.R., MARTINEZ, F., ESTRADA, A.L. and WATSON, R.R., 1991, Cocaine immunotoxicity: abnormal cytokine production in Hispanic drug users. Toxicol. Lett., 59, 818. CIRIMELE, V., SACHS, H., KINTY, P. and MANGIN, P., 1996, Testing human hair for cannabis. III. Rapid screening for the simultaneous identification of ?9-tetrahydrocannabinol, cannabinol and cannabidiol. J.Anal. Toxicol., 20, 1316. CLARK, D.R., OGASAWARA, P.A., SMITH, G.J. and OHLENDORF, H.M., 1989, Selenium accumulation in racoons exposed to irrigation drainwater at Keterson National Wildlife Refuge, California 1986. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 18, 787794. CONE, E., 1990, Testing human hair for drugs of abuse. I. Individual dose and time profiles of morphine and codeine in plasma, saliva, urine, and beard compared to drug induced effects on pupils and behavior. J. Anal Toxicol., 14, 17. CONE, E.J., YOUSEFNEJAD, D., DARWIN, W.D. and MAGUIRE, T., 1991, Testing human hair for drugs of abuse. II. Identification of unique cocaine metabolites in hair of drug abusers and evaluation of decontamination procedures. J. Anal. Toxicol., 15, 250255. Forensic Examination of Hair 224 CURCURUTO, O., GUIDUGLI, F., TRALDI, P., STURARO, A., TAGLIARO, F. and MARIGO, M, 1992, Ion trap mass spectrometry applications in forensic sciences. I.
69

Identification of morphine and cocaine in hair extracts of drug addicts. Rapid Commun. Mass Spectrom., 6, 434437. DE-WOLFF, F.A., 1985, Toxicological aspects of aluminum poisoning in clinical nephrology. Clin.Nephrol., 24, S9-S14. DOREA, J.G., MERCHAN-HAMMAN, E., RYAN, D.E. and HOLZBECHER, J.G., 1989, Retention of antimony in hair during leishmaniasis treatment. Clin. Chim. Acta, 179, 341 345. ELSENHANS, B., SCHMOLKE, G., KOLB, K., STOKES, J. and FORTH, W., 1987, Metalmetal interactions among dietary toxic and essential trace metals in the rat. Ecotoxicol. Environ. Safety,14, 275287. FAERGEMANN, J., ZEHENDER, H., JONES, T. and MAIBACH, I., 1991, Terbinafine levels in serum, striatum corneum, dermis-epidermis (without stratum corneum), hair, sebum and eccrine sweat. Acta Derm. Venereol. Stockh., 71, 322326. FORMAN, R., SCHNEIDERMAN, J., KLEIN, J., GRAHAM, K., GREENWALD, M. and KOREN, G., 1992, Accumulation of cocaine in maternal and fetal hair; the dose response curve. Life Sci., 50, 13331341. FRANCESCHIN, A., MOROSINI, L. and DELLANNA, L., 1987, Detection of morphine in hair with the Abbott TDx. Clin. Chem., 33, 2125. GRAHAM, K., KOREN, G., KLEIN, J., SCHNEIDERMAN, J. and GREENWALD, M., 1989, Determination of gestation cocaine exposure by hair analysis. J. Am. Med. Assoc., 262, 33283330. GRANDJEAN, P., 1984, Lead poisoning: hair analysis shows the calendar of events. Human Toxicol., 3, 223228. GOLDBERGER, B.A., CAPLAN, Y.H., MAGUIRE, T. and CONE, E.J., 1991, Testing human hair for drugs of abuse. III. Identification of heroin and 6-acetylmorphine as indicators of heroin use. J.Anal. Toxicol., 15, 226231. HARKEY, M.R., 1993, Anatomy, and physiology of hair. Forens. Sci. Int., 63, 18. HARKEY, M.R., HENDERSON, G.L. and ZHOU, C., 1991, Simultaneous quantitation of cocaine and its major metabolites in human hair by gas chromatography/chemical ionization mass spectrometry. J. Anal. Toxicol., 15, 260265. HENDERSON, G.L., 1993, Mechanisms of drug incorporation into hair. Forens. Sci. Int., 63, 1929. HENDERSON, G.L., HARKEY, M.R., ZHOU, C. and JONES, R.T., 1992, Cocaine and metabolites in the hair of South American coca chewers. J. Anal. Toxicol., 16, 199201. KALASINSKY, K.S., MAGLUILO, J. and SCHAEFER, T., 1993, Hair analysis by infrared microscopy for drugs of abuse. Forens. Sci. Int., 63, 253260. KAUERT, G. and RHRICH, J., 1996, Concentrations of ?9-tetrahydrocannabinol, cocaine and 6-monoacytlmorphine in hair of drug abusers. Int. J. Legal Med., 108, 294299. KELLER, T., MIKI, A., REGENSCHEIT, P., DIRNHOFER, R., SCHNEIDER, A. and TSUCHIHASHI, H., 1998, Detection of designer drugs in human hair by ion mobility spectrometry (IMS), Forens. Sci. Int., 94, 5563.

70

KIDWELL, D.A., 1993, Analysis of phencyclidine and cocaine in human hair by tandem mass spectrometry. J. Forens. Sci., 38, 272284. KINTZ, P. and CIRIMELE, V., 1997, Interlaboratory comparison of quantitative determination of amphetamine and related compounds in hair samples. Forens. Sci. Int., 84, 151156. KINTZ, P., CIRIMELE, A., TRACQUI, A. and MANGIN, P., 1995, Simultaneous determination of amphetamine, methamphetamine, 3,4-methylendioxyamphetamine and 3,4,methylendioxymethamphetamine in human hair by gas chromatography/mass spectrometry. J. Chromat. B.,670, 162166. KINTZ, P., LUDES, B. and MANGIN, P., 1992a, Detection of drugs in human hair using Abbott Adx with confirmation by gas chromatography/mass spectrometry. J. Forens. Sci., 37, 328331. KINTZ, P. and MANGIN, P., 1993, Opiate concentrations in human head, axillary and pubic hair. J. Forens. Sci., 38, 657662. KINTZ, P., TRACQUI, A. and MANGIN, P., 1992b, Tobacco, drug and narcotic abuse during pregnancy. Evaluation of in utero exposure by analysis of hair of the neonate. Presse Med., 21, 21392141. KINTZ, P., TRACQUI, A. and MANGIN, P., 1992c, Detection of drugs in human hair for clinical and forensic applications. Int. J. Legal Med., 105, 14. KLEIN, J., GREENWALD, M., BECKER, L. and KOREN, G., 1992, Fetal distribution of cocaine: case analysis. Pediatr. Pathol., 12, 463468. LANDRY, M.J., 1992, An overview of cocaethylene, an alcohol derived psychoactive cocaine metabolite. J. Psychoactive Drugs, 24, 273276. MARIGO, M., TAGLIARO, F., POIESI, C., LAFISCA, S. and NERI, C., 1986, Determination of morphine in the hair of heroin addicts by high performance liquid chromatography with fluorimetric detection. J. Anal. Toxicol., 10, 158161. MARQUES, P.R., TIPPETTS, A.S. and BRANCH, D.G., 1993, Cocaine in the hair of mother infant pairs: quantitative analysis and correlations with urine measures and self reports. Am. J. Drug Alcohol Abuse, 19, 159175. MARSH, D.O., MYERS, G.J., CLARKSON, T.W., AMIN-ZAKI, L., AL-TIKRITI, S., MAJEED, M.A. and DABBAGH, A.R., 1981, Dose response relationship for human exposure to methylmercury. Clin. Toxicol., 18, 13111318. MARTINEZ, F., POET, T.S., PILLAI, R., ERICKSON, J., ESTRADA, A.L. and WATSON, R.R., 1993, Cocaine metabolite (benzoylecgonine) in hair and urine of drug abusers. J. Anal. Toxicol.,17, 138142. MARTZ, R., DONNELLY, B., FETTEROLF, D., LASSWELL, L., HIME, G.W. and HEARN, W.L., 1991, The use of hair analysis to document a cocaine overdose following a sustained survival period before death. J. Anal. Toxicol., 15, 279281. MIECZKOWSKI, T. and NEWEL, R., 1993, An evaluation of patterns of racial bias in hair assays for cocaine: black and white arrestees compared. Forens. Sci. Int., 63, 8598. MIKI, A., KELLER, T., REGENSCHEIT, P., DIRNHOFER, R., TSTSUNO, M., KATAGI, M., NISHIKAWA, M. and TSUCHIHASHI, H., 1997, Application of ion mobility
71

spectrometry to the rapid screening of methamphetamine incorporated in hair. J. Chromat. B., 692, 319 328. MIYAZAWA, N. and UEMATSU, T., 1992, Analysis of ofloxacin in hair as a measure of hair growth and as a time marker for hair analysis. Ther. Drug Monit., 14, 525528. MIYAZAWA, N., UEMATSU, T., MIZUNO, A., NAGASHIMA, S. and NAKASHIMA, M., 1991, Ofloxacin in human head hair determined by high performance liquid chromatography. Forens. Sci. Int., 51, 6577. MOELLER, M.R., 1992, Drug detection in hair by chromatographic procedures. J. Chromatogr., 580, 125134. MOELLER, M.R., FEY, P. and SACHS, H., 1993, Hair analysis as evidence in forensic cases. Forens.Sci. Int., 63, 4353. NAGAI, T., SATO, M., NAGAI, T., KAMIYAMA, S. and MIURA, Y., 1989, A new analyticalmethod for stereoisomers of methamphetamine and amphetamine and its application to forensic toxicology.Clin. Biochem., 22, 439442. NAKAHARA, Y., OCHIAI, T. and KIKURA, R., 1992a, Hair analysis for drugs of abuse. V. The facility in incorporation of cocaine into hair over its major metabolites, benzoylecgonine and ecgonine methyl ester. Arch. Toxicol., 66, 446449. NAKAHARA, Y., SHIMAMINE, M. and TAKAHASHI, K., 1992b, Hair analysis for drugs of abuse. III. Movement and stability of methoxyphenamine (as a model compound methamphetamine) along hair shaft with hair growth. J. Anal. Toxicol., 16, 253257. NAKAHARA, Y., TAKAHASHI, K., SHIMAMINE, M. and SAITOH, A., 1992c, Hair analysis for drugs of abuse. IV. Determination of total morphine and confirmation of 6acetylmorphine in monkey and human hair by GC/MS. Arch. Toxicol., 66, 669674. NAKAHARA, Y., TAKAHASHI, K., SHIMAMINE, M. and TAKEDA, Y., 1991, Hair analysis for drug abuse. I. Determination of methamphetamine and amphetamine in hair by stable isotope dilution gas chromatography/mass spectrometry method. J. Forens. Sci., 36, 7078. NAKAHARA, Y., TAKAHASHI, K., TAKEDA, Y., KONUMA, K., FUKUI, S. and TOKUI, T., 1990, Hair analysis for drug abuse. Part II. Hair analysis for monitoring of methamphetamine abuse by isotope dilution gas chromatography/mass spectrometry. Forens. Sci. Int., 46, 243254. NATION, J.R., BOURGEOIS, A.E., CLARK, D.E. and HARE, M.F., 1983, The effects of chronic cobalt exposure on behavioral metallothionein levels in the adult rat. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 5, 915. NATION, J.R., HARE, M.F., BAKER, D.M., CLARK, D.E. and BOURGEOIS, A.E., 1985, Dietary administration of nickel: effects on behavior and metallothionein levels. Physiol. Behav., 34, 349353. NIWAGUCHI, T., SUZUKI, S. and INOUE, T., 1983, Determination of methamphetamine levels in hair after single and repeated administration to rat. Arch. Toxicol., 52, 157164. OBARA, K., SAITO, T., SATO, H., YAMAKAGE, K., WATANABE, T., KAKIZAWA, M.,

72

TSUKAMOTO, T., KOBAYASHI, K., HONGO, M. and YOSHINAGA, K., 1991, Germaniumpoisoning: clinical symptoms and renal damage caused by long term intake of germanium. Jpn J. Med., 30, 6772. OFFIDANI, C., CARNEVALE, A. and CHIAROTTI, M., 1989, Drugs in hair: a new extraction procedure. Forens. Sci. Int., 41, 3539. OFFIDANI, C., STRANO ROSSI, S. and CHIAROTTI, M., 1993a, Drug distribution in the head, axillary and pubic hair of chronic addicts. Forens. Sci. Int., 63, 105108. OFFIDANI, C., STRANO ROSSI, S. and CHIAROTTI, M., 1993b, Improved enzymatic hydrolysis of hair. Forens. Sci. Int., 63, 171174. PIROZHKOV, S.V., WATSON, R.R. and ESKELSON, C.D., 1992, Gas chromatographic detection of cocaine and cocaethylene in hair of mice chronically injected with cocaine or cocaethylene and fed alcohol. Forens. Sci. Int., 57, 99107. POET, T.S., MARTINEZ, F. and WATSON, R.R., 1992, Effect of murine retroviral infection on hair and serum levels of cocaine and morphine. Forens. Sci. Int., 54, 2938. PTSCH, L. and MOELLER, M.R., 1996, On pathways for small molecules into and out of human hair fibers. J. Forens. Sci., 41, 121125. PTSCH, L., SKOPP, G. and MOELLER, M.R., 1997, Biochemical approach on the conservation of drug molecules during hair fiber formation. Forens. Sci. Int., 84, 2535. PUSCHEL, K., THOMASCH, P. and ARNOLD, W., 1983, Opiate levels in hair. Forens. Sci. Int., 21, 181186. RUNNE, U., OCHSENDORF, F.R., SCHMIDT, K. and RAUDONAT, H.W., 1992, Sequential concentration of chloroquine in human hair correlates with ingested dose and duration of therapy. Acta Derm. Venereal. Stockh., 72, 355357. SACHS, H., 1997, History of hair analysis. Forens. Sci. Int., 84, 716. SACHS, H., DENK, R. and RAFF, I., 1993, Determination of dihydrocodeine in hair of opiate addicts by GC/MS. Int. J. Legal Med., 105, 247250. SKOPP, G., PTSCH, L. and MOELLER, M.R., 1997, On cosmetically treated hairaspects andpitfalls of interpretation. Forens. Sci. Int., 84, 4352. SMITH, F.P. and LIU, R.H., 1986, Determination of cocaine metabolite in perspiration stain, menstrual bloodstain and hair. J. Forens. Sci., 31, 12691273. SPRINGFIELD, A.C., CARTMELL, L.W., AUFERHEIDE, A.C., BUIKSTRA, J. and HO, J., 1993, Cocaine and metabolites in the hair of ancient Peruvian coca leaf chewers. Forens. Sci. Int., 63, 269275. STEWART-PINKHAM, S.M., 1989, The effect of ambient cadmium air pollution on the hair mineral content of children. Sci. Total Environ., 78, 289296. TAGLIARO, F., ANTONIOLI, C., MORETTO, S., ARCHETTI, S., GHIELMI, S. and MARIGO, M., 1993, High sensitivity, low cost methods for determination of cocaine in hair: high performance liquid chromatography and capillary electrophoresis. Forens. Sci. Int., 63, 227238. TRACQUI, A., KINTZ, P. and MANGIN, P., 1992a, Fatal poisoning involving amitriptyline: toxicologic data. J. Toxicol. Clin. Exp., 12, 39.

73

TRACQUI, A., KREISSIG, P., KINTZ, P., POULIQUEN, A. and MANGIN, P., 1992b, Determination of amitriptyline in the hair of psychiatric patients. Hum. Exp. Toxicol., 11, 363367. UEMATSU, T., MATSUNO, H., SATO, H., HIRAYAMA, H., HASEGAWA, K. and NAKASHIMA, M., 1992, Steady state pharmacokinetics of haloperidol and reduced haloperidol in schizophrenic patients: analysis of factors determining their concentrations in hair. J. Pharm. Sci., 81, 10081011. UEMATSU, T., NAKANO, M., AKIYAMA, H. and NAKASHIMA, M., 1993, The measurement of a new antimicrobial quinolone in hair as an index of drug exposure. Br. J. Clin. Pharmacol., 35, 199203. UEMATSU, T. and SATO, R., 1990, Human scalp hair as evidence of individual dosage history of haloperidol: long term follow up study. Ther. Drug Monit., 12, 582583. VALENTE, D., CASSINI, M., PIGLIAPOCHI, M. and VANSETTI, G., 1981, Hair as the sample in assessing morphine and cocaine addiction. Clin. Chem., 27, 19521953. VAN WOUWE, J.P., DE-WOLFF, F.A. and VAN GELDEREN, H.H., 1986, Zinc in hair and urine of paediatric patients. Clin. Chim. Acta, 155, 7782. VIALA, A., DETURMENY, E., AUBERT, C., ESTADIEU, M. DURAND, A., CANO, J.P. and DELMONT, J., 1983, Determination of chloroquine and monodesethylchloroquine in hair. J. Forens.Sci., 28, 922928. WELCH, M.J., SNIEGOSKI, L.T. and ALLGOOD, C.C., 1993, Interlaboratory comparison studies on the analysis of hair for drugs of abuse. Forens. Sci. Int., 63, 295303. WINTERBERG, B., BERTRAM, H., ROLF, N., ROEDIG, M., KISTERS, K., REMMERS, S., SPIEKER, C. and ZUMKLEY, S., 1987, Differences in plasma and tissue aluminum concentrations due to different aluminum containing drugs in patients with renal insufficiency and with normal renal function. Trace Elem. Electro. Health Dis., 1, 6972.

74

Cap. IV. Otrvuri nevolatile. Otrvirea cu metale Exist cinci grupe analitice de otrvuri sau toxici: toxici gazoi; toxici volatili; toxici minerali; toxici organici nevolatili; toxici speciali (dup Ogier). Grupa a IV-a analitic conine toxicii organici nevolatili extractibili cu solveni organici n mediul acid, neutru sau alcalin. Aceast grup nglobeaz majoritatea (90%) compui naturali (vegetali sau animali) i sintetici. In aceast grup gsim substane cu caracter acid (acizi organici, derivai barbiturici, sulfamide, lactone, anhidride); heterozizi; metilxantine; medicamente de sintez; alcaloizi; pesticide; aditivi alimentari; detergeni; toxine vegetale i animale. Separarea acestor substane n stare pur din diferite produse se realizeaz prin extragerea cu solveni organici, dup metode generale sau speciale. Unele dintre substane, cum ar fi nicotina, acidul picric, etc., pot fi izolate i prin antrenare cu vapori de ap, operaie care este de obicei urmat de extragerea distilatului cu solveni organici. Extragerea cu solveni se bazeaz pe principiul dup care solubilitatea substanelor este invers proporional cu masa molecular. Se urmrete de regul ca solventul s extrag toxicul nealterat, precipitnd n acelai timp proteinele. Pentru a mri eficiena extractiv a solventului se adaug acizi sau baze. Spre deosebire de izolarea toxicilor volatili i minerali, extragerea toxicilor organici cu solveni prezint o serie de dificulti suplimentare, precum: concomitent cu toxicul se por extragere i unii produi ce deranjeaz analiza (proteine, lipide, colorani, metabolii proprii etc.); se poate pierde o parte din toxic prin: oxidare; extracie incomplet; adsorbie pe precipitatele din cursul operaiilor de purificare etc. Metodele de extracie se pot clasifica n funcie de: 1. Solvenii folosii: - alcool acidulat (pentru majoritatea toxicilor): - extracia selectiv (cu solveni specifici toxicului respectiv). 2. Eficiena extragerii - extracie prin echilibrare; - extracie exahusiv. Extracia general cu alcooli acidulai Prima metod eficient de extragere cu solveni organici a fost elaborat de State (1850). Ulterior metoda a fost ameliorat de Otto, apoi Orgier. n prezent se utilizeaz metoda StasOtto, modificat de Ogier i Kohn-Abrest. Metode de extracie Metoda State se bazeaz pe principiul solubilitii n ap, alcool sau amestec hidroalcoolic, a srurilor alcaloizilor cu acid tartic sau oxalic i a insolubilitii lor n solveni organici. Aceste sruri sunt descompuse cu bicarbonat de sodiu, cnd alcaloizii trec n forma bazic, insolubilii n ap, dar extractibili cu solveni organici.

75

Metoda Stas Otto: extragerea cu eter din lichidul apos acid a toxicilor cu caracter acid i neutru. Sunt extrai acizi organici, glicozizi, derivai barbiturici, metilxantinele, sulfamidele, pesticidele, lactone, anhidride, compui neutri, precum i o serie de impuriti. Metoda Stas - Otto Origer: ntruct n variantele anterioare se obin reziduuri impurificate cu proteine, lipide, colorani, rezine, Origer a purificat iniial filtratul hidroalcoolic acid prin tratarea acestuia cu alcool concentrat, agent precipitant al impuritilor menionate. Metoda Stas Otto, modificat Metoda Stas Otto: Pentru izolarea toxicilor, materialul biologic de analizat se mparte in dou poriuni: pe prima poriune se execut reacii preliminare, iar cea de a dou se divide n trei poriuni (A, B, C), n care se cerceteaz toxicii i anume: n prezena A- toxicii volatili i minerali, n prezena B- toxicii organici, iar n poriunea C este utilizat pentru cercetri complementare.

76

Organe-25 g+ 50 ml alcool etilic 95 o + 0,25 g acid tartric ( pH=4-5) M acerare pe B.M. la 70 o C 2-3 ore Filtrare (prin tifon, apoi hrtie de filtru)

Lichid hidroalcoolic acid evaporare pr B.M pentru ndeprtarea alcoolului

Lichid apos R acid

-srurile alcaloizilor -toxici organici acizi si neutri - impuritti: proteine, lipide, coloranti, rezine, etc.

Purificare

prin tratri succesive (3-4ori) cu alcool etilic 95 (50ml) -filtrare, evaporare. Ultima dat se foloseste alcoolul etilic absolut.

Lichid apos R acid - debarasat de impuritti extractie cu eter etilic (de 2 ori cu 30:50ml)

Solutie apoas acid A extractie cu cloroform (de 2 ori cu 30:50ml)

Solutie apoas Acid B

extract cloroformic acid -fenacetin alcalinizare la pH 8-9 cu -fenilbutazon bicarbonat de sodiu 10% -cafein -meprobamat extractie cu eter

Extract eteric acid -acizi organici (ac.salicili, picric, oxalic, acetic, benzoic). -derivati barbiturici -glucozizicardiotonici -sulfamide -lactone : a.cantaridina b.santonina -pesticide: HCH, DDT, ANTU, paration -veratrina -colchicina -glutetimid partial -picrtoxin

Solutie apoas alcalin extractie cu cloroform

Extract eteric alcalin -cocain -pilocarpin -izoniazid Observatii: - Pentru ndeprtarea lipidelor se poate face o extractie cu eter de petrol (de 2 ori cu 30:50ml) a lichidului apos R acid. n extractul de eter de petrol se poate identifica: acidul salicilic, glutetimida, insecticide, organoclorurate

extract cloroformic alcalin -alcaloizi de baz: -morfin, codein, dionin, papavrin -stricnin, brucina -chinina, chinidin -atropin -ezerina -nicotina -colchicina -fenazona, aminofenazona -tranchilizante -antidepresive -anestezice locale de sintez -antihistaminice -antipaludice -teofilina, si alte substante cu caracter alcalin

Modul de lucru: Proba biologic de analizat (50-500 g) n funcie de natura acesteia, se omogenizeaz prin pulverizare, solubilizare sau suspendarea acestuia ntr-o cantitate mic de ap. n cazul coninutului stomacal, acesta este titrat n mojar cu puin ap cald. Se adaug la proba omogenizat un volum dublu de alcool de 95 i acid tartric n cantitate de 1% fa de produs, astfel nct pH-ul s fie acid (pH-ul=4-5) (Schema nr.1). Nu folosesc acizi minerali, deoarece aceste impurific produsul de analizat cu albuminaii solubili i determin hidroliza unor alcaloizi (cocain, atropin). Se macereaz 6-12 ore pe B.M. la 50, 3-6 ore la
77

70C sau 1-2 zile la temperatura laboratorului. Dac produsul de analizat a coninut apcazul organelor masa macerat are o concentraie alcoolic final de aproximativ 70, din cauza ieirii apei din produs. Se stoarce totul printr-un tifon i se filtreaz. Filtratul este distilat sub presiune redus sau este evaporat pe baie de ap la o temperatur sub 40, pn la consistena siropoas, apoi se rcete. Proba se trateaz, agitnd continuu, cu 3-4 ori volumul su cu alcool de 95, se las s se aglomereze precipitatele floconoase proteice, apoi se filtreaz. Filtratul este splat cu alcool, care se adaug la filtrat. Filtratul este din nou distilat, apoi tratat cu alcool de 95 i filtrat. Purificarea prin tratare cu alcool este repetat de 3-4 ori. Ultima dat se folosete alcool absolut. Purificarea este complet atunci cnd la adugare de alcool absolut nu se mai observa formare de flocoane proteice. Lichidul obinut se concentreaz pe B.M. pn la consisten siropoas apoi se dilueaz cu ap la 50 ml. Se obine astfel lichidul apos R acid purificat. El conine majoritatea toxicilor sub form de tartrai (alcaloizi) sau sub form liber (glucozizi, barbiturice, acizi organici etc.). Toxicii sunt extrai din lichidul apos R acid, in mediul acid sau alcalin, dup natura toxicului, cu eter acid sau cloroform. n lipsa indicaiilor asupra naturii toxicului se procedeaz la extracii succesive att n mediul acid, ct i n mediul alcalin. Dac lichidul apos R este uor opalescent din cauza impuritilor lipidice nu trebuie filtrat, pentru a nu se antrena i o parte din toxicii fixai prin absorbie pe microprecipitat. Extracia eteric acid: Se aduce cantitativ lichidul apos R acid ntr-o plnie de separare se verifica dac pH-ul este acid i se adaug eter de petrol (30 ml). Se repet extragerea de 3 ori. Operaia servete pentru eliminarea restului de impuriti din produs. Extractul de eter de petrol poate conine acid salicilic glutetimid, insecticide organoclorurate. Se evapor extractele neunite de eter de petrol pe cteva sticle de ceas i se cerceteaz prezena substanelor menionate. Lichidul apos acid rmas este extras apoi cu eter etilic, operaia se repet de 3 ori sau cte 20, 30 i 50 ml. La agitarea pentru separarea straturilor trebuie s se evite formarea emulsiilor, dac totui ele sau format, se sparg prin centrifugare, filtrare pe sulfat de sodiu anhidru sau adugare de eter de petrol (sau alcool amilic). Extractul eteric, denumit eter acid, poate conine: derivai barbiturici; glucozizi cardiotonici; lactone i derivai; acizi organici; metilxantine (parial); colchicin i veratrin (parial); pesticide etc. Extractele reunite de eter etilic sunt evaporate pe cteva sticle de ceas. Este preferabil ca evaporarea s se execute la un ventilator cu curent de aer cald, la o surs de raze infraroii sau pe baie de ap electric. Dac reziduurile sun pure, se purific prin recristalizare din ap sau solveni adecvai sau prin microsublimare, precum i reaciile de identificare a toxicilor menionai. Extracia eteric alcalin:Lichidul apos acid rmas de la extracia acid cu eter etilic este adus la pH-8 cu carbonat acid de sodiu 10% sau uneori cu amoniac 10% i extras de trei ori cu eter etilic. Extractul eter etilic, denumit eter alcalin poate conine; alcaloizii (cu excepia morfinei i a unei pri din stricnin); alte substane organice, naturale sau de sintez. Eterul
78

alcalin este evaporat pe sticle de ceas. Dac reziduurile nu sunt pure, se dizolv n HCl 0,1 N i se extrag cu eter, care ndeprteaz impuritile. Soluia apoas rmas este alcalinizat cu carbonat acid de sodiu i extras din nou cu eter, care se evapor pe cteva sticle de ceas. Extracia cloroformic alcalin: Lichidul apos R alcalin rmas poate conine morfin i o parte den stricnin, precum i teobromin i teofilina. Pentru ale separa din lichidul apos R alcalin se execut o extracie suplimentar cu cloroform care se evapor pe sticle de ceas, se concentreaz substanele menionate. Extracia prin echilibrare: Metoda se bazeaz pe agitarea produsului de analizat cu o cantitate anumit de solvent, cnd se realizeaz un echilibru de repartiie a toxicului ntre substrat (produsul de analizat) i solvent deci un echilibru ntre reinerea toxicului n substrat i extragerea lui n solvent. Din lichidul de extracie, ajuns la echilibru, se determin toxicul. Extracia exhausiv: Metoda se bazeaz pe epuizarea pe epuizarea produsului de analizat cu solvent mereu proaspt, operaia repetndu-se pn la extragerea complet. Se poate folosi urmtoarele procedee: extracie cu solvent care recircul (n aparat Soxhler, Kumanawa etc.); extracie cu solvent care se rennoiete (plnia de separare). Alte tehnici de izolare Metoda Florence: Toxicii sunt solubilizai n ap prin trecere cu acid tricloracetic 20% care particip n acelai timp proteinele. Filtratul apos acid este epuizat apoi cu solveni organici n mediu acid i n final alcalinizat. Metoda este rapid i uor de executat, ns prezint dezavantajul absorbiei pariale a toxicilor cercetai de ctre coagul, ca i a alterrii unor glicozizi i alcaloizi datorit aciditii puternice. Metoda proteolizei (Fabre):Produsul este supus degradrii enzimatice cu tripsin, cnd se solubilizeaz proteinele. Lichidul este apoi extras cu solveni organici. Metoda electrodializei (Dhr-Fabre): Produsul acidulat este supus electrolizei ntrudispozitiv special; sunt astfel separai i ionii minerali, alturi de cei organici. Metoda este folosit pentru extragerea barbituricilor i alcaloizilor, ns necesit uneori o modificare suplimentar a dispozitivului, pentru a evita degradarea toxicului. Metoda cu tungatat de sodiu (Valov): Precipitarea substanei organice se realizeaz prin tratarea cu tungatat de sodiu i apoi nclzire, urmat de filtrare i extragere cu solveni organici. Metoda este deosebit de util pentru substanele cu caracter acid sau neutru. Metoda cu sulfat de amoniu (Nicolle): Produsul de analizat este acidulat cu HCl, apoi saturat cu sulfat de amoniu i nclzit la 90. Filtratul rcit este epuizat cu solveni organici. Metoda este utilizabil pentru orice material-organe, snge, alimente, buturi.
79

Metoda digestiei acide: Produsul de analizat acidulat cu HCl este nclzit pe baie de ap timp de o or, cnd precipitnd proteinele. Filtratul este extras cu solveni organici. Metoda este recomandat pentru fenotiazine, chinin, morfin, etc., pe care le separ din complexul drog-protein. n schimb, este inutilizabill pentru atropin, aconitin, cocain, benzodiazepine, paracetamol, pe care le hidrolizeaz. Metoda cu sulfat de sodiu anhidru (Griffon-Le Breton): Lichidele biologice sunt acidulate sau alcaline n raport de natura substanei-apoi tratate cu sulfat de sodiu anhidru pn obinerea unei mase pulverulente, care se epuizeaz cu solveni organici. Metoda este rapid i util pentru extragerea barbituricilor i a unor alcloizi. Metode directe (izolare prin cromatografie cu rini schimbtoare de ioni): Unele medicamente ca antihipertensive, colinergice, insulina etc. Sunt extrase din snge i urina direct prin cromatografia produsului acidulat cu ajutorul unei coloane cu rini schimbtoare de ioni.

Identificarea i determinarea toxicilor organici nevolatili Alcaloizii Identificarea alcaloizilor se face curent cu reactivi generali care dau precipitate sau produi colorai cu cantiti mici de alcaloid. Reacia de identificare cu reactivi generali se execut pe o soluie clorhidrat sau sulfat de alcaloid, astfel: reziduul rmas pe sticla de ceas dup evaporarea eterului (cloroformului, dicloretanului etc.) alcalin este reluat cu cteva picturi de acid clorhidric diluat sau acid sulfuric diluat i se evapor la sec pe B.M. Reziduul, care reprezint alcaloidul salifiat, se solv n 3-4 picturi din reactivul general. n prezena alcloizilor , poate aprea opalescen, un precipitat sau zone colorate. Este necesar ca reaciile generale ale alcaloizilor s fie executate pe reziduuri de alcaloizi lipsite de impuriti proteice, care interfer reacia, dnd i ele precipitate cu reactivi generali ai alcaloizilor. Reactivii generali ai alcaloizilor se mpart n: A.- reactivi de precipitare; B.- reactivi speciali de culoare. Reactivi de precipitare n raport cu compoziia chimic, reactivii de precipitare ai alcloizilor se pot mpri, schematic, n patru grupe: 1. ioduri duble; 2. cloruri ale metalelor grele i sruri duble; 3. heteropoliacizi; 4. pseudoacizi, acizi organici i ali compui organici. Ioduri duble
80

a. Reactivul Bourchardat (Wagner) (soluie de iod- iodurat, KI.I2) 2 g de iod, 2 g iodur de potasiu se solv n ap distilat 100 ml. . Reactivul Bourchardat d precipitate colorate cu toi alcaloizii salificai, cu excepia cafeinei. Precipitatele sunt solubile n exces de iodur de potasiu i i alcool. Reactivul se pstraz indefinit n sticle brune, bine nchise (tab.1). b. Reactiv Drangendorff (iodobismutat de potasiu, K(BiI4)H2O 5 g subnitrat de bismut se solv n 40 ml ap distilat la care se adaug 10 ml acid clorhidric concentrat, apoi se adug 100 ml iodur de potasiu 40%. Reactivul nu este stabil dect n mediul acid i precipit prin diluare cu ap, precipitatul redizolvndu-se prin acidulare. Prin edere se elibereaz iod, care se extrage prin agitare cu cloroform. Reactiv Drangendorff d cu alcaloizii clorhidrai precipitate amorfe, roii-portocalii, solubile parial prin nclzire i reprecipitnd la rece. Complecii formai sunt solubili n cloroform, aceton, acetat de etil, ciclohexanon etc., soluiile pretndu-se la dozri colorimetrice. c. Reativul Mam (iodocadmiat de potasiu K2 (CdI4) 5 g iodur de cadmiu se dizolv ntr-o soluie cald de 10 g iodur de potasiu n 30 g ap, apoi se completeaz cu ap distilat la 110 ml. Reactivul Mam d cu alcaloizii precipitate albe sau glbui, solubile n exces de reactivi. Cafeina nu d precipitat, iar atropina nu precipit dect n soluii destul de concentrate. d. Reactivul Mayer (iodomercuriat de potasiu, K2HgI4) 13,52 g clorur mercuric, 48,8 g iodur de potasiu se dizolv n 1000 ml ap distilat. Reactivul Mayer d cu alcaloizii precipitate albe pn la galben deschis, amorfe sau cristaline. d. Reactivul Walzer (iodomercuriat de potasiu) Peste soluia de iodur de potasiu 10% se adaug iodur de mercur solid, pn la saturare. Reactivul Walzer este varianta mbuntit a reactivului Mayer, fiind mai sensibil. 2.Cloruri ale metalelor grele i sruri duble a. Clorura de aur (soluie apoas de diferite concentraii: 5%, 10%, 30%, 40%). Aceste soluii dau precipitate de cloroaurai, de alcaloizi cu formula Au Cl3HClAlc. de culoare galben sau alb. b. Clorur de platin (soluie apoas 5%) D precipitate de cloroplatinat de alcaloizi, cu formula PtCl42HClAlc. c. Clorura de mercur (soluie apoas 5%) cloromercurai ai alcaloizilor, precipitate albe. d. Sarea lui Reinecke [Cr(NH3)2(SCN)4 NH4] H2O Sarea Reinecke 4 g , ap distilat 100 ml. Reactivul d precipitate cu soluii clorhidrice de alcaloizi. 3.Heteropoliacizi Heteropoliacizii dau precipitate cu alcaloizi; datorit masei lor moleculare mari se obin precipitate abundente, care pot servi eventual i pentru dozarea gravimetric a alcaloizilor. a. Reactivul Bertrand (acid silicotungetic) 5 g acid silicotungetic (sau sare de sodiu)se dizolv n 100 ml ap distilat. Este cel mai sensibil dintre heteropoliacizi, datorit masei moleculare mari (aproximativ 2880).

81

D precipitate cu formula SiO2 12 TuO3 2H2O 4 Alc.+ nH2O. Complexul este descompus la rece de alcalii, cu eliberare de alcaloid, care poate fi extras cu un solvent organic. Reactivul Bertrand precipit cu unele substane proteice i cu glicogenul, nu ns cu glicoizii, taninul i cianurile. b. Rectivul Scheilber (acid foafotungatic) Se solv 4 g tugetat de sodiu n 20 ml ap, apoi se adaug 1 g acid fosforic 50% . Reactivul d precipitate albe cu alcaloizi. c. Reactivul Schultze (acid fosfoantixonic) 3 g corur de stibiu, 9 g fosfat acid de sodiu se dizolv n 100 ml ap distilat. D precipitate albe cu alcaloizi. d. Reactivul Sonnenschein (acid fosfomolibdenic) n lips de substan pur, reactivul se precipit astfel: se precipit o soluie nitric de molbdat de amoniu cu o soluie de fosfat disodic. Precipitatul galben se filtreaz la pompa de vid, apoi se dizolv ntr-o cantitate suficient de hidroxid de sodiu. Soluia se nclzete pe o baie de nisip pn la ndeprtarea complet a amoniacului. Cu substana obinut se prepar o soluie de 10% n acid azotic 10%. Reactivul Sonnenschein d precipitate cu alcaloizii i cu substanele nrudite (anilin substituit, alte amine etc.). 4. Pseudoacizi, acizi i ali compui organici a. Reactivul Hager (acid picric, soluie saturat) Soluiaapoas saturat (10%) de acid picric d precipitate galbene, uor solubile la cald, care reprecipit la rece. Unele cristale au forme caracteristice. Urmtoarea variant a reactivului propus de Ionescu Matiu permite obinerea mai uoar a cristalelor caracteristice: la soluia saturat de acid picric n alcool de 95 se adaug glicerin n proporie de 5%. b. Rectivul Knorr (acid picrolonic: 1-p-nitrofenil, 3-metil 4-nitro 5-pirazolin.)
H3C

C
HN N

C C

NO2 O C6H4 NO2

Se prepar o soluie de acid picrolonuc cu 2% n alcool (soluie saturat), care d cu alcaloizii, precipitate galbene sau roii, care se descompun la cald. d. Acidul tanic (tanin) Taninul d precipitate de tanai de alcaloizi. Specificitatea reactivului este redus, deoarece taninul d precipitate i cu ali produi (substane proteice). Complexul tanin-alcaloid este descompus de oxidul de plumb. d.Acidul stifnic (2,4,6-trinitrorezorcin).

82

OH O2N NO2 OH NO2

Soluia apoas saturat de acid stifnic d precipitate cu alcloizii. Reactivi de culoare speciali pentru alcaloizi Dup stabilirea prezenei alcaloizilor cu ajutorul reactivilor generali, se trece la caracterizarea unui alcaloid sau a unei grupe de alcaloizi prin culoarea obinut la tratarea cu reactivi speciali. Reaciile se execut cu alcaloizii nesalifiai i sunt cu att mai nete, cu ct reziduul este mai purificat; aceasta, deoarece cei mai muli reactivi speciali sunt preparai cu acid sulfuric concentrat care carbonizeaz impuritile, astfel nct coloraia reactiv-alcaloid este interferat sau chir mascat. Reactivii speciali de culoare a alcaloizilor de mpart n 3 grupe: a. acizi concentrai; b. amestec de acizi; c. amestec de acizi cu diferite sruri. a. Acizi concentrai acid sulfuric, acid azotic (lipsit de vapori nitroi). b. Amestec de acizi reactivul Edrman. Se amestec 20 ml acid sulfuric concentrat cu 10 picturi dintr-o soluie de 8 picturi acid azotic 25% i apoi cu 100 ml ap distilat. c. Amestec de acizi cu diferite sruri: -reactivul Frhde (acidul sulfomolibdenic) : 0,5 g, molibdat de amoniu 0,1 g (molibdat de sodiu) se dizolv n 10 ml acid sulfuric concentrat. (Se prepar extemporaneu); -reactivu Mandelin (sulfovanadat): 1g vanadat de amoniu se dizolv n 200 ml de acid sulfuric concentrat; -reactiv Lafon (sulfoselenit): 1 g selenit de sodiu se dizolv n 20 ml acid sulfuric concentrat; - reactivu Marke (sulfoselenit): 1 g selenit de sodiu se dizolv n 20 ml acid sulfuric concentrat; -reactivulMarquie (sulfoformolat): 1 ml formolat 40% se amestec cu 30 ml acid sulfuric concentrat (se prepar extemporaneu); -reactiv Wasicki (PABA n acid sulfuric concentrat): 2 g p-dimetilaminobenzoid se dizolv n 6 ml acid sulfuric concentrat i 3 ml ap distilat. Reaciile obinute de alcaloizi cu acidul sulfuric concentrat, acidul azotic concentrat i reactiv Erdman sunt redate n tabelul nr. 2. Reaciile de culoare cu aceti reactivi sunt redate n tabelul nr. 3.

83

Tabelul 1. Reaciile alcaloizilor cu formare de precipitate (dup Banciu) REACTIV HAGER precipit nunai n soluie concentat precipitat galben numai n soluii concentrate precipit numai n soluii concentrate precipitat amorf (1:40000) precipitat galben (1 : 1000) precipitat galben (1 : 225) precipit numai n soluii concentrate precipit numai n soluii concentrate nu precipit precipitat REACTIV MAYER precipitat alb n soluii d diluate (1:7000) REACTIV DRANGERDOF F precipitat galben (1 : 40000(x) galben-rocat, trece n galben intens (1:01000) REACTV BOUCHARDA T precipitat brun

ALCALOIDUL

Aconitina

Atropina

brun-rocat (1:3000) precipitat brun numai n soluii concentrate rou brun

Cafeina

nu precipit precipitat alb (1:125000) (1 140000) (1 : 50000) precipit numai n soluii concentrate precipitat alb (1: 5000) (1:2500) precipitat
84

nu precipit

Chinina

precipitat rou (1:50000) : precipitat rou (1:30000)

Cocaina

precipitat brun (1 : 50000) precipitat brun (1:60000) precipitat brun (1:25000) precipitat rocat (1:25000) brun

Codeina

Colcichina

(1:3000)

Fizostigmina

precipit rou - galben (1:5000) ptecipitat rou,

Morfina Nicotina

brun - rocat (1:25000) precipitat brun -

Papavelina Pilocarpina Srricnina

galben numai n n soluii concentrate precipitat galben (1 : 500) precipit precipitat galben (1 : 20000) nu precipit

alb (1:12500)

trece n alb -cenuiu (1 40000) precipitat portocaliu (1 : 10000) precipit

rocat (1:50000)

precipitat alb (1:15000) precipit precipitat alb (1:15000) nu precipit

rou-

precipitat galben (1 : 25000)

Teobromina

precipitat rounchis (1 : 50000) precipit precipitat brun rocat (1:50000) precipitat brun numai n soluii concentrate

(x) = cifrele din parantez reprezint gradul de sensibilitate a reaciei.

Tabelul 2. Reaciile alcaloizilor cu acizii cu formare de produse colorate

REACTIV DE CULOARE ALCALOID H2SO4 Atropina Brucina Chinina fr culoare trece n glbui i la cald n brun Cocaina Codeina lacald albastru- violet Colcichicina galben Heroina Dionina Morfina Nicotina Papavelina Pilocarpin Stricnin la cald ourpuriu la cald volet-albastru Fr culoare,cu KOH

HNO3 rou-trece n galben galben-verzui violet,trece n brunrocat : cu NOH trece n portocaliu galben, la cald trece n rou galben verzui rou orange trece n galben rocat glbui, trece n rou ntunecat Galben La cald trece n galben
85

R. Erdman la cald albastru albastru,cu KOH trece n rou galben, verde pal albastru orange rou trece n brun albastru-verzui -

Picrotozin

trece n galben Galben pal

Tabelul 3 Reacii de culoare ale alcaloizilor cu reactivi speciali Heroina Purpuriu REACTIVI DE CULOARE Verde Alcaloid R.Frhde R.Mandelin Violet roR.Marquis cat,la cald trece n albastruviolaceu 3 Albastru,violet Maroniu,la murdar cald verde Ro ucarmin,trece n violetalbastru Verde R.Lafon

0 Dionina Atropina

Morfina Brucina

Chinina

Nicotina Cocaina

Papaverin aCodeina

Pilocarpin aColchina Stricnina

1 Verde, trece n albastru Violet,trece Ro un brunverde galben apoi n galbenbrun n timp albroscat Verde, albastru, la cald rosu Galben visiniu murdar, - cald la albastru Galben trece n galben verzui

2 Galben trece Ro u,trece in la galben cald n verde cat, trece Ro u n Albastruviolaceu -

4 Verde -

-Verde, albstrui, albastrutrece Verzui n albastru Galben,verde, albastru AlbastruViolet,albastru verzui trece n ro u brun Galbenviolaceu
86

- Rosu trece n orange Ro u-carmin trece n n Albastru- timp glbui,apoi violaceu ro u citrin Galben n timp,la cald brun-verzui -

Albastru, Galben, Verzui,la ro u cald trece La cald n brun (strlucitor) Galben n timp,ro u, Verzui, la cald albastru, portocaliu la Verde cald violet smarald Galben citrin, la cald galben brun

R.Wasik y 5 Ro -u cire iu, violet Ro u -

Ro u -

-Ro uviolet

Picrotoxin

Determinarea cantitativ a toxicilor organici nevolatili Spectrofotometria de absorbie n UV, Vis i IR n domeniul vizibil, valoarea absorbiei luminii este apreciat prin intermediul extinciei, care este definit pentru soluii, prin intermediul legii Lamoert Beer dup ecuaia: E= . C . 1 Relaia arat c extincia, deci absorbia luminii este funcie de lungimea de und (prin intermediul lui ), de concentraia C, de grosimea stratului absorbant 1. Pentru a studia E1 = f(c), trebuie ca () i 1 s se menin constante. Aceasta se realizeaz practic, innd = max (valoarea lungimii de und coresponztoare maximului i lucrnd n cuve de grosime constant. n aceste condiii, pentru o serie de soluii de concentraie C1......Cn se vor detrmina extinciile E1.......En. Reprezentareagrafic trebuie sp fie o dreapt. Se c legea Lambert Beer se verific n domeniul de concentraie C1 Cn, iar dreapta obinut se numete curb etalon. Ea se folosete pentru determinarea oricrei concentraii necunoscute Cx. n domeniul vizibil de reacii, absorb numai substanele colorate ele vor absorbi din spectrul luminii din vizibil (400 800 nm) radiaia complementar culorii ce o prezint. Substanele incolore nu absorb n vizibil. Pentru a putea studia dependena E = f(c) i pentru aceast categorie de substane, se efectueaz o reacie de culoare prin tratarea substanei incolore cu un reactiv de culoare. Sistemul obinut va absorbi n vizibil i concentraia se va putea determina cantitativ n acest domeniu. Concentraia probei de analizat se poate calcula prin metoda grafic sau metoda matematic. Metoda grafic: se traseaz curba etalon, reprezentnd pe abcis concentraia, iar pe ordonat extincia i cunoscndu-se extincia probei necunoscute se poate calcula concentraia. Metoda matematic: se calculeaz factorul de pant pentru fiecare eprubet din scara etalon dup relaia: F p= C / E n care: C = concentraia n g. E = extincia n nm. Apoi se calculeaz factorul de pant mediu ca media artimetic a factorilor de pant din scar5a etalon, iar concentraia probei necunoscute cx este dat de relaia: Cx=Fp x Ex n care : Fp= factorul de pant mediu; Ex= extinc ia probei de analizat

87

Determinarea spectrelor de absorbie n U.V. (200-00nm) i I.R. (800-106 nm) constituie o cale rapid de depistare i chiar dozare a majoritii toxicilor organici nevolatili, fie singuri, fie n amestec. La determinrile n U.V., pe lng alura spectrului punctele de absorbie maxim i minim- are importan analitic i coeficientul de extincie specific, E(1%, 1 cm); trebuie de asemenea respectate condiiile de pH, solvent, concentraie, temperatur etc. Spectrofotometria n I.R. poate fi practicat la determinarea substanelor solide, lichide sau gazoase. Substanele solide sunt incluse n discuri de halogenuri alcaline; se pulverizeaz ntr-un mojarde agat sau ntr-un vibrator cu bile, 1 mg substan de cercetat i 250 mg halogenur, apoi se comprim sub form de disc. Includerea se poate face n ulei de parafin sau hidrocarburi halogenate. Substanele lichide sau solvite n solveni (cloroform,sulfur de carbon, teraclour de carbon) sun aplicate sub form de film pe materialul transparent fixat n faa aparatului. Substanele gazoase sun determinate fie direct n spectrofotometrul n I.R, dup o prealabil separare prin gazocromatografie. Cromatografia Dintre diferite forme de cromatografie- pe hrtie, pe coloan, n strat subire, n form gazoas-cromatografie pe stat subire (CSS) este deosebit de util prin rapiditatea,sensibilitatea, capacitatea de separare a componentelor dintr-un amestec. Se folosesc diferite suporturi. n funcie de grupa de substane de analizat se utilizeaz diferite amastecuri de solveni pentru migrare, care asigur obinerea unor Rf ct mai difereniate. Pentru o mai bun separare a compuilor apropiai structural, se recomand uneori C.S.S. bidimensional. Relevarea (identificarea componentelor izolate) se realizeaz prin examinarea plcii n lumin U.V. i/sau prin pulverizarea cu diferii reactivi, indicai pentru fiecare substan sau grupe de substane. Gazcromatografia este o metod aplicabil n special pentru separarea amestecurilor i depistarea ulterioar prin detectarea conductibilitii termice, detectarea ionizrii (n flacr, captur de electroni, ionizare e argon). Metoda are o mare sensibilitate i specificitate, ns necesit o aparatur complex. Teste biologice Identificarea unor substane, n special a celor active n concentraii de ordinul microgramelor, dificil i chiar imposibil prin metode uzuale, se realizeaz cu ajutorul testelor fiziologice. n acest scop, reziduul de la evaporarea solventului este administrat la animalele sau organe izolate, urmrindu-se efectele fiziologice caracteristice (midreaz, convulsii etc.) Otrvirea cu metalele grele Oamenii pot veni n contact cu metalele grele n munca industrial, industria farmaceutic sau agricultur. Copiii pot fi otrviti, jucandu-se cu solul contaminat. Intoxicaia cu plumb la aduli a fost descoperit la utilizarea glazurii pe baz de plumb de pe vasele de ceramic
88

folosite pentru alimente. Exist i contaminarea cu remedii pe baza de plante. Arsenul i taliul au fost amestecate cu alimente sau buturi pentru sinucidere sau pentru a-i otrvi pe alii. Urmtoarele nou elemente sunt toxice: aluminiu, antimoniu, arseniu, bismut, cadmiu, plumb, mercur, nichel, staniu. Pentru determinarea concentraiei lor se poate folosi firul de pr deoarece acesta acumuleaz metalele grele. Toxicitatea metalelor grele sau otrvirea apare atunci cnd organismul acumuleaz o cantitate excesiv dintr-un metal greu, cum ar fi mercur, plumb, arsen, cadmiu, nichel sau aluminiu, expunnd astfel individul mbolnvire grav sau moarte. Aceste metale grele nu joac n corpul uman niciun rol biologic cunoscut, spre deosebire de unele microelemente, cum ar fi seleniu, care este un antioxidant eficient, de fier, care este necesar celulelor sanguine sau de cupru, care este o parte integrant a multor enzime. Din moment ce aceste metale nu sunt utile organismului, i pentru c organismul are posibilitatea de a le stoca, aceste metale grele se pot acumula n esuturi n timp si pot provoca probleme grave de sntate. Dac apar simptome de otrvire cu metale grele, trebuie testat corpul cu metode analitice cum ar fi prin microanaliz colorimetric sau prin spectrofotometrie de absorbie atomica. In cazul determinrii unui anumit grad de toxicitate, se recurge la o ndeprtare a metalului greu prin tratament cu chelatori sau se adreseaz unui medic. Totui, o serie de simptome de intoxicare cu plumb sau mercur se pot intalni i n alte circumstane care nu au nimic n comune cu toxicitatea caracteristic metalelor grele. Aceste simptome generale includ o combinaie de oboseal prelungit i confuzie mental sau lips de concentrare. Aadar doar oboseala sau problemele de concentrare mental nu sunt suficiente pentru a suspecta otrvirea cu grele metale. Unele dintre metalele grele toxice, cum ar fi plumb, mercur, aluminiu, sunt suspectate n orice scdere notabil n abilitile motorii i echilibrului. Totui, dac corpul devine mai greoi i dezechilibrat, i aceat stare dureaza un timp, poate fi exclus intoxicaia cu metale grele. Problemele de echilibru i/sau scderea abilitatilor motorii sunt mai rare dect oboseala sau starea de confuzie mental i pot indica alte afeciuni medicale n afar de intoxicaia cu metale grele. De aceea, trebuie depistate simptomele specifice de intoxicaie cu metale grele. Simptomele generale a intoxicaiei cu metalele grele Otrvirea cu metale grele poate pune viaa n pericol, deci este foarte important sa se fac teste medicale dac exist simptome severe de toxicitate cu metale grele, cum ar fi afectarea capacitii de a merge, grea sever sau alte simptome importante. Trebuie gsite metalele prezente n corp i determinat concentraia lor pentru a stabili cel mai bun curs de aciune pentru detoxifierea de metale grele din sistem. Deoarece primele simptome de toxicitate cu metale grele pot fi, de asemenea, simptome ale altor afeciuni, este vital s se fac teste adecvate, timpuriu, nainte ca

89

simptomele s se agraveze. Analiza prului poate arta exact substanele nocive i, apoi, poate fi pus n aplicare detoxifierea adecvata de metale grele. Multi oameni au devenit alertai de toxicitatea mercurului. Ins i argintul coloidal este toxic, dei este un antiseptic i a fost folosit inca din antichitate pentru a inhiba bacteriile din apa de but. n cazul n care otrvete germenii, va otrvi i omul. Fierul formeaz cei mai distructivi radicali liberi i este astfel este foarte dunator pentru via. Deoarece toate metalele sunt toxice, corpurile noastre necesit mecanisme speciale de transport i manipulare pentru a le mpiedica s ne otrveasc. Acest lucru se aplic i la mineralele eseniale, cum ar fi fierul, zincul i cromul sau neeseniale i metaloizi, cum ar fi cadmiul i compuii cu arsen. Intoxicaia cu metale grele Intoxicatia cu metale grele reprezint acumularea toxic de metale grele n esuturile moi ale corpului. Cel mai frecvent implicate n intoxicaii accidentale i otrviri sunt plumbul, mercurul, arsenul i cadmiul. Mai recent, taliul a atras atenia n mass-media drept otrav utilizat n cazuri de crim din anii 90. Unele metale grele, cum ar fi zincul, cuprul, cromul, fierul i manganul, sunt necesare organismului n cantiti mici, dar aceleai elemente pot fi toxice n cantiti mai mari. Metalele grele pot intra n organism prin alimente, ap, aer sau prin absorbie prin piele. Odat ajuns n organism, concureaz i nlocuiesc mineralele esentiale, cum ar fi zinc, cupru, magneziu i calciu, i interfer cu funciile organelor. O form de otrvire cu mercur, frecvent n Statele Unite, este auto-injectarea mercurului sub piele. Unii boxeri injecteaz ei nii mercur, n credina c le crte masa muscular. Mercurul metalic, de asemenea, este utilizat n medicina popular sau n ritualuri religioase n diferite culturi. Aceste practici cresc riscul de otrvire cu mercur a copiilor din aceste grupuri etnice sau subculturi. Cauze i simptome Simptomele variaz, n funcie de natura i cantitatea de metale grele ingerate. Pacienii se pot plnge de grea, vrsturi, diaree, dureri de stomac, dureri de cap, transpiraii i un gust metalic n gur. n funcie de metal, pot fi linii albastre-negre n esuturile moi. n cazurile severe, pacienii prezint afeciuni evidente cognitive, motorii i incompetene lingvistice. Expresia nebun la cap vine de la otrvirea cu mercur rspndit n secolul al 17lea in Frana, printre confecionerii de plrii care mbibau pielea de animale ntr-o soluie de azotat de mercur pentru a-i nmuia prul. Diagnostic Intoxicatia cu metale grele poate fi detectat utilizand teste de snge i urin, analize de pr i esuturi, sau raze x. Diagnosticul este adesea trecute cu vederea, cu toate acestea, deoarece multe dintre simptomele precoce de intoxicatii cu metale grele sunt nespecifice. Medicul ar trebui s ia o istorie amnunit a pacientului cu ocuparetiaa pacientului.

90

n copilrie, nivelul de plumb din snge de peste 80 ug/dL indica, n general, intoxicatie cu plumb, cu toate acestea, nivelurile semnificativ mai reduse (> 30 ug / dl) pot provoca retardare mentala si alte probleme cognitive si comportamentale la copiii afectai. Centrele pentru Controlul si Prevenirea Bolilor consider c un nivel de plumb din sange de 10 ug / dl sau mai mare la copii este un motiv de ngrijorare. La aduli, simptomele otrvirii cu plumb, de obicei, sunt observate atunci cand nivelul de plumb din snge depeste 80 ug / dl pentru un numr de sptmni. Nivelul de mercur in sange nu trebuie s depeasc 3.6 ug / dL, in timp ce nivelul din urina nu trebuie s depeasc 15 ug / dl. Simptomele de otrvire cu mercur pot fi vzute atunci cnd nivelul de mercur depete 20 ug / dl n snge i de 60 ug / dL n urin. Nivelul de mercur in par poate fi folosite pentru a masura gradul de severitate al expunerii cronice la mercur. Deoarece arsenul este rapid eliminat din snge, nivelul de arsen din snge nu poate fi foarte util n diagnostic. Arsenul n urin (msurat ntr-o colecie de 24 de ore urmat de 48 de ore fara a manca fructe de mare) pot depi 50 ug / dl la persoanele cu otravirea cu arsen. Daca se suspecteaza o intoxicaiei acut cu arsen sau taliu, o analiza de raze x poate dezvlui aceste substane la nivelul abdomenului (deoarece ambele metale sunt opace la razele X). Arsenul poate fi, de asemenea, detectate n pr i unghii de luni de zile ca urmare a expunerii. Toxicitatea cadmiului este n general, indicata atunci cand nivelul creatininei din urin depete 10 ug / dl si nivelurile sanguine depesc 5 ug/dl. Intoxicaia cu taliu cauzeaza adesea caderea parului (alopecie), amoreal, i o senzaie de arsur la nivelul pielii, precum i grea, vrsturi i ameeli. 15-20 mg de taliu per kilogram de greutate corporal este fatala la om, cu toate acestea, cantitati mici pot provoca leziuni severe la nivelul sistemului nervos. Tratament Atunci cnd este suspectata intoxicatia cu metale grele, este important s se nceap un tratament ct mai curnd posibil pentru a minimiza daunele pe termen lung a sistemului nervos al pacientului si ale tractului digestiv. Intoxicatia cu metale grele este considerat o urgen medical, iar pacientul ar trebui s fie luat ntr-o camer de spital de urgenta. Tratamentul pentru cele mai multe intoxicatii cu metale grele este tratament chelator. Un agent de chelare specific metalului n cauz este administrat fie oral, intramuscular, sau intravenos. Cei mai frecventi trei ageni de chelare sunt edetat disodic de calciu, dimercaprol (BAL), i penicilamin. Agentul de chelare nconjoar i se leag de metal in tesuturile organismului, formnd un complex, acest complex este apoi eliberat din esut s cltoreasc n fluxul sanguin. Complexul este filtrat din sange prin rinichi i excretat n urin. Acest proces poate fi de lung durat i dureros, i de obicei necesita spitalizare. Tratamentului de chelare este eficace in tratarea intoxicaiilor cu plumb, mercur i arsen, dar nu este util n tratarea otrvirii cu cadmiu. Pn n prezent, nici un tratament a fost dovedit eficient pentru otravirea cu
91

cadmiu. Otrvirea cu taliu este tratat cu o combinatie de albastru de Prusia (hexacianoferat de potasiu feric) i un diuretic, deoarece aproximativ 35% din aceasta se excret n urin, cu toate acestea, n cazul n care tratamentul nu este nceput n termen de 72 de ore de la otrvire, leziunea sistemului nervos a pacientului poate fi permanent. n cazurile ingestiei acute de mercur, arsen sau taliu, pot fi induse vrsturi. Crbunele activat poate fi administrat n cazuri de intoxicaii cu taliu. Splarea stomacului (lavaj gastric) poate fi, de asemenea, util. Pacientul poate solicita, de asemenea tratament, cum ar fi lichide intravenoase pentru complicatii ale otravirii, precum oc, anemie, si insuficienta renala. Pacienii care au luat arsen, taliu, sau mercur ntr-o tentativ de sinucidere vor fi vzuti de un psihiatru, ca parte a tratamentului de urgen. Prognostic Procesul de chelare poate ntrerupe doar efectele ce pot apare n continuare a otrvirii, el nu poate inversa leziunile neurologice deja suferite. Prevenirea Deoarece arsenul i taliul au fost utilizate n mod obinuit n otrvuri pentru obolani i insecte la un moment dat, multe ri au ncercat s reduc rata de intoxicaii accidentale prin interzicerea utilizrii de metale grele n produsele de control a duntorilor. Taliul a fost interzis n Statele Unite, ca otrav pentru roztoare n 1984. Ca rezultat, aproape toate cazurile recente de otrvire cu arsen i taliului n Statele Unite ale Americii au fost n mod deliberat, mai degrab dect accidental. Deoarece expunerea la metale grele este de multe ori un risc profesional, i ar trebui s fie furnizate i purtat la locul de munc mbrcminte de protecie si protectie respiratorie. mbrcmintea de protecie ar trebui s fie apoi lasata la locul de munc i sa nu fie purtate acas, n cazul n care ar putea transporta praf toxic pentru membrii familiei. Industriile sunt ndemnate s reduc sau s o nlocuiasc metale grele n procesele lor ori de cte ori este posibil. Expunerea la surse de plumb din mediu, inclusiv vopsele pe baz de plumb, programe sanitare, de evacuare de vehicule, i a solului contaminat, ar trebui s fie reduse sau eliminate. Metale grele i cancerul Metalele pot deteriora ADN-ul direct i indirect, i asta nseamn un risc crescut de cancer (noi numim acest lucru genotoxicitate). Exist, de asemenea, ci non-genotoxice posibile, din cauza iritaiei sau imuno-toxicitate. Destul de sigur, un numr de metale sunt cunoscute a fi cancerigene. Acestea sunt: arsenul i compui ai arsenului; beriliu i compui ai beriliului; cadmiu i compui de cadmiului; Compui de nichel i crom hexavalent. inta uzual sunt plmnii, dei arsenul are o asociaie unica, cu cancerul de piele care a fost recunoscut de muli ani. Este un fapt c implanturi metalice n organism (ca, de exemplu, n fixarea osului sau plcilor) pot fi asociate cu cancerele adiacente, cauzate de iritare a esuturilor. Regretatul
92

Patrick Stortebecker la Institutul Karolinska din Stockholm, de asemenea, a subliniat i frecvena cu care cancerul la maxilar a fost gasit in asociere cu umpluturi amalgam de metal. Asta este deranjant, deoarece acest tip special de "proteze" tinde s fie foarte lung i foarte frecvent, ntr-adevr. O dezvoltare major n stomatologie este implantul de titan, pentru a inlocui dintii pierduti. Dar este un act de credin s presupunem c titanul este inert. Alte metale toxice Prezena de metale toxice din sistemul nostru este foarte importanta pentru c ele sunt capabile de a provoca probleme grave de sntate pentru ca interfera cu functionarea biologica normala. Dei acestea pot fi gsite n concentraii mari n organism, o serie dintre aceste metale grele (aluminiu, beriliu, cadmiu, plumb i mercur) nu au nici o funcie biologic cunoscuta. Altele (arsen, cupru, fier si nichel) sunt considerate a fi eseniale in concentratii mici, dar sunt toxice la concentratii ridicate. n general vorbind, metale grele perturba functiile metabolice n dou moduri de baz: n primul rnd, ele se acumuleaza si, prin urmare, perturba functia organelor vitale si glandelor, cum ar fi inima, creier, rinichi, oase, ficat, etc. n al doilea rnd, ele inlocuiesc mineralele vitale nutriionale de unde acestea ar trebui s fie n organism, pentru a oferi funcia biologic. De exemplu, enzimele sunt catalizatori practic pentru orice reacie biochimic, n toate procesele vieii pentru sustinerea metabolismului. Dar, n locul calciului din enzim, poate fi plumb sau cadmiu. Metalele toxice nu pot ndeplini acelai rol ca mineralele nutritive, prin urmare, prezena lor devine extrem de perturbatoare pentru activitatea enzimei. Din cauza impactului lor la un astfel de nivel fundamental, metalele grele pot fi factori de cauzalitate n orice problem de sntate. n cazul n care locul de munc sau a unor circumstane de via v expunei la metale grele, v-ar face bine sa reduceti sau sa eliminati expunerea ct mai mult posibil. Fii contieni de faptul c exist multe modaliti ca aceste toxine sa poata fi absorbite n corpul dumneavoastr - prin produse alimentare i buturi, expunerea pielii, sau prin aerul pe care il respirati. Deci, ori de cte ori este posibil, purtai mnui, utilizeazati aparate de protecie pentru respiraie, i asigurai-v c obineti o ventilatie de aer proaspt. Surse de metale grele Prezena de metale toxice din sistemul nostru este foarte importanta pentru c ele sunt capabile de a provoca probleme grave de sntate pentru ca interfera cu functionarea biologica normala. Dei acestea pot fi gsite n concentraii mari n organism, o serie dintre aceste metale grele (aluminiu, beriliu, cadmiu, plumb i mercur) nu au nici o funcie biologic cunoscuta. Altele (arsen, cupru, fier si nichel) sunt considerate a fi eseniale in concentratii mici, dar sunt toxice la concentratii ridicate. n general vorbind, metale grele perturba functiile metabolice n dou moduri de baz: n primul rnd, ele se acumuleaza si, prin
93

urmare, perturba functia organelor vitale si glandelor, cum ar fi inima, creier, rinichi, oase, ficat, etc. n al doilea rnd, ele inlocuiesc mineralele vitale nutriionale de unde acestea ar trebui s fie n organism, pentru a oferi funcia biologic. De exemplu, enzimele sunt catalizatori practic pentru orice reacie biochimic, n toate procesele vieii pentru sustinerea metabolismului. Dar, n locul calciului din enzim, poate fi plumb sau cadmiu. Metalele toxice nu pot ndeplini acelai rol ca mineralele nutritive, prin urmare, prezena lor devine extrem de perturbatoare pentru activitatea enzimei. n cazul n care locul de munc sau a unor circumstane de via v expunei la metale grele, v-ar face bine sa reduceti sau sa eliminati expunerea ct mai mult posibil. Fii contieni de faptul c exist multe modaliti ca aceste toxine sa poata fi absorbite n corpul dumneavoastr - prin produse alimentare i buturi, expunerea pielii, sau prin aerul pe care il respirati. Deci, ori de cte ori este posibil, purtai mnui, utilizeazati aparate de protecie pentru respiraie, i asigurai-v c obineti o ventilatie de aer proaspt. Aluminiu. (cuvinte cheie ce denot rolul aluminiului: alaun, folie de aluminiu, hrana pentru animale, antiacide, aspirina, auto, praf de copt, bere, fin albita, cutii de conserve, ceramica, brnz, filtre de igar, aditivi de culoare, materiale de constructii, vase, cosmetice, amalgamele dentare, deodorante, ap potabil, ageni de uscare, praf, cabluri izolate, compui medicamentosi, produse lactate, spray nazal, pesticide, poluare, sare, apa de la robinet, fumul de tutun, pasta de dinti, apa tratat, praf de vanilie. Cu alte cuvinte este un metal omniprezent.. Efecte: ALS, boala Alzheimer, anemia, pierderea poftei de mncare, probleme de comportament, carii, raceli, colita, confuzie, constipaie, demen, gur uscat, piele uscat, pierderea de energie, transpiratie excesiva, flatulen, dureri de cap, arsuri la stomac, hiperactivitate, inhibarea sistemelor enzimatice, disfunctii renale, reducerea functiei imunitara, dizabilitati de invatare, spasme musculare la picioare, disfuncie hepatic, pierderi de memorie, tulburri neuromusculare, amoreal, osteoporoza, paralizie, boala Parkinson, ulcer peptic, psihoz, reducerea activitatii intestinale, senilitate, probleme ale pielii, dureri de splin, dureri de stomac i dureri musculare slabe. Arsen: materialele de constructii tratate la foc cu arsen, arderea crbunelui, spray-uri de insecte, pesticide, soluri (bogate in arsen), fructe de mare din apele de coast, n special scoici, stridii i crevei. Efecte: Dureri abdominale, anorexie, unghii casante, diaree, grea, vrsturi, anemie cronica, senzaie de arsur n gur / esofag / stomac / intestin, confuzie, convulsii, dermatit, somnolen, inhibarea enzimelor, miros de usturoi a respiratiei / scaun, cderea prului, dureri de cap , hiper-pigmentare a pielii i a unghiilor, risc crescut de cancer de ficat / pulmonar / de piele, febr sczuta, mucoase n nas i gt, dureri musculare / spasme / nervozitate, slbiciune, infecii ale tractului respirator, dificultate de nghiire, gust dulce metalic, strngere de gt. Beriliu arderea crbunelui, in fabricaie, produse de uz casnic, praf industrial.

94

Efecte: tulburri ale metabolismului calciului i vitaminei D, epuizarea magneziului, cancer pulmonar, infecii pulmonare, rahitism, disfuncie de organe vitale. Cadmiu: contaminani industriali din aer, baterii, bomboane, ceramica, fumul de tigara, cola, intoxicaie congenitala, rafinrii de cupru, aliaje de cupru, aliaje dentare, ap potabil, galvanizare, ngrminte, produse alimentare din sol contaminat, fungicide, incinerarea de anvelope / cauciuc / plastic, cafea instant, acoperisuri de fier, rinichi, ficat, marijuana, carne procesata, lapte evaporat, ulei de motor, stridii, vopsea, pesticide, tevi zincate, alimentele procesate, cereale rafinate / cereale din fin, cauciuc, covor suport din cauciuc, produse de mare (cod, eglefin, stridii, ton), canalizare, argint rafinat (lustruit), topitorii, apa moale, suduri (inclusiv n cutii de alimente), tutun, masina ambulanta de bauturi racoritoare, unelte, lmpi cu vapori, ap (ora, dedurizat, bine), metal de sudur. Efecte: alcoolism, alopecie, anemie, artrita (osteo i reumatoid), boal osoas, dureri osoase n mijlocul de oase, cancer, boli cardiovasculare, carii, hemoragie cerebral, ciroza, diabet zaharat, tulburri digestive, emfizem, inima marita, simptome asemntoare gripei, insuficien de cretere, dureri de cap, colesterol ridicat, comportament hiperkinetic, hipertensiune, hipoglicemie, impotenta, inflamare, infertilitate, boli de rinichi, tulburri de nvare, leziuni hepatice, boli pulmonare, migrene, leziuni ale nervilor din celule, osteoporoza, disfuncii de prostata, tulburri de reproducere, schizofrenie. Cadmiul i compuii si (oxid, clorur, sulfit sau sulfur de cadmiu) determin apariia de sarcoame locale la obolani. Expunerile profesionale la cadmiu (mai ales oxidul de cadmiu) cresc riscul apariiei cancerului de prostat la om. Cupru: pastile pentru controlul naterilor, intoxicaii congenitale, vase de cupru, DIU cu cupru, evi de cupru, aliaje dentare, fungicide, maini de ghea, emisiile industriale, insecticide, piscine, ap, sudri, avocado, bere, fin de oase, ciocolata, ulei de porumb, crabi, gelatin, cereale, carne de miel, ficat, homar, margarina, lapte, ciuperci, nuci, carne de organe, stridii, biban, seminte, crustacee, soia, germeni de gru, drojdie de bere Efecte: acnee, insuficien suprarenal, alergii, alopecie, anemie, anorexie, anxietate, artrit (osteo & reumatoid), autism, cancer, frisoane, fibroza chistica, depresie, diabet, tulburari digestive, gur uscat, disinsulinism, dominarea estrogenului, oboseal, temeri, fracturi, ciuperc, atac de cord, hipertensiune arterial, nivel ridicat de colesterol, boala Hodgkin, hiperactivitate, hipertensiune, hipertiroidism, acid sczut clorhidric, hipoglicemie, infecii, inflamaii, insomnie, pierderea de fier, icter, tulburri renale, scderea libidoului, limfom, boal mintal, migrene, modificri ale dispoziiei, scleroz multipl, infarct miocardic, grea, nervozitate, osteoporoza, disfunctii pancreatice, atacuri de panic, paranoia, fobii, PMS, schizofrenie, senilitate, disfuncii sexuale, senzaie de Spacey, balbaiala, carii, accident vascular cerebral, caderea dintilor , toxemia de sarcin, infecii ale tractului urinar, infecii cu fungi.

95

Fier:ap potabil, vase de fier, evi de fier, sudura,. alimente: melasa, fina de oase, tre, arpagic, scoici, inima, rinichi, legume cu frunze, legume, ficat, carne, melas, nuci, carne de organe, stridii, patrunjel, vin rou, alimentele rafinate, crustacee, soia, germeni de grau , cereale integrale. Efecte: amenoree, furie, artrit reumatoid, malformaii congenitale, sngerarea gingiilor, cancer, constipaie, diabet, ameeli, probleme emoionale, oboseal, dureri de cap, dureri de inim, insuficien cardiac, hepatit, hipertensiune arterial, ostilitate, hiperactivitate, infecii, insomnie, iritabilitate, dureri articulare, boli hepatice, pierderea de greutate, probleme mentale, gust metalic n gur, miastenia gravis, grea, dureri ale pancreasului, boala Parkinson, mbtrnirea prematur, schizofrenie, scorbut, dificulti de respiraie, ncpnare. Plumb: frasin, gaze de esapament, baterie de fabricaie, fin de oase, conserve din fructe i suc, baterii auto, fumul de tigar, arderea crbunelui, cerneluri colorate, intoxicaii congenitale, cosmetice, tacmuri, galvanizare, praf de uz casnic, din producia sticlei, vopsele de pr, emisiile industriale, evi de plumb, geamuri de faian ceramic lustruite cu plumb, ficat, rimel, metal lustruit, lapte, ziare, carne de organe, vopsea, creioane, pesticide, produse aproape de drumuri, chituri, apa de ploaie, pvc containere, rafinrii, topitorii, ninsoare, cutii de conserve cu plumb de etanare sau lipit (cum ar fi sucuri, legume), tutun, past de dini, jucrii, ap, vin. Efecte: dureri abdominale, insuficien suprarenal, alergii, anemie, anorexie, anxietate, artrit (reumatoid i osteo), deficitul de atenie, autism, dureri de spate, tulburri de comportament, orbire, boli cardiovasculare, distrugerea cartilajului, pierderea coordonrii, pierderea de concentrare, constipaie , convulsii, surditate, depresie, dislexie, instabilitate emoional, encefalit, epilepsie, oboseala, gut, halucinaii, dureri de cap, ostilitate, hiperactivitate, hipertensiune arterial, hipotiroidie, impoten, supresia sistemului imunitar, scdere de IQ, indigestie, infertilitate, insomnie, iritabilitate, dureri articulare, tulburri renale, dificulti de nvare, disfuncie hepatic, pierderi de memorie (pe termen lung), probleme menstruale, modificri ale dispoziiei, dureri musculare, slbiciune muscular, distrofie muscular, scleroz multipl, mielopatie (patologia mduvii spinrii), nefrit, grea, comaruri, senzaie de amoreal, boala Parkinson, neuropatii periferice, psihoz, disfuncie psihomotorie, disfuncie renal, nelinite, retard, schizofrenie, convulsii, sterilitate, nscui mori, pentru sugari sindrom de moarte brusc, furnicturi, carii dentare, vertij, scdere n greutate neintenionat. Mercur: adezivi, filtre de aer conditionat, antiseptice, fabricarea bateriilor, pudre de corp, termometre sparte, arderea de ziare i materiale de construcie, loiuni calomel, cereale, intoxicaii congenitale, cosmetice, amalgamele dentare, diuretice, emolieni pentru esturi, fetru, cear de podea, fungicide, germicides, cereale, deeuri industriale, insecticide, laxative, cherestea, fabricarea hrtiei i a clorului, medicamente, mercurochrome, vopsele, produse din
96

hrtie, pesticide, fotogravura, ap poluat, unguent pentru psoriazis, produse de mare (n special tonul i petele-spad), eliminare prin canalizare, creme pentru iluminat pielea, soluie pentru lentile de contact moi, supozitoare, tbcirea pielii, tatuajul, apa (contaminat), conservarea lemnului. Efecte: disfuncia suprarenalelor, alergie, alopecie, anorexie, anxietate, malformaii congenitale, inroire, leziuni cerebrale, cataract, paralizie cerebral, coordonare srac / micri sacadate, surditate, depresie, dermatit, descurajare, ameeli, somnolen, eczeme, tulburri emoionale, exces de saliv, oboseal, sngerare i durere, dureri de cap (tip band), pierderea auzului, hiperactivitate, hipotiroidism, uitare, disfuncii ale sistemului imunitar, insomnie, iritabilitate, dureri articulare, leziuni renale, pierderea auto-controlului, pierderi de memorie, retard mintal, gust metalic, migrene, nervozitate, degenerarea fibrelor nervoase, amoreal, dureri la nivelul membrelor, erupii cutanate, schizofrenie, retinit, timiditate, tulburri de vorbire, tendine sinucigae, furnicturi, tremurturi (pleoape, buze, limb, degete, extremiti), pierderea vederii, slbiciune. Nichel: unt, ngrminte, prelucrarea produselor alimentare, arderea uleiului de combustibil, grsimi i uleiuri hidrogenate, imitaii de fric, deeuri industriale, varec, margarin, testarea dispozitivelor nucleare, stridii, vase din oel inoxidabil, ceai, fumul de tutun, semine i cereale nerafinate, scurtarea legumelor. Efecte: anorexie, disfuncie renal, apatie, perturbarea metabolismului hormonilor i cel lipidic febr, hemoragii, dureri de cap, atac de cord, cancer intestinal, scderea tensiunii arteriale, tremurturi musculare, grea, cancer oral, probleme ale pielii, vrsturi. Nichelul i compuii si (oxid, carbonat) induc sarcoame la oarece, obolan i hamster. Protecia prin alte metale: Prezena unui metal secund poate de fapt s protejeze de toxicitate. Astfel, de exemplu, magneziu n studii pe animale poate preveni toxicitatea cadmiului, care induce tumori testiculare. Zincul blocheaz cancerul pulmonar cauzat de inhalarea continu de cadmiu. Att magneziu ct i manganul au fost eficiente n prevenirea tumorilor formate la locul de injectare cu nichel la obolani. De fapt, magneziu are o mare varietate de efecte benefice mpotriva factorilor de risc de carcinogenez de metale. Avem un alt motiv c magneziul este unul dintre cele mai importante elemente nutritive i de sntate. Se menioneaz c seleniul este un protecor vital mpotriva mercurului i are, de asemenea, un puternic efect anti-cancer. n cazul n care consumul zilnic este de 100 de micrograme sau mai mult, riscul de cancer scade dramatic din toate cauzele. Chelatarea Chelatorii de tipul DMPS, DMSA, KELMER i EDTA pot lega metalele grele toxice. n cazul n care situaia este grav, de exemplu, suprancrcarea cu plumb sau cupru, se administreaz i.v. acid etildietilamino-tetraacetic (EDTA), ntr-o serie de infuzii la 3 ore interval. Din pcate, acest tratament este inadecvat pentru toxicitatea dat de mercur. Exist trei strategii eficiente pentru mercur, fiecare cu argumente pro i contra: 6 - 10 perfuzii i.v. din
97

DMPS, 3 mgms pe kg de greutate corporal. Acestea necesit experien calificat, dar fcut n mod corespunztor i la doza corect, nu au practic nici un efect secundar. Riscul teoretic este faptul c DMPS traverseaz bariera hemato-encefalic i poate duce mercur n esuturi neurologice, n cazul cel mai nedorit. Efectele secundare pot fi neplcute i acest lucru pare a fi metoda cea mai puin recomandabil. DMSA oral, 30 mg per kg greutate corporal. Durata depinde de rspuns, dar n aproximativ de 6 - 10 sptmni. Efectele secundare pot fi neplcute, dar pot fi ameliorate prin reducerea dozei. n general, copiii tolereaz mult mai bine decat adultii DMSA. Exist controverse c dac EDTA elimin mercurul. Pentru tot felul de motive tiinifice, care au de a face cu valena i ncrctura electric, acesta nu ar trebui s funcioneze bine. Dar Dr. Gary Gordon cere: prin urin recent i testarea esuturilor, n care se poate observa c fost excretat dup regimul de chelare oral (care include, desigur, mult mai mult dect simpla EDTA). Terapia auto-administrat nu este recomandat. Dar Chlorella este un atractor mare de metale grele, este sigur i din belug, mai puin usturoiul i coriandru. O dat ce sursa de contaminare este eliminat, dac corpul are o bun capacitate de detoxifiere, metale grele vor disprea treptat i lent din esuturi, printr-un proces numit leiere sau, mai exact, de epurare. Otrvirea accidental De pild, otrvirea accidental cu mercur poate fi provocat prin: - Consumul de ap contaminat - Consumul de pete contaminat cu mercur - Extragere de mercur din plombe dentare montate prost. - De la vaccinurile ce conin timerosal.

Toxicitatea de metale grele din ap potabil contaminat: A fost estimat c americanii de rnd sunt expui la ap de robinetul cu coninut de metale grele la niveluri care depesc limita de siguran superioar. Crima prin otrvire cu metale grele S-au raportat numeroase cazuri de sinucidere prin nghiire de mercur de la termometre. Dureri atroce durau i o sptmn, iar prognosticul era nefavorabil. De asemenea, au fost semnalate crime comise cu ajutorul clorurii mercurice. Toxicitatea mercurului de la vaccinri care conin thimerosal:

Thimerosal structura Aceasta este una dintre problemele cele mai de actualitate de pe toxicitatea mercur. Este unul care ctig teren n mod constant a opiniei publice nc de legtur ntre autism i vaccinrile a fost propusa pentru prima data. Un fapt puin cunoscut nainte de campanii de sensibilizare a
98

opiniei publice a nceput este faptul c conservant, de obicei, adaug la thimerosal vaccinuri contin mercur. n 1999, la Centrul pentru Controlul si Prevenirea Bolilor (CDC) a solicitat pentru eliminarea mercurului din vaccinuri. Paradoxal, CDC continu s se recomande pojarului, oreionului i rubeolei. Copiii mici sunt deosebit de sensibile la mercur toxicitate i statisticile au artat c de la introducerea de thimerosal n vaccinuri n 1990 a existat o cretere de 10 ori a incidentei autismului. Muli prini raport, de asemenea, debutul de comportament autist la copiii lor, n termen de zile de la vaccinare. Surprinzator, 40% dintre prinii copiilor cu autism se spune s credem c vaccinurile cauza bolii. Efectele de mercur asupra sistemului nervos central este bine documentat. Expunerii excesive prenatale duce la funciile ntrziate de dezvoltare, inclusiv mersul pe jos intarziata, dezvoltarea vorbirii amnat i afectarea auzului Thimerosal conservant este cel mai frecvent utilizat n vaccinuri i biologice care sunt comercializate in Statele Unite. Thimerosal este utilizat pentru a ajuta la prevenirea unui vaccin de la rasfat, pentru inactivarea bacteriilor folosite pentru a formula mai multe vaccinuri, i pentru a preveni contaminarea bacteriana a produsului final. Mai multe dintre vaccinuri recomandate de rutin pentru copii n Statele Unite conin thimerosal. Cu toate acestea, rapoartele au aparut leaga thimerosal la intoxicatii cu mercur la sugari, cauznd adesea autism. Simptomele de otrvire cu mercur: dureri abdominale, gastroenterit, grea, salivaie excesiv, slaba coordonare, pierderea poftei de mncare i pierderea n greutate, anurie (producia de urin se oprete), i nefrita (boala de rinichi). Pe termen lung, expunerea la substante toxice poate duce, de asemenea, la infertilitate la barbati si femei. Toxicitatea afecteaz, de asemenea, rezultatul sarcinii i, de asemenea, a fost legat cu boli cardiovasculare. ntr-un studiu de peste 2000 de oameni, ridicat de mercur coninut de pr a fost legat cu un risc crescut pentru boli de inima si accident vascular cerebral. n tineri, mercur toxicitate, de obicei, duce la dificulti de nvare din copilrie (a se vedea mai sus discuia asupra autismului). Cercetri privind efectul otrvitor al metalelor Plumbul Plumbul este un element care se gsete n mod natural n scoara terestr, utilizat de oameni nc de la nceputurile civilizaiei. Ca urmare a activitilor umane, plumbul a fost larg rspndit n mediu, regsindu-se n aer, ap, sol, plante, animale, alimente i diverse construcii. Otrvirile cu plumb de proporii epidemice au fost raportate pe toat durata mileniului trecut, un exemplu constituind oraul Devon n 1738 prin cidrul contaminat cu Pb. n natur plumbul se gsete mai ales sub form de sulfuri, dar i sub form de carbonai, sulfai i cromai. n zonele rurale necontaminate concentraia plumbului n sol este mai mic de 50 mg/kg. Ca urmare a polurii antropogene concentraia acestuia n sol poate

99

atinge 1000 mg/kg sol. Sursele de contaminare ale solului sunt utilizarea deeurilor ca fertilizani, emisiile industriale i auto. Transferul sol-plant este relativ sczut, iar transferul de la rdcini n alte organe ale plantei este limitat. Concentraia mare de plumb n plante este n majoritatea cazurilor rezultatul contaminrii solului sau prin depunerea de praf pe legumele cu frunze. Nivelul plumbului n apa de but i n apele de adncime n majoritatea rilor europene este sub 20/L. Concentraii mai mari pot fi observate n zone cu ap moale i n cazul utilzrii evilor din plumb. Apa potabil care conine carbonai acizi de calciu i magneziu i sulfai solubilizeaz plumbul cnd este fierbinte sau cnd a stat n evi mai mult timp. Fierberea apei nu va ndeprta plumbul, dar ndeprtarea apei care staioneaz pe evi prin lsarea apei s curg cteva minute nainte de utilizare i utilizarea apei reci pentru but reduce expunerea. Concentraia plumbului n apa mrilor este mai mic dect n apele dulci fiind ntre 0,003-0,4g/L. Plumbul se gsete sub diferite forme n apa marin i apa dulce, iar majoritatea plumbului gsit n peti este legat de proteine. Limita admis n prezent este de 50 g/L ap i va fi progresiv redus la 10 g/L. Alimentele pot fi contaminate cu plumb i n timpul produciei, procesrii i ambalrii. n timpul produciei, n afar de aportul de plumb din mediul poluat (sol, ap, aer), mai ales n zonele industrializate i cu circulaie intens a autovehiculelor, acest metal mai poate ajunge n produsele vegetale prin aplicarea de pesticide pe baz de plumb, cum este arseniatul de plumb. Alte surse de contaminare a alimentelor includ: glazura vaselor ceramice care conine un amestec de bioxid de siliciu i oxizi de plumb, vinul i alcoolul fcut n cas, distilat sau pstrat n vase de plumb, introducerea frauduloas de miniu de plumb (Pb3O4) n boia, de cromat de plumb (PbCrO4) pentru colorarea n galben a untului sau margarinei i de carbonat de plumb (PbCO3) pentru albirea finei. Toxicitatea plumbului .Toxicitatea plumbului depinde de numeroi factori, cum ar fi vrsta, nutriia, starea fiziologic, doza, mrimea particulelor, forma sub care se gsete (organic sau anorganic), calea de ptrundere. Majoritatea animalelor de ferm tolereaz aproximativ 30 mg Pb/kg hran, cu excepia oilor, care se pare c tolereaz doar 10 mg Pb /kg hran. Toxicocinetica Plumbul anorganic poate ptrunde n organism pe cale oral, respiratorie sau dermic. Studiile pe animale au artat c plumbul este bine absorbit pe cale transdermic. Expunerea pe cale respiratorie Plumbul din aerul atmosferic se gsete sub form de aerosoli i particule materiale i poate fi depozitat n tractul respirator atunci cnd aerosolii sunt inspirai. Proporia i modul de depozitare a aerosolilor n tractul respirator sunt determinate de mrimea particulelor, factori dependeni de vrst, care determin modul de respiraie (pe gur sau pe nas), geometria cilor respiratorii i viteza curentului de aer n tractul respirator. Particulele mari care sunt depozitate n
100

regiunile ciliate (regiunile nasofaringiene i traheobronice) pot fi transferate mucociliar n esofag i, apoi, nghiite. Particulele mici care pot fi depozitate n regiunile alveolare pot fi absorbite dup disoluia extracelular sau ingerarea de ctre celulele fagocitare. Expunerea pe cale oral Rata i proporia absorbiei gastrointestinale a plumbului ingerat sunt influenate de starea fiziologic a individului expus i caracterele fizico-chimice ale plumbului ingerat. Absorbia poate fi influenat i de cantitatea de plumb ingerat. Efectul vrstei. Absorbia gastrointestinal a plumbului hidrosolubil pare s fie mai mare la copii dect la aduli. Studiile la copii (ntre 2 sptmni i 8 ani) au indicat c aproximativ 40-50 % din plumbul ingerat este absorbit. La aduli se estimeaz c absorbia compuilor hidrosolubili de plumb variaz ntre 3 i 10%. Efectul flmnzirii. Prezena alimentelor n tractul gastrointestinal scade absorbia plumbului hidrosolubil. La aduli, absorbia acetatului de plumb a fost de aproximativ 63% cnd a fost ingerat de indivizi flmnzi i 3% cnd a fost ingerat cu mncare. Efectul nutriiei. Absorbia plumbului la copii este influenat de statusul nutriional al fierului. Copiii care sunt deficitari n fier au concentraii mai mari de plumb n snge, comparativ cu copiii care nu sunt deficitari, ceea ce sugereaz c deficiena n fier poate determina absorbie crescut de plumb. Acest lucru a fost demonstrat din studiul pe animale. La obolani, deficiena n fier crete absorbia gastrointestinal a plumbului, posibil prin creterea legrii plumbului la proteinele care leag fierul n intestin. Aportul calciului prin raie pare s influeneze i el absorbia plumbului. A fost observat o corelaie invers ntre aportul de calciu i concentraia plumbului n snge la copii, dar i la aduli. n studiile experimentale pe obolani s-a demonstrat depleia crescut a calciului din raie n caren de vitamina D. Distribuia Perioada de njumtire a plumbului n snge este de aproximativ 30 de zile. Plumbul se gsete aproape n exclusivitate n hematii (99%). Cea mai mare parte a plumbului din hematii este legat de proteinele din celul i mai puin de membrana eritrocitar. Aproximativ 40-75% din plumbul din plasm este legat de proteinele plasmatice, dintre care albuminele par s fie principalii liganzi. Plumbul se mai poate lega i de globuline. Plumbul din ser care nu este legat de proteine se gsete mai ales sub form de compleci cu compui sulfhidril cu greutate molecular mic i cu ali liganzi. La aduli, aproximativ 94% din plumb se gsete n oase. La copii acest procent este de doar 73%. Concentraia plumbului din oase crete cu vrsta, ceea ce indic un turnover relativ lent al plumbului n osul adult. Acest depozit mare de plumb n osul adult poate surveni pentru meninerea nivelului sangvin de plumb mult timp dup ce expunerea a ncetat. Plumbul nu este distribuit uniform n oase, ci se acumuleaz n acele regiuni ale osului, n care procesul de calcifiere este mai activ la momentul expunerii. La copii, plumbul este depozitat pe osul la trabecular, iar la aduli, att n osul trabecular, ct i cel cortical. Dei la maturitate majoritatea plumbului din organism este depozitat n oase i dini, plumbul din
101

regiunile corticale ale oaselor este parial labil i este eliberat n fluxul sanguin i esuturile moi prin difuzie i resorbie. Gestaia, alptarea, osteoporoz postmenopauzal determin creterea nivelelor sanguine ale plumbului, ca rezultat al mobilizrii acestuia din depozitele osoase. Metabolizarea Metabolismul plumbului anorganic const n formarea unor compleci cu o mare varietate de liganzi proteici i neproteici. Fiind un cation divalent, capacitatea mare de legare a acestuia la proteinele sulfhidril creeaz interferene cu enzime i proteine structurale. Cea mai cunoscut este interferena cu calea de sintez a hemului i scderea subsecvent a rezervelor de hem din organism sunt unele din principalele cauze ale patologiei determinate de plumb. Cnd nivelul plumbemiei depete 20 de g/dl, activitatea ALAD este inhibat n proporie de 50 %. Totui activitatea ALAD poate fi blocat i n porfirie, ciroz hepatic i alcoolism. n plus nivelele ALAD nu pot fi utilizate pentru diagnosticarea gradului de toxicitate al plumbului, deoarece corelaia dintre plumbemie i ALAD nu este liniar. Inhibiia ALAD previne concentrarea acidului aminolevulinic n profobilinogen, inhibnd ncorporarea fierului n inelul protoporfirinic.

Protofibilinogen Ca o consecin a acestor modificri n activitatea enzimelor se constat anemie i oboseal. n plus, crete nivelul circulator al ALA, ceea ce duce la scderea eliberrii GABA n sistemul nervos central, ceea ce poate explica tulburrile comportamentale observate n intoxicaia cu plumb. Plumbul inhib i 5- pirimidin- nucleotidaza din eritrocite ceea ce determin acumularea de pirimidinnucleotide n eritrocite sau reticulocite i distrucia subsecvent a acestor celule. Plumbul anorganic sau plumbul alchil este activ metabolizat n ficat prin dealchilare oxidativ catalizat de citocromul P450, rezultnd trietil- i trimetil-plumb, metabolii puternic neurotoxici. Eliminarea Indiferent de calea de ptrundere, plumbul absorbit este eliminat n primul rnd prin urin i fecale. Mecanismul eliminrii prin fecale a plumbului absorbit nu este bine neles; totui, cile de eliminare pot include secreia n bil, sucul gastric i saliv, reprezentnd aproximativ o treime din excreia total a plumbului absorbit. Alte ci de eliminare sunt
102

acid aminolevulinic

reprezentate de transpiraie, lapte, pr i unghii. n cazul animalelor, eliminarea prin lapte i ou este mic i devine semnificativ numai la aport mare. Efecte patogene Plumbul este un toxic cumulativ, care produce numeroase efecte toxice, dar n special n sistemul hematopoetic, sistemul nervos i n rinichi. Simptomele iniiale, timpurii ale intoxicaiei acute cu plumb, ntlnite la muncitorii expui profesional sau la indivizi expui la nivele ridicate de plumb, sunt cele gastrointestinale i anume colica de plumb. Aceasta este caracterizat de combinaia urmtoarelor simptome: dureri abdominale, constipaie, crampe, vom, grea, anorexie i scderi n greutate. Efectele hematologice Expunerea la plumb determin anemie microcitar i hipocrom i uoar anemie hemolitic. Aceasta este determinat att de inhibarea sintezei hemului, ct i de scurtarea duratei de via a eritrocitelor. Plumbul interfer cu sinteza hemului prin alterarea activitii dehidrazei acidului delta-aminolevulinic (ALAD) i a ferochelatazei. Ca o consecin a acestor modificri, biosinteza hemului este sczut i activitatea enzimei corespunztoare, deltaaminolevulin sintetaza (ALAS), care este inhibat prin feedback de ctre hem, este ulterior crescut. Rezultatele finale ale acestor modificri n activitatea enzimelor sunt creterea porfirinelor urinare, coproporfirinelor i a acidului delta-aminolevulinic, creterea nivelului sanguin i plasmatic al ALA i creterea protoporfirinelor eritrocitare. Modificrile hematologice asociate plumbului sunt considerate reversibile. Efectul plumbului asupra sistemului nervos. Avnd n vedere posibila expunere nc din stadiul prenatal prin placent i apoi prin lapte sau apa utilizat pentru refacerea laptelui praf, simptomele neurotoxice pot fi observate nc de la vrste mici. Deoarece plumbul afecteaz procesele de dezvoltare nervoas ntreruperea acestor procese poate conduce la alterri permanente ale funciei cerbrale. Una dintre cauzele majore ale efectelor neurotoxice ale plumbului este faptul c este n competiie cu calciul sau mimeaz aciunea acestuia. La concentraii picomolare, plumbul este n competiie cu calciul pentru situsurile de legare din cerebel ale fosfochinazei C. Acest proces afecteaz intrarea n celule a calciului i funcionarea neuronilor, alternd structura mitocondrial, ceea ce duce la inhibarea respiraiei celulare, alterarea reaciilor bazate pe calciu i transmiterea influxului nervos. Aceasta conduce la creterea eliberrii spontane a neurotransmitorilor i inhibarea eliberrii controlate stimulate a acestora. Acest tip de toxicitate afecteaz n principal sistemul nervos n dezvoltare a fetusului, cruia i lipsesc proteinele care leag plumbul din astrogliile mature, care, n mod normal, chelateaz i elimin plumbul. Plumbul este toxic pentru astrocitele imature i interfereaz cu formarea mielinei, ambele procese fiind implicate n formarea barierei hematoencefalice. Cnd aceast barier este lezat, n SNC ptrund proteine moleculare ca albuminele, determinnd edem, presiune intracranial crescut i encefalopatie.
103

Simptomele timpurii ale neurotoxicitii plumbului, att la copii, ct i la aduli, includ iritabilitatea, durerea de cap, perioad de atenie sczut, pierderea memoriei i atenuarea strii cognitive. Pe msur ce expunerea continu, se constat simptome de impulsivitate, inabilitate de a urma anumite direcii, dorin de joac sczut, IQ sczut i atenie sczut, dizabiliti de citire i putere de concentrare la examene sczut. Astfel de simptome au fost constatate la nivele sangvine ale plumbului ntre 10 35 g/dl. Cel mai grav efect la aduli este encefalopatia, care prezint ca simptome iniiale slbiciunea, iritabilitatea, perioad de atenie redus, durerile de cap, tremurul muscular, pierderea memoriei i halucinaii. Aceste stri se pot nruti, ajungndu-se la delir, convulsii, paralizie, com i moarte. Astfel de simptome pot fi ntlnite la concentraii ale plumbului cuprinse ntre 50 300 g/dl. Efecte musculo-scheletice. La persoanele expuse la cantiti mari de plumb, fie profesional, fie ca urmare a consumului de whisky contaminat cu plumb se constat slbiciune muscular, crampe i dureri articulare. ntr-un studiu realizat de Campbell i colab. n 2004 n ceea ce privete expunerea la plumb i densitatea osoas, la copii s-a constatat, contrar ateptrilor, c indivizii cu expunere cumulativ mare au prezentat densitate osoas mai mare dect n expunere mai mic. Autorii studiului au emis ipoteza c plumbul accelereaz maturarea osoas prin inhibarea proteinelor care reduc rata de maturare a condrocitelor n formarea endocondral osoas. Un vrf sczut al densitii minerale osoase atins n faza de adult tnr poate predispune la osteoporoz mai trziu. Studiile realizate pe animale n ceea ce privete expunerea oral la plumb i creterea oaselor i metabolizarea la animale indic faptul c aportul oral de plumb tulbur creterea osoas i remodelarea, fapt indicat de densitatea osoas sczut i coninutul n calciu al osului, scderea volumului trabecular osos, activitatea de resorbie crescut i morfologie alterat a creterii lamelare. S-a mai constatat c plumbul ntrzie mineralizarea dinilor, rezultnd un smal mai puin dur i rat de erupie sczut a dinilor. Efecte renale. Nefrotoxicitatea plumbului este caracterizat prin nefropatii tubulare proximale, glomerulare, scleroze i fibroze interstiiale. La oamenii expui la exces de plumb s-a constatat proteinurie, transport deficitar al anionilor organici i ai glucozei i rat de filtrare glomerular sczut. Expertiza produselor de origine animal Carnea rezultat din sacrificrile de necesitate va fi dat n consum dezosat i dac este corespunztoare organoleptic i bacteriologic, iar coninutul de plumb este de sub 1 mg/kg. Capul i organele se confisc i se prelucreaz tehnic. Laptele se supune examenului toxicologic i, dac se constat depirea limitelor maxim admise, se retrage din consum. Aportul plumbului prin raie i nivele maxime admise Estimri recente ale aportului de plumb bazate pe date din diferite ri europene indic valori cuprinse ntre 0,001-0,008 mg/kg greutate corporal/sptmn pentru aduli i pn la 0,019 mg/kg pentru copii. Contribuia fiecrui tip de aliment la aportul de plumb a fost calculat
104

de autoritile australiene. Dei aceasta pare s nu corespund cu raia european, calculul arat c laptele contribuie cu 16% n raia copiilor, iar carnea cu aproximativ 5-7% din contaminarea raiei adulilor. Limitele admise sunt reglementate de organismele abilitate din fiecare ar. Astfel, pentru aer, EPA (Environmental Protection Agency,SUA) recomand maxim 1,5 g/m3 pentru plumb i compuii si, iar pentru ap 0,015 mg Pb/l. FDA recomand ca aditivii alimentari s nu conin concentraii mai mari de 10 ppm Pb, iar apa de but mbuteliat 0,005 mg/l. Limita permis de expunere profesional este de 0,05 mg/m3. Legislaia naional, n acord cu cea european stabilete ca nivele admise de plumb n diverse produse urmtoarele valori (Tabelul 1) Tabel 1. Nivelurile maxime admise pentru plumb n alimente Produsul Limita maxim admis (mg/kg) Lapte crud, lapte pentru procesare n produse pe 0,02 baz de lapte i lapte tratat termic Lapte praf 0,02 Carne de bovine, ovine, porcine i carne de pasre 0,1 Organe comestibile de bovine, ovine, porcine i 0,5 Pasre Carne de pete 0,3 Crustacee 0,5 Molute bivalve 1,5 Cefalopode 1 Grsimi i uleiuri de origine animal 0,1 Cereale 0,2 Legume 0,1 Varz, legume frunzoase i toate ciupercile 0,3 Cultivate Fructe, exclusiv cele cu boabe i fructe mici 0,1 Fructe cu boabe i fructe mici 0,2 Sucuri de fructe, concentrate de fructe i nectar 0,05 de fructe Vinuri, cidru i vinuri de fructe 0,2

Arsenul Arsenul este dificil de caracterizat n particular ca un singur element deoarece chimia lui este att de complex i sunt muli compui diferii ai arsenului. Arsenul poate fi trivalent sau pentavalent i este larg rspndit n natur. Cei mai comuni compui trivaleni ai arsenului sunt trioxidul de arsen, arsenitul de sodiu i tricloritul de arsen. Compuii anorganici pentavalenti sunt pentaoxidul de arsen, acid arsenic i arsenaii precum arsenatul de plumb sau arsenatul de calciu.
105

Arsenul este ndeosebi transportat n mediu prin ap i prin aer prin intermediul contaminrii industriale i poate varia ntre cteva nanograme i cteva zeci dintr-un microgram pe metru cub. Acesta se leag covalent cu majoritatea nemetalelor (n special cu oxigenul i sulful), dar i cu metalele (de exemplu cu calciul i plumbul). Intoxicaiile cu arsen pot avea urmtoarele posibile surse: 1.Surse naturale: soluri care conin minereuri cu arsen i ape de adncime (n special cele din apropierea zonelor cu activitate geotermal). Arsenul este prezent n toate tipurile de soluri, nivelul mediu fiind de 5-6 mg/kg, acesta putnd ns varia considerabil. Concentraii variabile ale arsenului pot fi ntlnite n ruri, lacuri i apa de but. Valori foarte ridicate au fost gsite n apele de adncime cu activitate termal i cu arsen n roci. Nivelul mediu al arsenului n apele de but i n cele de adncime n Germania este de sub 10 g/l. Concentraiile arsenului n apele marine sunt, n general ntre 1 i 8 g/l. 2. Produse comerciale: conservani ai lemnului, insecticide, erbicide, fungicide, vopsele i pigmeni. 3. Alimente: vin (struguri stropii cu pesticide pe baz de arsen), tutun, peti i fructe de mare (n special bivalve i peti care triesc i se hrnesc cu sediment, alge marine) i produse de origine animal provenite de la animale intoxicate cu arsen. Coninutul de arsen al plantelor este determinat de expunerea la arsen via sol, ap, aer, fertilizani i alte produse chimice, originea geologic a solului i specie, partea din plant i vrsta acesteia. Concentraiile pot diferi, iar plantele care cresc pe terenurile bogate n arsen pot acumula concentraii mult mai mari. Majoritatea produselor vegetale conin mai puin de 0,3 mg/kg i rareori depesc 1 mg/kg substan uscat, n timp ce algele marine pot avea concentraii foarte mari de arsen organic (4050 mg/kg substan uscat). Pe baza datelor limitate existente pn n prezent, s-a estimat c procentul de arsen anorganic este de 75% n carne i produse lactate i 65% n cereale. 4. Procese industriale: purificarea gazelor industriale (ndeprtarea sulfului), arderea combustibililor fosili, arderea lemnului tratat cu conservani pe baz de arsen, producerea de electronice (componente pentru aparate cu microunde, lasere, diode, celule fotoelectrice, semiconductori), sticlrie i ceramic, aliaje cu plumb. 5. Terapie: antiparazitare, medicamente (pentru tratarea leucemiei, psoriazisului i astmului). Unii compui organici ai arsenului (de exemplu acidul arsalanic) au fost utilizai ca i aditivi furajeri pentru controlul unor boli i mbuntirea creterii greutii corporale la porci i psri n concentraii de 100 mg/kg furaj, dar utilizarea lor n Europa a fost interzis, nu ns i n alte ri de pe alte componente. Toxicitatea arsenului Toxicitatea compuilor cu arsen este diferit la mamifere, n funcie de valen, form (anorganic sau organic), starea fizic (gaz, soluie sau pulbere) i factori ca solubilitatea, mrimea particulelor, rata de absorbie i eliminare i prezena impuritilor. Arsenul anorganic este n general mai toxic dect cel organic. Totui studiile pe animale au artat c metil i fenil arsenaii pot produce efecte asupra sntii similare cu cele produse de arsenul anorganic. Toxicitatea arsenului trivalent este de cteva ori mai mare dect a arsenului pentavalent, datorit aportului celular mai mare. Arsenul metalic este considerat n general netoxic, datorit
106

insolubilitii sale n ap i fluidele corpului. Rumegtoarele prezint semne de toxicitate doar la expunere de 200-300 mg arsen anorganic/kg raie. Porcii hrnii cu 100 mg arsen din acid arsalanic/kg raie prezint apetit redus. Ginile outoare i reduc consumul de furaje cu pn la 20% cnd sunt hrnite cu o raie care conine 44 mg arsen din acid 3-nitro-4-fenilarsenic/kg raie. Greutatea oului a fost redus cnd n raie a fost introdus arsenul sub form de trioxid de arsen, 15 mg/kg raie. Efectele toxice la peti dup expunerea prin raie la concentraii de arsenat ntre 32-160 mg/kg raie includ niveluri crescute ale metalotioneinelor hepatice, alterri histopatologice ale ficatului i vezicii urinare i rat redus de cretere. Dimpotriv nu a fost observat nici un efect toxic la petii expui la concentraii de 10 ori mai mari de arsen organic. NOAEL ( No Observed Adverse Effect Level) stabilit pentru populaia uman este de 0,0003 mg/kg greutate corporal/zi. Doza zilnic tolerabil sptmnal pentru arsenul anorganic stabilit este de 0,015 mg/kg greutate corporal/sptmn. Studiile realizate n diferite ri europene au artat c aportul mediu zilnic de arsen prin hran este de aproximativ 0,065 mg arsen total/zi/persoan. Toxicocinetica Aportul oral zilnic de arsen anorganic a fost estimat ntre 1-20 g iar de arsen sub toate formele de 40 g. Dintre alimente carnea, petele, fructele de mare, orezul i ciupercile conin concentraiile cele mai mari de arsen. Petele, fructele de mare i algele conin arsen sub form de arsenobetain i arsenocolin, produse adesea menionate ca pete arsenic. Acest arsen prezint toxicitate redus pentru om i este rapid excretat prin urin. Vinul fcut din struguri stropii cu pesticide pe baz de arsen poate conine cantiti apreciabile de arsen. Compuii arsenului ce ptrund n corp pe cale oral sunt absorbii la nivelul tractului gastrointestinal. Absorbia depinde de forma fizic a compusului, solubilitate, pH-ul gastric, motilitatea gastrointestinal i biotransformrile microbiene din intestin. Absorbia formelor solubile la om variaz ntre 60-90%. Forma arsenului care predomin n aer este cea de trioxid de arsen i n funcie de mrimea particulelor absorbia va avea loc fie pn n tractul respirator inferior fie pn n cile respiratorii superioare unde vor rmne particulele pn vor fi nghiite de clearance-ul mucociliar. Dup absorbia din plmni sau tractul gastrointestinal, arsenul se acumuleaz iniial n ficat, splin, rinichi, plmni i tractul gastrointestinal. Dup 2-4 sptmni dup ce expunerea nceteaz majoritatea arsenului rmas n organism este regsit n esuturile bogate n cheratin ca prul, pielea i unghiile. La om a fost semnalat i transferul placentar. Metabolizarea In vivo au loc reacii de oxido-reducere rezultnd interconversia arsenului pentavalent i trivalent, ngreunnd distincia dintre aceste dou categorii de compui arsenici anorganici. O parte din arsenul trivalent este metilat, mai ales n ficat, la acid metilarsenic i acid dimetilarsenic. Acest proces reprezint principalul mecanism de detoxifiere al organismului deoarece produii care rezult sunt mai uor de excretat i mai puin toxici. La doze mari de
107

arsen ns eficiena acestui proces scade deoarece se ajunge la depirea capacitii de metilare a ficatului iar arsenul ajunge s fie reinut de ctre esuturile moi. Acest lucru poate fi mbuntit i anume prin tratarea cu cantiti mici de arsen pe o perioad lung de timp se mrete eficiena metilrii la aplicarea subsecvent a unei cantiti mari de arsen. Aceasta a fost studiat pe culturi celulare i arat c procesul de metilare este unul inductibil. Arsenul din petele arsenic nu este metabolizat in vivo, ci este rapid excretat nemodificat prin urin. Eliminarea Studiile arat c 6 pn la 9 procente din As administrat oral este eliminat prin fecale, indicnd absorbia aproape complet din tractul gastrointestinal. Excreia arsenului absorbit este n principal prin urin. Viaa biologic a arsenului anorganic ingerat este de aproape 10 ore i 50 pn la 80 procente excretat n aproape 3 zile. Acesta are o predilecie pentru piele i este excretat prin descuamarea pielii i prin transpiraie n special n perioadele de transpiraie abundent. Se concentreaz de asemenea n unghii i pr. Arsenul n unghii produce linii Mee (benzi albe transversale pe unghii) aprnd aproape dup 6 sptmni dup apariia simptomelor toxicitii. Timpul expunerii poate fi estimat prin msurarea distanei de la linie pn la baza unghiei i rata creterii unghiei care este de aproape 0,3 cm pe lun sau 0,1 mm pe zi. Transferul placentar a fost artat la hamsterii injectai intravenos cu doze mari de arsenat de sodiu i studiile nivelelor de arsen din esut la fetui i nou nscui din Japonia arat c totalul cantitii de arsen din ft tinde s creasc n timpul gestaiei indicnd transfer placentar. Biotransformarea Biotransformarea arsenului a fost dificil de studiat datorit problemelor analitice. Compuii arsenului pentavalent sunt redui n vivo la compui mult mai toxici trivaleni. Cu toate acestea ingerarea arsenului trivalent de animalele folosite pentru experimente i de oameni este urmat de excreia unui anumit procentaj din doza administrat ca arsen pentavalent. Efecte patogene Toxicitatea arsenului prezint dou mecanisme prin care afecteaz respiraia celular. Astfel ntr-un prim mecanism arsenul se leag la gruprile sulfhidril blocnd enzimele sulfhidrice. Ca rezultat, sunt inhibate cile oxidrii piruvat i succinat i ciclul acidului tricarboxilic, mpiedicnd gluconeogeneza i reducnd fosforilarea oxidativ. De acest efect este rspunztor arsenul trivalent.

108

Cel de-al doilea mecanism implic substituirea arsenului pentavalent cu fosforul n multe reacii biochimice. nlocuirea anionului stabil de fosfor n fosfat cu anionul arsen pentavalent mai puin stabil duce la hidroliza rapid a legturilor bogate n energie n compui ca ATP. Aceasta duce la pierderea legturilor nalt energetice fosfat, decuplnd fosforilarea oxidativ. Arsenul gazos, spre deosebire de celelalte forme, produce un sindrom hemolitic. Dup inhalare, arsenul se fixeaz pe hematii producnd leziuni celulare-membranare ireversibile. n doze mici, arsenul este un hemolitic puternic, determinnd hemoliz intravascular dependent de doz. n doze mari, arsenul produce citotoxicitate direct multipl. Dup ingerare i absorbie, arsenul produce rni celulelor din sistemul nervos, vaselor de snge, ficatului, rinichilor i altor esuturi. Efecte celulare. Este cunoscut de civa ani faptul c arsenul sub forma compuilor trivaleni reprezint principala form toxic i compuii pentavaleni au un efect foarte mic asupra activitii enzimelor. La expunerea la arsen s-a descoperit c sunt alterate un numr de proteine coninnd grupaea sulfhidril i un numr de sisteme enzimatice. Unele dintre acestea pot fi refcute prin adugare de monotioli cum ar fi glutationul; enzimele care conin dou gripri tiolice pot fi refcute cu ajutorul ditiolilor cum ar fi 2,3-dimercaptopropanol dar nu i monotioli. Arsenul afecteaz enzimele mitocondriale i mpiedic respiraia esuturilor care pare s fie legat de toxicitatea celular a arsenului. Mitocondria acumuleaz arsen i respiraia mediat de NAD este n mod special sensibil la arsen. Mitchell a propus c arsenul inhib funciile legate de energie ale mitocondriei n dou moduri: competiia cu fosfat n timpul fosforilrii oxidative i inhibiia reducerii energetice a NAD. La nivelul tractului gastrointestinal, leziunile produse de arsen determin creterea permeabilitii capilarelor, ducnd la pierderea de fluid i hipotensiune. Inflamarea i necroza progresiv a mucoasei i submucoasei stomacului i intestinuli pot duce la perforarea peretelui intestinal i cu manifestri de gastroenterit hemoragic. Efecte renale i hepatice. Intoxicaia cu arsen poate duce, de asemenea i la toxicitate hepatic, incluznd hepatit toxic i niveluri ridicate ale enzimelor hepatice. Din necropsiile copiilor japonezi intoxicai cu lapte contaminat cu arsen au fost relevate necroze hepatice

109

hemoragice i degenerescen gras a ficatului. Aportul cronic de arsen poate duce la hipertensiune portal cirotic. Toxicitatea sistemic produs n intoxicaia acut cu arsen poate fi nsoit de necroza tubular acut i insuficien renal acut. Cauzele rnilor pot fi ocul hipotensiv, rnirile hemoglobinurice sau mioglobinurice tubulare sau efectele directe ale arsenului asupra celulelor tubulilor. Afeciunile glomerulare pot determina proteinurie. Intoxicaia acut poate determina fisuri capilare difuze, care conduc la vasodilataie generalizat, transudaii ale plasmei, hipotensiune i oc. Ingestia cronic a arsenului prin apa de but a condus la modificri vasculare periferice pronunate. Evidenele epidemiologice au indicat c expunerea cronic la arsen este asociat cu spasmul vascular i insuficien vascular periferic. Intoxicaia acut cu arsen este legat i de toxicitatea neurologic manifestat prin neuropatie periferic, implicnd nervii senzitivi i motori. Efectele senzoriale, ca disestezia dureroas, apar devreme i pot predomina n intoxicaia moderat, n timp ce n intoxicaia mai sever apare slbiciunea progresiv i paraliziile. Nervii cranieni sunt rar afectai, chiar i n intoxicaiile acute. Neuropatia este datorat distruciilor axonilor neuronali. Recuperarea dup neuropatiile induse la expunerea cronic la arsen este, n general, lent, durnd uneori ani, fr s se produc recuperarea complet. Studiile realizate asupra copiilor japonezi care au consumat cronic lapte contaminat cu arsen, au relevat o inciden crescut a pierderii auzului, retardare mental, epilepsie i alte afeciuni ale creierului. Expunerea oamenilor la arsen determin i apariia afeciunilor dermatologice, cele mai frecvente fiind hiperpigmentarea, hipercheratoza i cancerul de piele. Petele hiperpigmentate pot s apar pe tot corpul, dar apar mai ales pe pleoape, tmple, axile, gt i regiunea inghinal. n cazurile severe, pigmentaiile se extind pe piept, spate i abdomen. Modificrile pigmentare au fost observate la oamenii expui cronic la mai mult de 400 ppb arsen prin apa de but. Hipercheratoza arsenioas apare mai frecvent pe palme i tlpi. Att intoxicaia acut ct i cea cronic cu arsen pot afecta sistemul hematopoetic. Se poate produce supresarea mduvei osoase cu pancitopenie. Anemia i leucocitopenia sunt frecvente n intoxicaia cronic cu arsen . Toxicologie Ingestia unor doze mari (70 pn la 180 mg) poate fi de fapt fatal. Simptomele constau n febr, anorexie, hepatomegalie i aritmie cardiac. Ingestia acut poate conduce la iritaii la nivelul mucoaselor i formarea de vezicule. Afectarea sistemului nervos periferic este efectul neurologic cel mai comun instalndu-se la una sau dou sptmni dup expunerea la doze mari ce presupune degenerarea axonilor, aceasta fiind reversibil dac expunerea este oprit. Pielea este organul critic al toxicitii arsenului i o varietate de leziuni ale pielii au fost asociate cu intoxicaia cu arsen. Cancerul de piele datorat expunerii la arsen a fost prima dat raportat de un terapeut englez, Sir Jonathan Hutchinson la persoanele cu o ndelungat ingerare a soluiei Fowler.
110

Simptomatologie Simptomele apar de obicei la o or dup ingestie, dar pot ntrzia cteva ore. Mirosul aliaceu al respiraiei i al fecalelor, pot s apar la pacienii cu intoxicaii grave. n intoxicaia cu arsen predominante sunt efectele gastrointestinale, ntre care voma, durerile abdominale i diareea apoas sau hemoragic, sunt cele mai frecvente. Printre efectele gastrointestinale se ntlnesc i inflamaia, formarea de vezicule i eventual desprinderi ale mucoaselor din gur, faringe i esofag. Acestea sunt rezultatul aciunii unui metabolit arsenios asupra vaselor de snge, determinnd vasodilataie i permeabilitate capilar crescut. Afectat n intoxicaia acut este i sistemul nervos central, unde simptomele care apar sunt dureri de cap, stare de disconfort, somnolen i confuzie. Simptomele pot progresa i includ slbiciunea muscular i spasme, hipotermia, letargia, delirul, coma i convulsiile. Afeciunile renale se manifest sub form de proteinurie, hematurie, glucozurie, cilindri urinari i, n intoxicaiile severe, necroze tubulare. Manifestrile cardiovasculare includ ocul, cianoza i aritmiile cardiace, datorate aciunii toxice directe i tulburrilor electrolitice. Afeciunile hepatice pot fi manifestate prin niveluri enzimatice ridicate i icter, iar afectarea esuturilor hemato-formatoare poate determina anemie, leococitopenie i trombocitopenie. Moartea survine, de obicei, dup 1-3 zile de la debutul simptomelor, adesea ca rezultat al insuficienei circulatorii i renale. Pacienii care supravieuiesc prezint parestezii dureroase, furnicturi i amoreli n mini i picioare, slbiciune muscular i spasme. Hiperpigmentarea i hipercheratoza sunt semne tipice ale intoxicaiei cu arsen. Alte semne ale intoxicaiei cronice cu arsen cuprind edeme subcutanate ale feei, pleoapelor i gleznelor, stomatite, striaii albe pe unghii i uneori cderea unghiilor sau prului. Uneori papulele hipercheratozice sufer transformri maligne. La fel de frecvente sunt ns i simptomele neurologice. Printre ele se afl i neuropatia periferic ce se manifest prin parestezie, durere, anestezie, pareze i ataxie. Pot debuta adesea cu simptome senzitive n extremitile inferioare i progresa la slbiciune muscular i, eventual, paralizii i atrofie muscular. Se poate produce i encefalopatia, nu att de comun ns, manifestat prin tulburri de vedere i tulburri mentale, foarte asemntoare cu cele ntlnite n deficiena de tiamin.

Tiamina Efecte cele mai tardive ale aportului cronic de arsen sunt cancerul de piele, de pulmoni i de vezic urinar. Expertiza produselor alimentare i msuri pentru protecia consumatorului n cazul sacrificrilor de necesitate ale animalelor intoxicate cu arsen se confisc organele, tubul digestiv, capul i mamela, indiferent dac sunt sau nu corespunztoare
111

organoleptic. Carnea va fi supus examenului toxicologic de laborator, iar cea care depete limitele maxime admise i prezint modificri organoleptice se confisc. Animalele de talie mic intoxicate cu arsen se vor exclude de la consum. La animalele mari nu se permite consumul ndelungat deoarece exist riscul acumulrii lente de arsen i declanarea intoxicaiilor la om. Laptele provenit de la vacile intoxicate, cu evoluie subacut sau cronic trebuie retras din consum uman cel puin 20 de zile, deoarece laptele este o cale de eliminare important pentru arsen. Atunci cnd conine doar urme neglijabile de arsen, laptele se dirijeaz spre fabricarea untului. Oule se vor supune de asemenea analizelor de laborator, excluzndu-se din consum cele care depesc limitele maxime admise. Limitele admise de arsen din unele produse alimentare sunt prezentate n tabelul 2: Tabel 2. Concentraii admise de arsen Produs Concentraie (mg/kg) Dulciuri, dropsuri, ciocolat, halva, cacao 0,2 Cartofi 0,3 Legume proaspete sau congelate 0,5 Fructe proaspete sau congelate 0,5 Sucuri, buturi alcoolice naturale 0,1 Condimente 0,2 Cafea 0,2

Mercurul Niciun alt metal nu ilustreaz mai bine diversitatea efectelor cauzate de diferitele forme biochimice. La baza caracteristicilor toxicologice sunt 3 forme ale mercurului: elemental, anorganic i organic. Sursa major de mercur provine din degazarea natural a crustei pmntului. Mercurul metalic din atmosfer reprezint principala cale din transportul global al mercurului. Toxicocinetica Toxicitatea diverselor forme sau sruri ale mercurului este dat de mercurul cationic pe cnd solubilitatea, biotranformarea i distribuia n esuturi sunt influenate de starea de valen i de componenta anionic. Mercurul metalic sau elemental volatilizeaz la temperaturi ambientale i majoritatea expunerilor de la oameni se fac prin inhalare. Vaporii de mercur difuzeaz de-a lungul membranei alveolare i este liposolubil nct are o afinitate pentru celulele roii i pentru sistemul nervos central. Mercurul metalic poate fi inghiit dintr-un termometru spart i este absorbit foarte lent de tractul gastrointestinal i este deseori considerat a nu avea vreo consecin toxic. Srurile de mercur anorganic pot fi divalente (mercurice) i monovalente (mercuroase). Absorbia gastrointestinal a srurilor de mercur anorganic din hran reprezint mai puin de 15% la oareci i aproximativ 7% ntr-un studiu la oameni voluntari pe cnd absorbia
112

metilmercurului este de ordinul a 90-95%. Distribuia ntre celulele roii i plasm difer de asemenea. Rinichii conin cea mai mare concentraie de mercur ca urmare a expunerii la srurile anorganice ale mercurului i mercur vapori, pe cnd mercurul organic are o afinitate deosebit pentru creier, n special pentru cortexul posterior. Cu toate acestea mercurul sub form de vapori are o mai mare predilecie pentru sistemul nervos central dect are mercurul anorganic dar mai mic dect mercurul organic. Excreia mercurului din organism se face prin intermediul urinei sau fecalelor, n funcie de specia de mercur, doz i timpul de expunere. Expunerea la vapori de mercur este urmat de eliminarea unei pri mici prin expiraie, dar excreia reprezint partea major i este predominant iniial dup expunerea la mercur anorganic. Excreia renal crete cu timpul. Aproximativ 90% din metilmercur este excretat dup expunerea acut sau cronic i nu se modific cu timpul. Toate formele mercurului traverseaz placenta ajungnd la ft. Preluarea mercurului de ctre ft la obolani probabil datorit liposolubilitii este de 10-40 de ori mai mare dect absorbia sa dup expunerea la srurile anorganice. Concentraia mercurului n fetus, dup expunerea la compuii alchil mercurici este de 2 ori mai mare fa de cea gsit n esutul matern, iar nivelul de metilmercurului n celulele roii fetale este cu 30% mai mare dect n celulele roii materne. Gradientul fetal-matern pozitiv i concentraia crescut a mercurului n celulele roii ale ftului mresc toxicitatea fetal la mercur n special dup expunereala alchil mercur. Cu toate c laptele matern poate conine doar 5% din concentraia mercurului a sngelui matern expunerea neonatal la mercur poate fi mrit prin alptare. Transformarea metabolic i excreia Mercurul elemental este oxidat la mercur divalent dup absorbia la esuturi n organism, mediat de catalaze. Vaporii de mercur inhalai i absorbii de celulele roii sunt transformai n mercur divalent dar o poriune este de asemenea transportat ca mercur metalic la mai multe esuturi distale, n mod particular creierul unde se pot produce biotransformri. Similar o fraciune din mercurul metalic absorbit poate fi transportat prin placent pn la ft. Mercurul oxidat divalent este apoi acumulat de aceste esuturi. Alchilmercurul este de asemenea supus biotranformrii la compui mercurici divaleni n esuturi prin clivarea legturii carbon-mercur. Nu este nici o dovad a formrii nici unei forme organice a mercurului de ctre esuturile mamare. Compuii aromatici sunt convertii la mercur anorganic mai rapid dect cel mai scurt lan al compuilor alchil. n situaiile n care mercurul organic este mai rapid absorbit dect cel anorganic, crescnd rata biotransformrii va scdea rata de excreie. Fenil i metoxietil mercurul sunt excretate cam cu aceeai vitez ca i cel anorganic pe cnd excreia metil mercurului este mai lent. Metabolismul celular n interiorul celulelor, mercurul se poate lega de diferite sisteme enzimatice printre care i cele ale microzomilor i ale mitocondriei producnd afectarea nespecific a celulelor i chiar moartea lor. Are o afinitate particular pentru liganzii ce conin grupri sulfhidril. n celulele din
113

ficat metil mercurul formeaz compui compleci solubili cu cisteina i glutationul care sunt secretate n bil i reabsorbite din tractul gastrointestinal. Vaporii de mercur Inhalarea vaporilor de mercur poate produce o bronit acut i coroziv, iar dac nu produce moartea poate fi asociat cu simptome ale efectelor asupra sistemului nervos central cum ar fi tremurul sau excitabilitatea crescut. Efectele majore ce apar la expunerea cronic la vaporii de mercur sunt la nivelul sistemului nervos central. Semnele sunt nonspecifice i au fost denumite sindromul astenic vegetativ sau micromercurialism. Identificarea sindromului necesit simptome neuroastenice i trei sau mai multe dintre urmtoarele diagnosticri clinice: tremur, mrirea tiroidei, puls labil, tahicardie, gingivit, schimbri hematologice sau excreia mrit a mercurului n urin. O dat cu expunerea crescut, simptomele devin caracteristice ncepnd cu tremurul intenionat al muchilor care ndeplinesc funciile motorii, cum ar fi degetele, pleoapele i buze i pot ajunge la un tremur generalizat al ntregului corp i spasme cronice violente ale extremitilor. Acestea sunt nsoite de schimbri de personalitate i comportament, cu pierderi de memorie i chiar delir sau halucinaii. O alt caracteristic a toxicitii mercurului este salivarea sever i gingivit. Triada excitabilitii crescute, tremurul i gingivita a fost recunoscut istoric ca manifestarea major a otrvirii cu mercur prin inhalarea vaporilor i expunerea la nitratul de mercur din industria blnurilor i plriilor. Mercurul mercuric Clorura mercuric (HgCl2) este cea mai cunoscut sare a mercurului anorganic i numele su sugereaz efectul su aparent toxicologic la ingerarea n concentraii mai mari de 10%. Efectele ingerrii acestei sri sunt: ulceraii corozive, sngerri i necroza tractului gastrointestinal. Acestea sunt nsoite de obicei de oc i colapsul circulator. Dac pacientul supravieuiete daunelor gastrointestinale, blocajul renal apare n 24 de ore datorit necrozei epiteliului tubular proximal. Regenerarea celulelor de aliniere tubulare poate fi posibil dac pacientul poate fi meninut n via de dializ. Injectarea clorurii mercurice produce necroza epiteliului rinichiului. Schimbrile celulare includ fragmentarea i ntreruperea plasmei membranare i anexelor sale, vezicularea i ntreruperea reticulului endoplasmatic i a altor membrane citoplasmatice, disocierea polizomilor. Aceste schimbri sunt comune necrozei celulelor renale datorate diverselor cauze. Dei expunerea la o doz mare de clorur mercuric este direct toxic pentru celulele renale tubulare, expunerea cronic la doze sczute la srurile mercurice pot induce o boal imunologic glomerular. Persoanele expuse pot dezvolta o proteinurie care este reversibil dup ce muncitorii sunt ndeprtai de locul n care a avut loc expunerea. Studiile experimentale au artat c patogeneza neuropatiei cronice cauzat de mercur are 2 faze: o faz de nceput caracterizat de o membran antisubsolic glomerulonefrit urmat de un complex glomerulonefritic imun superimpus. Nefrita glomerular de nceput poate progresa la oameni pn la un complex nefritic interstiial imun. Compuii mercuroi
114

Compuii mercuroi ai mercurului sunt mai puin corozivi i mai puin toxici dect srurile, probabil din cauza solubilitii mai sczute. Calomelul (Hg2Cl2), o pudr coninnd clorur mercuroas, are o istorie lung de utilizare n medicin. Probabil cea mai notabil utilizare a fost pudra pentru creterea dinilor la copii i este cunoscut a fi responsabil de acrodinie i boala roz. Aceasta este cel mai probabil un rspuns de hipersensibilitate la srurile de mercur, n piele producnd vasodilataie, hipercheratoz sau hipersecreia glandelor sudoripare. Copiii dezvolt febr, o urticarie roz, umflarea splinei i hipercheratoz i umflarea degetelor. Efectele sunt independente de doz i se cred a fi reacii de hipersensibilitate. Mercurul organic Metilmercurul este forma cea mai important n termeni de toxicitate, iar efectele din expunerea din mediul nconjurtor i multe efecte produse de lanurile scurte de alchil sunt unice n termeni de toxicitate a mercurului dar sunt nespecifice n aceea c pot fi gsite n alte stri ale bolilor. Majoritatea lucrurilor care sunt cunoscute despre toxicitatea mercurului metilic este din studiile epidemiologice ale populaiei expuse. Dou epidemii majore ale otrvirii cu metilmercur s-au petrecut n Japonia n Golful Minamata i n Niigata. Amndou au fost cauzate de eliberarea industrial a compuilor mercurici n Golful Minamata i n rul Agano urmat de acumularea mercurului de petii comestibili. Nivelul mediu al mercurului total n petii prini n Golful Minamata n timpul epidemiei a fost de aproximativ 11 mg/kg greutate proaspt i mai puin de 10 mg/kg n petii din rul Agano. Cea mai mare epidemie de otrvire cu mercur metilic a fost nregistrat n Iraq n iarna anilor 1971-1972 rezultnd n internarea a peste 6000 de pacieni i a peste 500 de mori n spitale. Expunerea la metilmercur a fost datorat pinii coninnd gru importat mbrcat cu fungicide ce conineau metilmercur. Coninutul de metilmercur din probele de fin a fost 0,1 mg/kg. Din studiile acestor epidemii au fost obinute date n legtur cu manifestrile clinice, patologia organelor i nivele de expunere. Majoritatea manifestrilor clinice sunt legate de sistemul nervos constnd n ataxie, dizartrie i surzenie aprnd n aceast ordine. Principalele trsturi patologice ale toxicitii mercurului metilic includ degenerarea i necroza neuronilor n arii focale ale cortexului cerebral, n special n ariile vizuale ale cortexului occipital i n stratul granular al cerebelului. Studiile experimentale ale mercurului organic i a celui anorganic arat degenerarea a celulelor ganglionare primare senzoriale. Distribuia particular a leziunilor n sistemul nervos central se crede a reflecta tendina mercurului de a deteriora celulele nervoase mici din cerebel i cortexul vizual. Mercurul metalic Pentru populaia general expunerea zilnic la mercur este estimat a fi 1 g/zi din aer, mai puin de 2 g/zi din ap i aproape 20 g/zi din hran, dar poate ajunge pn la 75 g/zi n funcie de cantitatea de pete din diet. Limita permis n expunerea cu mercur anorganic la locul de munc este de 0,05 mg Hg/m3 i este echivalent cu un nivel de 0,015 mg/m3 din aerul ambiant pentru populaia general.
115

Sistemul nervos central este principalul loc afectat de toxicitatea mercurului. Se crede c un muncitor expus la o concentraie medie constant de vapori de mercur atinge o stare stabil dup un an de expunere i se poate atepta s existe relaie ntre nivelul mercurului n aer i coninutul de mercur din snge sau urin. Coninutul de mercur din snge i urin reflect doar expunerea recent la mercur metalic. Alchil mercurul Standardul pentru expunerea la mercurul alchilic la locul de munc este de 0,01 mg/m3. Nivelele de mercur din pr pot fi corelate cu severitatea simptomelor clinice. Cazurile uoare presupun amoreala extremitilor, tremurturi uoare i o uoar ataxie. Cazurile moderate prezint dificulti de auz, paralizie parial i cazurile severe o combinaie de paralizie total, pierderea vederii, pierderea auzului, pierderea vorbirii i com. Persoanele fr niciun simptom pot avea nivelele de mercur din pr pn la 300 mg/kg, cele afectate moderat pot avea ntre 120 i 600 mg/kg iar cele sever afectate au ntre 400 i 1600 mg/kg. Nu este neles n totalitate de ce expunerea la mercurul metilic are efecte att de selective asupra cerebelului i cortexului vizual. Concentraia de mercur din aceste zone ale creierului nu este foarte diferit de aceea din celelalte zone ale creierului care nu sunt afectate de mercurul metilic. Mercurul metilic inhib sinteza proteinelor nainte de instalarea semnelor otrvirii i s-a artat c refacerea sintezei proteinelor nu are loc n celulele granulare ca n celelalte celule nervoase. Tratament Terapia n otrvirea cu mercur ar trebui s fie direcionat n diminuarea concentraiei de mercur n organele critice sau n locul afectat. Pentru cele mai severe cazuri, n special n cedarea renal acut, hemodializa poate fi prima msur luat mpreun cu infuzia de ageni chelani pentru mercur cum ar fi cisteina sau penicilamina. Pentru cazurile mai puin severe cu otrvirea cu mercur anorganic, chelarea cu BAL poate fi eficient. Cu toate acestea, terapia chelant nu este foarte util la expunerea la mercuric alchilic. Excreia biliar i reabsorbia de ctre intestin i ciclizarea enterohepatic a mercurului pot fi ntrerupte prin drenarea vezicii biliare n mod chirurgical sau prin administrarea pe cale oral a unei rini de tiol neabsorbabil care leag mercurul i mrete excreia intestinal.

cisteina Penicilamina Expertiza produselor alimentare n produsele i subprodusele de origine animal provenite de la animale intoxicate sau tratate cu compui ai mercurului, reziduurile presist mult timp, astfel c sacrificarea animalelor
116

se recomand s se realizeze dup 9-10 luni de la remisie sau dup ncetarea aplicrii tratamentului. n cazul intoxicaiilor, pericol pot prezenta i laptele i oule, acestea fiind ci de eliminare pentru mercur. Deoarece metil mercurul din pete i produse din pete reprezint pn la 85% din aportul total de mercur prin raie, pentru a asigura protecia consumatorilor au fost stabilite nivele maxime admise pentru mercur n pete. Limita maxim admis pentru mercur n petii nerpitori este de 0,5 mg/kg, n timp ce petii rpitori pot conine pn la 1 mg/kg. Limita fixat de Comisia European pentru Furaje este de 0,1 mg/kg pentru toate animalele, cu excepia animalelor de companie, n raia crora se tolereaz pn la 0,4 mg/kg. Pentru apa de but, limita maxim este de 1 g/l. Pentru muncitorii expui profesional, OSHA (Occupational Safety and Health Administration) a mpus o limit de 1,2 ppb mercur organic n aerul din ncpere (echivalent cu 0,01 mg/m3) i 6,1 ppb (0,05 mg/m3) pentru mercurul anorganic pentru a proteja muncitorul pe durata a 8 ore de munc, Deoarece metilmercurul se gsete mai ales n esutul muscular al petelui legat de proteine, ndeprtarea pielii i a grsimii nu reduce semnificativ concentraia mercurului din muchi. Gtitul, de asemenea, nu ndeprteaz mercurul din muchi ci, dimpotriv, deoarece umiditatea scade dup gtit, concentraia mercurului ajunge s fie chiar mai mare dect n petele proaspt. n ceea ce privete produsele de origine vegetal, o atenie deosebit se recomand s se acorde culturilor din zonele din jurul fabricilor care elibereaz mercur n mediu i ciupercilor, care sunt acumulatoare de mercur. Pentru a reduce contaminarea mediului, n special a ecosistemelor acvatice, apele reziduale care se tie c pot conine mercur se supun unor tratamente speciale pentru a-l ndeprta. Se utilizeaz materiale absorbante cum sunt crbunele din lemn, crbunele activat de cocos, chitosam, zgur granulat de la oelrii pentru a ndeprta mercurul ionic i unele bioreactoare, care sunt eficiente n proporie de 97%. Pentru a scdea toxicitatea apelor reziduale, n special de la fabricile de sod, au fost utilizate i bacterii rezistente la mercur. Algele albastre-verzi acumuleaz cantiti substaniale de mercur din mediu, n timp ce tulpinile rezistente de bacterii volatilizeaz peste 90% din mercur organic i anorganic. Tulpinile de Streptomyces termofile pot stimula reducerea concentraiei mercurului anorganic din ap.

Nichelul Nichelul este un metal de culoare alb-argintie, ductil i rezistent la coroziune. A fost descoperit n 1751 n Suedia de Axel Fredik Cronstedt. Este folosit ca aliaj n oelul inoxidabil i n monede. Este de asemenea folosit i pentru placarea metalic a bateriilor, dar i pe post de catalizator n procesele chimice. Distribuia n alimente Nichelul poate fi gsit n aproape toate alimentele. Cele mai mici concentraii se gsesc de obicei n produsele animale i lapte. Cerealele i fructele conin concentraii intermediare din
117

acest metal iar cele mai mari nivele se gsesc de exemplu n cacao. Majoritatea coninutului de nichel din diet provine probabil din contaminarea din timpul procesrii i preparrii. nclzitoarele electrice pentru ap pot constitui o surs considerabil de nichel n diet. Studii din Danemarca i Suedia au artat c nclzitoarele placate cu Ni sau cu elemente din oel inoxidabil pot da apei fierbini pn la 1 mg Ni/l. Tabel 3. Concentraii ale Ni n alimente necontaminate Alimente Concentraie Ni (mg/kg) Carne, pete, lapte, ficat i rinichi 0,02 Fructe i legume, cereale 0,1 Ciocolata cu lapte,ciuperci 1 Cacao, semine, fasole 1-5 Absorbia Ni din alimente se estimeaz a fi n proporie de 0,7 % pe cnd Ni din buturi este absorbit mult mai eficient, mai ales dac este ingerat pe stomacul gol. Efectele toxice sunt datorate n principal expunerii ocupaionale sau accidentale i nu prin alimente. Nichelul este un carcinogen al tractului respirator pentru muncitorii din industria rafinrii nichelului. Alte consecine serioase pe termen lung nu sunt aa de evidente, dar sunt severe i acute i cteodat pot fi fatale la expunerea nicheltetracarbonil. Dermatita alergic este comun la persoanele din populaia general. Totui, deficiena nichelului altereaz metabolismul glucozei i scade tolerana la glucoz. Din studiile fcute pe obolani s-a dovedit c nichelul poate fi un metal esenial de urme pentru mamifere. Toxicodinamie Nichelul este numai slab absorbit de tractul gastrointestinal. Este transportat n plasm fiind legat de albumina seric i muli ali liganzi organici, aminoacizi sau polipeptide. Excreia prin urin este aproape complet n 4-5 zile. Aportul de nichel din diet la adulii din Statele Unite ale Americii a fost estimat la 300 pn la 600 g/zi. ntr-un studiu mai recent a coninutului de nichel din mncarea pregtit n buctriile universitilor i ale spitalelor s-a gsit un aport de nichel a fi de 165 g/zi sau 65-85 g/1000 de calorii. Nichelul administrat parenteral la animale este rapid distribuit la rinichi, plmni, piele, glanda pituitar. Distribuia intracelular i legarea nichelului nu este bine cunoscut. Liganzii ultrafiltrani par a fi de mare importan n transportul n ser i n bil, n excreia urinar ct i n legarea intracelular. Toxicologie Se cunoate de peste 40 de ani faptul c expunerea ocupaional la nichel provoac apariia cancerului nazal sau pulmonar. Studiile epidemiologice din 1958 au artat c muncitorii ce se ocupau cu rafinarea nichelului n Anglia au avut o cretere de 5 ori a riscului de cancer pulmonar i de 150 de ori a cancerului nazal n comparaie cu ceilali oameni. Mai recent a fost raportat creterea cazurilor de cancer pulmonar la muncitorii din diferite ri. Un numr de 6 cazuri de cancer renal au fost raportate printre muncitorii canadieni i norvegieni.
118

Studiile experimentale pe animale au artat c sulfura de nichel (Ni3S2) produce tumori locale i in vitro, iar testarea celulelor mamare demonstreaz c Ni3S2 i NiSO4 crete transformarea celulelor mamare.

Otrvirea cu nicheltetracarbonil Nichelul metalic se combin cu monoxidul de carbon pentru a forma nicheltetracarbonil [Ni(CO)4] care se descompune la nichel pur i monoxid de carbon la nclzirea la 2000 C. Aceast reacie reprezint o metod eficient de rafinare a nichelului. Cu toate acestea nicheltetracarbonilul este foarte toxic i au fost raportate foarte multe cazuri de toxicitate acut. Boala ncepe cu durere de cap, stri de vom, dureri n piept urmate de tuse, cianoz, simptome gastrointestinale. Simptomele pot fi nsoite de febr i leucocitoz, iar cazurile mai severe progreseaz la pneumonie, cedarea aparatului respirator i eventual edem cerebral i moarte. Autopsiile arat c plmnii dein cantitatea cea mai mare de nichel spre deosebire de rinichi, ficat sau creier. Indicatori ai toxicitii nichelului Nivelele de nichel din snge imediat dup expunerea la carbonil de nichel ofer o informaie n ceea ce privete severitatea expunerii i o indicaie asupra terapiei chelante. Dietilditiocarbamatul de sodiu este medicamentul preferat dar i ali ageni chelani precum dpenicilamina i trietilentetraamina ofer un grad de protecie mpotriva efectelor clinice.

Cobalt Cobaltul este un component esenial al vitaminei B12, care este necesar pentru producerea celulelor roii i prevenirea anemiei. Exist 0,0434 g de cobalt pe microgram de vitamin B12. Cobaltul este un metal relativ rar i se obine ca un produs secundar la producerea altor metale, n primul rnd a cuprului. Este folosit n aliaje pentru temperaturi nalte i n magneii permaneni. Srurile sale sunt folosite ca usctori pentru vopsele i pentru producerea numeroilor pigmeni. Srurile de cobalt sunt n general foarte bine absorbite dup ingestia oral, probabil n jejun. n ciuda acestui fapt nivelele crescute par s nu provoace o acumulare semnificativ. Aproape 80% din cobaltul ingerat este eliminat prin urin. Un procent de 15% din cobaltul rmas este excretat prin fecale pe o cale enterohepatic, n timp ce laptele i transpiraia sunt ci secundare de excreie. Cantitatea total de cobalt din organism a fost estimat la 1,1 mg. Muchii conin cea mai mare fracie total, iar grsimea conine concentraia cea mai mare. Ficatul, inima i prul au concentraii semnificative n comparaie cu celelalte organe, dar ele sunt tot mici. Concentraiile normale n urina uman i snge sunt de aproximativ 98 i respectiv 0,18 g/L.
119

Policitemia este rspunsul caracteristic majoritii mamiferelor, incluznd oamenii, la ingerarea unei cantiti excesive de cobalt. Toxicitatea rezultat din administrarea terapeutic excesiv produce vom, diaree i senzaii de cldur. Administrarea intravenoas conduce la nroirea feei, tensiune ridicat, respiraie sczut i surzenie datorate efectelor duntoare asupra sistemului nervos. Cardiomiopatia este cauzat de aportul excesiv de cobalt n special din consumul berii n care s-a adugat 1 ppm de cobalt pentru a-i mri calitatea de spumare. Dup injectarea obolanilor cu cobalt s-a raportat o hiperglicemie provocat de daunele aprute la celulele pancreatice. Reducerea presiunii sngelui a fost de asemenea observat la obolani i a condus la nite utilizri experimentale la oameni.

Zincul Zincul este un metal nutriional esenial iar deficiena sa produce consecine severe n ceea ce privete sntatea. Pe de alt parte, expunerea excesiv la zinc este relativ neobinuit i necesit expunere ndelungat. Zincul nu se acumuleaz la expunere continu, dar coninutul din corp este modificat de mecanisme homeostatice care acioneaz n principal la absobie i nivelele ficatului. Zincul este omniprezent n mediu i de aceea, este prezent n majoritatea alimentelor, n ap i n aer. Coninutul de zinc poate fi crescut n contact cu cuprul galvanizat sau evi de plastic. Fructele de mare, carnea, cerealele integrale, produsele lactate i legumele au un coninut ridicat de zinc. Zincul folosit pentru sol este preluat de legumele n cretere. Nivelele atmosferice de zinc sunt crescute deasupra zonelor industriale. Toxicocinetic Aproximativ 20-30 de procente din zincul ingerat este absorbit. Mecanismul pare a fi controlat homeostatic i este probabil un proces purttor mediat. Este influenat de prostaglandinele E2 i F2 i este chelatat de acidul picolinic un derivat de triptofan. Deficiena de piridoxin i triptofanreduce absorbia zincului. n interiorul celulelor mucoaselor, zincul induce sinteza metalotioneinei i, cnd este saturat, poate reduce absorbia zincului. n snge, aproape 2/3 din zinc este legat de albumin i restul este complexat cu 2-macroglobulina. Zincul intr n tractul gastrointestinal ca un component al metalotioneinei secretat de ctre glandele salivare, mucoasa intestinal, pancreas i ficat. Aproape 2 g de zinc sunt filtrate de rinichi n fiecare zi i aproximativ 300 pn la 600 g/zi sunt excretate de un adult normal. Reabsorbia renal tubular este mpiedicat de medicamentele uzuale prescrise precum diuretice i este mai departe influenat de proteinele din diet. Concentraia zincului n esuturi variaz. Ficatul primete pn la 40% din doz eliminnd pn la 25% pe durata a 5 zile. Concentraia zincului n ficat este influenat de factorii umorali incluznd hormonul adrenocorticotropic, paratiroidal i endotoxina. n ficat ca i n alte esuturi, zincul este legat de metalotionein. Cea mai mare concentraie a zincului din corp este n prostat, probabil legat de coninutul bogat n zinc a enzimei acid fosfataz. Deficiena
120

Mai mult de 70 de metaloenzime au nevoie de zinc drept cofactor, iar deficiena conduce la un spectru larg de efecte clinice ce depind de vrst, stadiul de dezvoltare i deficienele legate de alte metale. Deficiena n zinc la oameni a fost caracterizat pentru prima dat de Prasad i colaboratori n 1963 la bieii adolesceni egipteni cu cretere deficitar i maturizare sexual ntrziat. Acestea erau nsoite de malnutriie protein-caloric, pelagr i deficien de fier. Deficiena de zinc la nou-nscui se poate manifesta prin dermatit, pierderea prului, vindecare ncetinit, susceptibilitate la infecii i anormaliti neuropsihologice. Inadecvenele dietare cuplate cu boli ale ficatului din alcoolismul cronic pot fi asociate cu dermatit, orbul ginilor, atrofie testicular, impoten i vindecare ncetinit. Alte boli cronice clinice, precum colita ulcerativ, boal cronic renal i anemia hemolitic. Multe medicamente afecteaz homeostaz zincului n special agenii chelani ai metalelor i unele antibiotice, precum penicilina i isoniazid. Deficienele mai puin comune ale zincului sunt artritele i hipertensiunea. Concentraia normal a zincului din plasm este de la 85 pn la 110 g/dl. Deficiena sever poate conduce la scderea nivelului zincului din plasm pn la 60 sau 40 g/dl, nsoit de 2-globulin i scderea -globulinei. Excreia zincului prin urin poate scdea de la 300 g/zi la mai puin de 100 g/zi. Bineneles interaciile zincului cu cadmiul i plumbul pot modifica toxicitatea acestor metale. Toxicitatea zincului Toxicitatea zincului datorat ingerrii excesive este neobinuit, dar afeciunea gastrointestinal i diareea au fost raportate ca urmare a ingerrii unor buturi ce au stat n canistre galvanizate sau de la folosirea ustensilelor galvanizate. Cu toate acestea dovezi cu privire la toxicitatea hematologic, hepatic i renal nu au fost observate la indivizi ce au ingerat pn la 12 g de zinc elemental pe o perioad de 2 zile. Cu privire la expunerea industrial cel mai important efect este apariia febrei la inhalarea fumului metalic. Tulburarea a fost n general asociat cu inhalarea fumului de oxid de de zinc, dar poate fi asociat i cu inhalarea fumului altor metale, n special magneziu, fier i cupru. Semnele apar de obicei dup 4 sau 8 ore de la expunere, frisoane i febr, transpiraie i slbiciune i dureaz numai 24 sau 48 de ore. Patogeneza nu este cunoscut. Extracte preparate din mucoasa traheal i plmni ale unor animale n care a fost introdus fumul metalic produce aceleai simptome atunci cnd este introdus n alte animale. Alte aspecte ale toxicitii zincului nu au fost stabilite. Experimental li s-a administrat animalelor de 100 de ori mai mult necesarul dietar fr vreun efect vizibil. Expunerea porcuorilor de guineea 3 ore pe zi timp de 6 zile consecutive la 5 mg/m3 oxidul de zinc ultrafin format a produs scderea volumului din plmni i capacitatea difuziei monoxidului de carbon, efect ce a durat 72 de ore dup expunere. Aceste schimbri funcionale au fost corelate cu dovezi microscopice a ngrorii interstiiale i a infiltrrii celulare n canalele alveolare.

121

Cadmiu Cadmiul este un metal moale, ductil, alb-argintiu foarte toxic care este prezent n cantiti mici n mediul nconjurtor, incluznd alimentele, apa i solul i n majoritatea substraturilor biologice dei nu are nici un rol biologic cunoscut. Din acestea cile primare de expunere sunt prin alimentaie i contact dermal dup expunere ocupaional susinut. Solul se contamineaz prin depunerea particulelor de cadmiu din atmosfer. Cadmiul din sol poate fi clasificat n 3 categorii distincte n ceea ce privesc efectele asupra sntii omului. Acestea cuprind solurile neagricole, solurile agricole i cderile de pmnt controlate. Cadmiul din cderile de pmnt controlate este practic imobil i este puin probabil s aib vreun efect asupra sntii omului sau a mediului. Cadmiul din solurile neagricole nu va afecta sntatea omului deoarece nu intr direct n lanul trofic, sau poate s ajung indirect prin transferul spre terenurile agricole via transportul prin ap sau prin aer. n solurile agricole, cadmiul este, de asemenea, relativ imobil n condiii normale, dar poate deveni mai mobil n anumite condiii de cretere a aciditii solului sau de cretere a concentraiei prin utilizarea de ngrminte chimice, naturale sau a nmolurilor. Factorii principali care infleneaz speciaia, adsorbia i distribuia cadmiului n sol sunt pH-ul, coninutul de materie organic, coninutul de oxid metalic hidratat. Datorit presiunii sale de vapori relativ sczute i a volatilitii termice mari i n special datorit eliberrii de sruri de cadmiu acvosolubile n apa rezidual industrial, concentraiile de cadmiu din mediul nconjurtor sunt n continu cretere i prezint un risc considerabil pentru sntatea public. Metalul se gsete n concentraii mai mari n anumite plante de exemplu n frunzele de tutun i se acumuleaz esutul moale al animalelor, ajungnd la nivele potenial toxice. Aportul alimentar i fumatul sunt astfel principalele surse ale expunerii umane la cadmiu. Faptul c din populaia general, fumtorii sunt n special n pericol a fost demonstrat prin nivele semnificativ de ridicate de cadmiu msurate n snge i fluide seminale n comparaie cu valorile corespondente gsite la nefumtori. O igar conine ntre 0,5-2 g Cd aproximativ 10% din coninut fiind inhalat atunci cnd se fumeaz o igar. Toxicitatea cadmiului DL50 dup injectarea unui compus solubil al cadmiului este ntre 2,5-25 mg/kg. DL50 oral este de 10-20 de ori mai mare dect cea prin administrare parenteral. Doza letal estimat este ntre 350-8900 mg, corespunztoare la doze ntre 20-130 mg/kg pentru un adult de 70 kg. Toxicocinetica Absorbia pe cale respiratorie. Expunerea pe aceast cale se realizeaz prin inhalarea particulelor de cadmiu. Proporia de cadmiu absorbit este influenat de mrimea particulelor, de solubilitatea i forma chimic a acestuia. Din totalul inhalat, se estimeaz c se absoarbe 1050%, iar din acesta pn la 90% n partea inferioar a plmnului. Absoria pe cale oral. Cadmiul ingerat este slab absorbit i totodat absorbit n proporii diferite dependent de speciaia acestuia, specia de animal, doza i frecvena administrrii, statusul nutriional i interaciunile cu diveri nutrieni. Absorbia acestui metal
122

crete n cazul deficienei de fier i calciu i scade n prezena zincului i crete i cu coadministrarea de cupru. Cadmiul legat de metalotioneine n alimente este absorbit de oareci n proporie mai mic dect sub form ionic. Totodat absorbia este mai accentuat la tineri i mai mare la femele dect la masculi. Distribuia. Cadmiul nu sufer conversii metabolice, dar ionul de cadmiu se poate lega la grupri anionice, n special grupri sulfhidril, n proteine i alte molecule. Dup absorbie, cadmiul este transportat de snge, fixat pe eritrocite sau legat de proteine cu mas molecular mare. Cadmiul este preluat de celulele hepatice unde se leag la metalotioneine. Legat astfel n ficat, el este eliberat lent n plasm. Datorit dimensiunilor mici ale complexului cadmiu-metalotionein, acesta trece liber prin glomer n tubulul renal. Cadmiul legat de metalotionein este preluat eficient n tubul proximal prin pinocitoz. n celulele tubulare renale, vacuolele pinocitare sunt lizate de lizozomi, care degradeaz metalotioneina, elibernd astfel cadmiul. Metalul se combin apoi cu nou-sintetizatele metalotioneine produse de celulele tubulare i se acumuleaz n rinichi pentru zeci de ani. Studiile au artat c expunerea la nivele sczute de cadmiu induce producerea de metalotioneine, permind depozitarea n proporie mai mare n ficat i rinichi, reducnd astfel toxicitatea acut a metalului. Eliminarea. Mare parte din cadmiul ingerat este eliminat nemodificat prin fecale, iar cel absorbit este eliminat din organism mai ales prin urin, dar i prin bil,saliv i transpiraie. Proporia de cadmiu eliminat zilnic prin urin este totui foarte mic, reprezentnd doar 0,0050,01% din totalul din corp. La subiecii expui profesional la cadmiu excreia urinar este de 2g/g creatinin.

Efectele patogene Simptomele clinice ale toxicitii cadmiului includ, n general, manifestri hepatice i renale, anemie, piele solzoas. Exist dovezi i n ceea ce privete interferena cadmiului n formarea oaselor creterea resorbiei osoase in vivo i scderea acumulrii osteoblastice a calciului in vitro. Metalul a fost asociat i cu neoplasm malign la oameni, iar carcenogenitatea indus de cadmiu poate fi n principal datorat deteriorrii oxidative a ADN-ului. Principalele efecte constatate ca urmare a expunerii omului la cadmiu sunt urmtoarele: Efecte renale. Numeroase studii au artat c rinichii sunt principala int a toxicitii cadmiului. Metalul lezeaz att glomerulul, ct i tubulul renal proximal. Leziunile glomerulare sunt caracterizate prin pierderi ale proteinelor mari prin urin, aminoacidourie, glucozurie i hipercalciurie. Efectele adverse asupra tubulului proximal sunt caracterizate prin creteri ale nivelurilor urinare a numeroase proteine tubulare. Proteinele tubulare sunt proteine mici, care se gsesc n plasm i care nu sunt filtrate de glomerul, trecnd astfel n tubulul renal. Creterea concentraiilor urinare ale proteinelor tubulare, cum sunt microglobulina 2, microglobulina 1, proteina legat de retinol i N-acetil--glucoza-minidaza indic leziuni ale tubului proximal.
123

Retinol n afar de nivelurile crescute ale unor proteine urinare, nivelurile crescute de cadmiu pot fi, de asemenea, consecin a leziunilor renale. Atunci cnd efectele tubulare nu sunt evidente, sunt observate creteri ale concentraiilor de cadmiu n urin, o dat cu vrsta. n jurul vrstei de 50 de ani, concentraia acestui metal n rinichi atinge maximul, dup care ncepe s scad. Scderea se poate datora rspunsului funciei tubulare alterate cu vrsta. Disfuncia renal asociat cu expunerea ridicat la cadmiu se reflect, de asemenea, prin reducerea nivelului cadmiului n rinichi i concentraii ridicate ale acestuia n urin. n ambele circumstane, abilitatea rinichilor de a depozita cadmiul poate fi compromis. La muncitorii expui la cadmiu, n special cei care prezint proteinurie, s-a constatat inciden crescut de pietre la rinichi. Acest efect poate fi secundar creterii excreiei de calciu, atunci cnd sunt prezente leziuni tubulare substaniale. Efecte neurotoxice. Cadmiul este cunoscut c altereaz concentraia neurotransmitorilor din creier i poate inhiba intrarea calciului n neuroni. Efectele neurologice constau n activitate motorie redus, slbiciune i atrofie muscular, comportament agresivi alterri ale nivelurilor dopaminei, 5-hidroxitriptaminei, dehidrogenazei succinice i monoaminooxidazei din creier . Expunerea cronic poate conduce la neuropatii periferice.

Dopamina

5-hidroxitriptamina

Efecte cardiovasculare i hematologice. Un numr de studii pe oameni i animale au gsit o corelaie ntre ingestia de cadmiu i presiunea sanguin crescut, dar alte studii nu au gsit nici o asociere semnificativ. S-a concluzionat c dovezile de toxicitate cardiovascular rezultate n urma expunerii orale sunt neconcludente la om, iar intensitatea oricrui efect al cadmiului asupra presiunii sangvine este mic n comparaie cu ali determinani ai hipertensiunii. Creteri ale tensiunii alteriale au fost observate la animale expuse la doze de 0,008-1,6 mg Cd/kg/zi i 0,01-1,7 mg Cd/kg/zi dup o expunere intermediar, respectiv cronic. Mecanismele prin care cadmiul afecteaz presiunea sangvin au fost studiate de Perry i Koop (1983). La doze care produc hipertensiune a fost detectat activitatea crescut a reninei

124

circulatorii i, att expunerea parenteral ct i cea oral cronic, a determinat creterea reinerii de sodiu. Expunerea oral reduce absorbia gastrointestinal a fierului, ceea ce poate conduce la anemie dac aportul de fier prin raie este redus. n studiile pe animale, s-a constatat c suplimentarea raiilor cu fier sau acid ascorbic poate preveni anemia.

Acid ascorbic Administrarea parenteral a cadmiului produce distrugerea eritrocitelor, dar nu sunt indicaii asupra faptului c ar afecta sinteza de hemoglobin. Efecte asupra gonadelor, reproductive i de dezvoltare. n urma expunerilor acute i subacute la cadmiu au fost observate efecte testiculare, constnd n necroz i atrofii ale epiteliului tubulilor seminiferi, greutate crescut a testiculelor i scderea numrului i motilitii spermatozoizilor (castrare chimic). Aceste efecte apar la doze de 5,8 mg Cd/kg/zi i mai mari. Efectele testiculare ale cadmiului pot fi datorate interferenei acestuia cu complexele zincproteine, care controleaz transcripia ADN, ducnd ulterior la apoptoz. Doze similare la femei induc hemoragii i necroze ovariene. Cele mai frecvente efecte ale expunerii la acest metal sunt reducerea greutii fetale sau a nou-nscutului la natere i alterri ale comportamentului locomotor. n timp ce cadmiul a produs i toxicitate matern, efectele asupra produilor de concepie nu par neaprat a fi datorate acesteia. Efecte mutagene i teratogene. Genotoxicitatea cadmiului a fost studiat att la oameni, ct i la animale i in vitro. n timp ce genotoxicitatea a fost observat n unele studii pe oameni expui la cadmiu i n unele teste in vitro, concluziile sunt confuze i contradictorii. Studiile de genotoxicitate nu asigur dovezi complete c efectele genotoxice se datoreaz mai ales aciunii cadmiului; genotoxicitatea pare s fie doar unul dintre mecanismele de aciune care contribuie la toxicitatea cadmiului. Teratogenitatea cadmiului a fost trecut n revist de Ferm i Layton, 1981 i Ferm i Hanlon, 1983. S-a constatat c folosirea produilor de concepie cu doze mici de cadmiu protejeaz mpotriva unor doze ulterioare de cadmiu, la un nivel la care ar fi probabil teratogen, probabil prin inducerea sintezei de metalotioneine. Protecia este asigurat de co-administrarea zincului sau seleniului. Deficiena matern n zinc, singur, poate produce malformaii congenitale, iar administrarea de cadmiu animalelor zinc deficiente ar crete incidena malformaiilor. Efecte asupra imunitii. S-a observat c efectele imunologice induse de cadmiu sunt diverse n studiile pe animale, n unele cazuri constatndu-se supresie, iar n altele stimularea rspunsului imun. Cadmiul s-a observat c supreseaz imunitatea umoral i este
125

citotoxic pentru limfocitele splenice. De asemenea, cadmiul a determinat mortalitate crescut n leucemiile induse viral, sugernd c imunosupresarea este un posibil mecanism de aciune n ceea ce privesc efectele tumorigene ale acestuia. Pe de alt parte, administrarea cadmiului a determinat rezisten crescut la infeciile virale i imunitate mediat-celular crescut. Efecte cancerigene. Studiile epidemiologice ale aciunii cancerigene ale cadmiului au fost realizate mai ales n cazurile de expunere prin inhalare la locul de munc, costatndu-se creterea procentului de cancer pulmonar i de prostat printre astfel de muncitori. IARC (International Agency for Research on Cancer) a clasificat cadmiul n grupa 1 carcinogen- cunoscut carcinogen uman, iar EPA (Environmental Protection Agency) l-a clasificat ca probabil carcinogen prin inhalare, pe baza datelor obinute pe oameni i animale. Efecte asupra metabolismului calciului i oaselor. Cel mai cunoscut eveniment cu privire la toxicitatea cadmiului asupra omului este probabil boala itai-itai. ntr-un district al Japoniei dup cel de-al doilea rzboi mondial i pn pe la nceputul anilor 1970, s-a descoperit c muli oameni sufereau din cauza unei boli care provoca durere i suferin i chiar i moarte. S-a descoperit a fi rezultatul polurii apei rurilor cu reziduri coninnd Cd ce proveneau din activitile de minerit. Apele poluate au fost folosite pentru irigare terenurilor cu plantaii de orez, rezultnd orez contaminat cu Cd. Consumatorii, n special femeile sufereau din cauza decalcifierii scheletului, boala itai-itai fiind caracterizat prin producerea unor fracturi multiple i distorsiuni ale oaselor scheletice lungi, dureri mari i leziuni renale. Cteva mecanisme toxice pot contribui la boala itai-itai, incluznd disrupii n metabolismul vitaminei D, eliminare crescut a calciului prin urin i interferene cu metabolismul calciului i fosfatului. Este interesant de menionat c efectele scheletice nu sunt observate la muncitorii cu proteinurie datorat expunerii la cadmiu. Alte studii vaste n Europa au legat expunerea la cadmiu cu excreia urinar crescut de calciu i activitate seric crescut a fosfatazei alcaline la femei i la brbai. Prin distrugerea dentinei se ajunge la carii dentare. Expertiza produselor alimentare n cazul sacrificrilor de necesitate se confisc organele interne, capul, mamela i se dirijeaz spre prelucrare tehnic. Carnea se supune examenului toxicologic de laborator n vederea stabilirii coninutului de cadmiu. Carcasele la care sunt depite limitele maxim admise se confisc. Sacrificarea animalelor remise este permis numai dup 15 sptmni. Sngele animalelor sacrificate se confisc i se denatureaz. Glandele endocrine nu se vor folosi n industria farmaceutic sau n alt scop tehnic. Laptele se d n consum numai dup control toxicologic de laborator. Petii, molutele i crustaceele se vor supune i ei examenului toxicologic de laborator, n special dac provin din ape care conin cadmiu, chiar n cantiti mici, tiut fiind c acesta se acumuleaz n organismele acvatice. Din produsele de origine vegetal s-a ncercat ndeprtarea metalului prin splare cu ap, caz n care se ndeprteaz doar dac metalul este depus pe suprafa sub form de pulberi. Din uleiul vegetal, Ivanov i colaboratorii au ncercat s aplice diverse metode pentru a demetaliza produsele. S-a constatat c, o dat cu creterea gradului de esterificare a poliuronidelor utilizate, eficiena demetalizrii scade. Prin tratarea uleiurilor cu acid pectinic, gradul demetalizrii a fost i mai mare. Prin tratarea uleiurilor cu soluii apoase de acid pectinic,
126

s-a constatat c gradul de ndeprtare a ionilor metalici crete o dat cu scderea concentraiei acizilor pectinici n soluia apoas. Din sursa de ap, cadmiul poate fi ndeprtat eficient prin tratare cu var i coagulare cu sulfat feric, prin acest proces fiind ndeprtat peste 90% din concentraia iniial de cadmiu. Limite maxime admise Pentru aer se accept maximum 5 ng Cd/m3. OSHA (Occupational Safety and Health Administration) limiteaz concentraia cadmiului n aerul de la locul de munc la 100 g/m3 sub form de fum sau vapori i 200 g/m3 sub form de pulberi. FDA (Food and Drug Administration) limiteaz proporia de cadmiu din coloranii alimentari la 15 ppm. Pentru apa de but EPA a limitat cantitatea la 5 g/l. Coninutul maxim admis de cadmiu din furajele de origine nimal sau vegetal este ntre 1-2 mg/kg la o umiditate de 12%. Nivelele admise de cadmiu sunt prezentate n tabelul 4

Tabel 4. Nivele admise de cadmiu n alimente PRODUSUL Carne de bovine, ovine, porcine i carne de pasre Carne de cal Ficat de bovine, ovine, porcine i de pasre Rinichi de bovine, ovine, porcine i de pasre Pete Pete marin Crustacee Molute bivalve Cefalopode Cereale cu excepia grului, orezului Tre, germeni, fin Soia Legume i fructe cu excepia produselor frunzoase Produse frunzoase, ierburi proaspete Legume cu tij, rdcinoase i cartofi Limita maxim admis (mg/kg) 0,05 0,2 0,5 1,0 0,05 0,1 0,5 1,0 1,0 0,1 0,05 0,2 0,1 0,2 0,1

127

Cromul Cromul este un metal dur, lucios i rezistent la coroziune ce a fost descoperit n 1797 n Frana de Nicolas-Louis Vauquelin. Acesta este abundent n scoara terestr i apare n stri de oxidare de la Cr2+ pn la Cr6+, dar numai formele trivalente i hexavalente prezint importan biologic. Principala surs de crom provine din minereul de crom. Cromitul metalurgic este de obicei transformat n aliaj ferocromic sau alte aliaje pe baz de crom ce conin cobalt sau nichel. Srurile de crom se folosesc pentru obinerea de pigmeni sau ca anticorozive n diferite sisteme. Cromul din aer provine din surse industriale, n special din producia aliajului ferocromic, rafinarea mineurului i din procese chimice. n zonele rurale, cromul se gsete de obicei n aer n concentraii mai mici de 0,1 ng/m3 i n concentraii de la 0,01 la 0,03 g/m3 n oraele industriale. Particule din fabrici bazate pe arderea crbunilor pot conine de la 2,3 pn la 31 ppm. O alt surs important de crom atmosferic o reprezint fabricile productoare de ciment. Cromul precipit i se depune pe cmpuri sau n ape. Cromul n alimente se gsete ntr-o concentraie foarte mic iar aportul zilnic de Cr se estimeaz a fi mai mic de 100 g. Prezena cromului n alimente se poate datora contaminrii n diversele etape ale produciei. Cromul trivalent este forma cea mai ntlnit form a cromului din natur. Nu exist dovezi cum c cromul trivalent s-ar transforma n crom hexavalent n sistemele biologice. Totui cromul hexavalent trece uor prin menbranele celulelor i este redus intracelulr la crom trivalent. Cr3+ joac un rol important n metabolismul zahrului i funcioneaz prin intermediul insulinei meninnd tolerana normal pentru glucoz. n prezena unei cantiti optime de crom activ biologic este nevoie de mai puin insulin. Cromul este absorbit de organism n proporie de 0,5%. Cromul hexavalent este mult mai toxic i poate da natere, de exemplu, la alergii sau eczeme de contact i poate fi de asemenea i carcinogen. Concentraii mari de crom se gsesc de obicei n ARN dar rolul su este necunoscut. Cantiti sub form de urme de Cr3+ sunt eseniale pentru metabolismul carbohidrailor la mamifere. Are de asemenea un rol n activitile periferice ale insulinei prin formarea unui complex ternar cu receptorii insulinei, facilitnd ataarea insulinei de aceste situsuri. Deficiena de crom la oameni poate aprea la copiii ce sufer de malnutriie proteincaloric i la persoanele n vrst cu tolerana pentru glucoz afectat, dar acest lucru nu este foarte bine documentat. Consumarea prelungit a unei diete sintetice fr suplimentare cu crom poate conduce la afectarea metabolismului glucozei i posibile efecte asupra creterii i asupra metabolismului lipidelor i a proteinelor. Toxicitatea cromului Intoxicarea cu crom are loc de obicei datorit expunerii accidentale i ncercrilor ocazionale de a folosi cromul pe post de agent pentru sinucideri. Efectul acut major al cromului ingerat este necroza renal tubular acut. Expunerea la cromul folosit n industria pigmenilor de exemplu, poate produce cancer la nivelul tractului respirator. La nceputul anilor 1936 autoritile germane ce se ocupau cu sntatea public au gsit cancer pulmonar printre muncitorii expui la praful de crom. Cel mai mare risc de cancer este atribuit expunerii la cromul hexavalent solubil n acizi i insolubil n ap ce apare n procesele de coacere i rafinare. Cromul hexavalent este coroziv i produce ulceraii
128

cronice i perforaii ale septului nazal. Provoac de asemenea ulceraii cronice i aupra altor suprafee ale pielii, ceea ce este independent de reaciile de hipersensibilitate ale pielii. Reacii alergice ale pielii datorate cromului au loc foarte uor i sunt independente de doz. Dei compuii cromului covalent sunt considerabil mai puini toxici i nu sunt nici iritani, nici corozivi, muncitorii din industrie sunt expui la ambele forme. Nu este clar nc dac cromul provoac i n alte zone cancer dect la nivelul tractului respirator. Studiile pe animale sprijin faptul c cei mai posibili carcinogeni sunt compuii cromului hexavalent puin solubili. n schimb studiile in vitro pe sisteme bacteriene nu arat c ar fi vreo diferen ntre compuii solubili i cei mai puin solubili. Srurile cromului trivalent nu au sau au foarte puin activitate mutagenic asupra sistemelor bacteriale. Din moment ce este preferat absorbia cromului hexavalent de ctre celule iar forma trivalent este cea metabolic activ i se leag cu acizii nucleici n interiorul celulei, s-a sugerat c agentul cauzal n mutageneza cromului este cromul trivalent legat de materialul genetic dup reducerea formei sale hexavalente.

Concentraiile de crom din esut la populaia general prezint variaii geografice considerabile, ce ajung pn la 7 g/kg n plmnii persoanelor din New York sau Chicago cu concentraii mai mici n rinchi i ficat. La persoanele fr expunere excesiv, concentraia Cr din snge este ntre 20 i 30 g/l i este distribuit n egal msur ntre eritrocite i plasm. n cazul expunerii ocupaionale, creterea cromului din snge este legat de creterea cromului din celulele roii. Excreia urinar este n general mai mic de 10 g/zi n absena expunerii excesive. Tabel 5. Aportul mediu zilnic de crom (mg) din diet n anumite ri Aduli Femei Brbai SUA 0,012 0,019 Austria 0,031 0,038 Belgia 1992 0,053 Suedia 1988 0,020 Marea Britanie 1994 0,30 Marea Britanie 1997 0,10

Cuprul Cuprul se gsete n natur sub form de minereuri, mai frecvent sub form de cuprit (Cu2O) i malahit (Cu2CO3(OH)2). Principalele minereuri sunt sub form de sulfii, oxizi i carbonai. Cuprul a fost cunoscut, minerit i utilizat de oameni din cele mai vechi timpuri, fiind probabil al doilea, dup fier, n ceea ce privete utilitatea lui pentru oameni. Se utilizeaz intens pentru fabricarea evilor pentru ap, n special pentru uz casnic. Cuprul este utilizat i n producerea cablurilor electrice i a aliajelor cum sunt alama i bronzul. Este de asemenea
129

utilizat n galvanizare la fotografii, acoperiuri, catalizator n industria chimic i pentru ndeprtarea mercaptanilor i rafinarea petrolului. Cuprul este utilzat intens i n diverse formulri de pesticide. De exemplu, sulfatul de cupru este utilizat ca fungicid i bactericid pentru prevenirea bolilor la fructe, legume i culturile cerealiere i ca ierbicid, muloscocid i pentru controlul dezvoltrii creveilor n orezrii. Dup absorbia n fungi sau bacterii, ionii de cupru se vor lega la diferite grupe chimice (imidazol, fosfat, hidroxil) prezente n numeroase proteine i vor tulbura funcionarea acestora. Ionul toxic de cupru este absorbit de sporul germinativ al fungului, astfel c, pentru a obine rezultate optime, cuprul trebuie reaplicat pe msur ce plantele cresc, pentru a menine protecia i pentru a preveni apariia bolilor. Este utilizat i pentru conservarea lemnului i pentru tratarea apei de but i a celei din bazine. n sol cuprul se gsete n jur de 70 ppm, iar n apa de mare ntre 0,001-0,02 ppm. n apa de but, concentraia cuprului este variabil, cu medii ntre 60-150 g/l, concentraii care cresc n special n cazul apei cu pH sczut i duritate mic i care ajunge la consumator prin evile de cupru. Acestea ns nu sunt singurele variabile care influeneaz dizolvarea cuprului n ap potasiul, sodiul, hidrogenul, sulfatul, oxigenul dizolvat, clorul, nitratul i conductivitatea apei influennd gradul de solvire al cuprului n ap. Deoarece perioada de timp ct st apa n conducte este de asemenea important, cele mai relevante date privind aportul de cupru prin ap sunt furnizate de concentraia cuprului n apa consumat. Cuprul este disponibil i n majoritatea alimentelor naturale. Unii specialiti afirm chiar c aportul mediu este mai ridicat dect nevoile zilnice i c toxicitatea acestuia a devenit chiar o problem. Alimente cu coninut ridicat de cupru sunt cerealele, n special grul i hrica, creveii i fructele de mare, ficatul i alte organe interne, fasolea i mazrea uscat, nucile, alunele, soia, fructele uscate, cacaoa, piperul negru i drojdia. Stridiile conin cantiti mari de Cu, de aproximativ cinci ori mai mult dect alte alimente. n alimentele procesate sau pstrate n vase cu aliaje din cupru, concentraia acestuia este mare, cuprul fiind solvit, n special n alimentele acide. Cuprul este esenial n alimentaia mamiferelor, fiind necesar n numeroase reacii enzimatice. Este esenial n pentru utilizarea normal a fierului, datorit necesitii feroxidazei (ceruloplasminei) pentru transportul fierului. Deficiena cuprului (sub 2 mg/zi) duce la anemie, rezultat prin incapacitatea reticulocitelor de a obine fier de la transferine i de a sintetiza hemul din fier i protoporfirine la o rat normal. Clinic se traduce prin anemie hipocrom, microcitar, refractar la fier i prin susceptibilitate la infecii. Deficiena este uneori nsoit de anomalii osoase.

130

Hem B

Hem A

Alte sisteme enzimatice care necesit cupru includ monoaminooxidazele, necesare pentru pigmentare, controlul neurotransmitorilor i a neuropeptidelor; liziloxidaza, esenial pentru meninerea esuturilor de legtur din pulmoni, oase i a elastinei din sistemul cardiovascular, citocrom c oxidaza, implicat n metabolismul oxidativ, funcionarea creierului, sinteza hemului i a fosfolipidelor i superoxid dismutaza, necesar pentru distrugerea radicalilor superoxid. Exist i cteva boli genetice care afecteaz utilizarea cuprului, acestea fiind sindromul Menke, boala Wilson i aceruloplasminemia. Anomaliile genetice asociate primelor dou boli au fost identificate a fi defecte ale ATP-azelor de tip P. Aceruloplasminemia este o tulburare autosomal recesiv determinat de modificrile n gena ceruloplasminei, care afecteaz abilitatea ceruloplasminei de a lega cuprul. Ca urmare, n sindromul Menke, absorbia intestinal a cuprului este foarte sczut, ceea ce duce la acumularea acesteia n mucoasa intestinal i, adesea, la moarte. n sindromul Wilson tulburrile de metabolizare a cuprului conduc la concentraii mici de cupru n ser i n pr, dar nivele ridicate n ficat i creier. Toxicitatea cuprului Toxicitatea cuprului este dependent de specie, tipul de compus, calea de ptrundere n organism i raportul cu alte microelemente din raie. Cei mai toxici compui sunt srurile mai solubile. DL50 pentru obolani sunt ntre 30 i 472 mg/kg. Rspunsuri toxice la oameni au fost observate la doze de 11 mg/kg. Ingestia sulfatului de cupru este adesea netoxic, deoarece se declaneaz automat voma, ca urmare a efectului iritant asupra tractului gastrointestinal. Moartea se poate produce la ingestia a ctorva grame de sulfat de cupru. Toxicocinetica Cile de ptrundere a cuprului n organism sunt calea oral, cu apa i alimentele contaminate n urma tratamentelor la care au fost supuse sau ca urmare a pstrrii n vase de cupru, calea respiratorie i dermic, n special n special n cazul muncitorilor expui profesional.

131

Dup ptrunderea pe cale, cea mai mare parte a cuprului este absorbit la nivelul stomacului i duodenului. Concentraia maxim a cuprului n snge a fost observat n intervalul 1-3 ore dup ingestie. Eficiena absorbiei este ntre 15-97%. Absorbia cuprului se realizeaz att prin mecanisme active, ct i pasive. La aport sczut i moderat de cupru, acesta este absorbit prin mecanisme de transport active saturabile, iar la aport ridicat este absorbit prin difuzie pasiv. Factorii care pot interfera cu absorbia cuprului includ competiia pentru situsurile de legare cu zincul, interaciunile cu molibdenul, manganul i sulfaii, chelatarea cu fitaii i inhibarea cu acidul ascorbic. Cuprul absorbit din tractul gastrointestinal este transportat rapid n snge i depozitat n ficat, legat de metalotioneine, din care este eliberat i ncorporat n ceruloplasmine, un transportor specific pentru cupru. Cu2+ care rmne n snge este legat la albumine sau aminoacizi sau la eritrocite. Aproximativ 80% din cuprul absorbit este legat de metalotioneinele din ficat, iar restul este ncorporat n citocrom c oxidaza sau este sechestrat de ctre lizozomi. Cuprul, sub form de Cu2+, atunci cnd intr n hepatocite este iniial redus i complexat de ctre glutation nainte de legarea la metalotioneine. Alternativ, cuprul care intr n celule poate fi exportat de ctre cupru-ATP-translocaza. Distribuia cuprului este influenat de sex, vrst i de nivelul su din raie. Creierul i ficatul prezint concentraia cea mai mare (aproximativ o treime din cantitatea total din organism), concentraii mai mici fiind gsite n inim, splin, rinichi i snge. Nivelul cuprului din eritrocite este foarte stabil, n timp ce concentraiile plasmatice prezint fluctuaii mari, n legtur cu sinteza i eliberarea ceruplasmei. Nivelul plasmatic al cuprului n timpul sarcinii poate fi de dou ori mai mare dect nainte, datorit sintezei crescute de ceruloplasmine. Sursa cuprului suplimentar este ficatul. Estrogenii par a fi agenii stimulatori de eliberare a cuprului din ficat. Principala cale de eliminare a cuprului este calea biliar i apoi fecalele. Alte ci minore sunt saliva, transpiraia i laptele. Timpul de njumtire a cuprului n organism este foarte scurt, astfel nct acesta nu are tendina de acumulare. Efectele patogene i simptomatologia Intoxicaia acut cu cupru este rar la mamiferele superioare, avnd n vedere aciunea emetizant puternic a acestuia. La oameni, toxicitatea acut este de obicei corelat cu ingestia accidental; simptomele includ gust metalic n gur, grea, vom, durere epigastric, diaree, icter. n cazuri grave, fecalele i saliva sunt verzi-albastre. n fazele terminale, anemia, hipotensiunea i coma preced moartea. Indivizii cu deficien de glucuzo-6-fosfat-dehidrogenaza pot prezenta risc crescut n ceea ce privete efectele hematologice ale cuprului. Efectele gastrointestinale ale cuprului au fost investigate n mai multe studii, care au pus n eviden o corelaie ntre concentraia cuprului i incidena simptomelor
132

gastrointestinale, n timp ce ali indicatori ai homeostaziei cuprului, cum sunt nivelurile serice i cele ceruloplasminice i statutul ficatului nu s-au modificat semnificativ. Riscul de aport prin raie de peste 5 mg Cu/zi pare s fie mic. Se tie doar c viticultorii care aplic sulfat de cupru dezvolt boli de ficat dup 3-15 ani de expunere la astfel de soluii, indivizii mai expui, n afar de cei cu deficit de glucuzo-6-fosfatdehidrogenaz, fiind cei cu boala Wilson, care duce la absorie i depozitare excesiv de cupru. Variaii mari au fost raportate n ceea ce privete susceptibilitatea la cupru a diferitelor specii de animale, cele mai sensibile fiind oile, iar cei mai puin sensibili fiind obolanii. EPE a clasificat cuprul n grupa D-neclasificabil ca i carcinogen uman; nu produce genotoxicitate, iar studiile efectuate n ceea ce privesc efectele reproductive i de dezvoltare nu au evideniat vreo corelaie ntre prezena cuprului i astfel de efecte. La doze mari s-a constatat moarte fetal i numr mic de nou nscui la oarece.

133

Tratamentul cu chelatori Tratamentului de chelare implic utilizarea de compui chimici injectat n fluxul de snge, musculare sau luate de gura pentru a lega metale, care sunt prezente n concentraii toxice astfel nct s poat fi eliminat (de obicei n urin) din organism. Care sunt utilizrile legitime pentru tratament chelator? Tratamentului de chelare este indicat medical atunci cnd niveluri toxice de metale grele, cum ar fi de fier, arsenic, plumb, mercur i sunt prezente. n timp ce fierul este un metal vital alte metale (arsenic, plumb, mercur i) nu sunt cerute de organism. Toxicitatea plumbului apare cel mai frecvent cu copii mai mici expusi la case vechi cu praf vopsea cu plumb sau chips-uri. Expunerea profesional (sudori de lipit,, topitorii, baterie regenerare) este, de asemenea, un risc. Screening-ul de plumb pentru copii a devenit acum o parte standard a vizita un medic pentru copii n statele membre pot. Mercur toxicitate apare aproape ntotdeauna cu expunerile la risc ridicat de munc, inclusiv lucrtorilor dentare, producatori de baterii / termometre, lucru tbcrie / taxidermie, i fructe de mare contaminate. ntoxicaia cu arsen apare, de obicei de la expunerea la insecticide, erbicide, otrvuri roztoare, medicamente veterinare parazitare, sau otrvire intenionat. Alte metale grele, menionat doar n trecere, deoarece expunerea la substante toxice este extrem de puin frecvente, includ: cadmiu, aluminiu mangan, cobalt, zinc, nichel, cupru i magneziu. Toxicitatea metalelor grele poate provoca o gam larg de probleme, inclusiv leziuni grave la organele corpului i a creierului. Ageni de chelare: mesilat Desfuroxamine: utilizate pentru toxicitate de fier, pe cale intravenoas preferat de administrare. Dimercaprol (BAL): agent de plumb, arsenic i preferat pentru toxicitate mercur, administrat intramuscular DMSA: un analog de Dimercaprol care poate fi administrat oral timp de intoxicare cu plumb i arsenic D-penicilamina: o cale orala Chelatori utilizate pentru plumb, arsenic, mercur sau otravire. Mult mai puin costisitoare, dar nu la fel de eficient ca DMSA. calciu disodiu Versante (CaNa2-EDTA): pot fi folosite n conjuncie cu BAL n toxicitate plumb. Nu a folosit niciodat singur n tratarea toxicitate chelai de plumb, deoarece numai extracelular, duce nu intracelulare. Diagnosticul de toxicitate metale grele este grav i trebuie s fie fcut de un medic pe baza simptomelor clinice n legtur cu testele de laborator. Ageni de chelare sunt potenial toxici i nu ar trebui s fie utilizai dect dac este absolut indicat. Toi agenii de chelare au att minore si pune viata in pericol efecte secundare. Acestea trebuie s fie utilizate sub supravegherea unui medic ntr-un cadru spital.Efectele secundare ale CaNa2-EDTA includ: 2 Ne concentrm pe CaNa2-EDTA, pentru c este de departe cel mai frecvent utilizate agentului de chelare promovate de ctre practicanii vraci pentru alte utilizri dect intoxicatii
134

dovedit metale grele. Trebuie amintit faptul c, dei CaNa2-EDTA a fost unul dintre agenii de dispoziie pentru prima dat, nu mai este tratamentul de alegere pentru orice toxicitate de heavy metal. Care sunt creane vraci pentru tratament chelator? 1 Dup ce EDTA a fost gasit eficace in chelator i ndeprtarea metalelor toxice din sange, unii oameni de stiinta a postulat c arterele intarit ar putea fi nmuiat n cazul n care de calciu in peretii lor a fost eliminat.Prim indiciu care ar putea beneficia de tratament EDTA pacientii cu ateroscleroza a venit de la Clarke, Clarke, i Mosher, care, n 1956, a raportat c pacienii cu boli vasculare periferice ocluzive au spus ca simtit mai bine dup tratamentul cu EDTA. n 1960, Meltzer et al, care au studiat zece pacieni cu angin pectoral., A raportat c nu au existat dovezi obiective de mbuntire n oricare dintre ele care ar putea fi atribuit la cursul tratamentului de chelare EDTA. Cu toate acestea, n urmtoarele dou luni, cei mai multi pacienti au inceput de raportare neobinuite ameliorare a simptomelor lor. Determinat de aceste rezultate, Kitchell et al. studiat efectele de chelare, la 28 pacieni suplimentare i bazeze pe reevaluarea cursul celor zece pacieni a utilizat n procesul iniial [2]. Ei au descoperit c, dei 25 din cele 38 de pacienti au avut expuse modele de mbuntit anginoase i jumtate au artat mbuntiri n practicile electrocardiografice cteva luni dup tratament au nceput, aceste efecte nu au fost de durat. La momentul raportului, 12 din cele 38 au murit i doar 15 au raportat simti mai bine. (Aceast "mbuntire", nu a fost semnificativ, cu toate acestea, pentru c nu era mai bun dect s-ar fi ateptat cu metode dovedite i pentru c nu a existat nici un grup de control pentru comparaie.) Kitchell et al. a concluzionat c chelatizare EDTA, aa cum este folosit n acest studiu, a fost "nu este un instrument util clinic n tratamentul bolii coronariene." Susintorii susin c tratamentului de chelare este eficient impotriva aterosclerozei, boala coronariana, si boli vasculare periferice. Beneficiile sale ar trebui sunt multiple i includ cresterea circulatiei sanguine colaterale; grosime de snge a sczut; mbuntirea funciei celulelor membrana; imbunatatit intracelular organelle funcie; a sczut vasospasm arterial; a sczut formarea radicalilor liberi, inhibarea procesului de imbatranire; inversare a aterosclerozei, scdere n angina; inversare de cangrena, mbuntirea de culoare a pielii, de vindecare a ulcerului diabetic. Unii susin de asemenea c chelare este eficace mpotriva artrita, scleroza multipla, boala Parkinson, psoriazis, boala Alzheimer, precum i probleme cu vederea, auzul, mirosul, coordonare musculara, si potenta sexuala. Cerere primar n prezent la mod este faptul c de chelare a dizolva depozitele de calciu prezente in placi, care bloca si va infunda arterele. Nu exist absolut nici un agent cunoscut faptul ca poate sa "dizolve" placi aterosclerotice i invers ", de rigidizarea arterelor Aceste placi sunt foarte complexe i constau de ingrosare a peretelui muscular al arterei n plus fa de calciu i de depozite de colesterol.. Dac a existat o magie poiune ar fi un pariu sigur c companiile farmaceutice i medicii de legitime ar fi o folosesc! n plus, CaNa2-EDTA este eficient numai n chelare metale grele extracelulare (care a gasit dizolvat n snge i alte fluide ale corpului in afara de celule).
135

Diverse studii au fost citate de ctre suporterii tratamentului de chelare pentru ateroscleroza, cu toate acestea, niciuna dintre aceste beneficii susinut a fost demonstrat de bine concepute studiile clinice. concluzie Tratamentului de chelare ar trebui s fie folosite numai pentru toxicitate de heavy metal care a fost diagnosticat de un medic de renume. Nu are nici un loc n inversare sau de prevenire a aterosclerozei, angin pectoral, hipertensiune arterial, circulaie proast sau alte cardiovasculare (boli cardiace). CaNa2-EDTA se pot infiltra n alte metale eseniale, cum ar fi fier, zinc, cupru i magneziu din snge provoac efecte adverse asupra sntii n timp ce care nu au nici un efect asupra placi calcifiata aterosclerotice. Dei nu dorim pentru a minimiza problemele cauzate de toxicitate de metale grele, n general, aceasta este destul de rar i necesit n mod normal expunerii specifice sau factori de risc. Marea majoritate a oamenilor nu vin n contact semnificativ cu metale grele toxice. n cazul n care persoana solicita afacerea dvs., susinnd c toxicitatea metalelor grele, ar putea fi o problema pentru tine i vrea s fac testarea i tratamentul sfatul nostru este s se ntoarc i a alerga. Dac suntei n cauz s-ar putea fi factori de risc sau a expunerii la metale grele toxice vizita un medic de renume. Bibliografie Chelation Therapy- Unproven Claims and Unsound Theories" by Saul Green, Ph.D. @: http://www.quackwatch.com provides a comprehensive review of chelation therapy well worth reviewing for those interested in learning more) Heavy Metals.by Marsha D. Ford in: Emergency Medicine- A Comprehensive Review, 4th ed., Tintinalli, JE., Ruiz, E., and RL. Krome editors, 1996, pp.833-841 Graeme KA, Pollack CV Jr. 1998 Jan-Feb;16(1):45-56. Heavy metal toxicity, Part I: arsenic and mercury. J Emerg Med. Graeme KA, Pollack CV Jr.Heavy metal toxicity. I: arsen and mercury. J Med Emerg. 1998 16 (1) :45-56. THOMAS F. Criminal poisoning by administration of a douche of corrosive sublimate. Ann Med Leg Criminol Police Sci Toxicol. 1953 Apr-May;33(2):123-9. AUGUSTINE JR. Mercury bichloride (corrosive sublimate) poisoning. Can Med Assoc J. 1956 Mar 1;74(5):371-2. MONTUSCHI E. Mercuric chloride poisoning treated with dimercaprol. Br Med J. 1953 Sep 5;2(4835):545. Arena JM. Treatment of mercury poisoning. Mod Treat. 1971 Aug;8(3):619-25.

CAP.V.OTRVURIFOARTEPUTERNICE
136

ACIDULCIANHIDRIC Acidul cianhidric, HCN, este un lichid incolor n stare pur care, la 26 oC, se transform ntr-un gaz incolor, cu miros uor de migdale amare. Este uor solubil n ap i miscibil n orice proporie cu majoritatea solvenilor organici.Are un miros specific de migdale amare care este perceput la o concentraie de 1g/l aer, n funcie de sensibilitatea personal. Este folosit n silozuri pentru combaterea roztoarelor i insectelor. Ca gaz de lupt nu mai este utilizat deoarece se disperseaz rapid n atmosfer. Poate fi uor obinut din srurile sale prin tratare cu acizi tari, deoarece acidul cianhidric este un acid slab ce poate fi uor deslocuit din acestea. Ferocianura de potasiu este inofensiv i se utilizeaz n agricultur i n alte domenii fr niciun risc. In prezena acidului sulfuric ce poate fi procurat uor de la bateriile de automobil, aceasta elibereaz acid cianhidric, volatil i otrvitor. Srurile sale, cianura de sodiu (mai rar folosit n tehnic datorit higroscopicitii sale) i cianura de potasiu (utilizat la extracia aurului, galvanoplastie, etc.) sunt otrvitoare provocnd moartea unui om adult n cantiti de 100-200 mg. Toxicocinetic. Acidul cianhidric se absoarbe repede pe cale respiratorie (sub form de gaz), transcutanat (mai lent) i digestiv. Cianurile alcaline ptrund prin ingerare i transcutanat (aciune coroziv asupra tegumentelor care favorizeaz ptrunderea). Se distribuie n toate esuturile, dar nu se acumuleaz. Metabolizarea major (80%) se realizeaz prin detoxicare la sulfocianur, SCN, cu toxicitate redus, sub aciunea rodanazei (tiosulfat: cianurisulftransferaza). Se consider c sulful provine din aminoacizii sulfurai, iar cedarea sulfului se realizeaz prin intermediul tiosulfatului; de asemenea c rodanaza are o grupare disulfur
S E S
2+ S2O3

S E S

SO3

2-

CN-

S E S
2+ SO3 + SCN-

activ: Eficiena reaciei de detoxicare este limitat de cantitatea redus de rodanaz din organism. Cile secundare de metabolizare (20%) includ: reacia cu cisteina; oxidarea la HCNO, apoi la CO2 ; hidroliza la HCOOH; formarea de ciancobalamin. Numai o parte mic se elimin ca atare pe cale respiratorie. Toxicodinamie. Toxicitatea acidului cianhidric se datorete capacitii ionului CN de a inhiba un numr mare de enzime tisulare, n special a citocromoxidazei, mpiedicnd astfel utilizarea oxigenului molecular de ctre celule n procesul respiraiei celulare. ntr-o prima faz a lanului respirator are loc transferul hidrogenului i a ionilor de hidrogen, H+, de la substrat, iar n faza a doua, are loc transferul electronilor (e) cu ajutorul citocromilor, ntr-o ordine dependent de potenialul lor redox. Intervine nti citocromul b, apoi citocromii c i, n final, citocromoxidaza (cit.a + cit.a3), cnd oxigenul activat(1/2 O22) se unete cu 2 H+ pentru a forma ap. Ionul cian inhib citocromoxidaza prin blocarea Fe3+, ntrerupnd lanul respirator i deci mpiedicnd utilizarea oxigenului de ctre celule, ceea ce conduce la asfixie celular. Sngele rmne saturat cu oxigen, ceea ce explic culoarea roie-viinie a pielii n
137

intoxicaia acut fatal cu HCN. Complexul cian-citocromoxidaz disociaz pe msur ce ionul CN este detoxicat la SCN. Ionul cian se combin i cu hemoglobina, dar n proporii foarte mici, lipsite de importan toxicologic. Acesta reacioneaz cu MetHb cu formare de CNMetHb (cianmethemoglobin); MetHb are afinitate mai mare pentru CN dect ciancromoxidaza, iar CNMetHb este mai puin toxic dect CN. Dac doza nu este fatal, ionul CN este eliberat progresiv de ctre citocromoxidaz sau methemoglobin i transformat n tiocianat, compus netoxic care se elimin prin urin.
CNSCNExcreie

Cisteina

Rezerva de CNHCN HCNO expiraie HCOOH

Ciancobalamina Metabolit C 1

Acid 2-imino-4tiazolin-carbonic

Excreie urinar

CO2

Excreie urinar

Toxicocinetic: metabolizarea ionului cian (dup Goodman si Gilman)

Doza letal (ingerare) este 100 mg pentru HCN i 200 mg pentru NaCN i KCN. O concentraie de peste 270 mg/m3 este mortal. Expunerea la concentraii mari de vapori (peste 300 mg/m3) de HCN provoac intoxicaia supraacut cu evoluie mortal n cteva minute. Intoxicatul prezint ameeli, palpitaii i dispnee, urmate de com, convulsii, stop respirator i stop cardiac. Expunerea la concentraii mari, ntre 150 i 300 mg/m3, provoac intoxicaia acut, curabil. Primele semne constau n gust amar, senzaie de sufocare, ameeli, dureri intense de cap, slbiciune muscular i stare confuzional, la care se adaug hipersalivaie, grea, vrsturi i dispnee. Aceast simptomatologie dispare dac victima prsete locul accidentului. Expunerea la concentraii mici de HCN (25-65 mg/m3) provoac cefalee, vrsturi, tulburri de echilibru i uneori confuzie mintal. Fenomenele dispar n cteva ore dup ce bolnavul a prsit mediul poluat. Inhalarea n doze subletale (sub 20 mg/m3) este curabil numai dac intoxicatul a fost scos imediat din mediul toxic i dac tratamentul s-a aplicat ct mai repede posibil, chiar la locul accidentului.
138

Recomandri: persoanele care urmeaz s lucreze cu HCN trebuie s fie instruite asupra pericolelor la care sunt expuse; trebuie s existe n dotarea laboratorului sau seciei suficiente aparate pentru protecia respiraiei; este necesar ca ncperile n care se lucreaz cu HCN s fie nzestrate cu un sistem de detectare automat i semnalizare a concentraiilor nocive, precum i un numr suficient de aparate de tip Drger pentru detectare; instalaiile n care se produce HCN s fie perfect etane; ventilaia din laboratoarele sau ncperile de lucru trebuie s fie foarte eficace; ncperile n care se pot acumula cantiti mai mari de HCN, trebuie s fie prevzute cu o instalaie de stropire cu ap pentru captarea vaporilor de HCN; apele reziduale i de splare trebuie tratate nainte de a fi deversate n sistemul de canalizare. Distrugerea HCN se poate efectua prin introducerea clorului cu adugare simultan de alcalii sau prin reacie cu alcalii i sruri de fier. Procesul trebuie controlat prin analize, meninndu-se un pH de minimum 11; interveniile n instalaii trebuie s fie executate numai cu aprobarea conductorului de lucrare sau de secie. n toate cazurile se folosete materialul de protecie necesar, inclusiv masca cu cartu adecvat; nainte de intervenie, toate componentele instalaiei vor fi splate cu o mare cantitate de ap. Dac se folosesc alcalii, locul se va neutraliza cu acid diluat i apoi se va spla cu o mare cantitate de ap cald; fumatul, utilizarea luminii deschise i a flcrilor vor fi strict interzise; instalaia electric din laboratoarele de lucru va fi de tipul antiex; spaiile de lucru vor fi prevzute cu duuri i dispozitive de splare a ochilor prin pulverizare cu ap. Primul ajutor: intervenia de prim ajutor comport extrem urgen; accidentatul va fi scos imediat din zona contaminat i dus ntr-o ncpere cald i bine ventilat; ndeprtarea hainelor i decontaminarea tegumentelor cu ap i spun; inhalarea imediat de nitrit de amil 1 fiol (pe compres); operaia se repet din 5 n 5 minute, cel mult 20 minute; se va evita asfixierea prin cderea limbii, resturi alimentare etc; n caz de stop respirator se face respiraie artificial cu oxigen pur (este contraindicat respiraia gur la gur), concomitent cu inhalarea de nitrit de amil 1 fiol (pe compres), care se repet din 5 n 5 minute, cel mult 20-25 minute; n intoxicaia prin ingestie se va proceda astfel: inhalarea imediat de nitrit de amil o fiol (pe compres); operaia se repet din 5 n 5 minute, cel mult 25 minute; spltur gastric cu KMnO4 1/5000, H2O2 3% i Na2S2O3 1%;
139

 cnd spltura gastric nu este posibil, se recomand ingerarea de cantiti mari din aceleai soluii, urmat de provocarea de vrsturi; administrarea de purgative saline; oxigenoterapie; se va anuna medicul care va conduce mai departe tratamentul necesar. Analiza toxicologic folosete: hrtie indicator bazat pe reacia de formare a ferocianurii ferice albastre; detectare cu tuburi indicatoare Drger; dozare argenimetric. Se recolteaz aerul ntr-un vas absorbant care conine o soluie de AgNO3 N/20 acidulat cu HNO3, efectundu-se apoi dozarea gravimetric sau volumetric prin metoda Volhardt; dozarea colorimetric a izopurpurinei formate prin captarea acidului cianhidric ntro soluie de acid picric i alcalinizare cu Na2CO3. Compararea se face cu o scar etalon artificial de bicromat de potasiu,; metoda bazat pe transformarea n bromcian i apoi aldehid glutaconic, urmat de cuplarea cu acid barbituric i spectrofotometrare; reacia Schnbein hrtia mbibat cu soluie de CuSO4 i tinctur de guaiac se coloreaz n albastru; reacia Castaldi hrtia mbibat cu soluie de acetat cupric i benzidin se coloreaz n albastru; din medii biologice (corpuri delicte) se izoleaz prin distilare n mediu de acid tartric; se capteaz distilatul n NaOH i se identific CN prin reacia Liebig (formarea tiocianatului feric) i prin reacia Chelle (formarea albastrului de Prusia). Cteva cazuri de otrvire. Cianura determin hipoxie intracelular datorit legrii reversibile de citocrom oxidaza mitocondrial. Semnele i simptomele intoxicaiei cu cianur apar de obicei n mai puin de 1 minut dup inhalare i n cteva minute dup ingestie. Manifestrile precoce includ anxietate, dureri de cap, ameeal, incapacitatea de concentrare i midriaz (Hamel, 2011). Dac hipoxia progreseaz, scade nivelul de contiin, apar convulsii i com. Pielea poate arata normal sau uor cenuie, iar saturaia cu oxigen arterial poate fi normal. Tratamentul n Statele Unite l reprezint antidotul pentru cianur cu hidroxicobalamin. Hidroxicobalamina detoxific cianura prin legare cu aceasta i excretare prin urin a ciancobalaminei netoxice. Pentru c reacioneaz cu cianura fr s formeze methemoglobin, hidroxicobalamina poate fi utilizat pentru a trata pacienii, fr a compromite capacitatea de transport a oxigenului de ctre hemoglobin. Un brbat n vrst din Sri Lanka a fost njectat cu o sering n abdomen n timp ce doarmea. Acesta a dezvoltat progresiv insuficien respiratory i com i a murit o or mai trziu (Abeyasinghe et al. 2011). Constatrile de autopsie i a analizelor de laborator au confirmat moartea ca fiind cauzat de intoxicaia cu cianur. Astfel cianura poate fi mijlocul de asasinat n cazul n care se observ o moarte rapid cu insuficien respiratorie progresiv, dup injectarea unei substane necunoscute. In suicidare, accident i crim ste frecvent intoxicaia cu cianur prin ingestie nu prin injectare.
140

Au mai fost studiate 17 sinucideri cu cianur n New York ntr-un interval de zece ani (Gill et al. 2004). Au predominat oamenii de tiin, bijutieri i lucrtori n metal. Paisprezece din cele 17 victime au fost brbai. S-a folosit un test de culoare pentru screening-ul pentru cianur cu confirmare i determinare cantitativ prin cromatografia de gaz. A fost prezentat un caz de sinucidere mai puin obinuit prin ingerarea oral de cianur de potasiu i inhalare de HCN (Musshoff et al. 2011). Un comerciant de 48 de ani a fost gsit mort n maina sa. Un miros penetrant de migdale amare a fost observat la deschiderea uilor. Un aragaz de camping i o oal de gtit care conineau cantiti mari de cristale albastre inchis au fost gsite n zona picioarelor n main. O pulbere alb a fost gsit pe degete i n jurul gurii. n plus, s-au gsit flacoane care conin tipuri ferocianur de potasiu i diferii acizi, mpreun cu informaii de pe internet, despre ferocianur i cianur de potasiu. La autopsie s-au observat hemoragii i eroziuni ale mucoasei tractului respirator, esofagului i stomacului. Concentraiile de cianur au fost 0,2 mg / l n coninutul stomacal, 0,96 mg / kg n esutul cerebral, 2.79 mg / kg n plmni i 5,3 mg / l n snge. Acest caz se refer la o persoan care nu a fost familiarizat cu substane chimice, dar care obine informaii profesionale prin intermediul internetului, pentru o sinucidere complex. Antidoturi. Compuii care conin grupri carbonilice pot reaciona uor cu cianurile (Moore et al. 1986). Acidul piruvic, un acid alfa-cetocarboxilic, are efecte antagonice fa de cianur. Se sugereaz c mecanismul su de aciune se bazeaz pe capacitatea sa de a reaciona cu cianuri. Acidul alfa-ketoglutaric, de asemenea, un acid alfa-cetocarboxilic, a fost evaluat pentru capacitatea sa de a contracara efectele letale de cianur (Bhattacharya et al., 2001.). Acesta a crescut valoarea DL50 pentru cianur (6,7 mg / kg) de cinci ori, o valoare statistic echivalent cu cea constatat la soareci pretratai cu tiosulfat de sodiu i nitrit de sodiu. Amestecul de acid alfa-cetoglutaric i tiosulfat de sodiu a crescut valoarea DL50 a cianurii la 101 mg / kg. Adaosul de nitrit de sodiu la acidul alfa-cetoglutaric i tiosulfat de sodiu a crescut valoarea DL50 a cianurii la 119 mg / kg. Spre deosebire de nitrit de sodiu, nu induce formarea de methemoglobin. Reiese din aceste studii c administrarea de acid alfa ketoglutaric i tiosulfat de sodiu conduce la mai puine decese fr formarea de methemoglobin care este periculoas. Au fost propuse o serie de promedicamente bazate pe 3-mercaptopiruvat ca substrat pentru enzima 3-mercaptopyruvate/cyanide (3-MPST) sulfurtransferaz, care convertete cianura la tiocianat netoxic (Nagasawa et al. 2007). Aceste promedicamente, care sunt foarte eficiente antidoturi pentru cianur, sunt unice fiind luate pe cale oral, dar pot fi administrate pn la o or nainte de cianur ca agent profilactic, putnd fi administrate i parenteral. Toxicologia analitic a acidului cianhidric Izolare. HCH se izoleaz din aer n soluii absorbante, iar din produse biologice i alte produse, prin distilare n mediu slab acid. Identificare. Depistarea mirosului de migdale amare, procedeul nu este recomandat, fiind riscant. Identificarea se face din aer, coninut stomacal, organe, snge. Se execut cu ajutorul
141

hrtiilor indicatoare; n cazul organelor (coninut stomacal), hrtiile se suspend pe capacul recipientelor n care se gsesc produsele, avnd grij s nu vin n contact cu acestea. Reacia Schnbein: hrtia mbibat cu sulfat de cupru 0,05%, apoi cu guaiac 4% n alcool, se coloreaz n albastru n prezena acidului cianhidric. Reacia se bazeaz pe proprietatea acidului cianhidric de a mri potenialul oxidant al cuprului, care singur nu oxideaz guaiacul, dar n prezena acidului cianhidric l oxideaz la ozonid guiaconic, dup reaciile: CuSO4 + 2 HCN = Cu(CN)2 + H2SO4 2 Cu(CN)2 + H2O = Cu(CN)2 + 2 HCH + [O] Reacia este sensibil (1/300000), aproape instantanee, dar nespecific, fiind dat i de substanele oxidate (clor, ozon, etc.). Reacia Castaldi: hrtia mbibat n acetat de cupru 0,28% i apoi n acetat de benzidin 0,5%, se coloreaz n albastru n prezena acidului cianhidric. Reacia se bazeaz pe o dismutaie cu formare de oxigen n stare nscnd, care oxideaz benzidina la produsul merichinoic, albastru: Cu(CH3-COO)2 + 2 HCN = Cu(CN)2 + 2CH3-COOH 2 Cu(CN)2 + H2O = Cu2(CN)2 + 2 HCH + [O]

NH2

NH2

+ 2 CH3-COOH +[O]

NH2

NH2

CH3-COOH + H2O
NH NH

Reacia este sensibil, dar nespecific. Reacia Guignard: hrtia tratat cu acid picric 1%, uscat, apoi cu Na2CO3 5% i uscat la temperatura camere se nroete prin formarea izopropanolului n prezena acidului cianhidric, conform reaciei: ONa
ONa O2N NO2
O2N NO2

O2N

NCN 2

+ 3NaCN + H2O

+ NaNCO + 2NaOH

Reacia este specific, sensibil, dar se desfoar lent. Reacia Chelle Regnier se bazeaz pe oinerea albastrului de Prusia (albastru de Berlin). La 5 ml distilat se adaug o pictur soluie fenoftalein, apoi se aciduleaz cu H2SO4 0,1 N i se realcalinizeaz net cu borax, pn la apariia culorii roz (dac culoarea dispare, se mai
142

adaug borax); se adug cteva picturi de FeSO4 2%, apoi se aciduleaz uor cu 4 5 picturi HCl conc. Apare o coloraie albastr datorit formrii ferocianurii ferice. Reaciile care au loc sunt: 2 NaCN + FeSO4 = Fe (CN)2 + Na2SO4 Fe (CN)2 + 4 NaCN = Na4[Fe(CN)6] 6 FeSO4 + 3/2 O2 + 3 H2O = Fe(SO4)3 + 2 Fe(OH)3 3 Na4[Fe(CN)6] + 2 Fe(SO4)3 + Fe4[Fe(CN)6]3 + 6 Na2SO4 Sensibilitatea reaciei este de 1/ 100000. Pentru a mri sensibilitatea, se adaug o pictur de BaCl2, cnd se formeaz BaSO4, care se depune i antreneaz colorantul albastu de Prusia (de Berlin). Reacia s-ar putea executa i cu FeCl3, ns excesul de FeCl3 confer soluiei o culoare galben, care mascheaz culoarea verzuie a concentraiilor mici de albastru de Berlin. Reacia Liebig de formare a sulfocianurii ferice, se realizeaz nclzind la fierbere soluia de analizat cu cteva picturi de polisulfur de amoniu 10%, cnd se formeaz sulfocianura de amoniu. Se aciduleaz cu acid clorhidric pentru distrugerea excesului de polisulfur, se filtreaz i se trateaz cu FeCl3 1% (soluie proaspt preparat), cnd apare o coloraie roie datorit sulfocianurii ferice. Reacia este specific: CN- + (NH4)2S2 SCN- + (NH4)2S 3SCN- + Fe3+ Fe(SCN)3 Reacia cu azotat de argint: se trateaz soluia de analizat cu cteva picturi de AgNO3 1%, cnd se formeaz un precipitat alb, insolubil n acid azotic, solubil n cianur alcalin. n exces de azotat de argint apare un precipitat alb de diciano argintat de argint: KCN + AgNO3 = AgCN + HNO3 AgCN + KCN = K[Ag(CN)2] K[Ag(CN)2] + AgNO3 = Ag[Ag(CN)2] + KHO3 Reacia Dnigs se realizeaz cu azotat de argint i iodur de potasiu: ionul CN- formeaz cu AgNO3, AgCN solubil n amoniac, iar excesul de AgNO3 reacioneaz cu KI dnd AgI galben, insolubil n amoniac. KCN + AgNO3 = AgCN + HNO3 AgCN + 2 HN3 = [Ag (NH3)2] CN KI + AgNO3 = AgI + KNO3 Reacia de formare a bromurii (clorurii) de cianogen: ionul CN- formeaz cu apa de brom (clor), bromur (clorur) de cianogen. Aceasta se combin cu nucleul piridinic, deschizndul, cu formare de aldehid glutaconic, care se cupleaz cu diamine aromatice (de exemplu: benzdina), obinndu-se baza Schiff, roie (tehnica Truhaut) sau cu antipirina dimetilic, dnd culoare albastr (tehnica Epstein). + ClCN + 2H2O
N CN CN
+

+ H2N-CN + HCl CH
HC

CH CH OH

O CH
143

aldehida glutaconica
CH
HC

+ 2H2N-Ar-Ar-NH2
CH CH OH
H2N Ar Ar
HC

CH

+ H 2O
CH CH NH Ar Ar NH2

O CH

CH N

Dozarea spectrofotometric a acidului cianhidric din aer Metoda Chelle Regnier. Principiu metodei se bazeaz pe reacia ionului de cianur cu sulfatul feros cu formare de ferocianur de potasiu care, tratat cu o sare feric, formeaz albastru de Berlin, colorimetrabil. Reactivi: 1. Soluie absorbant NaOH, 0,1 N. 2. Soluie alcoolic de fenoftalein 1%; 3. Acid sulfuric 0,1 N. 4. Soluie saturat de borax: se dizolv prin nclzire 5 g borax n 100 ml ap distilat. 5. Soluie sulfat feros 2% (cu cteva picturi de clorur feric 2%). 6. Acid clorhidric concentrat. 7. Standard: se dizolv 0,1 g KCN n 100 ml NaOH 0,1 N. Se titreaz argentrimetric sau iodometric i se stabilete concentraia n CN-: 10 ml soluie standard stoc se trateaz cu 5 ml iodur de potasiu 20% i se titreaz cu azotat de argint 0,01 N pn la apariia unei opalescenei alb glbui dat de iodura de argint. 1 ml AgNO3 0,01 N corespunde la 0,25 mg CN8. Standard de lucru: Se dilueaz cu NaOH 0,1 N o parte alicot din standardul stoc, astfel nct soluia s conin 100 g CN-/ml. Soluia se prepar extemporaneu. Recoltarea probelor Se aspir aerul prin dou vase spltoare, coninnd fiecare 10 ml NaOH 0,1 N. Se recolteaz 40 50 l aer cu viteza de 25 litri/or, se noteaz 1 i p. Modul de lucru Se iau cte 5 ml soluie absorbant din fiecare vas spltor, se trateaz cu o pictur fenoftalein 1% cnd apare o culoare rou viiniu, apoi se adaug 5 ml acid sulfuric 0,1 N cnd soluia se decoloreaz (la nevoie se adaug 2 -3 picturi n plus). Se realcanizeaz net cu 2 ml soluie saturat de borax, cnd apare o culoare roz viinie, se agit i se las 5 -10 minute n repaus. Se adaug1 ml sulfat feros 2% cnd se formeaz un precipitat galben verzui, apoi se adaug 6 picturi acid clorhidric concentrat, se agit pn la dizolvarea precipitatului i apariia unei coloraii bleu albastru. Dup 10 minute se msoar extincia la spectrofotometru Spekol la = 720 nm, n cuva de 1 cm n compensaie cu proba martor. Curba de standardizare se face ntre 70 i 150 g ion CN-, prin puncte din 20 n 20, n condiiile descrise mai sus. Cu extinciile obinute se construiete, curba standard sau se calculeaz cu factorul de pant.

144

Valorile extinciilor pentru probe se raporteaz la curba standard, apoi se nmulesc cu 2 ( pentru c s-a lucrat cu din soluia absorbant), obinndu-se concentraia C a CN- n g . Eprubeta 1 2 0.7 0.9

Reactivi(ml) Standard de lucru(100 g CN / ml) Conc.g NaOH 0.1% Fenolftalein 1% sol. alcoolic H2SO4 0.1 N FeSO4 2 % HCl =720nm Calcul Rezultatele se exprim n mg CN/ m3 aer. mg/m3 = C / V n care: C= concentraia CN-, n g V= volumul de aer recoltat n litri.
-

3 1.1

4 1.3

5 1.5 150 3.5

6 5.0

70 90 110 130 4.3 4.1 3.9 3.7 1 pictur 2.0 agitare, 5-10repaus 1.0 agitare 6 picturi, agitare, 10 repaus

Metoda colorimetric pentru sulfocianur Metoda Liebig se bazeaz pe determinarea sulfocianurilor din snge (aer) i urin; ionul SCH- apare prin metabolizarea HCN sau n procesul de putrefacie. n mod fiziologic se produc sulfocianuri n organism, nct la persoanele normale se gsesc urmtoarele condiii: - n ser: la nefumtori pn la 2 mg sulfocianur/100ml; la fumtori pn la 3 mg sulfocianuri/100 ml; - n urin: la nefumtori pn la 15 mg sulfocianuri/litru; la fumtori pn la 26 mg sulfocianuri/litru. Se consider ca indice de expunere la compui ai cianului nivele sanguine peste 8 mg/100 ml i eliminri urinare peste 30 mg/litru. Cnd se urmrete CN- n produse cadaverice este necesar transformarea HSCN n HCN prin oxidare cu acid cronic i separare prin distilare a HCN (matoda Chelle). Astfel, HSCN formeaz complexul Fe(SCN)3 (reacia Liebig). Reactivi 1. Acid triclor acetic 1%; 2. Nitrat feric 5%; se dizolv 12,5 g nitrat feric n 250 ml acid azotic 1 N. 3. Standard: sulfocianur (tiocianat) de potasiu 0,1% (aproximativ 1 ml = 1 mg). 4. Standard de lucru: se titreaz soluia stoc cu AgNO3 0,1 N i se calculeaz concentraia exact de KSCN. Se dilueaz cu ap astfel, nct s se obin o soluie 1 ml = 25 g KSCN. Se prepar extemporaneu din soluia stoc care se titreaz n aceeai zi. Recoltarea probelor
145

Se recolteaz snge prin puncie venoas, se centrifugheaz timp de 5 minute la 3000 turaii/minut Se colecteaz urin n vas curat. Este indicat s se cerceteze sulfocianurile n aer i n urin ct mai curnd dup expunerea probabil (pn la 24 ore). Modul de lucru Se pipeteaz 2 ml aer i se adaug 2 ml acid tricloracetic 10%, se agit i dup 10 minute se filtreaz. Se pipeteaz 5 ml urin i se adaug 5 ml acid triclor acetic 10%, se agit, dup 5 minute se filtreaz. La 2 ml filtrat (corespunznd la 1 ml ser sau urin) se adaug 3 ml nitrat feric i se agit. n paralel se face un martor al reactivilor, cu 2 ml ap i 3 ml nitrat feric 5% i un martor alurinei cu 2 ml filtrat de urin i 3 ml ap (aceasta se face pentru fiecare prob de urin). Dup 10 minute se citete extincia probelor de ser, la spectrofotometru Spekol la = 470 nm, n cuva de 1 cm, n compensaie cu martorul reactivilor, obinndu-se extincia ES . Pentru urin se msoar att extincia probelor (EU), ct i extincia martorului urinei (E0), fa de martorul reacivilor, n condiiile descrise mai sus (conform schemei). Curba de standardizare se face ntre 10 i 50 g KSCN, prin puncte din 10 n 10, msurnd extinciile fa de martorul reactivilor. Cu extinciile obinute se calculeaz factorul de pant (A). Eprubeta Proba 2.0 3.0 -

Reactiv (ml) Filtrat de urin Fe(NO)3 5 % n HNO3 1N Ap distilat Agitare, repaus 10 =470 nm Eu E0

Martorul urinei 2.0 3.0

Martorul reactivilor 3.0 2.0

Reactivi(ml) Standard de lucru (25 g SCN / ml) Conc.g Ap distilat Fe(NO3)3 5 % n HNO3 1 N
-

Eprubeta 1 2 0.4 0.8

3 1.2

4 1.6

5 2.0 50 -

6(M) 2.0

10 20 30 40 1.6 1.2 0.8 0.4 3.0 agitare 10 repaus

Calculul - pentru ser: ES . A = CS, n g KSCN.; - pentru urin: (EU E0) . A = CU, g KSCN. Rezultatele se exprim n mg sulfocianur (KSCN) la 100 ml ser sau la litru urin. ntruct proba luat n lucru reprezint 1 ml ser sau urin, rezultatele sunt: mg sulfocianur/100 ml ser = CS . 0,1
146

mg sulfocianur/litru urin = CU Observaii 1. n cazul mai multor determinri, cnd se lucreaz n serie, pentru a nu se mai face pentru fiecare prob i un martor al urinei, se procedeaz astfel: se lucreaz probele, se citete extincia EP i api se adaug n fiecare prob 1 2 picturi Hg(NO3)2, i soluie saturat i se citete EU. 5SCN- + Fe3+ Fe(SCN)3 Fe(SCN)3 + Hg(NO3)2 Hg(SCN)2 + Fe3+ + 2 NO3- + SCNNu se folosete HgCl2 deoarece este greu disociabil. 2. Subiectul examinat nu va lua medicament coninnd salicilai (aspirin antinevralgice,etc.) cu cel puin 48 ore nainte de determinare, ntruct acetea dau aceeai coloraie cu sarea feric. Determinri curente Cromatografia capilar cu detector cu captur de electroni a fost folosit la determinarea acidului cianhidric din fumul de igar (Xu et al. 2006). Lindsay i OHare (2006) determin amperometric acidul cianhidric din snge.

Bibliografie specific Abeyasinghe, N. L., Perera, H. J. M., Weerasinghe, D. S. K. Case report - Death by subcutaneous injection of cyanide in Sri Lanka. J. Forensic Legal Med., 18, 182-183, 2011. Bhattacharya, R., Kumar, D., Sugendran, K., Pant, S. C., Tulsawani, R. K., Vijayaraghavan, R. Acute toxicity studies of -Ketoglutarate: a promising antidote for cyanide poisoning. J. Appl. Toxicol., 21, 495 499, 2001. Drochioiu, G., Arsene, C., Murariu, M., Oniscu, C. Analysis of cyanogens with resorcinol and picrate. Food and Chemical Toxicology, 46, 35403545, 2008. Drochioiu, G., Mangalagiu, I., Avram, E., Popa, K., Dirtu, A. C., and Druta, I. Cyanide reaction with ninhydrin: Evaluation of interference and mechanisms. Analytical Sciences, 20, 1443 1447, 2004. Drochioiu, G. Highly selective and sensitive reaction of cyanide with 2,2-dihydroxy-1,3indanedione. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 372(5-6) 744 747, 2002; Drochioiu, G. Fast and highly selective determination of cyanide with 2,2-dihydroxy-1,3indanedione. Talanta, 56(6) 1163 1165, 2002; Drochioiu, G., Mangalagiu, I., Tataru, V. Specific spectrophotometric determination of hydrocyanic acid in the environment. Analyst, 125, 939-941, 2000. Drochioiu, G., Popa, K., Humelnicu, D., Murariu, M., Sandu, I., Cecal, A. Comparison of various sensitive and selective spectrophotometric assays of environmental cyanide. Toxicol. Environ.Chem., 90, 221-235, 2008;
147

Drochioiu, G., Oniscu, C., unel, V., Popa, K., Cozma, D. Cyanide assay based on its novel reaction with resorcinol and picric acid. Eur. J. Min. Proc. Environ. Prot., 3(3) 291296, 2003; Drochioiu, G., Mangalagiu, I. Assay of cyanide in biological materials using 2,2-dihydroxy1,3- indanedione. Pakistan J. Appl. Sci., 2(6) 658 660, 2002; Drochioiu, G., Mangalagiu, I., Popa, K., Avram, Ecaterina, Molnar, Ramona, and Druta, I. Novel reactions of cyanide with 2,2-dihydroxy-1,3-indanedione. Rev. Roum. Chim., 50(1), 53 59, 2005 Drochioiu, G., unel, V., Grebinian, D., Vlahovici, A., Saiz, V., Murariu, M. Dosage des ions cyanure totaux par linhibition de lactivit catalasique. Rev. Roum. Chim., 49(2) 121-125, 2004; Drochioiu, G., Pui, A.,Dnac, R., Bsu, C., Murariu M. Improved spectrophotometric assay of cyanide with picric acid. Rev. Roum. Chim., 48(8) 601-606, 2003; Gill, J. R., Marker, E., Stajic, M. Suicide by cyanide: 17 deaths. J. Forensic Sci., 49, 826-828, 2004. Hamel, J. A review of acute cyanide poisoning with a treatment update. Critical Care Nurse, 31, 72-82, 2011. Lindsay, A. E., OHare, D. The development of an electrochemical sensor for the determination of cyanide in physiological solutions. Anal. Chim. Acta, 558 , 158-163, 2006 . Mihaescu, I. M., Drochioiu, G. Cyanide reaction with ninhydrin: the effect of pH changes and UV-Vis radiation upon the analytical results. Rev. Roum. Chim., 54(10) 841-845, 2009. Moore, S. J., Norris, J. C., Ho, I. K., Hume, A. S. The efficacy of alpha-ketoglutaric acid in the antagonism of cyanide intoxication. Toxicol. Appl. Pharmacol., 82, 40-44, 1986. Musshoff, F., Kirschbaum, K. M., Madea, B.An uncommon case of a suicide with inhalation of hydrogen cyanide. Forensic Sci. Intern., 204, E4-E7, DOI: 10.1016/j.forsciint.2010.05.012, 2011. Nagasawa, H. T., Goon, D.J., Crankshaw, D. L., Vince, R., Patterson, S. E. Novel, orally effective cyanide antidotes. J. Med. Chem., 50, 6462-64624, 2007. Xu, J., Tong, H., Yan, X. Y., Du, S., Yao, Z., Liu, S. Sensitive determination of cyanide in cigarette smoke by capillary GC with a microECD. Chromatographia, 64, 609-612, 2006.

148

 CAP.VIMETABOLIZAREAOTRVURILORNCORP METABOLIZAREA PRESUPUNE CONVERSIA ENZIMATIC A

OTRVURILOR N METABOLII CARE SUNT SUBSTANE CU CARACTER MAI POLAR, FIIND ASTFEL MAI UOR DE EXCRETAT I, UNEORI,MAIPUINTOXICI. LA ORGANISMELE TERESTRE NS, BIOTRANSFORMAREA ESTE

INDISPENSABIL, DEOARECE SUBSTANELE LIPOSOLUBILE SUNT REABSORBITE LA NIVELUL TUBULAR RENAL I, DE ACEEA, FR INTERVENIA METABOLIZRII, ELIMINAREA LOR AR FIDE ORDINUL ZILELORICHIARANILOR(PENTRUELIMINAREAETANOLULUIARFI NECESARE 24 DE ZILE). ORGANISMELE ACVATICE NU POSED SISTEME METABOLIZANTE PENTRU XENOBIOTICE, DEOARECE ELE EXCRET COMPUII LIPOSOLUBILI DIRECT N AP PRIN TOAT SUPRAFAACORPORAL.

ORGANISMUL UMAN ARE POSIBILITATEA DE A METABOLIZA STRUCTURILE SUFER CHIMICE CUNOSCUTE. CU TOI EXOGENI METABOLIZARE, EXCEPIA

APROAPE TOATE COMPUII

COMPUILORPUTERNICPOLARI(ACIZIIIBAZELETARI,MINERALII ORGANICI)IUNIICOMPUINEPOLARI(ETERETILIC,DIELDRINETC.). METABOLIZAREA SE DATOREAZ FUNCIEI VITALE A

ORGANISMELOR DE A SE PROTEJA DE COMPUII STRINI, CARE PTRUND SEPARAT SAU ODAT CU SUBSTANELE NUTRITIVE (VOICUIOLINESCU,1977)IARELOC,DEREGUL,NDOUFAZE: N PRIMA FAZ, UN COMPUS, ACTIV SAU INACTIV BIOLOGIC,

ESTE TRANSFORMAT PRIN REACII DE OXIDARE, REDUCERE SAU HIDROLIZ,NTRUNALTCOMPUS,ACTIVSAUINACTIV;

149

N FAZA A DOUA, COMPUSUL INIIAL MPREUN CU

PRODUSULSUDETRANSFORMARESUFERREACIIDECONJUGARE PENTRU A FORMA UN COMPUS INACTIV BIOLOGIC. ASTFEL, BENZENUL TRECE, N PRIMA FAZ, PRIN OXIDARE DIRECT SAU PRIN INTERMEDIUL UNOR REACII DE EPOXIDARE, N FENOL, DI I TRIFENOLI, IAR ACETIA SUFER, N FAZA A DOUA, O CONJUGARE, NPRINCIPALCUACIDULGLUCURONICICUIONULSULFAT.UNELE PRODUSESEMETABOLIZEAZCOMPLETNPRIMAFAZ,CUMARFI ETANOLUL, N TIMP CE ALTELE TREC DIRECT N FAZA A DOUA (FENOLUL). PRIN METABOLIZARE, POLARITATEA COMPUSULUI CRETE N

GENERAL. COMPUSUL INIIAL, DE OBICEI LIPOSOLUBIL, DEVINE POLARNFAZAIIMAIPOLARNFAZAAIIA,CNDESTEPUTERNIC ACID (MAJORITATEA METABOLIILOR) SAU ALCALIN (PIRIDINA). FIIND POLARI, ACETI ULTIMI METABOLII STRBAT MAI GREU BARIERELE MEMBRANARE LIPOIDICE, IAR REABSORBIA TUBULAR ESTEREDUS.SECREAZASTFELIMPRESIACBIOTRANSFORMAREA ARE ROLUL DE A MRI POLARITATEA I, INDIRECT, DE A REDUCE TOXICITATEAXENOBIOTICELOR. ETERUL ETILIC I ACIDUL FTALIC SUNT ELIMINAI

NEMODIFICAI,IARUNELESUBSTANENEPOLARE,CUMARFIHCH, INSECTICIDELE CLORURATE NU SUNT UOR METABOLIZATE I NICI EXCRETATE FIIND DEPOZITATE N ESUTURILE GRASE DIN ORGANISM. FAPTULCOSINGUROTRAVPOATEFIMETABOLIZATLA

UN NUMR IMENS DE PRODUI SUGEREAZ C ORGANISMUL NUL RECUNOATE I C ACEASTA INTERFER DOAR CU SISTEMELE DE METABOLIZARE PE CARE CORPUL LE UTILIZEAZ DE REGUL PENTRU TRANSFORMAREA UNOR COMPUI EXOGENI N COMPUII PROPRII. CU SUBSTANELE PE CARE CORPUL LE RECUNOATE, DE EXEMPLU PROTEINELE, AMINOACIZII, GRSIMILE ETC. LUCRURILE STAU CU TOTUL ALTFEL: CILE METABOLICE SUNT PRECISE I TRANSFORMAREA LOR SE PETRECE DE FIECARE DAT LA FEL. EXOGENUL PERTURB BUNA FUNCIONARE A ORGANISMULUI SAU
150

DOAR A UNOR ESUTURI I ORGANE I, PRIN ACEASTA, INTR N REACIECHIMICSAUDEALTNATUR(FIZIOLOGIC,MECANIC ETC.) CU COMPONENTELE CORPULUI. N CAZUL N CARE OBIECTUL SAUCOMPUSULINTRODUSNCORPNUAFECTEAZNNICIUNFEL STRUCTURA I FUNCIILE ORGANISMULUI, ACESTA DIN URM SE COMPORT PASIV (PROTEZE DIN ARGINT SAU MATERIAL PLASTIC IMPLANTATENCORP). REACIILE DIN FAZA I CONSTAU DIN INTRODUCEREA N

MOLECUL A GRUPRILOR CHIMICE CU POLARITATE CRESCUT: OH, NH2, COOH, SH. CEA MAI FRECVENT DINTRE REACIILE ACESTEI FAZE ESTE OXIDAREA, NS PENTRU UNELE XENOBIOTICE REDUCEREA ESTE SINGURA CALE DE METABOLIZARE, N TIMP CE ALTELESEDEGRADEAZPRINHIDROLIZ. REACIIDEOXIDARE NS SEDIUL METABOLIZRII POATE FI ORICE ESUT SAU ORGAN, SEDIUL PRINCIPAL ESTE FICATUL. ENZIMELE DE

METABOLIZARE EXIST NS I N ORGANELE I ESUTURILE CARE FACILITEAZ INTRAREA I IEIREA DIN ORGANISM (PIELE, RINICHI, PLMN, INTESTIN), PRECUM I N ALTE ESUTURI (OCHI, PLASM ETC.). SEDIUL METABOLIZRII NU CORESPUNDE TOTDEAUNA CU SEDIUL PRINCIPAL AL ACIUNII TOXICE. ASTFEL, METANOLUL SE METABOLIZEAZNPRIMULRNDNFICAT,DAREFECTULTOXICSE EXERCIT LA NIVELUL RETINEI, SNC, RINICHIULUI; HIDROXILAREA 2NAFTILAMINEI ARE LOC N FICAT, DAR EFECTUL CANCERIGEN APARE N VEZICA URINAR; PLUMBTETRAETILUL ESTE TRANSFORMATNPLUMBTRIETILNFICAT,DARMETABOLITULESTE TOXIC N SPECIAL PENTRU SNC; N CAZUL DIMETILNITROZAMINEI, SEDIUL METABOLIZRII FICATUL CORESPUNDE CU SEDIUL PRINCIPALALACIUNIITOXICE. TABELUL2
151

 REACIA HIDROXILA REA AROMATIC HIDROXILA REA CATENEI ALIFATICE N OXIDAREA TRIMETILAMI NA TRIMETILAMI NONOXID SOXIDAREA CLORPROMA ZINA S OXIDUL CLORPROMA ZINEI O DEZALCHIL AREA N DEZALCHIL AREA
152

EXEMPLU

FORMULAGENERAL

BENZENUL FENOLI

ARX HOARX

FENAZONA 3HIDROXI FENAZONA

R(CH2)NCH3 R(CH2) CH2OH

R3N R3N O

R'

S R' OH

CODEINA MORFIN

ROCH3 ROCH2OH ROH+HCHO

MORFINA NORMORFIN

RNHCH3 RNHCH2OH RNH2+HCHO

S DEZALCHIL AREA DEZAMINA REA OXIDATIV

METILTIOPUR INA TIOPURIN AMFETAMINA FENILACETO N

R R'

RSCH3 RSCH2OH RSH+HCHO

H C NH2 OH NH2 R R'

R R'

DESULFURA REA EPOXIDARE A OXIDAREA CU DESCHIDER EA CICLULUI

PARATIONUL PARAOXON ALDRINUL DIELDRIN NICOTINA ACID(3 PIRIDIL) METI AMNOBUTIRI C

R' N R

R R'

S X

R R'

O X

R - CH = CH - R'

R - CH - CH - R' O

CH3

R' NH

COOH R

IN ORGANISMUL UMAN I N CEL ANIMAL EXIST DOU

TIPURI DE ENZIME: ENZIME BIOCHIMICE (PARAMETABOLICE) I ENZIMEXENOBIOTICE(XENOMETABOLICE). PRIMELE, CELE BIOCHIMICE, CATALIZEAZ

BIOTRANSFORMAREA SUBSTANELOR ENDOGENE, PRECUM I METABOLIIIACESTORACAREPREZINTASEMNRISTRUCTURALE CUSUBSTANELEENDOGENE,DEOARECE,ODATMETABOLIZATEI AJUNSELALOCULDEACIUNEAENZIMELOR,ACESTEANULEMAI

153

POT

DIFERENIA

DE PE

SUBSTRATELE ACEEAI

LOR CALE.

NORMALE ENZIME

LE CA:

METABOLIZEAZ DECARBOXILAZA, NESPECIFICE XANTINOXIDAZA

ALCOOLDEHIDROGENAZA,

ALDEHIDDEHIDROGENAZA, GUANAZA,

DOPA

MONOAMINOOXIDAZA, DEGRADEAZ

COLINESTERAZELE NUCLEOTIDAZELE, SUBSTRATELE

PLASMATICE,

DEOPOTRIV

NATURALEIPECELESTRINE,DARSIMILARECASTRUCTUR. ENZIMELE XENOBIOTICE CATALIZEAZ BIOTRANSFORMAREA OTRVURILOR I SUBSTANELOR CHIMICE POLUANILOR, MEDICAMENTELOR,

MAJORITII INDUSTRIALE,

CANCERIGENILOR, ADITIVILOR ALIMENTARI, CARE NU PREZINT, CA ATARE SAU CA METABOLII, ASEMNRI STRUCTURALE CU SUBSTRATELENORMALE.ACESTEENZIMEAUSEDIULNMICROZOMI I CATALIZEAZ N SPECIAL REACII DE OXIDARE. NC DIN ANUL 1955,AXELRODADEMONSTRATEXISTENAUNUISISTEMDEENZIME CARE FOLOSESC NADPH (NICOTINAMID REDUS) I OXIGEN MOLECULAR, NUMITE OXIDAZE CU FUNCII MIXTE MICROZOMIALE (MICROSOMAL MIXED FUNCTION OXYDASES) SAU OFMM. N MICROZOMI PE LNG ACESTE ENZIME, SE MAI GSESC I UNELE REDUCTAZEIHIDROLAZE. EXIST I SUBSTANE METABOLIZATE ATT PE CILE

NORMALE, CT I PE CELE CARACTERISTICE XENOBIOTICELOR. DE EXEMPLU, ETANOLUL SE OXIDEAZ N CITOPLASM PRIN INTERMEDIUL ALCOOLDEHIDROGENAZEI (ENZIM BIOCHIMIC), IAR N MICROZOMI PRIN INTERMEDIUL UNUI SISTEM ENZIMATIC ASEMNTOR. ENZIMELE BIOCHIMICE SE MAI DEOSEBESC DE OFMM PRIN

LOCALIZAREA,NUMRUL,SPECIFICITATEAIACTIVITATEALOR. ENZIMELE DE OXIDOREDUCERE BIOCHIMIC AU SEDIUL N

SPECIAL N MITOCONDRII, ENZIMELE DE HIDROLIZ N LIZOZOMI, CITOPLASM, PLASM SANGVIN, IAR OFMM SE GSESC APROAPE EXCLUSIVNMICROZOMI.

154

ENZIMELE BIOCHIMICE SUNT DIVERSIFICATE I N CANTITATE

SUFICIENT PENTRU A SATISFACE METABOLIZAREA SUBSTRATELOR ENDO I EXOGENE; NUMRUL OFMM ESTE MIC SAU CHIAR REDUS LAUNSISTEMUNICIUNIVERSALDEOXIDAZE. ENZIMELE OFMM SUNT LIPSITE DE SPECIFICITATE, DEOARECE NUMEROASE SUBSTRATURI CU STRUCTURI

METABOLIZEAZ

DIFERITE,NTIMPCEENZIMELEBIOCHIMICESUNTSPECIFICE. ENZIMELE BIOCHIMICE SUNT N STARE ACTIV, PE CND

OFMM SE ACTIVEAZ SUB EFECTUL DIRECT AL XENOBIOTICELOR, PUTND METABOLIZA ATUNCI COMPUSUL CARE LEA ACTIVAT, PRECUM I ALI COMPUI METABOLIZAI PE ACEEAI CALE. PROPRIETATEASENUMETEINDUCIEENZIMATIC.

REACIIDEREDUCERE REACIA ALDEHIDE ALCOOLPRIMAR CETONE ALCOOL SECUNDAR SATURAREADUBLEI LEGTURI NITRODERIVAT NITROZODERIVAT HIDROXILAMIN AMIN AZODERIVAT HIDRAZODERIVAT AMIN
155

EXEMPLU RCHO RCH2OH RCOR RCHOHR RCH=CHR RCH2CH2R RNO2 RNO RNHOH R NH2

RN=NR RNHNHR RNH2+RNH2 RCONHOH RCONH2 RSSR RSH+RSH

ACIDHIDROXAMIC AMID DISULFUR SULFHIDROL AS5+ AS3+

RASO(OH)2 RAS=O

INDUCIA ENZIMATIC DETERMIN CRETEREA NIVELULUI DUP ADMINISTRAREA CRONIC A UNUI

ENZIMELOR IMPLICATE N METABOLIZAREA UNEI OTRVI SAU XENOBIOTIC MEDICAMENT SAU TOXIC. ASTFEL, DATORIT NESPECIFICITII MARCATE, ADMINISTRAREA UNUI MEDICAMENT INDUCE O METABOLIZAREA CRESCUT A ALTOR SUBSTANE (VOICU I OLINESCU, 1977). DE PILD, NICOTINA MRETE ACTIVITATEA ENZIMELOR CARE METABOLIZEAZ O SERIE DE MEDICAMENTE I CHIAR METABOLISMUL NICOTINEI ESTE MAI INTENS LA FUMTORI FA DE NEFUMTORI, PROBABIL DATORIT EFECTULUI INDUCTOR ALHIDROCARBURILORPOLICICLICEDINIGAR. METABOLIZAREA MICROZOMIAL INCLUDE OXIDRI,

REDUCERIIHIDROLIZE. REACIIDEHIDROLIZ REACIA FORMULA GENERAL DEZESTERIFICARE DEZAMIDARE RCOOR R COOH+ROH RCONHR R COOH+RNH2 ATROPINA ACID TROPIC +TROPANOL LIDOCAINA ETILENGLICOCO L+XILIN
156

EXEMPLU

OXIDAREAESTEREALIZATDEOXIDAZELECUFUNCIIMIXTE

MICROZOMIALE (OFMM), UN SISTEM ENZIMATIC COMPONENT AL MEMBRANELORRETICULULUIENDOPLASMATICNETED(REN).ACEST SISTEM ESTE CONSTITUIT DIN DOU HEMOPROTEINE (CITOCROMUL P450 I CITOCROMUL B5), DOU FLAVOPROTEINE (NADPHCITOCROM P450REDUCTAZA OXIGENUL I NADHCITOCROM (O2), B5REDUCTAZA), O FOSFOLIPID (FOSFATIDILCOLINA). N REACIE SUNT NECESARI: MOLECULAR NICOTINAMIDADENIN DINUCLEOTIDFOSFATUL, FORMA REDUS (NADPH) IAR UNEORI I NICOTINAMIDADENINDINUCLEOTIDUL,FORMAREDUS(NADH): RH+O2+2H++2E ROH+H2O ATTDISOCIEREAMOLECULEIDEOXIGENCTIDESFACEREA

LEGTURII RH DIN SUBSTRAT RECLAM UN APORT CRESCUT DE ENERGIE DE ACTIVARE I, DE ACEEA, ORGANISMUL REALIZEAZ ACEASTOXIDARENOPTETAPE:

ROH
8

RH
1

Fe3+

4 2-

(ROH)Fe 3+
7

(RH)Fe 3+
2

e-

(RH)Fe 2+ XOOH XOH (RH)Fe 3+(O -) 2 O2

3

(R)(Fe
6

OH) 3+

(RH)Fe 2+(O 2)

RH(Fe H2O

O)3+
5

2H+

(RH)Fe 3+(O2)

157

e-

 ETAPELEACTIVRIIOXIGENULUINCICLULCITOCROMULUIP450 NREACIILEDEHIDROXILAREMICROZOMIAL(DUPCOTRU, 1993). 1. CITOCROMUL P450 (NOTAT AICI CU FE3+) SE UNETE CU SUBSTRATULNEPOLAR,RH; 2. FIERULHEMINICFE3+SEREDUCELAFE2+PRIN TRANSFERULUNUI ELECTRON DE LA NADPH, PRIN INTERMEDIUL NADPH CITOCROMP450REDUCTAZEI; 3. OXIGENUL MOLECULAR FORMEAZ UN COMPLEX TERNAR, (RH)FE2+(O2); 4. UN AL DOILEA ELECTRON SE TRANSFER DE LA NADPH (PRIN INTERMEDIUL NADPHREDUCTAZEI) ORI DE LA NADPH SAU NADH (PRIN INTERMEDIUL CITOCROMULUI B5) CU FORMAREA UNUIANIONPEROXIDIC; 5. ANIONULPEROXIDICLEAGHIDROGENUL,CUFORMAREDEAP IACOMPLEXULUIRH(FEO)3+; 6. HIDROGENUL DIN SUBSTRATUL RH SE TRANSFER PE OXIGEN, CUFORMAREARADICALULUIINTERMEDIAR(RO)(FEOH)3+; 7. RADICALUL SUBSTRATULUI SE RECOMBIN CU OXIDRILUL DIN COMPLEX,CUFORMAREAPRODUSULUIDEHIDROXILARE,ROH; 8. PRODUSULROHREGENEREAZFORMAOXIDATA CITOCROMULUIP450ICICLULSENCHIDE.
158

HIDROPEROXIZII,

XOOH,

PRECUM

UNII

OXIDANI

PUTERNICIUNTEAZACESTCICLU. PRIN HIDROXILAREA TOXICILOR SE FACE N MICROZOMII HEPATICI LABILIZAREA MOLECULELOR ACESTORA DATORIT

INTRODUCERII GRUPRILOR ADIIONALE, MAI ALES A GRUPEI HO. CITOCROMUL P450 CONSTITUIE LOCUL ACTIVITII OXIGENULUI, FUNCIONND CA O MONOOXIGENAZ N OXIDAREA UNOR SUBSTANE DIVERSE (HIDROCARBURI POLICICLICE, MEDICAMENTE, STEROIZI,COLESTEROL,ACIZIGRAI,,ETC. SUPEROXID DISMUTAZA CATALIZEAZ DESCOMPUNEREA

SUPEROXIDULUI PRINTRO REACIE DE DISPROPORIONARE N OXIGENIPEROXIDDEHIDROGEN: 2O2 +2H+ H2O2+O2

ACEASTAINHIBREACIADEHIDROXILARESAUDEMETILARE (XANTIN + XANTIN OXIDAZ) STIMULEAZ

ALE UNOR TOXICE, IAR ADUGAREA UNUI SISTEM GENERATOR DE SUPEROXID HIDROXILAREA UNOR TOXICE DE CTRE SISTEMUL ENZIMATIC MICROZOMIAL. Se fac n continuare cercetri pentru a lmuri implicarea ramurii peroxidante din sistemul enzimatic microzomial. Exist un vast material experimental n favoarea peroxidrii lipidelor microzomiale n anumite condiii n cursul metabolizrii medicamentelor. Vitezele reaciilor de peroxidare a lipidelor microzomiale i de hidroxilare a medicamentelor sunt invers proporionale, datorit probabil competiiei pentru O2 necesar ambelor procese. n ambele procese se dezvolt forme reactive ale O2 cum sunt O2 i 1O2 (Auclair i Lecomte, 1978). Sistemul oxidazic cu funcii multiple este responsabil de procesul de detoxifiere hepatic, care ncepe prin introducerea unor grupri polare n structura substratului lipofil pentru a-l face mai hidrosolubil. Sistemul enzimatic microzomial cuprinde de asemenea un numr de reacii oxidative ca hidroxilri, O i N-dealchilri, sulfoxidri etc. (Voicu i Olinescu, 1977). Reacia principal de hidroxilare a unui substrat AH se datorete contactului direct cu citocromul P450 care este redus cu ajutorul unui flux de electroni primit de la NADPH prin intermediul celorlali transportori. Peroxidarea este competitiv cu desaturarea i cu N- i O-dealchilarea (OBrien, 1978). Bidlack i Hochstein (1975) menioneaz nsuirile de peroxidaz ale hemoproteinelor din sistem (citocromii P450 i b5), ct i condiiile n care apare peroxidarea lipidelor microzomiale: Fe3+ liber, dar mai ales complexat cu ADP sau pirofosfat.
159

In vivo se poate realiza peroxidarea lipidelor microzomiale din ficat. Mecanismul cel mai probabil se bazeaz pe structura hemoproteinic a componenilor sistemului microzomial i capacitii acestora de a aciona ca peroxidaze. Producerea unor specii reactive, fie prin activarea O2 (1O2), sau prin peroxizi (H2O2 sau lipidici), este sigur datorit chemiluminiscenei ce nsoete hidroxilarea microzomial in vitro. Dup OBrien, O2 i citocromul P450 sunt componentele ambelor procese i acestea pot realiza hidroxilarea unor medicamente. Ramura peroxidant, dei este mai simpl deoarece nu necesit prezena celorlali citocromi, produce totui distrugerea citocromului P450. O dovad suplimentar a posibilitii peroxidrii lipidelor microzomiale este adus de amplificarea acestui proces de radiaiile ionizante (Wills i Daves, 1972). Peroxizii organici pot substitui NADPH i O2 n unele hidroxilri modificnd biosinteza hepatic a unor compui cum ar fi acizii biliari. Modificri minore ale membranelor microzomiale, aa cum se produc in intoxicri cronice cu solveni organici sau metale grele, pot crea condiii pentru creterea ponderii ramurii peroxidante a sistemului de transport electronic microzomial. PEROXIDAREA LIPIDELOR CONSTITUIE UN PROCES FIRESC AL

CRUI ROL CRETE ODAT CU CRETEREA CONCENTRAIEI TOXICILOR SAU MEDICAMENTELOR SUPUSE METABOLIZRII. DE ACEEA, N PROCESUL DETOXIFIERII CRETE SEMNIFICATIV CONCENTRAIALIPIDELORPEROXIDATE(OLINESCU,1982).
NADPH 3+ ADP-Fe 2+ ADP-Fe O2 ADP-Fe2+ .O Citocrom C reductaza RH Citocrom P 450 (peroxidaza) ROOH ROH + H2O ROOH ROH

Citocrom b 5 (peroxidaza)

Citocrom b 5 (reductaza)
2

Lipide Lipide-OOH NADH

160

 SCHEMAPROBABILAHIDROXILRIIDATORITCAPACITII PEROXIDAZICEACITOCROMILORP450IB5 In cazul metabolizrii otrvurilor i, n general, a substanelor exogene, are loc peroxidarea lipidelor. Cel puin n ficat, aceasta reprezint un fenomen fiziologic controlat de sistemele protectoare, care n anumite limite nu duce la pierderea de acizi grai polinesaturai. Pe baza acestei observaii, peroxidarea lipidelor n ficat ar fi un rspuns nespecific la o agresiune chimic, explicnd astfel apariia peroxizilor lipidici i a produilor de descompunere (dialdehida malonic, etanul) n urma intoxicrii cu substane cu cu caracter lipofil ce sunt metabolizate prin sistemul hidroxilant microzomal dependent de NADPH. Astfel, peroxizii lipidici i produii lor de descompunere au fost detectai n urma intoxicrii cu CCl4, etanol, bromtriclormetan sau paraquat. O dovad suplimentar a implicrii peroxidrii n instalarea unei hepatotoxiciti este efectul protector al glutationului, dietilditiocarbamatului i cistaminei (erban i colab., 1979), compui ce conin grupri SH libere, cu aciune antioxidant. Pe de alt parte, n urma administrrii unor substane hepatotoxice se observ scderea coninutului de grupri SH. Intoxicarea cu DDT (p,p-diclordifeniltricloretan) i alte insecticide clorurate nrudite produce o stimulare a enzimelor metabolizante din microzomi, la un nivel redus de absorbie. La o concentraie mai nalt a toxicului, se instaleaz o intoxicaie de tipul observat n cazul CCl4 (Olinescu, 1982). CONCENTRAII CRESCUTE DE PEROXIZI AI LIPIDELOR N

SNGEIFICATAUFOSTGSITEDUPIRADIEREAEXPERIMENTAL AOBOLANILOR(OLINESCUICOLAB.,1984). REACIILE ENZIMATICE DE HIDROXILARE SUNT N GENERAL

DEFORMA: RH+O2+XH2 ROH+H2O+X,

161

NCARERHREPREZINTSUBSTRATUL,IARXH2UNDONORDE

ELECTRONI,RESPECTIVNADPH2(VOICU,OLINESCU,1977). REDUCEREAESTEREALIZATDEREDUCTAZE(NITROIAZO)

NADHSAUNADPHDEPENDENTE,MICROZOMIALE. OXIDOREDUCERILE MICROZOMIALE SE REALIZEAZ SUB

INFLUENA DIOXIGENAZELOR, CARE NCORPOREAZ AMBII ATOMI DEOXIGENNSUBSTRAT, O2+SUBSTRAT SUBSTRAT O2

A OXIGENAZELOR, CARE REDUC O2, FIE LA H2O2 SAU LA DOU MOLECULEDEH2O,FRNCORPORAREAO2NSUBSTRAT: O2+2H+(4H+)+2E H2O2(2H2O)

SAU A MONOOXIDAZELOR, CARE NCORPOREAZ UN ATOM DE OXIGENNSUBSTRATIREDUCCELLALTOXIGENLAAP: O2+SUBSTRAT+DONOR H2 SUBSTRAT OH+H2O+DONOR HIDROLIZA ARE LOC SUB ACIUNEA ESTERAZELOR I

AMIDAZELORMICROZOMIALE. METABOLIZAREA OXIDRI NONMICROZOMIAL (OXIDAREA I AROMATICE, INCLUDE, PRIMARI, DE A

ASEMENEA,

ALCOOLILOR

ALDEHIDELOR

ALIFATICE

DEZAMINAREA

OXIDATIVAAMINELORAROMATICEIARILSUBSTITUITE),PRECUM I REDUCERI (DISULFURI, NOXIZI, SOXIZI) I HIDROLIZE (ESTERI, AMIDE), NS ENZIMELE SUNT LOCALIZATE N MITOCONDRII, CITOPLASM,PLASMSANGVIN. IMPLICAIILE TOXICOLOGICE ALE METABOLIZRII

OTRVURILORIMEDICAMENTELORNFAZAI: METABOLIII SUNT MAI POLARI, DAR NU NEAPRAT MAI

PUIN TOXICI I NU SE POATE DEFINI BIOTRANSFORMAREA CA DETOXIFIERE;

162

APARIIA METABOLIILOR MAI TOXICI EXPLIC FAPTUL C SCHRADANUL, GLUCOZIZII CIANOGENETICI,

UNELEXENOBIOTICESUNTINACTIVEINVITRO,DARACTIVEINVIVO (PARATIONUL, CLORALHIDRATUL,FENACETINA,ETC.); APARIIA METABOLIILOR CU ACTIVITATE DIFERIT DE A

COMPUSULUI INIIAL ESTE CARACTERISTIC UNOR XENOBIOTICE (EX.PRIMIDONA,TRECEPARIALNFENOBARBITALCUPROPRIETI SEDATIVE,ALTURIDECELEANTICONVULSIVANTE); ACTIVAREA ENZIMELOR MICROZOMIALE, RESPECTIV

INHIBAREA, SUB ACIUNEA XENOBIOTICELOR ADMINISTRATE CONCOMITENT SAU ANTERIOR D NATERE LA FENOMENUL DE INDUCIE,RESPECTIVDEINHIBIIEENZIMATIC. REACIILE DIN FAZA A IIA REPREZINT CONJUGRI: SULFOCONJUGAREA, ACETILAREA, METILAREA, GLUTAMINCONJUGAREA,

GLUCURONOCONJUGAREA, GLICOCOLCONJUGAREA,

MERCAPTAREAISULFURIZAREA. REACIIDECONJUGARE

REACIA

COMPUII INIIALI DERIVAI HIDROXILICI, TIOLICI, CARBOXILICI, AMINICI

COMPUII FINALI O GLUCONORIDE DETIPETER S GLUCONORIDE DETIPTIOETER O GLUCONORIDE DETIPESTER N GLUCONORIDE

EX.*) 6/1

ENZIMA

GLUCURONO CONJUGAREA

GLUCONORIL TRANSFERAZ A

SULFO CONJUGAREA

DERIVAI HIDROXILICI, TIOLICI,

ESTERI SULFURICI, TIOSULFURICI,

163

6/2

SULFO TRANSFERAZ A

AMINICI TILAREA AMINE AROMATICE, SULFONAMIDE, HIDRAZINE, ACIDP AMINOBENZOI C DERIVAI CARBOXILICI (COOHFIXAT DIRECTPE CICLUL AROMATICSAU PRIN INTERMEDIUL UNEICATENE LATERALE) UNIIACIZI ARILACETICI DERIVAIN HETEROCICLICI ,AMINE AROMATICE ENDOGENE, FENOLI,TIOLI, AS(SE,TE) HIDROCARBURI AROMATICE, DERIVAI HALOGENAI AROMATICI ACID CIANHIDRIC, CIANURI, NITRILI

SULFAMAI DERIVAIN ACETILAI 6/3 NACETIL TRANSFERAZ A GLICOCOLN ACILAZA

COCOL JUGAREA

DERIVAIAI ARIL GLICOCOLULU I

6/4

UTAMIN JUGAREA TILAREA

DERIVAIAI FENILACETIL GLUTAMINEI DERIVAIN,O, SMETILAI

6/5 6/6

METIL TRANSFERAZ A

CAPTARE TEINSAU UTATION NJUGARE)

ACIZIARIL MERCAPTURIC I SULFOCIANURI (TIOCIANAI)

6/7

CISTEIN (GLUTATION) TRANSFERAZ A

FURIZARE

6/8

RODANAZA (TIOSULFAT: CIANURI SULF TRANSFERAZ A

*)EXEMPLENTABELULURMTOR;**ACTIVARECU UNA DINTRE CELE MAI IMPORTANTE ACIDUL REACII ESTE

GLUCURONOCONJUGAREA,

DEOARECE

GLUCURONIC,

GLUCURONILTRANSFERAZA I NUCLEOTIDUL DE ACTIVARE SE GSESC N MAJORITATEA ESUTURILOR (FICAT, RINICHI, INTESTIN) I, DE ASEMENEA, DATORIT VARIETII DE GRUPRI (OH, SH, NH2) PE CARE ACIDUL GLUCURONIC POATE FI TRANSFERAT. GLUCURONILTRANSFERAZA ESTE LOCALIZAT N MICROZOMI. SULFOCONJUGAREA SE REALIZEAZ ASUPRA ACELORAI GRUPRI CA GLUCURONOCONJUGAREA, PRIN TRANSFERUL SULFATULUI PROVENIT N SPECIAL
164

DIN

AMINOACIZI

SULFURAI.

SULFTRANSFERAZA SE GSETE N CITOPLASM, NDEOSEBI N FICAT I INTESTIN. ACETILAREA ARE LOC N FICAT I N CELULELE SISTEMULUIRETICULOENDOTELIAL.CONJUGAREACUGLICOCOLUL SE REALIZEAZ N FICAT. METILAREA, CU SEDIUL N FICAT I RINICHI, SPOLIAZ ORGANISMUL DE GRUPRI METIL PROCURATE DELAMETIONINIDELABAZELEXANTINICE.MERCAPTAREAARE SEDIUL N RINICHI, IAR METABOLIII REZULTAI SUNT UNEORI MAI TOXICI, NS MAI RAPID DE ELIMINAT. SULFURIZAREA REPREZINT O REAL DETOXIFIERE, DEOARECE TOXICITATEA SULFOCIANURII FA DE CIANUR ESTE FOARTE SLAB, NS EFICIENA REACIEI ESTE REDUS, DIN CAUZA CANTITILOR LIMITATE DE RODANAZ DISPONIBIL. CONJUGAREA ARE LOC CU CONSUM DE

ENERGIE, DE ACEEA ESTE NECESAR O ACTIVARE PREALABIL. ACESTE REACII PRESUPUN FIE ACTIVAREA AGENTULUI DE CONJUGARE,FIEACTIVAREATOXICULUI. N URMA REACIILOR DE CONJUGARE REZULT COMPUI

HIDROSOLUBILI,MAIPUINTOXICIDECTMETABOLITULDINPRIMA FAZ. ASTFEL, BENZENUL, SE TRANSFORM N PRIMA FAZ N FENOL, TOXIC, IAR ACESTA, N FAZA A DOUA TRECE N ACID FENILGLUCURONIC,MAIPUINTOXICIMAIHIDROSOLUBIL. UNNUMRMICDEXENOBIOTICEPOTLUAPARTELAREACII

DE SINTEZ DENUMITE SINTEZE LETALE DIN CARE REZULT COMPUITOXICI. BIOTRANSFORMAREA ESTE

INFLUENAT DE FACTORI ENDOGENI I EXOGENI: SPECIE, RAS, VRST,SEX,STRIPATOLOGICE,STAREADENUTRIIE,BIORITMUL, FACTORII DE MEDIU, INTERACIUNILE CU ALTE XENOBIOTICE SAU CUFACTORIINUTRITIVI. BIOTRANSFORMAREA REPREZINT CALEA MAJOR DE

DEBARASARE A ORGANISMULUI DE TOXICI. SISTEMELE ENZIMATICE POT FI NS DEPITE, AVND DREPT CONSECIN SPOLIEREA ORGANISMULUI N GRUPRI ACETIL, METIL, SULFAT, TIOL, ETC.
165

NECESARE REACIILOR DIN FAZA A IIA; CRETEREA CERINEI DE NADPH IMPLICAT N OFMM, CU CONSECINE NEFAVORABILE ASUPRAUNORMETABOLISME. ELIMINAREATOXICILORDINCORP NOCIVITATEA UNUI TOXIC ESTE CU ATT MAI MARE CU CT

ELIMINAREA SA ESTE MAI LENT. IN PRINCIPAL, ELIMINAREA SE REALIZEAZ PE CALE RENAL, DIGESTIV, PULMONAR I TRANSCUTANAT. CALEA RENAL ESTE CEA MAI IMPORTANT MODALITATE DE

ELIMINARE A TOXICILOR DIN CORP. PE ACEAST CALE SE ELIMIN TOXICIICUMASEMOLECULARESUB400. ELIMINAREA RENAL SE REALIZEAZ PRIN TREI MECANISME:

FILTRAREA GLOMERULAR, SECREIA ACTIV I REABSORBIA TUBULAR.VITEZAELIMINRIIDEPINDEDE: DEBITUL URINAR, DEPENDENT DE PARAMETRII INTERNI I

EXTERNI; RATA DE FIXARE A PROTEINELOR PLASMATICE (LEGAREA

NTRUN PROCENT MAI RIDICAT A TOXICULUI CONDUCE LA ELIMINAREASAMAILENT); PHUL URINAR: O PARTE DIN TOXICUL FILTRAT

GLOMERULAR POATE FI REABSORBIT TUBULAR, N FUNCIE DE CARACTERISTICILE FIZICOCHIMICE. COMPUII LIPOSOLUBILI SE REABSORB PN LA METABOLIZARE COMPLET N COMPUI HIDROSOLUBILI, ELIMINABILI RENAL; ELECTROLIII SLABI SE ELIMIN N RAPORT CU PHUL URINEI TUBULARE (PHUL ALCALIN FAVORIZEAZELIMINAREACOMPUSULUIACIDIONIZAT,DEOARECE REABSORBIA TUBULAR ESTE MPIEDICAT, IAR PHUL ACID FAVORIZEAZ ELIMINAREA COMPUSULUI BAZIC); ELECTROLIII
166

TARI SE ELIMIN RAPID, INDIFERENT DE PHUL URINAR DEOARECE SUNTCOMPLETDISOCIAI. INDUCIA (SAU INHIBIIA) ENZIMATIC MODIFIC RITMUL

EXCREIEI; VRSTA I INTEGRITATEA FUNCIEI RENALE: LA VRSTNICI

ITARAIRENALELIMINAREATOXICULUIESTEREDUS; INTERACIUNI: TOXICII CARE SE ELIMIN PRIN SECREIA TUBULAR POT INTRA N COMPETIIE PENTRU

ACTIV

MECANISMELEDETRANSPORT. CALEA DIGESTIV (PRIN SUCURI DIGESTIVE I BIL) ESTE

CARACTERISTIC PENTRU TOXICII CU MASE MOLECULARE DE 400 500.ROLULFICATULUIESTEIMPORTANTNELIMINAREATOXICILOR DIN ORGANISM, DAR EFECTUL SU ESTE CONTRACARAT DE REABSORBIA TOXICULUI DE INTESTIN PRIN CIRCUITUL ENTEROHEPATIC. DE ACEEA, SE ELIMIN PRIN TUBUL DIGESTIV (FECALE) ACEI TOXICI CARE SUNT CONCENTRAI N BIL, DAR NU SUNTREABSORBIIDININTESTIN. CALEA PULMONAR ESTE CARACTERISTIC GAZELOR I VOLATILE CARE STRBAT MEMBRANA

SUBSTANELOR PRINEXPIRAIE.

ALVEOLOCAPILAR I, AJUNGND LA ALVEOLE, SUNT EVACUATE

ALTE CI DE ELIMINARE: PRIN TEGUMENTE, FANERE, GLANDE

SUDORIPARE SE ELIMIN METALE GRELE, ARSEN, HALOGENURI, UNELE SUBSTANE VOLATILE; PRIN GLANDA MAMAR SE ELIMIN OSERIEDEMEDICAMENTEITOXICI. REACIIDECONJUGARE

167

1. Glucuronoconjugarea: R - OH + HO (R - SH) HO H O H COOH OH H H H OH (RS)RO HO H H O H COOH OH H H OH

Acid D-glucuronic O Ar - COOH + HO

O (sau S) - glucuronid de tip eter(tioeter) O - H2O Ar - COO O - glucuronid de tip ester

O Ar - NH2 + - H2O

O Ar - NH N - glucuronid

2. Sulfoconjugarea: C6H5 OH (SH)

Sulfat activat

C6H5 O SO3H (S) Fenilsulfat (feniltiosulfat)

C6H5-NH2

Sulfat activat

C6H5-NH-SO3H Sulfamat

3. Acetilarea H2N-C6H4-SO2NH2 + CH3-CO SCoA Sulfanilamida

4. Glicocolconjugarea: C6H5-CO~SCoA + H2N-CH2-COOH Benzoil-CoA Glicocol HS-CoA C6H5-CO-HN-CH2-COOH Acid hipuric

Acetil-CoA

HS CoS

CH3CONH-C6H4-SO2NH2 N-4-acetilsulfanilamida

5.Glutamincojugarea:
C6H5-CH2CO~SCoA + H2N-CH-(CH2)2-CONH2

Fenil-acetil-CoA

HS-CoA

C6H5-CH2COHN-CH-(CH2)2-CONH2 COOH

COOH

Glutamina

Fenil-acetil-glutamina

168

6. Metilarea:
Metil activat Metil activat

N Piridina

(+)

_ N

N H

N N CH3 Nicotina

CH3 N-metil-piridiu

Nornicotina

HO HO

CH CH2 NH CH3 OH

Metil activat

H3C O HO

CH CH2 NH CH3 OH

Adrenalina
C2H5 SH activat
Metil

Metnefrina
C2H5 S CH3

Etilmercaptan
7. Mercaptarea: Ar-H + HS-CH2-CH(NH2)-COOH cisteina 2H

Etilmercaptan metilat

Ar-S-CH2-CH(NH2)-COOH Arilcisteina (acid mercapturic) HX

Ar-X + HOOC-CH-CH2-CH2-CO-NH-CH-CO-NH-CH2-COOH NH2 Glutation CH2-SH

HOOC-CH-CH2-CH2-CO-NH-CH-CO-NH-CH2-COOH NH2 CH2-S-Ar Aril-glutation

S u lf d in t io a m i n o a c iz i

8 . S u l fu r iz a r e a : N aC N N aSC N

169

 CAP. VII ACIUNEA TOXICILOR ASUPRA

ORGANISMULUI:TOXICODINAMIA EFECTELE NOCIVE ALE TOXICILOR SE RESIMT LA NIVEL DE ESUT, ORGAN,APARATISISTEM.TOTALITATEAPROCESELORBIOCHIMICE IFIZICOCHIMICECAREAULOCNCADRULINTERACIUNIITOXIC ORGANISMCONSTITUIEACIUNEATOXICODINAMIC. TOXICII PROVOAC PRIN MODIFICRI RAPIDE I I ADESEA

REVERSIBILE CARE AU LOC LA NIVEL CELULAR I SUBCELULAR, OBSERVABILE MICROSCOPIE OPTIC ELECTRONIC. MODIFICRILE PATOLOGICE DIN ESUTURI SUNT PRECEDATE DE MODIFICRINBIOCHIMIALOR. N TOATE LEZIUNILE BIOCHIMICE, LA BAZA PROCESULUI SE

AFL (I) O REACIE MOLECULAR. INTERACIUNEA TOXIC ORGANISM A FOST EXPLICAT PRIN IMPACTUL NTRE TOXIC I/SAU METABOLII I ANUMITE MOLECULE ALE ORGANISMULUI. SITUSUL PRIMAR DE ACIUNE TOXIC SAR AFLA AADAR LA NIVEL MOLECULAR.MAIMULT,NUMAIANUMITEGRUPRIDINMOLECUL (COOH, NH2, OH, SH) AR FI REACTIVE, IAR RESTUL MOLECULEI DOAR MODULEAZ REACIA, NCT MAJORITATEA REACIILOR AULOCLANIVELSUBMOLECULAR. 1. ACIUNEA TOXICILOR LA NIVEL DE ESUT, ORGAN, APARAT, SISTEM SISTEMUL NERVOS POATE FI AFECTAT DE TOXICI N TOATE SECTOARELESALE:CENTRAL,PERIFERIC,VEGETATIV,PRINACIUNE DIRECT (LA NIVELUL CENTRILOR NERVOI, AL SISTEMELOR
170

NEUROEFECTOARE HIPERCAPNIEI,

AL

SISTEMELOR

AFERENTE I

NEUROACCEPTOARE) I INDIRECT (CA URMARE A HIPOXIEI, MODIFICRILOR HIDROELECTROLITICE ACIDOBAZICE, COLAPSULUI VASCULAR). PRINCIPALELE TULBURRI NEUROLOGICEIPSIHICEDININTOXICAIILEACUTESUNT: COMA TOXIC APARE N INTOXICAIILE ACUTE, N SPECIAL

MEDICAMENTOASE I PREZINT VARIAII SIMPTOMATICE N FUNCIEDETOXIC; CONVULSIILE SUNT CONSECINA HIPEREXCITABILITII

ZONELOR MOTORII DIN SCOAR SAU A UNOR CENTRI NERVOI MOTORIIMEDULARI; TULBURRILE MOTORII (PAREZE, PARALIZII) I SENZITIVE

(NEUROMIALGII,ANESTEZII,PARESTEZII)AUDIFERITESUBSTRATURI; MIDRIAZA, MIOZA, RIGIDITATEA PUPILAR POT APREA

DIRECT, GENERATE DE TOXICPRIN STIMULENI VEGETATIVI, CA I PRIN BLOCAREA SISTEMELOR ENZIMATICE VEGETATIVE SAU PRIN STRIHIPOXICE; DELIRUL,CUSAUFRHALUCINAII,APARENINTOXICAII

ACUTE CU FEBR SAU CU INSUFICIEN RENAL ACUT, CU TULBURRICIRCULATORIIIANEMIEGRAV; CEFALEEA,INSOMNIA,SOMNOLENA,APATIA,ANXIETATEA,

IRITABILITATEASUNTTULBURRINEUROPSIHICE. LEZIUNILE HISTOPATOLOGICE LA NIVELUL SISTEMULUI

NERVOS CENTRAL MBRAC DIFERITE FORME, N RAPORT CU SPECIFICUL TOXICULUI. N INTOXICAIILE ACUTE I N UNELE CRONICE (EX. SATURNISM) SE OBSERV DEGENERESCEN MIELINICANERVILORPERIFERICI. SISTEMULCARDIOVASCULARESTEAFECTATDETOXICI,DIRECT

SAU INDIRECT, PRIN ACIUNE ASUPRA PRINCIPALELOR VERIGI ALE CIRCULAIEI: CONTRACTIBILITATEA MIOCARDULUI, FRECVENA CARDIAC,VOLUMULSANGVINCIRCULANT,VASOMOTRICITATEA.
171

TULBURRILE DE CONTRACTIBILITATE SURVIN PRIN

ACIUNE DIRECT ASUPRA MIOCARDULUI SAU PRINTRUN REGIM CIRCULATOR CORONARIAN INADECVAT SAU CA URMARE A HIPOXIEI; TULBURRILE DE RITM APAR PRIN ACIUNE ASUPRA

SISTEMULUI NERVOS PERIFERIC, CA I ASUPRA FASCICULELOR EXCITOCONDUCTOAREALEMIOCARDULUI; SCDEREA VOLUMULUI SANGVIN CIRCULANT ARE LOC, N

PRINCIPAL, PRIN CRETEREA PERMEABILITII CAPILARE CU EXTRAVAZAREDEPLASMNESUTURI,CAVITISEROASE,LUMEN GASTROINTESTINAL; ALTERRILE VASOMOTRICITII SUNT VASODILATAIA

(PRINDEPRIMAREASNC)IVASOCONSTRICIA. DINTRE MANIFESTRILE CLINICE ALE TULBURRILOR

CARDIOVASCULARE DIN INTOXICAIILE ACUTE, INSUFICIENA CIRCULATORIE ACUT PERIFERIC (OCUL TOXIC SAU COLAPSUL TOXIC) I STOPUL CARDIAC SUNT MODALITILE CELE MAI FRECVENTEDELETALITATE. CI: INFLAMAIA ACUT A MUCOASEI TRACTULUI RESPIRATOR APARATUL RESPIRATOR POATE FI AFECTAT PE URMTOARELE

CAREPOATECONDUCELAASFIXIE,PRINLIPSDEAER; ALTERAREA PERMEABILITII MEMBRANEI

ALVEOLOCAPILARE, URMAT, IMEDIAT SAU TARDIV, DE EDEM PULMONARACUTTOXIC; EXCITAREA SAU DEPRIMAREA CENTRILOR RESPIRATORI

POATECONDUCELASTOPRESPIRATOR; BLOCAREA HEMOGLOBINEI CIRCULANTE (CAZUL CO) SAU A

RESPIRAIEI CELULARE (CAZUL CN ) CONDUCE LA ASFIXIE PRIN

172

INCAPACITATEA DE FIXARE A OXIGENULUI PE HEMOGLOBIN, RESPECTIVPRINANOXIETISULAR; SE PARALIZIAMUCHILORRESPIRATORIDETERMINASFIXIE. FICATUL POATE FI LEZAT PRIN ACIUNE TOXIC DIRECT PRODUCE CARENA SE POT N UNII FACTORI SAU PRIN INDISPENSABILI I PRIN IMATURITATE

ASUPRA HEPATOCITULUI SAU PRIN ACIUNE TROFOPATIC, CND HEPATOCITULUI. PRODUCE HEPATOPATII

HIPERSENSIBILITATE

INDIVIDUAL

HEPATIC (PERIOADA NEONATAL) SAU PRIN DEFICIT ENZIMATIC. TOATEFORMELEDEHEPATOPATIIIMPLICSCDEREACIRCULAIEI INTRAHEPATICE. TOXICII LIPOSOLUBILI IAR TOXICII AFECTEAZ PREDOMINANT CELULELE

HEPATOCITELE, TUBULORENALE.

HIDROSOLUBILI,

LEZIUNILE HEPATICE INTERESEAZ ATT PARENCHIMUL

(HEPATOCITELE), CT I MEZENCHIMUL. INIIAL SE PRODUCE DEGENERESCENA HEPATOCITELOR, URMAT DE INFLAMAREA MEZENCHIMULUI.ACEASTADINURMNUARELOCDACLEZAREA HEPATOCITELOR ESTE FIE UOAR I REVERSIBIL, FIE MASIV, CU EVOLUIE RAPID FATAL. LEZIUNILE PARENCHIMATOASE SUNT DE TIP NECROZ, STEATOZ (NCRCARE GRAS) I COLESTAZ, IAR LEZIUNEAMEZENCHIMULUICONSTNSCLEROZ. N FUNCIE DE DURATA I INTENSITATEA EXPUNERII LA SE EXPRIM PRIN: ATROFIE GALBEN ACUT

TOXIC, PRECUM I CU SENSIBILITATEA INDIVIDUAL, AFECTAREA FICATULUI (HEPATONECROZ NTINS, IREVERSIBIL), HEPATIT ACUT (HEPATONECROZ LIMITAT CU REGENERARE N TIMP), HEPATIT SUBACUT SAU CRONIC (HEPATONECROZ PROGRESIV, CU REPARAIE MEZENCHIMAL), CIROZ (SCLEROZ NTINS, CU SFRITLETAL). RINICHIUL ESTE AFECTAT DE ACEI TOXICI I/SAU METABOLII

CARE SE ELIMIN N PRINCIPAL LA ACEST NIVEL. LEZAREA SE

173

PRODUCE PRIN MECANISM DIRECT SAU ALERGIC SAU CA O CONSECINAHIPOXIEIDINSTAREADEOC: NEFROPATIA ACUT TUBULAR TOXIC SE PRODUCE PRIN

ACIUNEANEFROTOXICDIRECT.PORIUNEACEAMAISENSIBIL ESTE TUBUL CONTORT PROXIMAL UNDE AU LOC CONCENTRAREA I REABSORBIA AFECTAREA EXPRIMNDUSE PRIN PROCESE DEGENERATIVE DE DIFERITE GRADE. LEZIUNILE NEFROTICE SE NSOESC, CND INTOXICAIA ESTE GRAV, DE LEZIUNI DETERMINATE DE ISCHEMIE (DEFICIT CIRCULATOR LOCAL). TABLOULCLINICESTEDEINSUFICIENRENALACUTTOXIC; RINICHIUL N STARE DE OC ESTE CONSECINA ACIUNII

TOXICE INDIRECTE, CND N CADRUL OCULUI TOXIC, ALTURI DE ALTE ORGANE I SISTEME, ESTE AFECTAT I RINICHIUL, DATORIT ANOXIEI ISCHEMICE, CU INSTALAREA OLIGURIEI (ANURIEI). DAC ISCHEMIA ESTE PRELUNGIT, DIUREZA NU ESTE RELUAT DUP NLTURAREA STRII DE OC A INTOXICATULUI I APARE SINDROMULDEINSUFICIENRENALACUTTOXIC; NEFROPATIA CRONIC, PROFESIONAL SAU

MEDICAMENTOAS, POATE FI PRIMAR SAU SECUNDAR CRONIC CNDREZULTDINEVOLUIAUNEINEFROPATIIACUTE. APARATUL DIGESTIV ESTE AFECTAT DE MAJORITATEA

TOXICILOR INTRODUI PE CALE ORAL. ACETIA ACIONEAZ FIE DIRECT PE DIFERITE STRUCTURI, FIE INDIRECT, PRIN INTERMEDIUL SISTEMULUI NERVOS CENTRAL SAU VEGETATIV SAU AL UNOR REACIIIMUNOALERGICE.LEZIUNILEORGANICESAUFUNCIONALE SUNTEXPRIMATEPRINDIFERITEMANIFESTRI. SNGELE I MDUVA HEMATOGEN POT FI ATACATE DE HEMATOGENE (HEMOPATII INDUSE MIELOTOXICE PRIN SAU

TOXICI CARE PROVOAC HEMOPATII INDUSE PRIN ATACAREA MDUVEI IMUNOPATOGENE), HEMOPATII ATACAREA

ELEMENTELOR SNGELUI CIRCULANT, HEMOPATII INDUSE PRIN COMBINAREAAMBELORMECANISME,ACIUNEAPREVALNDFIEPE MDUV,FIEPEELEMENTELESNGELUI.

174

TULBURRILE HIDROELECTROLITICE I DE ECHILIBRU ACIDO

BAZIC POT FI DEOSEBIT DE GRAVE N INTOXICAIILE SEVERE I SE REALIZEAZ PRIN URMTOARELE MECANISME: VRSTURI I DIAREE; HIPERSUDORAIE (ABOLIREA) I HIPERSECREIE RENALE; GLADNULAR; NTRERUPEREA SCDEREA FUNCIEI

APORTULUI ORAL SAU APORT EXAGERAT PARENTERAL; FORMAREA DE EXCES DE ACIZI PRIN METABOLIZAREA TOXICULUI; APORT DE ACIZI I BAZE EXOGENE (INTOXICAII ACUTE CU ACIZI I BAZE, UNDECRETESAUSCADEPHULSANGVIN). ACIUNEA TOXIC DIRECT ESTE CARACTERISTIC UNUI

NUMR LIMITAT DE TOXICI CARE DETERMIN INFLAMAIA SAU NECROZA ESUTULUI CU CARE VIN N CONTACT: TEGUMENTELE (SUBSTANE VEZICANTE, ACIZI I BAZE TARI), CONJUNCTIVELE BULBARE (SUBSTANE LACRIMOGENE), MUCOASELE TRACTULUI RESPIRATOR(GAZEIRITANTE),MUCOASELEBUCAL,ESOFAGIANI GASTRIC(SUBSTANEIRITANTE,CAUSTICE,COROZIVEETC.). 2.ACIUNEATOXICILORLANIVELCELULAR MEMBRANA CELULAR (FIG. 2) REGLEAZ PTRUNDEREA I ELIMINAREA SUBSTANELOR SPRE INTERIOR I SPRE EXTERIOR, MENINNDCONSTANTCOMPOZIIAMEDIULUIINTERN.TOXICUL POATE INFLUENA FLUXUL IONIC PRIN MEMBRAN PRIN MICORAREA PRIN CANALELOR IONICE, CND SE PRODUCE COCAINEI). STABILIZAREA MEMBRANEI I BLOCAREA CONDUCERII NERVOASE NTRERUPEREA FLUXULUI IONIC (CAZUL DEOARECE EXIST CANALE SEPARATE PENTRU NA+ I PENTRU K+, UNII TOXICI(TETRODOXINA) BLOCHEAZ FLUXUL DE SODIU, ALII (CLORURADETETRAETILAMONIU),FLUXULDEPOTASIU; DEASEMENEA,UNIITOXICI(DDT,ALCALOIZIIDINVERATRUM)

FAVORIZEAZ LRGIREA CANALELOR IONICE, CND SE PRODUCE LABILIZAREA MEMBRANEI. TOTODAT, PRINTRO ACIUNE ANTI
175

ATPAZIC CATIONICE.

(OUABAIN)

SE

PRODUCE

INHIBAREA

POMPEI

NUCLEULESTEAFECTATDETOXICIPRIN: INHIBAREAPRECURSORILORACIZILORNUCLEICI; NCORPORAREANACIZIINUCLEICI; LEGAREACOVALENTCUACIZIINUCLEICI; FORMAREACOMPLECILORREVERSIBILICUADN; INTERFERAREACUADNIARNPOLIMERAZA. INHIBAREA DE PRECURSORILOR ANTAGONITII BAZELOR ACIZILOR ACIDULUI NUCLEICI FOLIC I ESTE DE

REALIZAT

ANTIMETABOLIII

PURINICE

(ADENINA,

GUANINA,

HIPOXANTINA, XANTINA) SAU PIRIMIDINICE (URACILUL, CITOZINA, TIMINA), CARE, DEI ANALOGI CHIMICI AI ACESTOR BAZE, FORMEAZ COMPUI INUTILIZABILI DE CTRE CELUL . ASTFEL, 6 TIOPURINA, ANALOG CHIMIC AL HIPOXANTINEI, MPIEDIC INTRAREA ACESTEIA N CELUL, DEOARECE HIPOXANTINA FORMEAZACIDINOZINIC,NTIMPCE6TIOPURINASINTETIZEAZ ACID TIOINOZINIC, RESPINS DE CELUL. ASEMNTOR REACIONEAZ I 5FLUOROURACILUL, ANALOG CHIMIC AL URACILULUI. 6TIOGUANINA, INHIB BIOSINTEZA ACIZILOR NUCLEICI, DAR

SEPOATENCORPORANACETIANLOCULBAZELORNATURALE. LEGTURA COVALENT CU ACIZII NUCLEICI SE REFER LA

SUBSTANELEANTITUMORALEILACANCERIGENI. COMPLECI REVERSIBILI CU ADN POT FORMA LSD I UNELE

ANTIBIOTICE (ANTRACILINA, RUBIDOMICINA) CARE AFECTEAZ REPLICAREAITRANSCRIEREA;LEGTURILEFIINDELECTROSTATICE, MODIFICAREA COMPLECILOR. PHULUI MEDIULUI DETERMIN DESFACEREA

176

INTERFERENA CU ADN I ARNPOLIMERAZA ESTE CAZUL

SARCOMICINEI CARE INHIB ADNPOLIMERAZA, BLOCNDUI GRUPRILESH,SAUALRIFAMICINEIIRIFAMPICINEI,CAREINHIB ARNPOLIMERAZA LAMICROORGANISMENU NSLAMAMIFERE FAPTPECARESEBAZEAZUTILIZAREALORCLINIC. MITOCONDRIILE SUNT SEDIUL LANULUI RESPIRATOR

(TRANSPORTORDEELECTRONI)IALCUPLRIIACESTUIPROCESCU FOSFORILAREAOXIDATIV,AVNDCAREZULTATSINTEZADEATP. TRANSPORTUL ELECTRONILOR ESTE DE ASEMENEA CUPLAT CU CICLUL KREBS. ACIUNEA TOXICILOR POATE AVEA LOC LA URMTOARELENIVELE: CICLULKREBSESTEBLOCATDEDIFERIITOXICI(INHIBITORI)

LA ORICARE DIN SECVENELE SALE; ASTFEL, ACIDUL FLUORACETIC REALIZEAZ SINTEZA LETAL UNELE FENOTIAZINE INHIB DEHIDROGENAZELE NADDEPENDENTE, CU OPRIREA CICLULUI LA NIVELELERESPECTIVE; LANUL RESPIRATOR ESTE BLOCAT PRIN INHIBAREA (CN , H2S, ACTINOMICIN), A ENZIMEI Q

FLAVINNUCLEOTIDELOR (BARBITURICE, UNELE FENOTIAZINE), A CITOCROMILOR (DICUMARINICE)ETC.; (CCL4, SINTEZA ATP ESTE MICORAT DE UNELE XENOBIOTICE TETRACICLINE, RESPIRATOR DIGITALICE); PRIN A I ALI TOXICI ATP; MPIEDIC ASUPRA OXIDATIV ACIUNE MIXT

FOSFORILAREA LANULUI

SINTEZEI

DECUPLAREA

TRANSPORTULUIDEELECTRONICUFOSFORILAREAOXIDATIVESTE MODULDEACIUNEALDINITROFENOLILOR; MODIFICAREA PERMEABILITII MEMBRANEI

MITOCONDRIALE ARE LOC PRIN DIFERITE MECANISME (DE PILD, PRININTERACIUNECUSH); INFLUENA SINTEZEI PROTEINELOR MITOCONDRIALE ARE

LOC PRIN INHIBARE (ACTINOMICINA D BLOCHEAZ ARN

177

POLIMERAZA) SAU PRIN ACTIVARE (HORMONUL TIROIDIAN STIMULEAZCAPTAREAUNORAMINOACIZI). RETICULUL ENDOPLASMATIC ESTE FORMAT DIN MEMBRANE

DE SEPARARE ARANJATE NTRUN SISTEM DE CANALICULE CARE ATINGNUCLEULINCONJOARMITOCONDRIILE.UNELEPORIUNI ALE RETICULUI ENDOPLASMATIC SUNT NETEDE (REN), N TIMP CE ALTELEPOARTGRANULEDERIBOZOMI(RETICULENDOPLASMATIC RUGOS, RER). RETICULUL ENDOPLASMATIC ARE ROLUL DE A CONCENTRA RIBOZOMI. I PRIN TRANSPORTA PROTEINELE SINTETIZATE SE DE CENTRIFUGARE DIFERENIAT OBIN

FRAGMENTE DE RER BOGATE N FOSFOLIPIDE I N RIBOZOMI, I DE REN, DENUMITE MICROZOMI, N CARE SE GSETE MANJORITATEA OFMM. PRINCIPALELE MECANISME DE ACIUNE A TOXICILOR ASUPRARETICULULUIENDOPLASMATICSUNT: MODIFICAREA STRUCTURII RETICULULUI PRIN SCDEREA

SINTEZEILIPOPROTEINELOR,CONSECINASCDERIISINTEZEIATP N MITOCONDRII. ASTFEL, TETRACICLINELE DETERMIN STEATOZ HEPATIC CU VACUOLIZAREA RETICULULUI ENDOPLASMATIC I CRETEREA CANTITII DE MEMBRANE NETEDE (REN), CONCOMITENTCUSCDEREACANTITIIDEMEMBRANERUGOASE (RER).TETRACLORURADECARBONDETERMINDILATAREARERCU DESPRINDEREARIBOZOMILORISCDEREASINTEZEIPROTEICE; HIPERTROFIA RETICULULUI PRIN STIMULAREA ACTIVITII

OFMMCAURMAREAINDUCIEIENZIMATICE; INHIBIIA DIRECT A ENZIMELOR (NOVOBIOCINA INHIB HEPATIC, CU ELIBERARE DE

GLUCURONILTRANSFERAZA

BILIRUBINIAPARIIAHEPATITEITOXICE); RIBOZOMII SUNT GRANULELE DISPUSE DEA LUNGUL

RETICULULUIENDOPLASMATICIREPREZINTLOCULDESINTEZA PROTEINELOR DUP MODELUL DAT DE ARNMESAGER. SINTEZA PROTEIC POATE FI AFECTAT DE UNII TOXICI. ASTFEL, PUROTONINA, UN ANTITUMORAL ASEMNTOR STRUCTURAL CU PORIUNEA DIN ARN DE TRANSFER (TARN) LA CARE SE FIXEAZ
178

AMINOACIZII ACTIVAI (AMINOACILTARN). PUROMICINA POATE FORMA O LEGTUR PEPTIDIC CU UN AMINOACID ANTERIOR LEGAT DE LANUL PEPTIDIC (PRIN GRUPAREA NH2), NS MPIEDIC LEGAREA AMINOACIDULUI URMTOR, OPRIND CRETEREALANULUIPEPTIDIC. LIZOZOMII, CU ROL N ACTIVITATEA DIGESTIV A CELULEI,

POTFIAFECTAIDETOXICIPRINURMTOARELEMECANISME: AFECTAREA PERMEABILITII MEMBRANELOR: LIZOZOMII

CONIN ENZIME HIDROLITICE CU PH OPTIM ACID CARE, N MOD OBINUIT, SUNT SEPARATE DE SUBSTRATELE LOR DIN CITOPLASM PRIN MEMBRANA FOSFOLIPIDIC A LIZOZOMILOR. DAC PERMEABILITATEA MEMBRANAR ESTE UOR AFECTAT, SE PRODUC DEREGLRI N TRECEREA APEI I A ELECTROLIILOR. N CAZUL N CARE ALTERAREA ESTE PROFUND SAU MEMBRANA RUPT, ENZIMELE HIDROLITICE SUNT ELIBERATE I ATAC CONSTITUENII CELULARI DE BAZ (NUCLEOTIDE, PROTEINE, LIPIDE, GLUCIDE). N FINAL I SE PRODUCE DEREGLAREA ORGANITELOR (MITOCONDRII RETICUL ENDOPLASMATIC),

URMATDECITOLIZ. PRINCIPALA CAUZ A MODIFICRII PERMEABILITII

MEMBRANARE ESTE ANOXIA, IAR ACEASTA ESTE CONSECINA DEREGLRII RESPIRAIEI CELULARE I A PRODUCERII DE ENERGIE. MODIFICAREA PERMEABILITII MEMBRANARE ESTE PRODUS DE HEPATOTOXICI (CCL4), SULFAT DE STREPTOMICIN, DIGITALICE, DNOCETC.; INTERVENIREA N FAGOCITOZ, DE PILD, CU FORMARE DE

VACUOLE; MODIFICAREA REACIILOR DIN INTERIORUL LIZOZOMILOR,

CANCAZULDETERGENILORNEIONICI. 3.ACIUNEATOXICILORLANIVELMOLECULAR
179

 OMAREPARTEDINEFECTELETOXICESUNTCONSECINAINHIBIIEI ENZIMATICE.ACEASTAPOATEFI: COMPETITIV, CND INHIBITORII, FIIND ANALOGI CHIMICI

AI SUBSTRATULUI, INTR N COMPETIIE CU ACESTA PENTRU OCUPAREA CENTRILOR ACTIVI AI ENZIMEI, FORMND COMPLEXUL INHIBITORENZIM. CU CT CONCENTRAIA SUBSTRATULUI ESTE MAI MARE, CU ATT CAPACITATEA INHIBITORULUI DE A FORMA COMPLEXULCUENZIMAESTEMAIMIC; NECOMPETITIV, CND INHIBITORII NU AU STRUCTUR

ANALOGSUBSTRATULUI,DECINUCONCUREAZPENTRUCENTRII ACTIVI ENZIMATICI, IAR CONCENTRAIA SUBSTRATULUI NU INFLUENEAZ EFECTUL INHIBITORILOR. EXIST INHIBITORI NECOMPETITIVI REVERSIBILI, CARE INDUC DOAR O NCETINIRE A REACIEI ENZIMATICE, I INHIBITORI NECOMPETITIVI REPETITIVI IREVERSIBILI,CAREDETERMININACTIVAREAENZIMEI. UN TIP APARTE DE COMPETIIE ENZIMATIC ESTE

COMPETIIA ALOSTERIC, CU ROL IMPORTANT N REGLAREA ACTIVITIIENZIMATICE.NUMEROASEENZIMEPOSEDDOICENTRI CAPABILI S FIXEZE SUBSTANELE: UN CENTRU IZOSTERIC (ACTIV) CARE LEAG SUBSTRATUL I COMPUII NRUDII STRUCTURAL, REALIZND CATALIZA; UN CENTRU ALOSTERIC, CARE LEAG COMPUII DIFERII STRUCTURAL DE SUBSTRAT, CU ROL DE INHIBITORI SAU ACTIVATORI. FIXAREA UNUI INHIBITOR DE EXEMPLU CITRATUL DIN CICLUL KREBS PE CENTRUL ALOSTERIC AL FOSFOKINAZEI DETERMIN MODIFICRI CONFORMAIONALE ALE ENZIMEI LA NIVELUL CENTRULUI ACTIV, SCZNDUI AFINITATEA FA DE SUBSTRAT GLICOLIZEI(FIG.5). PRINCIPALELE MECANISME DIN INTERACIUNEA TOXIC CU LIMITAREA, N EXEMPLUL DAT, A

ENZIMSUNT:

180

DENATURAREAPROTEINENZIMEI(APOENZIMEI),PRINACIZI

IBAZETARI,FENOL,FORMALDEHID,METALEGRELE; BLOCAREAGRUPRILORREACTIVATEALEAPOENZIMEI(SH,

OH,NH2,COOH);DEEXEMPLU,GRUPRILESHSUNTBLOCATEDE AGENI OXIDANI (FERICIANUR), COMPUI DE ARSEN, METALE GRELE(PB,HG),AGENIALCHILANI(IODACETAT,IODAMID); MODIFICAREA CONFORMAIONAL A ENZIMEI: ANUMII

TOXICI NGUSTEAZ, DE EXEMPLU, LA ALCOOLDEHIDROGENAZ, CALEADEACCESAETANOLULUISPRECENTRULACTIV; COMPETIIACUGRUPAREAPROSTETIC:CN COMPLEXEAZ

FE3+DINCITOCROMOXIDAZ; COMPETIIA CU COENZIMA: ACIDUL PIRIDIN3SULFONIC I ACIONEAZ CA ANTIMETABOLII AI

ACETIL3PIRIDINA

NICOTINAMIDEIDINCOMPOZIIACOENZIMELORNADINADP; COMPLEXAREA METALULUI ACTIVATOR: FLUORUL CU DIN

COMPLEXEAZ MG DIN ENOLAZ; SULFURA DE CARBON, DISULFIRAMUL, DITIOCARBAMAII COMPLEXEAZ CITOCROMOXIDAZ, ALDEHIDDEHIDROGENAZ,

MONOAMINOOXIDAZ, TIROZINAZ I ZN DIN ANHIDRIDA CARBONIC, LACTIC DEHIDROGENAZ, ALCOOLDEHIDROGENAZ; CHELATANII (EX. SRURILE ACIDULUI EDETIC EDTA) SPOLIAZ ORGANISMULDEUNELEMETALEBIVALENTE; COMPETIIACUSUBSTRATUL; SUSTRAGEREA SUBSTRATULUI (H3ASO3 REACIONEAZ CU ETAPA URMTOARE A GLICOLIZEI DE ACIDUL

GLICERALDEHIDA CU FORMARE DE ACID FOSFOARSENGLICERIC, I PRIVEAZ DIFOSFOGLICERIC,SUBSTRATULNORMAL). SINTEZA LETAL ESTE PROCESUL PRIN CARE O SUBSTAN

EXOGENNETOXICESTETRANSFORMATNORGANISMNTRUNA TOXIC. ESTE CAZUL FLUORACETATULUI CARE IN VITRO NU ESTE TOXIC PENTRU ENZIMELE CICLULUI KREBS; IN VIVO, DIN
181

FLUORACETAT

ACTIV

OXALOACETAT

SE

SINTETIZEAZ

FLUORCITRAT. ACESTA INHIB ACONITAZA (ENZIMA DIN ETAPA CITRATOXALOACETAT), BLOCND CICLUL KREBS. CA URMARE A LEZIUNII BIOCHIMICE LA ACEST NIVEL, ORGANISMUL ESTE PRIVAT DEENERGIE,IARCITRATULSEACUMULEAZNESUTURI,LEGND CA2+,SPOLIINDORGANISMULDEACESTELEMENT. ALTERAREA METABOLISMULUI PRIN CELULAR. UNII

ANTIMETABOLII, FIIND ANALOGI CHIMICI AI METABOLITULUI NORMAL, ACIONEAZ NLOCUIREA ACESTUIA, DETERMINND FIE OPRIREA REACIEI, FIE FORMAREA UNUI NOU METABOLITCARENCETINETESAUOPRETEREACIAURMTOARE DINLANULMETABOLIC.DEPILD,SULFANILAMIDASESUBSTITUIE N BACTERII ACIDULUI PAMINOBENZOIC, MPIEDICND SINTEZA ACIDULUI FOLIC; DICUMAROLUL SE SUBSTITUIE VITAMINEI K, DETERMINND HEMORAGII; ACIDUL PIRIDIN3SULFONIC NLOCUIETE NICOTINAMIDA DIN NAD I NADP I DE ASEMENEA, CARENEAZORGANISMULNNICOTINAMID;ETIONINA,ANALOG METIONINEI, INDUCE O LEZIUNE BIOCHIMIC PRIN FORMAREA S ADENOZILETIONINEI N LOCUL SADENOZILMETIONINEI, CU IMPLICAII N PROCESUL DE METILARE I N SINTEZA PROTEIC; 6 TIOPURINAI5FLUOROURACILULINTERFERCUBAZELENORMALE ALE ACIZILOR NUCLEICI, REALIZND O NCORPORARE LETAL ETC. EFECTE NOCIVE ASUPRA ACIZILOR NUCLEICI. BAZELE STRUCTURI ELECTROFILE. CANCERIGENII SUNT

AZOTATE CONIN PERECHI DE ELECTRONI NEPARTICIPANI I POT ACCEPTA SUBSTANE CU STRUCTUR FOARTE VARIAT, NS MAJORITATEA LOR SUNT REACTANI ELECTROFILI. UNII CANCERIGENI I AGENI ANTITUMORALI ELECTROFILI IONI METALICI, AGENI ALCHILANI SE. ALII, HIDROCARBURI SUNT PER POLICICLICE

CONDENSATE, NITROZAMINE, AMINE AROMATICE POLICICLICE, SUNT DE FAPT PRECANCERIGENI I NECESIT O PREALABIL ACTIVARE METABOLIC CND SE FORMEAZ PRECURSORI CANCERIGENI I N FINAL METABOLITUL ULTIM, CANCERIGEN, PUTERNIC ELECTROFIL. ACESTA SE POATE DETOXICA PRIN
182

METABOLIZARE SAU SE POATE FIXA COVALENT PE ADN, MACROMOLECULA INT, SAU PE ALTE MOLECULE PROTEICE. ALI CANCERIGENI DETERMIN PERTURBRI N PROPRIETILE ADN FR INTERVENIA LEGTURII COVALENTE, PRIN SIMPL INTERCALARENDUBLAELICEAACESTUIA. INTERACIUNEA XENOBIOTICRECEPTOR. RECEPTORII

FARMACOLOGICI SUNT FORMAIUNI INFRASTRUCTURALE ALE CELULEI, AVND PROPRIETATEA DE A LEGA, MAI MULT SAU MAI PUIN SPECIFIC, ANUMITE MOLECULE ENDOGENE I EXOGENE (MEDICAMENTE I TOXICI). MAJORITATEA RECEPTORILOR SUNT PORIUNIALEMEMBRANEI.ALIISEGSESCNCITOPLASMSAUN SUBUNITIALEUNEIMOLECULEDEENZIM. INHIBITORUL (TOXIC, CHIMIOTERAPIC) ARE AFINITATE

PENTRURECEPTORCUCAREPOATEFORMAUNCOMPLEX. INTERFERENA N NEUROTRANSMISIE POATE AVEA LOC PRIN

DIFERITE MECANISME I LA DIVERSE NIVELE ALE SISTEMULUI NERVOS, DATORIT: AGENILOR BLOCANI AI RECEPTORILOR COLINERGICI SAU ADRENERGICI LA SINAPSELE INTERNEURONALE SAU LA JONCIUNILE NEUROEFECTOARE; UNOR INHIBITORI AI SINTEZEI I ELIBERRII NEUROTRANSMITORILOR; UNOR SUBSTITUIENIAINEUROTRANSMITORILOR,CUACIUNEPROPRIE COLINERGICSAUADRENERGIC. EFECTE TOXICE ASUPRA TRANSPORTULUI, DIFUZRII I

UTILIZRIIOXIGENULUI,CAIASUPRASTOCRIIENERGIEI: BLOCAREA TRANSPORTULUI DE OXIGEN: CO INTR N CU O2 PENTRU HB I FORMEAZ

COMPETIIE

CARBOXIHEMOGLOBINA, BLOCND TRANSPORTUL DE OXIGEN LA ESUTURI.NITRIIINITROIAMINODERIVAIIAROMATICI,PRECUM IALTEMETHEMOGLOBINIZANTETRANSFORMHB(FE2+)NMETHB (FE3+)CARENUTRANSPORTOXIGENUL.TOTUI,MICICANTITIDE METHB SUNT REDUSE LA HB N HEMATII. DAC METHB ESTE N CANTITATE MARE SAU N DEFICIT DE GLUCOZO6FOSFAT DEHIDROGENAZ,REDUCEREASPONTANNUSEMAIREALIZEAZ.
183

SULFONAMIDELE OXIGEN.

PREZENA DE

METHEMOGLOBINIZANTELOR LEZEAZ MEMBRANA

TRANSFORM HB N SULFHEMOGLOBIN, NETRANSPORTOARE DE DERIVAII HIDRAZIN ERITROCITAR CU ELIBERAREA HB DIN ERITROCIT (HEMOLIZ), IAR HEMOGLOBINAPLASMATICNUTRANSPORTOXIGENUL; (ETER, MPIEDICAREA DIFUZRII OXIGENULUI: UNII ANESTEZICI HALOTAN) I SOLVENI ORGANICI NEPOLERI SE

ACUMULEAZNLIPIDELEMEMBRANAREIMPIEDICDIFUZAREA OXIGENULUIIGLUCOZEININTERIORULCELULEI.NEURONULESTE DEOSEBITDESENSIBILLALIPSAACESTORSUBSTANE; MPIEDICAREA UTILIZRII OXIGENULUI: CIANURILE

COMPLEXEAZ FE3+ DIN CITOCROMOXIDAZ; TRANFERUL DE ELECTRONI PE LANUL MITOCONDRIAL POATE FI BLOCAT LA DIFERITENIVELE;ACIDULFLUORACETICBLOCHEAZCICLULKREBS LANIVELULACONITAZEI; RISIPIREA ENERGIEI I SUB FORM DE CLDUR: PRODUC

DINITROFENOLUL

DINITROORTOCREZOLUL

DECUPLAREAFOSFORILRIIOXIDATIVE,CNDOXIGENULESTEBINE UTILIZAT, NS ENERGIA NU SE ACUMULEAZ N FOSFAII MACROERGICI (ATP) PUTND FI APOI UTILIZAT DE CELULE, CI SE PIERDESUBFORMDECLDUR. CU2+, ANTAGONISMULNTREIONI:CD2+ESTEANTAGONISTULZN2+ I PROBABIL PRIN COMPETIIE PENTRU SITUSURILE DE

TRANSPORT. INDUCEREA REACIILOR DE SENSIBILIZARE: UNII TOXICI (ANTIBIOTICE, SULFAMIDE, ANTIPIRETICE

(IZOCIANAI, FORMALDEHID, ANHIDRID FTALIC ETC.) I MEDICAMENTE ANALGEZICE, ETC.) INDUC SENSIBILIZARE DATORIT PROPRIETII DEAJUCAROLDEHAPTEN.ACEASTASEUNETENORGANISMCU OMACROMOLECUL,REALIZNDANTIGENECAREDETERMIN,CA RSPUNS,SINTEZDEANTICORPI.
184

4.FACTORIIDETERMINANIAITOXICITII Factori dependeni de substan. Toxicitatea unei substane depinde de doza, structura chimic, puritatea, modul de administrare i interaciunile sale cu ali compui. Structura chimic. Gruprile chimice confer caracterul hidro- sau liposolubil i, deci, i tipul de aciune biologic. Gruprile toxofore: =C=, =S, NO2, N=C<, CN, P<, asemntoare gruprilor cromofore din colorani, sunt responsabile de toxicitate, iar gruprile autotoxe (halogeni, oxizi inferiori, NH2, >C=C<, C6H5, C6H4, CH2), asemntoare grupelor auxocrome, intensific aciunea toxic. Stereoizomeria determin variaii n intensitatea i tipul de aciune toxic, datorit faptului c substanele biologic active reacioneaz cu receptorii (enzimele) care, de regul sunt substane optic active. Asemnarea sau diferenierea n structura izomerilor optici dirijeaz formarea legturilor toxic-receptor. Izomerii geometrici pot determina de asemenea variaii ale intensitii legturii toxic-receptor datorit distanei dintre gruprile reactive, conformaiei etc. Activitatea electronic (distribuia i conformaia electronic n molecul) influeneaz toxicitatea. Se consider c electronii de valen sunt activi biologic. Densitatea electronic inegal n diferite puncte ale moleculei i confer polaritate i centri de maxim densitate electronic. Aceste conformaii electronice determin un anumit tip de activitate. Pn n prezent relaia structur-toxicitate nu poate fi prezentat legic. 5. Proprietile fizico-chimice ale toxicilor Starea de agregare influeneaz ptrunderea toxicilor n organism; toxicii gazoi acioneaz rapid i intens cnd ptrund pe cale respiratorie. Masa molecular mare i gradul mic de dispersie influeneaz negativ viteza de absorbie. Forma amorf asigur o dizolvare i o absorbie mai rapid dect forma cristalin pentru aceeai substan (ex. morfin, stricnin i novocain). n unele cazuri, substanele sunt active numai n form amorf, deoarece hidroliza la nivel gastrointestinal nu afecteaz forma cristalin, nct substana nu poate fi absorbit(de ex. stearatul i palmitatul de cloramfenicol). Polimorfismul are implicaii n cinetica toxicilor, deoarece structura cristalin imprim stabilitate sau instabilitate termodinamic formei respective. Forma cristalin stabil prezint solubilitate redus, punct de topire crescut i stabilitate chimic crescut, ntrziind absorbia. Volatilitatea crescut mrete riscul intoxicrii. Hidro- i liposolubilitatea, ca i raportul lipo/hidrosolubilitate influeneaz cinetica absorbiei. O substan insolubil nu poate fi absorbit. Dizolvarea este condiionat, n primul rnd de lipofilie (dependent de gruprile chimice) deoarece membrana de traversat este lipoidic, iar molecula trebuie s se dizolve n ea. n plus, dup depirea membranei, molecula difuzeaz n apa protoplasmatic, apoi n apa extracelular, nct trebuie s posede o
185

anumit hidrofilie. De aceea, moleculele cu un coeficient mediu de repartiie lipide/ap (coeficient Owerton-Meyer) sunt cel mai bine absorbite. n cazul ptrunderii pe cale respiratorie, cnd hidrosolubilitatea este mare (coeficient lipide/ap mic) alcoolul organismul are o capacitate de absorbie mare. Saturarea organismului i eliminarea pulmonar au loc lent, ceea ce conduce la intoxicaii n timp, prin acumulare. Din contra, atunci cnd hidrosolubilitatea este mic (coeficient lipide/ap mare) benzenul saturarea organismului i eliminarea pulmonar au loc rapid, producndu-se intoxicaii acute. n cazul ptrunderii transcutanate, riscul intoxicaiei depinde deopotriv de liposolubilitate i de hidrosolubilitate. De aceea, substanele cu coeficient lipide/ap mediu eterul prezint un risc cutanat crescut. Calea digestiv, este aplicabil att substanelor hidrosolubile ct i celor liposolubile. Absorbia substanelor disociabile este influenat de pH-ul segmentului digestiv respectiv. Ionizare, pH-pK: acizii slabi (barbituric, salicilic), neionizabili n mediu acid, sunt absorbii n stomac, pe cnd bazele slabe (alcaloizi, amfetamin, imipramin), puternic ionizate n mediu acid, sunt absorbite n duoden, al crui mediu este alcalin. Puritatea i concentraia. Impuritile pot influena aciunea toxic. Conservarea necorespunztoare este capabil s modifice toxicitatea (acizii pstrai n recipiente de plumb, dizolv metalul devenind toxici). Perioada de recoltare, aria geografic, condiiile meteorologice influeneaz coninutul n principii active al plantelor. Operaiile de splare, fierbere, etc., pot micora toxicitatea ciupercilor. Concentraia din produs determin, de regul, creterea toxicitii; n unele cazuri ns, concentraiile mari micoreaz permeabilitatea mucoasei reducnd apreciabil absorbia toxicului la acel nivel (ex. HCl conc.). Calea i viteza de administrare. Calea de administrare influeneaz intensitatea aciunii toxice, perioada de laten pn la apariia efectului toxic, precum i durata aciunii toxice. De asemenea, poate fi modificat tipul de aciune (MgSO4 administrat oral este purgativ, iar parenteral, este deprimant al SNC). n raport cu calea de administrare, absorbia se realizeaz cu viteze diferite i poate interveni sau nu detoxicarea hepatic naintea ptrunderii toxicului n circulaia general. Toxicitatea este influenat, de asemenea, de viteza de administrare a toxicului. Interaciuni. Dou sau mai multe xenobiotice interacioneaz ntre ele sau cu anumii constitueni ai alimentelor. Efectul interaciunii poate fi: Sinergic, cnd cele dou substane au acelai sens de aciune. Dac suma efectelor este egal sau mai mic dect efectele celor dou substane considerate separat (ex. bromuri alcaline) se obine sumare sau adiie. Dac suma lor este mai mare, efectul reprezint o potenare (barbiturice + etanol, morfin + amfetamin).

186

Indiferent, cnd aciunea celor dou substane se desfoar independent una de alta, fr a interaciona ntre ele. Antagonic, cnd aciunea celor dou substane are sens contrar, rezultnd un efect global micorat, nul sau inversat (de pild, anticolinergice + morfin, antiparkinsoniene + fenotiazine etc.). Nivelul interaciunii poate fi oricare din fazele cineticii (tab. 7) i de asemenea faza dinamic. Mecanisme de interaciune cinetic ntre xenobiotice (dup Sellers): Absorbia modificri fizico-chimice n tubul digestiv; variaii ale motilitii gastrointestinale; leziuni ale mucoaselor gastrointestinale. Fixarea pe proteine fixarea pe proteine plasmatice; fixarea pe receptorii tisulari. Distribuia Metabolizarea inducia enzimatic i inhibiia enzimatic Eliminarea interferene n transport la nivelul tubilor urinari i interferene n procesele de conjugare biliar sau de transport Absorbia poate fi stimulat sau inhibat la administrarea oral a dou sau mai multe xenobiotice, prin: Modificri fizico-chimice n tubul digestiv, datorate: variaiei pH-ului gastric sau intestinal (substanele antiacide scad absorbia substanelor acide); chelatrii sau complexrii cu ntrzierea absorbiei(srurile metalelor grele + ageni chelani, sruri de calciu, magneziu, fier, aluminiu + tetracicline); neutralizrii reciproce (heparin + protamin); Variaii ale motilitii gastrointestinale: laxativele i colinergicele, crescnd peristaltismul, reduc absorbia riboflavinei, care are loc predominant n poriunea superioar a intestinului subire (sediul principal al absorbiei) i faciliteaz absorbia vitaminei B12 din ileon; anticolinergicele, scznd peristaltismul, produc efecte inverse n absorbia riboflavinei i vitaminei B12; Leziuni ale mucoaselor gastrointestinale sunt observate n cazul substanelor corozive, caustice, colchicinei, neomicinei etc. Fixarea pe proteine (plasmatice sau receptori tisulari) poate fi modificat prin dou mecanisme: Competiia pentru proteinele plasmatice (n timpul transportului sau depozitrii) are loc pentru centrii oferii de proteine, ntre dou substane, ambele cu afinitate pentru acestea. Substanele cu afinitatea cea mai mare( cu caracter acid, ca fenilbutazona, acidul tricloracetic sau bazic, ca imipramina, difenilhidantoina) ocup locul celeilalte substane. Aceasta, mpiedicat s se fixeze,rmas liber, se echilibreaz la locul aciunii la un nivel mai ridicat, rezultnd potenare. Astfel, warfarina se fixeaz pe proteinele plasmatice n proporie de 97%, rmnnd liber numai 3%; dac o substan competitiv deplaseaz din fraciunea fixat nc 3%, concentraia formei libere se dubleaz, crescnd n mod periculos cantitatea de protrombin la subiecii tratai cronic cu anticoagulante. Alt dezavantaj al deplasrii competitive este ncrcarea ficatului (care metabolizeaz fraciunea rmas liber) i a rinichiului (care o filtreaz glomerular). Prin creterea metabolismului i a clearance-ului
187

renal, rezult o perioad plasmatic redus i o scdere progresiv a concentraiei plasmatice totale a substanei pn n momentul cnd concentraia plasmatic liber atinge nivelul avut anterior administrrii substanei competitive pentru proteinele plasmatice. Starea de echilibru care se stabilete acum se caracterizeaz printr-o concentraie plasmatic total inferioar, o concentraie a fraciunii libere egal i un nivel de activitate egal cu acelea anterioare interaciunii cu substana competitiv. Dei dezechilibrul determinat de competiia pentru proteinele plasmatice este doar tranzitoriu, totui, n cazul potenrii, efectele inhibiiei pariale a fixrii pe proteine pot fi deosebit de grave; Competiia pentru receptorii tisulari (sau centrii activi) determin modificri n structura teriar a proteinei (cu reducerea numrului centrilor de fixare) dac unele substane, mpiedicate s se fixeze pe proteina specific, se fixeaz pe ali centri. Distribuia substanelor n cele trei compartimente hidrice poate suferi modificri. Modificarea pH-ului (rezultat al proceselor metabolice sau al aciunii xenobioticelor) nu este uniform n compartimentele extra- i intracelular. Ca urmare, datorit difuziei neionice, se produce o trecere selectiv a xenobioticelor dintr-un compartiment ntr-altul. Astfel, substana se acumuleaz n compartimentul cu pH mai alcalin i invers. Au loc modificri ale concentraiei plasmatice i tisulare ale xenobioticelor, fr ca aceste modificri s se repercuteze asupra absorbiei sau eliminrii (de exemplu, fenobarbitalul, cu aciune intracelular, pierde din activitatea sa n prezena bicarbonatului de sodiu, realiznd o concentraie plasmatic mai mare). Metabolizarea: prin unele asocieri de xenobiotice se poate determina creterea sau scderea ratei de metabolizare cu toate consecinele sale pentru toxicitate prin fenomenul de inducie sau de inhibiie enzimatic. Inducia enzimatic reprezint accelerarea metabolizrii xenobioticelor ca urmare a stimulrii sintezei i activitii enzimelor microzomiale. Inducia are loc n cazul hipnoticelor, sedativelor, narcoticelor, stimulanilor SNC, analgezicelor-antipireticelor, etanolului, unor pesticide, substanelor cancerigene etc. Inhibiia enzimatic este fenomenul invers induciei i este observat la iproniazid, catron, nialamin, cloramfenicol, compui organofosforici, ozon, tetraclorur de carbon. Eliminarea este accelerat sau ntrziat prin: Competiie pentru folosirea aceleai ci (penicilina i probenecidul folosesc, ambele, transportul activ tubular, rezultnd ntrzierea eliminrii penicilinei, cu prelungirea activitii sale); Alcalinizarea sau acidifierea urinei (alcalinizanrzierea eliminrii penicilinei, cu prelungirea activitii sale); Alcalinizarea sau acidifierea urinei (alcalinizanii ionizeaz barbituricii, sulfamidele, salicilaii, mpiedicndu-le reabsorbia i accelerndu-le eliminare; dimpotriv, acidifianii grbesc eliminarea amfetaminei, imipraminei, antipirinei, bazelor purinice). Faza toxicodinamic: interaciunile pot avea loc i n aceeai faz, la nivelul unor receptori. Astfel, nalorfina intr n competiie cu morfina la nivelul receptorilor celulari; alcoolul i barbituricele se poteneaz pentru c acioneaz la acelai nivel; diureticele determin scderea ionilor de potasiu, potennd aciunea curarizantelor etc.
188

Pericolul asocierii xenobioticelor const n: posibilitatea creterii toxicitii substanelor nocive; intensificarea activitii i toxicitii unor medicamente (n special cu margine ngust de siguran); anularea efectului farmacologic, uneori cu rezultat fatal, ca n cazul coagulantelor. 6. Factorii dependeni de organism Exist diferene calitative i cantitative n efectul toxic ntre speciile animale, ca i ntre animal i om: talidomida este teratogen la om i iepure, dar nu la hamster; toxicitatea alfanaftilureei este de peste 500 de ori mai mare la maimu dect la obolan. Aceste diferene prezint interes pentru interpretarea datelor experimentale i depind de mai muli factori. Factori de care depind diferenele efectului toxic ntre specii Variaii n absorbie, distribuie, eliminare Variaii n rata i calea de metabolizare (ambele fiind funcie de enzimele de metabolizare Hexobarbitalul i antipirina sunt metabolizate de 3-6 ori mai rapid la oarece dect la iepure, dar anilina este metabolizat cu aceeai rat la ambele specii; p-clorfentermina nu poate fi hidrolizat la obolan; Fenolul nu este conjugat cu acidul glucuronic la pisic; Amfetamina se hidrolizeaz preponderent la catena lateral la om i la unele specii de laborator i se p-hidroxileaz numai la obolan; N-acetilaminofluorenul (AAF), precancerigen, este Nhidroxilat la N-hidroxi-AAF, precursor cancerigen la om, oarece, obolan, cine, nu i la cobai Variaii n calitatea i cantitatea receptorilor

Paraquatul se absoarbe de 20 de ori mai intens la obolan dect la om; Sulfatioxazolul se fixeaz pe proteinele serice n procent de 16% la om i de 69% la oarece; Feniltioureea este de 50 de ori mai puin toxic la cobai dect la obolan, deoarece cobaiul este mai puin sensibil la metabolitul toxic (H2S), iar eliminarea se realizeaz n majoritate ca sulfuri metalice neutre i cu vitez mare

Histamina se manifest la cobai prin constricie bronic, la cine prin hipotensiune, la om prin ambele efecte; obolanul este insensibil la histamin, pe cnd cobaiul sucomb la doze mici

189

Sexul. S-a constatat o mai mare frecven i intensitate a reaciilor adverse i a toxicitii la unele medicamente i toxici, la femeie de brbat. Au fost incriminai factori psihosomatici, metabolici (metabolizarea ar fi mai lent la femeie), hormonali (la animal, diferena de toxicitate ntre sexe a fost observat numai dup pubertate sau dup castrare). Vrsta. Fetusul i nou-nscutul prezint o sensibilitate deosebit la numeroase medicamente, n funcie de mecanismele de aciune ale acestora. Vrstnicii manifest o frecven crescut a accidentelor terapeutice, datorit mai multor factori. Graviditatea. Placenta este permeabil pentru unele xenobiotice sau poate interveni direct n biotransformarea lor. Majoritatea xenobioticelor cu M<1000 traverseaz placenta prin transfer activ sau pasiv i se regsesc n sngele fetusului. Transferul este maxim ntre sptmna a 6a i a 20-a de gestaie. n placent pot avea loc reaciile din faza I a metabolizrii, ns reaciile din faza a II-a sunt deficitare din cauza activitii reduse a glucuronil-transferazei. Factorii responsabili de sensibilitatea embrionului la xenobiotice sunt redai n tabelul 11. Masa i suprafaa corporal. S-a constatat la animal c exemplarele cu mas corporal mic necesit, proporional, o cantitate mai mare de substan pentru a rspunde n acelai mod ca animalele cu mas corporal mare (din aceeai specie). Starea psihic. Substanele biologic active acioneaz sinergic cu nivelul stresului. Strile patologice. Afeciunile renale scad eliminarea substanelor excretabile preponderent pe cale urinar (antibiotice, digitalice), crescndu-le semiviaa plasmatic; dac dozele nu sunt reduse, pot aprea efecte toxice. Afeciunile hepatice determin ncetinirea sau insuficiena metabolizrii medicamentelor, rezultnd acumularea lor (2-metilaminofluorenul formeaz derivatul N-hidroxi, cancerigen, ntr-o rat mai mare la animalele tarate hepatic). Factorii genetici. Pn n prezent evideniat mai multe enzimopatii, corelate cu absorbia unor xenobiotice, de ex.: Factori determinani ai frecvenei crescute a accidentelor toxice la vrstnici (dup Heusghem) Factori ca influeneaz (direct sau indirect) fazele cineticii sau dinamica xenobioticelor Scderea absorbiei digestive (din cauza micorrii secreiilor, a ncetinirii transportului activ etc. Scderea capacitii de legare a xenobioticelor (metaboliilor) de proteinele plasmatice (tisulare), cu creterea fraciunii libere; Scderea eliminrii renale i biliare;
190

Factori care intervin n declanarea reaciilor toxice Deficiena echilibrului metabolic i a reglrii neurohormonale; Dereglarea materialului genetic; Afectarea sistemului vascular; Formarea autoanticorpilor fa de constituenii celulari (tisulari), intaci sau dereglai etc.

 Scderea masei celulare active, a cantitii i sensibilitii receptorilor etc. Acetiltransferaza inactiveaz izoniazida (HIN). Exist inactivatori rapizi (care elimin rapid HIN) i inactivatori leni (elimin lent HIN); diferena ntre cele dou categorii de subieci const n cantitatea de enzim din ficat mai mare la inactivatorii rapizi dect la cei leni; Pseudocolinesteraza inactiveaz, prin hidroliz, succinilcolina; unii subieci sunt foarte sensibili la doze de succinilcolin, pentru c plasma lor conine o variant anormal de enzim; Alcooldehidrogenaza (ADH) este principala enzim care metabolizeaz etanolul; s-a decelat la om existena izoenzimelor i a polimorfismului ADH, ceea ce explc, cel puin parial, sensibilitatea rasial i individual la efectele etanolului; Monooxidaza transform benzantracenul (precancerigen) n epoxid (cancerigen); ntrun lot reprezentativ s-a gsit c 10 din subieci manifestau activitate monooxidazic puternic, fiind deci expui la cancer pulmonar datorat acestei hidrocarburi policiclice existente n mediu (fum deigar, pulbere de asfalt ); Glucozo-6-fosfat dehidrogenaza (G-6-PD) intervine n metabolizarea glucozei pe cale pentozic; deficitul n aceast enzim afecteaz 3% din populaia globului, dar deficitul rmne inaparent pn la administrarea unor substane oxidante (antimalarice, sulfamide, sulfone, analgezice-antipiretice), cnd calea pentozic este suprasolicitat i, deoarece desfurarea reaciilor pe aceast cale este dej deficitar (prin lipsa sa G-6-PD), apar hemoliz i methemoglobinemie, cu manifestrile clinice corespunztoare. Factori determinani ai sensibilitii embrionului la xenobiotice (dup Heusghem) Predominana proceselor de multiplicare i de difereniere celular Imaturitatea enzimelor de biotransformare Posibilitatea stimulrii enzimelor de biotransformare prin inductori enzimatici administrai mamei Structura chimic a xenobioticelor (metaboliilor) Modul de metabolizare a xenobioticelor Stadiul dezvoltrii embrionului Factori genetici i fiziopatologici materni Bioritmul. n raport cu cu durata bioritmurilor fa de durata zilei, acestea se clasific n ultradiene (peste 24 ore), ciecadiene (aprox. 24 ore) i infradiene (sub 24 ore). Ritmurile ultradiene se mpart, la rndul lor, n sptmnale, lunare, anuale. Ritmurile ultradiene au fost evideniate att la om ct i la animal. n general, reaciile sunt mai rapide i mai intense n perioada de veghe, cnd dinamica enzimatic este maxim, corespunznd la o producie maxim de energie, dect n perioada pasiv (de odihn i somn).
191

Loturi identice de animale au prezentat letaliti diferite, n funcie de ora administrrii, pentru unii ageni fizici (zgomot, radiaii X etc.) i chimici (nicotin, stricnin, fenobarbital, acetilcolin, etanol). La om, variaiile circadiene au fost evideniate pentru histamin, salicilat de sodiu, rezerpin, insulin, etanol, lignocain, clorotiazid, corticosteroizi etc. Factorii dependeni de mediu. Alimentaia, condiiile de confort, temperatura, presiunea atmosferic, zgomotul, radiaiile ionizante, poluanii din mediu, fumatul etc. au, de asemenea, efecte certe asupra toxicitii. 7. Combaterea efectelor toxice Profilaxia intoxicaiilor. Prin aplicarea msurilor tehnico-organizatorice i igieno-sanitare de profilaxie colectiv i individual se poate reduce numrul i gravitatea intoxicaiilor profesionale: Acestea prevd nlocuirea, acolo unde este posibil, a substanelor toxice i/sau modificarea proceselor tehnologice nocive; Legiferarea manipulrii substanelor nocive; Educaia sanitar i instructajele periodice de protecia muncii; Folosirea tehnologiilor de fabricare n instalaii ermetice i etane, a ventilaiei adecvate (natural i mecanic), a semnalizatoarelor de alarm la depirea CMA etc.; Supravegherea medical a muncitorilor prin: examen medical la angajare i depistarea unor predispoziii la intoxicaii, nlturnd acele persoane de la locurile de munc cu noxe i reducnd incidena intoxicaiilor profesionale (profilaxie primar); examen medical periodic i examene speciale, cnd se depisteaz intoxicaiile n stadiu incipient, lund msuri pentru evitarea agravrii lor; Examinarea toxicologic prin determinri ale toxicilor din atmosfera de lucru, ale toxicilor i metaboliilor din lichidele biologice, ale indicatorilor biologici modificai sub aciunea toxicilor; scopul final este stabilirea msurilor necesare pentru scderea concentraiilor toxicilor sub limita admis; Izolarea muncitorilor de mediul toxic (cnd trebuie lucrat ntr-un astfel de mediu) prin profilaxie individual: echipament de protecie i masc, aplicarea de unguiente de protecie, respectarea igienei individuale etc. Tratamentul intoxicaiilor acute (Primele msuri de reanimare respiratorie) Imediat dup evacuarea din mediul toxic, dac intoxicatul prezint respiraie anormal, culoare neobinuit a tegumentelor (roie deschis, albastr, cianotic), tulburri psihice, se trece, chiar la locul accidentului i n timpul transportului ctre o unitate sanitar, la aplicarea msurilor de prim ajutor, i anume: Eliberarea cilor respiratorii superioare se face prin desfacerea mbrcmintei de la gt, ndeprtarea eventualilor corpi strini din gur (proteze), tergerea cavitii bucale,
192

aspirarea mucozitilor. Pentru pstrarea cilor aeriene libere se menine gura intoxicatului ntredeschis pe tot timpul transportului, iar la intoxicatul incontient se asigur poziia de decubit lateral cu ajutorul unei pturi fcute sul, ceea ce permite scurgerea lichidelor de secreie i previne inhalarea de mucoziti etc. Respiraia artificial se aplic dac respiraia nu revine la normal i se practic prin prin procedeele gur la gur sau gur la nas (nu se aplic n intoxicaiile cu HCN, CN, gaze toxice, compui organofosforici). Intoxicatul va fi plasat n poziie de decubit dorsal, ntins pe un plan orizontal dur, cu capul n hiperextensie (cu ajutorul unui sul aezat sub cap). Oxigenoterapia, aplicat att n cursul respiraiei spontane, ct i artificiale, se practic de obicei prin sond nazofaringian (n intoxicaia cu CO este indicat oxigenoterapia hiperbar) 8. ndeprtarea toxicilor neabsorbii Provocarea de vrsturi se aplic n lipsa posibilitii efecturii splturii gastrice. Se administreaz intoxicatului 300 ml ap (o cantitate mai mare ar determina forarea pilorului i trecerea toxicului n duoden), apoi de declaneaz reflexul de vom prin excitarea mecanic a fundului gtului. Dup evacuarea coninutului gastric se repet operaia de ccccteva ori, cu noi cantiti de cte 300 ml ap, pn la o cantitate total de 3-4 litri ap. Metoda este contraindicat la intoxicaii comatoi, cardiaci, vrstnici hipertensivi i aterosclerotici, emfizematoi, gravide i parial contraindicat la ingerarea de corozivi i caustici concentrai i n mari cantiti, sau de distilate petroliere i detergeni, precum i la subiecii la care toxicul ingerat a provocat covulsii. Provocarea vrsturilor se poate realiza prin aplicare de vomitive ca sirop de ipeca sau apomorfin. Spltura gastric realizeaz ndeprtarea toxicilor neabsorbii din stomac. Dac intoxicatul este contient se practic spltura cu ap, suspensie de crbune activat, cu sau fr antidot, prin sonda Faucher introdus n stomac pe cale faringo-esofagian. Dac intoxicatul este comatos, sonda se introduce pe cale nazal, iar calea aerian este intubat cu o sond prevzut cu un balona obturator, pentru a evita aspirarea coninutului gastric n cile aeriene i asfixierea intoxicatului. Poriunile de lichid de spltur se pstreaz pentru analize toxicologice i chimico-legale. Purgativul de obicei sulfatul de sodiu este administrat dup golirea stomacului prin vrstur sau spltur (n acest caz purgativul este introdus prin sond). Splarea tegumentelor are rolul mpiedicrii absorbiei toxicului transcutanat. Dup ce se ndeprteaz rapid mbrcmintea, se spal tegumentele cu ap i spun (15 minute), de preferin sub du. Splarea sacului conjunctival se realizeaz cu ap n jet la presiune mic, timp de 5-10 minute, meninnd pleoapele ndeprtate de globul ocular. 9. Administrarea antidoturilor

193

Antidoturile sunt substane capabile s inactiveze toxicii prin fenomene fizice sau reacii chimice (antidoturi chimice sau antidoturi propriu-zise) sau s antagonizeze efectele toxicilor (antidoturi fiziologice sau antagoniti). Printre nsuirile antidoturilor se pot enumera: aciunea specific asupra unui complex funcional celular; o activitate ridicat; nu determin efecte adverse; nu elibereaz, prin biotransformare, metabolii toxici; posed un efect antidotic persistent pentru o perioad de timp cunoscut. Numrul antidoturilor cu aceste caliti este restrns, astfel nct numai 2% din intoxicaiile acute beneficiaz de tratament antidotic. Antidoturile se administreaz pe cale oral (nainte, o dat cu, sau dup spltura gastric) pentru inactivarea toxicilor neabsorbii din tubul digestiv, sau pe cale oral ori parenteral pentru inactivarea toxicilor deja absorbii. Antidoturile care inactiveaz toxicii din tubul digestiv acioneaz prin: Absorbie: crbunele activat adsoarbe unii toxici organici i anorganici. Adsorbia este micorat sau mpiedicat de alimentele din stomac care astup porii particolelor de crbune, dar nu este practic influenat de pH-ul mediului. Eficacitatea este maxim la 30 minute dup ingerarea toxicului, dar antidotul este util i mai trziu, cnd toxicul a trecut de pilor. Oxidoreducere:permanganatul de potasiu, n prezent rar folosit, este eficient n intoxicaia cu morfin, atropin, cocain, barbiturice etc. Activitatea antidotic este accentuat de mediul alcalin i limitat de causticitatea pentru mucoasa gastric. Formare de compui insolubili (puin solubili): albuul de ou i laptele, datorit proteinelor din compoziia lor, precipit ca albuminai unii alcaloizi i sruri de metale grele; fiind emoliente, scad efectele substanelor corozive i caustice. Sunt contraindicate n intoxicaia cu toxici liposolubili (paration, solveni organici etc.). Acidul tanic este rar folosit datorit hepatoxicitii sale; precipit alcaloizii, glicozizii, srurile metalice. Srurile solubile de calciu (lactat, gluconat, clorur) precipit acidul oxalic, acidul fluorhidric, fluorurile, ca sruri insolubile de calciu. Oxidul de magneziu precipit anhidrida arsenioas, arseniii, ca sruri de magneziu insolubile i este indicat, de asemenea, n intocsicaia cu acizi. Sulfatul de magneziu precipit srurile de bariu i de plumb, dnd combinaii insolubile. Clorura de sodiu precipit azotatul de argint. Formaree de compui solubili netoxici: unele substane antiacide, ca oxidul de magneziu, sunt indicate la ngerarea de acizi; nu se recomADN administrarea per os de bicarbonat de sodiu i carbonat de sodiu, deoarece n contact cu acizii degaj CO2, provocnd distensie gastric soldat uneori cu perforaia peretelui stomacal deja lezat. Unele substane antialcaline, cum ar fi soluia 1% de CH3COOH, se recomADN uneori la ngerarea bazelor caustice; este ns mai eficace administrarea, chiar la locul accidentului, de ap potabil, repetat, i provocare de vrsturi, deoarece mai trziu n intoxicaiile severe actul deglutiiei nu mai este posibil. Soluia de spun este antidot pentru detergenii cationici, dnd compui inactivi (dup care se provoac vrsturi). Chelatorii capabili s stabileasc legturi cu cationii metalici prin electronii neparticipani (de la N, -O, -SH) formeaz chelai ciclici, stabili, solubili, netoxici. Stabilitatea crete cu cifra de coordinare a metalului. Utilizarea chelatorilor ca antidot este limitat de : competiia ntre metalul toxic i metalele indispensabile organismului pentru
194

acelai chelator (spoliere de metale); competiia ntre chelatorul antidot i chelatorii naturali (compui cu grupri SH, ca enzime, tioaminoacizi etc.) pentru acelai metal (ineficiena antidotului). Principalii chelatori cu rol de antidot sunt: Srurile acidului etilendiaminotetraacetic (EDTA) (acid edetic) i compuii nrudii (fig. 10) sunt antidoturi n intoxicaii cu numeroase metale. De la acidul etilendiaminotetraacetic: (HOOCH2C)2NCH2N(CH2COOH)2 deriv urmtoarele antidoturi: EDTACaNa2 (Edetamin) este antidot n intoxicaia cu Pb, precum i cu alte metale (Ni, Cr, Fe, Cu, Mn, Cd, Co), dar puin eficace n cazul Hg. Are loc un schimb ionic ntre calciu i acel metal toxic cu mai mare afinitate pentru complexon dect Ca. Se formeaz complexonai (chelai interni) tridimensionali, cu stabilitate diferit, n funcie de constanta lor de disociere. EDTANa2 este recomADNat n intoxicaia cu digitalice, deoarece complexeaz 2+ Ca (crescut n acest tip de intoxicaie). EDTACo2 (Kelocyanor) este antidot n intoxicaia cu CN, pe care-l fixeaz n dou trepte, ntruct EDTACo2 se disociaz n dou trepte: EDTACo2 [EDTACo]2 + Co2+EDTA4 + 2Co2+ Co2+ + 6CN [Co(CN)6]4 Deoarece Kelocyanor se administreaz n doz mai mare dect este necesar pentru fixarea CN, rmne un exces de Co2+; din aceast cauz se administreaz, la 15 minute dup Kelocyanor, EDTACaNa2 care fixeaz excesul de Co2+. Kelocyanor manifest toxicitate la
COONa NaOOC H2C H2C N-CH2-CH2-N COO Ca CH2 OOC CH2 H2C H2C N-CH2-CH2-N COO Co CH2 OOC COO Co OOC CH2

EDTA-CaNa2 CH2 N-CH2 N-CH2 CH2 COONa COO Co COO COONa Na OOC CH2

EDTA-Co2 CH2 CH2 CH2 N-CH2 N CH2 CH2 N-CH2 CH2 COO COONa COONa COO Co

DCTA-CaNa2

DTPA-CaNa2

Fig. 4. Sruri ale EDTA si compusi nruditi.

nivel cardiovascular atunci cnd, din eroare, este administrat unui subiect neintoxicat cu CN. La supradozare apar efecte toxice. DCTACaNa2 (diaminociclohexantetraacetatul de sodiu i calciu) este folosit n intoxicaia cu Cd, pentru c formeaz chelai mai puin toxici dect EDTACaNa2.

195

 DTPACaNa3 (dietilentriaminopentaacetatul de sodiu i calciu) este recomADNat n intoxicaia cu radioelemente din seria lantanidelor, ca i cu unele metale grele (Pb, Fe, Mn). D-Penicilamina (, dimetilcisteina) (fig. 5) este antidot n intoxicaia cu metale grele, n special cu Hg (mineral i organic). De asemenea, este indicat n tratamentul bolii
COOH H3C H3C D - Penicilamina CH C NH2 SH H3C H3C COOH CH C NH2 S Hg/2

D - Penicilamina

Fig. 5. D - Penicilamina

Wilson (o degenerare hepatolenticular prin depunere intracelular de Cu n ficat, consecin a unui deficit n ceruloplasmin). Este contraindicat n intoxicaia cu Cd (formeaz chelai nefrotoxici). Toxicitatea D-penicilaminei fiind redus, permite un tratament ndelungat; s-au semnalat i unele reacii adverse. Ditiocarb (dietilditiocarbamatul de sodiu), (C2H5)2NC(S)SNa este recomADNat n special n intoxicaia cu nichel carbonil. Desferioxamina (Desferal) (fig. 6)este recomADNat n intoxicaia cu fier i n hemocromatoz. Fierul este eliminat prin legare covalent la nivelul resturilor hidroxamice,
H2N-(CH2)5-N-C-(CH2)2-C-N-(CH2)5-N-C-(CH2)2-C-N-(CH2)5-N-C-CH3 HO O O H HO O OH HO O

Fig. 6. Desferioxamina (Desferal) rezultnd un complex ferioxamic eliminabil renal. Desferal nu scoate Fe2+ din hemoglobin, citocromi etc. i nici nu spoliaz organismul n alte microelemente.

Antidoturi cu grupri SH (care nu formeaz legturi coordinative): Dimercaptopropanolul (DMP) a fost utilizat pentru prima dat (1941) ca antidot al levizitei (se mai numete BAL, de la cuvintele British Anti-Lewisite). Este utilizat ca antidot n intoxicaiile acute cu As i Hg (mineral), ns este mai puin eficient n intoxicaiile cu Cd, Pb, Fe, Se, V, ca i n cazul leziunilor hepatorenale grave. DMP leag metalul n stare ionic din combinaiile organice sau fixat pe SH din enzime (proteine) (fig. 12). Acesta are dezavantajul spolierii organismului de unele metale utile (Cu, Zn, Ca, Mg) i inactivarea insulinei, citocromoxidazei etc. datorit aciunii reductoare a gruprilor SH. Dimercaptosuccinatul de sodiu, este recomADNat n intoxicaia cu HgCl2 i a fost
NaOOC CH CH COONa SH SH

ncercat i n intoxicaia cu Pb (1978). Este mai puin toxic dect DMP i nu spoliaz organismul de microelemente. Thiola (2-mercapto-propionilglicocolul), este indicat n intoxicaia cu compuii Hg.
CH3-CH-CO-NH-CH2-COOH SH
196

 Reactivatorii colinesterazei de tip aldoximic au fost introdui n terapeutic n 1955 de Wilson. n prezent se folosesc: Pralidoxima (PAM-2) (metiliodura de piridilaldoxim) i obidoxima (toxogonin) (Cotru, 1993). Substanele organofosforice insecticide, substane toxice de lupt etc. blocheaz centrul activ al acetilcolinesterazei (AchE), mpiedicnd accesul la enzim al substratului su natural, acetilcolina; aceasta se acumuleaz la nivelul sinapselor, conducnd la fenomene toxice. Reactivarea AchE are loc spontan, dar lent prin hidroliz. Mecanismul acestei reactivri este urmtorul: blocarea AchE de ctre substanele organofosforice const din fosforilarea sa, prin stabilirea unei legturi covalente ntre P i O din hidroxilul serinei (component a centrului esterazic al AchE). Aldoxima se plaseaz cu azotul cuaternar n dreptul centrului anionic al AchE; hidrogenul de pe gruparea oxim reface centrul esterazic al AchE (:NHO) iar restul fosforic se leag de aldoxim, elibernd enzima (v. insecticide organofosforice). Acest proces are loc dac tratamentul este aplicat imediat, cnd enzima este reactivat (tnr). Dac tratamentul este tardiv, enzima este nereactivabil (mbtrnit), rmnnd definitiv blocat. Se presupune c aldoxima reacioneaz, n afara acestui mecanism de reactivare, i prin facilitarea transmisiei neuromusculare pre- i postsinaptice, ceea ce contribuie la revenirea la normal a transmisiei blocat de ctre organofosforice. Toxigoninul, dei are n structur doi radicali amoniu cuaternar, poate strbate bariera hematoencefalic, permind reactivarea acetilcolinesterazei din SNC. Antidoturile fiziologice (antagonitii) sunt: Atropina este folosit n intoxicaia cu substane organofosforice, n care caz combate efectele muscarinice declanate de acumularea de acetilcolin, ns nu acioneaz asupra blocrii periferice a transmisiei neuromusculare din aceast intoxicaie. Administrarea de atropin trebuie efectuat urgent, chiar la locul accidentului, i n doze mari; pericolul supradozrii este mai mic dect cel al subdozrii, iar dozele mici de atropin pericliteaz viaa intoxicatului. Fizostigmina (eserina), o amin teriar, combate aciunea substanelor anticolinergice (colinolitice), fiind un inhibitor reversibil al colinesterazei. Asemntor acioneaz i aminele cuaternare neostigmina (prostigmin), miostin) i piridostigmina. Nalorfina, levalorfanul i naloxanul combat efectele toxice majore ale analgezicelor narcotice de tip morfinic, acionnd competitiv asupra acelorai receptori i crescnd sensibilitatea centrului respirator fa de bioxidul de carbon. Aceti antagoniti nu sunt recomADNai n intoxicaia cu alte deprimante ale SNC. Vitaminele utilizate ca antidoturi sunt: Acizii folic i folinic sunt antidoturi n intoxicaia cu citostatice (aminopterin, metotrexat). Acidul folic se reduce, succesiv, la acizii di- i tetrahidrofolic sub aciunea reductazelor specifice. Acidul tetrahidrofolic trece, prin formilare, n acid folinic, care ia parte la sinteza bazelor purinice i pirimidinice necesare formrii acizilor nucleici. Citostaticele acioneaz ca antimetabolii ai acidului folic, inhibnd reductaza acidului dihidrofolic, deci

197

blocnd sinteza acidului folinic, respectiv a acizilor nucleici. Administrarea acizilor folic i folinic restabilete aceast sintez. Fitomendiona (vitamina K1) este antidotul specific pentru anticoagulantele orale derivai de cumarin i indantion. Vitamina K1 are rol de coenzim n sinteza complexului protrombinic, implicat n coagulare. Anticoagulantele orale acioneaz ca antimetabolii ai vitaminei K1, nct intoxicaia cu aceste medicamente conduce la blocarea sintezei complexului protrombinic, exprimat prin hemoragii. Administrarea de vitamin K1 determin creterea sintezei complexului protrombinic. Hidroxicobalamina (vitamuna B12a) este indicat n intoxicaia cu cianuri, deoarece are mare afinitate pentru CN, dislocuindu-l din ciancitocromoxidaz. Hidroxilul fixat pe Co din vitamina B12a este nlocuit cu CN, rezultnd ciancobalamina (vitamina B12). Aciunea antidotic a vitaminei B12a este sinergic cu a tiosulfatului. Piridoxina (vitamina B6) este antidot fiziologic n intoxicaia cu izoniazid, care se nsoete de scderea piridoxemiei. Antidoturile cu aciune indirect sunt: Nitritul de sodiu (sau amil) este antidot pentru CN. Nitritul produce methemoglobin care, avnd mai mare afinitate pentru citocromoxidaz dect ionul cian, l deplaseaz i formeaz cianmethemoglobin, elibernd astfel citocromoxidaza. Tiosulfatul de sodiu este antidot pentru CN, ns prin alt mecanism dect nitritul. n mod normal CN se detoxific sub aciunea rodanazei. Administrarea tiosulfatului, substratul necesar enzimei, accelereaz ritmul de formare a SCN. Albastrul de metilen este antidot pentru methemoglobinizante. Acestea transform o parte de Hb (Fe2+) n MetHb (Fe3+) incapabil de a transporta oxigenul. Albastrul de metilen funcioneaz ca un sistem redox: el se reduce la derivatul leucometilen, care reduce apoi MetHb la Hb. Derivatul leucometilen se reface, oxidndu-se prin intermediul sistemului diaforazic, avnd drept coenzime pe NADH i NADPH. n acest mod se activeaz concomitent ciclul pentozic, dependent de aceste coenzime. Alte sisteme redox utilizate ca antidoturi pentru methemoglobinizante sunt tionina i acidul ascorbic. Etanolul este antidot pentru metanol i etilenglicol. Ambii alcooli i manifest toxicitatea, n mare msur, prin metaboliii lor toxici. Metabolizarea are loc sub aciunea alcooldehidrogenazei (ADH), iar aceeai enzim catalizeaz i metabolizarea etanolului, pentru care posed ns mai mare afinitate dect pentru ceilali alcooli. Prin administrare de etanol n intoxicaiile cu metanol i etilenglicol, metabolizarea acestora este blocat, cci ADH este saturat de etanol. Clorura de sodiu este antidot pentru Br. Fiind mai hidrosolubil dect Cl, ionul de brom l nlocuiete pe acesta din mediile biologice, rezultnd fenomene toxice. Administrarea de ser fiziologic concomitent cu salidiuretice determin o diurez forat salin, cnd se elimin att NaCl ct i NaBr, debarasnd astfel organismul de Br. Oxigenul hiperbar (2-3 atm) este antidot pentru CO, combtnd hipoxia determinat de acesta. Aciunea antidotic se bazeaz pe competiia ntre CO i O2 pentru hemoglobin, mioglobin i citocromi. Administrarea de O2 100%, sub presiune, determin creterea
198

cantitii de O2 solvit n plasm, cu reducerea hipoxiei i accelerarea procesului de descompunere a carboxihemoglobinei n hemoglobin i CO. Citocromul C este recomADNat uneori n intoxicaia cu CO, deoarece ntrerupe lanul reaciilor care conduc la hipoxie tisular. Pseudocolinesteraza exogen sau plasma joac rol de tampon fiziologic n intoxicaia cu organofosforice, suplinind colinesteraza plasmatic inhibat de toxic. Favorizarea eliminrii toxicilor absorbii. Se aplic diferite metode n funcie de natura intoxicaiei. Diureza forat se recomADN n cazul toxicilor ce se elimin, de regul, pe cale renal. Hemodializa se aplic toxicilor dializabili, iar hemoperfuzia toxicilor absorbabili pe crbune activat. n cazul toxicilor gazoi i volatili se aplic ventilaia mecanic, iar n cel al oxidului de carbon, oxigenoterapia hiperbar. Tratamentul symptomatic. Msurile de asigurare a funciilor vitale constituie adesea primul act din ansamblul msurilor terapeutice de urgen.

199

Cap. VIII Otrvirea cu pesticide Pesticidele sunt substane utilizate pentru protejarea chimic a plantelor mpotriva duntorilor i pentru asigurarea strii de sntate n cadrul bolilor transmisibile prin insecte sau ali duntori. n funcie cu aciunea lor principal, pesticidele se pot mpri n zece categorii: fungicide i bactericide; insecticide; acaricide; produse cu aciune mixt; nematocide i sterilizani ai solului; rodenticide, moluscocide, repeleni; erbicide; defoliani i desicani; regulatori de cretere; produse auxiliare. Dup gradul lor de toxicitate, exprimat prin DL50 mg/kg, oral, la obolan, pesticidele se clasific n: grupa I, extrem de toxice (sub 50 mg/kg), grupa II, toxice (50-200 mg/kg), grupa III, moderat toxice (200-1000 mg/kg) i grupa IV, puin toxice (peste 1000 mg/kg). Otrvirea cu insecticide se poate produce neintenionat prin confuzie, n majoritatea cazurilor victimele orind s consume buturi alcoolice sau s bea ap au nghiit insecticid din flacoane neetichetate i depozitate necorespunztor. Sunt i cazuri de otrvire intenionat, crim sau sinucidere. In Evul Mediu se utiliza frecvent trioxidul de arsen (oricioaica), utilizat ca rodenticid. Controversat este cazul Mdlinei Manole care a decedat dup ingerare de furadan, un pesticid carbamic. 1. Insecticide Otrvirea poate fi produs i de insecticide diverse. Distrugerea insectelor se poate realiza cu substane minerale, care sunt compui ai As, Pb, F, Se, HCN, H2S, PH3, AsH3, CS2, precum i compui organici din diferite clase. 1.1 Insecticide organoclorurate Insecticidele organoclorurate sunt derivai halogenai ai difeniletanului (DDT) i ciclohexanului (HCH), derivai halogenai policiclici (Aldrin, Dieldrin, Clordan, Heptaclor) i terpenici (Toxafen, Camfen policlorurat ). Insecticidele organoclorurate sunt pulberi cristaline albe, inodore sau cu miros specific, insolubile n ap, solubile n solveni organici i lipide. Sunt utilizate sub form de pulberi i soluii. Toxicocinetic. Insecticidele organoclorurate ptrund n organism pe cale respiratorie, transcutanat, digestiv. Fiind liposolubile, se localizeaz n esutul adipos, ficat, mduva osoas, creier. Se depoziteaz n esutul adipos al omului, de unde se mobilizeaz prin pierdere ponderal brusc, cu apariia intoxicaiilor. Dup biotransformare, acestea se elimin urinar lent. Sunt toxici cumulativi. Toxicodinamie. Insecticidele organoclorurate sunt neurotoxici. Iniial provoac excitaie la nivelul SNC, cu tulburri motorii, apoi deprimani, cu afectarea centrilor respiratori. DDT, Lindan, Aldrin i Dieldrin provoac tulburri cardiovasculare, n timp ce Clordan, Aldrin, Dieldrin, Heptaclor sunt hepatotoxici. Acestea prezint un anumit potenial cancerigen. Au o mare stabilitatea i, de aceea, las reziduuri n produsele alimentare sau se acumuleaz n grsimea i carnea animalelor de unde trec la om, pentru a se acumula n
200

lipide. Dozele letale sunt: 20 g DDT, Clordan, 7-15 g Lindan, 7 g Toxafen, 3-5 g Aldrin, Dieldrin, Heptaclor.
Cl H Cl H Cl Cl H Cl H Cl H Cl C Cl Cl Cl Cl Cl C Cl Cl Cl Dieldrin (hexaclor-epoxi-octohidroendo-exo-dimetan-naftalen) Cl H C H O Cl Cl Cl Clordan (octoclor-tetrahidro-endo-metan-indan) Cl C Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Heptaclor (heptaclor-tetrahidro-endo-metan-indan) Aldrin (hexaclor-hexahidro-endoexo-dimetan-naftalen) Cl Cl C Cl Cl H C H

Cl

CH CCl 3 DDT (diclordifenil-tricloretan)

Cl

H Cl HCH (hexaclorciclohexan)

Diverse insecticide organoclorurate Simptomatologie. n cazul otrvirii cu insecticide organoclorurate, apar, iniial, semne de iritaie gastric (greuri, vrsturi, diaree), urmate de excitaie nervoas, apoi deprimare (parestezii, tremurturi, cefalee, ataxie, confuzie, convulsii i moarte prin insuficien respiratorie). Poate apare i fibrilaie ventricular cu moarte subit. n cazul Lindan-ului s-a semnalat i scderea acuitii vizuale pn la orbire. La derivaii policiclici, fazele de excitaie alterneaz cu cele de deprimare. Simptomatologia poate fi mascat de solvenii organici n care aceti compui sunt dizolvai. Primul ajutor. n lipsa convulsiilor se aplic spltur gastric i purgativ salin. Se administreaz anticonvulsivante. Sunt contraindicate: purgativele uleioase, laptele, grasimile, precum i adrenalina (risc de fibrilaie). La contaminarea tegumentelor, se spal acestea cu ap i spun. Analiza toxicologic. In caz de deces, se extrag cu solveni organici compuii organoclorurai i se separ i identific prin GC-MS. Din produsele alimentare se extrag cu aceton, benzen, diclormetan. Identificarea se realizeaz prin reaciile pentru ionul de clorur (dup saponificare) sau prin reaciile specifice fiecrui compus organoclorurat n parte. Dozarea se bazeaz pe nitrare, declorinare i dozarea C6H6, n cazul HCH, precum i pe gazcromatografie. 1.2 Insecticide organofosforice Majoritatea insecticidelor organofosforice (peste 50 000 produse organofosforic) provoac frecvente intoxicaii acute. Tipul reprezentativ al acestei clase este Parationul.

201

Proprieti. Majoritatea insecticidelor organofosforice sunt substane lichide, incolore sau glbui, cu tensiune mare de vapori. Unele dintre ele posed grupri hidrofile i sunt solubile n ap, celelalte sunt insolubile. Sunt instabile chimic i se descompun n prezena apei, luminii i oxigenului. Au remanen redus. Toxicocinetic. Insecticidele organofosforice ptrund n organism pe cale respiratorie, transcutanat i digestiv. Se absorb rapid i se distribuie n ficat, rinichi, plmni i mai puin n muchi, miocard, creier, fr a se acumula. Biotransformarea se realizeaz prin desulfurare oxidativ (Parationul trece n paraoxon, iar acesta se hidrolizeaz n dietilfosfat i pnitrofenol), hidroliz cu detoxifiere (Dipterex), N-demetilare (Rogor) sau N-dezalchilare (OMPA). Sistox sufer desulfurare oxidativ, ambii izomeri formeaz sulfoxizi i sulfone, mai toxici dect produii iniiali. Toxicodinamie. Insecticidele organofosforice i manifest aciunea toxic prin inhibarea acetilcolinesterazei (AchE), dup ptrundere n fanta sinaptic. n prima etap are loc orientarea spaial: acetilcolina se plaseazcu polul su pozitiv (azot cuaternar) n dreptul centrului anionic al AchE i cu polul negativ (gruparea electrofil C = O) n dreptului centrului esterazic al AchE (constituit din azotul histidinei i hidroxilul serinei). ntr-o a doua etap, se realizeaz apropierea i adsorbia de suprafa, deoarece ncrctura electric este de semn contrar; la centrul anionic se manifest fore van der Waals cu azotul cuaternar, iar la centrul esterazic, o legtur covalent ntre C (din C = O) i O (din OH al serinei). n etapa final, H de la N histidinic trece pe oxigenul alcoolic, rezultnd colina care, fiind slab legat la centrul anionic, se desprinde din complex. Radicalul acetil legat covalent reacioneaz cu apa refcnd centrul esterazic i formare de acid acetic. Viteza de hidroliz a acetilcolinei este foarte mare: 21015 molecule pe secund. Inhibarea AchE de ctre insecticidele organofosforice are loc n mod similar. Gruparea fosforic se plaseaz n dreptul centrului esterazic al AchE. Centrul anionic nu intr n reacie. Dup formarea complexului AchEIOP, H de la N histidinic trece pe un radical al insecticidului care se elimin, iar radicalul fosforic legat covalent blocheaz AchE, mpiedicnd accesul substratului natural, acetilcolina. Aceasta se acumuleaz la nivelul sinapselor, cu stimularea, apoi inhibarea transmisiei sinaptice. Spre deosebire de hidroliza rapid a acetilcolinei, hidroliza spontan a insecticidelor organofosforice cu eliberarea acidului fosforic i regenerarea enzimei are loc extrem de lent, realiznd inhibiia cvasiireversibil a AchE. Aceste substane manifest i aciune toxic direct asupra miocardului, exprimat prin tulburri de ritm i conducere aprute la cteva zile dup intoxicare, cnd starea bolnavului se ameliorease i valorile colinesterazei plasmatice erau n cretere. Aceste insecticide, TEPP, Paraoxon, Paration, Diclorvos, OMPA, Metilparation, Sistox (izomerul tiolo este mai toxic dect cel tiono) sunt foarte toxice. Pe de alt parte, Rogor, Dipterex sunt moderat toxice, iar Clortion i Malation slab toxice. Dozele letale (oral) sunt de 100 mg pentru Paration i 150 mg Metilparation. Simptomatologie. n caz de otrvire se constat: mioz, hipersecreie glandular generalizat, hipersecreie bronic, tulburri digestive, hipotensiune, bradicardie, colaps,

202

anxietate, somnolen, convulsii i com. De asemenea, pot apare fibrilaii musculare, convulsii tetanice i, n cazuri grave, paralizia muchilor respiratori. Intoxicaia cronic se exprim prin tulburri neuropsihice (oboseal, anxietate, iritabilitate, parestezii, tremor,cefalee), digestive, opresiune toracic, mioz, transpiraii.
H5C2 O H5C2 O P O O NO2 H3C O H3C O P O O CH = CCl2 H5C2 O H5C2 O S O NO2

Paraoxon (p-Nitrofenil, dietilfosfat) H3C O H3C O P S O NO2

Diclorvos (Diclorvinil,dimetilfosfat) H5C2 O H5C2 O P S O (CH2)2 S C H 2 5 +

Paration (p-Nitrofenil,dietilfosfat) H5C2 O H5C2 O P O O (CH2)2 S C H 2 5

Metilparation (p-Nitrofenil,dimetiltiofosfat) S H3C O P S CH COO C H5 H3C O 2 CH2 COO C2H5 Malation (Ditiofosfat de dimetil, 1,2-dicarboxietil) H5C2 O H5C2 O P O P O O O

Sistax H3C O H3C O P S S CH2 CONHCH 3 H3C O H3C O O

Rogor (Ditiofosfat de dimetil N-metil-carbamoil-metil) C2H5 (H3C)2 N (H3C)2 N

CH CCl3 OH Dipterex (Triclor,1-hidroxietilfosfat de dimetil) N(CH3)2

O C2 H5

TEPP (Tetraetil pirofosfat)

N (CH3)2 O O OMPA (Schradan) (Octametil-tetraamida acidului pirofosforic)

P O P

Insecticide organofosforice reprezentative

H5C2 O H5C2 O O O NO2 H5C2 O H5C2 O H3C O H3C O H3C O H3C O H5C2 O H5C2 O P S(O) O H5C2 O H5C2 O H3C O H3C O P O OH O OCH CCl 2 P S(O) O H3C O H3C O (H3C)2 N (H3C)2 N S + CH2 CCl3 OH P OH O + HO NO2

H3C O H3C O

O CH CCl 3 OH

+ H2O HCl

O (CH2)2 S C H 2 5 S S CH COO CH5 2 CH2 COOH

O (CH2)2 S C H 2 5 O P S S CH COOH

S CH2 CONH 2
N(CH3)2

H3C O H3C O

P O P O

CH2 COOH

N CH3 O CH OH 2

Metabolizarea unor insecticide organofosforice

203

Primul ajutor. Se administreaz atropin i reactivatori ai colinesterazei (PAM i Toxogonin). Atropina se injecteaz imediat i.v. n doz de 1-5 mg, apoi cte 1-5 mg i.v. sau i.m. la intervale de 5, 10, 20, 30 minute, pn la apariia semnelor de atropinizare (uscciunea gurii, midriaz, tahicardie). n urmtoarele zile se administraz s.c. 1 mg atropin la 4-6 ore. Concomitent, se administreaz Toxogonin 1-6 fiole i.m. Dup primele doze de antidoturi se efectueaz spltura gastric cu suspensie de crbune activat n soluie de NaHCO3 5%, urmat de administrare de Na2SO4. Se trateaz convulsiile. n intoxicaia prin contact se ndeprteaz mbrcmintea i se spal tegumentele cu ap i spun, 15 minute. Sunt contraindicate: administrarea de lapte, purgativ uleios, medicamente deprimante ale respiraiei. Analiza toxicologic. Insecticidele organofosforice se separ din mediile biologice prin metodele Stas-Otto-Ogier sau Florence (pentru snge). Cele volatile se izoleaz prin antrenare cu vapori de ap. Se pot extrage i cu solveni organici din mediu acid. Pentru identificare, se face hidroliz n mediu acid i oxidare; se determin P prin formare de albastru de molibden. Se pot identifica i doza cromatografic i spectrofotometric n U.V. i I.R. Pentru diagnostic i evoluia intoxicaiei se determin activitatea colinesterazei. Identificarea i dozarea Parationului se bazeaz pe reducerea NO2 la NH2, apoi formarea azoderivatului sau indofenolului.

O NHCH 3 N

CH(CH 3)2 N O C O N(CH 3 )2

Carbaril (metilcarbamat de alfa-naftil)

H3C

Izolan (dimetilcarbamat de izopropil-metilpirazol)

Unele insecticide carbamice

Insecticidele carbamice sunt inhibitori ai colinesterazei, ns, spre deosebire de insecticidele organofosforice, ptrunderea n SNC este minim, inhibarea este de scurt durat, iar reactivarea enzimei are loc spontan. Doza letal pentru cel mai toxic compus carbamic (Izolan) este de 6 g.

204

Acetilcolina + (H3C)3N CH2 CH2 O C O CH3 + (H3C)3N CH2 CH2 O C O CH3

Centru anionic

.. N....H O Centru Histidina

esterazic

+ N H O

Serina Complex AchE - acetilcolina O CH3 H2O .. N....H O AchE reactivata HO C O CH3

Acetilcolinesteraza (AchE) + (H3C)3N CH2 CH2 OH .. N AchE acetilata Insecticid organofosforic (IOP)

O O2 N C6H4 O P RO OR .. N....H O AchE

O2 N C6H4 O RO + N H

O OR

Complex AchE - IOP

O2 N C6H4 OH RO .. N

O OR H2O

HO RO

O OR

.. N....H O AchE reactivata

AchE fosforilata

Mecanismul de toxicitate al insecticidelor organofosforice prin inhibarea acetilcolinesterazei

205

1.3 Rodenticide Pentru distrugerea roztoarelor i a altor vertebrate duntoare se utilizeaz substane vegetale (Scilla maritima), minerale(fosforul alb, fosfuri de zinc sau aluminiu, derivai de arsen, sruri de bariu sau taliu) i organice (stricnin, veratrin, produi de sintez).
S NH2 NaS C O Cl (Cl) O Pival (2-pivaloil-1,3-indandiona) CO-C(CH 3)3

HN

NH2 N-N = N

ANTU (alfa-naftiltiouree)

Promurit (p-clor-fenildiazotiouree) Clorpromurit (3,4-diclor-fenildiazotiouree)

O OH C6H4Cl CH CH2 OH C6H5 CH O O CH2 O Nidan (2-naftil-1,3-indandiona)

O O C CH3 O Cumaclor 3-(alfa-clorfenil-beta-acetiletil)-4-hidroxicumarina

O O C CH3 Warfarina 3-(alfa-fenil-beta-acetiletil)-4-hidroxicumarina

Exemple de rodenticide utilizate pentru uciderea roztoarelor Derivaii de tiouree sunt slab toxici la om. La ingerarea unei mari cantiti de substan poate surveni moartea prin insuficien respiratorie sau cardiovascular. n intoxicaia acut se recomand administrarea Na2S2O3 soluie 10%, 10 ml i.v. Anticoagulantele de sintez (Warfarin, Cumaclor, Pival, Nidan) se comport ca antimetabolii ai vitaminei K; urmare a blocrii sintezei complexului protrombinic, scade protrombina cu apariia hemoragiilor. Antidotul este vitamina K1 (fitomenadiona), 50-100 mg i.v., lent, n primele 24 ore. Fluoroacetatul de sodiu, FCH2COONa, determin, prin sintez letal, formarea de acid fluorhidric, cu manifestri toxice determinate de inhibarea ciclului Krebs i spolierea organismului de Ca2+. Antidotul este glicerolmonoacetatul (Monoacetin), donor de acetat. Analiza toxicologic. ANTU se extrage cu CHCl3, se hidrolizeaz alcalin i se identific naftilamina rezultat prin reacia Griesz. Warfarina se extrage cu CHCl3 n mediu acid, se nitreaz, se reduce NO2 la NH2, se diazoteaz i se cupleaz. Fluoroacetatul se identific, dup hidroliz alcalin, prin F rezultat. 1.4 Erbicidele Sunt substane minerale (NaClO3, CaCN2, CuSO4, NH2SO2ONH4, Na2B4O7, NaBO2) i organice utilizate la distrugerea buruienilor, fr afectarea plantelor utile.

206

Ariloxiacizii (Diclordon, Agroxon, Triclordon) interfer n metabolismul glucidelor, cu manifestri la nivelul sistemului nervos, miocardului, ficatului i rinichilor. Sunt toxici cumulativi. Doza letal este de 6 g. n intoxicaia acut se recomand spltura gastric i tratament simptomatic. Derivaii ureici provoac intoxicaii acute (tulburri digestive, neurologice i hepatorenale) i cronice (cefalee, astenie, dermatoze, agranulocitoz). Cel mai toxic reprezentant al clasei este tioureea, care prezint i proprieti abortive.
O COOH R1HN Alanap (N-naftilamida acidului ftalic) O-CH2-COOH Cl Cl Agroxon (acid 2 metil, 4 clorfenoxiacetic) O-CH2-COOH CH3 Cl Cl Triclordon (2,4,5 D) (acid 2,4,5 triclorfenoxiacetic) O-CH2-COOH Cl N N Cl N Simazin: R1 = C2H5 R2 = C2H5 Atrazin: C 2H5 CH(CH 3)2 NHR2 Propazin: CH(CH 3)2 CH(CH3)2

HN

Cl Diclordon (2,4 D) (acid 2,4 diclorfenoxiacetic)

H3C

+ N Paraquat

+ N CH3 . 2CH SO 3 4

Erbicide utilizate n agricultur la distrugerea buruienilor Derivaii ftalici (Alanap; doza letal= 1 g) determin leziuni corozive pe tractul gastrointestinal, cu simptomatologie i tratament ca la acizii corozivi. Diazinele i triazinele (Simazin, Atrazin, Propazin) sunt lipsite de toxicitate i nu sunt iritante. Paraquatul (metilsulfat de 1,1,4,4 dipiridiniu) acioneaz toxic prin legare de acizii nucleici i mucozaharidele intercelulare. 1.5 Insecticidele dinitrofenolice. Dinitrofenolii (DNOC, Dibutox, Dinex) sunt toxici celulari, decuplani ai fosforilrii oxidative, cu scderea formrii de ATP. Ca urmare, energia nu mai este stocat, ci risipit sub form de cldur, consumul de oxigen este mrit, iar mitocondriile
OH O2N CH3 O2N OH CH-CH2-CH3 CH3 NO2 DNOC (dinitro-ortocrezol) NO2 207 Dibutox (dinitro-o-sec.butilfenol) NO2 Dineb (dinitro-o-ciclohexilfenol) O2N OH C6H11

miocardului, muchilor scheletici, ficatului, rinichilor, sunt lipsite de energia stocat de obicei n ATP. Doza letal este de 1-3 g; pot determina intoxicaii grave prin acumulare. Primul ajutor const din spltur gastric cu NaHCO3 soluie 5% i purgativ salin, combaterea hipertermiei (bi reci), combaterea convulsiilor, oxigenoterapie, aport de lichide.

1.6 Toxicologie de laborator

Determinarea parationului
O S P O C2H5 O C2H5 NO2

A. Izolare Parationulse izoleaz din mediul acid cu solveni organici. Fiind volatili, poate fi izolat i prin antrenare cu vapori de ap. a. Izolare din urin: se aciduleaz 25-50 ml urin cu acid clorhidric 10% i se extrag de minimum m 2 ori cu volume egale de eter etilic. Extractele organice reunite sunt filtrate printr-un filtru uscat. Filtratul este evaporat la sec pe baia de ap. b. Izolare din snge: se trateaz 5-10 ml snge cu 5-10 ml acid tricloracetic 20%. Se filtreaz, iar filtratul se extrage de minimum 2 ori cu cte 20 ml eter etilic. Extractele eterice reunite sunt filtrate printr-un filtru uscat. Filtratul este evaporat la sec pe baia de ap la 50C. c. Izolare din coninut stomacal: se tritureaz 5-10 ml coninut stomacal cu sulfat de sodiu anhidru, pn la obinerea unei mase pulverulente. Se extrage masa cu o cantitate dubl de eter de petrol. Extractul este evaporat la sec. d. Izolare din organe: se extrag 20 g organe prin metoda Stas-Otto-Ogier. Parationul i p-nitrofenolulprincipalul sau metabolit-se regsesc n eterul acid. c. Izolare din produse alimentare sau corpuri delicte: se extrage o cantitate din produsul de analizat cu un volum egal de alcool etilic, ntr-un borcan cu dop rodat, timp de 20 minute. Se decanteaz i se filtreaz extractul alcoolic ntr-un balon cotat de volum corespunztor i se completeaz la semn cu alcool etilic. B. Identificare 1. Teste preliminare a. Din coninut stomacal: 1. Se nclzete pe baia de ap o cantitate de coninut stomacal cu volum dublu de alcool etilic absolut. Se filtreaz pe sulfat de sodiu anhidru i se evapor filtratul la sec. Se trateaz reziduul cu 12 ml hidroxid de sodiu 20% i se fierbe cteva minute. Prin hidroliz se elibereaz p-nitrofenolul, care n mediul alcalin, prezint o coloraie galben, p-nitrofenolat de sodiu, iar la acidulare, coloraia dispare p-nitrofenol.
208

2. Se concentreaz, prin evaporare pe baia de ap, o cantitate de coninut stomacal pn la 1/4 din volumul su. Se trateaz cu 1 ml perhidrol i se nclzete din nou. Dup distrugerea, pe aceast cale, a substanelor organice care ar deranja reacia, se alcalinizeaz cu hidroxid de sodiu 20% i se fierbe cteva minute, cnd apare o coloraie galben. b. Din snge i urin: se deproteinizeaz 2-5 ml snge sau 5-10 ml urin cu acid tricloracetic 20%. Se filtreaz, se alcalinizeaz filtratul cu hidroxid de sodiu 20% i se fierbe cteva minute, cnd apare coloraia galben. 2. Reacii de culoare a. Reacia Averell-Norris: reziduul se trateaz cu 2 ml acid tricloracetic 10%. Se trece ntr-o eprubet i se adaug 1-2 granule de zinc amalgamat. Se nclzete 5-10 minute pe baia de ap la fierbere. Se filtreaz, se rcete, se adaug 0,2 ml nitrit de sodiu 0,1%. Se agit i se las n repaus 15 minute. Se adaug 0,2 ml N-naftiletilen-diamin (NKD) 0,1%, cnd apare o coloraie violet. b. Reacia de formare a derivailor chinoniminici: 1. Reziduul se trateaz cu 2 ml hidroxid de sodiu 5% i 0,5 g aliaj Dewarda (10 p.Cu, 9p.Al, 1p.Zn, reductor n mediul alcalin, prin hidrogenul n stare nscnd pe care-l degaj), cnd se formeaz prin reducerea p-nitrofenolului. Se adaug dup 15 minute, 0,5 ml ortocrezol 1% n alcool i 1-2 ml ap oxigenat. Se obine prin cuplarea p-nitrofenolului cu o- crezolul, un derivat chinonimic deculoare albastr. 2. Reziduul se trateaz cu 2 ml hidroxid de sodiu 5%. Se adaug cteva cristale de ditionit de sodiu, Na2S2O2. Dup cteva minute se distruge excesul de ditionit cu acid clorhidric 10% , apoi se adaug 1 ml alfa-naftol 1% n alcool, sau 1 ml oxin (S-hidroxichinolin) 1% n alcool i 1 ml perhidrol. Se alcalinizeaz la pH = 8-9 cu hidroxid de sodiu 10% . Se obine, prin cuplare p-nitrofenolului cu alfanaftol sau oxina, un derivat chinoniminic de culoare albastr. c. reacia de formare a p-nitrofenolatului de sodiu se trateaz reziduul cu cteva picturi de perhidrol si 3-5 ml hidroxid de sodiu 20%. Se nclzete, pe baia de ap, la fierbere , 15 minute. Prin hidroliz n mediul alcalin se formeaz p-nitrofenolatul de sodiu de culoare galben. Soluia se decoloreaz prin acidulare. 3. Cromatografie pe strat subire Suportul: plci cu silicagel G activate 20-30 minute la 110C . Spotarea: reziduul se reia cu 0,2-0,3 ml aceton. Martori: paration, malation n 0,2-0,3 ml aceton. Sistemul de developare: eter de petrol: aceton (75 : "5). Revelarea: - expunerea plcii n lumin Wood spoturi galbene pulverizare cu: a. soluie de iod 0,1 N ce conine 3% azid de sodiu. se obin spoturi albe pe fond galben; b. expunere 10 minute la vapori de brom. Se pulverizeaz cu o soluie de clorur feric 0,1% n etanol 80. Se usuc i dup 15 minute se pulverizeaz cu soluie de acid sulfosalicilic 1% n etanol 80. se obine spoturi albe pe suport violet. 1. Dozarea cu azoderivat. Metoda Averell-Norris. a. Pentru aer Principiu: Gruparea nitro din paration este redus la gruparea amino. Aceasta se diazoteaz, iar clorura de diazoniu se cupleaz cu N-naftil-etilendiamin (NKD), rezultnd un azoderivat violet, colorimetrabil. Sensibilitatea metodei este de 0,1 ml paration/m3 aer.

209

O S P O

C 2H 5 O C 2H 5 NO2 6H(Zn +HCl) -2H2O HO NH2

NaNO2, 2HCl -2H2O, NaCl

H N HO N N Cl -HCl

(CH2)2 NH2

HO

NH (CH2)2 NH2

Reactivi: 1. alcool etilic 96. 2. Acid clorhidric N. 3. Zinc pulbere. 4. Sulfat de cupru 2%. 5. Nitrat de sodiu 0,1% (soluia se conserv maximum o sptmn la frigide). 6. Sulfamat de amoniu 5% )soluia se conserv maximum dou sptmni la frigider). 7. N-naftiletilendiamin 1%. 8. Soluie standard stoc. Se cntrete un balon cotat 100 ml care conine 10 ml alcool etilic. (A g). Se adaug 3 picturi de paration i se recntrete balonul (B g). Se completeaz la semn cu alcool etilic. Coninutul n paration va fi: mg paration/ml = 10(B-A). 9. Soluie standard de lucru. Se dilueaz soluia standard stoc cu alcool etilic, astfel ca 1 ml = 40 micrograme paration. Recoltarea probelor ntr-o alonj de recoltat pulberi se aeaz, n ordine, ncepnd de la captul su ngust, urmtoarele: un tampon de vat un strat de 0,5 g pulbere celuloz care se trateaz pn la uniformizarea stratului; un strat format dintr-un amestec de 0,5 g i 0,1 g pulbere de zinc, de asemenea tasat uor, un al doilea tampon de vat pentru meninerea poziiei stratului de pulbere de celuloz i zinc. Alonja astfel pregtit se conecteaz la o pomp de vid i se aspir, cu un debit de 5 litri/minut, un volum de aer care s conin, n medie, 20 g paration (100-200 litri aer). Modul de lucru Se monteaz alonja cu proba recoltat ntr-un stativ, cu ajutorul unei cleme, n poziie vertical. Se prepar un amestec din 10 ml alcool etilic, 10 ml acid clorhidric N i 2 picturi sulfat de cupru 2%. Se adaug acest amestec peste stratul de pulbere de celuloz, culegndu-se 10 ml cluant ntr-o eprubet gradat de 30 ml. n aceeai eprubet se adaug: 1 ml nitrit de sodiu 0,1% se agit i se las n repaus 15 minute; 1 ml sulfamat de amoniu 5% ; se agit i se las n repaus 15 minute; se dizolv 1 ml NKD i se completeaz cu ap distilat la 15 ml. Se citete extincia dup 15 minute, la spectrofotometru, la = 550 nm, n cuva de 1 cm, fa de amestec alcoolic: HCl N(1 : 1).
210

Curba de etalonare se ntocmete ntre 0 i 20 g, procednd astfel: ntr-un balon Erlenmayer de 100 ml se aduc 10 ml soluie standard n lucru, apoi 2 picturi sulfat de cupru i maximum 100 mg pulbere de zinc. Se agit 5 minute i se filtreaz pe hrtie de filtru . Se spal precipitatul de pe filtru cu un amestec, cu volume egale de HCl N i alcool etilic, colectnd peste filtrat, pn la obinerea a 40 ml soluie. Aceast soluie conine parationul redus, 1 ml = 10 g paration. Din soluie se iau, n 5 eprubete de cte 30 ml: 0,5; 1,0: 1,5; 2,0 ml. Se completeaz la 10 ml cu amestec de alcool etilic: HCl N (1 : !). n continuare , se adaug nitrit 0,1%, sulfat 5% i NKD 1% ca la probe i n aceleai condiii, se citesc extinciile. Valoarea extinciei pentru prob se raporteaz la curba etalon, obinndu-se concentraia "C" a parationului, n g, n prob. Calcul: Rezultatele se exprim n mg paration la m3 aer: n care: C = concentraia parationului, n g; V = volumul de aer recoltat, n litri. Observaii: 1. Metoda nu este specific, purtnd interfera o serie de nitro- i aminoderivai aromatici, prezeni ca impuriti alturi de paration, 2. Etaloanele se pot prepara i dintr-o soluie de p-nitrofenol cu concentraiea exprimat n paration. Normele republicane aflate n vigoare prevd pentru paration CMA de 0,15 mg/mc aer. b. Pentru produsele biologice, corpuri delicte. Principiu: (Acelai ca n metoda pentru aer) Modul de lucru: Reziduul obinut prin extracie cu solveni organici (v. izolarea a, b, c, d) se dizolv n civa mililitri etanol de 96 i de trece cantitativ ntr-un balon cotat de 10 ml. Se iau ntr-o eprubet 2 ml din soluia alcoolic i se adaug 2 ml acid clorhidric 10%, 0,2 g zinc pulbere, o pictur sulfat de cupru 2%. Se las 10 minute, agitnd periodic. Se pregtete un filtru umectat cu amestec alcool etilic : acid clorhidric N (1 : 1) i se filtreaz coninutul eprubetei, culegndu-se filtratul ntr-o eprubet gradat de 10 ml. Se spal filtratul cu 1 ml amestec alcool : HCl (1 : 1) care se colecteaz tot n eprubet. Se adaug n eprubet: 0,1 ml nitrit 0,1% se agit i se las n repaus 15 minute, 1 ml sulfamat, se agit i se las n repaus 15 minute, 0,5 ml NKD 1%, se agit i se aduce la 10 ml amestec alcool : HCl 1 N (1 : 1). Se citete extincia dup 15 minute, la spectrofotometru, la = 550 nm n cuva de 1 cm, fa de un martor al reactivilor. Curba de etalonare se ntocmete ntre 10 i 50 g paration, prin puncte din 10 n 10, n condiiile descrise mai sus. Valoarea extinciei pentru probe se raporteaz la curba etalon, apoi se nmulete cu 5 deoarece s-a lucrat cu 1/5 din prob obinndu-se concentraia C a parationului, n g, n prob.

Concentraia probei necunoscute se poate calcula i cu ajutorul factorul pant. Eprubeta Reactivi(ml)

5 6(M)

211

Standard de lucru 0.25 0.50 0.75 1.0 1.25 Conc. g 10 20 30 40 50 Etanol 96 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 Acid clorhidric 10 % 2.0 Zinc pulbere 0,2g Sulfat de cupru 2% 1 pictur 10 minute repaus.Filtrare Nitrit de sodiu 0.1-agitare, 15 minute repaus Sulfat de amoniu 1,0 se agit 15 minute repaus NED 1% Amestec alcool: acid clorhidric (1:1) 0.5 agitare Extinc ia =500nm Calcul Rezulatele se exprim nmg paration la 100 ml (g) snge sau organe i la 1000ml urin sau coninut stomacal : mg paration/100ml(g)snge,organe = C / loA mg paration/100ml(g)urin,con inut stomacal = C / A n care: C= concentra ia parationuli, n g A =masa (volumul) de produs luat n lucru, n g/ml 2. Metoda spectroscopic (formarea unui derivat chinoniminic) Principiu: Parationuleste hidrolizat la p-nitrofenol. Acesta este redus cu ditionit, sau aliaj Dewarda, la paminofenol. P-aminofenolul este cuplat cu alfa naftolul sau oxina, n mediu alcalin, cu formarea unui derivat chinoniminic de culoare albastr. Sensibilitatea este de 1 g/ml
O S P O C2H5 O C2H5 S P OH NO2

H2O
OC2H5

3Na2S2O4, 4H2O
HO NO2

-6NaHSO3

OC2H5

HO

NH2

OH

-H2O

OH

3Na2S2O4 + HCl

2H2S2O4 + 4 NaCl 2 SO2 + S + 2H2O

NaHSO3 + HCl

SO2 + H2O + NaCl

212

Reactivi: 1.Hidroxid de potasiu 10%. 2. Acid clorhidric 10%. 3. Ditionit de sodiu (hidrosulfit de sodiu). 4.Eter etilic. 5. Sulfat de sodiu 6. Alfa naftol 1% n 5%. 7. Soluii standard de lucru 1 ml = 100g (v. paration). Soluie standard de lucru se prepar cu pnitrofenol dar cu concentraia exprimat n paparation. Modul de lucru: Reziduul obinut de la extragerea cu solveni organici este dizolvat n 10 ml hidroxid de potasiu 10%. Se nclzete 15 minute pe baia de ap la fierbere, se rcete i se aduce cantitativ (prin reluri cu ap distilat) ntr-o plnie de separare. Se aciduleaz cu HCl 10% i se extrage de 3 ori cu cte 20ml eter etilic. Fazele eterice reunite se filtreaz pe sulfat de sodiu anhidru ntr-o capsul. Se evapor sub ni la temperatura laboratorului. Reziduul se aduce cantitativ cu mici poriuni de hidroxid de potasiu 10% (2 ml) ntr-o eprubet gradat (10 ml) se adaug un vrf de spatul de ditionit de sodiu, se agit i se fierbe 10 minute Se rcete proba i se adaug 1 ml acid clorhidric 10% (pentru distrugerea excesului de ditionit sodiu i a sulfului acid) se agit i se las 5 minute n repaus.Se adaug 1 ml hidroxid de potasiu 10% i 1 ml alfa naftol 1% n hidroxid de potasiu 5%. Se aduce cu ap distilat la 5 ml. Se citete extincia dup 15 minute la spectrofotometru, = 610 nm, n cuva de 1 cm, fa de un martor al reactivilor.

Curba de etalonare se ntocmete ntre 20 i 100 g paration, prin puncte din 20 n 20 n condiiile descrise mai sus. Eprubeta Reactivi(ml) Standard de lucru 100 paration/ml Conc.g KOH 10% Ditionit de sodiu Acid clorhidric 10% Hidroxid de potasiu 10% Alfa naftol 1% n KOH 5 % Extinc ia mg

1 0.2

2 0.4

3 0.6

4 0.8

5 1.0 100 1.0 6(M) 2.0

20 40 60 80 1.8 1.6 1.4 1.2 un vrf de spatul 1.0-agitare, 5 minute repaus 1.0-agitare 1.0-agitare 15minute repaus =610nm

Valoarea extinciei pentru probe se r4aporteaz la curba etalon, obinndu-se concentraia C a parationului, n g, n prob.
213

Calcul: (v. metoda precedent). Observaii: 1. Cuplarea se poate face n aceleai condiii i cu oxin (8 hidroxchinolin) 0,1% n alcool. 2.Reducerea p-nitrofenolului la p-aminofenol n mediul alcalin poate fi fcut i cu aliaj Dewarda. Scara etalon n acest caz este efectuat astfel: Eprubeta Reactivi(ml) 1 2 3 4 5 6(M) Standard de lucru 100 mg 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 paration/ml Conc.g 20 40 60 80 100 KOH 10% 4.8 4.6 4.4 4.2 4.0 5.0 Aliaj Dewarda un vrf de spatul,2o minute repaus,se agit. Filtrare Alfa naftol 1% n KOH 5 % 1.0-agitare 15minute repaus Extinc ia =610nm Interpretarea rezultatelor Doza letal de paration, la om, se nscrie ntre 20 i 100mg. ptrunderea n ochi a 0,5 ml paration poate fi fatal. n mai multe cazuri de intoxicaie sever s-au gsit valori urinare de p-nitrofenoli de 1,6 mg/litru pn la 11,6 mg/litru. n 19 cazuri fatale s-au decelat urmtoarele valori medii i extreme de paration: 9 (0,5 34) mg /100 ml snge; 10 (0,4 76) mg/litru urin; 11 (0,1 - -120) mg/kg ficat. DETERMINAREA MALATIONULUI
O S P O CH3 S CH3 H C H2C COOC2H5 COOC2H5

A. Izolare: Malationul se izoleaz din mediu acid cu solveni organici (eter etilic, cloroform) dup tehnicile indicate de paration, din: produse biologice, produse alimentare, corpuri delicte. B. Dozare: 1. Metoda spectrofotometric (formarea complexului hidroxamat Fe3+) Principiu: Malationul, coninnd gruparea carbonil, reacioneaz cu hidroxilamina n mediul alcalin, cu formare de hidroxamai , care cu clorura feric dau un complex rou, de tip Hantzsch, de forma
O R C HN O 3 Fe

, colorimetrabil Sensibilitatea metodei este de 10 g/ml. Metoda este comun esterilor acetici. Reactivi:
214

1.Alcool etilic 95. 2. Hidroxilamin clorhidric 20% (se poate conserva maximum dou sptmni la frigider, ns este preferabil s se prepare extemporaneu). 3.Hidroxid de sodiu20%. 4.Acid clorhidric 50% (v/v). 5. Clorur feric 12%. Se dizolv 12 g FeCl3 . 6H2O n 100 ml HCl 0,1N. 6. soluie standard stoc. Se aduc 0,5 g malation la 100 ml cu alcool etilic. 1ml = 5 mg. 7. Soluie standard de lucru. Se dilueaz soluia standard stoc cu alcool etilic n proporie de 1 : 50. 1 ml = 100 g malation. Modul de lucru Reziduul de la extragerea cu eter (cloroform) este adus ntr-o eorubet gradat de 20 ml cu alcool etilic 95. Se aduag 2 ml hidroxilamin 20%. Se las n repaus 5 minute i se adaug 2,5 ml acid clorhidric 50% i 1 ml clorur feric 12% apoi cu ap distilat 15 ml. Se citete extincia probei la spectrofotometru, la = 500nm, n cuva de 1 cm, fa de un martor al reactivilor. Curba de etalonare se ntocmete ntre 20 i 100 g malation prin puncte din 20 n 20 n condiiile descrise mai sus. Eprubeta Reactivi(ml) 1 2 3 4 5 6(M) Standard de lucru 100 mg 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 malation/ml Conc.g 20 40 60 80 100 Alcool etilic 95 4.8 4.6 4.4 4.2 4.0 5.0 Hidroxilamin 20% 2.0 Hidroxid de sodiu 20% 2.0-agitare, 5 minute repaus Acid clorhidric 50% 2.5 Clorur feric 15% 1.0-agitare Ap distilat ad 15 Extincia =500nm

Valorile extinciei pentru probe se raporteaz la curba etalon, obinndu-se concentraia C a malionitului, n g, n prob. Calculul: rezultatele se exprim n mg malation/100 mg (g) sau mg malation/100 ml (g) produs de analizat mg malation/100ml(g) produs analizat = C / 10A mg malation/100ml(g) produs analizat = C / A n care: C = concentraia malationului, n g A = volumul (masa) de produs luat n lucru, n mg (g). 2. Metoda spectrofotometric (formarea dimetilditiofosfatului de Cu+ Principiu: Prin hidrolizarea malationului n mediul alcalin rezult dimetilditiofosfatul de sodiu care formeaz cu Cu+, dimetilditiofosfat de cupru de culoare galben extractibil n tetra cloru de carbon. Sensibilitatea metodei este de 10g/ml.
215

O 2S P O

CH3 S CH3 H C H2C 6NaOH COOC2H5 COOC2H5 - 2NaOOC -4 C2H5OH -H2O O CH3 S CH3 Cu S O P O CH3 S CH3 C H C H COONa 2S

O P O

CH3 S CH3 Na

CuSO4 -Na2SO4

P O

Reactivi: 1.Hidroxid de sodiu 6 N. 2.Clorur feric 0,2%. Se dizolv 0,2 g clorur feric n civa mililitri ap, se adug 10 ml acid clorhidric concentrat i se completeaz la 100ml cu ap. 3. Fenoftalin1% n alcool. 4. Acid clorhidric 5N. 6. Tetraclorur de carbon. 7. Soluie standard (v. metoda precedent).. Modul de lucru: Reziduul de la extragerea cu solveni organici este tratat cu 1 ml hidroxid de sodiu 6 N i 25 ml clorur feric 0,2%. se agit i se las n repaus 5 minute, apoi se neutralizeaz cu acid clorhidric n prezena de fenolftalein. Se aduce cantitativ ntr-o plnie de separare, se adaug 2 ml sulfat de cupru 1% i se extrage de dou ori cu cte 5 ml tetraclorur de carbon. Extractele organice reunite se configureaz. Se citete extincia la spectrofotometru, = 470 nm, n cuva de un cm, fa de tetraclorura de carbon. Curba de etalonare se ntocmete ntre 20 i 100 g malation, prin puncte din 20 n 20, n condiiile descrise n scara etalon. Eprubeta Reactivi(ml) 1 2 3 4 5 6(M) Standard de lucru 100 mg 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 malation/ml Conc.g 20 40 60 80 100 Hidroxid de sodiu 6 N 1.0 Clorur feric 0.2% 25.0 se agit,repaus 5minute Hidroxid de sodiu 20% 2.0-agitare, 5 minute repaus Neutralizarea cu acid clorhidric 5N n prezen de fenoftalein 1 % n alcool Sulfat de cupru 1% 2.0 Tetra clorur de carbon 5.0 se extrage de 2 ori Se centrifugheaz extractele reunite

Se citete extincia la Spekol, = 470 nm, n cuva de 1 cm, fa de tertraclorura de carbon.

216

Valoarea extinciei pentru probe se raporteaz la curba de etalon, obinndu-se concentraia C a malanitului, n g, n prob. Calcul: (v. metoda precedent). Interpretare rezultatelor: Doza latent medie de malation la om, este apreciat la 60 grame. Ingerarea de 14 g a determinat,la adult, simptome de intoxicaie sever. n 4 cazuri fatale prin ingerare de 25 70 g malation, n scop de sinucidere, s-au decelat urmtoarele valori medii i extreme; 815 (100-18807) mg/ml snge; 1215 (200 1700) mg/kg ficat. DETRMINAREA ACTIVITII COLINESTERAZIC A. Teste orientative 1. testul cu albastru de brom timol a. Se impregneaz o band de hrtie de filtru, n soluie de acetilcolin 0,o1 M, apoi n soluie de albastru de brom timol =,1% n alcool. Se spoteaz 1 - 2 picturi de ser de analizat, proaspt. Se apreciaz activitatea colinesterazic dup tipul de modificare a culorii spotului, astfel: activitatea normal, 7 - 18 minute; activitatea sczut, 35 - 150 minute. b. Testul cu acid 5,5-ditiobis-2-nitrobenzoic. - n coninut stomacal: n dou eprubete, M i P, de introduc: Eprubeta/ reactivi M P Solu ie de acid ditio-bis-nitrobenzoic(ml) Iodur de acetilon 5% (ml) Ap distilat (ml) Con inut stomacal filtrat (ml) 3 0.1 0.2 3 0.1 0.2

Se las n repaus 2 minute. Absena unei diferene de culoare ntre cele dou eprubete indic prezena compuilor organofosforici sau altor inhibitori i colinesterazei. Soluie de acid 5,5-ditiobis-2-nitrobenzoic: se dizolv 10 mg acid 5,5'-ditiobis-2-nitobenzoic n 100 ml tampon fosfat pH = 7,4. -n snge: n dou eprubete M i P se introduc: Eprubeta/ reactivi M P Solu ie de acid ditio-bis-nitrobenzoic(ml) Iodur de acetilon 5% (ml) Ser normal (microlitri) Ser de cercetat (microlitri) 3 0.1 20 3 0.1 20

Se las n repaus 2 minute. Absena diferenei de culoare ntrecele dou eprubete indic prezena compuilor organofosforici sau a altor inhibitori ai colinesterazei. B. Dozare: Metoda spectrofotometric Principiu:
217

Colinesteraza seric (pseudocolinesteraza, BuCnE,EC 3.1.1.B) elibereaz prin hidroliza butirilcolinei, tiocolina, care reacioneaz cu DTNB (acid 5,5-ditiobis-2-nitrobenzoic) dnd un compus colorat galben maximum de absorbie la 412 nm (mM= 13,6).

Reacii: 1. Subsrat: Se dizolv unul din cele 5 comprimate aflate n cutia nr.1 n 5 ml ap bidistilat, prin agitare uoar a substanei. Soluia este stabil minimum dou sptmni la 4. 2. Reactiv de culoare: Se dizolv comprimatul aflat n cutia nr.2 ntr-un volum aproximativ de 50 ml ap bidistilat. Pentru grbirea dizolvrii se pote sfrma comprimatul cu o baghet de sticl. Se trece soluia ntr-un cilindru gradat de 250 ml i se completeaz volumul la 130 ml ap bidistilat. Se adaug 120 ml etanol de 95. Soluia este stabil la temperatura camerei timp de mai multe luni. 3. Serul de analizat: Se dilueaz 1/11, pipetnd ntr-un tub de hemoliz 0,2 ml NaCl 0,9% i 0,02 ml aer (se folosete micropipeta destinat dozrii hemoglobinei). Serul de analizat poate fi pstrat nediluat minimum o sptmn la 4. Tehnica de lucru: Pentru fiecare determinare se pregtesc 2 tuburi de hemoliz n care se pipeteaz: M P Substrat(ml) Ser diluat 1/11(ml) Incubare 10 minute la 25, apoi se pipeteaz Reactiv de culoare(ml) Ser diluat 1/11(ml) 2.0 0.02 2.0 0.20 0.20 0.02

Se citete extincia probei la 412 nm fa de martor, la un interval de maximum 15 minute de la adugarea ultimului reactiv. Calculul activitii: 1. Unitatea (U) de activitate enzimatic este corespunztoare cantitii de enzim carte hidrolizeaz 1mol butirilcolin n timp de 1 minut la temperatura de 25. Activitatea seric se exprim n U/L. U/L colinestereaz = 8978 x E412. Valorile normale pentru condiiile descrise mai sus sunt cuprinse ntre 3000 8000 U/L ser. Valoare diagnosticat: BuChE scade n insuficienele hepatice, intoxicaii cu organofosforice i n denutriie proteic grav. Creteri se ntlnesc n sindromul nevrotic, diabet, hiperlipemie. Observaii: a. Fotometrele de tip Pulfrich FEK sau alte instrumente cu filtrare colorate nu pot fi folosite. Sunt adecvate spectrofotometre de ori ce tip, spectrofotometrul Spekol sau instrument lamp de descrcare n gaz (Hg) prevzute cu filtre de interferen pentru 405 nm. b. Pentru determinri la un numr mare de subieci (anchete epidemiologice) se recolteaz 0,02 ml snge din pulpa degetului i se introduc imediat n 1 ml ap distilat. Se spal pipeta de mai multe ori prin aspirare i refulare. Pentru determinri se folosesc 0,02 ml snge diluat 1/51, timpul de incubare fiind prelungit la 40 minute. Se recomand ca determinrile s fie efectuate n aceiai zi. U/L colinesterez = 10 . 410 x 412. Valorile normale pentru snge integrat sunt cuprinse ntre 1600 i 4400 U/L.
218

c. Cutia cu comprimate se pstreaz la loc rcoros, ferit de umiditate. Dup deschiderea cutiei se recomand nvelirea comprimatelor rmase n etanol i pstrarea la 4C.

DETERMINAREA WARFARINEI
OH H C C6H5 O H2 C

CO

CH3

A. Izolare: Warfarina (etilhidroxicumarina) se izoleaz prin extracie cu solveni organici din mediu acid. Izolare din produse biologice: 5 g esut, 5ml snge sau 10 ml urin se trateaz cu puin nisip purificat, cu o cantitate dubl de sulfat de sodiu anhidru i 0,5 g acid tartric, pn se obine o mas solid. Amestecul se aduce cantitativ ntr-un Erlenmeyer i se extrage cu 20 ml aceton sau dicloretan prin agitare timp de 20 minute. Se filtreaz ntr-o capsul, splnd filtratul cu aceton, iar fazele organice se evapor la sec pe B.M Reziduul se folosete pentru reacii identificare. B. identificare: 1. Reziduul se dizolv n 1-2 ml tampon fosfat pH = 8, apoi se adaug 0,5 ml soluie 4aminoantipiridin 1% i 0,5 ml soluie fericianur de potasiu 3% cnd rezult o coloraie roie. 2. Reziduul se dizolv n 1 ml hidroxid de sodiu 10%, se nclzete pe B.M. timp de 1-2 minute. Dup rcire, se trateaz cu 2-3 picturi doluie Lugol pn laculoarea galben, apoi excesul de iod se distruge cu hidroxid de sodiu 10%. n prezena warfarinei se formeaz iodoform cu miros caracteristic. 3. Reziduulse trateaz cu 1- 2 ml amestec sulfonitric i se ine pe baie de ap la fierbere, timp de 15 minute. Dup rcire se alcalinizeaz cu hidroxid de sodiu 20%, cnd apare o coloraie galben datorit formrii nitroderivatului Warfarinei (reacia Meltzer). 4. Reziduul reluat cu 1 2 ml reactiv Liebermann (10 g nitrat de potasiu n 100ml acid sulfuric concentrat) d o coloraie portocalie. 5. Cromatografie n strat subire Reziduul dizolvat n 0,2 0,5 ml cloroform sau etanol se spoteaz pe o plac cromatografic, n paralel cu un martor. Sistem de migrare = eter de petrol anhidru: anhidrid acetic: cloroform: etanol (10:5:7:1). Revelarea se face cu un amestec de soluie de ferocianur de potasiu (2 volume) i clorur feric 1% (1 volum). Ambele soluii se prepar n etanol 50%, iar amestecul se face extemporaneu. C. Dozare Metoda spectrofotometric Principiu: Warfarina se nitraz la nucleul benzenic, apoi se reduce, se diazoteaz i se cupleaz cu NKD obinndu-se un azoderivat de culoare violet ce se spectrofotometreaz la 550nm, fa de un martor.

219

OH H C CO CH3
HNO3 , H2SO4

OH H C H2C O O CO CH3 NO2

C6H5 O O

OH H C NH2 CO CH3
NaNO2 HCl

OH H C H2C O O CO CH3 N N

6H
Zn , HCl

H2C O O

Cl

HN

(CH2)2

NH2 OH H C H2C O O CO CH3 N N H N (CH2)2 NH2

Reactivi: 1. Amestec sulfonitric (acid sulfuric concentrat: acid azotic fumans 1 : ). 2. Eter etilic; 3. acid clorhidric 10%; 4. Zinc pulbere; 5. Nitrat de sodiu 0,1%; 6. Uree 10%; 7. N-naftiletilendiamin (NKD) 1%; 8. Soluie standard de lucru se cntrete 0,1000 g warfarin i se aduce la 200 ml cu diclor etan sau aceton (1 ml = 500g warfarin) 1%). Modul de lucru: se trateaz reziduul cu 5 ml amestec sulfonitric i se ine pe B.M. la 60 - 80c timp de 15 minute, dup care se dilueaz cu 20 ml ap. Se tranzvazeaz cantitativ ntr-o plnie de separare i se extrage de dou ori cu 20 ml eter etilic. Extractele eterice reunite se filtreaz printr-un filtru uscat i se evapor la sec pe B,M. Reziduul se dizolv n 10 ml acid clorhidric 10%, se adaug 0,2 g zinc pulbere i se nclzete pe B.M. la fierbere. Se las n repaus15 minute, apoi se filtreaz ntr-un balon cotat de 25 ml aducndu-se cu ap distilat la semn. SE iau 5 ml soluie i se adaug 0,2 ml nitrat de sodiu 0,1%, dup 10 minute se adaug 2 ml uree 10%. Se agit i dup 10 minute se adaug 1 ml NKD 1%. Se obine o coloraie roz-roie care se spectrofotometreaz dup 10 minute la 550 nm n cuva de 1 cm, fa de un martor. n paralel se lucreaz o curb de etalonare cu concentraii prinse ntre 25 i 250 g warfarin. Valoarea extinciei probei se raporteaz la curba etalon i se nmulete cu 5 (deoarece s-a lucrat cu 1/5 din prob) obinndu-se concentraia C n g de warfarin peo prob. Calculul: Rezultatele se exprim n mg warfarin pe 100 g produs biologic.

220

Cap. IX Alcaloizi i substane cancerigene 1. Alcaloizii i nicotina Se numesc alcaloizi compuii organici care conin azot, extrai de obicei din plante (se cunosc alcaloizi de natur animal cum ar fi adrenalina) i care sunt ntr-o msur mai mare sau mai mic substane cu caracter bazic, ce formeaz sruri cu acizii. Din punct de vedere analitic trebuie s lrgim oarecum aceast definiie, n sensul c compuii sintetici, care sunt bazele organice care conin azot, dau un numr de reacii dup care trebuie studiai i ei; de aceea, alturi de alcaloizii tipici, vom putea studia dup aceste reacii i unele substane asemntoare alcaloizilor (antipirina, piramidolul, chinozolul, acrihina etc.). Majoritatea alcaloizilor conin i oxigen, afar de carbon, hidrogen i azot. Numai puini alcaloizi, mai ales cei volatili i lichizi, nu conin oxigen. Aproape toi alcaloizii aparin compuilor heterociclici. Unii alcaloizi au fost obinui pe cale sintetic. Majoritatea alcaloizilor (baze libere) sunt nite substane cristaline i au o temperatur de topire determinat; civa sunt la temperatur obinuit, lichide uleioase, care pot fi antrenate cu vapori de ap i n general se pot distila. Cei mai muli, sub form de baze libere, se dizolv foarte greu n ap sau sunt complet insolubili n solveni organici: alcool, eter, cloroform, alcool amilic, acetat de etil, benzol etc., unii alcaloizi sunt uor solubili, alii greu solubili. Aproape toi alcaloizii au un gust amar; majoritatea nu au miros; numai puini, ca de exemplu coniina i nicotina, se deosebesc, printr-un miros puternic. Numeroi alcaloizi sunt optic activi. Alcaloizii fiind baze au n stare liber o reacie mai mult sau mai puin alcalin. Acetia formeaz sruri cu acizii, dup tipul srurilor de amoniu sau al aminelor (fr eliminarea apei): C17H17ON(OH)2 + HCl C17H17ON(OH)2 .HCl O molecul de alcaloid cu un atom de azot n molecul leag o molecul de acid monobazic; de exemplu clorhidratul de morfin. Alcaloizii cu doi atomi de azot n molecul pot lega, n multe cazuri, una sau dou molecule de acid monobazic ca de exemplu C20H24O2N2.HCl clohidratul de chinin, C20H24O2N2.2HCl biclorhidratul de chinin (K1=10-6 ; K2=1,3 10-10). n aceste cazuri, cnd a doua constant de disociere este extrem de mic, asemenea alcaloizi leag numai o molecul de acid monobazic, de exemplu stricnina cu acidul clorhidric formeaz numai sarea cu compoziia C21H22O2N2 .HCl (K1=10-6 ; K2=2 10-12). Disocierea srurilor alcaline, ca i srurilor de anine, se reprezint astfel: AlK N.HCl Al K NH+ + Cl221

Majoritatea alcaloizilor sunt baze aminice teriare; o parte mai mic sunt aminobaze secundare; unii alcaloizi sunt baze de amoniu cuaternare. La formarea srurilor, acestea din urm se comport diferit de celelalte, de exemplu berberina. ntruct alcaloizii sunt baze slabe, srurile lor se descompun nu numai cu baze tari [NaOH, KOH, Ca(OH)2], ci i cu amoniac i n majoritatea cazurilor, chiar cu carbonai alcalini; pe aceast cale se separ bazele libere. De asemenea, unii alcaloizi au proprieti chimice care se datoreaz prezenei n molecul, pe lng azotul bazic, a altor grupe funcionale: OH morfina, salsolina; CO lobelina; CH2=CH chinin; CH3NHCO ezerin etc. Prezena, de exemplu a grupei OH n molecula morfinei i d un caracter fenolic, ceea ce condiioneaz solubilitatea bazei date n alcali, cu formarea morfinatului; acelai caracter l d grupa OH moleculei salsolinei; gruparea carboxilic, n narcein, condiioneaz de asemenea solubilitatea n alcali. Prin adugarea alcalilor, la nceput se separ morfina liber i prin adugarea ulterioar la srurile morfinei se formeaz morfinatul solubil n ap. Morfinatul, ca i fenoliii, se descompune cu srurile de amoniu, cu eliberarea morfinei libere. Unii alcaloizi ca de exemplu: atropina, cocaina etc. sunt esteri dup structura lor i se saponific sub aciunea mai mult sau mai puin prelungit a acizilor. 2. Extragerea alcaloizilor Pentru extragerea alcalozilor din prile cadaverice, din obiecte bogate n substane vegetale extractibile i alte materiale se folosete de obicei metoda Stas Otto, care se bazeaz pe urmtorul principiu: tartraii acizi ai alcaloizilor sunt solubili, att n alcool de 80 90 o, ct i n ap; de aceea, alcaloizii se extrag din diferite obiecte de cercetat cu ajutorul alcoolului, care conine acid tartric. De obicei, prin aceste extrageri pot trece n alcool, alturi de alcaloizi, i diferite impuriti i anume: ele se concentreaz pn la consistena unui sirop, dup aceea reziduul se trateaz cu ap i lichidul se filtreaz. Astfel se elimin grsimile. Dac se evapor imediat lichidul apos pn la densitatea unui sirop i se trateaz acest sirop cu o cantitate dubl sau tripl de alcool pur (mai bine absolut), atunci precipit, n general, substanele proteice. Prin repetarea operaiei menionate, se elimin de obicei impuriti care pot mpiedica identificarea alcaloizilor. Lichidul acid obinut se supune extraciei, cu ajutorul solvenilor corespunztori. Substana de cercetat se mojareaz, se introduce ntr-un balon i, n cazul unei reacii alcaline, se adaug acid tartric pn la o reacie acid net. Dac substana de cercetat are reacie acid, atunci se neutralizeaz cu carbonat de sodiu i apoi se aciduleaz din nou cu acid tartric, pn la reacia net acid. Apoi se acoper masa cu o cantitate dubl sau tripl de alcool 90o. Se monteaz balonului un tub lung de sticl, care are rolul unui refrigerent ascendent, se nclzete cteva ore pe o baie de ap la 60 70o i apoi lichidul se las s se rceasc. Dac reacia lichidului nu va fi net acid, se adaug acid tartric i se nclzete din nou. Lichidul se decanteaz, iar reziduul din balon se acoper din nou cu un volum dublu de alcool, care conine acid tartric, i se extrage a doua sau a treia oar.
222

Extractele reunite se filtreaz, filtratul se evapor ntr-o capsul de porelan, pe o baie de ap, la cel mult 60o, pn la consistena siropoas. Dup rcire, reziduul se trateaz cu ap cald i, dup limpezirea lichidului se filtreaz printr-un filtru umezit cu ap. Filtru apos se evaporeaz din nou pn la consistena siropoas; reziduul se trateaz cu un volum de 3 4 ori mai mare de alcool, care se adaug treptat, n cantiti mici. Dup limpezire lichidul se filtreaz i filtratul se evaporeaz din nou. Printr-o tratare alternativ cu ap i cu alcool, purificarea extractelor, se repet pn la dizolvarea reziduului, soluiile rmnnd transparente (att cea n ap ct i cea n alcool). n final, reziduul se evapor pe o baie de ap, pn la eliminarea urmelor de alcool, se dizolv n 30-50 cc ap, se filtreaz printr-un filtru umezit cu ap; n aceast stare, lichidul este pregtit pentru extraciile urmtoare. 3. Extracia cu solveni organici Lichidul acid se extrage cu un volum egal de eter pur, ntr-o plnie de separare, i se separ stratul de eter. Extracia se repet de dou ori, cu porii noi de eter, i se adaug la primul extract. n soluia eteric trec grsimile i acizii grai, rezinele, substanele colorante; trec de asemenea, n cantiti infime, unii alcaloizi cu un slab caracter bazic: colchicina, cafeina, apoi atropina i veratrina. Cnd extractul eteric este colorat n rou sau violet, atunci n lichidul acid apos poate fi prezent apomorfina, ale crei produse de disociere se dizolv n eter dnd o coloraie roiatic sau violet. Din soluia acid pot trece n cloroform cantiti considerabile de stricnin, ca i o parte mare de cafein. Aceasta se explic prin faptul c colchicina ( Kb=4,5 10-13 ), cafein ( Kb=4,1 10-12 ) i alte cteva baze foarte slabe formeaz cu acizii sruri ce sunt hidrolizate n ntregime n soluie apoas i se descompun n acid i bazele libere ale alcaloizilor, care baze trec apoi n solvenii organici. Extractul eteric se filtreaz, se toarn n sticle de ceas, eterul se evaporeaz i cu reziduurile se fac cercetri corespunztoare. Lichidul apos acid se suprasatureaz apoi cu hidroxid de sodiu i se extrage din nou de cteva ori cu eter sau CHCl3. Extractul eteric se culege ntru-un balon i dup limpezire, se filtreaz. Extractul eteric din soluie alcalin poate s conin aconitin, coniin, atropin, brucin, chelidonin, chinin, cocain, codein, emetin, hiosciamin, narcotin, nicotin, papaverin, fizostigmin, solanidin, stricnin, tebain, veratrin, plus resturi de colchicin i cafein. Extractul eteric din soluia alcalin se toarn n sticle de ceas, ca i mai sus, eterul se evaporeaz i cu reziduul se fac reaciile respective. Lichidul alcalin rmas se suprasatureaz cu acid clorhidric diluat, apoi se adaug amoniac pn la o reacie alcalin i se extrage de cteva ori cu eter. n acest extract poate fi apomorfina. Dup aceasta, lichidul apos amoniacal se extrage de cteva ori cu alcool amilic sau cu cloroform, dar mai bine cu un amestec de 5 10% alcool cu cloroform. Extractul cloroformic poate s conin morfin, narcein, pilocarpin ( pentru extragerea acesteia este mai bine ca lichidul acid s se alcalinizeze cu bicarbonat de sodiu).
223

Dup evaporarea solventului, se fac reacii de identificare cu reziduul. Dup ultima extracie, lichidul apos, se evapor la sec n prezena nisipului curat i reziduul pulverizat se extrage cu alcool absolut la uoar nclzire. Alcoolul se evapor, reziduul se reia cu ap cald, se filtreaz, se evapor la sec, apoi se trateaz cu alcool absolut, iar soluia se las s se evapore la temperatura camerei. La extragerea alcaloizilior din preparatele farmaceutice i formele medicamentoase nu este necesar s se foloseasc ntreg procedeul de separare al alcaloizilor expus mai sus. n general, este suficient folosirea schemei simplificate de extragere. 4. Baze libere ale alcaloizilor Caracterul alcaloid al unei substane se manifest n proprietile sale bazice, prin formarea de sruri cu acizii ce pot fi descompune cu baze mai puternice. Unii alcaloizi dau o reacie net alcalin fa de hrtia de turnesol. n majoritatea cazurilor dac exist alcaloid liber, hrtia de turnesol se albstrete. Se pune apoi o cantitate infim de substan pe o sticl de ceas, se adaug 1 2 picturi de ap i o pictur de acid clorhidric. Alcaloid sub form de baz liber se solubilizeaz prin adugarea acidului clorhidric. Dac adugm la o soluie acid, pictur cu pictur, o soluie de carbonat de sodiu, majoritatea alcanoizilor se separ sub form liber, deseori n stare cristalin. Prin dizolvarea substanei n ap acidulat i precipitarea ei cu carbonat de sodiu se poate determina caracterul bazic al alcaloidului. Grupa mare de reactivi care precipit alcaloizii o formeaz n principiu acizii, i ea poate fi mprit n dou grupe: 1. Acizi simpli a) acid picric b) tanin c) acid picrolonic, etc. 2. Acizi compleci, care pot fi mprii la rndul lor n dou subgrupe ntr-una din ele rolul principal l are cationul, iar n cealalt anionul:

a)HgI2 KI BiI3 KI HgCl2 HAuCl4 H2PtCl6 CdI2 KI, etc.

b)I2 KI H3PO4 12MoO3 H3PO4 12WO3 2H2O 12WO2 SiO2 4H2O, etc.

O molecul de baz monoacid reacioneaz cu un echivalent de acid. Aceste reacii, ca i precipitarea alcaloizilor cu acidul silicowolfracmic, sunt folosite la determinarea cantitativ a unor alcaloizi. Pentru determinare, probei calitative de precipitare a se dizolv o cantitate mic de substan alcaloidic n 1 2 cc ap acidulat cu cteva picturi de acid clorhidric diluat, se
224

toarn n picturi pe cteva sticle de ceas i fiecare sticl se trateaz cu cte o pictur din diferiii reactivi de precipitare. Dac se obin precipitate cu majoritatea reactivilor, putem conchide asupra prezenei alcaloizilor (dac este exclus prezena altor substane care dau precipitate cu reactivi generali pentru alcaloizi, de exemplu albuminele, etc. ). Din soluii nu prea diluate de alcaloizi se pot obine cu ajutorul acizilor, HAuCl4 (acid auroclorhidric) i H2PtCl6 (acid platino clorhidric), compleci bine cristalizai. De asemenea, sublimatul corosiv formeaz precipitatele cristaline cu numeroase sruri ale alcaloizilor. Prezena azotului n alcaloizi se face prin reacia cu sodiul metalic. Civa dintre numeroii reactivi de precipitare ai alcaloizilor sunt: IOD IODUR DE POTASIU (reactiv Wagner, Boucharda ) Soluia, compus din 5 g iod i 10 g iodur de potasiu n cc de ap, formeaz cu soluiile apoase ale srurilor alcaloizilor, precipitate care variaz de la brun - deschis pn la brun - nchis; acestea reprezint produsele de combinare ale hidroiodurilor alcaloizilor cu iodul liber: Alk. ( HI ). IODURA DE BISMUT CU IODURA DE POTASIU (reactivul Dragendorf) Acest este o soluie de iodur de bismut ntr-o soluie de iodur de potasiu. Se dizolv 80 pri de nitrat bazic de bismut n 200 pri de acid azotic (greutatea specific 1,18) i, n soluia astfel obinut, se toarn o alt soluie, format din 272 pri iodur de potasiu n 300 pri ap. Dup cteva zile, soluia se filtreaz, pentru a elimina salpetrul care s-a format. Cu srurile alcaloizilor, ntr-un mediu de acid clorhidric sau acid sulfuric, soluia formeaz un precipitat amorf de culoare rou portocalie (teobromina formeaz un precipitat cristalizat).

ACIDUL FOSFOMOLIBDENIC H3PO4 12MoO3 (reactivul Sonnenschein) Soluia de fosfat de sodiu, acidulat cu acid azotic, se trateaz cu o soluie de molibdat de amoniu acidulat cu acid azotic, la o temperatur de 40 o, pn la ncetarea formrii unui precipitat galben. Acesta se filtreaz, se spal bine, se agit, se suspend n ap i se nclzete cu o soluie concentrat de carbonat de sodiu, pn la completa dizolvare. Soluia obinuit a amoniacului, se umecteaz cu acid azotic i, n cazul reducerii preparatului (coloraie de la albastru, pn la negru), se calcineaz din nou. Acest reziduu se dizolv ntr-o cantitate de 10 ori mai mare de ap i se adaug o cantitatea de acid azotic necesar pentru ca precipitatul format la nceput s se dizolve din nou.
225

Reactivul formeaz precipitate chiar n soluii foarte diluate (neutre sau acide) ale srurilor de alcaloizi i este unul din cei mai sensibili reactivi, comuni tuturor alcaloizilor. Precipitatele sunt colorate n galben deschis sau brun galben i adesea se coloreaz n albastru sau verde, din cauza reducerii acidului molibdenic. Unele precipitate se dizolv n amoniac, uneori dau o coloraie albastr caracteristic, de exemplu, n prezena berberinei, coniinei; coloraie verde n prezena brucinei i codeinei. IODO MERCURIATUL DE POTASIU (reactivul Mayer) Soluia format din 1 parte sublimat coroziv n 50 pri ap se amestec cu o soluie fcut din 4 pri de potasiu n 50 pri ap. Acest reactiv formeaz cu majoritatea alcaloizilor, ntr-un mediu neutru sau slab acid, precipitate de culoare alb sau alb-glbuie; nu precipit colchicina, cafeina, solanina. SOLUIA DE TANIN Soluia proaspt preparat din 1 parte tanin n 9 pri ap formeaz cu majoritatea alcaloizilor, att ntr-un mediu neutru ct i n unul slab acid, precipitate de culoare glbuie, solubile n alcool, acid acetic, i sruri de amoniu. ACIDUL FOSFOWOLFRAMIC (reactivul Scheibler) Se dizolv 10 pri wolframat de sodiu i 7 pri fosfat de sodiu n 50 cc ap i se aciduleaz cu acid azotic. Reactivul precipit aproape toi alcaloizii. Precipitatele se descompun cu hidroxid de bariu sau hidroxid de calciu, cu eliberarea alcaloizilor liberi. ACIDUL PICRIC Soluia apoas 1% precipit majoritatea srurilor alcaloizilor sub form de picrai de culoare galben, n stare amorf sau cristalizat. Din soluiile sulfurice diluate se precipit majoritatea alcaloizilor (complet sau parial). Numai din soluiile mai concentrate se precipit parial: aconitina, atropina, cocaina, hiosciamina. Mult mai sensibil este o soluie alcoolic saturat la care s-a adugat glicerin 5%. n practic se folosesc primii trei reactivi. Reacia negativ dovedete, cu rare excepii, absena alcaloizilor i garanteaz exactitatea concluziilor. Reacia pozitiv, cu oricare din reactivii generali citai, necesit continuarea cercetrilor cu reactivi specifici pentru diferii alcaloizi. REACII SPECIFICE ALE ALCALOIZILOR

226

Reaciile este urmtoarea: la reziduul unui alcaloid se adaug o baghet de sticl, pe o sticl de ceas, 1-2 picturi de reactiv i se urmrete apariia coloraiei (uneori prin nclzire la o baie de ap) i modificrile ulterioare posibile care reprezint cteodat momentul decisiv. METODE PENTRU CERCETAREA ALCALOIZILOR DIN AMESTECURILE MEDICAMENTOASE O cantitate mic de pulbere sau civa ml de soluie se dilueaz cu 5 ml ap; soluia se introduce ntr-o plnie de separare, se alcalinizeaz cu amoniac i se extrage cu 5-10 ml cloroform (sau eter). Extractul cloroformic se filtreaz, o parte se evaporeaz i reziduul, dup dizolvare n acid clorhidric diluat, se cerceteaz cu reactivii generali pentru alcaloizi. Cealalt parte din extractul cloroformic se evapor (pe o baie de ap) i cu reziduul se fac reaciile respective sau alt prob. Adesea avem posibilitatea, n funcie de compoziia formei medicamentoase, s simplificm acest procedeu, de exemplu, s extragem alcaloidul direct, n cazul cnd el exist sub form de baz liber i s executm ulterior reaciile necesare. DETERMINAREA CANTITATIV Metoda se bazeaz pe separarea cu alcalii (NaOH, KOH, NH4OH, Na2CO3) a bazei libere din srurile alcaloizilor i extragerea ei cu solvenii organici potrivii. Se pun 1 2 g pulbere sau o cantitate corespunztoare de soluie ntr-o plnie de separare, se adaug 10 15 ml de ap, se alcalinizeaz cu hidroxid de sodiu i se extrag de mai multe ori (3 4 ori) cu cloroform sau alt solvent. Extractele cloroformice sau eterice reunite se spal cu o cantitate mic de ap (5 ml), se separ stratul de cloroform i se filtreaz. Cloroformul se distil, reziduul se usuc i se cntrete; de cele mai multe ori se determin pe cale volumetric. Pentru aceasta, reziduul se dizolv n 10 ml alcool (printr-o uoar nclzire pe o baie de ap), soluia se trateaz cu 15 ml de ap, 2 picturi de soluie de rou de metil i se trateaz cu o soluie de acid clorhidric 0,01 n. La titrarea majoritilor alcaloizilor, se ntrebuineaz cu succes rou de metil. n majoritatea cazurilor, bazele biacide ca i cele monoacide, se titreaz net n prezena roului de metil [brucina, chinina, nicotina, novocaina ( baz ), stricnina]. Pe lng titrarea direct, se ntrebuineaz cu succes metoda titrrii inverse; pentru aceasta baza se dizolv ntr-un exces cunoscut de HCl 0,01 n, n prezena indicatorului rou de metil. 5. Metode de precipitare - formare poliiodurilor poate servi la determinarea cantitativ a numeroilor alcaloizi. Alcaloidul se precipit cu excesul de iod n iodur de potasiu; n filtrat se titreaz excesul de iod cu tiosulfatul de sodiu

227

- precipitat cu iodo-mercurat de potasiu. Metoda se bazeaz pe formarea precipitatelor de alcaloizi ntr-un mediu de acid clorhidric, cu reactivul Mayer. Precipitatele cu compoziia general Alk. HI (HgI2) n: excesul iodo-mercuratului de potasiu se determin, fie prin titrare cu NaCl, fie prin metoda Babici. - precipitare sub form de silicowolframai dup metoda lui Cliacichina. - metoda combinat. Bazele alcaloizilor se dizolv n exces de acid clorhidric 0,1 n sau 0,01 n i soluia se trateaz cu un exces de iod iodur de potasiu. ntr-o parte a filtratului, dup decolorarea iodului cu tiosulfatul de sodiu, se titreaz excesul de acid cu un hidroxid alcalin (indicator fenolftaleic). Pentru unii alcaloizi se folosete aceeai metod, cu reactivul lui Mayer. Microdeterminarea alcaloizilor din formele medicamentoase complexe cu reactivul Dragendorf Bolotnicov i Craizman. Aminometria alcalizilor Prin aminometrie se nelege determinarea volumetric a aminelor, bazat pe reacia aminelor cu acizii. Reacia nu poate avea loc ntr-un mediu apos sau alcoolic i, n general, n condiiile care favorizeaz transformarea aminelor n baze (formarea ionilor OH). n general, autorii consider c acidul potrivit pentru aminometrie acidul paratoluensulfonic dizolvat n cloroform. Titrul soluiei se stabilete n prezena hexametilentetraminei. Ca solveni se folosesc: tetraclorura de carbon, cloroformul (cel mai des), tetracloretanul, clorura de metil. Pentru prepararea soluiei 0,2 n de acid paratoluensulfonic se dizolv circa 8,6 g preparat anhidru (greutate molecular 172,12) n cloroform i se completeaz cu cloroform pn la un litru. Pentru stabilirea titrului, se ia o cantitate cntrit de 0,05 g hexametilentetramin (a), se dizolv n 10 cc cloroform i, dup adugarea a 5 picturi dintr-o soluie cloroformic de dimetilaminoazobenzol 0,05% se titreaz cu acidul al crui titru se determin pn la virarea culorii galbene n roie. Dac titrarea va necesita b cc, atunci factorul pentru acidul paratoluensulfonic 0,2 n va fi: F=142,7 a/b. Pentru accelerarea virrii culorii, se adaug aproximativ 1% fenol. Cantitile cntrite de amine i alcaloizi se titreaz dup aceeai metod. Nu se pot determina aminele primare volatile (RNH2) sau greu solubile n solvenii indicai. Se titreaz bine aminele secundare R2NH i teriare R3N. Metoda are o importan practic pentru determinarea unor preparate farmacopeice cu caracter bazic: urotropina, dietilamina, benzoamina, anilina, i naftalina, paraanizidina, pantocaina, percaina, piridina, chinolina, acridina etc. Majoritatea alcaloizilor se titreaz bine aminometric. Se determin aminometric alcaloizii din frunzele de Belladonna, iarba de Lobelia i rdcina de Harmala.

228

Nicotina: C10H14N2, este un lichid incolor, cu punct de fierbere 246o levogir, []D 163o; srurile nicotinei sunt dextrogire. Nicotina se dizolv n ap, n orice proporii, la temperaturi mai joase de 60o i mai nalte de 210o; ntre aceste limite este numai parial miscibil cu apa. Nicotina este solubil n dizolvani organici. La aer se coloreaz n brun. Nicotina, pricipalul alcaloid din tutun (diferite specii de Nicotiana din familia solanaceelor, printre care cele mai importante sunt nicotiana tabacum i nicotiana rustica, ambele cultivate), este nsoit n plant de 11 ali alcaloizi ce apar n cantiti mult mai mici. Dup structura lor, se mpart n trei grupe: Alcaloizi cu un inel Alcaloizi cu un inel Alcaloizi cu un singur inel piridinic legat de un inel piridinic legat de un inel piperidinic sau piridinic pirolidinic Analeasin ( - ) Nicotina N Metilanabasin Prolidin Nicotirina Anatalein N Metilpirolidin ( - ) Nornicotina N Metilanatabin Piperidin ( + ) Nornicotina 2,3` Dipiridil n afar de tutun, nicotina mai apare n numeroase plante (printre care cteva specii de Licopodium) ns n totdeauna n cantiti mici. Anabasina, care se gsete n tutun n proporie foarte mic, este alcaloidul principal din Anabasis aphylla, o chenopodiacee. (+) Narcotina se gsete ntr-o solanacee australian (Duboisia hapwoodii) i n cantitate mai mic n tutun (din care se izoleaz o ( ) nornicotin). Nicotina se mai gsete n frunzele de tutun sub forma srurilor cu acizii citric i malic. Nicotiana tabacum conine circa 2% nicotin, iar Nicotiana rustica circa 8% nicotin. Nicotina brut se prepar de obicei din praf de tutun, prin tratare cu hidroxid de sodiu, distilare cu aburi i extragere cu un dizolvant, cum ar fi benzenul, eterul de petrol sau chiar petrolul lampant. Nicotina se purific prin distilare ntr-o atmosfer de gaz inert sau prin recristalizarea oxalatului. Structura nicotinei a fost stabilit prin reacii de degradare i prin sinteze. Oxidarea cu diveri ageni oxidani duce la acidul piridin carboxilic, numit acid nicotinic. Nicotina este, prin urmare, un derivat al piridinei, avnd o grup C5H10N n poziia . Grupa aceasta s-a dovedit a fi N metil pirolidin. Aadar nicotina este: ( piridil) N metilpirolidina.

229

Se obine astfel acidul N metilpiranidinic carboxilic s-au acidul higric i anume n forma levogir, acelai care se formeaz din higrin, din (-) prolin. Configuraia steric a nicotinei este deci aceeai ca a amino acizilor naturali. O prim sintez a nicotinei a fost realizat de A. Pictet (1904). Prin distilarea uscat a srii acidului mucic cu amino piridin se formeaz se formeaz nti - piridil N pirolul. Trecut printr-un tub nclzit la rou, acest compus se izomerizeaz dnd piridil pirolul care, alchilat cu iodur de metil, trece n iodmetilatul nicotirinei. Prin distilarea acestuia cu var se obine apoi nicotirina.

piridil N piralul piridil piralul Nicotirin

Nicotirina se formeaz i din nicotin, prin dehidrogenarea cu ageni oxidani slabi. Prin hidrogenarea nucleului pirolic al nicotirinei, se formeaz nicotina. Pictet a realizat aceast reacie iodurnd i bromurnd succesiv nicotirina, n nucleul pirolic i reducnd compuii obinui, cu zinc i acid clorhidric. Mai trziu, hidrogenarea nicotirinei la nicotin, sa fcut i pe cale catalitic. O alt sintez a nicotinei se bazeaz pe condensarea esterului acidului nicotinic, cu N metilpirolodin, n prezena etoxidului de sodiu (SPTH 1928):

230

(-) Nicotina este un toxic puternic. Doza letal pentru un om este de aproximativ 40 mg. n cantiti mici nicotina acioneaz ca un excitant al nervilor centrali i periferici; ce provoac o secreie mrit a glandelor i o contracie a vaselor sanguine, deci o cretere a tensiunii arteriale. (+) Nicotina are o aciune fiziologic de circa 8 ori mai slab dect (-) nicotina natural. Nicotina este un toxic puternic pentru insecte i folosete ca insecticid n grdinrie. Printre alcaloizii care folosesc nicotina n frunzele de tutun (n proporie de 2 5 %) au fost identificate urmtoarele substane: Nicotirina C10H12N2 bisdehironicotina, un lichid incolor, cu punct de fierbere 280 oC, se obine ca intermediar n sinteza nicotinei dup Pictet. (-) Nornicotina C9H12N2 (nicotin fr metil la azot) se gsete n cantitate foarte mic, mpreun cu (+) nornicotina (caracemic) n frunzele de tutun obinuit. (-) Nornicotina este ns alcaloidul principal din numeroase specii slbatice de nicotiana. Anabasina C10H14N2, levogir, izomer cu nicotin, se gsete n tutun numai n cantiti foarte mici, este ns alcaloidul principal al unei plante asiatice, Anabases aphylla (A. Orecov 1928). Prin oxidarea anabazina d acid nicotinic, iar prin dehidrogenare catalitic d 2,3 dipiridil (un compus care de asemenea se gsete n tutun). De aici s-a dedus c anabasina are urmtoarea structur, confirmat prin sintez:

231

Analabina C10H12N2, care se izoleaz din capul de distilare al nicotinei brute, are o structur analoag anabasinei, cu o dubl legtur n inelul piperidinic. Fumul de igar conine nicotin i ali civa alcaloizi din tutun, precum i produi de descompunere ai acestora, printre care vom meniona numai miosmina, C9H10N2, o nornicotin, coninnd o dubl legtur n inelul piranidinic. Din fumul de tutun se depun gudroane, n care s-au identificat hidrocarburile cancerigene. Cancerul pulmonar este mai rspndit printre fumtorii de igri dect printre nefumtori. 6. Producerea alcaloizilor de ctre plante Sunt substane organice azotate complexe, produse doar de ctre organismul vegetal, ce prezint o reacie alcalin mai mult sau mai puin important. Sunt produi finali ai metabolismului azotat. Se cunosc aproximativ 5000 de alcaloizi naturali diferii. Alcaloizii se pot localiza n frunze (ceai, coca), semine (cafea), rdcini i scoar, spermoderm (brndue), scoara fructului (mac), canale secretoare, laticifere etc. n general, alcaloizii se caracterizeaz prin structuri heterociclice. Datorit azotului din molecul, prezint caracter bazic. Sunt substane insolubile n ap i solubile n solveni organici. Reacioneaz cu acizii minerali i formeaz sruri solubile. n plante se gsesc sub form de sruri ale acizilor oxalic, citric, malic, fumaric etc. Dau reacii caracteristice de precipitare cu numeroi reactivi (iodura de potasiu, clorura de platin, acid picric, acid sulfuric etc.). Exercit efecte fiziologice considerabile asupra omului i asupra animalelor. Alcaloizii sunt folosii n terapeutic drept narcotice i calmante. Unii alcaloizi sunt otrvuri puternice, spre exemplu curara, ce are capacitatea de a paraliza sistemul nervos. Se consider c alcaloizii constituie mijloace de aprare ale plantelor mpotriva insectelor. Unii alcaloizi, de exemplu nicotin, joac rol n procesele enzimatice de oxido-reducere. Plantele productoare de alcaloizi sunt dicotiledonatele, iar n msur mai mic monocotiledonatele i criptogamele. n general o plant conine mai muli alcaloizi. Coninutul n alcaloizi depinde de vrsta plantei, regiune, clim i anotimp. Algele i muchii nu au alcaloizi. Ei sunt rari la ciuperci (ergotamina), la pteridofite (nicotin de la Equisetum, coniina sporilor de Lycopodiu) i la gimnosperme (efedrina de la Ephedra). La angiosperme, anumite familii sunt recunoscute prin bogia lor n alcaloizi: Solanaceae (solanina, nicotina, hiosciamina, atropin .a.), Rubiaceae (cofeina, ernetina, chinina), Papaveraceae (morfina, papaverina, codeina, narseina .a.). Alcaloizii mai importani sunt:
232

coniina, nicotina, tropanul, atropina, cocaina, chinina, papaverina, morfina, codeina, stricnina, cofeina etc. Coniina se extrage din seminele de cucut. Este o otrav puternic, care n doze mari produce moartea prin paralizia centrului nervos respirator. Acest alcaloid prezint nucleu piperidinic. NICOTIN ( piridin N metilpirolidina) este principalul alcaloid din tutun. n cantiti mari este excitant al nervilor centrali i periferici i provoac contracia vaselor sanguine. n cantiti mari este un toxic puternic. Este un alcaloid care conine un nucleu piridinic legat de un heterociclu pirolidinic. TROPANUL, ATROPIN l COCAINA se extrag din solanaceae, convolvulaceae, dioscoraceae, i eritroxilaceae. Din punct de vedere chimic, aceti alcaloizi sunt esteri ai unor alcooli derivai de la tropan. Atropin acioneaz asupra sistemului nervos parasimpatic. Ea produce o relaxare a muchilor netezi i se folosete ca medicament antispasmodic. n cantitate mic dilat pupila, n cantiti mari este toxic. Cocaina, n cantiti mici este anestezic local, iar n cantiti mari produce paralizia nervului central. MORFINA i CODEINA se extrag din opiu. Morfina determin o insensibilitate la dureri datorit aciunii asupra sistemului nervos central. Codeina nu posed nsuiri narcotice. n cantitate mic se folosete ca medicament contra tusei. Codeina are structur chimic similar morfinei cu deosebirea c din nucleul A este nlocuit hidroxidul cu o grupare metoxilic. Morfina i codeina conin n molecul un inel fenantrenic parial saturat. CHININA se extrage din arborele de chinin. Se utilizeaz la combaterea malariei. Regleaz temperatura corpului uman. Chinina conine n molecula ei un eterociclu chinonic. PAPAVERINA se extrage din sucul lptos al capsulelor necoapte de mac (opiu). Ea acioneaz direct asupra musculaturii netede. Papaverina conine n molecul heterociclu izochinolinic. STRICNINA se extrage din seminele i frunzele plantei numit Strychnos mix voimica (turta lupului). Este o otrava puternic. n cantiti mici este toxic general iar n cantiti mari este insecticid. Stricnina conine n molecul heterociclu indol. COFEINA se extrage din boabele de cafea. Este un excitant al sistemului nervos. Cofeina conine n molecul ciclul purinic. Alcaloizii sunt produi finali de metabolism ai compuilor azotai i constituie mijloace de protecie i de aprare ale plantelor. n cantiti mici pot fi folosii ca substane farmaceutice, iar n cantiti mari acioneaz ca insecticide i otrvuri. Nicotina, una din cele mai mult de 4000 chimicale gsite n fumul de la produsele tabacice cum ar fi: igaretele, trabucurile i pipele, este un component esenial din tutun care acioneaz asupra creierului. Produsele tabacice care la folosire nu elimin fum cum ar fi: tabacul de prizat i cel de mestecat, conin de asemeni multe toxine precum i un nivel nalt de nicotin. Nicotina recunoscut ca una dintre cele mai frecvent utilizate droguri ce creaz dependen, este un lichid produs natural, incolor (culoare tears, pal) care devine brun cnd este ars i capt mirosul specific de tutun atunci cnd este expus la aer. Exist mai multe specii de plante tabacice; plantele tabacice sunt utilizate ca principal surs a produciei de tutun din prezent. Cum nicotina a fost identificat pentru prima dat la nceputul anului 1800,
233

a fost studiat extesiv i s-a demonstrat c are un numr de compleci i uneori efecte imprevizibile asupra creierului i a ntregului organism. Fumatul igrilor este cea mai predominant (rspndit) form a dependenei de nicotin n Statele Unite i pe ntreg globul. Majoritatea igrilor de pe piaa mondial n prezent conin 10 mg sau mai mult nicotin. Prin inhalarea fumului, un fumtor mediu inhaleaz 1-2 mg nicotin / igar. Au avut loc substaniale creteri n vnzarea, consumul i a produselor tabacice care nu produc fum, i mai recent, n vnzarea trabucurilor. Nicotina este absorbit prin piele i prin cptueala mucoaselor gurii i nasului sau prin inhalarea n plmni. Nicotina poate atinge concentraia maxim din l snge i creier foarte rapid. Fumatul igrilor, de exemplu, conduce la rapida distribuie a nicotinei n ntregul corp ajungnd la creier la numai 10 secunde de la inhalare. Trabucurile i pipele ce produc fum, pe de alt parte, tipic nu se inhaleaz fumul, deci nicotina e absorbit lent prin membranele mucoaselor din gurile fumtorilor. Nicotina din produsele ce nu produc fum, de asemenea, este absorbit prin membrana mucoaselor. 7. Dependena de nicotin Nicotina produce dependen. Muli fumtori folosesc tutunul cu regularitate deoarece sunt dependeni de nicotin. Dependena este caracterizat prin cutarea coercitiv a drogului i folosirea acestuia, chiar n faa unor consecine negative asupra sntii. Majoritatea fumtorilor de tutun exprim o dorin de a reduce sau de a opri utilizarea acestui drog i aproximativ 35 milioane dintre ei fac o serioas ncercare de a renuna n fiecare an. Din nefericire, mai puin de 7% dintre cei care ncearc s renune, reuesc prin proprie iniiativ mai mult de un an de abstinen; cei mai muli dintre acetia au o recdere (recidiv) dup cel mult cteva zile de la momentul ncercrii de a renuna. Ali factori trebuie luai n considerare, n afar proprietilor nicotinei, inclusiv nivelul ei ridicat de utilizare, numrul mic de consecine legale i sociale ale utilizrii tutunului i proiecte de marketing sofisticate i metodele de publicitate folosite de ctre companiile de tutun. Aceti factori, combinai cu dependena de nicotin, adesea sunt determinai pentru prima utilizare (folosire) i n ultimul rnd, pentru dependen. Efectele nicotinei Nicotina poate aciona n dou moduri: ca stimulent sau ca sedative. Imediat dup expunerea la sedative, apare o lovitur cauzat n parte de stimularea de ctre drog a glandelor de adrenalin i rezult descrcri de epinefrine (adrenalin). Afluxul adrenalinei stimuleaz corpul i cauzeaz o eliberare brusc de glucoz, de asemeni, o cretere a tensiunii arteriale, o respiraie, i a btilor inimii. Nicotina suprim, de asemeni, producia de insulin provenit de la pancreas, ceea ce nseamn c fumtorii sunt ntotdeauna uor hiperglicemici. Pe lng aceasta nicotina cauzeaz indirect o eliberare de dopamin n regiuni ale creierului care controleaz plcerea i motivaia. Aceste reacii sunt similare cu semnele altor abuzuri de droguri precum cocaina i heroina i este adevrat c se afl la baza senzaiilor plcute exprimate de ctre muli fumtori. n mod contrariu, nicotina poate, de asemeni, s exercite un efect de sedative, depinznd de nivelul de trezire (deteptare) a sistemului nervos a fumtorului i de doza de nicotin luat.
234

Expunerea cronic la nicotin are ca rezultat dependena. Cercetrile sunt doar la nceput privind documentarea n legtur cu schimburile neurologice care nsoesc dezvoltarea i meninerea dependenei de nicotin. Consecinele comportamentale ale acestor schimbri sunt bine documentate, totui, mai de 90% dintre fumtorii care au ncercat s renune fr s caute sprijinul tratamentelor, au recidivat n mai puin de o sptmn. Expunerea repetat la nicotin are ca efect dezvoltarea toleranei, condiie n care doze mai ridicate (mai mari) de droguri sunt necesare pentru a produce acea stimulare ca la nceput. Nicotina este metabolizat foarte rapid, disprnd din corp n cteva ore. Din aceast cauz, o parte din toleran se pierde n timpul nopii i fumtorii deseori mrturisesc c prima igar din cursul zilei are cel mai mare efect i / sau este cea mai bun. Pe msur ce zilele trec, se dezvolt o acut toleran i igrile urmtoare (de dup prima igar) au efect din ce n ce mai sczut. ncetarea utilizrii nicotinei este urmat de ctre o serie de simptome specifice utilizrii drogului, simptome care uneori pot dura pn la o lun sau mai mult; include i simptome care determin fotii fumtori s utilizeze tutunul i astfel s aib o recidiv. Siptomele retragerii utilizrii nicotinei includ iritabilitate, pofte (dorina de a consuma din nou), deficite de atenie i cognitive, disturbarea somnului i apetit crescut i pot ncepe nc de la doar cteva ore de la consumarea ultimei igri. Simptomele pot atinge apogeul nc din primele zile i vor scdea n intensitate n ultimele sptmni. Pentru unele persoane, oricum, simptomele pot persista cteva luni sau mai mult. Un comportament important dar foarte puin neles al sindromului retragerii de la nicotin este dorina (pofta), o nevoie disperat de nicotin care a fost descris ca fiind obstacolul principal n obinerea unei abstinene cu succes. Un nivel ridicat al dorinei de tutun poate persista nc 6 luni sau mai mult. n timp ce sindromul retragerii este relatat referitor la efectele farmaceutice ale nicotinei, mui ali factori comportamentali pot afecta cu seriozitate simptomele retragerii de la folosirea nicotinei. Pentru unele persoane, pipirea, mirosul i vederea igrilor, precum i ritualul obinerii, folosirii, aprinderii i a fumatului n sine sunt toate asociate cu efectele plcute ale fumatului i pot face retragerea i / sau dorina de a fuma mai greu de depit. n timp ce guma cu nicotin i rupturile pot uura aspectele farmaceutice ale retragerii, dorina de a consuma persist uneori. Efecte medicale ale nicotinei Consecinele medicale ale expunerii la nicotin rezult din efectele amndorura: al nicotinei n sine i felul cum este consumat. Cel mai pernicios efect al dependenei de nicotin este rezultatul utilizrii tutunului, care este justificarea pentru 1 / 4 din numrul total de cazuri care cauzeaz cancer. n primul rnd, printre cazurile cauzate de tutun, de cancer de plmn este de departe numrul minim de cancer provocator de moarte att n rndul brbailor ct i n rndul femeilor. n afara cancerului de plmn, fumatul provoac de asemeni boli (afeciuni) ale plmnilor cum ar fi: bronitele cronice i efizem i a fost gsit ca agravator a simptomelor asmatice la aduli i copii. Fumatul este, de asemeni, asociat cu cancerul gurii faringelui,
235

laringelui, esofagului, stomacului, pancreasului, colului uterin, rinichilor, uretrelor i a vezicii urinare. Ratele obinuite de deces provocate de cancer sunt de 2 ori mai ridicate n rndul fumtorilor dect n cele a nefumtorilor, ratele fumtorilor mptimii fiind de 4 ori mai ridicate dect cele ale nefumtorilor. Fumatul igrilor este cea mai important cauz preventiv de deces n U.S. 430.000 mori anuale sunt atribuite fumatului de igri.

8. Substane cancerigene. n grupa acesta au fost incluse unele medicamente clorambucilul i ciclofosfamida i alte substane chimice: amestecuri analgezice care conin fenacetin; azatioprina; 1,4butandioldimetan-sulfonat (Mileran); asociaii chimioterapice utilizate n tratamentul limfoamelor (Metotrexat, Oncovin, Procarbazin i Prednison); estrogeni conjugai; treosulfan; metoxalen, etc. Expunerea profesional la azbest determin creterea incidenei cancerului pulmonar, precum i un risc crescut al apariiei cancerului gastro-intestinal i al laringelui. Toate tipurile de fibre de azbest testate sunt cancerigene la oarece, obolan, hamster i iepure producnd mezotelioame i cancer pulmonar dup inhalare, administrare intrapleural, intratraheal i intraperitoneal. Diferii compui ai cromului (oxid cromic, bioxidul de crom, trioxidul de crom, cromatul de calciu) au indus tumori pulmonare sau sarcoame la obolani. 4-Aminobifenilul, antioxidant n industria cauciucului, este cancerigen asupra vezicii urinare la oarece, obolan, iepure i cine. La om s-a observat creterea incidenei cancerului de vezic la muncitorii expui profesional la aceast substan.
NH2

Benzidina este cancerigen la oarece, obolan, hamster i cine, inducnd carcinoame ale vezicii urinare i tumori hepatice. Studiile epidemiologice au demonstrat o strns legtur ntre expunerea profesional la benzidin i creterea incidenei cancerului de vezic urinar.
H2N NH2

2-Naftilamina, administrat peroral, induce carcinoame ale vezicii urinare la cine i maimu, iar n doz mare la hamster. La obolan i iepure, efectul su cancerigen este slab sau chiar nul. Se pare c exist o legtur cauzal ntre expunerea la 2-naftilamin i incidena cancerului vezicii urinare.
NH 2

Bis(clormetil)eterul (BCME) (ClOH2OCH2Cl), clormetilmetileterul (CMME) (ClCH2OCH3) sunt ageni de clormetilare. BCME este cancerigen la oareci i obolan prin inhalare i administrare subcutanat. CMME induce sarcoame la oarece dup administrare
236

subcutanat. Incidena cancerului pulmonar crete direct proporional la muncitorii expui la BCME i CMME. Iperita, S(CH2CH2Cl)2 este induce tumori pulmonare dup inhalare sau injectare intravenoas i sarcoame locale dup injectare subcutanat. La om s-a constatat o cretere a mortalitii prin cancer al cilor respiratorii la subiecii expui cronic la aceast substan. Clorura de vinil (H2C=CHCl), administrat peroral sau prin inhalaii, induce carcinom pulmonar, mamar, angiosarcom al ficatului la oarece i obolan. Aflatoxinele s-au gsit n mucegaiul Aspergilus flavus. Aflatoxinele sunt toxice la oarece, obolan, pete, ra i maimu, administrate pe mai multe ci, inclusiv calea oral i induc n special cancer hepatic, de colon i rinichi. Au fost denumite B (blue) de la fluorescena albastr pe care o emit n lumin ultraviolet, respectiv G (green) de la fluorescena verzuie, iar n funcie de originea apariiei pe cromatogramele n strat subire, s-au mprit n aflatoxine B1, B2, respectiv, G1, G2. La om exist o corelaie pozitiv ntre media concentraiei aflatoxinelor din dieta populaiei i incidena cancerului primitiv hepatic. Aflatoxinele sunt substane cristaline alb-glbui. n u.v. emit fluorescen albastr sau verzuie; toate prezint absorbie la 363 nm. Sunt substane insolubile n ap i solveni nepolari. Aflatoxine produc liniile de Aspergillus flavus i unii fungi ca: Aspergillus parasiticus, A. niger, A. ruber, A. weniti, A. spp., Penicilium puberulum, P. frequentas, P. citricum etc., n condiii corespunztoare de temperatur i umiditate, pe substraturi de arahide i, n general, de plante oleaginoase. S-ar prea c aproape toate alimentele stocate n condiii specifice de umiditate i temperatur pot fi contaminate cu aflatoxine.

237

O O

O O

O O

OH

O Aflatoxina B 1

OC H 3

O Aflatoxina B 2

OC H 3

HO

O Aflatoxina B 2a

OCH 3

O O

O O

O OH O

O O

OH

O Aflatoxina G 1

OC H 3

O Aflatoxina M 1

OC H 3

O Aflatoxina R o

OC H 3

O O

O O
O

O O
O

CH 2-CH 2 -OH

HO

O Aflatoxina G 2a

OCH 3

O Aflatoxina G 2

OC H 3

Parazitol (Aflatoxina B 3 )

Toxicitatea aflatoxinelor. Sunt substane toxice acute la cele mai multe specii, dar ele au o susceptibilitate variat, n funcie de specie, sex, vrst. Aflatoxinele B1 i G1 n doze unice sunt letale i au o aciune relativ similar: la rute de 50 g, DL50 este de 18,2 mg B1 i 39,2 mg G1. Similar la obolanii masculi DL50 este de 7,2 mg B1/kg i.p. i 14 mg G1/kg i.p. Aflatoxinele B2 i G2 au o aciune mai slab la rute (DL50 = 1,76 mg B2/kg i, respectiv, 2,83 mg G2/kg) i sunt netoxice la obolani la doze de 200 mg/kg. Toxicitatea aflatoxinelor descrete n ordinea: B1>G1>B2>G2. Carcinogenitatea aflatoxinelor. Lancaster, n 1961, prezint aciunea cancerigen a finei de arahide asupra obolanilor. S-a observat o relaie linear doz-rspuns n inducerea. Astfel, incidena carcinoamelor hepatice induse de fina de arahide coninnd 0,5 ppm (mg/kg fin) aflatoxin este de 100% i pentru 0,1 ppm de 50% la obolanii masculi, iar la femele pentru 0,5 ppm se observ o inciden de 80%, iar pentru 0,1 ppm o inciden de aproximativ 17%. Aflatoxina B1 pur determin, la concentraii de 0,015 ppm n diet, tumori n proporie de 100% att pentru obolanii masculi, ct i pentru femele. Aflatoxina are o aciune cancerigen transplacentar; puii de obolan fac hepatoame, dac mamele sunt hrnite cu mncare coninnd aflatoxin, n perioada de gestaie. Aflatoxina B1 este cel mai puternic hepatocancerigen cunoscut. Dei sensibilitatea n cadrul speciilor variaz, toate speciile animale tratate cu aflatoxin B1 fac tumori la ficat.
238

Metabolismul. Metabolizarea aflatoxinelor se realizeaz n microzomii hepatici. oarecele metabolizeaz integral aflatoxina B1 la produi netoxici i aflatoxin M1, n timp ce obolanul poate metaboliza aflatoxina B1 doar la aflatoxin M1 care este un cancerigen ultim pentru aceast specie.
O O OH H O OH H O O OH H OH O O O OCH3 Aflatoxicol M1 O Aflatoxicol OCH3 O O OCH3

OH

Aflatoxicol H1

O O O OH O O O Aflatoxina M1 OCH3 O Aflatoxina B1 O O

O O

OH OCH3 O O Aflatoxina Q1 OCH3

O O H HO O O

O O O O OCH3 O O Aflatoxina B1 2,3 - epoxid

O O

OCH3

O Aflatoxina P1

OH

Aflatoxina B2a PROTEINE BAZE SCHIFF

ADN, ARN ACIZI NUCLEICI

Fig. 16. Metabolizarea aflatoxinei B 1

Patulina (C7H6O4). Substana pur se prezint sub form de prisme sau plci incolore, este solubil n ap i solveni organici uzuali, cu excepia eterului de petrol. Este produsul de metabolism al unor specii de ciuperci i anume: Penicillium claviforme, P. patulum, P. expansum, Aspergillus clavatus, A. giganteus etc.

CH3

DL50 la oareci a fost de 15 mg/kilocorp prin injecii subcutanate, 25 mg/kilocorp prin injecii intravenoase, 5 mg/kilocorp prin injecii intraperitoneale i aproximativ 35
239

mg/kilocorp prin administrare peroral. Prin administrarea patulinei s-au obinut sarcoame la obolani, la locul injeciei subcutanate dup 69 sptmni. Medicamente: Clorambucilul este un medicament antineoplazic aplicat n tratamentul unor leucemii i limfoame. Administrarea sa intraperitoneal induce limfoame la obolani i limfosarcoame i tumori ovariene i pulmonare la oarece. Au fost relatate cazuri de leucemie i cancer renal la bolnavii tratai cu clorambucil.
HOOC-CH2CH2CH2 N(CH2CH2Cl)2

Ciclofosfamida (Endoxan, Clafen) este mult utilizat n tratamentul cancerului i ca agent imunosupresor (artrit reumatoid, lupus eritematos, pneumonie interstiial cronic). Administrat n doze similare cu cele folosite n clinica uman, ciclofosfamida induce la oareci i obolani tumori pulmonare, limforeticuloame, tumori hepatice, ale organelor de reproducere, sarcoame i carcinoame, tumori ale vezicii urinare.
O P N(CH2CH2Cl)2 .H2O
NH

Clornafazina (N,N-bis (2-cloretil)-2-naftil-amina) remediu antineoplazic. La animale induce tumori pulmonare dup administrare intraperitoneal (oarece) i sarcoame locale (obolan) dup injectare subcutanat.

N(CClH 2CH 2 Cl) 2

La om crete incidena cancerului de vezic urinar la bolnavii cu policitemia vera tratai cu clornafazin. Melfalanul (Sarcolizina) este utilizat n clinica uman ca COOH agent antineoplazic n tratamentul mielomului multiplu, CH-CH2 N(CH2CH2Cl) melanomului malign, adenocarcinomului de ovar. La NH2 oareci a provocat cancer pulmonar i sarcoame, iar la obolani fibrosarcoame mamare. La om au fost semnalate cazuri de cancere secundare, n special leucemii acute, la bolnavii tratai cu melfalan pentru o alt tumoare primar (Einhorn, 1978). Tetraclorura de carbon (CCl4) este cancerigen, inducnd tumori hepatice asociate cu ciroz. Dimetilsulfatul [(CH3)2SO4], utilizat n industria farmaceutic, este cancerogen dup inhalare. Amitrolul, un erbicid, administrat peroral sau n injecii subcutanate induce tumori tiroidiene i hepatice la oarece i obolan. La om crete riscul, diferenele fiind statistic semnificative. Derivai policlorurai ai difenilului sunt cancerigeni la oarece i obolan dup administrare pe cale oral, inducnd tumori hepatice. La om crete incidena melanomului malign la cei expui. Beriliul i compuii acestuia sub form de pulbere de sulfat de beriliu, minereu de beriliu i bertrandit au indus tumori pulmonare la obolani n urma inhalrii acestora. Prin
2

240

administrare intravenoas de silicat de beriliu i zinc, fosfat de beriliu i beriliu metalic s-au obinut tumori osoase la iepuri. Alte substane probabil cancerigene: dicarbazina; procarbazina; bisclormetilnitrozourea; 1-(2-cloretil)-3-ciclohexil-1-nitrozourea etc. Epiclorhidrina este un solvent pentru rinile naturale i sintetice. Injectat subcutanat la oarece, induce sarcoame locale. La om s-a constatat o cretere a mortalitii prin cancer al cilor respiratorii i leucemii la muncitorii expui prin profesie la aceast substan, dar creterea este nesemnificativ statistic.
O CH2 CH CH2Cl

Tricloretilena (Cl2C=CHCl), solvent, este cancerigen la oarece; dup administrare peroral induce carcinom hepato-celular i tumori pulmonare. Stirenul induce tumori pulmonare la oarece dup administrare peroral. La oamenii expui profesional la stiren, benzen i butadien au fost semnalate cazuri de leucemie i limfom. Plumbul i srurile de plumb conduc la tumori renale benigne i maligne la obolani. Medicamente: Tio-TEPA (Trietilen-tiofosfamida) este un antineoplazic folosit n tratamentul adenocarcinomului mamar i ovarian, limfoamelor maligne, carcinomului bronic, etc. Este cancerigen la oareci i obolani. La om au fost raportate unele cazuri de leucemie n urma tratamentului cu Tio-TEPA.
S CH2 CH2 N P N CH2 CH2 N CH2 CH2

Fier-dextranul, medicament utilizat n tratamentul anemiei feriprive, induce tumori locale dup injectare subcutanat i intramuscular. Oximetolona, medicament anabolizant, provoac tumori hepatice la bolnavii tratai cu aceast substan, singur sau asociat cu alte medicamente androgene. Exist riscul unei terapii ndelungate cu acest medicament n clinic.
CH3 HO-CH O H CH3 OH CH3

Fenacetina, medicament antipiretic i analgezic, dezvolt tumori ale cilor urinare i nazale la obolan. N-hidroxi-fenacetina, un m etabolit al acesteia, induce carcinoame hepatice dup administrare peroral la obolani.

241

O NH-C-CH3

O-CH2-CH3

La om fenacetina induce necroz papilar a rinichiului, care ar putea degenera n cancer. Fenitoina, utilizat n tratamentul epilepsiei i al tulburrilor psihomotorii, s-a dovedit a fi cancerigen la oarece dup administrare intraperitoneal sau peroral, inducnd limfoame i leucemii. La om s-a constatat o relaie ntre apariia limfoamelor i chimioterapia anticonvulsivant pe termen lung cu fenitoin. Fenobarbitalul este cancerigen la oareci i obolani. Izoniazida este utilizat n clinica uman ca agent tuberculostatic. Induce cancer la oarece, dup administrare peroral, subcutanat sau intraperitoneal. Triazichinona este un medicament antineoplazic. Induce o varietate de tumori maligne dup administrare intravenoas i intraperitoneal la obolani.
O N CH2 CH2 N O N CH2 CH2 CH2 CH2

OH

-C-N-NH2

Inducerea tumorii. Oncogeneza este de regul un proces multistadial, determinat de agenii cancerigeni i influenat de promotori tumorali. administrarea unei doze unice, sub pragul cancerigen, dintr-o substan sigur cancerigen, pe pielea animalelor de experien induce modificri n cteva celule, care nu sunt perceptibile dac tratamentul cu agentul cancerigen nu se continu, neconducnd la dezvoltarea tumorii. Aceast prim etap a cancerogenezei chimice a fost denumit iniiere i poate fi efectuat numai de ctre o substan chimic sigur cancerigen. Etapa a doua a cancerogenezei chimice promovarea favorizeaz exprimarea modificrilor care rezult n decursul procesului de iniiere. Promovarea are loc dup o perioad de sptmni sau luni de la aciunea de iniiere a agentului cancerigen; ea nu este ireversibil, ci mai degrab poate fi reversat n anumite mprejurri. Cancerigenii complei induc ambele etape ale cancerogenezei, iniierea i promovarea. Administrarea unic a 7,12-dimetilbenzantracenului (DMBA), cancerigen complet, urmat de aplicarea repetat a unui promotor duce la dezvoltarea unui numr tot att de mare de tumori i necesit o cantitate de 20 de ori mai mic de DMBA dect dac s-ar administra singur. Se admite c tumorile nu sunt exclusiv consecina inevitabil a unei leziuni genetice i, n consecin, prevenirea cancerului trebuie s fie ndreptat att n direcia ndeprtrii
242

substanelor cancerigene (iniiatori) sau mpiedicrii metabolizrii lor n organism la produi mai activi (electrofili), ct i a evitrii expunerii repetate la substane cu rol promotor. Metabolizare i cancerizare.Observaii mai vechi au sugerat c metabolizarea substanelor chimice cancerigene in vivo ar constitui factorul cheie n explicarea aciunii lor cancerigene. S-a demonstrat legarea covalent a unui metabolit al dimetil-azobenzenului (DAB) la proteinele hepatice solubile la obolanii hrnii cu acest colorant. Se formeaz compleci ntre derivaii unor amine aromatice (2-acetilaminofluoren AAF), precum i a altor clase de substane chimice cancerigene (hidrocarburi aromatice policiclice) i proteinele esuturilor int (ficat, piele). S-au mai identificat aduci ai derivailor cancerigenilor chimici cu DNA, ARN i proteine n esuturile int. Majoritatea cancerigenilor chimici sunt activi numai dup activarea metabolic n organism la cancerigeni ultimi. Excepie fac substanele chimice alchilante i acilante, care sunt electrofile n forma lor natural, putnd s efectueze legturi chimice cu macromoleculele celulare. Ageni alchilani
+ CH2-CH2 Cl R-N + CH2-CH2 Cl

+ CH2 _ O

CH
C=O

CH3 CH3

+ O C _ Cl

Gaz mustar

-propiolactona

Clorura de dimetilcarbamoil

Datele experimentale susin c formele ultime ale cancerigenilor chimici sunt reactani electrofili puternici. n felul acesta, substane chimice cu structuri diferite ajung prin activare metabolic n organism la metabolii activi, care au ca trstur comun electrofilia. Cancerigenii ultimi conin n molecula lor atomi deficitari n electroni, care pot s reacioneze cu centrii nucleofili, adic cu atomi care posed o pereche de electroni capabili s formeze o legtur chimic. Astfel de centri nucleofili ntlnim n macromoleculele celulare, cum ar fi acizii nucleici (atomi de azot, carbon i oxigen) i proteine (atomi de azot, sulf i oxigen). Activitatea biochimic a cancerigenilor chimici n organism este iniiat de sistemele enzimatice i anume de oxidaze cu funcie mixt, dependente sau nu de citocromul P450, existente n microzomi. Cancerigenii ultimi odat formai, reacioneaz, de obicei neenzimatic, cu centrii nucleofili din macromoleculele celulare in vivo. Interesul deosebit pentru aceti derivai l constituie interaciunile covalente ale acestor reactani electrofili cu macromoleculele informaionale DNA, ARN i proteine. Deoarece cei mai muli dintre cancerigenii chimici sunt metabolizai n organism la mai mult dect un tip de cancerigen ultim i pentru c sunt mai muli centri nucleofili n fiecare macromolecul, exist posibilitatea formrii mai multor compleci cu DNA, ARN i proteine pentru fiecare cancerigen ultim n parte. De aceea, nu se poate ti care din aceti compleci sunt mai importani pentru cancerogenez.

243

Activarea metabolic a aminelor i amidelor aromatice Cancerogenitatea aminelor i amidelor aromatice depinde de transformarea lor n organism n derivai N-hidroxilai i convertirea mai departe a acestora la metabolii mai reactivi, care se leag covalent la centrii nucleofili din macromoleculele celulare. 2-Acetil-aminofluorenul (AAF) obolanii hrnii cu AAF excret prin urin un metabolit al acestuia, N-hidroxi-2-acetilaminofluorenul, a crui concentraie crete proporional cu cantitatea de AAF administrat. Metabolitul este un cancerigen mai puternic dect compusul de origine. Studiile efectuate in vivo cu izotopi marcai au artat c administrarea ambilor produi (AAF i N-hidroxi-AAF) la obolani conduce la formarea de aduci cu acizii nucleici i proteinele hepatice, care au fost evideniai i separai prin tehnici cromatografice din ficatul acestor animale. In vitro, aceeai compui nu formeaz aduci cu acizii nucleici i proteinele. S-a ajuns astfel la supoziia c N-hidroxi-AAF ar suferi o nou activare n organism, etapa secundar de activare metabolic ce duce la derivai electrofili mai puternici, ce reacioneaz cu centrii nucleofili din macromoleculele celulare. S-a demonstrat (King i Olive, 1975) c activitatea N-hidroxi-AAF n ficat are loc sub aciunea unei enzime localizat n citosolul acestei celule cu formarea esterului sulfuric al Nhidroxi-AAF, considerat cancerigenul ultim major al N-hidroxi-AAF n ficatul de obolan. Sa ajuns la concluzia c ar exista o corelaie ntre activitatea sulfotransferazei hepatice i susceptibilitatea animalelor hrnite cu AAF de a dezvolta tumori hepatice. Cu toate acestea, s-a mai gsit c exist i ali derivai ai N-hidroxi-AAF care i ei sunt foarte activi att din punct de vedere cancerigen, ct i mutagen. N-hidroxi-2-acetilaminofluorenul sufer o oxidare catalizat de o peroxidaz cu formarea unui radical nitroxid liber. Doi asemenea radicali pot, prin dismutare, s formeze N-acetoxi-2-aminofluorenul, un reactant electrofil puternic i 2-nitrozofluorenul, inactiv. Activarea aminelor i amidelor aromatice depinde de convertirea lor la compui Nhidroxilai. Metaboliii ultimi cancerigeni nu au putut fi identificai n toate cazurile i de asemenea reaciile intermediare care conduc la aceti metabolii ultimi difer n funcie de substituenii aril, de esut sau de specie. Metabolismul coloranilor aminoazoici. Metabolizarea N-metil-4-aminoazobenzenului (MAB) are loc la derivai N-hidroxilai urmat de convertirea acestora la esteri ai acidului sulfuric. Oxidarea coloranilor aminoazoici n organism este catalizat de o oxidaz microzomial flavo-proteic, independent de citocromul P450, deosebindu-se astfel de cea care hidroxileaz AAF. Activarea n continuare a coloranilor aminoazoici se face sub aciunea sulfotransferazei, care are specificitate de substrat, deosebindu-se astfel de cea care activeaz 2-acetilaminofluorenul. Esterii sulfurici formai sunt reactani electrofili puternici i formeaz aduci cu AAND substituia fcndu-se ca i n cazul AAF la C8 al guaninei (aductul principal) i N2 al acesteia.

244

Metabolismul 2-naftilaminei i 4-aminodifenilului. Prin instilri repetate cu N-hidroxi-2naftilamin n vezica urinar la cine, apar tumori n acest organ. S-a constatat de asemenea o strns corelaie ntre gradul de cancerogenitate al 1-naftilaminei (necancerigen ca atare), 2naftilaminei i 4-aminodifenilului, cu producerea methemoglobinei (care msoar Nhidroxilarea acestora n snge) i concentraia produilor N-hidroxilai n urin. S-ar prea c N-hidroxilarea acestor arilamine ar fi factorul molecular cheie n producerea cancerului de vezic urinar.
N=N N CH3 H

MAB

OXIGENAZA MICROZOMIALA FLAVOPROTEICA

N=N

CH3 OH

N-HIDROXI-MAB
SULFOTRANSFERAZA + PAPS

N=N

CH3 O-SO3-

N-SULFAT-MAB
+ ADN

ADUCTI CU ADN
HIDROLIZA ENZIMATICA

CH3 N=N N

O N N N O N N N NH N H2

dR

+
H N=N

HN
N

dR NH CH3 Fig. 17. Metabolizarea N-metil-4-amino-azobenzenului (Miller I.A. si E.C., 1980)

Mecanismul probabil al producerii cancerului de ctre 2-naftilamin i 4-aminodifenil ar fi urmtorul: aceti compui sunt N-hidroxilai n ficat sub aciunea oxigenazelor mixte dependente de citocromul P450 i conjugai apoi tot n ficat cu acid glucuronic. Din ficat, sunt transportai sub form inactiv i solubil prin snge, ajungnd n vezica urinar. Aici, glucuronoconjugaii hidrolizeaz n mediul slab acid al urinei sau sub aciunea glucuronidazei urinare, punnd n libertate compusul activ N-hidroxilat. n mediul urinar acid compuii hidroxilai conduc la ioni de arilnitreniu, care sunt probabil cancerigenii ultimi responsabili de inducerea cancerului vezicii. Exist o corelaie cantitativ ntre cancerogenitatea 1-naftilaminei, 2-naftilaminei i 4aminodifenilului pentru vezica urinar la cine cu nivelul excreiei N-hidroxilaminelor corespunztoare. Argumente n plus n acest sens sunt aduse de experiene care au indus
245

carcinoame ale vezicii urinare prin instilaii cu N-hidroxi-2-naftilamin, dar nu i cu 2naftilamin. Rolul metaboliilor urinari ai 2-naftilaminei n inducerea cancerului vezicii urinare la cine a fost bine ilustrat de cercetrile care protejnd epiteliul vezicii urinare de contactul cu urina nu dezvolt tumori, n timp ce epiteliul vezicii expus la urin se transform neoplazic (Kadlubar i colab., 1977). Formarea in vitro a N-glucuronidelor stabile din Nhidroxi-arilamine permite izolarea acestor compleci n cantiti suficient de mari. Amidele i aminele aromatice iniiaz formarea tumorii prin modificarea macromoleculelor esutului int. ntr-o prim etap, acestea sunt N-hidroxilate, pentru ca ulterior s formeze derivai electrofili puternici, capabili s reacioneze cu macromoleculele celulare, acizii nucleici i proteinele. Aceti derivai electrofili fiind reactivi sunt i foarte instabili, fapt ce limiteaz distana la care pot s-i exercite proprietile cancerigene.
Ar-NH2
+ NADPH reticul + O2 endoplasmatic
COOH H HO H OH O H OH H N H Ar OH

FICAT

Ar-N

OH H

reticul endoplasmatic

+ AUDPG

Transport

COOH

Ar-N

OH H

pH < 7
pH < 7 pH > 7

H HO

O H OH H H OH

OH N H Ar

URINA
H ion de arilnitreniu + Ar-N

+ OH2 Ar-N H

- H2O + H2O

Ar-N

OH + H+ H - H2O activare metabolica

+ Ar-N

EPITELIUL VEZICII URINARE

ELECTROFILI REACTIVI

SE LEAGA COVALENT LA LOCURILE NUCLEOFILE DIN MACROMOLECULELE CRITICE

FORMAREA TUMORII

Ar - substituent aril; AUDPG - acid uridin-difosfoglucuronic;

- transport sau reactie

Fig. 18. Formarea si transportul metabolitilor cancerigeni proximali (N-hidroxi) si ultimi (ioni de aril-nitreniu) ai arilaminelor pentru inducerea cancerului vezicii urinare

n cazul 2-acetil-aminofluorenului, cancerizarea presupune substituirea ADN cu fragmente de 2-AAF la C8 al guaninei. Exist opinia c la formarea aductului, guanina sufer o rotaie n afara dublului helix, fragmentul de fluoren nserndu-se astfel n interiorul helixului. Acest model este n acord cu substituia perechilor de baze i deleia mutanilor. Aceste substituii conduc n final la modificri n transcripia informaiei genetice. Donorii de grupe alchil Dialchil-nitrozaminele, dialchil-hidrazinele, aril-dialchil-triazenele, alchil-nitrozimidele, etc. sunt donori de grupe CH3 i C2H5.

alchil-nitrozamidele,

246

Dialchil-nitrozaminele sunt activate prin oxidarea unei grupe alchil de ctre sisteme monooxigenazice dependente de citocromul P450 din reticulul endoplasmatic alcelulelor corespunztoare (Michejda i colab.,1980). Derivaii monoalchil formai se descompun spontan la ionii monoalchil-diazoniu, foarte reactivi. N-nitrozamidele i N-nitrozimidele pot fi activate neenzimatic prin reacia lor cu H2O sau alte grupri nucleofile (SH, NH2), conducnd la formarea acelorai intermediari monoalchil-diazoniu. Se obin numeroi compleci metilai ai acizilor nucleici i proteinelor n esuturile int. Metilarea poate avea loc n diferite poziii nucleofile: O6 la guanin, N7 la guanin, N3 la adenin etc.; N1 i N2 la histidin, S1 la cistein etc. Asemntor cu dialchil-nitrozaminele, 1,2-dialchil-hidrazinele i aril-dialchiltriazenele sunt convertite n reticulul endoplasmatic de monooxigenaze mixte dependente de citocromul P450 tot la ageni alchilani puternici. Metabolismul aflatoxinelor Exist o legtur ntre toxicitatea, mutagenitatea i cancerogenitatea aflatoxinei B1 i dubla legtur din inelul furanic terminal. Astfel, aflatoxina B2, creia i lipsete aceast dubl legtur, este mult mai puin activ dect aflatoxina B1 n experienele pe animale. n plus, toxicitatea i mutagenitatea aflatoxinei B1 pentru Salmonella typhymurium este dependent de adugarea preparatelor care conin un sistem enzimatic monooxigenazic dependent de citocromul P450. De aici rezult c epoxidul aflatoxinei B1 poate fi metabolitul ultim activ din punct de vedere biologic. S-a izolat 2,3-dihidro-2,3-dihidroxi-aflatoxina B1(dihidro-diol) dintr-un hidrolizat acid al aductului rARN-aflatoxin B1, format prin oxidarea microzomial a aflatoxinei B1 n prezena rARN. De asemenea, s-a evideniat un derivat similar n ficatul obolanilor hrnii cu aflatoxin B1 tritiat. Aceste dou cercetri sugereaz epoxidarea aflatoxinei B1 in vivo, cu formarea 2,3-epoxidului aflatoxinei B1, cancerigen ultim foarte activ.

247

O O

O Aflatoxina B1

OCH3

Fig. 19. Activarea aflatoxinei B1 de catre monooxigenazele hepatice

O O O O O

OCH3

Aflatoxina B1 - 2,3 - oxid

OH
(ADN, ARN) PROT

O
Hidroliza acida

O
HO HO

OCH3

OCH3

Aflatoxina B2 confer numai 1% din cantitatea de aduci cu rARN i AND obinui n cazul administrrii aflatoxinei B1. Pentru ca aflatoxina B2 s devin activ, trebuie s se transforme enzimatic n aflatoxin B1, care la rndul ei urmeaz calea de activare metabolic la 2,3-epoxid. Pe de alt parte, nu s-a reuit sinteza 2,3-oxidului aflatoxinei B1, probabil din cauza marii reactiviti i instabilitii acestuia. S-a artat ns c 2,3-diclorura aflatoxinei B1 sintetizat ca un model pentru 2,3-oxidul aflatoxinei B1 manifest o mare putere cancerigen i mutagen ca atare, fr s necesite o activare metabolic. Se considera c o hidrocarbur este cancerigen dac posed o regiune K cu o densitate mare de electroni.n aceast regiune din hidrocarbur are loc adiia electrofil cu formare de compui fenolici. Conform teoriei soilor Pullmann, numai hidrocarburile aromatice policiclice care au n regiunea K o densitate de electroni mai mare de 1,283 au efecte cancerigene. Majoritatea substanelor chimice i manifest aciunea cancerigen dup metabolizare n organism sub aciunea unor sisteme enzimatice de oxigenaze mixte la metabolii mai reactivi. Acetia reacioneaz cu centrii nucleofili din macromoleculele celulare, AND, ARN i proteine. Deoarece hidrocarburile aromatice policiclice sunt o clas de substane relativ inerte, s-a presupus c un grup de metabolii mai reactivi ai acestora sunt responsabili de activitatea lor cancerigen. Plecnd de la existena unei regiuni foarte reactive (regiunea K) n hidrocarburile aromatice policiclice cancerigene, a fost firesc ca primii epoxizi testai pentru aciunea lor cancerigen i mutagen s fie epoxizii formai n regiunea K. Slaba cancerogenitate a multor epoxizi ai regiunii K n benzantracen sau n hidrocarburi nrudite cu acesta n-au confirmat aceast ipotez. Totui, aceti epoxizi s-au dovedit a fi cancerigeni mai puternici dect hidrocarburile corespunztoare n culturi de celule.

248

12 11 10 9 8 7 6 5

1 2 3 4 10 9 11

12

1 2 3 4

cit - P450 monooxigenaza + NADPH + O2

Benzpiren
12 11 1 2 3 4 6 5

7,8-oxidul benzpirenului

HO

HO 7, 8 dihidroxi-9+ 10epoxi-7,8,9,10-tetrahidrobenzpiren
12 11 1 2 3 4

cit - P450 monooxigenaza

HO OH

Dihidrodiolul benzpirenului

HO HO

7, 8 dihidroxi-9+ 10epoxi-7,8,9,10-tetrahidrobenzpiren

Fig. 20. Activarea metabolic a benzpirenului.

Cancerigenul ultim al benzpirenului este 7-beta-8-alfa-dihidroxi-9-alfa-10-alfa-epoxi7,8,9,10-tetrahidro-benzpirenul, electrofil, mutagen i cancerigen. Produii majori de reacie ai acestor izomeri cu DNA implic gruparea 2-amino din guanidin i C10 a epoxidului. Epoxizii cancerigeni se formeaz ntr-o regiune a moleculei numit golf (bay region). Se afirm astfel c aceast regiune s-ar gsi ntre poziiile 4 i 5 n fenantren, 1 i 12 n benzantracen i 10 i 11 n benzpiren.
4 5 12 1 10 11

Fenantren

Benzantracen

Benzpiren

Fig. 21. Pozitia "bay region" in fenantren, benzantracen si benzpiren (Jerina D. M., 1978)

n consecin, se poate explica de ce dintre urmtorii epoxizi, numai 7,8-diol-9,10epoxidul benzpirenului este cancerigen (realizat n regiunea bay): S-au obinut totui dovezi c se formeaz i ali metabolii cancerigeni n afara regiunii golf.
O O O

HO OH 7,8 - diol - 9,10 - epoxidul benzpirenului

HO OH 8,9 - diol - 10,11 - epoxidul benzantracenului

HO OH CH3 8,9 - diol - 10,11 - epoxidul 7 - metl - benzantracenului

249

9. Mecanismul cancerogenezei chimice Mutaia n DNA constituie etapa primar n iniierea cancerogenezei de ctre substanele chimice cancerigene. Nu poate fi exclus posibilitatea ca, n unele cazuri, modificri negenetice s constituie evenimente primare n cancerogenez. Nu s-a demonstrat pn acum rolul virusurilor oncogene n iniierea cancerogenezei prin substane chimice. Este, de asemenea, probabil ca o parte din reactanii electrofili s joace rol i n promovare; numrul mare de aduci formai pentru acelai cancerigen att cu DNA, ct i cu ARN i proteine sunt necesari unii pentru iniierea fenomenului de cancerogenez i alii n etapa de promovare a procesului de cancerizare. Benzpirenul i alte hidrocarburi aromatice policiclice cancerigene pot aciona ca un cancerigen complet, adic iniiaz, dar i promoveaz cancerogeneza chimic, atunci cnd se aplic repetat pe pielea animalelor de experien; este posibil ca aceti cancerigeni s poat induce anumite efecte asupra membranelor celulare, care sunt similare cu cele induse de forbolesteri, promotori tumorali. S-a confirmat c aceti compui au efecte similare cu cele produse de 12-o-tetradecanoilforbol-13-acetat (TPA), inclusiv creterea turnoverului fosfolipidelor membranei. S-a demonstrat c TPA intensific transformarea celulelor induse de virusul polioma, Epstein-Barr, accelereaz replicarea i efectul citopat al unor virusuri oncogene: adenovirusuri, E-B, virusul tumorii mamare de oarece . a. Totodat, benzpirenul i metabolitul su mai reactiv, benzpiren-dihidrodiol-9,10-epoxidul, au efecte similare de inducere a replicrii virusului polioma, chiar dac au fost administrai o singur dat i n ciuda faptului c aceti compui sunt degradai rapid. Aceasta sugereaz c aceti cancerigeni chimici complei pot induce unul sau mai muli factori celulari care stimuleaz replicarea unor virusuri oncogene integrate n genomul celulei gazd. 10. Toxicologie analitic DETERMINAREA STRICNINEI I BRUCINEI

N HC CH2

250

A. Izolare: 1. Izolare din lichide biologice: Proba de analizat (20 ml) se alcalinizeaz cu hidroxid de sodiu 10%. Se extrage ntr-o plnie de separare de 2 ori cu cte 25 ml cloroform. Extractele cloroformice reunite se filtreaz prin sulfat de sodiu anhidru i se evapor la sec pe B.M. 2. Izolare din organe Din organe, stricnina se izoleaz prin metoda Stas-Otto-Ogier: din lichidul apos R alcalin prin extragere cu cloroform. 3. Izolarea stricninei n prezena brucinei: Proba de analizat se trateaz cu civa ml de acid sulfuric 5% se nclzete 20 minute pe B.M. la 50C. Se adaug peste soluia cald 1-2 m acid azotic fumans i se continu nclzirea nc 10-15 minute. Brucina este transformat n cacotelin iar stricnina rmne ca atare. Se alcalinizeaz cu amoniac concentrat i se extrage de 2 ori cu cte 20 ml cloroform. n aceste condiii se extrage numai stricnina, cacotelina format rmne n soluia apoas. Extractele cloroformice reunite sunt filtrate pe sulfat de sodiu anhidru i evaporate la sec pe B.M., dup care se execut reaciile de identificare. B. Identificare: 1. Reacii de precipitare: a. Reziduul reluat cu 1-2 picturi reactiv Bouchardat d un precipitat brun -roca (1 : 50000). b. reziduul reluat cu 1-2 picturi reactiv Dragendorff d un precipitat galben - intens (1 : 250000). c. Reziduul reluat cu 1-2 picturi reactiv Mazer d un precipitat alb (1 : 15000). d. Reziduul reluat cu 1-2 picturi de reactiv Hager d cristale caracteristice n form de dini ferstru. 2. Reacii de culoare a. Reacia Bauer: peste reziduu se adaug o pictur de soluie de bicromat de potasiu 10% i se evapor la sec pe B.M. Dup rcire, reziduul se reia cu acid sulfuric bihidrat (90 g acid sulfuric concentrat + 36 g ap, dup Dragendorff), apare o culoare violet fugace, care trece n rou, apoi la incolor. Sensibilitatea reaciei este de 1 g. n loc de bicromat poate fi folosit alt oxidant (oxid de ceriu, bioxid de mangan, bioxid dec plumb). Reacia este mpiedicat de prezena ptomainelor; dac se folosete n loc de bicromat, fericianur de potasiu interferena este nlturat. O variant a reaciei Bauer este urmtoarea: peste reziduul de pe sticla de ceas, se adaug cteva cristale de bicromat de potasiu i 3-4 picturi de acid sulfuric concentrat, dac pe suprafaa sticlei de ceas traseaz linii cu o baghet, n urma acesteia apar striuri violete care vireaz la rou i apoi dispar. Dac purificarea nu a fost suficient, coloraia violet este mascat de o coloraie brun, datorit carbonizrii substanelor organice de ctre acidul sulfuric concentrat. b. Reacia Malaquin (reacie tetrahidrostricninei): reziduul se reia cu 3-4 ml acid clorhidric concentrat si 1-2 granule de amalgam de zinc. Se fierbe cteva minute. Dup rcire, se decanteaz i se traseaz co o pictur de nitrat de sodiu 0,1% cnd apare o corelaie rozroie, stabil, colorimetrabil. Nu se folosete acid clorhidric mai diluat i nici nitrat de sodiu mai concentrat deoarece se degajeaz vapori nitroi, care deranjeaz reacia de culoare.
251

Lichidul colorat prezint la spectroscop, dou benzi de absorbie n regiunea verde albastr a spectrului. Fenotiazinele interfer reacia, ns coloraia roz, dat de acestea, apare imediat dup adugare de acid clorhidric i dispare prin reducere cu amalgam de zinc reaprnd, fugace, la tratarea cu nitrat de sodiu. Observaii: n locul nitritului de sodiu pot fi folosii i ali oxidani ca: apa de brom, sulfat ceric. c. Reactivul Mendelin d o colorai albastr violet care vireaz n rou prin adugare de ap sau prin alcalinizare. Sensibilitatea reaciei este de 1g. d. Cromatografie pe strat subire: Reziduul obinut prin evaporarea extractului cloroformic din medii biologice, se dezvolt n 0,2-0,3 ml cloroform sau metanol. - Faza staionar: Silicagel G. Merck. - Faza mobil: cloroform : metanol (8 : 2(v/v) - Relevare: Reactiv Mandalin spoturi violet. b. Reactiv Drangerdorff spoturi portocalii. Test fiziologic O poriune din reziduu se dizolv ntr-o pictur acid clorhidric 10-2N i 0,5 ml ap distilat. Soluia obinut se injecteaz sub cutanat la broasc. n cazul prezenei stricninei apar convulsii tonico- clonice i animalul se aeaz n poziie de opistotonus. Prin acest test se poate identifica 1g de stricnin. Fig.4. Brucina

N H3CO H3CO N HC CH2

A. Izolare: Brucina se izoleaz din soluii apoase alcaline prin extracia cu solveni organici. B. Identificare: 1. Reacii de precipitare: Reziduul reluat cu reactivi generali de precipitare ai alcaloizilor dau precipitate colorate. Reziduul reluat cu bicromat de potasiu 10% d un precipitat sub form de buchet. 2. Reacii de culoare
252

a. Reacia Noll. reziduul se trateaz cu 1-2 picturi de acid azotic concentrat i cteva picturi de acid sulfuric concentrat cnd se obine o coloraie roie, care vireaz n portocaliu, apoi n galben prin formarea cacotelinei (hidrat de nitrobrucinchinon). Dac se trateaz soluia galben de cacotelin cu clorur stanoas sau sulfat de amoniu, apare o culoare violet. b. Reacia cu clorat de potasiu: reziduul tratat cu cteva picturi de acid formic 10% i 2-3 cristale de clorat de potasiu, cnd se formeaz, la nclzire o coloraie roie. c. Reacia cu ap de brom: reziduul tratat cu cteva picturi de ap de brom i evaporat la sec pe B.M. las un depozit rou amorf de dibrombrucin. d. Reziduul tratat cu reactiv Frhde d o coloraie albastr violet (sens. 1g.).

IV.1.5. DETERMINAREA NICOTINEI

N N CH3

A. Iolare: a. Izolare din organe,lichide biologice, soluii insecticide: Nicotina se izoleaz prin metoda Stas-Otto-Origer sau prin antrenare cu vapori de ap. 1. Urina alcalinizat la pH 11-12 cu hidroxid de sodiu 10% este supus antrenrii cu vapori. Se culege distilatul n puin acid clorhidric 0,1 N. n aceste condiii nu sunt antrenai compui cu structur similar prezeni n mod normal n organidm (amida acidului nicotinic). Urina alcalinizat la pH 11-12 cu hidroxid de sodiu 10% se extrage cu 10 ml cloroform de 23 ori. Extractele cloroformice reunite se trateaz cu 1-2 picturi acid clorhidric 0,1 N i se evapor la 40-50C pebaie de ap. 2. Izolare din aer: se barboteaz aerul prin acid sulfuric diluat. 3. Izolare din tutun: se macereaz tutunul ntr-o soluie alcalin timp de 30 minute. Se filtreaz i se extrage cu cloroform. Se repet extragerea de 2-3 ori. Extractele cloroformice reunite sunt evaporate. Se reia reziduul cu acid acetic 1% sau cu o soluie foarte diluat de etanol. B. Identificare: 1. Reacii de precipitare: Nicotina d precipitate cu reactivi generali de precipitare al alcaloizilor. Reziduul tratat cu 23 picturi de reactivii Bouchardat i Drangendorff formeaz un precipitat brun-rocat, rou, iar, cu reactivul Sonnenschein un precipitat galben-portocaliu. n soluii mai concentrate se obine cu reactivul Hager, picrat de nicotin, precipitat galben sub form de cristale cu p.t. 217C.
253

2. Reacii de culoare: a. Reacia Kning: se neutralizeaz cu 5 ml soluie de analizat cu acid acetic 10% sau acid clorhidric 10%. Se adaug 1 ml soluie bromcian, proaspt preparat i se menine 2 minute pe baia de ap la 80C. Se adaug 3 ml soluie acetat de benzidin 1% i 2 ml HCl 20%. Apare o coloraie galben - portocalie, colorimetrabil. Reacia este caracteristic nucleului piridinic, care sub aciunea bromcianului se scindeaz cu formare de aldehid glutaconic. Aceasta, prin condensare cu o amin primar, formeaz o aldehid galben portocalie. Sensibilitatea reaciei este de cteva micrograme. Bromcianul se prepar adugnd peste apa saturat cu brom, o soluie de cianur de potasiu 10% pn la decolorare. Pentru a elimina riscul legat de manipularea cianurii de potasiu, se poate utiliza , n loc de bromcian, bromtio9cian, preparat din tiocianat de potasiu, n loc de cianur de potasiu. b. Reacia cu p-dimetil-amino-benzaldehid; se trateaz soluia de nicotin cu 1-2 ml soluie p-dimetil-amino-benzaldehid 10% n acid clorhidric concentrat, cnd apare o coloraie violet. 3. Reacii microcristalografice a. Reacia Roussin: se trateaz reziduul dizolvat n eter cu o soluie eteric de iod 2-3 %. Se prepar un lichid uleios rou-brun, din care, dup cteva ore, apar cristale aciulare roii rubinii, transparente, de iod-nicotin. Hidrocianina, d n, aceleai condiii, cristale brun nchis. b. Reacia Drangendorff, cnd se formeaz cristalele roii nchis pn la negru, cu aspect de: "psri n zbor" vizibile la microscop. Sensibilitatea reaciei este de 1 g. 4. Cromatografie n strat subire: Se execut la cocain. Rf. = 0,75 5. Test fiziologic: Prin injectarea clorhidratului de nicotin n sacul limfatic al broatei, se obine "poziia nicotinic" specific, variind n raport cu doza administrat (fig.nr.5). Fig.nr.5. DETERMINAREA CONIINEI

H2 C N H

H2 C

CH3

A. Izolare: Coniina se izoleaz din soluii apoase alcaline, cu solveni organici sau prin antrenare cu vapori de ap. B. Identificare: 1. reacii de precipitare: c. Coniina d precipitate cu reactivii generali de precipitare ai alcaloizilor.
254

- Reziduul tratat cu 2 3 picturi reactiv Mayer d un precipitat alb (sensibilitatea 1 : 5000). - Reziduul tratat cu 2-3 picturi reactiv Drangendorff d un precipitat galben (sensibilitatea 1 : 6000). - Reziduul tratat cu 2-3 picturi reactiv Bouchardat d un precipitat brun. - Reziduul de coniin d reacii de precipitare cu reactivul Hager dect n concentraii mari. - Reacia cu sulfur de carbon: prin tratare cu sulfur de carbon se obine sarea acidului coniincarbonic, ctistalizat n ace galbene, cu p.t. 71 - 72C . - Clorhidratul coniinei, obinut prin evaporarea coniinei n soluie de acid sulfuric foarte diluat, cristalizeaz n ace sau prisme alungite, dispuse n stea sau dentrite, cu caracter birefrigent. 2. Reacii de culoare: a. Coniina nu dezvolt coloraie cu majoritatea reactivilor generali de culoare. b. Reacia cu coloranil (tetraclorchinon). n soluie benzenic, coniina d o coloraie verde. 3. Test fiziologic: Extractul eteric alcalin injectat la broasc determin convulsii asemntoare clor stricninice. IV.1.9. DETERMINAREA PRINCIPALILOR ALCALOIZI NATURALI DIN OPIU IV.1.9. MORFINA este principalul alcaloid din opiu avnd n structur nucleul fenantrenic. Morfina este o pulbere alb, puin solubil n cloroform, alcool amilic, eter acetic. Este absorbit de crbune i bentonit. Srurile sale: acetatul de morfin, clorhidratul de morfin, sulfatul de morfin, tartratul morfin sunt hidrosolubile i precipitabile cu alcali.
H3C N

HO

OH

A. Izolare: a. Izolarea morfinei din urin: Se alcalinizeaz 25 ml urin la pH = 8 cu amoniac 1/1 sau cu bicromat de sodiu i se extrage de 2 ori cu cte 25 ml cloroform (diclormetan sau amestec cloroform : etanol (9 : 1). alcalinizarea se face n timpul agitrii cu solventul, pentru ca morfina baz sa fie extras direct n form amorf de ctre solvent; n caz contrar forma amorf trece n form cristalin, greu solubilizat de solvent. De asemenea, nu se folosesc pentru alcalinizare, hidroxizi de sodiu sau de potasiu, deoarece se obin fenolai (morfinai) hidrosolubili, deci, nextractibili cu solveni organici. Extractele organice reunite sunt filtrate pe sulfat de sodiu anhidru i evaporate la sec la temperatur sub 80C. b. Izolarea metaboliilor conjugai i a morfinei din urin:
255

Se supun 25 ml urin la hidroliz acid prin tratare cu 10 ml acid clorhidric 15% timp de 30 minute pe B.M. la fierbere, cu refrigerent ascendent. Dup rcire, se aduce la pH = 8 cu amoniac 10% sau bicarbonat de sodiu 10% i se continu cu extragerea cu cloroform ca n metoda precedent. B. Identificare: 1. Teste screening: a. Reziduul se trateaz cu 1 - -2 picturi de acid azotic. n prezena morfinei se va dezvolta o coloraie portocalie roiatic ce trece treptat n portocaliu galben; heroin d o coloraie galben care se schimb ncet n verde-pal. b. Reziduul se dizolv ntr-un mililitru etanol. Se spoteaz o pictur reactiv pe o hrtie de filtru, peste care se adaug o pictur reactiv Marque. Culoarea roie care apare se schimb n violet albastru i indic prezena n proba de analizat a morfinei, codeinei dau heroinei. c. Reziduul se trateaz cu picturi Lafon (Merck9. n prezena morfinei se dezvolt imediat o coloraie albastr, care trece repede i n verde i n final n brun murdar; codina produce o coloraie albastr verzuie, ce vireaz n albastru deschis i apoi n verde smarald, iar heroina dezvolt o culoare verde, care vireaz n albastru i apoi n final n verde oliv. 2. Reacii de precipitare: a. Morfina congenerii si dau reacii cu reactivii speciali ai alcaloizilor dnd culori specifice conform tabelului nr.8 Alcaloid Morfina Codeina Dionina Heroina Reactiv Frde Violet Verde Verde Violet Reactiv Marquis Violet Violet Violet murdar Violet Reactiv Lafon-Mecke Verde Verde intens Verde smarald Verde cenuiu Reactiv Mandelin Albastru cenuiu Verde Albastru cenuiu

b. Reacii datorate oxidului fenolic. - Reziduul tratat cu clorur feric 1% ( proaspt preparat) d o culoare albastr sau verde albastr. - Reziduul tratat cu 3- 4 picturi de fericianur de potasiu 10% i 2 picturi clorur feric 1% ( proaspt preparat) d o culoare albastr datorit reducerii fericianurii de potasiu la ferocianur de culoare oxidrilului fenolic, aceast clorur feric dezvolt o coloraie albastr (albastru de Prusia sau de Berlin). c. Reacia de diazotare (reacia Khrlich) Se dizolv reziduul n acid clorhidric 10% i se trateaz cu reactiv Khrlich (5 ml soluie A i 3 picturi soluie B). Se agit i se alcalinizeaz cu bicarbonat de sodiu, cnd apare o coloraie verde, care prin acidulare trece n portocaliu. Reacia este negativ pentru derivaii morfinei cu oxidrilul fenolic substituit.
256

Reactiv Khrlich se prepar din: Soluia A : 0,5 g acid sulfanilic se dizolv n 5 ml acid clorhidric concentrat i se aduce cu ap distilat la 100 ml. Soluia B: nitrat de sodiu 0,5% d. Reacia apormofinei: Se nclzete reziduul pe B.M. cu 5 6 picturi de acid sulfuric concentrat pn la o uoar brunificare. Are loc deshidratarea morfinei, cu formarea apormofinei (cu dou funcii fenolice n orto).
H3C N

HO

OH

Apomorfina se identific: - direct prin adugare de 2 picturi de acid azotic concentrat. Cnd apare o coloraie roie orange (ce variaz n galben); coloraia este dat i de brucin, dar culoarea nu se modific la adugarea unui exces de clorur sstanoas; - fie prin metoda Grimbert i Leclere, adaptat de Denigs. La reziduul apomorfinic se adaug, pentru tamponarea acidului sulfuric 5 ml soluie saturat de acetat de sodiu i se nclzete pe B.M. 2 minute (dac pH-ul nu este neutru, se mai adaug acetat de sodiu crist.). se adaug apoi 2 picturi clorur mercuric 2% i se mai las 4 5 minute pe B.M., apare o coloraie verde, mai mult sau mai puin intens. Aceast reacie este caracteristic i destul de sensibil. 2. Reacia caracteristic a lui Denigs. Aceast reacie difereniaz morfina de cilali alcaloizi, din grupa sa. Reziduul se reia cu 1 ml acid clorhidric concentrat, se adaug 2 picturi ap oxigenat i 2 picturi amoniac (pH = 8-9) i o pictur sulfat de cupru 0,5%. Reacia este pozitiv dac se dezvolt o coloraie roz roie. f. Reacia cu nitrit. Reziduul se reia cu 2 ml acid clorhidric 10% i se trateaz cu 0,1 ml nitrit de sodiu 10%; se formeaz 2 nitrozo-morfina care prin alcalinizare cu amoniac dezvolt o culoare roie, colorimetrabil. 4. Identificare prin CSS: Alcaloizii din opiu se pot identifica prin CSS folosind. - Suport : Silicagel G Merck plci cromatografice (5x10 cm sau 10x20 cm); - Sisteme de solveni: N-butanol-ap-amoniac (90 : 25 : 2 v/v/v); - Soluie de analizat: extract coloroformic;
257

- Alcaloizi de referin. morfina, heroina, codeina; - Revelare: - Reactiv Drangendorff; - Iodoplatinat de potasiu; - Reactuv Marcuis.

Valorile Rf-urilor i culoarea spoturilor sun redate n tabelul alturat: Alcaloidul Morfina Codeina Heroina Reactif Dragendorff Orange Cenuiu Cenuiu Rf 0.36 0.32 0.40

5. Determinarea cantitativ a morfinei: Principiu: Morfina formeaz cu nitritul de sodiu n mediu acid, 2-nitrozomorfina, de culoare galben n mediu acid i roie n mediul alcalin (amoniacal). Sensibilitatea reaciei este de 5g/ml. Reactivi: 1. Soluie etalon morfin: 0,12 g morfin hidrocloric anhidr, corespunznd la 0,1 g morfin baz, se solv n acid clorhidric 0,1 N i dup solvire se completeaz la 100 ml. soluia obinut conine 1 mg/ml. 2. Nitrit de sodiu 1% (proaspt preparat); 3. Acid clorhidric 0,1 N. 4. Amoniac concentrat. Tehnica de lucru: Reziduul obinut dup extracie cu cloroform din mediul biologic, se dizolv n 5 ml acid clorhidric 0,1 N i se aduce cantitativ ntr-o eprubet, se adaug 2 ml nitrit de sodiu 1%, se agit i se las 15 minute n repaus; apoi se adaug 3 ml amoniac concentrat, iar dup 5 minute se citete extincia la spectrofotometru Spekol n cuva de 1 cm la = 470 nm, fa de martorul reactivilor.

Scar etalon: Eprubeta Reactivi(ml) Sol.etalon(ml) Conc.g HCl 0.1N NaNO2 1%

1 0.2 200

2 3 4 5 0.4 0.6 0.8 1.0 400 600 800 1000 4.8 4.6 4.4 4.2 4.0 5.0 2ml se agit,repaus 15minute
258

6(M) -

NH3 conc.

3 ml-dup 5 minute se citete la = 470nm

Calculul: mg morfin/1000ml urin = ax1000 / n.p.1000 n care: a = g determinate n prob; n = ml Hcl 0,1 N cu care s-a reluat reziduu; p = ml prob biologic prelucrat.

Determinarea colchicinei

OH3C OH3C CH3O

H NH CO CH3

O OCH3

A. Izolare: Colcichina se izoleaz prin metoda Stas-Otto-Origer, att n mediu acid, ct i n mediu alcalin. Modul de lucru: 25 ml urin se alcalinizeaz la pH=10 cu hidroxid de sodiu 0,1 N i se extrage cu 30 ml cloroform prin agitare timp de 5 minute. Extractul cloroformic se filtraz pe sulfat de sodiu anhidru, se mparte pe sticle de ceas, i pe reziduu se execut reacii de indentificare. B. Identificare: 1. Reacii de precipitare: Dintre reactivii generali de precipitare ai alcaloizilor sunt mai sensibili reactivul Bouchardat i reactivul Drangendorff. Cu reactivul Hager i reactivul Mazer, colchicina precipit numai n soluii concentrate. 2. Reacii de culoare: a. Dintre reactivii generali de culoare ai alcaloizilor, colchicina d reacii cu: - Acid azotic concentrat coloraie violet care trece n rou-portocaliu prin alcalinizare (reacia Geiger); - Acid sulfuric concentrat coloraie galben; dac se adaug un cristal de azotat de potasiu se dezvolt o coloraie albastr, apoi verde, violet, roie i galben. Uneori violetul apare concomitent cu verdele, astfel nct aspectul este al unui centru verde nconjurat de un lizereu violet. Dac se alcalinizeaz cu hidroxid de potasiu 10%, apare o cloraie roie; - Reactivul Lafon; albastru-verde, verde apoi brun; - Reactivul Frhde galben;
259

- Reactivul Mandelin galben deschis. b. Reacia Pesez : prin tratarea soluiei apoase de colchicincu izoniazid 10% i carbonat de sodiu 10%, apoi nclzit pe baia de ap a0 minute, se obine o coloraie galben- portocalie. c. Reziduul tratat cu 0,5 ml acid sulfuric concentrat i civa cristali de acid tartric. n prezena colchicinei se obine o coloraie verde. d. Reziduul se dizolv n 1 ml ap distilat. Se adaug 2-3 picturi ap de clor. se formeaz un precipitat galben - portocolaliu, solubil n amoniac cu apariia culorii roii. e. Reacia Vitali: reziduul este tratat cu cteva picturi de acid azotic fumans i evaporat pe baie de ap. Peste reziduu galben, se adaug 3-4 picturi hidroxid de potasiu soluie etanolic 1% ( proaspt preparat) cnd apare o coloraie verde. f. Reacia Ziesel (diferenierea colchcinei de ptomaine): prin nclzire cu acid clorhidric concentrat colchicima este demetilat, iar gruparea hidroxil liber d culoare verde cu clorur feric 1% (proaspt preparat). Potomainele nu dau o coloraie n aceste condiii. 1. Cromatografie n strat subire Faza staionar: cromatoplci cu silicagel G Merck. Sistemul de developare: cloroform-aceton-trietilamin (5 : 4 : 1 v/v/v). Martori: colchicina n cloroform. Proba de analizat: extract cloroformic (extracie de urin n mediul alcalin) Revelare: a. n lumin Wud la = 254- 266 nm aparte un spot fluorescent de culoare galben. b. cu reactivul Wasickz apar spoturi de culoare galben. n aceste condiii de lucru, colchicina are Rf = 0,52. Dozarea spectrofotometric. Principiu metodei Colchicina reacioneaz cu reactivul Lieberman Bouchardat dnd coloraie galben stabil, colorimetrabil la = 425 nm. Reactivi: - Reactivul Lieberman Bouchardat: se amestec 19 volume anhidrid acetic i un volum acid sulfuric concentrat. - 3 ml extract cloroformic de colchicin se trateaz cu 3 ml reactiv Lieberman Bouchardat, se obine o coloraie galben care se spectrofotometreaz la Spekol la 425 nm, fa de proba martor )3 ml cloroform + 3 ml Liberman).

IV. 1.15. DETERMINAREA ALCALOIZILO DI ERGOT

CH3 OC NH CH CH2OH N CH3

N H

260

A. Izolare: 1. Reacii de precipitare: a. Reziduul reluat cu 1-2 picturi de acid clorhidric 10% i 4-5 picturi acid trinitrobenzoic 5% formeaz cristale n form de dendrite. 2. Reacii de culoare - Ergometrina (Ergobazina) a. Reactivul tratat cu 2-3 picturi reactiv Marquis d o coloraie brun. b. Rezidul tratat cu 2-3 picturi reactiv Frhde d o cloraie verde ce trece n rou i apoi n albastru. c. Reacia Vitali execut pe reziduu d o coloraie portocalie-galben-purpurie. - Ergotoxina a. Reziduul tratat cu 2-3 picturi reactiv Frhde d o coloraie violet-albastr ce trece n verde. b. Reziduul tratat cu 2-3 picturi reactiv Mandelin d o coloraie violetce trece n verde. c. Reziduul tratat cu 2-3 picturi reactiv Lafon d o coloraie galben ce trece n verde. d. Reziduul tratat cu 2-3 picturi reactiv Wasickid o coloraie violettrece n pal. e. Reziduul tratat cu 2-3 picturi reactiv Marquis d o coloraie neagr cu contur violet. f. Reziduul tratat cu 2-3 picturi acid sulfuric concentrat d o d o coloraie galben ce trece n verde. - Ergotamina a. Reziduul tratat cu 2-3 picturi reactiv Frhde d o coloraie cenuie-albastr . b. Reziduul tratat cu 2-3 picturi reactiv Mandelin d o coloraie brun. c. Reziduul tratat cu 2-3 picturi reactiv Marquis d o coloraie brun. d. Reacia Vitali efectuat d o coloraie portrocalie violet. 3. Cromatografie pe strat subire Reziduul reluat cu metanol se spoteaz pe cromatoplac n paralel cu un martor. sistemul de migrare: cloroform : metanol (9 : 1), amoniac concentrat : metanol (1,5 : 100) Relevare: Se spoteaz placa cu reactiv paradimetilaminobenzaldehid (PABA) (se dizolv 1 g PABA n 100 ml etanol i se adaug 10 ml acid clorhidric concentrat). Se obine o fluorescen albastr n UV dat de prezena acidului lisergic. 4. Identificarea alcaloizilor globali Se extrag alcaloizii globali din vom, spltur stomacal, corpuri delicte, cu eter etilic dup alcalinizarea cu hidroxid de sodiu 10%. Extractul eteric se mparte n patru poriuni i se fac reaciile de identificare: - o cot parte de extract se nclzete cu 1 ml hidroxid de potasiu 10% cnd se degaj un miros neplcut de trimetilamin; - o cot parte de extract se trateaz cu bicarbonat de sodiu 10% cnd apare o coloraie roieviolet;

261

- o cot parte de extract se trateaz cu 5 ml acid sulfuric concentrat cnd apare o coloraie portocalie, iar la limita de separaie ntre cele dou lichide apare un inel albastru. - o cot parte de extract se trateaz cu 5 ml soluie oxalat de sodiu 5% cnd apare o coloraie roie. 5. Examen microscopic Se execut examen microscopic pe coninut stomacal sau corpuri delicte, cnd se observ aglomerri de celule inegale, rotunjite sau alungite, iar fragmentele stratului periferic sunt colorate n brun-violaceu.

262

Cap. X. Problema alcoolilor Toxicitatea alcoolilor monohidroxilici crete cu numrul atomilor de carbon (regula lui Richardson), cu excepia metanolului care este deosebit de toxic. Alcoolii cu caten normal sunt mai toxici dect izomerii ramificai, iar monoalcoolii sunt mai toxici dect polialcoolii, cu excepia etilenglicolului (Cotru i colab., 1993). Cu creterea numrului de atomi de carbon crete liposolubilitatea i, implicit, toxicitatea lor la nivelul SNC. Alcoolii C1 C3 sunt solubili n ap i slab narcotici. Metaboliii lor au grade diferite de toxicitate, iar viteza mic de metabolizare asociat cu o eliminare lent sporete toxicitatea n cazul metaboliilor toxici. Diferenele dintre gradele de toxicitate ale alcoolilor sunt nete: etilenglicolul este un toxic puternic, n timp ce glicerina este absorbit n doze nalte fr efecte nocive; metanolul este o otrav puternic, n timp ce etanolul este utilizat curent pentru a obine o stare euforic. Structura chimic poate explica numai parial aceast comportare. Metaboliii pot explica n mare msur toxicitatea alcoolilor. Mai greu se explic efectul lor direct asupra organismului, efectul euforic al etanolului, de pild, imediat dup introducerea n corp. Gustul arztor al etanolului, precum i gustul dulce al etilenglicolului i al glicerinei pot fi conferite acestor substane de capacitatea moleculor lor de a vibra n rezonan cu anumii receptori moleculari aflai la nivelul papilelor gustative. Din pcate, cercetrile n acest domeniu sunt nc n faza iniial. De asemenea, efectul vasodilatator periferic al alcoolului ar putea fi explicat prin perturbarea structurilor de ap inclus n biostructur i, implicit, prin perturbarea strii de excitaie tripletic a moleculelor biologic active. Alcoolul metilic, CH3OH Metanolul este un lichid volatil, inflamabil, cu miros i gust asemntor etanolului, dar mai puternic i mai iritant. Este miscibil cu apa i majoritatea solvenilor organici. Toxicocinetic. Metanolul ptrunde pe cale digestiv, respiratorie i, mai rar, transcutanat. Se distribuie, datorit hidrosolubilitii, n toate esuturile i, n special, n lichidele oculare care conin 99,7% ap. n ficat, sub aciunea alcooldehidrogenazei (ADH) i mai puin a catalazei, se oxideaz la formaldehid, iar aceasta trece n acid formic, ambii metabolii hidrosolubili; apar i mici cantiti de formiat de metil, liposolubil. Toi metaboliii sunt mai toxici dect metanolul. O oxidare la formaldehid are loc i n retin (n conuri i bastonae) unde este prezent ADH. Eliminarea are loc prin expiraie (metanol) i prin urin (metabolii i mici cantiti de metanol). Eliminarea metanolului din organism se produce n proporie de 25-75% sub form nemodificat n aerul expirat, 3-10% n urin ca atare. Din total, 3% se regsete n urin sub form de acid formic. Metabolizarea i eliminarea sunt lente, astfel nct metanolul se comport ca un toxic cumulativ. Alcoolul etilic este utilizat drept antidot n intoxicaia cu alcool metilic i etilen glicol. Rolul de antidot al alcoolului etilic n intoxicaia cu metanol se explic prin competiia pentru alcool dehidrogenaz: etanolul se metabolizeaz de 4-5 ori mai rapid, nct metanolul rmne nemetabolizat, i devine astfel mai puin toxic. Metanolul se comport ca un toxic
263

cumulativ cu eliminare foarte lent, ceea ce l difereniaz de etanol. De asemenea, etanolul, avnd o tensiune superficial mai mare, deplaseaz metanolul de pe suprafaa celulelor, favorizndu-i eliminarea. Toxicodinamie. Toxicitatea metanolului se datoreaz metaboliilor si care produc acidoz, anoxie celular i dereglri metabolice. Acidoza este provocat mai ales de acidul formic. Anoxia tisular este consecina inhibrii respiraiei celulare prin complexarea, de ctre acidul formic, a fierului din enzimele oxido-reductoare. Retina este de asemenea afectat, deoarece este sensibil la anoxie, iar ptrunderea metanolului la acest nivel i metabolizarea local conduce la metabolii toxici n concentraie mare. Totodat, ptrunderea formiatului de metil liposolubil afecteaz i nervul optic. Ca urmare, apar leziuni degenerative n celulele ganglionare ale retinei i n nervul optic, precum i tulburri circulatorii n coroide. Se mai nregistreaz tulburri nervoase, hepatice, renale, pulmonare i miocardice, multe dintre acestea datorndu-se hipoxiei. Totodat, sunt dereglate unele procese biochimice datorit blocrii gruprilor NH2 enzimatice de ctre HCHO. Doza letal este de 30 ml alcool metilic. Simptomatologie. n intoxicaia acut prin ingerare apar, dup o perioad de laten, tulburri digestive, respiratorii, neuropsihice (agitaie, delir, convulsii), cardiovasculare, apoi com i moarte. Dac victima supravieuiete, se instaleaz tulburrile oculare (midriaz, fotofobie, scderea acuitii vizuale, dureri n globii oculari), urmate brusc sau treptat de orbire temporar sau definitiv. Tulburrile oculare apar ca urmare a acidozei, deoarece se accentueaz odat cu aceasta. Intoxicaia acut prin inhalare se manifest prin iritaia conjunctivelor i mucoaselor respiratorii, tulburri nervoase i oculare (orbirea definitiv este mai puin frecvent). In aer, cocentraia maxim admisibil este de 150 mg/m3. n intoxicaia cronic apar fenomene iritative, nervoase (cefalee, tremor), digestive, vizuale (reducerea cmpului vizual). Primul ajutor. n intoxicaia prin ingerare se practic spltur gastric cu soluie de NaHCO3 5%, purgativ salin i tratament antidotic cu etanol, iniial 50 g, apoi cte 10 g pe or. n intoxicaia prin inhalare se recurge la oxigenoterapie i/sau respiraie artificial. Toxicologie analitic. Metanolul se cerceteaz din aer (recoltare n ap distilat) i medii biologice, corpuri delicte (distilare n mediu acid). Identificarea se realizeaz prin reducerea K2Cr2O7 n H2SO4 concentrat (Cr3+, verde) sau prin oxidarea CH3OH la HCHO i determinarea acesteia cu fenilhidrazin sau acid cromotropic n mediu de acid sulfuric. Se mai utilizeaz tuburi detectoare Drger cu indicativul 100/a. Etanolul, CH3CH2OH Intoxicaiile se produc prin ingerare voluntar de buturi alcoolice i acestea sunt acute i cronice (alcoolism). Etanolul este un lichid incolor, d = 0,788, volatil (p.f. 78,3 oC), cu gust arztor, miros specific, miscibil cu apa. Toxicocinetic. Etanolul este imediat absorbit i distribuit n toate esuturile, fr acumulare. Se elimin prin expiraie (3-7%) i urin (2-4%), restul este metabolizat n ficat, succesiv la acetaldehid, acid acetic i bioxid de carbon. Oxidarea la acetaldehid se realizeaz, la cantiti mici de alcool, sub aciunea alcooldehidrogenazei (ADH); la cantiti mai mari de etanol, intervin sistemul microzomial de oxidare (MEOS i oxidaze cu funcii
264

mixte microzomiale) i catalaza (CAT sau peroxidaze). Datorit coninutului constant de ADH din ficat, oxidarea etanolului are loc cu o vitez aproape constant de 8 g etanol/or.
CH3-CH2OH ADH NAD+ NADH CH3-CHO ALDH CH3-COO CoA-SH ATP TCA CH3-CO~SCoA Sinteze

NAD+ NADH

AMP + P

Biotransformarea etanolului
+ ADH = alcooldehidrogenaza; ALDH = aldehiddehidrogenaza; CoA-SH = coenzima A; NAD , NADH = nicotinamidadenindinucleotid oxidat si redus; AMP = adenozinmonofosfat; ATP = adenozintrifosfat; P = fosfat anorganic; TCA = ciclul acizilor tricarboxilici (ciclul Krebs)

Toxicodinamie. Etanolul are un efect deprimant asupra SNC. Aceast aciune ncepe cu scoara cerebral i se continu pn la bulb. Inhibarea centrilor superiori, cu funcii de coordonare i control, antreneaz i relaxarea centrilor inferiori, fapt ce explic efectul aparent stimulator al buturilor alcoolice. Etanolul acioneaz toxic prin molecula netransformat, prin acetaldehid i prin creterea raportului NADH/NAD+.
CH3-CH2OH + NAD+ CH3-CH2OH + H2O2 ADH (citosol) CAT (mitocondrie) MEOS (microzomial) CH3-CHO + NADH + H+ CH3-CHO + 2 H2O CH3-CHO + NADP+ + 2 H2O

CH3-CH2OH + O2 + H+ + NADPH

Oxidarea etanolului la acetaldehid

Acetaldehida este n majoritate transformat n acetat. Cantiti infime reacioneaz cu catecolaminele i cataboliii lor formnd compui tetrahidropapaverolinici cu gruprile SH din glutationul redus i coenzima A, sczndu-le activitatea, i cu NH2 din proteine i enzime, degradndu-le structural i funcional. Oxidarea etanolului i a acetaldehidei sub aciunea ADH, respectiv ALDH, necesit prezena NAD+, care trece n NADH. n cazul metabolizrii unor mici cantiti de alcool etilic, reoxidarea NADH n citoplasm are loc pe seama compuilor n form oxidat, acidul piruvic i fosfodihidroxiacetona. Deoarece aceti compui sunt n cantiti limitate, reoxidarea NADH n prezena unor mai mari cantiti de alcool nu se mai face total n citoplasm, ci se completeaz i n mitocondrii. Membrana mitocondrial este ns impermeabil pentru NADH i, de aceea, celula utilizeaz sistemul malat-aspartat care realizeaz transferul H+ de la NADH citoplasmatic la NAD+ intramitocondrial. Reaciile nlnuite prezentate n aceast figur asigur oxidarea etanolului fr acumulare de NADH numai att timp ct nu este depit capacitatea de oxidare a lanului respirator. Pentru cantiti mai mari de etanol ns, NADH se acumuleaz n citoplasm i mitocondrii, cu creterea valorii raportului
265

NADH/NAD+. Aceast cretere conduce la perturbarea ciclului Krebs, a metabolismului glucidic i lipidic, constituind toxicitatea biochimic determinat de consumul excesiv de alcool, avnd drept consecin acumularea de acetat (care nu mai poate fi oxidat n ciclul Krebs), hiperlactacidemie i hipoglicemie (prin perturbarea glicolizei i neoglicogenezei, acumularea lipidelor n hepatocit (cu apariia steatozei). Deoarece alcool dehidrogenaza (ADH) catalizeaz transformarea retinolului n retinal, blocarea sa n procesul de oxidare a etanolului conduce la un deficit de retinal. Retinalul este ns indispensabil procesului vederii i spermatogenezei, ceea ce explic amauroza etilic i perturbarea spermatogenezei din intoxicaia etilic. Doza letal este de 4-6 g etanol pur/kg corp. Simptomatologie. n intoxicaia acut se remarc trei faze: faza de excitaie la o alcoolemie de 0,5-1,5 g o/oo cu euforie, logoree, expansivitate, senzaie de cldur (vasodilataie periferic), diminuarea capacitilor fizice i psihice; faza medico-legal (faza de beie, alcoolemie 1,5-2,5 o/oo), cu mers ebrios, disartrie, confuzie mintal, scderea acuitii auditive i vizuale, tulburri psihice ducnd la acte agresive; faza comatoas (peste 2,5 o/oo) cu midriaz, hipotermie (prin vasodilataie generalizat), com, uneori cu sfrit letal. Alcoolemii peste 4 g o/oo (300-400 ml alcool pur) conduc rapid la com i moarte. n intoxicaia cronic se observ manifestri neuropsihice (polinevrit, nevrit optic retrobulbar, tulburri de comportament, insomnie, delirium tremens) i manifestri organosomatice (gastrite, ulcere, hepatit subacut pn la ciroz, tulburri cardiovasculare, endocrine, etc.). Alcoolismul reprezint o toxicomanie, denumit incapacitate legat de alcool. Primul ajutor. n primele dou ore de la ingerare, se recurge la spltur gastric cu soluie de NaHCO3 5%. Intoxicaii comatoi sunt spitalizai. Toxicologie analitic. Etanolul se cerceteaz din aer, medii biologice i corpuri delicte (distilare n mediu acid). Identificarea se realizeaz prin reacia xantogenatului sau reducerea K2Cr2O7, iar dozarea, enzimatic (cu ADH, gaz-cromatografic, colorimetric sau volumetric (prin dozarea excesului de K2Cr2O7 rmas dup oxidarea etanolului n mediu acid).
MDH CH3-CH2OH NAD+ Malat Malat Oxaloacetat MDH NAD+ H2O O2

CH3-CHO

NADH

Oxaloacetat

NADH

Glutamat TGO Alfa-cetoglutarat Aspartat CITOPLASM

Glutamat TGO Alfa-cetoglutarat Aspartat MITOCONDRIE

Oxidarea NADH la NAD + prin intermediul sistemului malat-aspartat (dup Nordmann)

266

ETILENGLICOLUL, HO-CH2-CH2-OH Lichid incolor, vscos, cu gust dulceag. Este relativ i miscibil cu apa, alcoolul etilic, acetona, acidul acetic, glicerina i piridina. Este insolubil n eter etilic, CS2, hidrocarburi halogenate, uleiuri i hidrocarburi aromatice. Este utilizat ca solvent i lichid antigel. Concentraia maxim admisibil este de 274 mg/m3 aer. Toxicocinetic. Ptrunderea etilenglicolului n organism se face pe cale digestiv i numai accidental respiratorie. Se distribuie n toate esuturile. Se elimin 40 % nemodificat pe cale renal, iar 60% se biotransform oxidativ, iniial la aldehid glicolic sub aciunea alcooldehidrogenazei (ADH) cu vitez mic (ceea ce explic efectul antidotic al etanolului, ca i la metanol) apoi parial la acid oxalic, trecnd prin acid glioxilic (fig. 12).
HOCH2-CH2OH Etilenglicol ADH HOCH2-CHO Aldehid glicolic HOCH2-COOH Acid glicolic HCOOH Acid formic (Calea major) HOOC-COOH Acid oxalic (Calea minor) CO2

OHC-CHO Aldehid glioxilic

OHC-COOH Acid glioxilic

Biotransformarea etilenglicolului

Acidul oxalic formeaz cu calciul oxalat de calciu care obtureaz tubii renali i afecteaz miocardul i alte organe. Toxicodinamie. Toxicitatea etilenglicolului se datoreaz metaboliilor si, care sunt mai toxici, i anume acidul glioxilic i acidul oxalic. Etilenglicolul conduce la edem cerebral. Doza letal la adult este 100 g. Leziunea principal este necroza tubular acut, iar pe plan metabolic, acidoza metabolic. Intoxicaia acut determinat de ingerarea etilenglicolului debuteaz prin tulburri digestive, apoi neuropsihice (de la euforie pn la com convulsiv), acidoz, manifestri cardiovasculare (tulburri de ritm, insuficien acut cardiovascular) i insuficien renal acut, adesea fatal. Intoxicaia cronic aprut n cazul inhalrilor repetate de vapori de etilenglicol se manifest prin tulburri ale sistemului nervos cu pierderea temporar a cunotinei, inapeten, somnolen, greuri, dureri de cap. n unele cazuri se observ modificri ale formulei hematologice, rinite i conjuctivite, modificri ale funciilor hepatice i ale splinei i anomalii n depunerea fierului n organism. Primul ajutor. se limiteaz la maxim efortul fizic al accidentatului; se administreaz ap i se provoac vrsturi; se aplic spltur gastric cu suspensie de crbune activat sau soluie de KMnO4: administrarea de purgative saline; se recomand aport de lichide;
267

 se administreaz, ca antidot, alcool etilic 50% per os, 0,75 ml/kg corp; oxigenoterapie sau respiraie artificial; se anun de urgen medicul. Analiza toxicologic: folosind metode gaz-cromatografice, spectrofotometrie n UV i vizibil; prin oxidare cu acid periodic la formaldehid i determinarea acesteia cu fenilhidrazin sau acid cromotropic. Determinarea cantitativ a alcoolilor a. Izolare Alcooli se izoleaz di aer prin reinere n soluii adecvate din aer, iar din produse biologice i alte produse prin distilare, antrenare cu aer cald sau microdifuzie n celule Conway sau celule Menzicescu. 1.1. ALCOOLUL METILIC B. Identificare 1. Reacia Kolthoff Denigs: la 2 ml soluie de analizat se adaug 1 ml acid fosforic 25% i 0,5 ml KMnO4 2%. Dup 10 minute se distruge excesul de KMnO4 cu perhidrol 12% (v/v) sau sulfit de sau sulfit de sodiu 15% adugat cu pictura pn la decolorarea soluiei, evitnd excesul de perhidrol sau sulfit. n lichid se identific formaldehida (v. formaldehida). 5CH3OH + 2KMnO4 + 4H3PO4 = 5HCHO + 2MnHPO4 + 2KH2PO4 + 8H2O 2KMnO4 + 5Na2SO3 + 4 H3PO4 = 5Na2SO4 + 2MnHPO4 + 2KH2PO4 +3H2O n cazulprezenei concomitente a formaldehidei, aceasta se ndeprteazastfel: se trateaz 10 ml soluie de analizat cu 5 ml AgNO4 10% i 5 ml NaOH 30%. Se nclzete cu refrigerent ascendent timp de 30 minute i se distil. Formaldehida se oxideaz la acid formic, care nu distil. Formaldehida se oxideaz la acid formic, care nu distil i concomitent, Ag2O se reduce la Ag metalic (oglind de argint): AgNO3 + NaOH = AgOH + NaNO3 2AgOH= Ag2O + H2O HCHO + Ag2O = HCOOH + 2 Ag n cazul indentificrii metanolului n snge se produce astfel: se trateaz 2 ml snge cu 2 ml acid triclor acetic 20%, se centrifugheaz i peste 1 ml supernatant se adaug 0,2 ml KMnO4 1% i 0,1 ml acid fosforic 85%. Se agit 1 minut, se reduce excesul de KMnO4 cu cteeva cristale de bisulfit de sodiu. Se adaug 1 ml acid cromotropic 1% n acid sulfuric concentrat i apoi cu grij, 1 ml acid sulfuric concentrat. La zona de contact a fazelor se observ un inel violet, iar la agitare, coloraia difuzeaz. n absena metanolului, apare o coloraie brun deschis. 2. Reacii de esterificare:

268

a. Se nclzete 1 ml soluie de analizat cu 0,1 g acid salicilic i 1 ml acid sulfuric concentrat : se dezvolt un miros specific de salicilat de metil, C6H4(OH)COOCH3; b. Se adaug la 2ml soluie de analizat, 2-3 picturi de clorur de bemzil (sau cteva cristale de acid benzoic) i 0,5 ml H2SO4 conc. Se neutralizeaz cu NaOH 20% cnd se dezvolt un miros specific de benzoat de metil, C6H5COOCH3. C. Dozare: Metoda spectrofotometric cu acid cromotropic pentru metanol Principiu Metanol este oxidat la formaldehid. Aceasta este tratat cu acid cromotropic (acid 1,8dihidroxinaftalen, 3,6- disulfonic) n mediu acid, cnd se obine un compus violet, colorimetrabil:
SO3H OH

SO H 3 OH OH
SO3H CH2

SO H 3 OH
OH OH

SO3H
CH

SO3H O

HCHO + 2
OH

H2 O +
SO3H

+[O]

HO

HO
SO3H SO3H

SO3H Sensibilitatea reaciei este de 1g/ml. Reactivi 1. Soluie absorbant: ap distilat; 2. Permanganat de potasiu, soluie 2%; 3. Acid fosforic 50% 4. Sulfit de sodiu, soluie saturat; 5. acid cromotropic, soluie 5% proaspt preparat. n momentul ntrebuinrii, se diluiaz 5 ml la 100 ml acid sulfuric 15N. 6. Acid sulfuric 9M. 7. Soluie etalon de metanol: se cntrete un balon cotat de 50 ml coninnd cca. 15 ml ap, se introduc 4-5 picturi metanol pur si se recntrete, diferena reprezint cantitatea de metanol. Se aduce la semn cu ap. Se prepar soluia etalon, astfel ca soluia s conin 1 ml = 0,1 mg = 100 g. Recoltarea probelor Se apir minimum 1litru aer, cu un debit de 0,2 litri/minut printr-un microabsorbitor coninnd 2 ml ap distilat. n afar de microabsorbitoarele destinate recoltrii de probe, se prevd nc dou, cu cte 2 ml ap distilat, care se transport n teren fr a aspirara aer prin ele, constituind probele martor. Modul de lucru Se transvazeaz cantitativ coninutul microabsorbitorului ntr-o eprubet gradat de 10 ml. Se adaug 1 ml permanganat de potasiu i 0,5 ml acid fosforic. Se las mpreun 15 minute, se decoloreaz excesul de permanganat cu sufit, evitnd excesul, apoi se adaug 5 ml acidcromotropic, agitnd i rcind la robinet. Se aduce proba n baia de ap la fierbere, meninnd-o 30 minute. Se rcete i se completeaz la 10 ml cu acid sulfuric 9 M.
269

n paralel se prelucreaz i probele martor. Se msoar extincia probelor la spectrofotometru la = 580 nm, n cuva de 1 cm, fa de martor. Curba de etalonare se ntocmete ntre 20 i 100 g, prin puncte din 20 n 20, n codiiile descrise mai sus. Valorile extinciilor pentru probe se raporteaz la curba etalon, obinnduse concentraia C a metanolului, n g, n prob. Eprubeta 1 2 3 4 5 6 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 20 40 60 80 100 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 2.0 1.0 se agit 5.0 se mentin eprubetele 30 n BM n fierbere, se rcesc imediat pn la 10 ml

Reactivi(ml) Standard de lucru(100 g / ml) KMnO4 20% H3PO4 5 % Na2SO3 sol. saturat Acid cromotroforic H2SO4 9 M

Calcul Rezulatele exprimate n mg metanol/m3 aer: mg, metanol /m3 aer = C/V n care: C = concentraia metanolului n g; V = volumul de aer recoltat, n litri. Normele republicane n vigoare prevd pentru alcoolul metilic CMA = 100mg/m3 aer. ALCOOLUL ETILIC B. Identificare 1. Reacia Leben: se alcalinizeaz 2 ml soluie de analizat cu NaOH 1% sau Na2CO3 10%, se nclzete uor i se adaug soluii Lugol (4 g iod i 4 g KI la 100 ml ap) pn la apariia culorii galbene-portocalie. Se distruge excesul de iod cu NaOH 10% sau Na2CO3 10% cnd apare opalescen i miros de iodoform, caracteristic, sau chiar precipitat galben cu forme caracteristice la microscop (la concentraii mai mari de etanol): C2H5OH + I2 +2 NaOH = CH3CHO + 2 NaI +2 H2O CH3CHO + 3 I2 + 3NaOH = CI3CHO + 3 NaI + 3 H2O CI3CHO + NaOH = CHI3 + HCOONa Reacia este sensibil, dar nespecific, fiind dat de aceton i metiletilceton, precum i de acetaldehid. Diferenierea cetonelor de etanol i acetaldehid se realizeaz, dac soluia de analizat este alcalinizazt cu amoniac n loc de NaOH, dup care se adaug soluie Lugol. n prezena etanolului i acetaldehidei apare un precipitat cenuiu-negru de iodur de azot, pe cnd acetona, n aceleai condiii, dezvolt miros de iodoform.
270

2.Reacia xantogenailor: la 2 ml soluie de analizat se adaug o granul de KOH de agit i se nclzete uor, se aciduleaz slab cu acid acetic !%, se adaug cteva picturi de sulfur de carbon i 2-5 picturi sulfat de cupru 5%. Se formeaz iniial un precipitat negru de xantogenat cupric, care trece prin dismutaie n xantogenat cupros, galben. 2C2H5-OK + 2CS2 +
C 2H 5 O

+ CuSO4 C SK
O SC S S Cu

C2H5

C S C

S Cu
2

C2H5

C S

S Cu
2

C2H5

C 2H 5

3. Reducerea bicromatului: se trateaz 2 ml soluie de analizat cu cteva picturi K2Cr2O7 5% i 1 ml H2SO4 conc., cnd se dezvolt o culoare verde (Cr3+), iar etanolul se oxideaz, n funcie de condiiile de reacie, la acetaldehid sau acid acetic: - la rece: 3 CH3CH2OH + K2Cr2O7 + 4 H2SO4 = 3 CH3CHO + Cr2(SO4)3 + K2SO4 + 7 H2O - la cald: 3 CH3CH2OH + 2 K2Cr2O7 + 8 H2SO4 = 3 CH3COOH + 2 Cr2(SO4)3 + 2 K2SO4 + 11 H2O Reacia este specific, fiind dat de toi alcoolii, ca alte substane organice i substane reductoare.

C. Dozare din aeru expirat, snge, urin, organe. 1. Metoda rapid pentru etanol, din aerul expirat. Se folosesc, fie tuburi umplute cu silicagel impregnat cu bicromat de potasiu sau anhidrid cromic i acid sulfuric- cnd se modific culoarea de la galben (Cr6+) la verde (Cr3+), concomitent cu oxidarea etanolului la acetaldehid - fie aparte speciale, de tipul Acootest, Breathanalyser etc., bazate pe reacii chimice sau msurtori fizice (de exemplu, absorbie n I.R.). 2. Metoda iodometric (oficial) pentru etanol din produse biologice (metoda Cordebard) Principiu Etanolul, izolat din produsul biologic prin distilare, este oxidat, la rece, pn la acid acetic, cu bicromat de potasiu, n mediu de acid acetic. Excesul de bicromat este titrat iodometric, n prezena amidonului sau a alcoolului polivinilic ca indicator: 3C2H5OH + 2K2Cr2O7 + 16HNO3 = 3CH3COOH + 4KNO3 + Cr(NO3)3 + 11H2O K2Cr2O7 + 6 KI + 14 HNO3 = 2 Cr(NO3)3 + 8 HNO3 + 2 I2 +7 H2O I2 + Na2S2O3 = 2 NaI + Na2S4O6 Reactivi

271

1. acid picric, soluie saturat. De aduc ntr-o capsul 20 g acid picric, se adaug 1000 ml ap i se nclzete amestecul la uoar fierbere, timp de 10-15 minute, apoi se rcete i se filtreaz. 2. Acid succinic sau acid tartric, soluie 5%; 2. Acid azotic d = 1,42 8lipsit de substane reductoare). 3. Iodur de potasiu, soluie 2% proaspt preparat. Se pstreaz n sticle brune cu dop rodat. 5. Bicromat de potasiu, soluie N/6,9 (0,144 N). Se cntresc exact 7,1065 g bicromat de potasiu pulverizat, n prealabil uscat la 125-150C i se dizolv n 1000 ml ap distilat. Soluia se conserv la ntuneric. Din aceast soluie, 3 ml corespund 10 ml bicarbonat de potasiu N/23 (0,0435 N) i oxideaz 5 mg etanol. 6. Tiosulfat de sodiu, soluie N/23 (0,0435 N). Se dizolv n 11 g Na2S2O3. H2O n ap distilat proaspt fiart i rcit, ntr-un balon cotat de 1000 ml, se adaug 0,10 g carbonat de sodiu anhidru i se completeaz la semn cu ap. Dup cteva zile se determin titrul, care se verific apoi sptmnal. Stabilitatea titrului se face astfel se iau 3 ml bicromat N/6,9, exact msurai, se adaug 5 ml ap distilat, 4 ml HNO3 i 20 ml KI 2%. Se astup flaconul i dup 2-3 minute, se titreaz iodul pus n libertate cu tiosulfat N/23 (indicator amidon sau alcool polivinilic). Factorul se calculeaz dup formula: Ftiosulfat = 10 / n

n care: 10 = ml bicromat N/23, corespunznd la 3 ml bicromat N/6,9 : n = ml tiosulfat N/23, folosii n titrare. 7. Indicator amidon 15 sau alcool polivinilic 10% (se dizolva 10 g alcool polivinilic, lipsit de substane reductoare, n 100 mlap fierbinte; se continu nclzirea, agitnd, pn la dizolvarea complet, (soluia se pstreaz n flacoane bine nchise, la rece). Modul de lucru a. Izolare Snge: se aduc 5 ml snge recoltat pe anticoagulante, exact msurai, ntr-un balon de distilare de 300ml, se adaug 20 ml ap, 25 ml acid picric (sau 45 ml acid succinic) i puin piatr ponce. Se agit uor i se adapteaz la coloan de distilare Vigreux, care se continu cu un refrigerent descendent, prevzut cu o alonj. Captul alonjei se introduce ntr-un balon cotat de 25 ml, n care se gsesc 2-3 ml ap distilat. Se distil pn aproape de semnul balonului, apoi se completeaz cu ap la semn. Distilarea dureaz aproximativ 25 minute. Urin: se aduc 5 ml urin exact msurai ntr-un ntr-un balon de distilare de 300 ml i se continu ca la snge. Organe: se cntrete repede o cantitate de organe (n funcie de natura organului) se mojareaz cu nisip purificat i se trece n balonul de distilare, relund de cteva ori cu ap, se adaug acid picric i se continu cala snge. b. Dozare (metoda Cordebard modificat de Banciu i Droc): ntr-un Erlenmeyer de 100 ml cu dop rodat, se iau 5 ml distilat(n cazul sngelui i al urinei, corespunde la 1 ml produs), se adaug 3 ml bicromat N/6,9 (msurai cu microbiureta) i 4
272

ml HNO3 conc. Se acoper balonul, se las n repaus 15 minute exact, se adaug 20 mlKI 2%. Dup 2 minute se titreaz iodul pus n libertate de excesul de bicromat, cu tiosulfat N/23, n prezena soluiei de amidon sau de alcool polivinilic ( ultimul vireaz la rou la incolor). Calcul 1 ml bicromat N/23 = 0,0005 g etanol g etanol/1000 ml snge (urin) = (10 n) x 0.5 = 10 n / 2 n care: 10 = ml ml bicromat N/23 (la care corespund 3 ml bicromat N/6,9 i care oxideaz 5 mg etanol); N = ml tiosulfat N/23 folosii la filtrare. Observaii 1. Dac distilatul conine mai mult etanol dect ar putea oxida bicromatul, se ia in lucru un alicot ??? mai mic. 2. Reactivii utilizai trebuie s fie p.a sau chimic pur s nu conin substane reductoare. 3. n cazul sngelui, rezultatele sunt corecte numai dac sngele nu a fost purificat. n cazul sngelui coagulat, se lucreaz pe ser i rezultatul final se mparte cu 1,2 ; deoarece etanolul este repartizat n cantitate mai mic n ser dect n sngele total. 4. n condiiile metodei, metanolul, aflat eventual n produsul biologic, este oxidat la rece numai n proporie de aproximativ 15%. Depistarea metanolului n snge se face dup tehnica indicat la metanol (v. Metanolul). 5. Se recomand ca dozarea s se execute pe dou probe paralele. 6. Din cauza scderii, n timp, a concentraiei de etanol, se recomand s se adauge 0,15% la rezultatul analizei, pentru fiecare or de ntrziere. aceast corecie se face, neinnd seama de primele dou ore i pe o perioad care s nu depeasc 5-6 ore (adic 7-8 ore) de la recoltrea sngelui. Peste aceast limit, sigurana calcului este mai redus. ETILENGLICOLUL: B. Identificare: 1. Oxidarea la acid oxalic. se trateaz 2 ml soluie de analizat cu0,5 ml HNO3 conc. i se nclzete uor; se formeaz acid oxalic, care decoloteaz soluia sulfuric de KMnO4. 2. Reacia Malaprade: la 2 ml soluie de analizat se adaug 0,5 ml acid periodic 5%; dup 20 minute se distruge excesul de acid percloric cu metaarsenit de potasiu 3% i se identific HCHO format. DETERMINAREA ALDEHIDELOR I CETONELOR A. Izolare Aldehidele se izoleaz din aer prin reinere n soluii absorbante adecvate, iar n produse biologice, prin distilare i antrenare cu vapori de ap. B. Identificare 3.1. Reacii comune aldehidelor

273

a. Reacia Fehling: peste 2 ml soluie de analizat se adaug 2ml reactiv Fheling i se aduce la fierbere, cnd apare un precipitat rou - crmiziu de Cu2O: Cu(OH)2 H2O + + R-CHO H R-COOH + O
Cu O

H2O + CuO

Cu OH

Cu OH Reactivul Fehling se preparuamestecnd, la ntrebuinare, pri egale din soluia A i B. C O Soluia A: se dizolv 35 g CuSOH . 5 H2O n ap, se adaug 5 ml H2SO4 conc. i se 4 completeaz cu ap la 1000 ml. Soluia B: se dizolv 150 g sare Seignette (tartrat de K i Na) n ap, se adaug 300 ml NaOH 30% i se completeaz cu ap la 1000 ml. b. Reactiv Nessler: peste 2 ml soluie de analizat se adaug 2-3 picturi reactiv Nessler, cnd apare un precipitat negru, prin punerea n libertate a mercurului metalic: HCHO + K2[HgI4] + 3 KOH Hg + HCOOK + 4KI + 2H2O b. Reacia Schiff: peste 1 ml soluie de analizat se adaug cteva picturi reactiv Schiff, cnd apare o coloraie roie violet, datorit unui derivat trifenilmetanic:

NH2 C C NH2

+ H2SO3
NH 2 HO 3S C

NH 2

+ 2 H2SO3 H2O +

NH 2

+
NH2 HO3S C

N H

SO2H

2 HCHO
NH2 HO3S C

N H H N

SO2 CH2OH

H2SO3 +
NH

H N SO H 2

N H

SO2 CH2OH

SO2 CH2OH

H N SO CH OH 2 2

Reactivul Schiff se prepar astfel: se dizolv 0,2 g fuxin bazic (pararozanilin) n 120 ml ap fierbinte, se rcete, se adaug 20 ml soluie bisulfit de sodiu 10% (bisulfitul nu trebuie s fie oxidat ) i 2 ml HCl conc. , apoi se completeaz la 200ml cu ap distilat. Se ntrebuineaz dup minimum 2 ore. Reactivul trebuie s fie incolor, el se coloreaz sub aciunea oxidanilor sau prin nclzire. Sensibilitatea reaciei este de 0,2 g/ml. Reacia poate reveni la diferenierea formaldehidei de alte aldehide, deoarece prin adugare de HCl, coloraia dat de alte aldehide dispare, pe cnd cea datorit formaldehidei se intensific spre albastru-violet. d. Reacia Marcuis se trateaz 5 pri soluie de analizat cuo parte H2SO4 conc. i se rcete. La 3-5 picturi din aceast soluie se adaug 2-3 cristale codein sau morfin dizolvate n 2 ml H2SO4 conc., cnd apare o coloraie violet roie pn la violet albastr.

274

e. Reacia Egrive (cu acid cromotropic): se trateaz 1 ml soluie de analizat cu 1 ml reactiv cromotropic, cnd apare o coloraie violet. Reactivul acid cromotropic: se dizolv 0,2 g acid cromotropic n 2 ml ap i se aduce la 100 ml acid sulfuric concentrat. f. Recia Scheyver (cu fenilhidrazin): se adaug, la 1ml soluie de analizat, 1 ml soluie fenilhidrazin clorhidric 1%, proaspt preparat, 1 ml acid clorhidric d= 1,19 i 1 ml fericianur de potasiu 1%, cnd apare o coloraie roie. 3.2. FORMALDEHIDA (reacii sprcifice) a. Reacia cu acetilaceton: se adaug, la 1 ml soluie de analizat, 2 ml reactiv acetiaceton i se menine 5 minute n baia de ap la fierbere, cnd se dezvolt o coloraie galben, datorit diacetildihidrolutidinei :
CH2 CO CH3 O C CH3

CH CO CH3 O C CH3

+ NH3 H2O +

CH CO CH3

H 3C O C

CH2

H2N
H3C

C CH3
CH CO CH3 N

CH CO CH3

H3C OC CH2

H 3C + HCHO

H2N C CH3 H3C OC CH CH2 CH CO CH3

H3C

C CH3

CH3

Reactiv acetilaceton: Se dizolv n ap distilat, 25 g acetat de amoniu, se adaug 2 ml acid acetic glacial, 0,2 ml acetil aceton i se aduce la 100 ml ap distilat. Metoda este specific. Sensibilitatea 0,2 g/ml. Reacii de difereniere a formaldehidei de alte aldehide. a. Reacia cu nitroprusiat: la tratarea soluiei de analizat cu 1 ml nitroprusiat 15 se formeaz o coloraie albastr n prezena formaldehidei i roie n prezena acetaldehidei. b. Reacia van Bok: la tratarea soluiei de analizat cu benzidin soluie 1% n acid acetic, se formeaz, n prezena formaldehidei, o coloraie galben -portocalie,care prin nclzire, trece n rou deschis. n aceleai condiii, benzaldehida d o coloraie glbuie, apoi un precipitat galben. C. Dozare din aer 1. Metoda spectrofotometric cu fenilhidrazin pentru formaldehid Principiu Formaldehida se condenseaz cu fenilhidrazina, trecnd n fenilhidrazon, care, cu fericianura de potasiu n mediu acid, d un compus chinoniminic, rou, colorimetrabil. C6H5-NH-NH2 . HCl + HCHO + K3[Fe(CN)6] O-C6H4=N-N=CH2 . HCl Sensibilitatea metodei este de 0,1 g/ml. Reacia nu este specific, fiind date de alte aldehide i ali reductori. Reactivi

275

1. Soluia absorbant fenilhidrazinclorhidric,solui 1%. Se dizolv 1g fenilhidrazin clorhidric n 2 ml HCl d = 1,19 i se aduce la 100 ml cu ap. Se agit energic i la nevoie, se filtreaz prin frit de sticl. Se prepar extemporaneu. 2. Acid clorhidric (d = 1,19) 3. Fericianur de potasiu, soluie 2%. Se prepar extemporaneu. 4. Soluie standard stoc. Se dilueaz 0,5 ml soluie de formaldehid 40%, cu ap, la 100 ml i se stabilete iodometric coninutul exact n formaldehid, astfel: ntr-un Erlenmyer cu dop rodat, se introduc 2 ml soluie standard, 20 ml soluie iod 0,1 N i 10 ml NaOH 1N, acoperindu-se imediat cu dopul. Se agit i se las 10 minute la ntuneric. Se adaug 12 ml acid sulfuric 1 N i se titreaz iodul pus n libertate cu soluie de tiosulfat de sodiu 0,1 N, cu soluie de amidon indicator. La 1 ml de iod 0,1 N corespund 1,502 mg formaldehid. Soluia de formaldehida se prepar extemporaneu. 5. Soluia standard de lucru. Se dilueaz soluie standard stoc cu ap pentru a obine o soluie cu 10 g formaldehid/ml. Recoltarea probelor Se aspir minimum 10 litri aer, cu un debit de 0,5 litri/minut, printr-un absorbitor coninnd 10 ml soluie absorbant. n afar de absorbitoarele destinate recoltrii de probe se prevd nc dou absorbitoare cu cte 10 ml soluie absorbant, care se transport n teren, fr a aspira aer prin ele, constituind probele martor. Modul de lucru Se transvazeaz coninutul fiecrui absorbitor, cantitativ n cte o eprubet gradat, completndu-se eventual, la 10 ml. Se iau 5 ml soluie absorbant, se adaug 1 ml HCl conc. i 0,5 ml fericianur 2% agitndu-se. n paralel se prelucreaz i probele martor. Se msoar extincia dup 15 30 minute, la spectrofotometru, la = 530 nm, n cuva de 1 cm, fa de martor. Curba de etalonare se ntocmete ntre 5 i 25g, prin puncte din 5 n 5, n condiiile descrise mai sus. Valorile extinciilor pentru probe se raporteaz la curba etalon, apoi se nmulesc cu 2 (pentru c s-a lucrat cu din soluia absorbant), obinndu-se concentraia C, a formaldehidei, n g, n prob. Eprubeta 1 2 0.5 1.0

Reactivi(ml) Standard de lucru (10g CH2O/ml) Conc. g. Fenilhidrazin 1% HCl conc. K3[Fe(CN)6] 2%

3 1.5

4 2.0

5 2.5 25 2.5

6 5.0

5 10 15 20 4.5 4.0 3.5 3.0 1 0.5 Agitare , repaus 20-30 minute

Calcul: Rezultatele se exprim n mg formaldehid / m3 aer: mg formaldehid/m3 aer = C / V

276

n care: C = concentraia formaldehidei, n g. V = volumul de aer recoltat, n litri. Normele republicane n vigoare prevd pentru formaldehid CMA = 3 mg/m3 aer.

Bibliografie G. Drochioiu, I. Mangalagiu, I. Dru, Elemente de teorie i practic toxicologic. Edit. Demiurg, Iai, 2001. M. Cotru, Implicaii ale consumului de etanol n industria chimic. M.I.Ch., Iai, 1983. M. Proca, E. Butnaru, L. Agoroaei Lucrri practice de toxicologie. Universitatea de medicin i farmacie Gr. T. Popa Iai, Centrul de multiplicare UMF, Iai, 1996.

277

Cap. XI. Drogurile: ntre plcere i moarte Drogurile au fost consumate de vraci, amani, iniiai pentru a intra n planurile superioare ale existenei, dup cum au afirmat acetia. Acestea pot ns fi folosite de laici, care, necunoscndu-le valoarea adevrat i abuznd utilizarea lor ajung la epuizarea corpului, degradarea sa i chiar la moarte. O carte interesant despre toxicologia medico-legal a drogurilor a fost scris de mai muli specialiti sub redacia Castiglioni, S., Zuccato, E., Fanelli, R n 2011. Aceasta cuprinde ntre altele, metabolismul i excreia drogurilor folosite de oameni (Manuela Melis, Sara Castiglioni, i Ettore Zuccato). Dintre droguri este studiat intens cocaina i metaboliii si (Alexander L.N. van Nuijs, Lieven Bervoets, Philippe G. Jorens, Ronny Blust, Hugo Neels, and Adrian Covaci). Pentru depistarea drogurilor autorii recomand spectrometria de mas i spectrometria de mas cuplat cu lichid-cromatografia (Flix Herndez, Juan V. Sancho, and Lubertus Bijlsma). Prezena drogurilor n apa de but sau n particolele de praf este, de asemenea discutat.

Analizele de laborator Determinarea cocainei

O C O CH3 C O C6H5

H3C

A. Izolare a. Izolare din organe: se extrage din soluie apoase alcaline, cu urmtoarele precauii, spre a evita hidroliza: macerarea se execut la rece; operaia de extragere se execut se conduce rapid, se execut la temperatura laboratorului sau la un curent de aer; din hidroliz rezult metanol, care se poate identifica. b. Izolare din vom, coninut stomacal, lichide biologice: se extrage cu eter (cloroform) din produsul alcalinizat la pH = 8 cu bicarbonat. c. Izolare de pe mucoasa nazal (la cocainomani): se prelev mucozitile cu ajutorul unui tampon de vat, care apoi este extras cu eter (cloroform). B. Identificare: 1. Reacii de precipitare: a. Cocaina d precipitate cu reactivi generali de precipitare ai alcaloizilor. - Reziduul tratat cu 2-3 picturi reactiv Hager cnd se formeaz un precipitat galben (sensibilitatea 1: 1000). - Reziduul tratat cu 2-3 picturi reactiv Bouchardat formeaz un precipitat brun (1 : 50000). - Reziduul tratat cu 2-3 picturi reactiv Mayer formeaz un precipitat alb-glbui.
278

- Reziduul dizolvat n 1-2 picturi de acid sulfuric 10% se trateaz cu 2 ml soluie permanganat de potasiu 3,5% cnd apare un precipitat violet, care, la microscop, se prezint sub form de cristale rectangulare, unele ntreptrunse. - Reziduul se dizolv n puin ap acidulat, se adaug cteva picturi bicarbonat de potasiu 55 i 2-3 picturi acid clorhidric 10%. n prezena cocainei se obine un precipitat galben. 2 Reacii de culoare: a. Reacia Pesez (variant a reaciei Vitali): reziduul se trateaz cu 2-3 picturi de acid azotic concentrat i 10-15 picturi acid sulfuric concentrat. Se solubilizeaz cu ajutorul unei baghete i se nclzete 10-15 minute pe baia de ap. Se rcete i se adaug 1 ml de ap, cnd apare culoare galben strlucitoare. Se transvazeaz ntr-o eprubet i se adaug 1 ml aceton. Se rcete i se agit puternic cu 5 ml hidroxid de sodiu 50%. Faza apoas rmne galben, iar la zona de contact cu acetona apare un inel albastru-violaceu, care prin agitare, care prin agitare, difuzeaz n toat masa acetonic. Culoarea albastr trece n violet, i n final n rou nchis. b. Reacia Ferreira de Silva: se nitreaz reziduul cu cteva picturi de acid azotic concentrat i se evapor la sec. Reziduul cald este tratat cu cteva picturi de potasiu 10% n alcool. se dezvolt un miros de benzoat de etil, sau dac alcaloidul este n cantitate mare, o coloraie roie purpurie. c. Reacia Guerbert: (v. atropina). d. reziduul se trateaz cu 0,5 ml acid sulfuric concentrat i cteva cristale de iodat de potasiu. Se nclzete pe baia de ap pn ncep s se formeze vapori albi de trioxid de sulf. n acest moment apare o culoare brun, care vireaz treptat n verde oliv, albastru- violet. 3. Reacia de miros: reziduul tratat cu acid sulfuric concentrat i nclzit pe B.M. i diluat cu 2 ml ap d un miros de benzoat de etil. 4. Diferenierea cocainei de atropin prin reacia Fesez (tabelul nr.7) Diferena se face pe baza coloraiei fazelor, astfel:: Tabelul nr.7 Cocaina Atropina Faza fr NaOH cu NaOH fr cu NaOH NaOH Apoas galben galben incolor incolor Acetonic incolor Albastru-violet galben albastru Rou-bordo

5. Cromatografie pe strat subire: a. Faza staionar: plci silicagel G Merck, activitate la 110, o or. b. Faza mobil: cloroform: metanol (9 : 1), amoniac concentrat : metanol (1,5 : 100) c. Proba de analizat: extract cloroformic bazic. d. Martor: cocain n cloroform.
279

e. Revelare: plcile se usuc n atmosfer i se stropesc cu reactiv iodoplatinat acidulat (Rf = 0,60). 6.Test fiziologic. Cocaina aplicat pe vrful limbii determin anestezie. Instilat n ochiul de pisic sau iepure, provoac midreaz (cellalt ochi servete drept martor).

HEROINA (DIACETIL MORFINA)

H3C N

COO

CH3

A. Izolare: Heroina se izoleaz din produii de analizat prin extracie cu cloroform din mediu alcalin. B. Identificare: 1. Reacii de precipitare: Reziduul obinut prin evaporarea extractului cloroformic se trateaz ci 1-2 picturi clorur mercuric 5% cnd apare un precipitat sub form de dendrite. 2. Reacii de culoare: a. Reziduul reluat cu 2-3 picturi reactiv Marcquis de dezvolt o coloraie viinie. b. Reziduul reluat cu 2-3 picturi reactiv Mandelin dezvolt o coloraie albastr-cenuie. d. Reziduul de heroin d reacia Vitali obinndu-se o coloraie verde - mslinie. f. Soluia apoas de heroin se nclzete cu clorhidrat de hidroxilamin n mediu alcalin cnd se formeaz acid hidroxamic ( de la radicalul acetil). Dup neutralizare, se trateaz cu clorur feric 1% cnd apare roz violacee, colorimetrabil (reacia Waxmuth). Diferenierea intoxicaiei cu morfin de intoxicaia cu preparat din opiu Intoxicaia cu preparat din opiu se difereniaz de acea cu morfin, prin identificarea acidului meconic, prezent n opiu n concentraie de 5-10%. Acidul meconic se extrage prin metoda Stas n mediu acid, cu eter. Pentru purificare, reziduul de la evaporarea eterului acid se reia cu ap i se epuizeaz de cteva ori cu benzen n care acidul meconic este insolubil. Se separ prin centrifugare cele dou faze. Reziduul fazei apoase este reluat cu eter care extrage acidul meconic. Soluia eteric tratat cu cteva picturi de clorur feric 1% d o coloraie roie. Culoarea este stabil n timp i n prezena acidului clorhidric cea ce difereniaz acidul maconic de sulfocianuri i acetai.

280

O OH COOH O COOH

IV.1.10.3 HIDROMORFONA SAU DILAUDID A. Izolare: Se extrage din soluia apoas amoniacal dup metoda Stas-Otto-Origer.
H3C N

OH

B. Identificare: 1. Reacii de precipitare: Reziduul reluat cu 2-3 picturi de nitroprusiat de sodiu 10% formeaz cristale sub form de prisme sau baghete. 2. Reacii de culoare. a. Cu reactivul Marque dezvolt o coloraie galben-rpie purpurie. b. Cu reactivul Mandelin dezvolt o coloraie viinie nchis, apoi portocalie . c. Cu reactivul Frhde dezvolt o coloraie viinie bleu, care trece la verde. d. Reacia Vitali se dezvolt o coloraie galben-galben portocalie. e. Cu clorura feric 3% apare o coloraie albastr. IV. 1.10.4. NALORFINA (SIN. LETHIDRONE) N-ALILNORMOFINA H3C N

OH

1. Reacii de precipitare: a. Cu bicromatul de potasiu 10% apare un precipitat sub form de stea. b. Reactiv Mayer- se obine un precipitat sub form de stea sensibilitatea reaciei este de 1 : 400). 2. Reacii de culoare: a. Reactivul Marquis dezvolt o coloraie viinie.
281

b. Reactivul Frhde d o coloraie bleu, ce trece n verde. c. Testul Vitali dezvolt o coloraie galben-galben portocalie. IV.1.11.2.METADONA (SIN. SINTALGON, DOLOPHINE, MECADIN O C 6H 5 CH3

CH3 CH2

C C CH2 CH N CH3 2 C6H5

1. Reacia de precipitare: a. Reactivul Hager reziduul se reia cu 2-3 picturi reactiv Hager cnd se formeaz un precipitat galben; se adaug 5 ml eter i se agit, precipitatul se dizolv (deosebire de petidin). b. Reziduul reluat cu clorur mercuric 5% formeaz un precipitat alb sub form de rozet (sens. 1 : 3000). 2. Reacii de culoare: a. Rezduul reluat cu 2-3 picturi reactiv Mandelin dezvolt o coloraie verde care trece n albastru. Determinarea papaverinei

OH3C OH3C N CH2

O O N CH3

O O OCH3 NH CH3
2

OCH3 OCH3

OCH3 OCH3 O

OC CH3 OCH 3

O COOH

Papaverin

Narcotin

Narcein

A. Izolare: Papavelina, narcotina i narceina se izoleaz din soluia apoas alcalin sau acid cu cloroform. B. Identificare:
282

1. Reacii de precipitare: Papavelina, noscapina i narcina dau precipitate cu reactivii generali de precipitare ai alcloizilor pe o soluie de clorhidrat sau sulfat de alcaloid: reziduul rmas pe sticl de ceas dup evaporarea solventului este reluat cu cteva picturi acid clorhidric sau sulfuric 10% i se evapor la sec pe baia de ap. Reziduul care reprezint alcloidul salifiat este tratat cu reactivii generali de precipitare ai alcaloizilor: a. Reziduul tratat cu 1-2 picturi reactiv Hager d un precipitat galben (sensibilitatea 1 : 500). b. Reziduul tratat cu 1-2 picturi reactiv Bouchardat d un precipitat rou nchis. c. Reziduul tratat cu 1-2 picturi reactiv Mayer d un precipitat alb. d. Reziduul tratat cu 1-2 picturi reactiv Drangendorff d un precipitat rou portocaliu. e. Reziduul tratat cu 1-2 picturi reactiv Marm d un precipitat alb, sub form de rouet. f. Reziduul reluat cu clorur de zinc 5% d un precipitat sub form de buchet. 2. Reacii de culoare: Papavelina. a. Reziduul tratat cu 2-3 picturi reactiv Erdmann d o coloraie albastr-verde, care trece n rou nchis. b. Reziduul tratat cu 2-3 picturi acid sulfuric concentrat prezint la nclzire o coloraie violet (deosebire de morfin). c. Reziduul tratat cu 2-3 picturi reactiv Frhde d o coloraie verde ce trece n albastr, iar la nclzire n roie viinie. d. Reziduul tratat cu 2-3 picturi reactiv Marquis d o coloraie galben- verde, care trece n roz-rou i apoi n brun (deosebire de morfin i esterii si). e. Reziduul tratat cu 2-3 picturi reactiv Mandelin d o coloraie verde albastr care trece n albastru. f. Reziduul tratat cu un cristal fericianur de potasiu 10% i cteva picturi reactiv Marquis d o coloraie albastr-verde care trece succesiv n violet, verde, galben. Noscapina (Narcotina) a. . Reziduul tratat cu 2-3 picturi acid sulfuric concentrat d o coloraie galben-verde care trece succesiv n portocaliu i rou viiniu. b. Reziduul tratat cu 2-3 picturi reactiv Marquis d o coloraie galben-verde ce vireaz la rou-violet, apoi la verde oliv i la galben (deosebire de morfin: culoarea purpur vireaz la bleu). c. Reziduul tratat cu 2-3 picturi reactiv Frhde d o coloraie verde. Narceina a. Reziduul tratat cu 2-3 picturi reactiv Frhde d o coloraie verde b. Reziduul tratat cu 2-3 picturi reactiv Marquis d o coloraie brun ce trece n verde. c. Reziduul tratat cu 2-3 picturi reactiv Madelin d o coloraie verde-brun. d. Reziduul tratat cu 2-3 picturi soluie apoas de iod 1% d o coloraie(sau precipitat) albastr. 3. Fluorescena

283

Reziduul de papavelin dizolvat la cald n anhidrid acetic i tratat cu cteva picturi de acid sulfuric concentrat d o culoare verde-galben, fluorescent n U.V.

Cap. XII. Otrvirea cu medicamente 1. Toxicologia medicamentelor Spectrul efectelor exercitate de medicamente cuprinde efecte benefice i efecte nedorite n raport cu circumstanele n care sunt utilizate. Efectele toxice decurg fie din aciunea farmacologic primar (care reprezint baza indicaiei terapeutice) - exagerat n situaia dat - fie din aciuni fr legtur cu aceasta, incluznd aici citotoxicitatea direct i perturbri ale proceselor metabolice. Intensitatea efectelor toxice depinde n general de concentraia toxicului n organism, mai precis de locul su de aciune. Excreia, n special prin rinichi, este o modalitate de epurare, valabil pentru multe medicamente. Ea intereseaz n general molecule purttoare de sarcini electrice depline sau pariale, care nu sunt liposolubile. Medicamentele, cu excepia celor macromoleculare (sau n form legat de proteinele plasmatice), filtreaz glomerular. Moleculele liposolubile se absorb tubular, rmnnd n organism, cele neliposolubile sunt reinute n urin i se elimin. Unele medicamente fac de asemenea obiectul secreiei tubulare, care implic mecanisme transportoare specifice. Medicamentele care sunt epurate total sau n mare parte prin excreie renal - de exemplu antibioticele aminoglicozidice de felul gentamicinei, majoritatea curarizantelor, digoxina - trebuie administrate n doze mici sau evitate (dup caz) n insuficiena renal. Vrsta naintat, care presupune un grad de insuficien renal funcional, oblig de asemenea la pruden n dozare. Eliminarea renal poate fi obiectul unor interaciuni semnificative clinic. Astfel, alcalinizarea urinii prin bicarbonat de sodiu crete proporia formei ionizate de salicilai (care au molecula acid) n urin; aceasta micoreaz reabsorbia tubular, mrind eliminarea renal, fenomen util n intoxicaia acut cu acid acetilsalicilic. Un alt exemplu este probenecidul, un medicament cu molecula acid, care intr n competiie cu benzilpenicilina, de asemenea cu molecula acid, pentru transportul specific ce intervine n secreia tubular;
284

de aceea probenecidul scade eliminarea urinar a penicilinei i poate fi utilizat pentru creterea nivelului plasmatic de antibiotic. Clearance-ul medicamentelor Clearance-ul este un parametru farmacocinetic primar, care arat viteza de epurare relativ la concentraia medicamentelor n lichidele biologice. Clearance-ul se exprim obinuit relativ la plasm-clearance plasmatic (Clp), care reprezint volumul de plasm epurat de medicament pe unitatea de timp. Clp=V/Cc n care V noteaz viteza de introducere a medicamentului n perfuzie intravenoas, iar Cc concentraia plasmatic constant. Clearance-ul plasmatic exprim clearance-ul sistemic sau total (Clt). El reunete componenta hepatic a epurrii (Clh), cea renal (Clr) i cea datorit altor organe (Clal): Clt=Clh+Clr+Clal Cunoaterea clearance-ului este important pentru c permite aprecierea perioadei ct medicamentul rmne n organism, respectiv a duratei efectului. Valoarea clearance-ului hepatic i renal arat contribuia celor dou organe de epurare. Clearance-ul renal mare al unui medicament - de exemplu gentamicina - semnific c acesta trebuie folosit cu pruden, n doze mici sau evitat n prezena insuficienei renale. Timpul de njumtire Timpul de njumtire este timpul necesar scderii la jumtate a concentraiei de medicament n plasm. Acest parametru depinde la nceput mai ales de distribuia medicamentului, apoi predominant de epurarea sa. Pentru majoritatea medicamentelor el se exprim prin relaia: T1/2=0,693 x Vd/Clp n care 0,693 este logaritmul natural de 2. Cunoaterea timpului de njumtire este util pentru stabilirea posologiei i intervalului ntre doze. Medicamentele i datoresc efectele interaciunii cu materia vie. Majoritatea acioneaz specific asupra unor anumite structuri macromoleculare prezente n cantitate mic n esuturile int. Consecutiv sunt declanate fenomene secvenionale multiple, reacii i contrareacii, care se manifest la diferite domenii dimensionale: celule, esuturi, sisteme, organe i n final, la nivelul organismului ntreg. Aciunea medicamentelor la nivel molecular i celular Aciunea primar a medicamentelor se exercit asupra moleculelor i reprezint mecanismul de aciune. Farmacoreceptorii sunt macromolecule proteice capabile s lege specific substane active cu molecula relativ mic, formnd cu acestea complexe, care comand anumite efecte biologice. Multe medicamente folosesc drept receptori macromolecule, care n mod obinuit

285

sunt acionate specific de molecule fiziologice - neurotransmitorii autacoizi, hormoni i ali compui activi proprii organismului. Receptorii recunosc specific semnalul chimic reprezentat de anumite molecule. Aceasta se datorete existenei la suprafaa macromoleculei a unui sediu de legare complementar chimic, electric i /sau ca organizare spaial cu molecula medicamentoas (sau endogen). Capacitatea de a se fixa specific de anumii receptori este denumit afinitate. Formarea complexului medicament-receptor se realizeaz prin stabilirea unor legturi ntre molecula de medicament i sediul de legare. Legturile sunt de regul labile i constau n legturi ionice, puni de hidrogen, fore van der Waals. Medicamentul se leag i se desface de receptori cu repeziciune i de repetate ori. Mai rar legarea este stabil i puternic (legturi covalente) ceea ce determin un efect prelungit, deseori cu caracter toxic. n cazul substanelor denumite agoniste, formarea complexului medicament-receptor declaneaz fenomene fizico-chimice i /sau biochimice, cu repercusiuni funcionale. n acest caz medicamentul are, pe lng afinitate, activitate intrinsec. Fenomenul iniial const probabil n modificri conformaionale ale macromoleculei receptoare, care determin, direct sau indirect, modificri ale permeabilitii membranare, modificri de activitate enzimatic, modificri ale unor mecanisme transportoare.

Modificarea conformaional a unei macromolecule receptoare (haurat), inclus in membran, ca urmare a acionrii specifice de ctre o molecul medicamentoas (negru plin); consecutiv se deschide un canal membranar prin care trec ionii, conform gradientului de concentraie (schem imaginar) Cuplul medicament-receptor iniiaz intrarea n funcie a unor mecanisme amplificatoare - reacii enzimatice secveniale n cascad, aciuni progresiv mai ample sau mai ndelungate pentru fiecare treapt, transformri de energie. Aa se explic consecinele funcionale majore ale unor aciuni primare foarte modeste cantitativ. O alt categorie de medicamente antagoniste - au afinitate, dar fixarea de receptori este imperfect i nu poate declana fenomenele responsabile de activitatea biologic. Asemenea substane sunt denumite antagoniste deoarece mpiedic fixarea de receptori, respectiv aciunea substanelor agoniste.Antagonismul are obinuit caracter competitiv, cele dou categorii de substane, agoniste i antagoniste, intrnd n competiie pentru sediul de legare de pe macromolecula receptoare.

286

Curba concentraiei de medicament (sau doz) - efect este hiperbolic cu convexitatea n sus. nscrierea semilogaritmic realizeaz o curb sigmoid. Centrul de simetrie din poriunea mijlocie a curbei definete doza care produce 50% din efectul maximal. Atunci cnd substana se cupleaz cu toi receptorii disponibili i i acioneaz efectul este maximal. Eficacitatea maxim indic intensitatea de aciune a unui medicament, figurat prin nlimea curbei proiectat pe ordonat. Potena, care exprim domeniul dozelor eficace, este figurat prin proiecia curbei pe ordonat.

Primele cunotine despre structura i organizarea receptorilor s-au referit la suprafaa de legare, considernd caracterul complementar ntre acestea i moleculele pe care le recunoate. Folosirea de liganzi specifici i tehnici complexe de identificare, izolare, dozare i analiz chimic au lrgit sfera cunotinelor. Studii farmacodinamice, utiliznd liganzi specifici au evideniat diferite familii, tipuri i subtipuri de receptori. n ultimii ani s-a reuit clonarea genelor responsabile de sinteza proteinelor receptoare, ceea ce a permis realizarea unor asemenea macromolecule recombinate.

287

Cele patru tipuri de receptori membranari: 1-receptor membranar nglobnd un canal ionic; asubunitate proteic receptoare; b-pentamer format din subunitile proteice care mrginesc canalul ionic efector; 2-receptor membranar cu funcie enzimatic; 3-receptor membranar serpentin, cuplat cu o protein reglatoare; 4-receptor intracelular care se leag de ADN (S i S-P = substrat, respectiv substrat fosforilat, G = protein reglatoare dependent de GTP, Ee = enzim efectoare, SMS = sistem mesager secund, E i E-P = enzim, respectiv enzim fosforilat; molecula de agonist este redat haurat) Conform cunotinelor actuale receptorii pot fi ncadrai n patru superfamilii n funcie de organizarea lor structural i de sistemele cu care sunt conectai. Receptorii pot fi situai n membrana celular sau intracelular. Receptorii membranari sunt proteine integrale nglobate n membrana celular, cu o extremitate care proemin n exterior i alta n interior. Receptorii intracelulari sunt proteine specifice situate n citoplasma i n cromatina nuclear. O prim categorie de receptori este reprezentat de recetorii-canal ionic. Acetia sunt formai dintr-o protein, care include sau mrginete un canal membranar ionic, astfel
288

receptorii colinergici nicotinici include un canal pentru ionii de sodiu i potasiu, iar receptorii GABAA include un canal pentru ionii de clor. Acionarea unor asemenea structuri macromoleculare determin deschiderea (sau nchiderea) canalului respectiv, cu modificarea ncrcrii electrice membranare, respectiv depolarizare i fenomene de excitaie sau hiperpolarizare i inhibiie. O a doua categorie de receptori membranari sunt receptorii-enzime. Ei constau n proteine transmembranare, care au un sediu de legare pe suprafaa extracelular i activitatea enzimatic n poriunea dinspre interiorul celulei. Acionarea acestor receptori determin modificarea direct a activitii enzimatice corespunztoare, cu consecine metabolice i funcionale. Insulina i anumii factori trofici activeaz receptori cu funcie protein-kinazic. A treia categorie de receptori, de asemenea membranari, mai compleci, sunt receptorii cuplai cu proteine G sau receptorii n serpentin. Ei cuprind o protein prevzut cu un sediu de legare, cuplat cu o alt protein denumit protein G i, prin aceasta, cu o enzim membranar important. Prima protein, cu funcie receptoare propriu-zis este cudat, traversnd de apte ori membrana celular; agonistul se fixeaz pe suprafaa extern. Modificarea conformaional, care urmeaz activrii proteinei receptoare, se transmite la o protein G, a crei funcie este dependent de GTP.Au fost descrise cteva tipuri de protein G, notate cu diferite litere mici: Gs, Gi (s i i de la stimulant, respectiv inhibitor), Gq, Go. Proteina G este cuplat pozitiv (stimulator) sau negativ (inhibitor) cu o anumit enzim membranar capabil s pun n funcie metabolii majori pentru economia metabolic celular denumii mesageri secunzi (mesagerii primi ai informaiei sunt reprezentai de moleculele care acioneaz receptorii). Principalele enzime membranare, care pun n funcie mesageri secunzi, sunt adenilat ciclaza i fosfolipaza C. Adenilat ciclaza catalizeaz transformarea ATP n AMPc (adenozin monofosfat ciclic). Adenilatul ciclic, un mesager secund, activeaz protein kinaze specifice, cu declanarea unor procese de fosforilare i activare enzimatic secvenial. Fosfolipaza C este o enzim membranar care desface, din fosfatidilinozitol, inozitol trifosfat (ITP) i diacil gliceroli (DAG). Aceti metabolii reprezint un sistem mesager secund. ITP stimuleaz eliberarea de ioni de calciu din depozitele celulare; calciul cuplat cu calmodulina (o protein specific) activeaz anumite protein kinaze, cu fosforilri n lan consecutive. DAG mpreun cu ionii de calciu activeaz protein kinaza C, o alt enzim fosforilant. Catecolaminele, acetilcolina, serotonina, opioizii i datoresc parte din efectele modificrii sistemelor mesagere secunde reprezentate de adenilatul ciclic i de ITP DAG / Ca2+, ca urmare a activrii anumitor receptori specifici. 1. Protein receptoare 2. Protein G 3. Adenilat ciclaz
289

Protein receptoare Protein G Fosfolipaza C

4. AMP ciclic 5. Protein kinaze AMPC dependente 6. Rspuns celular

ITP-DAG/Ca2+ Protein kinaze Ca2+ calmodulin dependente Rspuns celular

Etapele care urmeaz activrii receptorilor cuplai cu proteine G-1, 2; 3-enzima membranar modificat consecutiv; 4-mesagerul secund; 5-enzimele activate de mesagerul secund; 6-rspunsul celular consecutiv Receptorii aparinnd unei a patra categorii, au o component citoplasmatic i o alta la nivelul cromatinei nucleare, de unde denumirea de receptori nucleari. Moleculele care acioneaz la nivelul acestor receptori (steroizi hormonali, vitamina D, hormoni tiroidieni) sunt solubile n grsimi i ptrund cu uurin n celulele int. Ajunse n citoplasm se fixeaz de o macromolecul receptoare complex. Prin pierderea consecutiv a unor proteine asociate acestei macromolecule se formeaz un complex activ, care ajunge n nucleu unde se fixeaz de ADN la nivelul unui situs specific. Ca urmare sunt reglate pozitiv sau negativ anumite gene alturate, receptorii nucleari avnd funcie de factori de trascripie. Modificarea sintezei unor proteine enzimatice sau de alt natur este responsabil de efectul final. Timpul n care se evideniaz efectele acionrii receptorilor depinde de felul acestora. n cazul modificrii directe a canalelor membranare sau a funciei unei enzime efectul apare foarte repede. Pentru receptorii cuplai cu proteine G efectele se instaleaz ceva mai lent, deoarece implic sisteme mesagere secunde i secvene metabolice multiple. Efectele acionrii receptorilor nucleari se dezvolt dup o perioad de laten, deoarece ele presupun modificarea sintezei unor proteine. Aciunile medicamentelor asupra canalelor membranare i mecanismelor transportoare Canalele membranare sunt pori apoi inclui n proteine membranare sau mrginii cu acestea. Canalele permit trecerea prin difuziune controlat a ionilor de sodiu, calciu, potasiu, clor, conform gradientului de concentraie. De asemenea, pot fi traversate de anumite molecule hidrosolubile de dimensiuni mici. Trecerea pasiv a ionilor de sodiu i a celor de calciu determin depolarizare, respectiv genereaz potenialul post-sinaptic excitator i potenialul de aciune, cu excitaie consecutiv. Efluxul ionilor de potasiu i influxul ionilor de clor determin hiperpolarizare, respectiv potenial postsinaptic inhibitor.

290

(depolarizare)

(hiperpolarizare)

Permeabilizarea membranelor prin medicamente, cu translocarea ionic consecutiv: A depolarizare i generarea potenialului excitator (PPE); B hiperpolarizare, potenial postsinaptic inhibitor (PPI) Canalele membranare sunt prevzute cu mecanisme de poart, care pot fi manevrate prin influene electrice sau chimice. Astfel depolarizarea este recepionat de un senzor de voltaj i poate comanda deschiderea canalelor, exemple sunt canalele de calciu voltaj dependente. Canalele dispun, de asemenea, de locuri de legare specifice pentru anumite molecule, reprezentnd senzori chimici. Asemenea molecule pot determina, direct sau prin intermediul unor mecanisme receptoare, deschiderea sau nchiderea, modificnd procesele de translocare ionic, cu consecine funcionale. Diferii compui endogeni, medicamente, toxice, acioneaz asupra canalelor membranare, astfel, acetil colina deschide canalele pentru Na+ i K+ de la nivelul plcii motorii, ca urmare a acionrii receptorilor colinergici nicotinici; consecutiv, este stimulat musculatura striat. GABA acioneaz receptorii GABAA i deschide canalele pentru Cl- la nivelul unor neuroni din SNC, cu inhibiie consecutiv; benzodiazepinele favorizeaz acest fenomen, ceea ce explic efectul tranchilizant. Blocantele canalelor calciului i datoresc efectele farmacologice blocrii canalelor calciului de tip L (voltaj-dependente).Unele antiepileptice, unele antiaritmice, amiloridul (un diuretic) blocheaz canale ale sodiului.. Mecanismele transportoare specifice sunt o alt modalitate, care asigur trecerea prin membrane a ionilor i altor molecule. Din aceast categorie fac parte pompele ionice, care funcioneaz specific pentru anumii ioni, transportndu-i cu consum de energie mpotriva gradientului de concentraie. Pompa de sodiu / potasiu i pompa de calciu sunt ATP-aze specifice sensibile la ionii respectivi, care menin concentraia fiziologic a acestora. Glicozidele cardiace, de exemplu modific funcia acestor pompe la nivelul miocardului. Pompa protonic asigur secreia ionilor de hidrogen de ctre celulele parietale din mucoasa gastric, respectiv formarea acidului clorhidric. Omeprazolul blocheaz aceast pomp i mpiedic secreia acid.
291

Aciunile medicamentelor la nivelul unor organite celulare Anumite molecule endogene i medicamente i datoresc efectele aciunii la nivelul nucleului celular. Astfel glucocorticoizii, steroizii sexuali, vitamina D acioneaz asupra unor receptori nucleari, funcionnd ca factori de transcripie. Unele anticanceroase i datoresc citotoxicitatea afectrii directe a ADN sau mpiedicrii sintezei de novo a acestora. Ribozomii, sediu al sintezei proteice, pot suferi influene medicamentoase. Anumite antibiotice, de exemplu, interfereaz funcia ribozomilor bacterieni. Formaiunile veziculare sau granulare de depozit din anumite celule (cele din terminaiile presinaptice, care conin neurotransmitori, cele din mastocit, macrofage, bazofile, care conin anumite autacoide) pot fi influenate medicamentos. Astfel, efedrina i amfetamina elibereaz noradrenalina din terminaiile adrenergice, avnd efecte simpatomimetice, guanetidina mpiedic eliberarea noradrenalinei, provocnd bloc presinaptic, toxina botulinic paralizeaz terminaiile colinergice, deoarece mpiedic eliberarea acetilcolinei. Cromoglicatul disodic i ketotifenul mpiedic degranularea mastocitelor, cu consecine antialergice. Aciunea medicamentelor la nivelul unor sisteme de reglare Medicamentele i pot datora efectul modificrii contolului nervos, umoral sau hormonal a funciei structurii efectoare. Sinapsa ca loc de aciune a medicamentelor Sinapsele sunt deosebit de sensibile la influene chimice, datorit existenei neurotransmitorilor. Toate etapele dispoziiei biochimice i fiziologice a neurotransmitorilor sunt susceptibile la influene medicamentoase: sinteza neurotransmitorilor, depozitarea acestora n formaiuni veziculare sau granulare presinaptice, eliberarea n fanta sinaptic de ctre impulsul nervos, acionarea receptorilor specifici situai ndeosebi postsinaptic, inactivarea neurotransmitorilor prin metabolizare i/sau captare tisular. Aciunile medicamentoase sunt specifice, n funcie de neurotransmitorii respectivi. Se pot da numeroase exemple de medicamente a cror efecte se datoresc interferrii dispoziiei neurotransmitorilor. Astel levodopa favorizeaz sinteza dopaminei n sistemul nervos central, ceea ce este avantajos n Parkinson, boal caracterizat prin deficit de dopamin n anumite formaiuni din creier. Medicamente stimulante ale terminaiilor adrenergice, de felul efedrinei, elibereaz noradrenalina, dup cum guanetidina mpiedic eliberarea acestui neurotransmitor; consecutiv prima crete presiunea arterial, pe cnd cea de a doua o scade. Multe medicamente acioneaz sau blocheaz receptori specifici ai neurotransmitorilor. Pilocarpina i alte parasimpatomimetice stimuleaz receptorii colinergici muscarinici, iar atropina i celelalte parasimpatolitice i blocheaz. Salbutamolul este un stimulant beta2-adrenergic, pe cnd propanololul blocheaz receptorii betaadrenergici. Suxametoniul este un curarizant agonist la nivelul receptorilor colinergici nicotinici de pe placa motorie, iar tubocurarina blocheaz aceti receptori. Neurolepticele i datoresc efectele nervos centrale blocrii unor receptori ai dopaminei sau ai serotoninei n creier. Benzodiazepinele au proprieti tranchilizante ca urmare a facilitrii aciunii GABA
292

asupra receptorilor GABAA. Unele antidepresive acioneaz prin mpiedicarea recaptrii noradrenalinei i serotoninei n anumite sinapse din creier, dup cum alte antidepresive acioneaz prin blocarea MAO, respectiv mpiedicarea inactivrii metabolice a acestor neurotransmitori n sinapsele centrale. Aciunile la nivelul sistemelor autacoizilor Autacoizii sunt substane tisulare active local, care intervin n variate fenomene fiziologice i fiziopatologice. n aceast categorie pot fi ncadrate: histamina, serotonina, bradikinina, angiotensina II, prostaglandinele, leucotrienele, oxidul nitric i endotelina.Parte din autacoizi au de asemenea funcie de neurotransmitori, unii au, pe lng aciunile locale i aciuni la distan. O serie de medicamente au aciuni asemntoare celor produse de autacoizi sau acioneaz antagonist. Cteva exemple sunt: antihistaminicele antialergice i cele inhibitoare ale secreiei gastrice, inhibitorii enzimei de conversie, care mpiedic formarea angiotensinei II, avnd efect antihipertensiv, unele prostaglandine i anologi ai acestora folosii ca antiulceroase, vasodilatatoare. Antiinflamatoarele nesteroidiene i datoresc n mare parte efectele dorite terapeutic, ca i reaciile adverse, mpiedicrii sintezei prostaglandinelor. Aciunile medicamentelor la nivelul controlului hormonal Hormonii sunt substane endogene secretate de glandele endocrine, care acioneaz la distan, reglnd funciile anumitor celule i contribuind la integrarea lor n complexul organismului ntreg. Efectele hormonilor se datoresc acionrii unor receptori specifici la nivelul celulelor int. Insulina, de exemplu, acioneaz receptori-enzime cu funcie proteinkinazic, adrenalina acioneaz receptori cuplai cu proteine G, glucocorticoizii i steroizii sexuali acioneaz receptori nucleari, funcionnd ca factori de transcripie. Hormonii folosii ca medicament pot fi indicai ca medicaie de substituie, de exemplu insulina n diabet sau levotiroxina n insuficiena tiroidian. Anumii hormoni au proprieti farmacologice distincte, care pot fi utile terapeutic, de exemplu glucocorticoizii au aciune antiinflamatoare intens, de asemenea inhib procesele imune. O serie de compui semisintetici sau sintetici, mai mult sau mai puin nrudii cu hormonii naturali, sunt folosii n locul acestora, cu anumite avantaje (exemple sunt glucocorticoizii sau progestativele de sintez). Ali compui se comport antagonist, fiind indicai pentru tratamentul hiperfunciei unor glande endocrine, de exemplu antitiroidienele de sintez sau diferii antagoniti ai hormonilor sexuali. Aciunile medicamentelor asupra aparatelor efectoare Funcia aparatelor efectoare poate fi influenat medicamentos prin modificarea contolului vegetativ i umoral-hormonal al acestora i prin aciune direct asupra celulelor componente - celule musculare, celule glandulare. Bronhodilataia, de exemplu, care este util la astmatici, poate fi produs prin stimulante beta2-adrenergice, prin anticolinergice, ca i prin bronhodilatatoare musculotrope de felul
293

teofilinei. Secreia gastric de acid clorhidric poate fi inhibat prin antihistaminice blocante ale receptorilor protonilor, prin anticolinergice i prin omeprazol, care acioneaz direct asupra celulelor parietale, blocnd pompa protonic responsabil de secreia ionilor de hidrogen. Efectele medicamentelor asupra organismului ca un ntreg Efectele globale ale medicametelor evideniate asupra organismului n ansamblu sunt rezultanta aciunii primare i a tuturor reaciilor i contrareaciilor, care urmeaz acesteia. Intervin reglri de tip retroaferent, fenomene compensatorii, reflexe i reacii umoralehormonale, care imprim o mare complexitate manifestrilor integrate ale organismului. O serie de variabile care in de individ - factori fizici, factori fiziopatologici, variabilitatea biologic i de medicament, pot influena efectele farmacologice. Factori fiziologici, fiziopatologici i medicamentoi care pot influena efectele farmacologice Greutatea i dimensiunea corporal sunt factori care influeneaz concentraia medicamentului la locul de aciune.Pentru aceasta, n cazul anumitor medicamente i mai ales la copii, doza se calculeaz n funcie de greutatea sau de suprafaa corporal. Trebuie avut n vedere c la persoanele foarte slabe i pentru obezi intervin deosebiri mari privind volumul lichidian, ceea ce impune corectarea dozei. La cei slabi volumul lichidian reprezint circa 70% din greutate, la obezi circa 50%, de aceea concentraiile realizate de medicamente sunt mai mici la primii i mai mari la ultimii; corespunztor la subponderali dozele trebuie s fie mai mari dect la supraponderali. Excepie fac substanele care se acumuleaz n esutul adipos, de exemplu anestezicele generale, pentru care dozele trebuie s fie mai mari la obezi. Vrsta exercit influene de ordin cantitativ, legate de diferene n greutatea corporal, care sunt relevante la copii. Intervin, de asemenea, influene calitative, determinate ndeosebi de procesele de epurare a medicamentelor, n parte deficitare la copii mici i la vrstnici. Exist i o reactivitate diferit a copiilor i btrnilor la anumite medicamente. Starea funcional poate modifica reacia la medicamente. n general, cu ct un sistem funcioneaz mai intens, cu att efectul substanelor care l deprim este mai puternic, relaxantele musculare de exemplu sunt mai active cnd muchii sunt spastici.Efectele sunt de asemenea mai evidente atunci cnd se exercit n acelai sens cu tendinele fiziologice, de exemplu, hipnoticele sunt mai active seara la culcare, antipireticele atunci cnd febra tinde s scad n mod spontan. Disponibilitatea funcional a sistemului acionat de medicament poate fi determinant (sulfamidele antidiabetice de exemplu sunt ineficace cnd pancreasul endocrin este epuizat n diabetul juvenil). Sarcina poart riscul aciunilor dismorfogene proprii anumitor medicamente, dup cum substanele ocitocite pot provoca avort, natere prematur sau accidente obstetricale. Strile patologice condiioneaz uneori efectul medicamentelor.De exemplu, tonicele cardiace cresc debitul cardiac i realizeaz compensarea n condiii de insuficien cardiac, diureticele sunt mai active n prezena edemelor, antiaritmicele i pot exercita aciunea numai n prezena aritmiilor. n plus, strile patologice pot modifica efectele medicamentelor, interfernd dispoziia lor n organism sau influennd reactivitatea tisular. De exemplu,
294

insuficiena renal sau insuficiena hepatic avansat limiteaz epurarea i favorizeaz toxicitatea cumulativ pentru unele medicamente. Hipertiroidienii sunt foarte sensibili la catecolamine (reacii adverse cardiace sunt frecvente), dar rspund slab la digoxin. Influene de ordin psihic pot fi deosebit de importante la om. Efectul placebo este definit ca efectul de ordin psihic al oricrei substane sau procedeu terapeutic, care survine independent sau puin dependent de efectele farmacologice propriu-zise. Fenomenul se datorete sugestiei sau autosugestiei. El este mai semnificativ atunci cnd se refer la simptome subiective de felul anxietii sau durerii, ca i la simptome pentru care contolul vegetativ sau hormonal este important, de felul suferinei epigastrice provocat de hipersecreia acid sau al hipertensiunii arteriale. Efectul placebo este avantajos n condiii terapeutice i trebuie cultivat de ctre medic pentru a ntri efectul farmacologic propriu-zis. Expunerea anterioar la medicamente poate modifica reacia organismului. Tratamentul ndelungat cu anumite substane-analgezice morfinice, hipnotice, determin scderea progresiv a eficacitii, dezvoltnd starea de toleran. Administrarea repetat la intervale scurte de cteva doze de efedrin dezvolt tahifilaxie, adic o stare de toleran acut. Asocierea medicamentelor, uzual n practica terapeutic, poate determina interaciuni semnificative clinic. Acestea se datoresc unor interferene de ordin farmacocinetic sau farmacodinamic. Interaciunile de ordin farmacocinetic se refer la procesele de absoebie, la distribuia sau la epurarea medicamentelor. Interaciunile farmacodinamice se pot exercita la nivel molecular.Efectele a dou substane parasimpatomimetice, de exemplu, sunt aditive, deoarece se exercit asupra acelorai receptori colinergici muscarinici; dou antiinflamatoare nesteroidiene asociate acioneaz de asemenea aditiv, deoarece ambele inhib ciclooxigenaza i mpiedic formarea prostaglandinelor, ceea ce reprezint mecanismul de aciune comun. Asemenea asociaii nu sunt raionale. Pilocarpina i atropina au efecte antagonice, deoarece prima acioneaz receptorii colinergici muscarinici iar cea de-a doua i blocheaz competitiv. Asemenea asociaie este de regul contraindicat, cu excepia situaiilor de intoxicaie acut. Alte interaciuni farmacodinamice se exercit la nivelul unor sisteme anatomo-fiziologice. Parasimpatomimeticele i blocantele beta-adrenergice provoac bronhoconstricie aditiv, cunoscut fiind faptul c broniile sunt inervate colinergic i relaxate de ctre catecolamine. Deprimarea central provocat de neuroleptice favorizeaz efectul altor deprimante, anestezice generale, hipnotice, analgezice opioide. Acest ultim tip de interaciune poart numele de potenare, deoarece efectul global este mai mare dect suma efectelor pariale. Variabilitatea biologic, relaiile ntre doz i frecvena efectului farmacologic ntr-o populaie Variabilitatea biologic este proprie diferitelor specii sau inter-individual.In cazul medicamentelor ea se datorete profilului farmacocinetic sau reactivitii tisulare particulare. Determinismul este genetic. Variaiile individuale pot fi exprimate matematic i reprezentate grafic. Pentru aceasta se folosesc colectiviti la care se nregistreaz procentul de indivizi care reacioneaz printr-un
295

rspuns cuantal, de tip tot sau nimic, la doze crescnde de medicament. Curba doz / efect exprim n acest caz frecvena (nu intensitatea) efectului n populaia respectiv. Distribuia normal a frecvenei rspunsurilor individuale n funcie de doz construiete o curb simetric n form de clopot, curba Gauss. Majoritatea indivizilor din populaia studiat sunt ngrmdii n jurul poriunii superioare centrale a clopotului, la mijlocul creia se situeaz doza eficace medie-DE50, respectiv doza toxic medie sau doza letal medie-DT50, DL50. Dispersia n jurul mediei exprim variabilitatea rspunsului n lotul i fa de substana respectiv. Curba distribuiei frecvenei se poate construi integral pentru fiecare doz, nregistrnd sumat procentul de indivizi care rspund la doza respectiv i la toate dozele mai mici. Se realizeaz n acest caz o curb sigmoid, mai uor de mnuit, care nregistreaz distribuia cumulativ a frecvenei rspunsurilor individuale. Asemenea curbe ilustreaz cantitativ eficacitatea terapeutic i riscul toxic n condiiile folosirii clinice a medicamentelor, administrate n doze diferite la un numr mare de bolnavi, fiecare cu o individualitate proprie. DE50, pentru un medicament, exprim cantitatea potrivit terapeutic pentru majoritatea persoanelor. Trebuie ns avut n vedere c la extremitile curbei se gsesc persoane, relativ puine, care sunt mai sensibile, respectiv mai puin sensibile, necesitnd doze ceva mai mici sau ceva mai mari dect cele uzuale.Acesta este un argument puternic pentru importana observaiei clinice.Trebuie avut n vedere c parametrii farmacologici au valoarea orientativ, deoarece reprezint valori medii stabilite n situaii standard i nu valori individuale manifestate n situaii particulare. Frecven raspuns %

log doz Curba Gauss a distribuiei normale a frecvenei rspunsurilor individuale (d = unitate de deviaie standard fa de valoarea medie) Farmacotoxicologia Farmacotoxicologia are drept obiect studiul efectelor duntoare ale medicamentelor. Intoxicaiile medicamentoase Supradozarea medicamentelor produce intoxicaii acute sau cronice. Toxicitatea se evalueaz experimental i se cuantific prin stabilirea dozei care intoxic sau ucide 50% din animalele testate, definind astfel DT50 , respectiv DL50.

296

Intoxicaiile acute medicamentoase ocup un loc important n patologia uman. Printre medicamentele incriminate curent n asemenea intoxicaii sunt benzodiazepinele, barbituricele, antidepresivele, neurolepticele i ndeosebi, diverse asociaii medicamentoase, incluznd deprimante ale sistemului nervos central. Tratamentul intoxicaiilor acute const n msuri nespecifice, care urmresc, pe de o parte micorarea cantitii toxice din organism, pe de alta tratamentul simptomatic i susinerea funciilor vitale. Pentru ndeprtarea toxicului, dup caz, se fac splturi, se provoac vom, se administreaz purgative i /sau diuretice, la nevoie se dace dializa. Tratamentul simptomatic se adreseaz unor manifestri suprtoare sau duntoare - stare de excitaie, convulsii, sedare excesiv mergnd pn la com, vom, colici, diaree. Susinerea funciilor vitale, mai ales respiraia i circulaia presupune, de regul, ngrijirea intensiv ntr-un serviciu de reanimare. n unele cazuri este posibil i necesar tratamentul specific antidotic. Antidoturile sunt substane capabile s combat n mod electiv fenomenele toxice produse de anumite medicamente. Ele acioneaz fie prin mecanism farmacologic - aciuni contrarii la nivelul unor sisteme fiziologice sau antagonism competitiv la nivelul unor receptori specifici, fie prin mecanisme chimice, de exemplu inactivarea unor metale toxice prin chelare. Dintre antidoturile mai cunoscute sunt: nalorfina n intoxicaia cu morfina i alte opioide, atropina i obidoxima n intoxicaia cu anticolinesterazice, fitomenadiona n intoxicaia cu anticoagulante cumarinice. Intoxicaiile cronice apar n condiiile administrrii repetate de doze mari i se datoresc acumulrii de cantiti toxice de medicament. Reaciile adverse la medicamente Reaciile adverse se definesc ca fenomene nocive, care apar la dozele uzuale de medicament. Frecvena n condiii de spitalizare este n medie de 15%, dar variaiile sunt foarte mari. Btrnii, copiii, femeile nsrcinate prezint un risc foarte mare. Principalele simptome se situeaz, n ordinea descrescnd a frecvenei, la nivelul pielii, tubului digestiv, sistemului nervos central, sngelui aparatului circulator. Dup mecanismul lor, reaciile adverse pot fi de tip toxic, de tip idiosincrazic i de tip alergic.Un loc aparte l ocup dependena. Reaciile adverse de tip toxic Reaciile adverse de tip toxic sunt dependente de doz, apar n condiii de supradozare relativ, frecvena i intensitatea crete cu doza.Se manifest prin tulburri funcionale, eventual leziuni la nivelul unor aparate i sisteme. Factorii care fac ca dozele uzuale s provoace fenomene toxice in de bolnav i de produsul farmaceutic. Dintre factorii dependeni de bolnavi se pot enumera: -reactivitatea biologic individual; -insuficiena organelor responsabile de epurare (ficat, rinichi) care grefeaz procesul de inactivare metabolic i /sau eliminare a unor medicamente; -anumite stri patologice de organ sau metabolice, care cresc reactivitatea; exemple sunt miocardul bolnav sau hipokaliemia, care favorizeaz aritmiile.
297

Ali factori favorizani ai reaciilor adverse de tip toxic depind de medicament: -indicele terapeutic mic, respectiv distana mic ntre zona terapeutic i cea toxic, de exemplu n cazul citostaticelor anticanceroase, antibioticelor aminoglicozidice, digoxinei, adrenalinei; -biodisponibilitatea variabil a unor produse farmaceutice, care semnific inechivalena terapeutic, respectiv posibilitatea eficacitii slabe, dar i riscul crescut de reacii adverse toxice pentru dozele uzuale; preparate de digoxin sau fenitoin de exemplu se pot comporta n acest fel; -folosirea nejustificat a unor ci de administrare cu risc toxic mare, de exemplu injeciile, ndeosebi cele intravenoase; este cunoscut riscul mare al injeciilor intravenoase de adrenalin sau aminofilin; -schemele de administrare inadecvate , care pot favoriza reacii adverse de tip toxic mai ales n cazul medicamentelor cu potenial cumulativ mare, de exemplu digitalicele; -anumite interaciuni medicamentoase sunt semnificative prin riscul mare al reaciilor adverse de tip toxic; exemple sunt asociaia halotan-adrenalin (risc de aritmii severe), asociaia anticoagulante cumarinice - acid acetilsalicilic (risc de accidente hemoragice), asociaia antiinflamatorii nesteroidiene - glucocorticoizi (risc crescut de lezare a mucoasei gastrice, mergnd pn la ulcer), asociaia tranchilizante - buturi alcoolice (risc de sedare excesiv). Tipuri particulare de reacii adverse toxice sunt efectele dismorfogene sau teratogene, efectele mutagene i efectele cancerigene. Efectele dismorfogene se manifest prin defecte morfologice la copii, n cazul administrrii medicamentelor la femeile nsrcinate. Cnd defectele sunt majore, avnd caracter de monstruozitate, efectul se numete teratogen. O multitudine de factori favorizeaz efectele dismorfogene i teratogene. Dintre medicamentele cu risc cert sunt citostaticele anticanceroase, unele antiepileptice (mai ales fenitoina i trimetadiona), srurile de litiu, anticoagulantele cumarinice, anumii derivai de vitamin A, ndeosebi izotretinoina, hormonii sexuali androgeni i progestativele cu proprieti androgenice (care pot provoca masculinizarea ftului feminin). Vrsta sarcinii este alt factor major pentru riscul dismorfogen.Sensibilitatea este maxim n primul trimestru de sarcin, mai ales ntre zilele 20 i 40, cnd organogeneza i determinanii ei chimici sunt la apogeu. Efectele dismorfogene, respectiv teratogene sunt relativ rare, dar consecinele pot fi dezastruoase. Aceasta impune o serie de msuri profilactice, printre care: -evitarea, n msura posibilului, a medicamentelor n timpul sarcinii, mai ales n primul trimestru; -dac se impune folosirea anumitor medicamente n timpul sarcinii, acestea se administreaz n dozele cele mai mici eficace; -incompatibilitatea ntre sarcin i medicamente cu risc dismorfogen indispensabile n anumite situaii clinice, oblig la evitarea sarcinii (prin mijloace contraceptive) sau la ntreruperea acesteia. Efectele mutagene au drept consecin modificri permanente ale fenotipului, care ulterior, chiar dup mai multe generaii, pot determina afectarea fenotipului manifestat prin
298

diferite boli genetice. Exemple de medicamente cu risc mutagen cert sunt: citostaticele anticanceroase i imunodepresive, unele antiepileptice, unele neuroleptice, metronidazolul, pesticidele organofosforice. Reglementrile actuale interzic introducerea n terapeutic a medicamentelor cu risc mutagen, cu excepia celor care sunt indispensabile n anumite situaii, de exemplu citostaticele la bolnavii neoplazici. Exist riscul ca unele substane s iniieze sau s promoveze dezvoltarea cancerului. Uretanul, agenii alchilani citostatici, DDT-ul sunt exemple de compui, care n anumite condiii au proprieti cancerigene. Substanele cancerigene sunt de regul proscrise; atunci cnd folosirea lor nu poate fi evitat, ele trebuie administrate sub control medical riguros. Reaciile adverse idiosincrazice Reaciile adverse idiosincrazice sunt independente de doz. Ele difer calitativ de efectele uzuale ale medicamentelor sau apar la doze obinuit lipsite de nocivitate. Reaciile idiosincrazice se datoresc fie modificrii unor procese de biotransformare a medicamentelor, fie unei reactiviti tisulare neobinuite. Determinismul este genetic i se refer la modificri ale sintezei unor proteine specifice, de regul proteine enzimatice. n stadiul actual sunt relativ puine fenomene idiosincrazice cu substrat genetic i biochimic elucidat. Un exemplu de reacie idiosincrazic datorit unei anomalii de metabolizare este apneea de tip toxic, care se produce la doze mici de suxametoniu, un ester al colinei cu proprieti curarizante. Proporia n populaie a persoanelor cu asemenea reactivitate este de circa 0,25. Fenomenul se explic prin existena unei colinesteraze plasmatice atipice cu capacitate redus de a hidroliza i inactiva curarizantul. Un exemplu de tulburare idiosincrazic datorit unei reactiviti tisulare neobinuite este hemoliza, pe care o provoac la unele persoane dozele obinuite de primachin, chinin, acid nalidixic, fenacetina i alte cteva medicamente. Reaciile adverse alergice Reaciile adverse alergice sunt efecte nocive ale medicamentelor, care au un mecanism imun. Ele sunt independente de doz, pot aprea la doze foarte mici, deoarece presupun o sensibilizare prealabil. Frecvena general a reaciilor alergice la medicamente se situeaz n jur de 10%. S-a descris o predispoziie, care este probabil determinat genetic. Sensibilizarea alergic se dezvolt de obicei dup 5-14 zile de la prima administrare, uneori mai mult n cazul tratamentului continuu. Ricul este mai mare pentru administrarea local i mai mic pentru administrarea oral. Alergia este specific la o anumit substan, dar poate cuprinde i compui nrudii structural - reaciile sunt de exemplu comune pentru toate penicilinele. Pentru dezvoltarea alergiei este necesar ca medicamentul, n general cu molecul mic, s formeze conjugai prin legarea covalent de o polipeptid sau protein din organism. Uneori determinantul antigenic este un metabolit al medicamentului, de exemplu derivai peniciloil pentru peniciline.

299

Organismul, odat sensibilizat, este capabil s rspund prin simptome tipice de alergie la cantiti foarte mici de antigen. Exist 4 tipuri de reacii alergice, care difer prin mecanism i prin manifestrile clinice. Reaciile alergice de tip anafilactic (tip I) sunt reacii de cuplarea antigenului cu IgE, care acoper suprafaa mastocitelor sau leucocitelor bazofile. Consecutiv sunt eliberai din aceste celule anumii autacoizi, printre care histamina, prostaglandine, leucotriene, responsabile de efectul alergic. Fenomenele alergice de acest tip au verigi comune cu inflamaia. Ele se manifest prin vasodilataie, eventual hipotensiune, permeabilizare capilar, edeme, bronhospasm. Simptomele caracteristice se ncadreaz n cteva entiti clinice: urticarie, edem angioneurotic, rinit seroas, astm bronic; sindromul cel mai acut i spectaculos este ocul anafilactic, care poate fi letal. Penicilinele i acidul acetilsalicilic sunt exemple de medicamente cu risc mare de reacii alergice anafilactice.

Reacie II) se anafilactic (I) Reaciile alergice de tip citotoxic (tip de tip datoresc formrii de anticorpi IgG i IgM direcionai specific asupra unor celule purttoare ale haptenei medicamentoase. Aa se explic anemiile hemolitice sau trombocitopeniile imune produse de chinin, chinidin, sulfamide, ca i granulocitopenia la derivaii pirazolici de felul aminofenazonei sau la tioamidele antitiroidiene. O categorie particular a alergiei de tip II sunt reaciile citotoxice autoimune. n cazul reaciilor autoimune, sub influena unor medicamente se formeaz antigeni nativi pe suprafaa anumitor celule. Exemple sunt anemia hemolitic la metildopa sau sindromul lupoid produs de hidralazine, sulfasalazin, beta-blocante.

300

Reacie de tip citotoxic (II) Reacii alergice prin complexe imune (tip III) se datoresc unor complexe solubile formate de antigen i anticorpi circulani (IgG, mai rar IgM). Acetia se fixeaz n pereii vaselor mici i membranele bazale, activnd complementul i genernd procese inflamatorii. Manifestrile clinice mai frecvente sunt boala serului i edemul Quinke, vascularitele, pneumonia cu precipitine. Printre medicamentele incriminate sunt penicilinele i sulfamidele. O modalitate particular de manifestare a vascularitei prin complexe imune sunt reaciile cutanate grave de felul eritemului polimorf, sindromului Stevens-Johnson sau sindromul Lyell, care survin rareori n cursul tratamentului cu peniciline, barbiturice, fenilbutazon, fenitoin.

Reacie prin complexe imune (III) Reaciile alergice ntrziate, mediate celular (tip IV), se datoresc limfocitelor sensibilizate, care elibereaz limfokine generatoare de infiltrate macrocelulare perivenulare. Exemple sunt dermatita de contact la unele antibiotice sau fotoalergia medicamentoas.

301

Reacie de tip celular sau ntrziat (IV) Principalul mijloc de profilaxie a alergiei medicamentoase este anamneza. Utilitatea testelor cutanate i a unor teste de laborator este limitat. Evitarea sensibilizrii alergice presupune, n primul rnd, folosirea cu mult discernmnt a substanelor cu risc mare i evitarea aplicrii locale a acestora. Cnd alergia la un medicament este cunoscut se recomand evitarea acestuia i a substanelor nrudite chimic. Dac apar manifestri alergice medicaia cauzatoare se ntrerupe. n situaii speciale se poate ncerca desensibilizarea specific. Alergiile medicamentoase se trateaz, dup caz, cu antihistaminice, utile n formele uoare, moderate ale alergiilor de tip anafilactic, glucocorticoizii, utili n toate tipurile de alergie, dar n general rezervai manifestrilor severe i adrenalina, care este indispensabil n ocul anafilactic. n caz de bronhospasm alergic se administreaz bronhodilatatoare, cromoglicat sau ketotifen (inhibitori ai degranulrii mastocitelor), glucocorticoizi inhalatori, la nevoie glucocorticoizi sistemici. Dependena Dependena medicamentoas, adicia sau toxicomania este o stare de intoxicaie cronic caracterizat prin necesitatea constrngtoare de folosire a unor substane medicamentoase sau toxice. Ea se caracterizeaz sub forma ei complet, prin patru trsturi definitorii: -dependena psihic, adic necesitatea de ordin psihologic de a folosi un anumit medicament sau toxic; -tolerana, adic diminuarea progresiv a efectului la repetarea administrrii, respectiv necesitatea creterii dozei pentru a obine efectul scontat; -dependena fizic, care const n necesitatea de a continua folosirea substanei respective pentru a evita tulburrile, uneori grave, care apar la ntreruperea administrrii i sunt cunoscute sub denumirea de sindrom de abstinen; -psihotoxicitatea. Substanele capabile s provoace dependen au, de cele mai multe ori, aciuni psihofarmacologice: euforizant, linititoare, stimulant psihomotorie, halucinogen. Principalele substane cu potenial de dependen sunt: morfina, heroina i alte opioide,
302

amfetaminele, cocaina, alcoolul etilic, barbituricele i alte hipnotice, benzodiazepinele i alte tranchilizante, canabinoidele (marijuana, hai) i, n msur mai mic, nicotina (tutunul) i cafeina (cafeaua). Dependena psihic este favorizat de beneficiul therapeutic: calmarea durerii, nlturarea anxietii, de efectele psihice proprii substanei respective i de fenomenul de condiionare a administrrii.O anumit reactivitate individual determinat genetic, ca i intervenia unor factori de ordin social pot motiva, de asemenea, dependena. Morfina, heroina, alcoolul, barbituricele, benzodiazepinele, cocaina, amfetamina au potenial mare de dependen psihic; pentru canabinoide, tutun i cafea potenialul este relativ mic. Administrarea repetat a unor medicamente sau toxice poate dezvolta tolerana i dependena fizic. Procesul este favorizat de prezena continu a unei concentraii mari de substan activ la nivelul esuturilor. Fenomenul prezint specificitate chimic i /sau farmacodinamic. Tolerana i dependena sunt ncruciate, pentru diferitele opioide de tip morfinic sau pentru alcool, barbiturice i n parte pentru benzodiazepinele tranchilizante. Tolerana apare mai ales pentru efectele centrale cu caracter subiectiv, mai puin pentru cele periferice. Doza letal este modificat diferit n funcie de categoria de substane, crete mult pentru opioide, este puin sau total modificat pentru alcool, barbiturice i benzodiazepine. Dup oprirea administrrii, sensibilitatea normal revine n cteva zile. Ca mecanism, tolerana are obinuit o semnificaie farmacodinamic, se dezvolt progresiv procese adaptative de sens contrar interveniei medicamentului sau toxicului respectiv. Uneori contribuie i interferene de ordin farmacocinetic, ndeosebi creterea procesului de inactivare metabolic, de exemplu prin autoinducia enzimatic produs de barbiturice. Bolnavul care a folosit repetat morfin sau alte opioide asemntoare, barbiturice, benzodiazepine, buturi alcoolice, prezint la ntreruperea administrrii un sindrom characteristic, sindromul de abstinen, care marcheaz dependena fizic, oblignd la continuarea administrrii. Sindromul de abstinen difer pentru diversele categorii de substane capabile de a dezvolta dependen; se descriu de exemplu un sindrom de abstinen propriu opioidelor, altul de tip alcool-barbiturice. Majoritatea simptomelor corespund unor efecte inverse celor produse de medicamentele sau toxicele respective. Aceasta sugereaz c n cursul administrrii repetate se dezvolt fenomene adaptative contrare, care ramn fr contrapondere la ntreruperea administrrii. Sindromul de abstinen este mai grav n cazul substanelor cu aciune intens i de durat relativ scurt, cum sunt morfina sau heroina. Antagonitii specifici, de exemplu naloxona n cazul morfinei, administrai la persoanele dependente declaneaz repede un sindrom de abstinen sever, datorit mpiedicrii aciunii caracteristice a drogului respectiv. Dintre substanele cu potenial mare de toleran i dependen fizic sunt morfina, barbituricele, benzodiazepinele i alcoolul; potenialul este mic pentru amfetamine, canabinoide, tutun i cafea. Psihotoxicitatea, cea de a patra caracteristic a dependenei, se manifest prin tulburari de comportament, uneori cu caracter psihotic. Acestea apar n condiiile folosirii ndelungate i abuzive de doze mari de barbiturice i alcool, amfetamine, cocain.

303

Tratamentul dependenei este foarte dificil datorit ntreptrunderii celor trei factori etiopatogenici: medicament psihotrop, teren psihic, condiii sociale favorizante. Sunt necesare, n primul rnd, msuri profilactice: aciuni educative, folosirea judicioas a medicamentelor cu risc, reglementri riguroase privind asemenea substane (cunoscute n legislaia noastr sub denumirea de ,,stupefiante). Tratamentul curativ se face n condiii de spitalizare, sub supraveghere. Pot fi utile, dup caz: medicamente psihotrope, care nltur fenomenele psihice favorizante ale dependenei, substane care atenueaz sindromul de dependen (de exemplu metadona pentru morfin sau heroin), substane care provoac aversiune (cum este disulfiramul n cazul intoxicaiei alcoolice). Analgezice-antipiretice, antiinflamatoare nesteroidiene Derivaii acidului salicilic Structura chimic n terapeutic se utilizeaz: salicilatul de sodiu, salicilatul de metil (Saliform), acidul acetilsalicilic (Aspirina), salicilamida (Salizol).
COONa COOCH 3 COOH CONH 2

OH

OH

OCOCH 3

OH

salicilat de sodiu

salicilat de metil

acid acetilsalicilic

salicilamida

Proprieti fizico-chimice Salicilatul de sodiu, salicilamida i acidul acetilsalicilic sunt pulberi albe cristaline, cu gust uor acid. Salicilatul de sodiu este uor solubil n ap, acidul acetilsalicilic este greu solubil n ap (1%), dar solubil n solveni organici. Salicilamida este solubil n ap la fierbere i n solveni organici. Salicilatul de metil este un lichid uleios, incolor, cu miros aromatic, insolubil n ap, solubil n alcool. Etiologia intoxicaiilor Intoxicaiile acute au loc cel mai frecvent cu aspirin. ntrebuinarea ndelungat i abuziv a derivailor salicilici poate genera fenomene de intoxicaie cronic. Intoxicaiile voluntare (sinucideri) se produc cu aspirin, cu mare frecven, n Europa i America i cu salicilat de metil n unele regiuni din Africa i Asia. Intoxicaiile accidentale propriu-zise, survin la copii, reprezentnd pn la 15% din intoxicaiile medicamenoase n unele ri i se produc mai ales cu aspirin efervescent. Intoxicaiile terapeutice, au loc prin hipersensibilitate sau prin supradozare. n ultimul caz, accidentul poate fi determinat de: doza masiv, funcia renal afectat (acumulare toxic), predispoziie local sau general (ulcer, ciroz hepatic) sau ingerare concomitent a mai multor preparate cu derivai salicilici. La copil, accidentele terapeutice sunt mai frecvente i mai grave i se explic prin particularitile morfo-funcionale ale rinichiului la copil, care determin o eliminare mai lent i mai labil. Totodat, chiar doze normale de aspirin pot
304

provoca salicilemii crescute la febrili i deshidratai, din cauza scderii fluxului sanguin i a pH-ului urinar, cu ncetinirea eliminrii renale. Ptrundere, distribuie, metabolizare, depozitare, eliminare Derivaii salicilici sunt absorbii pe toate cile. Pe cale digestiv, absorbia are loc n stomac i n primul segment din intestinul subire, cnd salicilaii se gsesc sub form neionizat, liposolubil, putnd strbate membranele celulare. n intestin, salicilaii sunt ionizai la pH alcalin, iar reabsorbia este mpiedicat. n acest mod se explic frecvena redus a eroziunilor mucoasei intestinale, precum i mai buna tolerare a aspirinei tamponate. n snge, ionul salicilat circul sub form liber i sub form legat de proteinele plasmatice, ambele forme fiind n echilibru dinamic. Dup absorbie, ionul salicilat este distribuit rapid n toate esuturile i lichidele organismului, traversnd i bariera placentar. Hidroliza derivailor salicilici, cu excepia salicilamidei care nu sufer hidroliz, are loc n plasm i ficat. Ionul salicilic este responsabil de majoritatea aciunilor farmacologice, totui unele efecte ale aspirinei se datoresc capacitii sale de a acetila proteinele. Acidul salicilic se metabolizeaz prin: conjugare la COOH cu acidul glucuronic i cu glicocolul i la OH cu acidul glucuronic i ntr-o mai mic msur, oxidare la nucleu cu formare de acid gentizic.
COOH CONHCH2 COOH

OH

OH

acid salicilic

acid saliciluric (acid 2-hidroxihipu

acid gentizuric

Salicilamida este conjugat cu acidul glucuronic i n mici cantiti oxidat la nucleu, similar acidului salicilic. Eliminarea renal este relativ lent i are loc prin filtrare glomerular i reabsorbie tubular a ionului salicilat i prin secreie tubular a derivailor conjugai. Eliminarea este
305

favorizat de alcalinizarea urinei datorit reducerii reabsorbiei tubulare; alcalinizarea, are i avantajul creterii eliminrii fraciunii libere, difuzibile a salicilailor. Mecanismul de aciune Aciunea antipiretic-analgezic, antiinflamatoare-antireumatic a derivailor salicilici i recomand n algii de diferite origini, stri febrile, reumatism articular (acut i cronic), stri inflamatorii diverse. Aciunea analgezic a medicamentelor de tip aspirin se explic prin deprimarea SNC, cu ridicarea pragului de percepere a durerii, fr a afecta cortexul i a modifica psihismul, ca analgezicele de tip morfin. Aciunea antipiretic se realizeaz prin influenarea centrului termoregulator, rezultnd o pierdere crescut a temperaturii corporale prin vasodilataie cutanat i stabilindu-se un echilibru ntre producerea i pierderea cldurii echilibru dereglat n strile febrile. Aciunea antiinflamatoare, se realizeaz n mare msur prin inhibarea prostaglandinelor i congenerilor acestora; acelai mecanism st la baza capacitii de antiagregant plachetar al aspirinei datorit creia este utilizat n tratamentul i prevenirea bolilor tromboembolice. a) Prostaglandine, prostacicline, tromboxani Prostaglandinele (PG) sunt compui biologici activi, care conin un ciclopentan i provin din acizii polinesaturai cu 3, 4, 5 duble legturi i 20 de atomi de carbon, ca acidul arahidonic.

Acid arahidonic

PGE2 Dup natura acidului gras polinesaturat, PG se divid n seriile 1, 2, 3, seria 2 provenind de la acidul arahidonic, precursorul PG cel mai abundent la om. Dup structura ciclului pentanic, PG se divid n seriile A, B, C, D, E, F numite i prostaglandine primare.
306

Acizii grai polinesaturai rezult prin scindarea fosfolipidelor din membranele celulare sub aciunea fosfolipazei A2 activat de hormoni vasoactivi ca kinina. Prostaglandinele s formeaz prin conversia acestor acizi grai polinesaturai, cu apariia intermediar a endoperoxizilor ciclici (-OOH n C15) sub aciunea ciclooxigenazei (prostaglandin sintetazei). Capacitatea esuturilor de a converti acizii grai nesaturai n PG variaz ntre 1% i 75%, dar ciclooxigenaza (PG sintetaza) este prezent n toate esuturile. Prostaglandinele nu sunt depozitate n esuturi, ci sunt eliberate imediat dup sintetizare, ca rspuns la diferii stimuli. Degradarea enzimatic a PG se realizeaz rapid prin patru modaliti, cea mai important fiind oxidarea la ceton n C15 sub aciunea prostaglandin-15 hidroxi-dehidrogenazei (PGDH), cu formare de compui cu slab activitate biologic. Printre inhibitorii sintezei PG se nscriu i agenii antiinflamatori nesteroizici de tip aspirin. Ei inhib eliberarea PG din diverse esuturi, ca urmare a blocrii sintezei prin inhibarea ciclooxigenazei (PG sintetazei). Proprietatea de a inhiba aceast enzim este oarecum specific agenilor antiinflamatori de tip aspirin, deoarece enzima nu este inhibat nici de corticoizii puternic antiinflamatori, nici de iyomeri ai acidului salicilic lipsii de efect terapeutic. Inhibiia determinat de aspirineste de tip competitiv ireversibil, n interreacia cu centrul catalitic al enzimei intrnd n prima etap gruparea acetil, iar n etapa urmtoare, salicilatul eliberat prin metabolizarea aspirinei. b) Aciunea antiinflatatoare Se consider c eritemul edemul, durerea, febra din procesele inflamatorii provocate de diveri ageni sunt, cel puin n parte, consecina aciunii unor PG tisulare eliberate n regiunea afectat. Eritemul se produce prin relaxarea musculaturii netede a arteriolelor i venulelor i a ptrunderii elementelor snguine n spaiul interstiial. Edemul este rezultatul contraciei celulelor endoteliale venulare, cu creterea permeabilitii vasculare. Durerea se datorete sensibilizrii regiunii inflamate la aciunea algezic a unor substane endogene ca bradikinina i histamina. Faptul c unele PG, ca de exemplu PGE1, sunt puternic pirogene, explic parial febra asociat procesului inflamator. n afar de aciunea asupra biosintezei PG, mecanismul antiinfamator al derivailor salicilici n boala reumatismal implic i aciuni asupra altor procese celulare i imunologice n esutul mezenchimal i conjunctiv, cum ar fi de pild, afectarea, de ctre salicilai, a compoziie, biosintezei i metabolismului mucopolizaharidelor. c) Aciunea de antiagregant plachetar n esutul vascular, este elaborat, plecnd de la acidul arahidonic, o substan care inhib aglutinarea plachetelor, dezagreg plachetele deja aglutinate i dilat vasele sanguine. Aceast substan a fost numit prostaciclin (PGI2). Dup formarea sa n peretele vascular, PGI2 difuzeaz n circulaie i contribuie la activitatea antiaglutinant a sngelui.
307

Tromboxanul A2, descoperit n trombocite, este un puternic aglutinant plachetar, fiind aadar antagonist PGI2, care este antiaglutinant. Aspirina, prin inhibarea PG sintetazei i deci suprimarea formrii endoperoxizilor ciclici, determin, odat cu inhibarea sintezei PG i inhibarea sintezei celorlali produi rezultai din endoperoxizii ciclici: PGI2 i TxA2. Deoarece inhibarea PG sintetazei este ireversibil, efectul inhibitor dureaz ntreaga via a plachetelor. Efectul de lung durat al aspirinei asupra PG sintetazei plachetare are importante aplicaii terapeutice, n prevenirea i tratarea complicaiilor aterosclerozei. n prevenirea trombozei, este eficace asocierea aspirin dipiridamol. Ambele medicamente cresc cantitatea de AMP ciclic (adenozin 35 monofosfat) n plachete, determinnd scderea agregrii plachetare, ns prin mecanisme diferite: aspirina inhib formarea TxA2 n plachete, facilitnd efectele PGI2 circulante asupra creterii AMP ciclic; dipiridamolul inhib fosfodiesteraza, care degradeaz AMP ciclic, deci mpiedic scderea AMP ciclic. Utilizarea aspirinei este ns complicat de faptul c aceasta inhib, pe lng formarea PG i formarea PGI2 n vasele sanguine. Ciclooxigenaza din peretele vascular este ns mai puin sensibil la aciunea inhibitoare a aspirinei dect ciclooxigenaza plachetar, astfel nct doza de aspirin este decisiv: doze slabe (100mg/zi) sunt suficiente pentru a mpiedica formarea TxA2 de ctre plachete, fr a afecta formarea PGI2 n esutul vascular i probabil n plmni. Adaosul de dipiridamol la dozele slabe de aspirin permite meninerea AMP ciclic plachetar la nivel ridicat, datorat PGI2 . Proprieti toxicologice Doza toxic de derivai salicilici prezint mari variaii individuale. Doze de 3 g/zi pot determina fenomene toxice, n timp ce doze de 10 g/zi pot fi bine suportate. Doza toxic este considerat 15 20 g aspirin la adult i 0,15 g/kg la copil. Doza letal de aspirin este apreciat la 20 30 g, dar se citeaz cazuri care au supravieuit dup ingerarea a 60 g i chiar 130 g aspirin. Salicilatul de metil este cel mai toxic dintre derivaii salicilici: 4 ml (4,7 g) pot determina moartea unui copil. Printre reaciile adverse se nscriu manifestrile: - digestive: greuri, vrsturi, anorexie, iritaia mucoasei gastrointestinale cu producerea hemoragiilor digestive prin mecanisme diferite; - neuropsihice i neurosenzoriale: euforie, bun dispoziie, agitaie psihomotorie, cefalee, tremurturi, datorate excitrii cortexului i a centrilor subcorticali, prin efect direct determinat de concentrarea salicilatului n celula nervoas i prin efect indirect, urmare a epuizrii rezervelor de glucoz din esutul cerebral: hipoacuzie, zgomote n urechi, datorate congestiei i hemoragiei la nivelul aparatului cochlear i a timpanului; reducerea cmpului vizual, viziune colorat, consecinele vasoconstriciei vaselor retiniene; - alergice: erupii cutanate, edeme, febr, n general benigne. La un numr restrns de persoane, pot aprea, la cteva minute dup ingerarea unei singure pastile de aspirin, fenomene de intoleran (hipersensibilitate) ca rinit cu secreie apoas abundent, edem angioneurotic, urticarie, hipotensiune, colaps vasomotor. Alte reacii adverse constau n perturbare de:
308

- Metabolisme: interferarea n metabolismul energetic cu decuplarea fosforilrii oxidative i scderea sintezei compuilor macroergici (ATP) cu multiple consecine, ca: alterarea permeabilitii membranare dependent de cantitatea de energie; scderea sintezei glutaminei, glicogenului care necesit ATP; creterea compensatorie a glicolizei aerobe, a crei energie oxidativ, transformat n energie caloric, se pierde prin tegumente. Derivaii salicilici perturb i metabolismul glucidic, prin scderea cantitii de glicogen hepatic i muscular; inhibarea neoglucogenezei hepatice i creterea folosirii glucozei n esuturile periferice, determin hipoglicemie. - Coagulare: scderea hemostazei plachetare, prin inhibarea PG sintetazei, determin interzicerea aspirinei i medicamentelor similare la pacienii cu afeciuni hepatice grave, hipoprotrombinemie, deficien n vitamina K, hmofilie, deoarece pot rezulta hemoragii. Din acelai motiv, tratamentul cu aspirin trebuie oprit cu o sptmn naintea unei intervenii chirurgicale. De asemenea, trebuie inut seama de faptul c utilizarea aspirinei n timpul tratamentelor de lung durat cu anticoagulani orali poate declana sngerri ale mucoasei gastrointestinale. Simptomatologie Intoxicaia acut cu aspirin i salicilat de sodiu se manifest prin: - Tulburri digestive: vrsturi, arsuri epigastrice, diaree, melen; - Modificarea echilibrului acido bazic: n faza iniial a intoxicaiei, salicilatul stimuleaz centrii respiratori bulbari, determinnd hiperventilaie i polipnee cu alcaloz respiratorie prin eliminare crescut de CO2, la care se adaug alcaloz metabolic provocat de vrsturi. Pentru compensarea alcalozei, rinichiul elimin mari cantiti de bicarbonai de sodiu i potasiu. n intoxicaia grav, salicilatul deprim centrii respiratori bulbari, provocnd hiperventilaie cu acidoz respiratorie prin retenie de CO2, la care se adaug acidoz metabolic determinat de acumularea de acizi organici (datorit inhibrii dehidrogenazelor din ciclul Krebs) i de acizi fosforici i sulfuric (datorit insuficienei renale). Ionul solicitat nu contribuie prin el nsui la acidoz, deoarece concentraia sa ionic este slab chiar la doze toxice. n cazul salicilatului de metil, metanolul eliberat prin hidroliz nu contribuie la agravarea acidozei, deoarece este n cantitate mic. n schimb, prin blocarea oxidrilor celulare de ctre metanol, aprarea organismului mpotriva acidozei din intoxicaia salicilic este sczut. - Tulburri hidroelectrolitice (evideniate prin ionogram) : deshidratare extracelular (pierdere de ap prin hiperventilaie, hipersudoraie, eliminare renal crescut) ; hipernatriemie; hipopotasemie ( prin eliminarea K+ n urin sub form de bicarbonai i prin scderea reabsorbiei sale, datorit alterrii renale). - Tulburri vegetative: vasodilataie cutanat cu transpiraii i hipertermie; - Tulburri neurosenzitive: cefalee, ameeli, surditate trectoare, scderea acuitii vizuale, fotofobie, agitaie, delir, uneori halucinaii vizuale i auditive, com cu midriaz sau mioz. Pot aprea complicaii: insuficien renal acut, edem pulmonar acut, hemoragii digestive. Moartea poate surveni prin colaps cardiovascular.
309

Intoxicaia cu salicilat de metil, survenit n special la copii, nu difer mult de intoxicaia cu aspirin. Caracteristice sunt tulburrile nervoase, hiperpneea, hiperpirexia. n intoxicaia cu acid salicilic, predomin manifestrile digestive, datorate aciunii iritante locale a acidului salicilic. Tratament - spltur gastric cu suspensie de crbune sau, dup unii autori, cu soluie de bicarbonat, urmate de purgativ salin; - diurez osmotic alcalinizant (cu bicarbonat de sodiu), aplicat precoce sub controlul pH-ului sanguin i cu corectarea hipopotasemiei i hipocalcemiei; - corectarea dezechilibrului hidroelectrolitic; - combaterea hipertermiei i a convulsiilor; - tratament cu vitamina K1. Derivai de anilin Substanele care conin un nucleu benzenic au, n principiu, activitate antipiretic. Deosebit de activ este anilina ns toxicitatea sa, conferit de grupa NH2, o exclude din terapeutic. Acetanilida (antifebrina), C6H5-NHCOCH3, cel mai vechi analgezic-antipiretic (1886) a fost de asemenea abandonat din cauza toxicitii. Structura chimic Derivaii de anilin analgezici-antipiretici sunt fenacetina (acetofenetidina) i paracetamolul (acetaminofenul).
NHCOCH 3 NHCOCH 3

OC2H5

OH

f enacetina

paracetamol

Proprieti fizico-chimice Fenacetina i paracetamolul sunt pulberi albe, cristaline, inodore, insipide sau cu gust uor amar (paracetamolul). Sunt puin solubile n ap, solubile n alcool i cloroform. Etiologia intoxicaiilor Intoxicaia acut se datoreaz absorbiei masive n scop de sinucidere sau prin confuzie. Intoxicaia cronic este urmarea absorbiei zilnice i ndelungate a produsului sau a formelor sale medicamentoase. Ptrundere, distribuie, metabolizare, depozitare i eliminare

310

Derivaii de anilin sunt absorbii rapid i complet din tractul gastrointestinal, apoi distribuii uniform n toate esuturile. Fenacetina este metabolizat prin dezetilare la paracetamol i mai puin, prin dezacetilare, urmat de 2-hidroxilare la p-fenetidin, respectiv 2-hidroxifenetidin i de asemenea, prin hidroxilare la nucleu, cu formare de hidroxifenacetin. Toi metaboliii sunt conjugai cu acid glucuronic sau sulfuric.
NH 2 OH NH 2 NHCOCH 3

OC2 H5

OC2 H5

OC2 H5

2-hidroxi-f enetidina

p-f enitidina
NHCOCH 3

f enacetina

NHCOCH 3 OH

conjugare cu acid glucuronic (60%), acid sulf uric (20-30%), cisteina si glutation (5%)
OC2 H5

OH

paracetamol

2 sau N-hidroxif enacetina

Conjugarea paracetamolului cu glutationul este cantitativ nensemnat, ns asigur inactivarea intermediarului reactiv, toxic, de tip chinonimin, produs prin N-hidroxilare. n doze excesive de paracetamol, are loc depleia rezervelor de glutation, astfel nct intermediarul toxic nu mai este inactivat prin conjugare, ci formeaz legturi covalente cu constituienii hepatocitului, rezultnd alterarea acestuia.
HO NHCOCH 3 N COCH3 COCH3 N

oxidaze cu f unctii mixte microzomiale

conjugare cu glutationul cu formare de acid mercapturic

OH

OH

paracetamol

paracetamol N-hidroxilat

N-acetil-p-benzochinonimina

legaturi covalente cu constituientii celularu

311

Inductorii enzimatici de tip fenobarbital intensific activitatea oxidazelor cu funcii mixte microzomiale, crescnd procentul de metabolit toxic i mrind hepatotoxicitatea paracetamolului. Proprieti toxicologice. Mecanism de aciune Fenacetina este analgezic, antipiretic i sedativ, iar paracetamolul are aciune antipiretic superioar fenacetinei. Paracetamolul este antiinflamator, dar numai n doze superioare celor necesare pentru analgezice. Aciunea antiinflamatorie redus, lipsa de iritare gastric i neinfluenarea timpului de sngerare corespund cu slaba capacitate de a inhiba prostaglandinele. Reaciile adverse mai frecvente sunt urmtoarele: -Alergice: erupii cutanate, hipertermie, n general benigne i trectoare, cu excepia dermatitei exfoliative; subiecii hipersensibili la salicilai manifest alergie i la derivaii de anilin; -Neuropsihice: euforie, impresie de ameliorare a oboselii i a cefaleei, fapt pentru care reparatele cu fenacetin sunt adesea ingerate fr o indicaie terapeutic expres i care constituie un pericol prin mascarea surmenajului renal; -Renale: tratamentul ndelungat (reumatism) poate determina nefropatia prin abuz de analgezice. Leziunea primar este o necroz papilar urmat de nefrit cronic interstiial; -Methemoglobinizante i hemolitice: fenacetina determin apariia methemoglobinei (MetHb), sulfhemoglobinei, cianozei, anemiei hemolitice numai la doze mari. n administrare cronic, nu apar astfel de manifestri deoarece MetHb nu se cumuleaz, ci trece n hemoglobin prin mecanismele normale ale organismului. ntruct o doz unic de 2 g fenacetin la adult transform numai 1-3% din Hb total n MetHb, methemoglobinemie determinat de doze terapeutice de fenacetin sau paracetamol nu se exprim clinic. n intoxicaia acut sau n abuzul cronic, methemoglobinemia poate contribui la toxicitatea general. -Hepatice: dup o doz unic de 10-15 g de paracetamol (25 g este doza letal), apare necroz centrolobular urmat de fibroz, dar fr ciroz; cauza este metabolitul reactiv care, n cazul depirii capacitii de conjugare cu grupri SH formeaz legturi covalente cu constituenii hepatocitului. Fenacetina nu este hepatotoxic, dei principalul su metabolit este paracetamolul, deoarece cantitatea acestuia nu depete capacitatea de inactivare a sistemelor de conjugare. Acest mecanism de producere a hepatotoxicitii a determinat cercetri pentru gsirea unui antidot n intoxicaia cu paracetamol i s-a ajuns la concluzia c: -cisteamina (-mercaptoetilamina) previne instalarea leziunilor hepatocelulare dac este aplicat n doze adecvate i destul de curnd dup intoxicaie (10 ore). Cisteamina ar aciona prin inhibarea oxidrii microzomiale - deci oprirea formrii metabolitului toxic -,prin detoxicarea metabolitului nociv datorit gruprilor sale SH libere sau ca precursor al glutationului. Cisteamina nu este ns lipsit de oarecare toxicitate; -N- acetilcisteina este mai eficace i mai puin toxic dect cisteamina. Aciunea sa se bazeaz pe hidroliza rapid la cistein. Trebuie ns ca administrarea s fie precoce (n
312

primele 16 ore de la intoxicaie), iar n cursul tratamentului s nu se administreze adsorbani (crbune activ) i purgativ, deoarece acetia inactiveaz antidotul. Simptomatologie Dei paracetamolul este principalul metabolit al fenacetinei, manifestrile din intoxocaiile cu cele dou medicamente sunt diferite. Intoxicaia acut cu fenacetin se caracterizeaz prin tulburri: -nervoase: ameeli, vjituri n urechi, hipotermie, somnolen, com profund; -circulatorii: hipotensiune, puls mic, tahicardie; -methemoglobinizante i hemolitice: cianoz, modificri sanguine. Nefropatia fenacetinic apare numai n intoxicaia cronic, dup tratament ndelungat cu o cantitate total de peste 5-6 kg fenacetin. Intoxicaia acut cu paracetamol se desfoar n trei etape: -n prima etap apar greuri, vrsturi, transpiraii, stare de ru general, somnolen; -n etapa a doua (24-36 ore de la ingerare), fenomenele din prima etap dispar; -n etapa a treia (36-48 ore), se instaleaz hepatita toxic (hepatomegalie, dureri, icter), urmate de forme grave de com hepatic i moarte; n cazuri rare apare insuficiena renal i insuficien miocardic. Tratament n intoxicaia acut cu fenacetin, se realizeaz: -spltur gastric cu suspensie de crbune activat, urmat de purgativ; diurez osmotic forat; -tratarea methemoglobinemiei, hipotermiei, hipoxiei, ocului. n intoxicaia cu paracetamol, se recurge la: -spltur gastric (ct mai precoce) cu suspensie de crbune activat sau colestiramin; eventual, unul dintre antidoturile recent experimentate (N-acetilcistein, cisteamin); -tratament simptomatic. Toxicologie analitic Izolare Fenacetina se izoleaz din mediu uor acid sau alcalin iar paracetamolul din mediu acid, cu solveni organici. Izolare din urin, snge: -se aciduleaz la pH 5-6 cu acid acetic 5%, 20 ml urin (2 ml ser) i se extrag de dou ori cu cte 50 ml eter (cloroform). Extractele organice reunite sunt repartizate n trei capsule i evaporate la sec pe B.M. Reziduul dintr-o capsul este tratat cu 2 ml HCl 20% i hidrolizat pe B.M. la fierbere, apoi se adaug 10 ml ap i se filtreaz. Identificare Reacii de culoare: a) Reacia cu H2SO4 i acetaldehid: reziduul din capsul este tratat cu 1 ml H2SO4 i 4-5 picturi acetaldehid, cnd apare o culoare roie.
313

b) Reacia indofenolului: la 2 ml filtrat, se adaug o pictur de fenol 1% i 2-3 picturi soluie de hipobromit, cnd apare o culoare roie-nchis, care n mediul alcalin trece n albastru. c) Reacia de diazotare i cuplare: la 2 ml filtrat se adaug 0,5 ml HCl 10%, 0,1 ml NaNO2 1%, se agit, se las n repaus 10 minute, se adaug 2 ml uree 10%, se agit i dup 10 minute, se adaug 0,2 ml NED 0,1%, cnd apare o culoare violet. d) Reacia cu FeCl3: 10 ml urin se trateaz cu 1 ml FeCl3 1% (proaspt preparat), cnd se obine o culoare roie virnd n brun. Dozare Metoda colorimetric (reacia indofenolului): Principiu: dup hidroliz acid, din fenacetin i metabolitul su urinar Nacetilparaaminofenol, rezult paraaminofenol, care n prezena fenolului i a hipobromitului formeaz indofenol:

1) 2) 3) 4) 5)

Reactivi: HCl 4 N; NaOH 0,2 N; Fenol soluie apoas 1% proaspt preparat; Soluie apoas de hipobromit de sodiu: se amestec 3 ml ap de brom saturat cu 20 ml soluie Na2CO3; Soluie etalon: se cntresc 0,1 g fenacetin i se aduc cu ap la 200 ml (1 ml=0,5 mg). Modul de lucru: ntr-o eprubet gradat se iau 1 ml urin, 1 ml ap distilat i 4 ml HCl 4 N. Se fierbe pe B.M. la 1000C timp de 45 minute. Se rcete i se aduce la 10 ml cu ap distilat. Din aceast soluie-hidrolizat de urin- se ia 1 ml, se adaug 8 ml NaOH 0,2 N, 1 ml fenol 1% i 1 ml soluie hipobromit. Se las la ntuneric 30 minute, apoi se citete extincia n cuv de 1 cm la =630 nm fa de o prob oarb. n condiii identice se execut o scar etalon cu concentraii cuprinse ntre 100-500 g/prob (0,2-1 ml soluie etalon completat la 1 ml cu ap distilat). Studii clinice i toxicologice Epidemiologie Incidena intoxicaiilor n populaia general este dificil de estimat datorit urmtoarelor cauze: majoritatea intoxicaiilor se produc la domiciliu, gravitatea lor nu impune ntotdeauna
314

prezentarea i internarea ntr-o secie specializat, manifestrile clinice sunt atribuite altor boli sau sunt dificil de difereniat de alte afeciuni prezente la acelai pacient. Intoxicaiile reprezint 5-10 % din cauzele internrilor n seciile de terapie intensiv. Cile de ptrundere a toxicelor n organism sunt: ingestie (75-80%), percutan, ocular, inhalator (fiecare cu aproximativ 5%), parenteral (sub 1%). Cazurile acute reprezint 90% din totalul intoxicaiilor, cele accidentale fiind prezente n aceeai proporie. Medicamentele sunt implicate n aproximativ 55% din intoxicaiile acute severe la adult i n 50% din cele pediatrice grave. Intoxicaiile accidentale medicamentoase sunt rezultatul autoadministrrii i autodozrii neinformate a medicamentelor, erorilor n prescrierea acestora de ctre medic, n dozarea lor de ctre asistente, prini, vrstnici, n prepararea i eliberarea medicamentelor de ctre farmaciti. Cele mai frecvente cauze de intoxicaii intenionate sunt consumul abuziv de alcool sau droguri i tentativele de suicid. La adult, cel mai frecvent sunt incriminate (n ordine descresctoare a frecvenei) n cazurile acute grave asocierile polimedicamentoase, etanolul, drogurile de abuz, anxioliticele, monoxidul de carbon, asocierea alcool-medicamente, barbituricele, compuii organofosforici, benzodiazepinele, ciupercile necomestibile i antidepresivele, iar la copil substanele caustice, benzodiazepinele, distonocalmul, etanolul, antidepresivele triciclice, barbituricele, derivaii de petrol, ciupercile necomestibile, drogurile de abuz, paracetamolul. Intoxicaiile copilului difer de cele ale adolescentului i adultului prin: caracterul mai frecvent accidental, depistarea mai precoce, toxicitatea mai mare la copil a aceleiai substane, cantitile ingerate de obicei mai mici, lipsa frecvent a condiiilor patologice supraadugate, rspuns favorabil la tratament i capacitate de recuperare mai mare. Mortalitatea este semnificativ mai mic la copii (0,5-2 %) fa de aduli (aproximativ 5%). Medicamentele care determin cel mai frecvent mortalitate n intoxicaiile acute sunt: analgezicele, antidepresivele, agenii cardiovasculari, sedative/hipnotice/antipsihotice, anticonvulsivantele, antiastmaticele, antihistaminicele, medicamentele coninnd fier (mai ales la copii). Studii toxicologice Intoxicaiile acute reprezint la ora actual o veritabil problem de sntate datorit indicilor de morbiditate i mortalitate n continu cretere peste tot n lume. n SUA, n 2004, intoxicaia medicamentoas a reprezentat a doua cauz dup accidentele de trafic. n Frana, dup autori diferii, s-a constatat c mortalitatea imputabil unui accident terapeutic poate varia de la 1% la 14%, punndu-se problema caracterului evitabil al evenimentului. Evaluarea real este extrem de dificil datorit metodologiilor specifice a sistemelor de nregistrare a maladiilor care difer n funcie de zona geografic. Includerea medicamentului ntre cauzele etiologice devine tot mai pregnant deoarece exist dou traiectorii distincte de abordare: 1) efectele imputabile direct agentului farmacoterapic; 2) elementele secundare modului de utilizare a substanei medicamentoase. n faa unei intoxicaii asistarea victimei presupune urmtorii pai: a) stabilirea diagnosticului; b) evaluarea gravitii; c) instituirea terapiei complexe simptomatice, evacuatorii / decontaminante, antidotice; d) determinarea necesitii msurilor preventive.
315

1) 2) 3) 4) 5) 6)

a) b) c) d)

Pentru a putea afirma diagnosticul de intoxicaie sunt necesare datele anamnestice coroborate cu tabloul clinic, investigaiile de laborator, inclusiv analiza toxicologic, iar n unele cazuri diverse teste diagnostice i terapeutice. Ideal ar fi ca toate aceste elemente s fie n concordan cu toxicul / medicamentul i cu doza ingerat. O etap esenial o constituie anamneza cu interogatoriul minuios al anturajului sau pacientului, care trebuie s raspund urmtoarelor ntrebri: Ce? (care substan, una sau mai multe au fost utilizate); Ct? (n ce cantitate o fost luat); Cum? (calea de administrare); Cnd? (momentul prizei, eventual durata); De ce? (motivul sau raiunea intoxicaiei); Ce alte maladii exist? (pentru evaluarea riscului co-morbiditilor). Interogatoriu poate fi orientat n funcie de tipul de intoxicaie estimat: -tentativele suicidare: reprezint 90% din intoxicaiile adultului, mai frecvent la femei 60%, iar medicamentele pot fi cauza n 85% din cazuri. Clasele cele mai incriminate de ageni farmacoterapici sunt: benzodiazepinele, neurolepticele, barbituricele, analgezicele, antipireticele, antiinflamatoarele, antiaritmicele de multe ori n combinaii diverse i mpreun cu alcoolul etilic; -intoxicaiile accidentale domestice: reprezint 95% din evenimentele toxice ale copilului -toxicomaniile: prezena contextului, antecedentelor i stigmatelor specifice -erorile terapeutice i supradozrile medicamentoase: frecvent la extremele de vrst n prezena unor factori de risc subevaluai i cu posibilitatea de a rmne nediagnosticate sau ignorate; -intoxicaiile din tentativele criminale: apanajul organismelor specializate de anchet n care unitatea medical este o verig foarte important. Simptomatologia este, n general, extrem de variat depinznd direct de natura toxicului / medicamentului i poate afecta toate aparatele i sistemele organismului uman. Investigaiile biologice, prin anomaliile decelate, pot avea o real importan diagnostic permind suspicionarea unei anumite clase de substane, fiind o reflectare direct a efectelor toxice, uneori foarte utile att n plan evaluativ ct i terapeutic. Analiza toxicologic are cert un mare impact diagnostic, prognostic, terapeutic i medicolegal. Ea trebuie focalizat de clinician pe baza datelor tabloului clinic. n urgen, analiza toxicologic cantitativ este indispensabil atunci cnd condiioneaz strategia terapeutic: administrarea antidotului, a chelatorului, a dozelor repetitive de crbune activat, instituirea epurrii extrarenale (de exemplu: intoxicaia cu paracetamol, salicilai, digitalice, fenobarbital, litiu, fier, metanol, etilenglicol, metale). n practic exist 4 situaii: Intoxicaie cert cu substan cunoscut i simptomatologie concordant cu toxicul i doza; Intoxicaie cert cu substan cunoscut dar cu tablou clinic neconcordant cu toxicul i doza; Intoxicaie sigur dup context dar cu toxic necunoscut; Simptomatologie evocatoare pentru o posibil etiologie toxic n absena contextului i a altor date.

316

Evaluarea gravitii este o etap fundamental pentru c ea determin strategia terapeutic i de supraveghere. Sunt implicai numeroi factori: toxicul i mecanismul su de aciune, criteriile clinice i paraclinice, tipul de intoxicaie, elemente de vulnerabilitate individual, asocierea diverselor substane (de exemplu, medicamente psihotrope cu etanol) i prezena comorbiditilor. Din punct de vedere terapeutic, n mod clasic, exist 4 piloni: tratamentul simptomatic, evacuator, epurator i antidotic. Preluarea unui caz de intoxicaie acut comport cu prioritate aplicarea terapiei simptomatice pentru c se realizeaz monitorizarea parametrilor vitali, precum i a bilanului clinico-biologic iniial cu aplicarea n cazul etiologiilor incerte a testelor diagnostico-terapeutice (de exemplu, glucoz, Flumazenil, Naloxon). Intoxicaiile medicamentoase reprezint o problematic extrem de complex, avnd implicaii multiple de ordin medical, socio-economic i etico-moral, care datorit extinderii alarmate a cazurilor, necesit o atenie amplificat din partea tuturor celor angajai n actul terapeutic. Toxicologie analitic Izolare Derivaii de acid salicilic se izoleaz din medii acide cu solveni organici. Salicilatul de metil poate fi antrenat cu vapori de ap. Identificare
Reacia de culoare cu clorura feric a.) Urin: se adaug la 1 ml urin (eventual diluat 1/5) 5 ml reactiv Trinder, cnd apare, n cteva secunde, o coloraie violet. Reacia este foarte sensibil. n condiiile metodei, numai cantiti mari de fenotiazine interfer prin apariia unor coloraii slabe. Reacia se poate executa i prin spotare pe o hrtie de filtru umectat cu reactiv Trinder. Reactivul Trinder: se adaug 20 g clorur mercuric ntr-un pahar cu 425 ml ap i se nclzete pn la solvire. Dup rcire se adaug 20 g nitrat feric Fe(NO3)39H2O i 60 ml HCl N. Clorura mercuric are rolul de a precipita proteinele, care se separ prin centrifugare i filtrare, nct reactivul poate fi folosit i pentru snge. b.) Snge, lichid cefalorahidian: se iau ntr-un tub de centrifug 1 ml ser (plasm, snge total, lichid cefalorahidian) i 5 ml reactiv Trinder; se agit un minut i se centrifugheaz, cnd n stratul supernatant apare o coloraie violet. c.) Lichid gastric: n acest caz este necesar, pentru acidul acetilsalicilic, s se hidrolizeze lichidul n mediu alcalin la cald, deoarece altfel reacia este negativ sau numai slab pozitiv. Se iau ntr-un pahar conic 10 ml lichid gastric, 10 ml ap i un ml NaOH 40%, se adaug o bil de sticl i se fierbe pe sit, timp de trei minute. Se rcete i se ia 1 ml hidrolizat, se adaug 4 ml ap i se ajusteaz la pH 5 cu HCl 10%. La 1 ml lichid ajustat la pH 5 se adaug 5 ml reactiv Trinder: o coloraie violet indic prezena acidului acetilsalicilic, atunci cnd reacia efectuat pe lichid gastric nehidrolizat a fost negativ sau slab pozitiv. Dozare Metoda colorimetric cu clorur feric a.) Principiu: ionul salicilic d cu ionul feric un complex de culoare violet, fotometrabil la =535 nm;
317

OH COOH

OH COO -

Fe3+
+

Fe
3

Reactivi: 1) Reactiv Trinder; 2) Soluie etalon stoc: se cntaresc 0,2320 g salicilat de sodiu i se aduc la 100 ml cu ap distilat (1 ml=2 mg acid salicilic); 3) Soluie etalon diluat: n momentul ntrebuinrii se dilueaz soluia etalon stoc 1/5 (1 ml=400 g acid salicilic). Modul de lucru: se ia 1 ml urin (eventual diluat) sau 1 ml ser (plasm, lichid cefalorahidian), se adaug 5 ml reactiv Trinder i se agit puternic. Se centrifugheaz i se extrage cu grij supernatantul. Se citete imediat extincia n cuv de 1 cm la =535 fa de o prob oarb. n condiii identice se execut o scar etalon cu cantiti ntre 100 i 400 g prob (0,25-1 ml soluie etalon diluat completat la 1 ml cu ap distilat). Se face corecia pentru diluia efectuat, eventual la urin (se dilueaz astfel nct concentraia final s se nscrie ntre 100 i 400 mg/litru). Interpretarea rezultatelor: 1) Dozarea salicilemiei este esenial pentru stabilirea diagnosticului i evaluarea, n oarecare msur, a gravitii intoxicaiei. Dimpotriv, saliciluria are valoare limitat, deoarece chiar ingerarea a 1-2 comprimate de aspirin determin o reacie pozitiv cu FeCl2; n schimb, dup stabilirea diagnosticului dozrile n dinamic n urin permit urmrirea eliminrii toxicului. Tabelul 1 Corelaia ntre salicilemie i gravitatea intoxicaiei (dup Meunier, 1972) Salicilemie (mg/100 ml plasm) < 50 50-80 80-100 100-150 >150 Manifestare clinic Lipsa, n general, a manifestrilor clinice Intoxicaie uoar sau medie Intoxicaie grav, cu apariia tulburrilor neurologice Intoxicaie foarte grav Intoxicaie, de obicei, fatal

2) Ingerarea a 3-5 g acid acetilsalicilic determin, n general, la adult, salicilemii de 25 mg/100 ml plasm dup 4 ore, de 15 mg/100 ml dup 12 ore i de 5 mg/100 ml dup 24 ore. Ingerarea a 20 g acid acetilsalicilic determin o salicilemie de 100 mg/100 ml. Saliciluria variaz n raport cu diureza i tratamentul, dar se nscrie de obicei, n intoxicaiile acute, ntre
318

1000 i 4000 mg/litru urin. Se poate stabili, dup unii autori, o corelaie ntre salicilemie i gravitatea intoxicaiei. (tabelul 1)

Determinarea meprobamatului

H3 C H2 C

H2 C

COO

NH2 NH2

C
C H2 H2 C COO

H3 C

A. Izolare Meprobamatului se izoleaz din soluie apoas acid cu solveni organici(eter, diclormetan, cloroform). Se mai poate izola i din mediu neutru i alcalin la pH = 10. a. Izolare din mediu acid cu eter 1. Se aciduleaz 20 ml urin (lichide gastrice), ntr-o plnie de separare, cu acid clorhidric concentrat pn la pH = 4 i extrage de dou ori cu cte 2o ml eter. Extractele eterice reunite sunt splate cu 20 ml ap distilat, filtrate pe sulfat de sodiu anhidru i evaporate la sec. 2. Se aplic pentru snge metoda Griffon Le Bretton (V. Derivaii barbiturici). b. Izolarea din mediu acid cu diclormetan sau cloroform 10 ml urin (2 ml ser) se aciduleaz la pH 4 cu acid clorhidric concentrat i se extrage ntr-o plnie de separare cu 20.30 ml diclormetan (agitnd 10-15 minute). Se separ faza organic, se spal de dou ori cu cte 15 ml ap distilat. Faza organic este filtrat pe sulfat de sosiu anhidru i se evapor la sec. c. Izolarea din mediul alcalin cu diclormetan sau cloroform. 10ml urin (2 ml ser) se alcalinizeaz la pH 10 cu amoniac 10% se extrage de dou ori cu cte 20 ml cloroform. Extractele reunite se spal cu 20 ml ap distilat, se filtreaz pe sulfat de sodiu anhidru i se evapor la sec. B. Identificare 1. Reacii de culoare i fluorescen a. reacia Nadeau- Sobolewski: se trateaz reziduul cu 0,3 ml ap distilat, cu civa cristale de hidrochinon i 3 ml acid sulfuric concentrat, cnd apare n maxim 5 minute, prin expunere n lumin U.V. (366nm), o fluorescen roz-orange. n cazul extractului din lichidul gastric este obligatorie meninerea soluiei timp de 15 minute pe B.M. la100C. b. Reacia cu acid sulfuric: se nclzete reziduul pe baia de ap cu acid sulfuric concentrat, timp de 10 minute, cnd prin expunere n lumina UV (366 nm) se observ o fluorescen alb - verzuie, caracteristic.
319

c. Reacia Hyndrickx: se reia reziduul cu 1,5 ml aceton, la care se adug imediat 0,1 ml acid sulfuric concentrat. Se agit cu o baghet pentru a uura dizolvarea i omogenizarea. Se adaug 0,1 ml furfurol 1% n aceton (preparat extemporaneu) i se imprim capsulei o uoar micare de rotaie. Se las n repaus cteva minute cnd apare pe pereii capsulei i deasupra fazei lichide, un inel discontinuu, intens colorat violet. Nu se iau n considerare inelele verzi, brune sau cenuii. d. Identificare din forme farmaceutice: pulverizeaz comprimatul i se trituraz cu 5 ml alcool. Se filtreaz; 2 ml filtrat se evapor la sec ntr-o capsul de sticl. Se rcete. Se adaug 2 ml para-di-meti-benzaldehid 10% n acid sulfuric concentrat (preparat extemporaneu). Se omogenizeaz cnd apare o culoare galben. Se menine capsula 3 minute pe baia de ap la fierbere, cnd apare culoarea vireaz la rou. Se rcete n ap cu ghea i se adug cu pictura, 2 ml ap distilat rcit la ghea cnd culoarea tece n albastru violet. 2. Cromatografie n strat subire Faza staionar: silicagel G Merck Faza mobil: a. ciclohexan: etanol (8 : 2 v/v) b. cloroform: metanol (9 : 1 v/v) c. metanol : amoniac 12 N (9 : 1 v/v) d. n butanol : amoniac (9 : 1 ) Proba de analizat : reziduul se dizolv n 0, 2 0,5 ml metanol. Martorul: meprobamat de metanol. Relevarea: uscarea cromatoplcii 15 minute la 70C i pulverizarea cu furfurol 1% n aceton (preparat extemporaneu) apoi cu acid sulfuric 4 % n aceton. Apar spoturi violete, ns reacia este interferat de fenotiazine. b. Pulverizarea cu hidrochinon 2% n acid sulfuric concentrat i uscare 20 30 minute 70C, apoi expunere la UV cnd apar spoturi fluorescente, roz.

III. 11. Determinarea medicamentelor pe baz de para-aminofenol

O C2H5 OH

HN

CO

CH3

HN

CO

CH3

Fenacetina

Paracetamolul

A. Izolare
320

Fenacetina se izoleaz din mediuu uor acid sau alcalin, iar paracetamolul din mediu acid , cu solveni organici (eter etilic, diclor etan i cloroform). 1. Izolare din urin i snge: se aciduleaz 20 ml urin (2 ml ser) cu acid acetic 5% la pH 5-6 i se extrag de dou ori cu cte 50 ml cloroform (eter). Extractele organice reunite sunt repartizate n capsule i evaporate la sec. Reziduul obinut este tratat cu 2 ml acid clorhidric 20% i hidrolizat pe baia de ap, la fierbere, timp de 15 minute. se adaug 10 ml ap i se filtreaz. Identificarea se execut att reziduu, ct i pe filtrat sau direct pe urin. B. Identificare 1. Reacii de culoare - Fenacetina a. Test preliminar: se adaug la 2 ml urin acidulat cu acid clorhidric 10%, 3 picturi nitrat de sodiu 1% i 3 picturi soluie alfa-naftol 1% n hidroxid de sodiu 10% (preparat proaspt). n prezena paracetamolului- metabolit al fenacetinei se dezvolt o culoare roie. b. Reacia cu clorur feric: se adaug la 2 ml filtrat o pictur de fenol 1% i 2-3 picturi de hipoclorit de sodiu 5% sau cloramin B 4%, cnd apare o culoare roie- violet, care n mediu alcalin trece n albastru. d. Reacia cu acid sulfuric i acetaldehid: se trateaz reziduul cu 1 ml acid sulfuric concentrat i 4-5 picturi acetaldehid cnd se dezvolt o culoare roie. c. Reacia indofenolului: se adaug la 2ml filtrat o pictur de fenol 1% i 2-3 picturi de picturi de hipoclorit de sodiu 5% sau cloramin B 4%, cnd apare o culoare roie-violet, care n mediu alcalin trece n albastru. d. Reacia cu acid sulfuric i acetaldehid: se trateaz reziduul cu 1 ml acid sulfuric concentrat i 4-5 picturi acetaldehid cnd se dezvolt o culoare roie. e. Reacia de diazotare i cuplare: se adaug la 2ml filtrat, 0,5 ml acid clorhidric 10% i 0,1 ml nitrat de sodiu 1%. Se agit i se las n repaus 10 minute, dup care se adaug 2 ml uree 10%, se agit i dup 10 minute se adaug 0,2ml N-naftiletilendiamin (NKD) 0,1% cnd apare oculoare violet. Reacia se preteaz i pentru dozare. f. Reacia cu bicromat: se trateaz 1 ml filtrat cu 2-3 picturi bicromat de potasiu 5%, cnd se dezvolt o culoare roi ribinie. n aceleai condiii, acetaldehida d o culoare galben, care vireaz n verde. - Paracetamol a. Reziduul reluat cu 2-3 picturi clorur feric 1% d o culoare verde-albastr. b. Reziduul tratat cu acid clorhidric 10% pentru hidroliz acid, d la adugare de bicromat 5% o culoare violet ce nu trece n rubiniu (reacia de difereniere de fenacetine). c. Reziduul tratat cu 1-2 picturi acid sulfuric concentrat i 1-2 picturi alcooletilic, degaj la fierbere, un miros specific de acetat de etil. d. Reziduul tratat cu reactiv Liebermann (0,6 g azotit de potasiu 10 ml acid sulfuric conc.) se obine o culoare galben. 2. Identificarea din corp delict (resturi de medicamente) Se fierbe 0,1 g substan cu 1 ml acid clorhidric concentrat timp de 3 minute. Se dilueaz la 10 ml cu ap, se rcete, se filtreaz i se adaug o pictur bicromat de potasiu 0,1 N. n

321

prezena fenacetinei apare o culoare violet, care trece n rou-rubiniu, iar n prezena paracetamolului, se dezvolt lent o culoare violet care nu vireaz n rou. 3. Cromatografia n strat subire (tehnica Bologh) La 25 ml urin se adaug 10 g clorur de sodiu (pentru obinerea extragerii) i se aduce cu hidroxid de sodiu 10% la pH 9. Se extrage de 3 ori cu cte 30 ml eter cu adaus de 1,5% alcoolizoamilic. Fazele eterice se evapor la sec. Se reia reziduul cu 1 ml etanol. Se spoteaz 10 g din soluia etanolic, alturi de martori soluii etenolice de fenacetin, paracetamol, p-fenetidin. Sistemul de migrare folositeste: cloroform : benzen : aceton (65 : 10 : 25). Revelarea se ealizeaz prin: expunere 10 minute la vapori de iod, apoi pulverizarea cu iodur de potasiu soluie 10% n amidon, cnd apare spoturi albastre violet; pulverizare cu soluie clorur feric fericianur de poasiu (3 g : 0,15 g dizolvate n 30 ml ap), cnd apar spoturi albastre violet pe fond albastru deschis. Rf-urile sunt: 0,81fenacetin; 0,41 paracetamol; 0,91 p-fenetidin. Pentru diferenierea fenacetinei de fenazon, aminofenazon, acetanilid, se folosete unsistem de migrare; aceton : cloroform (1 : 9). Relevarea se realizeaz prin pulverizarea cu clorur feric 5% n aceton; dup nclzire uoar, apar spoturi roii-violet pe fond galben. C. Dozarea Metoda spectrofotometric (reacia indofenolului) Principiu: Dup hidroliz acid, din fenacetin i paracetamol (metabolitul su urinar) rezult paminofenol, care n prezena fenoluluii a hipocloritului, formeaz indofenolul de culoare albastr ce se spectrofotometreaz la = 550 nm n cuva de 1 cm fa de martor.
2NaClO
-2NaCl -2H2O

HO

NH2 +

OH

HO

Reactivi: 1. Acid clorhidric 4 N 2. Hidroxid de sodiu 0,2 N 3. Fenol soluie apoas 1 % (proaspt preparat) 4. Soluie apoas de hipoclorit de sodiu (se amestec 3 ml ap de clor saturat cu 20 ml soluie carbonat de sodiu (2,2 g carbonat de sodiu anhidru la 20 ml ap). 5. Soluie standard: se aduc 0,1 g fenacetin la 200 ml cu ap . 1 ml = 500 g fenacetin. Modul de lucru ntr-o eprubet gradat se iau: 1 ml urin, 1 ml ap i 4 ml acid clorhidric 4 N. De fierbe pe baia de ap la 100C timp de 45 minute i se aduce cu ap la 100 ml. Din aceast soluie hidrolizat de urin se ia 1 ml, se adaug 8 ml hidroxid de sodiu 0,2N, 1 ml fenol 1% i 1 ml

322

hipoclorit. Se las la ntuneric 30 minute. Se citete extincia la spectrofotometru, la = 630 nm, n cuva de 1 cm, fa de un martor.

Curba de etalonare se ntocmete ntre 100 i 500 g/prob. Eprubeta Reactivi(ml) Standard de lucru 500 g/fencetin/ml Ap distilat Acid clorhidric 4N Se fierbe 45 pe BM. Se rcesc Hidroxid de sodiu 0.2N Fenol 1% Hiploclorit de sodiu Extincia

1 0.2 100 0.8 4.0

2 0.4 200 0.6

3 0.6 300 0.4

4 0.8 400 0.2

5 1.0 500 6(M) 1.0

1.0-agitare 1.0-agitare 1.0-agitare, 30 minute la ntuneric =630nm

Valoarea extinciei pentru prob se raporteaz la curba etalon, apoi se nmulete cu 10 (deoarece s-a lucrat cu 1/10 din prob) obinndu-se concentraia C a fenacetinei n g/prob. Calcul Rezultatele se exprim n mg fenacetin/litru urin. mg fenacetin/litru urin = C n care: C = concentraia fenacetinei, n g.

Determinarea derivailor pirazolonici

H3C
CH C CH3 O C N CH3 N C6H5

H3 C

N C O C

C CH3 N CH3 N C 6 H5

H3C

H2C C O C

C CH3 N C6H5 N C6H5

Fenazona

Aminofenazona
323

Fenilbutazona

A. Izolare: Fenazona se extrage din produse biologice cu eter etilic sau dicloretan n mediu neutru, slab alcalin i chiar acid. Aminofenazona se extrage cu eter etilic sau cloroform n mediu alcalin. Fenilbutazona se extrage din lichidul apos acid cu cloroform sau hexan. a. Izolare din urin i snge: se alcalinizeaz 50 ml urin (5 ml plasm) la pH = 8 cu bicromat de sodiu. Se extrage de dou ori cu cte 50 ml cloroform. Extractele cloroformice reunite sunt filtrate pe sulfat de sodiu anhidru, eventual i pe crbune activ i evaporate la sec pe baia de ap. n reziduu se identific fenazona i aminofenazona. Pentru fenilbutazon se procedeaz idntic, ns de extrage din mediu cu pH uor acid, cu cloroform pentru urin i cu hexan pentru snge. b. Izolare din organe. se tritureaz 10 g organe cu 1 g nisip purificat, se adaug 10 ml ap distilat i 10 ml acid tungstic 10%. Se nclzete 15 minute pe baia de ap, pentru a favoriza precipitarea proteinelor. Se filtreaz, se alcalinizeaz filtratul la pH = 8 cu amoniac concentrat i se extrage de dou ori cu cte 50 ml cloroform. Extractele reunite sunt evaporate pe baia de ap la sec. n reziduu se identific fenazona i aminofenazona. Pentru fenilbutazon se procedeaz identic, ns se extrage din mediu cu pH uor acid. B. Identificare: 1. Reacii de culoare: Fenazona a. Reacia feripiridinei: se trateaz reziduul cu 0,5 ml clorur feric 10% (proaspt preparat), cnd apare o culoare roie, care se intensific la nclzire i dispare la adaus de acid sulfuric. Dac se adaug 2-3 picturi hidroxid de sodiu 10% se obine o coloraie galben. b. Reacia nitrozoantipiridinei: se dizolv reziduu n 1-2 ml ap, se adaug 1 ml acid sulfuric 1% i 2-3 picturi azotit de sodiu 1% cnd apare o culoare verde persistent, prin formarea nitrozoantipiridinei.
CH C CH3 O C

NO O C

C CH3 N CH3 N C6H5

+ N CH3HONO
N C6H5

c. Se trateaz reziduul cu 1-2 picturi acid clorhidric 10% i 1-2 picturi formol 40%, se nclzete la fierbere i dup rcire, se alcalinizeazcu amoniac diluat, cnd apare un precipitat alb (difereniere de aminofenazon). d. Se trateaz reziduul cu 3-4 picturi reactiv Mandelin, cnd apare o coloraie verde. e. Se trateaz reziduul cu 10 picturi p-dimetilaminobenzaldehid 10% n acid sulfuric concentrat (reactiv Wasicky), cnd apare o culoare galben care trecen rou prin nclzire (reacia este negativ pentru aminofenazon).
324

- Aminofenazona a. Se trateaz reziduul cu 1-.2 picturi clorur feric 1% (proaspt preparat), cnd apare o culoare violet trectoare, care se decoloreaz n exces de reactiv. Dac se adaug 5 picturi acid clorhidric 10% soluia se coloreaz n galben. b. Se dizolv reziduul ntr-un ml ap, se adaug 0,5 ml azotit de sodiu 5% i 0,2 ml acid sulfuric 10%, cnd se dezvolt o culoare alb violacee, care se decoloreaz n exces de reactiv. c. Se trateaz reziduul cu 1 ml persulfat de potasiu 1%, cnd apare o culoare albastr, care trece succesiv n rou violet i galben. d. Se reia reziduul cu cteva picturi acid fosforic d = 1,71 i se adaug cteva cristale de clorat de potasiu, cnd se formeaz o culoare galben-aurie. e. Se trateaz reziduul cu reactiv Schiff, cnd se obine o culoare violet. f. Reziduul tratat cu cteva picturi azotat de argint 10% la cald, dezvolt o culoare violet, apoi n timp se depune un precipitat cenuiu de argint metalic. - Fenilbutazona a. Se trateaz reziduul cu cteva picturi reactiv Mandelin, cnd apare o culoare roie. b. Se dizolv reziduul n 1 ml ap i se adaug 1 ml reactiv Follin Ciolteu, iar dup alcalinizare apare o coloraie albastr ce se spectrofotometreaz la 750 nm. c. Se fierbe reziduul cu acid fosforic sau acid clorhidric 10%; benzidina format, prin hidroliz este identificat prin diazotare cu azotit de sodiu 1% i cuplare cu beta naftol sau N-naftiletilendiamina (NKD). Se obine o culoare roie crbunie. 2. Cromatografie pe strat subire Se dizolv reziduul n 0,2-0,5 ml etanol sau cloroform i se spoteaz pe cromatoplac n paralel cu martori. Sistemele de migrare sunt: metanol (etanol) : cloroform (1 : 9) sau aceton : cloroform (1 : 9) pentru anminofenoz; cloroform : metanol (9 : 1) sau acetat de etil : metanol : amoniac concentrat (8,5 : 1 : 0,5) pentru fenilbutazon. Revelarea se realizeaz prin: expunere n U.V., pulverizare cu reactiv Drangendorff sau reactiv Bouchardat (pentru aminofenozon) i permanganat de potasiu 1% (spoturi galbene pe fond roz) sau fericianur de potasiu 0,5% i clorur feric 1% (n volume egale) (spoturi albastre pentru fenil butazon).

Determinarea benzodiazepinelor

N Cl C

C N

NHCH3 CH2

C6H5

325

R1 R2a N R7 C C N R2b CH R3

Benzo(f)diazepine 1,4

Clordiazepoxidul

CH3 N Cl C C

O C CHOH N

O CH2 N
Oxazepamul

N Cl C

C6H5
Diazepamul

C6H5

A. Izolare : a. Izolarea clordiazepoxidului i a benzaldehidelor cu R1 = alchil Se aduce 25 ml urin pH = 6,8 7,0 cu tampon fosfat i se extrag de dou ori cu cte 50 ml cloroform, agitnd cteva minute. Se filtreaz extractele cloroformice reunite pe un filtru peste crbune activ i se spal filtru cu puin cloroform. Se evapor filtratul la sec pe baia de ap la 50 - 60C. Se procedeaz identic pentru 2 ml plasm, 0,1 ml tampon i 25 ml cloroform. Tampnul fosfat: 30 ml hidroxid de sodiu 0,1 N; 50 ml fosfat disodic 0,1 N, ap ad. 100ml. c. Izolare 2- aminobenzofenonei: Se hidrolizeaz ntr-un balon prevzut cu refrigerent ascendent, 25 ml urin cu 10 ml acid clorhidric concentrat, nclzindu-se pe baia de ap la fierbere timp de 30 minute. Se rcete i se filtreaz(dac este cazul). Se neutralizeaz lichidul cu hidroxid de sodiu 30% i se extrage de dou ori cu cte 50 ml eter. Se filtreaz extractele reunite pe sulfat de sodiu anhidru i se evapor la sec pe baia de ap. B. Identificare: 1. Reacii de culoare: Benzodiazepinele, spre diferen de majoritatea medicamentelor, nu pot fi puse n eviden, n produsele biologice, printr-o metod simpl i direct. Metoda de identificare rapid este indirect i de bazeaz pe reacia de diazotare i cuplare, caracteristic aminelor primare aromatice. ntr-adevr, prin hidroliza acid la nclzire, clordiazepoxidul i benzodiazepinele
326

cu R1 = H (oxazepamul, clorazepamul, lorazepamul, nitrazepamul) i metaboliii lor formeaz derivai ai 2- aminobenzofenonei, extractibili cu solveni organici:
H N C C C N

NH2
+H
+

+ C O

C C

H2N

Diazotarea nu poate fi aplicat la toate benzodiazepinele ca atare. Astfel: -bebzodiazepimele cu R1 = alchil )diazepam, prazepam, flurazepam, metazepam, nimetrazepam, flunitrazepam), fotmeaz prin hidroliz amine aromatice secundare, nediazotabile. n organism ns, aceste benzodiazepine sufer, parial, N1- dezalchilare, astfel nct metaboliii N1dezalchilai, prezeni n urin i snge, pot fi identificai dup hidroliza acid, prin diazotare i cuplare. Ele pot fi ns identificate prin aceast metod n lichide gastrice i corpuri delicte (medicamente), deoarece se gsesc n stare nemetabolizat, nediazotabil; - metazepamul posed dou grupri metilice ntre N1 i N4 (avnd R2a, R2b, i R3 = H). Gruparea CH2 din poziia 2 mrete stabilitatea legturii N1-C2, care nu poate fi scindat prin hidroliz acid (n condiiile metodei), astfel nct nici metabolitul N- dimetilat nu se scindeaz cu formare de derivat 2-aminobenzofenolic. n schimb, pintre metaboliii medazepanului se gsete i un compus N-demetilat avnd n C2 un alcool secundar, ceea ce labilizeaz legtura N1-C2 i permite scindarea compusului. a. Reacia Bretton- Marshall: 2-aminobenzofenona, avnd gruparea NH2 liber, poate fi diazotat i cuplat, formnd unazoderivat colorat, colorimetrabil. De asemenea, reziduul obinut prin extragerea direct, hidrolzat prin tratare cu 2 ml acid clorhidric 4 N i nclzire pe baia de ap la fierbere timp de 15 minute, apoi rcut, d aceast reacie. Se diazoteat reziduul de la izolarea 2-aminobenzofenonei reluat cu 1 ml acid clorhidric 10% sau reziduul de la extracia direct, prin tratare cu 0,5 ml azotit de sodiu 0,5% i se ine la ghea. Dup 15 minute se elimin excesul de nitrit cu 2 ml uree 10% sau 1 ml sulfamat 2,5%. Se agit i se las n repaus 10 minute apoi se daug 1ml N-naftiletilendiamin (NED) 0,1%, cnd se obine o coloraie roz violacee. Aceast reacie nu este dat de diazepamul ca atare, ci numai de metabolitul su N-demetilat. Pe acelai principiu se bazeaz i reacia Pelzer (cuplare cu alfa naftol, cnd se obine o coloraie roz colorimetrabil la = 492 nm i reacia Troul (cuplare cu N-alfa-naftil-N2dietilpropilendiamin), cnd se obine o coloraie violet colorimetrabil la = 540 nm. b. Reziduul tratat cu molibdat de amoniu d o coloraie portocalie. 2.Cromatografie n strat subire: Se dizolv reziduul de la extragerea direct (fr hidroliz acid n 0,2 ml cloroform i se spoteaz pe o cromatoplac n paralel cu martorii.
327

Sistemele de migrare sunt: cloroform : metanol : toluen (10 : 1 : 4) i metanol : aceton : trietanolamin (1 : 1 : 0,3). Revelarea se realizeaz prin pulverizare cu reactiv Drangendorff modificat, cnd apar spoturi brun-rocate, att pentru benzodiazepine, ct i pentru metaboliii lor, difereniai prin Rf. C. Dozare. 1. Metoda spectrofotometric Bartton-Marshall Principiu: Derivatul 2- aminobenzofenonic rezultat prin hidroliz acid la cald este diazotat i cuplat cu N-naftiletilendiamin, cu formarea unui azoderivat roz-violaceu, colorimetrabil.

NH CH2 CH2

NH2

NH2 C O
NaNO2 HCl
C

N N Cl O

- HCl

N N

NH CH2 CH2

NH2

Reactivi: 1. ACid clorhidric 2N; 2. Azotit de sosiu 0,5%; 3. Uree 10% sau sulfamat de amoniu 2,5%; 4. N-naftiletilendiamin 0,15; 5. Soluie standard stoc: Se cntresc 0,20 g clordiazepoxid, se dizolv n 10 ml ap distilat i 5 10 ml acid clorhidric concentrat. Soluia se fierbe pe baie de ap 30 minute. Se rcete i se aduce la 100ml cu acid clorhidric 2 N (1 ml = 2 mg). 6. Soluia standard de lucru: Se dilueaz soluia standard stoc 1 : 100 cu ap distilat (1 ml = 20 g). Modul de lucru: Se dizolv reziduul obinut prin extragere cu solveni organici, dup hidroliz acid, n 2 ml acid clorhidric 2 N i se aduc cantitativ cu ap distilat ntr-un balon cotat de 25 ml. Se iau 5 ml din aceast soluie i se adaug 0,5 ml acid clorhidric 2 N i 0,5 ml nitrit de sodiu 0,5%. Se agit i se las n repaus 5 minute la ghea. Se adaug 1 ml uree 10% sau sulfamat de amoniu 2.5%; se agit i dup 10 minute se adaug 1 ml naftl-etilendiamin 0,1%. Se citete extincia la spectrofotometru, = 550 nm, n cuv de 1 cm, fa de proba martor.
328

Curba de etalonare se ntocmete ntre 4 i 20 micrograme dup schema: Eprubeta Reactivi(ml) Standard de lucru (20g ml) Conc.g Ap distilat NaNO2 0.5% H4NO-SO2.NH2 NED 0.1%

1 0.2 4 2.1

2 0.4 8 1.9

3 0.6 12 1.7

4 0.8 16 1.5

5 1.0 20 2.5 6(M) -

2.3

0.5ml repaus la ghea 1ml repaus 10 minute 1.0ml-agitare = 550nm

Calcul: Rezultatele se exprim n mg benzodiazepin/100 ml plasm sau 1000 ml urin: mg benzodiazepin/100 ml plasm = C / A x 10 mg benzodiazepin/ 1000 ml urin= C/ A C = concentraia benzodiazepinei n g; A = volumul de plasm (urin) luat n lucru, n ml. Observaii: Se poate folosi i reziduul obinut prin extragere direct ( fr hidroliz), dac se trateaz cu 10 ml acid clorhidric 4 N , se hidolizeaz prin nclzire 30 minute pe baia de ap la fierbere i dup rcire, se aduce cantitativ ntr-un balon cotat de 25 ml cu ap distilat. Metoda este interferat de toi metaboliii N-dezalchilai ai benzodiazepinelor.

Determinarea fenotiazinelor

S
N CH3 H N C CH3 CH3

N R1

R2

CH2
Romergan
329

S
S

N CH2

Cl H2 C CH3 N CH3
N CH2
Romtiazina

H 2C

Cl H2 C

CH3 N CH3

Plegomasin

A. Izolare. Fenotiazinele se izoleaz din mediu alcalin i parial di mediu acid, cu diclor etan, diclormetan, cloroform, eter, hexan. Metaboliii conjugai se extrag dup o prealabil hidroliz acid, astfel nct pentru organe i snge este preferabil s se execute hidroliza, pentru a regsi i produii conjugai. a. Izolare din urin, lichide gastrice: Se iau ntr-o plnie de separare, 50 ml urin (lichid gastrice filtrate) i se alcalinizez la pH = 10 cu hidroxid de sodiu 20%. Se adaug 80 ml dicloretan, diclormetan, sau cloroform i se agit puternic 3 minute. Se repet extragerea cu 80 ml solvent. Se spal fazele organice de 2 ori cu cte 20 ml ap distilat, se filtreaz pe sulfat de sodiu anhidru i se evapor la sec sau se folosesc ca atare. b. Izolare din snge: 1. Se trateaz 10 ml snge total cu 10 ml acid tricloracetic 20%, se filtreaz, se alcalinizeaz la pH = 10 cu hidroxid de sodiu 20% i se extrage de dou ori cu cte 50 ml cloroform sau hexan. Se filtreaz extactele organice reunite pe filtru uscat i se evapor la sec pe baia de ap. 2. Se trateaz 5 ml ser cu15 ml ap distilat, 1 ml hidroxid de sodiu 4% i 25 ml dicloretan. Se agit puternic 10 minute. Se centrifugheaz i se elimin, prin aspirare, faza apoas supernatant. Se folosete n faza organic ca atare sau reziduul. c. Izolare din organe i snge: Se macereaz 10 g ficat cu 10 ml ap i se adaug 13,5 ml acid clorhidric concentrat. Se nclzete amestecul pe baia de ap timp de 5 minute, apoi se rcete n ghea. Se adaug 12 ml hidroxid de potasiu 60% splat n prealabil cu eter, se agit i se verific dac pH-ul este alcalin. Se rcete i se extrage de dou ori cu cte 50 ml eter. Extractele eterice reunite se agit cu 15 ml hidroxid de sodiu 2,5%. Se ndeprteaz faza apoas, iar faza eteric se spal de dou ori cu cte 10 ml ap. Extractele eterice reunite se evapor la sec. Se procedeaz identic pentru 10 ml snge, 2 ml ap, 8 ml acid clorhidric concentrat. B. Identificare: 1. Teste orientative (direct pe urin) a. Testul cu reactivul Forrest "universal" (reactiv FNP): se adaug la 1ml urin, 1ml reactiv Forrest. Se obin imediat coloraii portocalii, roz, roii, violete, culoarea depinznd de natura
330

fenotiazinei, iar intensitatea coloraiei fiind oarecum proporional cu concentraia acesteia. Reacia este pozitiv pentru salicilai, PAS, benzodiazepine pigmeni biliari. Reacia poate fi executat i prin suprapunerea unei picturi de reactiv FNP peste o pictur de urin proaspt pe o hrtie de filtru uscat. Reacia este mai sensibil dac se extrag 10 ml urin alcalinizat cu hidroxid de sodiu, cu 20 ml eter, faza eteric evaporat, iar reziduul eteric reluat n 2-3 picturi alcool etilic i spotat pe hrtie, peste care se suprapun 2-3 picturi reactiv Forrest (tehnica Noirfalise). Reactivul Forrest ("universal"): clorur feric 5%, 5 ml, acid percloric d = 1,67 20% (v/v) 45 ml, acid azotic d = 1,67 50% (v/v), 50 ml. Testul cu reactivul Forrest este utilzat pentru: depistarea intoxicaiei cu fenotiazine (un test negativ indic absena absorbanei masive de fenotiazine); urmrirea eliminrii fenotiazinelor n timpul splturii gastrice; urmrirea eliminrii fenotiazinelor n timul splturii gastrice; urmrirea eliminrii urinare a metaboliilor n cursul intoxicaiei fenoteazinice. Dezavantajul testului Forrest: sunt reaciile fals negative, cnd metaboliii fenoteazinici sun n doze mici, diluai, ntr-un volum mare de urin; reaciile false pozitive, cnd urina provine de la persoane care au ingerat salicilai sau PAS, sau cnd conine mari cantiti de pigmeni biliari, esterogeni. b. Spot-testul cu acid azotic concentrat: se aplic 1-2 picturi de urin peo hrtie de filtru, marcnd cu creionul conturul peteu, . Se usuc i se suprapune o pictur de acid azotic concentrat, cnd apar, peconturul creionat, n inele roz, roii, violete, n raport cu natura fenotiazinei i cocentaia sa. La concentraii foarte sczute, observarea hrtiei se face prin transparen. c. Testul cu acid sulfuric i clorur feric: se adaug la 1 ml urin, 1 ml reactiv compus din 80 ml acid sulfuric 10% i 20 ml clorur feric 5%, cnd se obine o coloraie roz-mov. d. Testul pentru tioridazin: se adaug la 1 ml urin, 1 ml reactiv compus din 98 ml acid sulfuric 30% i 2 ml clorur feric 5%, cnd apare, n prezena tioridazinei, o coloraie roz deschis care se intensific i trece n albastru. Toate aceste teste pot fi executate i pe rezduu sau pe soluia extractiv. 2. Reactii de culoare ( pe rezduu sau soluia extractiv). a. Reacia chinhidronic i acid fosforic )Reacia Meunier): ntr-o eprubet se introduc 15 ml soluie extractiv obinut de la extagerea urinii (v. iuolare, pt. A) i 5 ml reactiv chinhidron-acid fosforic. Se agit puternic un minut. Apariia unei coloraii de la rouportocaliu la violet albastru n faza inferioar acid indic prezena fenotiazinelor. Coloraiile sunt stabile i au absorbii maxime cuprinse ntre 497 i 638 nm; principlele fenotiazine avnd urmtoarele absorbiimaxime: Clorpromazina.............527 nm Triproperazina.............509 nm Levomepromazina.......567 nm Trietiperazina...............636 nm Alimemazina................510 nm Flufenazina...................500 nm Proclorperazina............528 nm Tioridazina....................636 nm Trifluoperazina.............497 nm Promrtazina.............512 nm Numai n prezena catitilor mai mari cloroprotixin, faza acid inferioar se coloreaz n portocaliu palid. n acest caz,expunerea soluiei acide n lumina U.V. pune n eviden
331

fluorescena intens, datorit clorprotixemiei, iar absorbia maxim este la 497 nm, deci n afara zonei de absorbie a fenotiazinelor. reacia se poate aplica i pe rezidiuu, care la tratare cu 0,2-0,3 ml reactiv chinhidron-acid fosforic dezvolt coloraiile menionate, datorit fenoteazinelor. Reactiv chinhidron-acid fosforic: se amestec extemporaneu 1 ml soluie chinhidron 0,001 M sau benzoparachinon 0,001 M n diclor metan i 4 ml acid ortofosforic d = 1,71. Masa molecular a chinhidronei = 218g iar benzoparachinonei = 108 g. b. Reacii de indentificare cu reactivi oxidani: Pe hrtia de filtru se pun cteva picturi din extractul diclormetanic (cloroformic), se fixeaz locul petei cu creionul, se las s se evapore, se adug api cteva picturi din urmtorii reactivi (tabelul 9) Tabelul nr. 9 Reaciile romerganului i plegomazinului cu reactivii oxidani Culoarea Reactivi Apa de brom 10% Bicromat acetic 1 % Cloramin T 2% Acid percloric

Romergan Brun-rocat-verde Roz Violet Rou-viiniu

Plegomazin Roz-rou Roz Violet Rou-viiniu

c. Reacii cu reactivii speciali de culoare ai alcaloizilor: Reziduul (n funcie de fenotiazina studiat) d culori de la roz-rou-violet-albastru cu reactivi speciali de culoare ai alcaloizilor: R. Frhde, R. Marquis, R. Wasicki. d. Reacia de difereniere clorpromazinei de prometazin: Reziduul tratat cu sulfat mercuric 1% d o coloraie roie n prezena prometazinei, nu ns n prezena clorpromazinei. 3. Cromatografie pe strat subire: Faza staionar (suportul): cromatoplci de silicagel G Merck, activate timpde o or la 110C. Faza mobil: (Sistemul de solveni): S1 metanol amoniac (100 : 1,5 v/v); S2 benzen dioxan amoniac (60 : 35 : 5 v/v/v) S3 acid acetic glacial-etanol-ap (30 : 50 : 20 v/v/v) S4 acetat de amoniu-ap-metanol (3 g : 20 : 100 v/v/v) Proba de analizat: reziduul reluat cu 0,2-0,5 ml cloroform. Martori: fenotiazine (romergan, plegomazin) dizolvate n cloroform. Revelare: 1. R.Forrest spoturi roz-rou; 2. Reactivul Meunier spoturi violet; 3. Reactivul Marquis spoturi roz-rou. n tabelul nr. 10 sunt prezentate valorile Rf-urilor pentru cteva fenotiazine:
332

Tabelul nr.10 Rf-urile fenotiazinelor n diferite sisteme de solveni S1 Rf 0.42 0.49 0.42 0.61 0.28 0.45 S2 Rf 0.62 0.94 0.62 0.70 S3 Rf S4 Rf 0.51 0.71 0.51 0.55

Compusul Romergan (prometazin) Clorpromazin (Clordelazin) Romtiazin (Promazin) Neuleptil Nozinan Emetiral (Proclorperazin) 0.27 C. Dozare: 1. Metoda spectrofotometric (tehnica Meunier): Principiu: Fenotiazinele, fiind puternic donori de electroni, reacioneaz cu acceptori de electroni oxidani anorganici i organici n mediu puternic acid (acizi: sulfuric, clorhidric,azotic). Coloraiile produse de oxalaii anorganici puternici sunt nestabile, deoarece are loc o trecere de la o form iniial de radicli la ali compui de oxidare, care difer de radicalul cationic iniial prin proprietile lor spectrofotometrice. De asemenea, acizii tari au ei nii capacitate oxidant, putnd induce reacii colorate i cu alte medicamente (de exemplu, cu dibenzcicloheptadienele). Pentru a evita aceste inconveniente, sunt preferabili oxidanii organici, mai blnzi, ca chinhidrona ( benzoparachinona) precum i mediul de acid fosforic, cu un pKa mai mic dect acizii uzuali. Mecanismul reaciei, propus de Meunier, este urmtorul: fenotiazina acceptnd protonul de la acidu fosforic, trece ntr-un derivat cationic (1), cu azot cuaternar. Acesta cedeaz protonul chinhidronei sau benzoparachinonei, rezultnd radicalul cationic (2), colorat, concomitent benzoparachinona se hidrogeneaz n dou etape, ajungnd n final la hidrochinon:

+H
N R1 R2

+
N R1 H R2

N R2

OH
+H+

HO
333

OH
O

Reactivi: 1. Reactiv benzoparachinon-acid fosforic (v. identificare). 2. Soluia standard stoc: se aduc 0,1000g fenotiazin la 50 ml cu metanol. 1 ml = 2 mg. 3. Souie standard de lucru: se dilueaz soluia standard stoc n proporie de 1 : 100. 1 ml = 20 g. Modul de lucru: Se reia cu metanol reziduul de la extragerea cu solveni i se aduce la 25 ml ntr-un balon cotat. Se iau 2,5 ml din aceast soluie i se adaug 0,2 ml reactiv benzoparachinon-acid fosforic. Se citete extincia la spectrofotometru, la lungime de und caracteristic fiecrei fenotiazinei (v. identificare). Curba etalon se ntocmete ntre 10 i 50 g/2,5 ml metanol (0,5-2,5 ml soluie standard de lucru, completat la 2,5 ml metanol. Eprubeta 1 2 0.5 1.0 10 20 2.0 1.5 0.2ml-seagit

Reactivi(ml) Standard de lucru(1 ml=20g) Conc.g Metanol Reactiv Meunier =carcateristic fiecrei fenotiazine

3 1.5 30 1.0

4 2.0 40 0.5

5 2.5 50 -

6(M) 2.5

Valoarea extinciei pentru prob se raporteaz la curba de etalon, apoi se nmulete cu 10deoarece s-a lucrat cu 1/10 din prob- obinndu-se concentraia C a fenotiazinei, n g, n prob. Caculul: Rezultatele se exprim n mg/100 ml snge sau mg/1000 ml urin: mg/100 ml snge = C / A x 10 mg/1000 ml urin = C / A n care: C = concentraia fenotiazinei, n g; A = volumul de snge (urin) luat n lucru, n ml. Interpretarea rezultatelor: 1. n tratamente cu o doz unic, oral, de 25-150 mg clorpromazin, concentraiile sanguine au fost de ordinul microgramelor/100 ml snge; n tratamente prelungite cu doze zilnice de 600 mg/zi, de ordinul zecilor de micrograme/100 ml snge, iar n tratamente psihiatrice cu doze de 1-2 g de 150-300 g/100 ml i chiar 1000g/100 ml snge.
334

2. n intoxicaii cu 1,5-2 g clorpromazin, concentraiile sanguine au fost de 0,5-1,5 mg/100ml snge, iar n cazuri de deces, 1-44 mg/100ml snge, de 54-2110 (n medie366) mg/kg ficat.

Bibliografie Cotru, M. Toxicologie-principii generale, Ed. Junimea, Iai, 1978. Cotru, M. Toxicologia substanelor organice, Bucureti, Ed. Ministerul Industriei Chimice, 1985. Cotru, M., Proca, M. Toxicologie analitic, Bucureti, Ed. Medical, 1988. Cotru, M., Popa, L., Stan, T., Preda, N. Toxicologie, Bucureti, Ed. Didactic i pedagogic, 1991. Dnil, G., Cotru, M., Nechifor, M. Ghid de date toxicologice, Bucureti, Ed. Medical, 1984. Drochioiu, G., Mangalagiu, I., Dru, I. Elemente de teorie i practic toxicologic, Iai, Ed. Demiurg, 2001. Drochioiu, G., Mangalagiu I., Dru I. Biochimie general, Iai, Ed. Demiurg, 2002. Gofi, E., Ionic, F. Toxicologia medicamentului, Craiova, Ed. Medical Universitar, 2007. Ionescu, D., Drgan, S., Dehelean, C. Elemente de toxicologie a medicamentului, Timioara, Ed. Mirton, 2007. Stroescu, V. Farmacologie, Bucureti, Ed. Big All, 1999. Voicu, V. Toxicologie clinic, Bucureti, Ed. Albatros, 1997.

335

Cap. XIII Probleme speciale: otrviri diverse Sulfura de carbon, CS2 Sulfura de carbon este o substan volatil (p.f. 46oC), incolor, cu miros eterat Este inflamabil, exploziv, insolubil n ap, miscibil n solveni organici. Toxicocinetic. Sulfura de carbon ptrunde n corp pe cale respiratorie i, uneori, transcutanat i digestiv. Din cantitatea inhalat, marea majoritate se elimin respirator, restul este vehiculat de hematii i distribuit n esuturile grase. Majoritatea sulfurii de carbon absorbite este metabolizat la compui organici i anorganici cu sulf. Toxicodinamie. Aceast substan acioneaz asupra sistemului nervos i a metabolismului. Sulfura de carbon acioneaz ca antimetabolit al piridoxaminei, cu formare de compui ditiocarbamici, ceea ce explic deficiena n vitamina B6 n intoxicaiile cu aceast substan (fig. 15). Carena n vitamina B6 determin scderea formrii acidului nicotinic din triptofan, sinteza fiind deviat spre derivai xanturenici. Acidul nicotinic este un component al coenzimelor NAD i NADP, astfel nct sunt perturbate respiraia celular, glicoliza, sinteza acizilor grai, dependente de aceste coenzime. Sulfura de carbon reacioneaz cu gruprile NH2 proteice, rezultnd derivai ditiocarbamici i tiazolidone, chelateaz Zn, Mn, Cu, Mg, Co, inhibnd enzimele crora aceste metale le servesc drept cofacturi, cu dereglarea consecutiv a unor metabolisme. Doza letala este de 10 ml, iar doza toxic prin inhalare 2-3 mg/l. Simptomatologie. n intoxicaia acut se produce beia sulfocarbonic i apar manifestri neuropsihice (agitaie, halucinaii, delir), apoi stupoare, com i moarte. Intoxicaia subacut prezint cefalee, oboseal, urmate de psihoz maniaco-depresiv (impulsivitate, accese de furie, insomnie, halucinaii, depresiune). Intoxicaia cronic se manifest prinsindrom astenovegetativ urmat de lezarea organic a SNC cu manifestri de tip encefalopatie toxic i/sau polinevrit senzitivo-motorie; uneori este afectat nervul optic. Mai apar simptome digestive, endocrine (suprarenale, gonade), vasculare (ateroscleroz cerebral i renal). Contactul pielii cu sulfura de carbon poate provoca iritaii i uneori chiar forme de leziuni eczematoase. Primul ajutor const n splatur gastric cu suspensie de crbune i purgativ salin, iar la inhalare i contact, decontaminare prin splare cu ap i oxigenoterapie i/sau respiraie artificial.
S C S + HO-H2C N CH2 NH2 OH CH3 HO-H2C N CH2 NH OH CH3 C S SH

Piridoxamina

Ditiocarbamat

S C S +

R CH NH2 C=O OH

R CH C=O OH

NH C SH S H2 O

R CH O=C S

NH C S

Efecte toxice ale sulfurii de carbon (inhibarea piridoxaminei si reactia cu grupele NH2 proteice)

336

Toxicologie analitic. Sulfura de carbon se recolteaz din aer n soluii alcoolice de amine secundare. Din medii biologice, se antreneaz cu vapori de ap sau cu un curent de aer i fixare n soluie alcoolic de amine secundare. Identificarea se realizeaz prin formarea xantogenatului cupros galben, sau prin reacia cu amine secundare (formare de ditiocarbamat cupric galben), care se preteaz i la dozare. La persoanele expuse, se cerceteaz dietilditiocarbamaii, metabolii ai CS2 prin testul iodazidei (acest compus catalizeaz reacia de reducere a iodului de ctre azida de sodiu). Se mai pot utiliza tuburi Drger special calibrate pentru CS2.

Detergenii
Detergenii sunt substane tensioactive ce conin n molecul un fragment hidrofil i unul hidrofob. Interes toxicologic major prezint detergenii cationici (DL50 = 0,05 0,50 g/kg), urmai de detergenii anionici (DL50 = 2 7 g/kg), n timp ce detergenii neionici sunt practic netoxici (DL50 = 50 g/kg). Detergenii cationici pot determina colaps (aciune ganglioplegic) i paralizie respiratorie (aciune curarizant). Fiind substane tensioactive, detergenii faciliteaz absorbia digestiv sau cutanat a substanelor insolubile, favoriznd producerea efectelor toxice (cancerigene) ale acestora. Primul ajutor const n spltur gastric i purgativ salin. Antidotul pentru detergenii cationici const ntr-o soluie de spun, 5 g n 20 ml ap, apoi provocare de vrsturi.

Anilina, C6H5NH2
Anilina este un lichid incolor, uleios, care devine galben pn la brun la aer i la lumin. Are un miros puternic, caracteristic. Este puin solubil n ap, dar solubil n solveni organici. Concentraia maxima admisibil este de 5 mg/m3 aer. Toxicocinetic. Anilina ptrunde n organism respirator, transcutanat i digestiv. Dup absorbie, se distribuie n esuturile lipoide. Se metabolizeaz prin oxidare la fenilhidroxilamin, care se izomerizeaz parial la p-aminofenol, excretat urinar ca sulfo- i glucuronoconjugat. Faptul c biotransformarea anilinei conduce la metabolii comuni cu ai nitrobenzenului explic efectele toxice asemntoare ale celor dou substane. O fraciune din anilin se N-acetileaz. Toxicodinamie. Anilina se caracterizeaz prin aciune methemoglobinizant, hemolitic i neurotoxic. Se admite i o aciune cancerigen la nivelul vezicii urinare, care ns s-ar datora n special impuritilor (benzidina i -naftilamina). Local, anilina este iritant i necrozant: doza letal este de 1-2 g. Simptomatologie. n intoxicaia acut se observ aceleai manifestri ca la nitrobenzen: cianoz i consecinele hipoxiei (cefalee, greuri, vrsturi, confuzie, vertije, dezorientare, somnolen, stupoare, com). n plus apare iritaia cilor urinare i a vezicii. n cazurile grave intervin tulburri cardiovasculare, insuficien renal acut i moarte prin stare de oc. Intoxicaia cronic se exprim prin tulburri neurovegetative i afectare hepato-renal.

337

Primul ajutor. La ingerare se aplic spltur gastric cu soluie de KMnO4 1/10000, apoi purgativ salin; n rest, msurile indicate la nitrobenzen. Profilaxia presupune msurile generale de protecie. Toxicologie analitic. Anilina se determin din aer (recoltare n HCl diluat sau H2SO4 0,01 N) i medii biologice (distilare sau antrenare cu vapori de ap n mediu alcalin i extragere cu solveni organici). Identificarea se face prin reacia Hoffmann (ca izonitril), reacia moveinei (cu hipoclorit), reacia Jacquemin (cu fenol i hipoclorit) sau prin reacia de diazotare i cuplare. Se dozeaz prin reacia Jacquemin. De asemenea, se poate folosi metoda spectrofotometric cu cloramin T i fenol cnd se obine o coloraie albastr a crei intensitate este proporional cu cantitatea de anilin din prob. Pentru dozare, se mai face apel la metoda titrimetric cu soluie bromatbromur.

Nitrobenzenul, C6H5NO2 Nitrobenzenul este un lichid uleios, d = 1,2, glbui, cu miros de migdale amare, volatil (p.f. 211oC), puin solubil n ap, solubil n solveni organici. Concentraia maxim admisibil este de 5 mg/m3 aer. Toxicocinetic. Nitrobenzenul ptrunde n organism respirator, transcutanat i, rareori, digestiv. Este metabolizat la nitrozobenzen, fenilhidroxilamin i anilin sub aciunea reductazelor NADH- i NADPH-dependente microzomiale, hidroxilare la nucleu conducnd la compui fenolici in echilibru cu p-chinonmonooxima i p-chinonimina. Din cantitatea absorbuit, 50% se elimin pulmonar nemodificat, 25% urinar ca paminofenol i p-nitrofenol, ambii sulfo-i glucuronoconjugai. Toxicodinamie. Principalele aciuni toxice ale nitrobenzenului i metaboliilor si sunt: Aciunea methemoglobinizant (methemoglobina se obine prin oxidarea Fe2+ din hemoglobin la Fe3+). n mod normal, n organism exist un echilibru ntre MetHb existent

MetHb

+e e

Hb

n concentraie de 2 % raportat la Hb total) i Hb. Reconversia MetHb la Hb necesit donori de electroni, prin care Fe3+ trece n Fe2+:

338

Aceti donori sunt :

Glicoliza NADH NAD+ Diaforaza Ciclul oxidativ pentozic NADPH NADP+ MetHb-reductaza (II) G-SH

G-S-S-G

+e MetHb (Fe3+) e Hb (Fe2+)

Actiune direct

Actiune prin metaboliti

Substante oxidante (medicamente sau toxice)

Fig. 14. Echilibrul methemoglobin-hemoglobin

NADP (format n cursul glicolizei) trece un e pe MetHb prin intermediul acceptorului diaforaza; NADPH (format n cursul oxidrii glucozei pe calea untului pentozic) trece un e pe MetHb prin intermediul acceptorului MetHb-reductaza; Glutationul redus (G-SH) transform H2O2 (prezent n mici cantiti n hematii) n H2O; altfel, H2O2 n exces ar oxida Hb la MetHb.

339

NO2
Reducere

NO

NHOH

NH2

Nitrobenzen Oxidare NO2

Nitrozobenzen NO

Fenilhidroxilamin NH2

Anilin

OH p- nitrofenol

OH p- nitrozofenol

OH p-aminofenol

NHOH

NH

O p-chinonmonooxima

O p-chinonimina

Biotransformarea nitrobenzenului (dup Bedeleanu si Kory)

n prezena oxidanilor, acestea desprind un e i trec Fe2+ n Fe3+ cu o vitez care depete capacitatea de reducere a donorilor de electroni; ca urmare, apare methemoglobinemia. Hb este transportor de oxigen, deoarece formeaz cu acesta HbFe2+O2 (oxiferohemoglobin). Dimpotriv, MetHb nu este transportor de oxigen, deoarece formeaz HbFe3+OH (hidroxiferihemoglobina) unde a treia valen a fierului este blocat cu gruparea OH i, n consecin, apar hipoxemie i hipoxie. Aciunea hemolitic: la methemoglobinemie masiv se produce liza hematiilor, cu eliberarea Hb n stroma globular i trecerea ei n plasm. Hb plasmatic nu transport oxigenul i este nefrotoxic (precipit n tubiirenali). Datorit afinitii pentru proteine, fenilhidroxilamina (i, posibil, i ali intermediari din biotransformarea nitrobenzenului) degradeaz ireversibil Hb prin desprinderea hemului, denaturarea globinei (prin reacie cu gruprile SH i S-S) i ncorporeaz un atom de sulf n ciclurile pirolice ale hemului; apar sulfhemoglobina i verdoglobina. Aciunea neurotoxic (deprimarea SNC) se datoretenitrobenzenului (liposolubil) i anoxiei determinate de methemoglobinemie. Aciunea cardiotoxic se manifest asupra fibrei miocardice i a sistemului de conducere i se explic prin afinitatea fenilhidroxilaminei pentru proteinele tisulare, ca i prin anoxie. Aciunea hepatotoxic se explic prin afinitatea metaboliilor nitrobenzenului pentru proteinele tisulare.
340

 Aciunea iritant i sensibilizant prin delipidare, rezultnd dermatoze i aciune indirect alergic (prin metaboliii cu afinitate pentru proteine) asupra tegumentelor i mucoaselor respiratorii, determinnd reacii alergice cutanate i respiratorii. Doza letal la ingerare este de 1-2 g. Simptomatologie. Intoxicaia acut se exprim clinic prin cianoz datorit methemoglobinemiei. Dac MetHb depete 15%, se remarc cianoza extremitilor. La 1540% MetHb intervine anoxia (cefalee, ameeli, dispnee). Peste 40% MetHb apar anxietate, astenie, greuri, tahicardie, tulburri audio-vizuale i de echilibru. Peste 75% MetHb se instaleaz depresiunea central, cu deces practic inevitabil. Tardiv, dac victima supravieuiete, se manifest consecinele hemolizei (nefropatie tubulo-renal, icter hemolitic, anemie hemolitic). La ingerare apar i tulburri digestive. Contactul cutanat dertermin dermatoze. Intoxicaia cronic se manifest prin tegumente palide, sindrom astenovegetativ, tulburri digestive, afectare hepatorenal. Primul ajutor const n spltur gastric cu suspensie de crbune, urmat de purgativ salin. La inhalare, se face apel la splare abundent cu ap i oxigenoterapie. Se administreaz albastru de metilen. Toxicologie analitic. Nitrobenzenul se cerceteaz din aer sau medii biologice (antrenare cu vapori de ap n mediu de acid tartric i extragere cu eter, apoi reducere cu Zn i HCl la anilin, eliberarea anilinei-baz prin alcalinizarea mediului i identificarea/dozarea acesteia. Nitrobenzenul se mai poate determina polarografic i spectrofotometric, prin reacia de formare a unui azoderivat de culoare portocalie, folosind ca reactiv de cuplare N-(1naftiletilendiamina)-hidrocloric.. Din urin, se extrage metabolitul conjugat cu eter, dup hidroliz. Methemoglobina se determin prin dozarea ei pe baza absorbiei caracteristice la 630 nm, apoi se transform MetHb n cianmethemoglobin (CNMetHb) i se msoar absorbia acesteia de asemenea la 630 nm. n paralel se dozeaz Hb total prin tratare cu fericianur i apoi transformare n CNMetHb.

341

Cap. XIV. Toxicologul ca martor expert

Toxicologul criminalist este adesea chemat s depun mrturie n instan cu privire la constatrile sale analitice i la interpretarea lor. Dei puini toxicologi au o diplom medical, acetia stabiliesc frecvent n instan efectele drogurilor sau a otrvurilor asupra organismului uman. Cnd este ntrebat cu privire la constatrile sale analitice, toxicologul trebuie s arate n primul rnd c el a pstrat toate probele analizate. Acesta trebuie s declare n scris c toate probele au fost recoltate de la victima la care se face referire n proces i c probele au fost stocate nainte, n timpul i dup analiz ntr-un mod care a mpiedicat persoane neautorizate s le manipuleze fraudulos. Toxicologul trebuie s fie bine familiarizat cu principiile, procedurile i limitele testelor pe care le realizeaz. Interpretarea lui trebuie s reflecte cunoaterea literaturii de specialitate, precum i propria sa experien cu cazuri similare. Dei poate c nu este de acord cu ali experi n domeniu, toate concluziile sale trebuie s se bazeze pe cunotine tiinifice sau medicale solide. Ca i n cazul tuturor martorilor experi, toxicologul criminalist trebuie s prezinte toate dovezile cu onestitate i integritate. Dac el nu cunoate rspunsul corect la o ntrebare, acesta trebuie s rspund c nu tie. Prezentarea de dovezi fizice n instan de ctre un expert este testul final de valabilitate a probelor. Concluziile trase de expert trebuie s ndeplineasc standardele riguroase ale dovezilor tiinifice i s reziste la o examinare ncruciat a avocatului la proces. Dovezile fizice i concluziile tiinifice trebuie explicate juriului ntr-un mod uor de neles pentru a se putea ajunge la un verdict ntr-un caz anume. De aceea, expertul criminalist trebuie s cntreasc imparial toate datele acumulate i, dac este convins sau nu de vinovia inculpatului, s prezinte doar fapte i concluzii valide n instan. Altfel, probele sale pot fi puse la ndoial, iar valoarea sa ca expert va scade.

Inducerea mrturiei la un suspect n multe cazuri, prezintarea de informaii faptice bazate pe probe fizice unui individ bnuit de crim, cum ar fi sngele victimei identificat pe hainele sale sau amprente gsite pe o arm, l va determina s recunoasc implicarea ntr-o crim. Acelai lucru se poate ntmpla dac asupra sa au fost gsite droguri sau substane toxice interzise. In principiu, foarte muli infractori regret faptele, doresc s se despovreze de zbuciumul sufletesc, mai ales dac sunt la prima abatere. Teama de pedeaps sau de necunoscut i poate determina s-i amne mturia. De aceea, dovedirea acestora este foarte important i pentru simplificarea procesului de justiie. Pe de alt parte, unele persoane care nu au comis fapte penale recunosc vinovii nchipuite pentru a scpa de teama unei pedepse mai mari. In acest caz este meritul criminalitilor de a-i exonera de vin aducnd dovezi clare ale nevinoviei acestor persoane i ndreptnd ancheta ctre adevraii fptai. Pot fi gsite dovezile fizice c o persoan nu a comis o crim. Un exemplu de acest tip de dovezi ar fi prezena ADN-ului in lichidul seminal din probe vaginale la o victim a unui violul, care nu se potrivete suspect.
342

Documentare i valorificarea datelor

Calitatea dovezilor fizice aduse n instana de judecat depinde de buna observare, documentare, de colectare, conservarea, ambalarea i de prelevarea probelor la locul crimei, precum i de la victim i suspect. Acest lucru edepinde de calificarea i meticulozitatea de anchetatorilor locul crimei, a detectivilor i patologilor implicai n caz, precum i de calitatea metodelor tiinifice utilizate de ctre toxicologii medico-legali. Acest lucru este realizat prin instruirea corespunztoare i experiena anchetatorilor i examinarea tiinific a probelor fizice n laborator. Pstrarea dovezilor fizice trebuie s se menin pe parcursul ntregului proces, inclusiv analiza i stocarea ulterioar. Acest lucru este necesar pentru a asigura admisibilitatea probelor fizice n cadrul procedurilor judiciare i la procesul de acuzat. Mai mult, probele fizice pot fi solicitate pentru contraexpertiz i, dac nu sunt corect conservate, etichetate, ambalate, pot conduce la alte concluzii. Este necesar s se menin relaia dintre dovezile fizice nainte de colectare i de ambalare de la locul crimei. Astfel, se realizeaz fotografii, note scrise, i diagrame care arat unde erau obiectele incriminate. Suspectul consumator de droguri poate prezenta urme de injecii, poate avea contuzii etc. Ambalajele trebuie s fie corespunztoare i etichetate, iar toxicologul s nu introduc accidental alte elemente la locul faptei. Trebuie luate msuri pentru a nu modifica, denatura sau contamina dovezile nainte de analiz. Elementele colectate ar trebui marcate cu un numr secvenial, raportat la locul specifice n care a fost descoperit notnd ora i data i parafat de ctre persoana colectarea probelor. Materiale cu risc biologic, cum ar fi sngele i fluidele corpului, ar trebui plasate n containere marcate n mod clar. Protocoalele de colectare a probelor i de ambalare ar trebui respectate cu strictee. De exemplu, materialele ptate de snge ar trebui uscate bine la aer, nainte de ambalare. Aceasta evit activitate bacterian care ar putea mpiedica analize ulterioare. Containere speciale sunt necesare pentru colectarea de urmelor de prob pentru a evita pierderea i contaminarea. O bun comunicare ntre laborator i tehnicienii de la scena crimei este esenial pentru a se asigura c procedurile standard sunt respectate.

Probleme teoretice speciale n toxicologia judiciar

n mod normal, n cadrul biologiei moleculare actuale, se studiaz numai aciunea toxicilor la nivel molecular, la fel cum se studiaz substanele chimice din natur fr a le raporta la legturile acestora cu mediul nconjurtor. Toxicii prezint ns efecte i asupra structurilor supramoleculare i a nivelurilor superioare celui molecular. Structura energetic a corpului viu poate fi afectat prin simpla prezen a unei substane, aa cum, de pild, este afectat un aparat electronic atunci cnd introducem obiecte metalice n acesta; nu conteaz compoziia i reacia chimic a componentelor sale cu circuitele electrice, ci doar modificarea configuraiei circuitelor. Substanele strine corpului prezint structuri i proprieti diferite i sunt transformate n corp n substane proprii acestuia, prin efortul organismului. Pentru a le degrada i transforma n substane proprii au loc reacii care restabilesc armonia dintre elementele constitutive ale corpului. Dac se realizeaz acest lucru, are loc vindecarea. Dar, pentru a le degrada, organismul trebuie s le cunoasc. n general, toate substanele, chiar i cele

343

alimentare obinuite, luate n cantitate prea mare devin toxice, deoarece organismul nu este capabil sa le digere, s le transforme. Pentru degradarea i asimilarea produilor rezultai, corpul face un efort care-l fortific aa cum se ntresc muchii ca urmare al unui efort gradat continuu. Dac solicitrile depesc posibilitile organismului, acesta, dimpotriv, slbete. Aceste substane se comport atunci ca toxici. Dac substanele chimice utilizate curent ajung n corp, acestea pot fi mai uor sau mai greu de degradat, n funcie de asemnarea lor cu substanele naturale cunoscute. De anumite substane organice, corpul nu se poate debarasa i acestea se depoziteaz, precum DDT n grsimi, afectndu-le funciile lor specifice. In corp, apar astfel structuri strine care perturb structural organismul (Bott, 1976). Dup o concepie cibernetic, toate organismele vii se afl n echilibru nestabil cu mediul nconjurtor. Organismul viu reprezint o entitate de sine stttoare, relativ independent fa de mediul extern care prezint procese coordonate pentru a-i conserva identitatea, structura proprie i funciile specifice. De aceea, o substan strin corpului intervine n echilibrul organismului n mod pasiv, provocnd reacia acestuia, sau activ prin reacia sa cu componentele moleculare ale acestuia. Distingem astfel: a) substane benefice echilibrului organismului, cum ar fi apa pur, aminoacizii eseniali, unele vitamine, etc.; b) substane i produse utilizate ca alimente i care au un caracter relativ nociv numai n cantitate mare; c) medicamente, care, n doze ponderale, readuc la normal echilibrul perturbat. ntre acestea se afl i remediile homeopatice care reprezint soluii cu concentraii infinitezimale, unele chiar dincolo de limitele numrului lui Avogadro, capabile s ofere corpului bolnav informaia de care are nevoie pentru autoechilibrare; d) substane toxice, factori care au tendina de a rupe echilibrul dintre individ (sau descendena sa) i mediul nconjurtor acetia putnd avea o natur fizic, chimic sau chiar psihic. Toxicul i poate manifesta aciunea n mod direct prin reacia sa cu unele componente ale corpului (cianurile reacioneaz cu ionii Fe3+ din citocromoxidaza pe care o inactiveaz) sau indirect, prin produii si de degradare (formaldehida i acidul formic provenii din metanol sunt, la rndul lor, toxici). De asemenea, unii toxici cu aciune lent, cum ar fi substanele cancerigene, suprasolicit organismul, pn la epuizare energetic ntr-un proces de ndeprtare al acestora sau a produselor lor de degradare. n acest caz, toxicii se manifest pasiv, iar organismul uman sau animal acioneaz nespecific asupra lor, n timp ce acetia perturb funciile organelor i esuturilor prin prezena lor sau prin produsele lor de degradare i compuii lor cu moleculele existente n organism. Otrvirea reprezint ansamblul de semne i simptome constituind o stare patologic care se instaleaz dup ptrunderea unei otrvi n organism. Ca urmare se produce dereglarea, alterarea sau chiar abolirea unor funcii vitale, uneori cu sfrit letal. Hans Selye (1984) constat n cazul tuturor agresiunilor, inclusiv a intoxicaiilor, o reacie stereotip din partea organismului afectat. A numit-o sindrom general de adaptare, deoarece aceasta permite corpului s rspund activ factorilor din mediul extern. Sindromul general de adaptare cuprinde mai multe faze, i anume: o faz de alarm, o faz de adaptare i, n fine, una de epuizare, n care caz sistemele de protecie ale corpului sunt depite. n oricare din aceste etape de rspuns la agresiunea toxicului, n funcie de intensitatea acestuia, animalul sau omul pot muri. Toxicii cu aciune moderat, dar de lung durat determin o a patra faz a sindromului general de adaptare: faza canceroas.

344

Bibliografie general
Bogusz, M. J. (2008) Opioids: methods of forensic analysis. In Forensic Science, Vol. 6: Handbook of analytical separation, M. J. Bogusz Edit.. 2nd Ed., Elsevier Sci. Publ., Amsterdam, Boston, Heidelberg, London, New York, Oxford, Paris, San Diego, San Francisco, Singapore, Sydney, Tokyo, pp.3-117. Crouch, D.J., Hersch, R.K., Cook, R.F., Frank, J.F., Walsh, J.M. (2002) J. Anal. Toxicol., 26, 493. Dhawan, B. N., Cesselin, F., Raghubir, R., Reisine, T., Bradley, P. B., Porthogese, P. S., Hamon, M. (1996) Classification of opioid receptors. Pharmacol. Rev., 48, 567-592. Jenkins, A. J., Goldberger, B. A. (2002) On-site drug testing. Humana Press, Totowa, New Jersey. Kilpatrick, G. J., Smith, T. W. (2005) Morphine-6-glucuronide: actions and mechanisms. Med. Res. Reviews, 25, 521-544. Sporer, K. A. (2003) Strategies for preventing heroin overdose. Brit. Med. J., 326, 442-444. Proca, M., E. Butnaru, L. Agoroaei Lucrri practice de toxicologie. Universitatea de medicin i farmacie Gr. T. Popa Iai, Centrul de multiplicare UMF, Iai, 1996. T. J. Haley, W. O. Berndt, Handbook of toxicology, Harpen and Row, Cambridge, New York, Philadelphia, 1987. Kimmel, C. A., Buelke-Sam, J. Developmental toxicology, Raven Press, 1981. Cotru, M. Implicaii ale consumului de etanol n industria chimic. M.I.Ch., Iai, 1983. Cotru, M. Toxicologia substanelor organice. Edit. M.I.Ch., Iai, 1985. Cotru, M. Toxicologie, Edit. did i ped., Bucureti, 1993. Drochioiu, G., Mangalagiu, I., Dru, I. Toxicologie, Edit. Tao, Suceava, 1999. Castiglioni, S., Zuccato, E., Fanelli, R. (eds.) Mass spectrometric analysis of illicit drugs in the environment. Wiley-Interscience Series on Mass Spectrometry, 2011, Ed., ISBN 978-0-470-52954-6 A.J. Jenkins and B.A. Goldberger (Eds.), On-site drug testing. Humana Press, Totowa, New Jersey, 2002. M. Gronholm and P. Lillsunde, Forensic Sci. Int., 121 (2001) 37. R. Wennig, M. Moeller, J.M. Haguenoer, A. Marocchi, F. Zoppi, B.L. Smith, R. de la Torre, C.A. Carstensen, A. Goerlach-Graw, J. Schaeffler and R. Leibberger, J. Anal. Toxicol., 22 (1998) 148. B. Buchan, J.M. Walsh and P.E. Leaverton, J. Forensic Sci., 43 (1998) 395. C. Barrett, C. Good and C. Moore, Forensic Sci. Int., 122 (2001) 163. S. George and S. Parmar, J. Anal. Toxicol., 26 (2002) 233. J.M. Holler, T.Z. Bosy, K.L. Klette, R. Wiegand, J. Jemionek and A. Jacobs, J. Anal.
345

Toxicol., 28 (2004) 489. E.J. Cone, S. Dickerson, B.D. Paul and J.M. Mitchell, J. Anal. Toxicol., 16 (1992) 72. D.A. Armbruster, R.H. Scharzhoff, E.C. Hubster and M.K. Liserio, Clin. Chem., 39 (1993) 2137. M.L. Smith, E.T. Shimomura, J. Summers, B.D. Paul, D. Nichols, R. Shippee, A.J. Jenkins, W.D. Darwin and E.J. Cone, J. Anal. Toxicol., 24 (2000) 522. E.J. Cone, L. Presley, M. Lehrer, W. Seiter, M. Smith, K.W. Kardos, D. Fritch, S. Salamone and R.S. Niedbala, J. Anal. Toxicol., 26 (2002) 541. M.L. Cheever, G.A. Armendariz and D.E. Moody, J. Anal. Toxicol., 23 (1999) 500. K. Moore, C. Werner, R.M. Zannelli, B. Levine and M.L. Smith, Forensic Sci. Int., 106 (1999) 93. P. Kemp, G. Sneed, T. Kupiec and V. Spiehler, J. Anal. Toxicol., 26 (2002) 504. S. Kerrigan and W.H. Phillips, Clin. Chem., 47 (2001) 540. H. Schu tz, F. Erdmann, M. Risse and G. Weiler, Arzneimittelforschung, 52 (2002) 716. J.T. Cody and S. Valtier, J. Anal. Toxicol., 25 (2001) 466. J.T. Cody, S. Valtier and J. Kuhlman, J. Anal. Toxicol., 25 (2001) 572. K.E. Rasmussen, S. Pedersen-Bjergaard, M. Krogh, H.G. Ugl and T. Grnhaug, J. Chromatogr. A, 873 (2000) 3. H.G. Ugland, M. Krogh and K.E. Rasmussen, J. Chromatogr. A, 749 (2000) 85. T.S. Ho, S. Pedersen-Bjergaard and K.E. Rasmussen, J. Chromatogr. A, 963 (2002) 3. T.S. Ho, S. Pedersen-Bjergaard and K.E Rasmussen, Analyst, 127 (2002) 608. V. Marko, L. Soltes and K. Radova, J. Chromatogr. Sci., 28 (1990) 403. L. Soltes, Biomed. Chromatogr., 6 (1992) 43. A. Gelencser, G. Kiss, Z. Krivacsy, Z. Varga-Puchony and J. Hlavay, J. Chromatogr. A, 693 (1995) 217. J. Scheurer and C.M. Moore, J. Anal. Toxicol., 16 (1992) 264. E.M. Thurman; M.S. Mills, Solid phase extraction: principles and practice, John Wiley & Sons, New York, 1998. D.L. King, M.J. Gabor, P.A. Martel and C.M. ODonnell, Clin. Chem., 35 (1989) 163. D.D. Blevins and D.O. Hall, LC-GC Int. (1998), Suppl., September 17, pp. 1621. F. Degel, Clin. Biochem., 29 (1996) 529. R.A. De Zeeuw, J. Wijsbeek and J.P. Franke, J. Anal. Toxicol., 24 (2000) 97. J.O. Svensson, A. Rane, J. Sa we and F. Sjo qvist, J. Chromatogr., 230 (1982) 427. A.I. Bouquillon, D. Freeman and D.E. Moulin, J. Chromatogr., 577 (1992) 354. I. Papadoyannis, A. Zotou, V. Samanidou, G. Theodoridis and F. Zougrou, J. Liq. Chromatogr., 16 (1993) 3017. G. Theodoridis, I. Papadoyannis, H. Tsoukali-Papadopoulou and G. Vasilikiotis, J. Liq. Chromatogr., 18 (1995) 1973. A. Geier, D. Bergemann and L. von Meyer, Int. J. Legal Med., 109 (1996) 80. W. Huang, W. Andollo and W.L. Hearn, J. Anal. Toxicol., 16 (1992) 307.
346

X.H. Chen, A.L.C. Hommerson, P.G.M. Zweipfenning, J.P. Franke, C.W. Harmen-Boverhof, K. Ensing and R.A. de Zeeuw, J. Forensic Sci., 38 (1993) 668. H. Lord and J. Pawliszyn, J. Chromatogr. A, 885 (2000) 153. F. Sporkert and F. Pragst, J. Chromatogr. B, 746 (2000) 255. A.M. Bermejo, R. Seara, A.C. Dos Santos Lucas, M.J. Tabernero, P. Fernandez and R. Marsili, J. Anal. Toxicol., 24 (2000) 66. A.C. Dos Santos Lucas, A. Bermejo, P. Fernandez and M.J. Tabernero, J. Anal. Toxicol., 24 (2000) 93. S.W. Myung, S. Kim, J.H. Park, M. Kim, J.C. Lee and T.J. Kim, Analyst, 124 (1999) 1283. U. Staerk and W.R. Kulpmann, J. Chromatogr. B, 745 (2000) 399. N. Fucci, N. De Giovanni and M. Chiarotti, Forensic Sci. Int., 134 (2003) 40. G. Guiochon, Int. Lab., 29 (1999) 13C. V. Cirimele, P. Kintz, R. Majdalani and P. Mangin, J. Chromatogr. B, 673 (1995) 173. W.E. Brewer, R.C. Galipo, K.W. Sellers and S.L. Morgan, Anal. Chem., 73 (2001) 2371 D.L. Allen, K.S. Scott and J.S. Oliver, J. Anal. Toxicol., 23 (1999) 16. K.S. Scott and J.S. Oliver, Med. Sci. Law., 39 (1999) 77. C. Staub, Forensic Sci. Int., 84 (1997) 295. C. Radcliffe, K. Maguire and B. Lockwood, J. Biochem. Biophys. Methods, 43 (2000) 261. Z. Fater, Z. Samu, M. Szatmary and S. Nyiredy, Acta Pharm. Hung., 67 (1997) 211. A.M. Al-Amri, R.M. Smith, B.M. El-Haj and M.H. Jumaa, Forensic Sci. Int., 140 (2004) 175. A.M. Al-Amri, R.M. Smith and B.M. El-Haj, Anal. Bioanal. Chem, 382 (2005) 830. J.L. Janicot, M. Caude and R. Rosset, J. Chromatogr., 437 (1988) 351. L. Krenn, S. Glantschnig and U. Sorgner, Chromatographia, 47 (1998) 21. V.C. Trenerry, R.J. Wells and J. Robertson, J. Chromatogr. A, 718 (1995) 217. I.S. Lurie, S. Panicker, P.A. Hays, A.D. Garcia and B.L. Geer, J. Chromatogr. A, 984 (2003) 109. M.J. Bogusz, Opioid agonists, in: M.J. Bogusz (Ed.) R.M. Smith (Series Ed.), Forensic Science, Handbook of Analytical Separations, Vol. 2. Elsevier Sciences, Amsterdam, 2000, pp. 365. K. Bjerver, J. Johnsson and J. Schuberth, J. Pharm. Pharmacol., 34 (1982) 798. G. Fritschi and W.R. Prescott Jr, Forensic Sci. Int., 27 (1985) 111. R.E. Struempler, J. Anal. Toxicol., 11 (1987) 97. A.B. Zebelman, B.L. Troyer, G.L. Randall and J.D. Batjer, J. Anal. Toxicol., 11 (1987) 131. H.N. ElSohly, M.A. ElSohly and D.F. Stanford, J. Anal. Toxicol, 14 (1990) 308. C.M. Selavka, J. Forensic Sci., 36 (1991) 685. K.D. Meneely, J. Forensic Sci., 37 (1992) 1158. M.G. Pelders and J.J.W. Ros, J. Forensic Sci., 41 (1996) 209. G. Casella, A.H.B. Wu, B.R. Shaw and D.W. Hill, J. Anal. Toxicol., 21 (1997) 376. C. Meadway, S. George and R. Braithwaite, Forensic Sci. Int., 96 (1998) 29. M.R. Moeller, K. Hammer and O. Engel, Forensic Sci. Int., 143 (2004) 183. R.J. Lewis, R.D. Johnson and R.A. Hattrup, J. Chromatogr. B, 822 (2005) 137.
347

T.P. Rohrig and C. Moore, J. Anal. Toxicol., 27 (2003) 449. M. Thevis, G. Opfermann and W. Scha nzer, J. Anal. Toxicol., 27 (2003) 53. W. Van Thuyne, P. Van Eenoo and F.T. Delbeke, J. Chromatogr. B, 785 (2003) 254. C. Kollias-Baker and R. Sams, J. Anal. Toxicol., 26 (2002) 81. N.K. Nair, V. Navaratnam and V. Rajananda, J. Chromatogr., 366 (1986) 363. A. Sperling, J. Chromatogr., 538 (1991) 269. C. Barnfield, S. Burns, D.L. Byrom and A.V. Kemmenoe, Forensic Sci. Int., 39 (1988) 107. H. Neumann, Forensic Sci. Int., 44 (1990) 85. H. Neumann, Forensic Sci. Int., 69 (1994) 7. E. Kaa, Forensic Sci. Int., 64 (1994) 171. A. Sibley, Forensic Sci. Int., 77 (1996) 159. 97 R.B. Myors, P.T. Crisp, S.V. Skopec and R.J. Wells, Analyst, 126 (2001) 679. L. Stromberg, L. Lundberg, H. Neumann, B. Bobon, H. Huizer and N.W. van der Stelt, Forensic Sci. Int., 114 (2000) 67. S.P. Sharma, B.C. Purkait and S.C. Lahiri, Forensic Sci. Int., 152 (2005) 235. P. Esseiva, F. Anglada, L. Dujourdy, F. Taroni, P. Margot, E. Du Pasquier, M. Dawson, C. Roux and P. Doble, Talanta, 67 (2005) 360. R. Brenneisen, F. Hasler and D. Wursch, J. Anal. Toxicol., 26 (2002) 561. B.M. El-Haj, A.M. Al-Amri and H.S. Ali, Forensic Sci. Int., 145 (2004) 41. J. Cartier, O. Gueniat and M.D. Cole, Sci. Justice, 37 (1997) 175. I.S. Lurie and S.M. Carr, J. Liquid Chromatogr., 9 (1986) 2485. I.S. Lurie and K. Mc Guiness, J. Liquid Chromatogr., 10 (1987) 2189. P.A. Hays and I.S. Lurie, J. Liquid Chromatogr., 14 (1991) 3513. A. Johnston and L.A. King, Forensic Sci. Int., 95 (1998) 47. R. Dams, T. Benijst, W. Gunther, W. Lambert and A. De Leenheer, Anal. Chem., 74 (2002) 3206. M.M.K. Reddy, P. Ghosh, S.N. Rasool, R.K. Sarin and R.B. Sashidhar, J. Chromatogr. A, 1088 (2005) 158. F. Tagliaro and F.P. Smith, Trends Anal. Chem., 15 (1996) 513. F. Tagliaro, S. Turina and F.P. Smith, Forensic Sci. Int., 77 (1996) 211. I.S. Lurie, D.S. Anex, Y. Fintschenko and W.Y. Choi, J. Chromatogr. A, 924 (2001) 421. I.S. Lurie, P.A. Hays, A.E. Garcia and S. Panicker, J. Chromatogr. A, 1034 (2004) 227. I.S. Lurie, P.A. Hays and K. Parker, Electrophoresis, 25 (2004) 1580. N. Anostos, N.W. Barrett, S.W. Lewis, J.R. Pearson and K.P. Kirkbridge, J. Forensic Sci., 50 (2005) 1039. H. Neumann and M. Gloger, Chromatographia, 16 (1982) 261. M. Chiarotti, N. Fucci and C. Furnari, Forensic Sci. Int., 50 (1991) 47. A.F. Hernandez, A. Pla, J. Moliz, F. Gil, M.C. Gonzalvo and E. Villanueva, J. Forensic Sci., 37 (1992) 1276. F. Besacier, H. Chaudron-Thozet, M. Rousseau-Tsangaris, J. Girard and A. Lamotte, Forensic Sci. Int., 85 (1997) 113. T. Bora, M. Merdivan and C. Hamamci, J. Forensic Sci., 47 (2002) 959.
348

R. Dams, T. Benijst, W.E. Lambert, D.L. Massart and A.P. De Leenheer, Forensic Sci. Int., 123 (2001) 81. J.G. Umans, T.S.K. Chiu, R.A. Lipman, M.F. Schulz, S.U. Shin and C.E. Inturrisi, J. Chromatogr., 233 (1982) 213. C.E. Inturrisi, M.B. Bax, K.M. Foley, K. Schutz, S.U. Shin and R.W. Houde, New Engl. J. Med., 310 (1984) 1213. A.J. Jenkins, R.M. Keenan, J.E. Heningfield and E.J. Cone, J. Anal. Toxicol., 18 (1994) 317. E.J. Cone, B.A. Holicky, T.M. Grant, W.D. Darwin and B.A. Goldberger, J. Anal. Toxicol., 17 (1993) 327. G. Skopp, B. Ganssmann, E.J. Cone and R. Aderjan, J. Anal. Toxicol., 21 (1997) 105. E.J. Cone, P. Welch, J.M. Mitchell and B.D. Paul, J. Anal. Toxicol., 15 (1991) 1. J. Fehn and G. Megges, J. Anal. Toxicol, 9 (1985) 134. B.D. Paul, J.M. Mitchell, L.D. Mell and J. Irving, J. Anal. Toxicol., 13 (1989) 2. R.W. Romberg and V.E. Brown, J. Anal. Toxicol., 14 (1990) 58. D.C. Fuller and W.H. Anderson, J. Anal. Toxicol., 16 (1992) 315. C. Meadway, S. George and R. Braithwaite, Forensic Sci. Int., 127 (2002) 136. W.H. Soine, Med. Res. Rev., 6 (1986) 41. C.L. ONeal and A. Poklis, J. Anal. Toxicol., 21 (1997) 427. C.L. ONeal and A. Poklis, Forensic Sci. Int., 95 (1998) 1. N. McLachlan-Troup, G.W. Taylor and B.C. Trathen, Addict. Biol., 6 (2001) 223. R. Brenneisen and F. Hasler, J. Forensic Sci., 47 (2002) 885. H.J. Derks, K. Van Twillert, D.P. Pereboom-De Fauw, G. Zomer and J.G. Loeber, J. Chromatogr., 370 (1986) 173. H. Hanisch and L.v. Meyer, J. Anal. Toxicol., 17 (1993) 48. J. Gerostamoulos, K. Crump, I. McIntyre and O.H. Drummer, J. Chromatogr., 617 (1993) 152. A.S. Low and R.B. Taylor, J. Chromatogr. B, 663 (1995) 225. R. Dams, T. Benijst, W.E. Lambert and A.P. De Leenheer, J. Chromatogr. B, 773 (2002) 53. P. Fernandez, C. Vasquez, L. Morales and A.M. Bermejo, J. Appl. Toxicol., 25 (2005) 200. 152 M.J. Bogusz, R.D. Maier, M. Erkens and U. Kohls, J. Anal. Toxicol., 25 (2001) 431. F. Musshoff, J. Trafkowski and B. Madea, J. Chromatogr. B, 811 (2004) 47. M. Katagi,M. Nishikawa,M. Tatsuno, A.Miki and H. Tsushihashi, J. Chromatogr. B, 751 (2001) 177. M.G. Klous, E.J. Rook, M.J.X. Hillebrand, W. van den Brink, J. van Ree and J. Beijnen, J. Anal. Toxicol., 29 (2005) 564. R.B. Taylor, A.S. Low and R.G. Reid, J. Chromatogr. B, 675 (1996) 213. W.S. Wu and J.L. Tsai, Biomed. Chromatogr., 13 (1999) 216. A.B. Wey and W. Thormann, J. Chromatogr. A, 916 (2001) 225. J. Schuberth and J. Schuberth, J. Chromatogr., 490 (1989) 444. F. Musshoff and T. Daldrup, Int. J. Leg. Med., 106 (1993) 107. R. Wasels and F. Belleville, J. Chromatogr. A, 674 (1994) 225. W.L. Wang, W.D. Darwin and E.J. Cone, J. Chromatogr. B, 660 (1994) 279.
349

B.A. Goldberger, E.J. Cone, T.M. Grant, Y.H. Caplan, B.S. Levine and J.E. Smialek, J. Anal. Toxicol., 18 (1994) 22. M.R. Moeller and C. Mueller, Forensic Sci. Int., 70 (1995) 125. J.G. Guillot, M. Lefebvre and J.P. Weber, J. Anal. Toxicol., 21 (1997) 127. P.P. Rop, M. Fornaris, T. Salmon, J. Burle and M. Bresson, J. Anal. Toxicol., 21 (1997) 232. B. Fryirs, M. Dawson and L.E. Mather, J. Chromatogr. B, 693 (1997) 51. S. Pichini, I. Altieri, M. Pellegrini, P. Zuccaro and R. Pacifici, Mass Spectrom. Rev., 18 (1999) 119. P. Zuccaro, R. Ricciarello, S. Pichini, R. Pacifici, I. Altieri, M. Pellegrini and G. DAscenzo, J. Anal. Toxicol., 21 (1997) 268. M.J. Bogusz, R.D. Maier and S. Driessen, J. Anal. Toxicol., 21 (1997) 346. M.J. Bogusz, R.D. Maier, M. Erkens and S. Driessen, J. Chromatogr. B, 703 (1997) 115. M.J. Bogusz, J. Chromatogr. B, 748 (2000) 3. N. Tyrefors, B. Hyllbrant, L. Ekman, M. Johansson and L. Langstro m, J. Chromatogr. A, 729 (1996) 279. W. Naidong, J.W. Lee, X. Jiang, M. Wehlin, J.D. Hulse and P.P. Lin, J. Chromatogr. B, 735 (1999) 255. G. Schanzle, S. Li, G. Mikus and U. Hofmann, J. Chromatogr. B, 721 (1999) 55. A. Dienes-Nagy, L. Rivier, G. Giroud, M. Augsburger and P. Mangin, J. Chromatogr. A, 854 (1999) 109. M. Blanchet, G. Bru, M. Guerret, M. Bromet-Petit and N. Bromet, J. Chromatogr. A, 854 (1999) 93108. M.H. Slawson, D.J. Crouch, D.M. Andrenyak, D.E. Rollins, J.K. Lu and P.L. Bailey, J. Anal. Toxicol., 23 (1999) 468. A. Cailleux, A. Le Bouil, B. Auger, G. Bonsergent, A. Turcant and P. Allain, J. Anal. Toxicol., 23 (1999) 620624. E.J. Rook, M.J.X. Hillebrand, H. Rosing, J.M. van Ree and J.H. Beijnen, J. Chromatogr. B, 824 (2005) 213. M. Concheiro, A. de Castro, O. Quintela, M. Lopez-Rivadulla and A. Cruz, J. Chromatogr. B, 832 (2006) 81. P. Kintz and N. Samyn, Unconventional samples and alternative matrices. in: M.J. Bogusz (Ed.), R.M. Smith (Series Ed.), Forensic science, handbook of analytical separations, Vol. 2. Elsevier Sciences, Amsterdam, 2000, pp. 459488. S. Pichini, I. Altieri, M. Pellegrini, R. Pacifici and P. Zuccaro, J. Liq. Chromatogr. Rel. Technol., 22 (1999) 873. N. Samyn, G. De Boeck and A. Verstraete, J. Forensic Sci., 47 (2002) 1380. A.J. Barnes, I. Kim, R. Schepers, E.T. Moolchan, L. Wilson, G. Cooper and C.H. Reid, C. Hand and M. A. Huestis,. J. Anal. Toxicol, 27 (2003) 402. E. Vinner, J. Vignau, D. Thibault, X. Codaccioni, C. Brassart, L. Humbert and M. LHermitte, Forensic Sci. Int., 133 (2003) 57. D. Montgomery, C. Plate, S.C. Alder, M. Jones, J. Jones and R.D. Christensen, J. Perinatol., 26 (2006) 11.
350

K. Wolff, M.J.S. Anderson and A.W. Hay, Ann. Clin. Biochem., 27 (1990) 482. D.J. Dietzen, J. Koening and J. Turk, J. Anal. Toxicol., 19 (1995) 299. J. Vecerkova, Soud. Lek., 42 (1997) 32. R. Jain, R. Ray, B.M. Tripathi and C. Singh, Indian J. Pharmacol., 28 (1996) 220. R. De la Torre, J. Segura, R. de Zeeuw and J. Williams, Ann. Clin. Biochem., 34 (1997) 339. M. Zezulak, J.J. Snyder and S.B. Needleman, J. Forensic Sci., 38 (1993) 1275. Z. Lin, P. Lafolie and O. Beck, J. Anal. Toxicol., 18 (1994) 129. P.L. Hackett, L.J. Dusci, K.F. Kenneth and G.M. Chiswell, Therap. Drug Monit., 24 (2002) 652. B.D. Paul, L.D. Mell, J.M. Mitchell, J. Irving and A.J. Novak, J. Anal. Toxicol., 9 (1985) 222. B.H. Chen, E.H. Taylor and A.A. Pappas, J. Anal. Toxicol., 14 (1990) 12. G.F. Grinstead, J. Anal. Toxicol., 15 (1991) 293. J. Fenton, J. Mummert and M. Childers, J. Anal. Toxicol., 18 (1994) 159. K.E. Brooks and N.B. Smiths, J. Anal. Toxicol., 20 (1996) 269. L.A. Broussard, L.C. Presley, T. Pittman, R. Clouette and G.H. Wimbish, Clin. Chem., 43 (1997) 1029. M.J. Bogusz, J. Anal. Toxicol., 21 (1997) 246. E.J. Cone and W.D. Darwin, J. Chromatogr., 580 (1992) 43. T. Gunnar, K. Ariniemi and P. Lillsunde, J. Mass Spectrom., 40 (2005) 739. R.J. Osborne, S.P. Joel, D. Trew and M.L. Slevin, Clin. Pharmacol. Ther., 47 (1990) 12. R.T. Penson, S.P. Joel, K. Bakhshi, S.J. Clark, R.M. Langford and M.L. Slevin, Clin. Pharmacol. Ther., 68 (2000) 667. M. Barberi-Heyob, J.R. Merlin, I. Krakowski, C. Kettani, E. Collin and P. Poulain, Bull. Cancer, 78 (1991) 1063. J.L. Mason, S.P. Ashmore and A.R. Aitkenhead, J. Chromatogr. B, 570 (1991) 191. R.K. Portenoy, E. Khan, M. Layman, J. Lapin, M.G. Malkin, K.M. Foley, H.T. Thaler, D.J. Cerbone and C.E. Inturrisi, Neurology, 41 (1991) 1457. P. Joel, R.J. Osborne and M.L. Slevin, J. Chromatogr., 430 (1988) 394. Y. Rothsteyn and B. Weingarten, Ther. Drug Monit., 18 (1996) 179. P.A. Glare, T.D. Walsh and C.E. Pippenger, Ther. Drug Monit., 13 (1991) 226. C.E. Hartley, M. Green, M. Quinn and M.I. Levene, Biomed. Chromatogr., 7 (1993) 34. M.J. Bogusz, R.D. Maier, K.D. Kru ger and U. Kohls, J. Anal. Toxicol., 22 (1998) 549. M. Zheng, K.M. McErlane and M.C. Ong, J. Pharmaceut. Biomed. Anal., 16 (1988) 971. W.Z. Shou, Y.L. Chen, A. Eerkes, Y.Q. Tang, L. Magis, X. Jiang and W. Naidong, Rapid Comm. Mass Spectrom., 16 (2002) 1613. D. Whittington and E.D. Kharash, J. Chromatogr. B, 796 (2003) 95. C.M. Murphy and M. Huestis, J. Mass Spectrom., 40 (2005) 1412. R. Kaushik and W.R. LaCourse, Anal. Chim. Acta, 556 (2006) 255. R. Aderjan, S. Hofmann, G. Schmitt and G. Skopp, J. Anal. Toxicol., 19 (1995) 163. S. Kerrigan, D. Honey and G. Baker, J. Anal. Toxicol., 28 (2004) 529. S. Cengiz, O . Ulukan, I. Ates and H. Tugcu, Forensic Sci. Int., 156 (2006) 91. M.L. Goff, W.A. Brown, K.A. Hewadikaram and A.I. Omori, J. Forensic. Sci., 36 (1991) 537.
351

F. Introna, C. Lo Dico, Y.H. Caplan and J.E. Smialek, J. Forensic Sci., 35 (1990) 118. P. Kintz, V. Cirimele, Y. Edel, C. Jamey and P. Mangin, J. Forensic Sci., 39 (1994) 1497. V. Hedouin, B. Bourel, L. Martin-Bouyer, A. Becart, G. Tournel, M. Devaux and D. Gosset, J. Forensic Sci., 44 (1999) 351. V. Hedouin, B. Bourel, A. Becart, G. Tournel, M. Devaux, M.L. Goff and D. Gosset, J. Forensic Sci., 46 (2001) 12. B. Bourel, L. Fleurisse, V. Hedouin, J.C. Cailliez, C. Creusy, D. Gosset and M.L. Goff, J. Forensic Sci., 46 (2001) 596. B. Bourel, G. Tournel, V. Hedouin, M.L. Goff and D. Gosset, J. Forensic Sci., 46 (2001) 600. C.P. Campobasso, M. Gherardi, M. Caligara, L. Sironi and F. Introna, Int. J. Legal Med., 118 (2004) 210. G. Skopp, K. Klinder, L. Potsch, G. Zimmer, R. Lutz, R. Aderjan and R. Mattern, Forensic Sci. Int., 95 (1998) 99. M. Balikova and V. Maresova, Forensic Sci. Int., 94 (1998) 201. R. Aderjan and G. Skopp, Ther. Drug Monit., 20 (1998) 561. H. Seno, H. Hattori, S. Kurono, T. Yamada, T. Kumazawa, A. Ishii and O. Suzuki, J. Chromatogr. B, 673 (1995) 189. U. Hofmann, M.F. Fromm, S. Sohnson and G. Mikus, J. Chromatogr. B., 663 (1995) 59. P. Kintz, A. Tracqui and P. Mangin, Int. J. Legal Med., 104 (1991) 177. H. Sachs, R. Denk and I. Raff, Int. J. Legal Med., 105 (1993) 247. D. Wilkins, D.E. Rollins, J. Seaman, H. Haughey, G. Krueger and R.L. Foltz, J. Anal. Toxicol., 19 (1995) 269. S.P. Gygi, D.G. Wilkins and D.E. Rollins, J. Anal. Toxicol., 19 (1995) 387. M. Balikova, V. Maresova and V. Habrdova, J. Chromatogr. B, 752 (2001) 179. C.P. Verwey-Van Wissen, P.M. Koopman-Kimenai and T.B. Vree, J. Chromatogr., 570 (1991) 309. S.S. Mohammed, M. Butschkau and H. Derendorf, J. Liquid Chromatogr., 16 (1993) 2325. J.O. Svensson, Q.Y. Yue and J. Sa we, J. Chromatogr. B, 674 (1995) 49. H. He, S.D. Shay, Y. Caraco, M. Wood and A.J. Wood, J. Chromatogr. B, 708 (1998) 185. P. Lafolie, O. Beck, Z. Lin, F. Albertioni and L. Boreus, J. Anal. Toxicol., 20 (1996) 541. L.C. Kirkwood, R.L. Nation and A.A. Somogyi, J. Chromatogr. B, 701 (1997) 129. E. Hufschmid, R. Theurillat, C.H.Wilder-Smith andW. Thormann, J. Chromatogr. B, 678 (1996) 43. A.B. Wey, J. Caslavska and W. Thormann, J. Chromatogr. A, 895 (2000) 133. S.L. Walsh, K.L. Preston, G.E. Bigelow and M.L. Stitzer, J. Pharmacol. Exp. Ther., 274 (1995) 361. 258 L. Amass, J.B. Kamien and S.K. Mikulich, Drug Alcohol Depend., 58 (2000) 143. P. Kintz and P. Marquet (Eds.), Buprenorphine therapy of opiate addiction. Humana Press, Totowa, USA, 2002. G. Vidal-Trecan, I. Vareson, N. Nabet and A. Boisonnas, Drug Alcohol Depend., 69 (2003) 175. L. Debrabandere, M. Van Bouven and P. Daenens, J. Forensic sci., 40 (1995) 250.
352

V. Cirimele, P. Kintz, S. Lohner and B. Ludes, J. Anal. Toxicol., 27 (2003) 103. M. Bo ttcher and O. Beck, J. Anal. Toxicol., 29 (2005) 769. V. Cirimele, S. Etienne, M. Villain, B. Ludes and P. Kintz, Forensic Sci. Int., 143 (2004) 153. E.J. Cone, C.W. Gorodetzky, D. Yousefnejad and W.D. Darwin, J. Chromatogr., 335 (1985) 291. K.A. Hadidi and J.S. Oliver, Int. J. Med. Leg., 111 (1998) 165. J.J. Kuhlman, J. Magluilo Jr., E.J. Cone and B. Levine, J. Anal. Toxicol., 20 (1996) 229. A.M. Lisi, R. Kazlauskas and G.J. Trout, J. Chromatogr. B, 692 (1997) 67. E.J. Cone, C.W. Gorodetzky, W.D. Darwin and W.F. Bunchwald, J. Pharm. Sci., 73 (1984) 243. L. Debrabandere, M. Van Boven and P. Daenens, J. Forensic Sci., 37 (1992) 82. P. Kintz, J. Anal. Toxicol., 17 (1993) 443. P. Kintz, A. Tracqui and P. Mangin, J. Forensic Sci. Soc., 34 (1994) 95. H. Hoja, P. Marquet, B. Verneuil, H. Lofti, J.L. Dupuy and G. Lachatre, J. Anal. Toxicol., 21 (1997) 160. A. Tracqui, P. Kintz and P. Mangin, J. Forensic Sci., 42 (1997) 111. D.E. Moody, J.D. Laycock, A.C. Spanbauer, D.J. Crouch, R.L. Foltz, J.L. Josephs, L. Amass and W.K. Bickel, J. Anal. Toxicol., 21 (1997) 406. D.E. Moody, M.H. Slawson, E.C. Strain, J.D. Laycock, A.C. Spanbauer and R.L. Foltz, Anal. Biochem., 306 (2002) 31. J.M. Gaulier, P. Marquet, E. Lacassie, J.L. Dupuy and G. Lachatre, J. Forensic Sci., 45 (2000) 226. A. Polettini and M.A. Huestis, J. Chromatogr. B, 754 (2001) 447. C.M. Murphy and M.A. Huestis, J. Mass Spectrom., 40 (2005) 70. A. Ceccato, R. Klinkenberg, P. Hubert and B. Streel, J. Pharm. Biomed. Anal., 32 (2003) 619. R. Kronstrand, T.G. Selden and M. Josefsson, J. Anal. Toxicol., 27 (2003) 464. D. Grimm, E. Pauly, J. Poschl, O. Linderkamp and G. Skopp, Ther. Drug Monit., 27 (2005) 526. V.P. Dole, . In: A. Tagliamonte, L. Maremmani (Eds.), Methadone maintenance. Comes of age, Drug addiction and related clinical problems, Springer Verlag, HeidelbergWien New York, 1995, pp. 4563. R.G. Newman, . In: A. Tagliamonte, L. Maremmani (Eds.), The pharmacological rational for methadone treatment of narcotic addiction, Drug addiction and related clinical problems, Springer Verlag, Heidelberg-Wien-New York, 1995, pp. 109136. 288 R. La Harpe and O. Fryc, Arch. Kriminol., 196 (1995) 24. A. Heinemann, J. Ribbat, K. Pu schel, S. Iwersen and A. Schmoldt, Rechtsmedizin, 8 (1998) 55. N. Chikhi-Chorfi, H. Galons, C. Pham-Huy, M. Thevenin, J.M. Warnet and J.R. Claude, Chirality, 13 (2001) 187. S. George, S. Parmar, C. Meadway and R.A. Braithwaite, Ann. Clin. Biochem., 37 (2000) 350. L. Moore, J. Wicks, V. Spiehler and R. Holgate, J. Anal. Toxicol., 25 (2001) 520.
353

N. De Giovanni, N. Fucci, M. Chiarotti and S. Scarlata, J. Chromatogr. B, 773 (2002) 1. G. Cooper, L. Wilson, C. Reid, D. Baldwin, C.H and and V. Spiehler, J. Forensic Sci., 50 (2005) 928. M. ElSohly, S. Feng and T.P. Murphy, J. Anal. Toxicol., 25 (2001) 40. P. Kintz, P. Mangin, A.A. Lugniert and A.J. Chaumont, J. Toxicol. Clin. Exp., 10 (1990) 15. L.D. Baugh, R.H. Liu and A.S. Walia, J. Forensic Sci., 36 (1991) 548. N. Schmidt, R. Sittl, K. Brune and G. Geisslinger, Pharm. Res., 10 (1993) 441. M.E. Alburges, W. Huang, R.L. Foltz and D.E. Moody, J. Anal. Toxicol., 20 (1996) 362. D.G. Wilkins, P.R. Nasagawa, S.P. Gygi, R.L. Foltz and D.E. Rollins, J. Anal. Toxicol., 20 (1996) 355. 301 G.A.A. Cooper and J.S. Oliver, J. Anal. Toxicol., 22 (1998) 389. D.W. Lachenmeier, L. Kroener, F. Musshoff and B. Madea, Rapid Commun. Mass Spectrom., 17 (2003) 472. 303 F.J. Couper, K. Chopra and M.L. Pierre-Louis, Forensic Sci. Int., 153 (2005) 71. P. Kintz, M. Villain, V. Dumestre-Toulet, B. Capolaghi and V. Cirimele, Ther. Drug Monit., 27 (2005) 741. L.M. Stolk, S.M. Coenradie, B.J. Smit and H.L. van As, J. Anal. Toxicol., 21 (1997) 154. O. Beck, L.O. Boreus, P. Lafolie and G. Jacobson, J. Chromatogr., 570 (1991) 198. N. Schmidt, K. Brune and G. Geisslinger, J. Chromatogr., 583 (1992) 195. R.L. Norris, P.J. Ravenscroft and S.M. Pond, J. Chromatogr. B, 661 (1994) 346. K. Kristensen, H.R. Angelo and T. Blemmer, J. Chromatogr. A, 666 (1994) 283. S. Rudaz and J.L. Veuthey, J. Pharm. Biomed. Anal., 14 (1996) 1271.H.R. Angelo, O. Beck and K. Kristensen, J. Chromatogr. B, 724 (1999) 35. P. Kintz, H.P. Eser, A. Tracqui,M.Moeller, V. Cirimele and P. Mangin, J. Forensic Sci., 42 (1997) 291. D. Ortelli, S. Rudaz, A.F. Chevalley, J.J. Deglon, L. Balant and J.L. Veuthey, J. Chromatogr. A, 871 (2000) 163. O. Dale, C. Hoffer, P. Sheffels and E.D. Kharasch, Clin. Pharmacol. Ther., 72 (2002) 536. S. Souverain, C. Eap, J.L. Veuthey and S. Rudaz, Clin. Chem. Lab. Med., 41 (2003) 1615. H.R. Liang, R.L. Foltz, M. Meng and O.P. Bennett, J. Chromatogr. B, 806 (2004) 191. D. Whittington, P. Sheffels and E.D. Kharash, J. Chromatogr. B, 809 (2004) 313. M.L. Etter, S. George, K. Graybiel, J. Eichhorst and D.C. Lehotay, Clin. Biochem., 38 (2005) 1095. S. Molteni, J. Caslavska, D. Allemann and W. Thormann, J. Chromatogr. B, 658 (1994) 355. W. Thormann, M. Lanz, J. Caslavska, P. Siegenthaler and R. Portmann, Electrophoresis, 19 (1998) 57. J. Esteban, M. de la Cruz Pellin, C. Gimeno, J. Barril, E. Mora, J. Gimenez and E. Vilanova, Toxicol. Lett., 15 (2004) 243. T. Kelly, P. Doble and M. Dawson, Electrophoresis, 24 (2003) 2106. C. Merslavic and L. Zupancic-Kraj, J. Chromatogr. B, 693 (1997) 222.
354

K.E. Goeringer, B.K. Logan and G.D. Christian, J. Anal. Toxicol., 21 (1997) 529. K.J. Lusthof and P.G.M. Zweipfenning, J. Anal. Toxicol., 22 (1998) 260. B. Levine, V. Ramcharitar and J.E. Smialek, J. Anal. Toxicol., 21 (1997) 43. G. Sticht, P. Schmidt and H. Ka ferstein, Rechtsmedizin, 7 (1997) 127. V. Gambaro, C. Benvenuti, L. De Ferrari, L. DellAcqua and F. Fare, Farmaco, 58 (2003) 947. H.J. Leis, G. Fauler and W. Windischhofer, J. Chromatogr. B, 804 (2004) 369. Y.F. Sha, S. Shen and G.L. Duan, J. Pharm. Biomed. Anal., 37 (2005) 143. K.A. Hadidi, J.K. Almasad, T. Al-Nsour and S. Abu-Ragheib, Forensic Sci. Int., 135 (2003) 129. M. Nobilis, J. Pastera, P. Anzenbacher, D. Svoboda, J. Kopecky and F. Perlik, J. Chromatogr. B, 681 (1996) 177. M. Nobilis, J. Kopecky, J. Kvetina, J. Chladek, Z. Svoboda, V. Vorisek, F. Perlik, M. Pour and J. Kunes, J. Chromatogr. A, 949 (2002) 11. S.J. Juzwin, D.C. Wang, N.J. Anderson and F.A. Wong, J. Pharm. Biomed. Anal., 22(2) (2000) 469. W.N. Wu, L.A. McKown and S. Liao, Xenobiotica, 32 (2002) 411. L.M. Zhao, X.Y. Chen, J.J. Cui, M. Sunita and D.F. Zhong, Yao Xue Xue Bao, 39 (2004) 458. E. Frankus, E. Friderichs, S.M. Kim and G. Osterloh, Arzneim. Forsch., 28 (1978) 114. B. Elsing and G. Blaschke, J. Chromatogr., 612 (1993) 223. A. Ceccato, P. Chiap, P. Hubert and J. Crommen, J. Chromatogr. B, 698 (1997) 161. A. Ceccato, F. Vanderbist, J.Y. Pabst and B. Streel, J. Chromatogr. B, 748 (2000) 65. U.B. Soetebeer, M.O. Schierenberg, H. Schulz, G. Grunefeld, P. Andresen and G. Blaschke, J. Chromatogr. B, 745 (2000) 271. U.B. Soetebeer, M.O. Schierenberg, H. Schulz, P. Andresen and G. Blaschke, J. Chromatogr. B, 765 (2001) 3. S. Rudaz, S. Cherkaoui, P. Dayer, S. Falani and J.L. Veuthey, J. Chromatogr. A, 868 (2000) 295. P. Lehtonen, H. Siren, I. Ojanpera and R. Kostiainen, J. Chromatogr. A, 1041 (2004) 227. J. Vecerkova, Criminalistics, 25 (1992) 216. K.L. Sees, M.E. DiMarino, N.K. Ruediger, C.T. Sweeney, S. Shiffman and J. Pain Palliat, Care Pharmacother., 19 (2005) 13. B.C. Wolf, W.A. Lavezzi, L.M. Sullivan and L.M. Flanagan, J. Forensic Sci., 50 (2005) 192. J.M. Abadie, K.H. Allison, D.A. Black, J. Garbin, A.J. Saxon and D.D. Bankson, J. Anal. Toxicol., 29 (2005) 825. 349 R.C. Backer, J.R. Monforte and A. Poklis, J. Anal. Toxicol., 29 (2005) 675. V.R. Spiehler, L. DeCicco, J.R. McCutcheon, T. Kupiec and P. Kemp, J. Forensic Sci., 40 (2004) 621. R.P. Kapil, P.K. Padovani, S.Y. King and G.N. Lam, J. Chromatogr., 577 (1992) 283. C.M. Moore, D. Deitermann, D. Lewis and J. Leikin, J. Anal. Toxicol., 10 (1995) 514.
355

J. Jones, K. Tomlinson and C. Moore, J. Anal. Toxicol., 26 (2002) 171. N.L. Le, A.E. Reiter, K. Tomlinson, J. Jones and C. Moore, J. Anal. Toxicol., 29 (2005) 54. R. Meatherall, J. Anal. Toxicol., 29 (2005) 301. A.W. Wright, M.L. Nocente and M.T. Smith, Life Sci., 63 (1998) 401. Y.L. Chen, G.D. Hanson, X. Jiang and W. Naidong, J. Chromatogr. B, 769 (2002) 55. E. Bostrom, B. Jansson, M. Hammarlund-Udenaes and U.S. Simmonsson, Rapid Commun. Mass Spectrom., 18 (2004) 2565. L.E. Edinboro, R.C. Backer and A. Poklis, J. Anal. Toxicol., 29 (2005) 704. S.E. Edwards and M.T. Smith, J. Chromatogr. B, 814 (2005) 241. O. Cheremina, I. Bachmakov, A. Neubert, K. Brune, F. Maertin and B. Hinz, Biomed. Chromatogr. (2005) online. 362 A.B. Wey and W. Thormann, J. Chromatogr. B, 770 (2002) 191. A. Baldacci, J. Caslavska, A.B. Wey and W. Thormann, J. Chromatogr. A, 1051 (2004) 273. R.C. Baselt, Disposition of toxic drugs and chemicals in man, (5th ed). Chemical Toxicology Institute, Foster City, California, 2000, pp. 353356. R. Kronstrand, H. Druid, P. Holmgren and J. Rajs, Forensic Sci. Int., 88 (1997) 185. P. Kintz, M. Villain, V. Dumestre and V. Cirimele, Forensic Sci. Int., 153 (2005) 153. T. Tobin, S. Kwiatkowski, D.S. Watt, H.H. Tai, C.L. Tai, W.E. Woods, J.P. Goodman, D.G. Taylor, T.J. Weckman and J.M. Yang, Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol., 63 (1989) 129. H. Ka ferstein and G. Sticht, Forensic Sci. Int., 113 (2000) 353. V. Watts and Y. Caplan, J. Anal. Toxicol., 12 (1988) 246. H. Ohta, S. Suzuki and K. Ogasawara, J. Anal. Toxicol., 23 (1999) 280. F.M. Esposito and C.L. Winek, J. Forensic Sci., 26 (1991) 86. A. Szeitz, K.W. Riggs and C. Harvey-Clark, J. Chromatogr. B, 675 (1996) 33. B. Fryirs, A. Woodhouse, J.L. Huang, M. Dawson and L.E. Mather, J. Chromatogr. B, 688 (1997) 79. H. Sachs, M. Uhls, G. Hege-Scheuning and E. Schneider, Int. J. Leg. Med., 109 (1996) 213. D.T. Anderson and J.J. Muto, J. Anal. Toxicol., 24 (2000) 627. J.J. Kuhlman Jr., R. McCauley, T.J. Valouch and G.S. Behonick, J. Anal. Toxicol., 27 (2003) 499. P.K. Lilleng, L.I. Mehlum, L. Bachs and I. Morild, J. Forensic Sci., 49 (2004) 1364. A.M. Tharp, R.E. Winecker and D.C. Winston, Am. J. Forensic Med. Pathol., 25 (2004) 178. 379 A. Poklis and R. Backer, J. Anal. Toxicol., 28 (2004) 422. C. Paradis, C. Dufresne, M. Bolon and R. Boulieu, Ther. Drug Monit., 24 (2002) 768. N.F. Van Nimmen, K.L. Poels and H.A. Veulemans, J. Chromatogr. B, 804 (2004) 375387. N.F. Vam Nimmen and H.A. Veulemans, J. Chromatogr. A, 1035 (2004) 249. W.Z. Shou, X. Jiang, B.D. Beato and W. Naidong, Rapid Commun. Mass Spectrom., 15 (2001) 466. D.E. Koch, R. Isaza, J.W. Carpenter and R.P. Hunter, J. Pharm. Biomed. Anal., 34 (2004) 577.
356

N.H. Huynh, N. Tyrefors, L. Ekman and M. Johansson, J. Pharm. Biomed. Anal., 37 (2005) 1095. J. Martens-Lobenhoffer, J. Chromatogr. B., 769 (2002) 227. L. Palleschi, L. Lucentini, E. Ferretti, F. Anastasi, M. Amoroso and G. Draisci, J. Pharm. Biomed. Anal., 32 (2003) 329. S.R. Edwards, C.F. Minto and L.E. Mather, Br. J. Anesth., 88 (2002) 94. A.F. Lehner, P. Almeida, J. Jacobs, J.D. Harkins, W. Karpiesiuk, W.E. Woods, L. Dirikolu, J.M. Bosken, W.G. Carter, J. Boyle, C. Holtz, T. Heller, C. Nattrass, M. Fisher and T. Tobin, J. Anal.Toxicol., 24 (2000) 309. M. Thevis, H. Geyer, D. Bahr and W. Schanzer, Eur. J. Mass Spectrom., 11 (2005) 419. T. Breindahl and K. Andreasen, J. Chromatogr. B, 736 (1999) 103. I. Sundstrom, U. Bondesson and M. Hedel and, J. Chromatogr. B, 763 (2001) 121. M.H. Andraus and M.E. Siquera, J. Chromatogr. B, 704 (1997) 143. H. Bagheri, A. Es-haghi and M.R. Rouini, J. Chromatogr. B, 818 (2005) 147. D.L. Kuhlenbeck, T.H. Eichold, S.H. Hoke, T.R. Baker, R. Mensen and K.R. Wehmeyer, Eur. J. Mass Spectrom., 11 (2005) 199. Fisher, B. A. J. Techniques of crime scene investigation / Barry A.J. Fisher ; 7th ed., CRC Press Boca Raton London New York Washington, D.C., 2004. Eckert W. G. Introduction to Forensic Sciences. 2nd Ed. CRC Press Boca Raton New York, London Tokyo, 1997. Shakhashiri, Bassam, Chemical Demonstrations, Vol. 1, U. Wisconsin Press, 1983, p. 156. Summerlin, L, Ealy, J, Chemical Demonstrations, American Chemical Society, 1985, p. 138. Drochioiu,G., Oniscu, C., Gradinaru, R., and Murariu, Manuela. The biostructural theory versus the chemiosmotic theory. Roum. Biotechnol. Lett., 9(2) 1579-1586, 2004; Drochioiu, G. Eugen Macovschis concept of biostructure and its current development. In Life and mind. In search of the physical basis. (S. Savva ed.) Trafford Publ., Canada, USA, Ireland & UK, 2006, pp. 43-60; ISBN: 1-4251-1090-8

357

358

Partea a-II-a

Separatologie judiciara

Ionel Mangalagiu Ramona Danac Costel Moldoveanu Gheorghita Zbancioc

I. INTRODUCERE II. CROMATOGRAFIA DE GAZE II.1. Introducere II.2. Concepte de baza II.3. Componentele cromatografului de gaze II.3.1. Gazul purtator II.3.2. Sistemul de introducere a probelor II.3.3. Temperatura coloanei II.3.4. Detectori utilizai n cromatografia de gaze III. TANDEMUL CROMATOGRAFIE -SPECTROMETRIE DE MASA III.1 Introducere III.2. Spectrometria de mas III.2.1. Generaliti III.2.2. Aspecte tehnice si aparatura III.2.2.1. Sistemul de introducere a probelor III. 2.2.2. Surse de ionizare utilizate n sistemul GC-MS III.2.2.3. Tipuri de analizoare utilizate n sistemul GC/MS III.2.2.4. Detectorii de ioni. IIII.2.2.5. Tipuri de interfee pentru sistemul GC/MS IIII.2.2.6. Puterea de rezolutie a spectrometrelor de masa III.3 Monitorizarea datelor in spectrometria de masa IV. REGULI GENERALE DE FRAGMENTARE IN SPECTROMETRIA DE MASA IV. 1. Introducere IV.2. Reactii de fragmentare IV.2.1. Fragmentari simple IV.2.2. Fragmentari insotite de transpozitia unui atom de hidrogen IV.2.3. Fragmentari complexe

IV.2.4. Fragmentari insotite de transpozitia a doi atomi de hidrogen IV.2.5. Fragmentari insotite de transpozitii de schelet V. APLICATII IN MEDICINA JUDICIARA V.1. Probe care se utilizeaza in medicina judiciara. Generalitati Modalitatea in care drogul/toxicul este conditionat si transportat Tipurile de impuritati, produsi de degradare, produsi secundari sau solventi care sunt prezenti in probele de drog/toxic Modalitatea in care proba drogul/toxicul se prezinta: in forma pura, amestec cu alte droguri, cu excipienti, cu adaos de produsi denaturati sau falsificati V.2. Probe biologice V.2.1. Introducere Metabolizarea drogurilor/toxicelor Administrare, transport, absortie, distributie si excretie V.2.2. Fluide biologice Singe, plasma, ser. Urina. Saliva V.2.3. Tesuturi si fluide postmortem Ficat, creier, bila, umoarea vitroasa, continut stomacal V.2.4. Probe neconventionale V.3. Pregatirea probelor V.3.1. Extractia si cromatografia in strat subtire V.3.1.1. Extracia V.3.1.2. Cromatografia in strat subtire V.3.2. Pretratamentul si prepararea probelor V.3.3. Derivatizarea chimica in medicina judiciara V.3.3.1. Reactii chimice utilizate in procesul de derivatizare V.3.3.2. Metode practice de derivatizare V.4. Droguri din opiu si derivati din familia opiaceelor V.5. Canabioide, marijuana si derivati V.6. Amfetamine si derivati

V.7. Cocaina si derivati V.8. LSD si derivati BIBLIOGRAFIE

I. INTRODUCERE

Drogurile (aici incluzind si medicamentele cu potential de drog) au constituit dintodeauna o clasa de compusi de mare risc pentru oameni. Fie ca sunt procurate licit sau ilicit, consumul abuziv de droguri constituie o problema majora a societatii umane actuale. Potrivit raportului World Drug Report 2007, utilizarea abuzului de droguri (Drug Abuse, DA) pare sa se fi stabilizat in ultimii ani, dar circa 200 de milioane de oameni inc mai folosesc droguri ilicite in fiecare an. Drogurile care produc dependenta consumatorilor, care pot reduce penal responsabilitatea unui inculpat, sau care poate reduce aptitudinile de a desfasura anumite activitati, trebuiesc monitorizate constant in organismul uman, cel mai adesea in fluide si tesuturi. Aceleasi aspecte sunt vizate si in controalele antidoping la sportivi, deoarece folosirea sau abuzul de medicamente care stimuleaza masa musculara, pentru a creste nivelul de performanta, duce la tulburari secundare nedorite cum ar fi reducerea in greutate, surmenaj, boli psihice, etc. In plus, in ultimele decenii, s-a dovedit ca atit drogurile in sine cit si produsii lor de metabolizare constitue o sursa de poluare deloc de neglijat a mediului inconjurator. In toxicologia medico-legala, separarea, identificarea si dovedirea structurii diverselor substante, a capatat o importanta hotaritoare atit in cazul drogurilor ilegale cit si in cazul otravurilor (introduse accidental sau cu scopuri criminale). In prezenta exisat o adevarata strategie de screening toxicologica, deoarece exista citeva mii de droguri sau de pesticide care trebuiesc sa fie luate in considerare atunci cind se efectueaza o analiza. In ultimii ani, GC (cromatografia de gaze), MS-ul (spectroscopia de masa) si tandemul GC-MS-ul au cunoscut o dezvoltare spectaculoasa devenind practic metodele cele mai importante, performante si uzuale in criminologie, permitind atit separarea cit si identificare diverselor clase de droguri. Pretratamentul

diverselor tipuri de probe utilizate in toxicologia medico-legala a condus si la aprofundarea cunostintelor in ceea ce priveste tehnicele analitice utilizate in acest sens: extractie, cromatografie in start subtire, derivatizare. Scopul acestui manual este acela de a aduna intr-un tot unitar atit notiunile teoretice de baza din GC-MS cit si aplicatile acestor tehnici in medicina judiciara. Un accent deosebit a fost pus in cazul aplicatiilor in medicina judiciara pe informatiile din ultimile doua decenii, cu precadere din ultimii 10 ani. In acest manual sunt descrise cu precadere principiile de baza, aparatura precum si tehnicile si metodele de baza utilizate in toxicologia medico-legala. Spectrometrul de masa, in diferitele sale forme constructive, este acum parte integranta din fiecare laborator criminalistic. Practic, GC-MS in modul de functionare cu ionizare electronica (EI), constituie la ora actuala metoda de referinta pentru confirmarea testelor pozitive in analizele toxicologice folosite in medicina judiciara. Metodele GC-MS in modul de functionare cu ionizare electronica (EI) prezinta avantajul ca sunt reproductibile si deja sunt librarii de spectre care permite o identificare rapida a diverselor droguri, toxice, metaboliti, etc. Asa spre exemplu determinarea morfinei si cocainei din probele de singe prin GC-MS este in prezent un procedeu de rutina, complet automatizat, care dureaza circa 2 ore, si este recunoscut atit in medicina judiciara cit si in controlul antidoping. Numarul de posibilelor aplicatii medico-legale ale spectroscopia de masa este limitat doar de imaginaia expertului medico-legal.

II. CROMATOGRAFIA DE GAZE

II.1. Introducere II.2. Concepte de baza II.3. Componentele cromatografului de gaze II.3.1. Gazul purtator II.3.2. Sistemul de introducere a probelor II.3.3. Temperatura coloanei II.3.4. Detectori utilizai n cromatografia de gaze

II. CROMATOGRAFIA DE GAZE

II.1. Introducere
Metodele chimice de analiz care s prezinte o selectivitate i specificate ridicat sunt n general foarte puine. Separarea analitului de potenialii interfereni dintr-o prob este adesea necesar, dar nu este considerat ca un pas vital n procedurile analitice. Fr a grei, putem spune c cea mai performant metod de separare utilizat n analizele chimice este cromatografia, metod care i gsete aplicaii n toate domeniile tiinifice. Aplicaiile cromatografiei au avut o cretere exploziv n ultimii 40 de ani, aceasta nefiind datorat n exclusivitate doar apariiei mai multor tipuri noi de tehnici cromatografice, ci i datorit necesitii descoperirii unor metode foarte performante pentru caracterizarea amestecurilor chimice foarte complexe. Cromatografia cuprinde diverse i importante metode de analiz care permit chimistului s separe compui cu structur asemntore din amestecuri complexe. Multe din aceste separri sunt imposibil de realizat prin alte procedee de separare. n toate metodele de separare cromatografic, proba este dizolvat n faza mobil, care poate fi gaz, lichid sau fluid. Faza mobil este apoi trecut peste o faz staionar nemiscibil, care este fixat n interiorul unei coloane sau pe o suprafa solid. Cele dou faze sunt alese n aa fel nct componenii probei s se distribuie ntre acestea la variaia temperaturii. Acei compui care sunt puternic reinui de faza staionar se vor deplasa mult mai ncet n comparaie cu viteza de curgere a fazei mobile. n contrast , componeii care sunt mai slab reinui vor traversa faza staionar mai repede. Ca o consecina a acestor diferene de mobilitate, componeii probei vor separa n benzi discrete cate pot fi apoi analizate calitativ i /sau cantitativ.

Metodele cromatografice pot fi clasificate dup dou direcii. Prima clasificare se poate face n funcie de fenomenul fizic prin care cele dou faze sunt aduse n contact: - cromatografia pe coloan, n acest caz faza staionar este plasat n interiorul unor tuburi cu diametre foarte mici, iar faza mobil este forat s treverseze coloana fie prin diferen de presiune fie datorit gravitaiei; - cromatografie planar, cnd faza staionar este depus pe un suport plat sau n capilarele unei hrtii speciale. n acest caz faza mobil se deplaseaz peste faza staionar sub influena forelor capilare sau a gravitaiei. O clasificare mult mai riguroas a metodelor cromatografice are la baz tipul fazelor mobile i a fazelor staionare i tipul de echilibru care este implicat n transferul solutului ntre cele dou faze. Pe baza acestui criteriu cromatografia se mparte n trei mari categorii generale: -cromatografia de gaze; - croamtografia de lichide; - cromatografia fluidelor supercritice. n sens larg, cromatografia de gaze este considerat a fi o tehnic puternic si larg utilizat, comparativ cu alte tehnici instrumentale. Cnd este folosit corespunztor, cromatografia de gaze poate da informaii calitative i cantitative despre compuii individuali dintr-o prob. Cromatografia este n esen o metod fizic de separare, n care componenii unei probe sunt separai n funcie de distribuia acestora ntre dou faze, una staionar i una mobil. Separarea compuilor este practic realizat n funcie de volatilitataea i structura lor. Muli compui chimici nu pot fi analizai prin cromatografia de gaze datorit proprietilor lor fizice i chimice. Sistemul gaz cromatografic poate monitoriza doar acei compui care prezint o volatilitate apreciabil la o temperatur cuprins ntre 350-400 0C. De asemenea, aceti compui trebuie s fie stabili la temperaturi nalte i totodat, trecerea lor rapid n stare de vapori s nu conduc la degradarea sau reacia lor cu

10

ali compui. Uneori structura compuilor i masele lor moleculare pot fi utilizate ca indicatori poteniali, n ceea ce privete analiza lor prin cromatografia de gaze. O caracteristic de baz a compuilor chimici, care este de o mare importana pentru acest tip de analiz, este volatilitatea lor. Compuii cu o volatilitate sczut nu pot fi analizai prin aceast tehnic instrumental, acetia neputnd fi adui n stare de vapori fr a exista posibilitatea degradrii termice a lor. Punctele de fierbere ale compuilor studiai, nu reprezint ntotdeauna un factor care s caracterizeze volatilitatea acestora. Compuii pot avea puncte de fierbere ridicate, dar totodat pot fi i analizai prin cromatografia de gaze. n general, masa molecular i polaritatea compuilor sunt considerate n vederea stabilirii posibilitii studierii acestora cu sistemul gaz cromatografic (compuii nepolari cu mas molecular mare pot fi mult mai volatili dect compuii polari cu mas molecular mic). Astfel hidrocarburile cu masa molecular peste 500 uam sunt n mod obinuit analizate prin sisteme standard GC, iar cele cu masa molecular peste 1400 uam au putut fi analizate cu uurint prin echiparea sistemelor GC cu coloane speciale. Prezena grupelor funcionale polare (-OH, -NH2), de multe ori conduce la scderea volatilitii compuilor. Civa compui cu molecule mici (aminoacizi, zaharide) nu pot fi analizai cu prea mare uurin prin GC datorit numrului mare a grupelor polare. Urmrind aceai linie se poate arta c, n principiu compuii anorganici nu pot fi analizai prin tehnica gaz-cromatografic, aceasta datorit faptului c metalele i srurile nu prezint volatilitatea cerut de acest metod de analiz. n particular se cunosc doar civa compui organometalici caracterizai de o volatilitate crescut care se pot analiza prin cromatografie de gaze. n ultimii ani au aprut noi direcii n vederea aplicrii cromatografiei de gaze care au schimbat caracterul informaiilor cromatografice. Astfel, noile descoperiri din tehnologia coloanelor, au pus la punct coloane cu un diametru

11

foarte mic, ceea ce a condus practic la o cretere semnificativ a rezoluiei cromatogramelor ntr-un timp de analiz foarte scurt. Cromatografia de gaze a fost sistematic utilizat n ultimii 20 ani pentru analiza compuilor din amestecuri complexe n diferite domenii de cercetare (industria chimic, farmaceutic, petrochmic), i a devenit n ultimul timp o tehnic indispensabil n analizele poluanilor chimici de natur organic, din mediul nconjurtor.

II.2. Concepte de baza

Informaiile obinute de la o analiz sunt coninute n cromatogram, care este o nregistrare grafic, a concentraiei sau profilului de mas a componenilor din prob funcie de micarea fazei mobile prin coloan. Informaia dat numai de cromatogram include: o msur a complexitii probei bazat pe numrul de picuri observate; identificarea calitativ a componenilor din prob, bazat pe acurateea determinrii poziiei picurilor; informaii cantitative asupra concentraiilor relative sau mrimea fiecrui pic i o indicarea a performanei coloanei (Figura II.1). n timpul trecerii lor prin coloana cromatografic, moleculele probei , petrec o parte din timp n faza mobil i o parte n faza staionar. Toate moleculele petrec acelai interval de timp n faza mobil, acest timp fiind denumit ca timpul mort al coloanei i este echivalent cu timpul necesar pentru ca un solut nereinut s ajung la detector, de la momentul injectri.

12

Figura I.1. Cromatogram cu definia termenilor carcteristici

Timpul de reinere al unui solut (tR) este intervalul de timp scurs de la momentul injectrii probei n coloan i momentul cnd detectorul sesizeaz maximul picului de reinere. Timpii de reinere sau ali parametri derivai de la acetia, sunt utilizai n analizele calitative (identificare) iar aria picurilor sau de regul integrala (A) acestuia, fiind proporional cu cantitatea componentului ajut la cunatificarea componeilor din proba analizat:
t2

A = Sdt
t1

(II.1)

unde A este aria picului (n cm2 ); S este intensitatea semnalului dat de detector, t1 i t2 sunt timpii ntre care ncepe i se termin picul cromatografic considerat. Timpul de reinere (tR), reprezint practic timpul necesar unui component dintr-o prob de a trece din faza staionar n faza mobil (indicnd perioada pe care componentul chimic o petrece n coloan cromatografic). Acesta este dat de relaia:

tR =

L (1 + k ) = t M (1 + k ) u

(II.2)

13

unde L este lungimea coloanei (n cm); u este viteza liniar medie a fazei mobile (n cm/sec); k este un derivat al coeficientului de distribuie a componentului ntre cele dou faze ( k = K

VL , cu VL volumul fazei staionare n coloan (n cm3)i VM VM L = t M reprezint timpul mort sau u

volumul fazei mobile n coloan (n cm3));

timpul la care apare picul gazului purttor; (tR-tM) reprezint timpul de reinere ajustat. Se poate concluziona c substanele cu valori diferite pentru K vor avea timpi de reinere diferii. Fiecare component din prob dup ce este separat de coloan, genereaz un semnal caracterizat nu numai de momentul apariiei picului, ci i de lrgimea acestuia (picurile A i B din figura II.1). O descriere cantitativ a acestui feneomen este dat de numrul de talere ,N, ale coloanei, Numrul de talere teoretice se poate calcula cu relaia:
2 tR

N=

II.2

unde N reprezint numrul de talere i 2 variana picului eluat. Pentru picurile cu simetrie Gaussian, deviaia standard, , poate fi calculat din cromatogram cu urmtoarea relaie: 2d =d 2

(II.3)

unde d este jumtatea limii picului la 0,607 din nlimea picului considerat ( Figura II.1). Numrul talerelor (N) poate fi raportat la lungimea coloanei de separare (L), prin introducerea parametrului cantitativ H:

H=

L N

(II.4)

14

unde H reprezint echivalentul nlimii unui taler teoretic. Acest parametru este o funcie de viteza liniar medie a gazului purttor i de un numr de parametri experimentali. Gradul de separare (rezoluia) a doi componeni realizat de o colon poate fi exprimat cu relaia:
1 k N Rs = 4 k + 1 unde este factorul de separare (II.5)

= t R ( B) / t R ( A) = k B k

(II.6)
A

Separarea este n general complet dac Rs =1,5 i acceptabil dac Rs =1. n mod obinuit coloanele pachet operez cu valori mari ale lui k i de aceea raportul k/(k+1) este aproximativ unitar. n orice caz coloanele tubulare deschise opereaz cu valori mai mici ale lui k, deoarece raportul VM/VL este mai mare. Din acest motiv, pentru obinerea rezoluiei cerute este necesar un numr mai mare de talere teoretice pentru coloanele capilare.Un numr mare de talere teoretice se obine uor ntr-o coloan tubular deschis dac lungimea acesteia este mrit.

II.3. Componentele cromatografului de gaze

n general sistemul cromatografic este compus din apte componente majore ( Figura II.1): butelia de gaz purttor(1); sistemul de control al debitului de gaz (2); sistemul de introducere a probelor (3); termostatul coloanei (4); coloana (5); detectorul (6); nregistratorul sau sistemul de procesare a datelor (7).

15

Figura II.1. Schema unui sistem GC

Gazul inert sau faza mobil (N2) trece continuu cu un debit constant de la butelia (1) direct n sistemul de introducere a probei, prin coloan i ajunge apoi la detector. Viteza de curgere a gazului purttor este foarte bine controlat cu ajutorul unui flow controler (2), pentru a asigura o reproductibilitate a timpilor de reinere i pentru a minimaliza zgomotul detectorului. Probele sunt injectate (folosind de regul o microsering), n sistemul de introducere a probelor (3), caracterizat de o temperatur nalt, ceea ce permite vaporizarea probelor i trecerea lor n interiorul coloanei prin intermediul gazului purttor. n cazul compuilor cu o stabilitate termic critic probele pot fi introduse direct n coloan (on-column injection). Coloanele pachet sunt alctuite din tuburi de sticl sau oel n interiorul crora se gsesc particole solide (suportul solid). Acest suport solid este mbrcat ntr-un film subire i uniform al unui lichid caracterizat de un punct de fierbere foarte ridicat (faza staionar). Coloanele capilare sunt practic nite tuburi de sticl sau silice fuzibil, n interiorul crora este localizat faza staionar, sub forma unui film subire care ader pe perei. Dup ieirea din coloan gazul purttor i proba ajung direct la detector. Rolul acestuia este de a sesiza prezena componenilor unei probe i de a genera un semnal electric proporional cu cantitatea de component care ajunge la el. Detectorul va trimite semnalul rezultat la un nregistrator sau sistem de achiziie a

16

datelor pentru ca n final s se obin o cromatogram. n noile instrumente GC sistemul de date afieaz pe lng cromatogram i timpii de reinere i rezultatele integrrii picurilor cromatografice sub forma unui raport final de analiz.
II.3.1. Gazul purtator

Rolul gazului purttor este de a transporta proba de la injector, prin coloan pn la detector. Gazul purttor trebuie s fie inert ( s nu reacioneze cu nici unul din componeii probei sau cu faza mobil). Alegerea gazului purttor poate afecta att separarea ct i viteza analizei. Un al doilea rol foarte important al gazului purttor este acela de a furniza o matrice corespunztoare pentru detector la msurarea componenilor din prob. n cazul unui detector termic conductiv (TDC), gazele uoare cu o conductivitate termic mare sunt corespuztoare pentru obinerea unei sensibilti crescute i uniforme. n acest caz He i H2 sunt cele mai utilizate gaze purttoare. n cazul termistorilor utilizarea H2 ridic unele probleme deoarece este posibil ca acesta s reacioneze cu oxizii pmnturilor rare din care sunt confecionai detectorii. Detectorii flam ionizatori (FID) opereaz cel mai adesea cu He sau H2. n acest caz N2 d o sensibilitate de dou ori mai mare dect n cazul utilizrii H2, la FID. n unele cazuri H2 este utilizat drept gaz purttor la colanele capilare pentru efectuarea unei analize foarte rapide. Detectorii cu captur de electroni (ECD) utilizeaz de N2 foarte uscat sau a amaestec de argon i metan 5%. O alt condiie pe care trebuie s o ndeplineasc gazul purttor, este ca acesta s fie foarte pur. Aceast condiie este necesar a fi ndeplinit deoarece impuritile pot genera o serie de degradri ale fazei lichide. Coloanele din poliesteri, poliglicoli sau poliamide sunt predispuse la astfel de degradri prin reaciile acestora cu O2 sau apa. De asemenea urmele de ap pot desorbi unii contaminani din coloan provocnd un zgomot de fond ridicat (background) sau chiar aa numitele picuri fantom. Urmele de hidrocarburi din gazul purttor pot

17

cauza creterea zgomotului detectorului de tip FID i conduc totodat la diminuarea limitelor de detecie. nlturarea urmelor de ap i de hidrocarburi se poate realiza prin instalarea unor filtre de tip site moleculare, ntre butelia gazului purttor i cromatograf. Aceste site moleculare pot fi apoi regenerate prin nclzira lor la o temperatur de 3000C timp de cca 3 ore, n curent de slab de N2. Acurateea controlului debitului de gaz purttor este deosebit de important att pentru mrirea eficienei coloanei ct i pentru analizele calitative i cantitative. Pentru o analiz calitativ este esenial s existe o reproductibilitate a vitezelor de curgere care se reflect n acurateea reproductibilitii timpilor de reinere. Comparnd timpii de reinere sau ali parametri dervai ai unor compui necunoscui, cu cei ai unor standarde se pot identifica rapid i comod compuii respectivi, dar trebuie precizat c este posibil ca unul sau doi compui s aib acelai timp de reinere. Identificarea componenilor doar pe baza identitii picului nu este elocvent cromatografiei de gaze, chiar i cnd aceste instrumente sunt prevzute cu detectori selectivi. n general aceast metod necesit analize auxiliare cum ar fi: MS, RMN sau IR. Datorit proprietilor fizice i a concentraiilor diferite ale componenilor dintr-o prob, precum i a diferitelor condiii cromatografice (lungimea i diametrul coloanei, procentul de mas a fazei staionare, viteza fazei mobile) s-au dezvoltat mai multe tehnici de sampling, care sunt utilizate frecvent n analiza cromatografic de gaze. Mrimea probei analizate depinde foarte mult de tipul de coloan care este utilizat n analiz. Aceasta poate varia de la uniti de grame pn la uniti de nanograme (Tabelul II.2).
Tabelul II.2 Intervalul volumelor de prob pentru diferite tipuri de coloane. Tipul de coloan Diametrul Faza lichid Prob gazoas mm Capilar 0,25-0,5 0,5 m <10 L Cu eficien mare 2 3% 0,1-1,0 mL Obinuit 4,6 10% 0,1-10 mL 20 20% 0,1- 1 L Preparativ

Prob lichid 0,001-1 L 0,01-1 L 0,1-10 L 0,01-1.0 mL

18

De asemenea starea de agregare impune i tipul de sistem de introducere a probei n coloana cromatografic. Probele gazoase se introduc de regul utiliznd un sistem de de supape (Figura II.3). n poziia de ncrcare , curentul de prob gazos, trece continuu printr-o bucl, pn cnd n interiorul acesteia va fi numai proba. Volumul buclei cu prob este controlat prin lungimea i diametrul tubului. n poziia de introducere a probei n colon, sistemul de supape este rotit i gazul purttor transfer proba din bucl direct n coloan. Sistemul de supape are o reproductibilitate bun , este uor de manipulat i poate fi mult mai uor automatizat dect sistemul de introducerea probelor prin injectare.

Figura II.3. Schema unui sistem de supape folosit pentru probe gazoase a) poziia de nrcare cu prob; b) poziia de introducere n coloan

19

II.3.2. Sistemul de introducere a probelor

Majoritatea probelor analizate prin GC sunt n faz lichid, fie c proba nsi este lichid fie c este rezultatul solubilizrii unei probe solide. Acestea sunt vaporizate ntr-un sistem special nainte de a fi introduse n coloan. De cele mai multe ori pentru introducerea lor se folosesc seringi de la 1 la 10L (n funcie de mrimea coloanei i a probei). Se cunosc mai multe tipuri de sisteme de trecere a probelor lichide n stare de vapori (Figura II.4).

Figura II.4. Schema bloc a unui injector

La introducerea probei n injector, datorit temperaturii ridicate i constante, aceasta se vaporizeaz trecnd direct sub acinunea curentul gazului purttor n coloan. Volumul suplimentar este minimalizat pentru a asigura vaporizarea probei n coloan i pentru a reducerea dispersia. Acest tip de injector este foarte des utilizat mai ales n cazul compuilor sau probelor instabil termic (amino acizi, steroizi, pesticide, hidrocarbonate i chiar unele medicamente). n cromatografia de gaze se disting dou categorii de coloane. Prima categorie cuprinde aa numitele coloane capilare sau coloane tubulare deschise, care sunt de fapt nite tuburi deschise, caraterizate o permeabilitate crescut. n particular aceste tuburi sunt confecionate din silice fuzibil. n mod obinuit se ntlesc dou tipuri de asfel de coloane capilare, coloane capilare deschise n care faza lichid (staionar) acoper pereii interiori ai capilarei sub

20

forma unui film subire; coloane capilare n care faza lichid se afl depus pe un suport poros. Cea de a doua categorie, coloanele pachet, sunt coloanele care conin pachete de particole solide mai mult sau mai puin dense. Coloanele pachet clasice sunt acele coloane care au n interior diametre de cca 1mm sau chiar mai mici. Coloanele care au o densitate substanial mai sczut dect cele calasice au fost denumite pachet de coloane capilare. Creterea eficienei coloanelor pachet se poate realiza prin dou modaliti. Pe deoparte creterea eficienei poate fi realizat prin micorarea particulelor de pe suportul solid i o a doua modalitate este prin creterea lungimii coloanelor care conin particole de dimensiuni mai mari. n ambele situai, este necesar o micorare a presiunii n momentul utilizrii acestor coloane. nlimea talerului teoretic pentru o colan capilar este dat de relaia:
2 2D 11k 2 + 6k + r 2u0 2 kd f u0 f 2 H = m + f1 + 2 3 (1 + k )2 Ds 24(1 + k ) Dm u0

(II.7)

unde Dm este coeficientul de difuzie al componentului n faza mobil; Ds este coeficientul de difuzie al componentului n faza staionar; r este diametrul interior al capilarei; df este grosimea filmului subire al fazei lichide; k este factortul de capaciate al solutului; f1 i f2 sunt factorii de corecie pentru presiune: f1 = 9 P4 1 P2 1 2 8 P3 1

2 P 1 f2 = 3 P3 1
2

( (

)( ) )

(II.8)

unde P reprezint raportul presiunilor gazului purttor la intrarea i la ieirea din coloan (Pi/Pe), i uo este viteza liniar a gazului purttor la intrare n capilar sau: u0 = u L = f 2 tM f 2 (II.9)

n multe condiiile experimetale ntlnite n cromatografia de gaze, debitul de gaz poate fi considerat liniar. Debitul de gaz este proporional cu gradientul de presiune:

21

u(x ) =

k dp dx

(II.10)

n relaia II? k este o msur a permeabiliti coloanei i caracterizeaz viscozitatea dinamic a gazului purttor1. Se poate spune c un gaz purttor este ideal pentru toate condiiile practice numai atunci cnd viscozitatea acestuia este independent de presiune. Integrnd acest ecuaie se obine: u0 = k Pe2 Pi 2 2LPe

(II.11)

Valoarea obinut ajut la calcularea vitezei medii a gazului purttor prin coloan (realia II.9). Pentru coloanele capilare cu diametrul dc, permeabilitatea este dat de relaia:
k= d c2 32 .

Cu ajutorul relaie II.7 se pot determina valorile optime pentru nlimea unui taler (H) i pentru viteza de curgere (uo) a gazului purttor. n cele mai multe cazuri grosimea filmului fazei lichide este foarte mic, astfel c termneul al treilea din relaia II.7, care reprezint rezistena la transferul de mas a fazei lichide, se poate neglija. Astfel:
H min = u0,optim 1 d c f (k ) 2 1 8 Dm = d c f (k )

II.12
2

f (k ) =

(1 + 6k + 11k )
3(1 + k )
2

aceste relaii, rezultate n urma diferenialei ecuaiei II.7, dau condiiile optime pentru nlimea unui taler teoretic i viteza gazului purttor, n cromatografia de gaze. n urma consideraiilor fcute, se pot trage urtoare concluzii:

22

a) - numrul maxim de talere teroretice, care poate fi obinut pentru o coloan capilar este independet de tipul gazului utilizat. Deasemenea, scderea diametrului coloanei are ca rezultato cretere a numrului de talere pe unitate de lungime. b) - viteza optim pentru gazul purttor este n strns dependent cu diametrul coloanei (dc), cu factorul de presiune (f2) i cu natura acestuia (Dm). Dac factorul f2 este egal cu unitatea, viteza optim pentru gazul purttor este direct proporional cu coeficentul de difuzie (Dm), i invers proporional cu dimetrul cintern al capilarei. Gazele inerte, precum H2 i He au artat interval destul de mari pentru valoarea optim uopt, hidrogenul putnd da o nalaiz mult mai rapid (Figura II.5).

Figura II.5. Dependena H=f(uopt) pentru , N2, H2, He

Considernd n continuare, apoximaia lui f2 i negiljarea termenului care d rezstena la transferul de mas a fazei staionare, timpul de reinere pentru o

23

separarea unui component dintr-o prob nesit un anumit numr de talere teoretice (N) , i se poate calcula cu relaia.
t R = t M (1 + k ) = NH min (1 + k ) uoptim

(II.13)

de aici se poate vedea ca tR este proporional cu 1/dc, astfel c o reducere 1n diametru coloanei de cinci ori , va duce la o cretere a timpului analizei printr-un factor de 25. Pentru optimizarea separrilor cromatografice, raportul timpilor petrecui de solut n faz mobil i n faza staionar este foarte important2. Timpul n care solutul se afl in faza staionr este in strns legtur cu afinitatea acestuia fa de cele dou faze: k= t R tM =

(tR tM )
tM

(II.14)

Reinerea relativ pentru dou picuri adiacente ntr-o cromatogram poate fi descris de factorul de separare (), dat de relaia: Factorul de separare este o msur a selctivitii unui sistem cromatografic. De multe ori acest factor mai este numit i factor de selectivitate sau selectivitate.
II.3.3. Temperatura coloanei

Coloana cromatografic este termic controlat pentru ca separrile care sunt fcute, s poate fi reproductibile. Deasemenea este important pentru o coloan s pot fi operabil ntr-un interval larg de temperaturi, de la 180 peste 4000C. Controlul temperaturii coloanelor este este important i usor de realizat deaorece acest parametru de multe ori influeneaz separarea. Temperatura coloanei trebuie s fie suficient de rridicat pentru a asigurao analiz complet i intr-un timp rezonabil. Pe de alt parte temperaturile prea ridicate pot conduce la o diminuare a factorului de separare i a factorului de capacitate a componeilor din prob ceea ce de cele mai multe ori duce la o

24

rezoluie foarte mic. n acord cu o simpl aproximaie, timpul de reienre se dubleaz pentru fiecare scdere cu 300C a temperaturii coloanei. n multe cazuri, pentru separea componenilor unei probe temperaturile joase sunt preferate (Figura II.6).

Figura II.6. Efectul temperaturii n analiza unui amestec de hidrocarburi simple

n funcie de acest important parametru, metodele cromatografice sunt clasate n dou categori, analiz izoterm cnd temperatura coloanei este meninut constant pe tot parcursul analizei i analiz cu proggram de tempertur , cnd , pe parcursul efecturii analizei, temperatura coloanei crete n timp, deobicei cu o vitez liniar (5-400C/min). n figura II.7 este prezentat diferenele care apar n cazul celor dou metode de analiz. De obicei analiza cu program de temperatur este des utilizat n analiz amestecurilor ce conin componei cu temperaturile de fierbere foarte diferite.

25

Figura II.7. Comparaie ntre cromatogramele izoterm i cu program de temperatur

n analiza cu program de temperatur, temperatura iniial este sczut, asfel c primul pic cromatografic va fi datorat compusului cel mai volatil, urmnd ca urmtoarele picuri s fie pentru compuii cu volatilitate din ce n ce mai mic. n general intervalul n care operea z analiza cromatografic este cuprins ntre 60 280OC.
II.3.4. Detectori utilizai n cromatografia de gaze

Detectorul cromatografic genereaz un semnal electric proporional cu cantitatea componentului care prsete coloana. Detectorii pot fi clasificai n dou clase. a) detectori dependeni de concentraie; b) - detectori dependeni de viteza masic.

26

detectorii

dependeni

de

concentraie,

(TCD

ECD),

semnaluldetectorului este proporional cu concentraia probei din gazul purttor. n detectorii dependenie de viteza masic (FID), semnalul detectorului este dependent de masa probei care trece prin detector pe unitate de timp. Sensibilitate unui detector este definit ca fiind mrimea semnalului produs pentru o concentraie dat a unei probe sau pentru o anumit vitez masic. Un detector sensibil va genera un semnal intens pentru mrimea probei date. Acest sensibiltate poate fi determinat din panta dreptei, n care se reprezint dependena rspunsulului detectorului funcie de concentraia sau viteza masic a probei. Zgomotul detectorului generat de rspunsul acestuia ntr-un interval de timp scurt sau la ntmplare, este dependent de proprietile electrice ale detectorului, temperatura de lucru i debitul gazului purttor. Zgomotul este un factor care determin cantitatea minim de prob care poate fi detectat. Cantitatea de prob care genereaz un semanal de dou ori mai intens dect nivelul zzgomotului, este definit ca fiind cantitatea minim detectabil. Foarte des utilizai ca detectori n cromatografia de gaze sunt detectorul termic conductiv (TCD), flam-ionizator(FID), detector captur de electroni (ECD). Detectorul termic-conductiv (TCD). Principiul de funcionare care st la baza acestui detector este c un corp nczit va pierde cldur cu o anumit vitez deteminat de compoziia gazului nconjurtor. Deci viteza pierderii cldurii poate fi utilizat ca o msur a compoziiei gazului. Figura II.8 prezint schema unui detector termic conductiv, constituit dintr-un filament din tungsten, localizat n interiorul unei caviti. Cavitatea este protejat de o manta din oel inoxidabil, care menine temperatura la o valoare constant. Filamentul nclzit poate pierde cldur prin schimbul termic cu prile mai reci ale blocului din oel prin urmtoarele procese: a) conducie termic; b) convecie;

27

c) radiaie;

Figura II.8. Celul cu conductibilitate termic

Procesele majore sunt pierderea cldurii prin conducie termic gazoas i convecie forat. Aceste dou procese produc o pierdere de 75% a cldurii filamentului. Unele gaze purttoare precum He sau H2 pot cauza o rcire a filamentului mai mult pe baza conduciei termice. Cldura este trannsferat instantaneu prin conducie cnd moleculelegazului purttor ating filamentul nclzit. Cu ct vitezele de curgere sunt mai mari cu att viteza de pierdere a cldurii este mai mare. Din acest motiv TCD este sensibil la debitul de gaz. Diferenele ntre conductivitile termice ale gazelor sunt bazate pe mobilitatea sau viteza cu care moleculele gazului difuzeaz (moleculele mai mici au o mobilitate mai mare i o conductivitate termic ridicat). De aceea H2 i He, care sunt cele mai mici molecule au o cea mai mare conductivitate termic. Detectorul flam-ionizator (FID) Detectorii ionizatori opereaz pe baza principiului c conductivitatea electric a gazului este direct proporional cu concentraia particuleor ncrcate din gazul purttor.

28

n FID o flacr de H2 este folosit pentru ionizarea probelor. Gazul purttor de la coloan trece direct n flacra care ionizeaz o parte din moleculele organice. Prezena particoloelor ncrcate (ioni pozitivi i ioni negativi i electroni) n paiul liber al electrodului (Figura II.9) generaz un curent care este msurat de un rezistor. Voltajul rezultat este amplificat de un electrometru i trimis apoi la un un nregistrator. Se poate considera c spaiul liber al electrodului este un rezistor variabil a crui rezisten are o valoare dat de numrul de particole ncrcate din acesta spaiu. Cnd un compus organic ajunge n flacr el este supus combustiei particulele ncrcate sunt formate. Acesta va determina descreterea rezistenei spaiului liber i creterea curentului. Rspunsul nregistratorului este proporional cu cantitatea de compus organic eluat din coloan. Figura II.9 prezint schema unui detector asfel de FID.

Figura II.9. Detectorul flam-ionizator

29

Trebuie menionat faptul c detectorii tip FID rspund numai la compuii organici. Aceti detectori sunt corespunztori pentru analiza compuilor organici aflai n urme, n aer sau ap. Detectorul cu captur de electroni(ECD) Acest tip de detector se bazez pe msurarea scderii semnalului electric. n funcie de modul de realizare a curgerii gazului putrttor spre detector, o plcu de
63

Ni radioactiv ionizeaz gazul i procesul de formare a electronilor este lent

(Figura II.10). Aceti electroni migreaz la anod care n mod normal are un potenial de cca 90V . Colectare acestor ioni conduce la un curent de cca 10-8 A, care este amplificat de un electrometru.

Figura II.10. Detector captur de electroni

Existen unui component cu afinitate pentru electroni va produce o scdere a acestui curent staionar. Aceast pierdere de curent este afit ca un pic pozitiv. Cele mai moderne detectoare de acest tip, au posibilitatea meninerii curentului la o valoare constant pe baza unor pulsuri voltaice cu frecven variabil. Frecvena pulsurilor este proporinal cu concentraia probei i poate fi utilizat pemtru analize cantitative.

30

Acest detector este foarte sensibili la derivai polihalogenaai ai alcanilor, la carbonili conjugai, nitrii, nitrai, compui polinitroaromatici i specii organometalice. Este insensibil la hidrocarburi alcooli i cetone.

31

III. TANDEMUL CROMATOGRAFIE SPECTROMETRIE DE MASA

III.1 Introducere III.2. Spectrometria de mas III.2.1. Generaliti III.2.2. Aspecte tehnice si aparatura III.2.2.1. Sistemul de introducere a probelor III. 2.2.2. Surse de ionizare utilizate n sistemul GC-MS III.2.2.3. Tipuri de analizoare utilizate n sistemul GC/MS III.2.2.4. Detectorii de ioni. IIII.2.2.5. Tipuri de interfee pentru sistemul GC/MS IIII.2.2.6. Puterea de rezolutie a spectrometrelor de masa III.3 Monitorizarea datelor in spectrometria de masa

32

III. TANDEMUL CROMATOGRAFIE SPECTROMETRIE DE MASA

III.1 Introducere
Cromatogramele dau informaii cu privire la complexitatea (numrul de componeni), cantitatea (nlimea picului sau aria acestuia) i identitatea (parametrul de reinere) componenilor dintr-un amestec. Identificarea compuilor chimici prin luarea n considerare numai a parametrului de reinere este de cele mai multe ori nerelevant, chiar i n cazul analizei unor amestecuri mai simple. Cnd se poate stabili cu mare precizie identitatea unui component din prob, atunci informaiile cantitative provenite de la cromatogram sunt considerate a fi foarte bune. Situaia este invers la tehnicile spectrometrice deoarece acestea furnizeaz suficiente informaii calitative din care se poate deduce identitate substanei, cu un grad mai mare de certitudine. Cu toate acestea instrumentele spectrometrice au dou limitri practice.Adeseori n spectrometrie este destul de dificil s se obin toate informaiile cantitative din semnalele generate i pentru o real identificare cu aceste tipuri de instrumente este necesar s se foloseasc probe cu un nalt grad de puritate. Astfel tehnicile cromatografice i spectrometrice furnizeaz informaii complementare despre identitatea i concentraia componeilor dintr-o prob. Descoperirea unor spectrometre de mas capabile s asigure o eficien i rezoluie ridicat n determinarea structurii compuilor chimici din probe complexe, a condus la extinderea utilizrii lor ca detectori n tehnica combinat GC-MS. Detectorii conveionali de tip flamionizatori, sau detectori cu captur de electroni sunt nlocuii n prezent de detectori de mas selectivi sau detectori tip ion trap, care au avantajul c asigur un grad de specificitate deosebit de nalt, i n cele mai multe cazuri cu o sensibilitate ridicat.

33

Principala tehnic combinat de analiz i cel mai des utilizat, este cromatografia de gaze interpus spectrometriei de mas (GC/MS) i spectrometriei n infrarou cu transformat Fourier (GC/FTIR). Avantajele prezentate de tehnicile n tandem, de tipul GC-MS, duc la utilizarea acestora pe scar larg n vederea analizei produilor chimici (de natur organic, n special, sau anorganic) din mediul nconjurtor. Alte tipuri de tehnici cuplate utilizate n analizele compuilor chimici, dar cu o arie mai mic de aplicabilitate, sunt: cromatografia de lichide-spectrometria de mas (LC/MS), cromatografia de lichide-spectrometria n infrarou cu transformat Fourier (LC/FTIR) i cromatografia de lichide-rezonana magnetic nuclear; cromatografia n strat subire-spectrometria de mas (TLC/FTIR), cromatografia n strat subire-spectrometria n infrarou cu transformat Fourier (TLC/FTIR). n ultimul timp au fost puse la punct i tehnici n serie care permit realizarea cuplrii mai multor tipuri de instrumente analitice( GC/FTIR/MS). Toate aceste tehnici sunt caracterizate prin abundena de date pe care le pot furniza. Avantajul major al acestor metode de analiz const n faptul c permit folosirea calculatoarelor sau microprocesoarelor de mare putere, n vederea controlului proceselor care au loc n fiecare instrument analitic, achiziia, stocarea, vizualizarea i interpretarea datelor. Calculatoarele ofer de asemenea posibilitatea obinerii directe a spectrelor de mas i astfel interpretarea datelor spectrale devine mai puin dificil. Tandemul GC-MS furnizez o serie de avantaje complementare celor prezentate de cromatografia de gaze. Interfaa sistemului GC-MS, realizat de cele mai multe ori prin sisteme deosebit de complexe, are capacitatea de a asigura meninerea probei n condiii optime pentru analiz, evitnd descompunerea sau degradarea termic i permite totodat obinerea unor timpi de reinere reproductibili de la o analiz la alta.

34

III.2. Spectrometria de masa

III.2.1. Generalitati Spectrometria de mas este una din cele mai utilizate metode de analiz

pentru stabilirea structurii compuilor organici. La baza acestei metode au stat observatiile lui Wien (1898) privind posibilitatea devierii unui flux de ioni pozitivi de ctre un cmp magnetic sau electric. Desi primele spectre de masa au fost trasate in 1912 de catre J.J. Thomson, aplicarea larga a spectrometriei de masa a inceput in jurul anului 1940 cand Hoover abordeaza analiza cantitativa a amestecurilor de hidrocarburi. Dupa 1948, o serie de cercetatori ca Beynon, McLafferty, William si altii, in urma unor studii sistematice, stabilesc reguli generale si specifice de fragmentare care permit stabilirea structurii compusilor organici. Dificultatile majore in raspandirea larga a spectrometriei de masa a constituit-o si o constituie inca pretul mare si intretinerea dificila a aparaturii. Spectrul de mas este obinut prin transformarea probelor ntr-un amestec gazos de ioni i separarea acestora funcie de raportul m/z. Spectrometria de mas este considerat a fi cea mai aplicat tehnic analitic n cercetarea tiinific, deoarece este capabil s dea informaii despre calitatea i cantitatea compuilor organici i anorganici din amestecuri complexe, despre structura unui numr mare de specii moleculare complexe, despre raportul izotopilor atomilor dintr-o prob i despre structura i compoziia suprafeelor solide. n tabelul III.1 este prezentat evoluia acestei tehnici analitice de-a lungul anilor. De precizat c toate din aplicaiile prezentate n acest tabel se ntlnesc nc n laboratoarele moderne.
Tabelul III.1. Evoluia spectrometriei de mas. Eveniment -Descrierea comportrii ionilor n cmp magnetic -Dubla focalizare

Dat aproximativ 1920 1935

Aplicaii -Determinarea abundenelor izotopilor unui element -Obinerea unei rezolii mai nalte

35 -Comercializarea primului spectrometru de mas -Sursa tip scnteie -Stabilirea regulior de fragmentare a speciilor moleculare -Cuplarea spectrometrului de mas cu cromatograful de gaze -Spectrometre de masa n tandem -Noi tehnici de ionizare -Aplicarea transformatei Fourier la spectrometria de mas -mbuntirea surselor pentru compuii nevolatili 1950 1955 1960 -Analize cantitative ale produselor petroliere -Analize cantitative elementale -Identificare i analize structurale ale moleculelor complexe -Analize calitative i cantitative ale amestecurilor complexe -Analiza rapid a amestecurilor complexe -Creterea capacitii de elucidare a structurii compuilor -mbuntirea rezoluiei si a raportului semnal-zgomot. -Analiza polimerilor i a suprafeelor

1965 1970 1970 1980 1980

Un termen carcteristic n spectrometria de mas este raportul mas-sarcin (m/z) a ionilor atomici sau moleculari. Acest termen se obine prin divizarea direct a masei ionului rezultat, la numrul sarcinilor ionului dat. Deoarece majoritatea ionilor obinui n spectrometria de mas au o singur sarcin, termenul m/z este adeseori prescurtat la termenul mas. Aceast abreviere nu este tocmai corect n termeni strici, dar este des ntlnit n literatura de specialitate. In principiu spectrometria de masa consta in: a. obtinerea ionilor pozitivi (ionizarea probei); b. separarea acestor ioni in functie de raportul dintre masa si sarcina lor (m/e) (in general emaxim = 3); c. inregistrarea abundentelor relative ale ionilor. Diversitatea mare a ionilor care se formeaza este cauzata de transformarile pe care la pot suferi moleculele organice in spectrometrul de masa. Acestea pot fi redate in modul cel mai general prin urmatoarea schema: 1. Ionizarea:

36

ABCDEF + e- ABCDEF]+ + 2eIon molecular 2. Fragmentarea: a. fragmentarea ionului molecular: ABCDEF]+ AB] + CDEF]+ ABC] + DEF]+ ABCD] + EF]+ b. scindarea in continuare a fragmentelor ionice: ABCD] AB] + + CD c. fragmentari insotite de transpozitii: ABCDEF]+ ABCF]+ + DE ABF]+ + CDE Ionii radicali formati pot suferi in continuare fragmentari conform schemei a.; d. coliziuni ioni-molecule neutre: ABCDEF]+ + ABCDEF ABCDEFABCDEF]+ ABCDEFA]+ + BCDEF] Probabilitatea formarii ionilor de coliziune este mica si in general previzibila; e. formarea ionilor cu sarcina multipla: ABCDEF + e- ABCDEF]n+ + (n+1) e- , n3 Probabilitatea aparitiei acestor ioni este foarte mica si specifica anumitor clase de compusi; f. formarea ionilor negativi ABCDEF + e- ABCDEF]- ABCD]- + DEF] Acesti ioni se formeaza numai in anumite conditii. S-au notat cu A, B, C, D, E si F diferiti atomi sau grupari de atomi din molecula, iar cu ]+ , ]+, ] ionii-radicali, ionii pozitivi si radicalii la care nu se poate preciza pe care atom sau grupare de atomi se gaseste sarcina sau caracterul de radical. Cand se cunoaste exact pozitia sarcinii, aceasta se noteaza simplu, in dreptul atomului care o poarta.
+

37

III.2.2. Aspecte tehnice si aparatura

Indiferent de principiile care stau la baza construciei lor, orice spectrometru de mas trebuie s permit obinerea, separarea n funcie de m/z i nregistrarea ionilor pozitivi (uneori i negativi) proveni din fragmentrile compuilor organici. Cum n marea majoritate a cazurilor z=e=1, separarea i nregistrarea ionilor se face n funcie de masele lor. n figura III.1 este prezentat schema bloc a unui spectrometru de mas.

Figura III.1. Principalele componente ale unui spectrometru de mas

Scopul sistemului de introducere a probelor este de a introduce cantitti mici de prob (de ordinul micromolilor sau mai mici) n spectrometrul de mas, unde componenii sunt convertii ntr-un amestec gazos de ioni. Adesea, aceste sisteme conin dispozitive speciale de volatilizare a probelor solide i lichide. Sursa de ionizare a spectrometrului de mas convertete componenii probelor n ioni, prin bombardarea cu ioni, electroni, atomi sau fotoni. O

38

alternativ la acest tip de ionizare este obinerea direct a ionilor probei, prin ionizare termic sau electric. n unele cazuri sursa de ioni i sistemul de introducere a probei se gsesc cuplate ntr-un singur component. n ambele situaii, la ieire, proba se gsete sub forma unui curent de ioni pozitivi sau negativi (cel mai adesea pozitivi), care apoi este decelat n analizorul de mas. Rolul analizorului de mas este analog cu rolul reelelor de difracie din spectrometrele optice, n fapt, dispersia realizndu-se n acest caz pe baza raportului m/z a ionilor probei. Ca i spectrometrele optice, spectrometrele de mas cuprind un detector (pentru ioni) care convertete radiaia ionic ntr-un semnal electric, care este procesat, stocat n memoria unui calculator i afiat sau nregistrat n diferite variante. O caracteristic important a spectrometrelor de mas, care nu este gsit n cazul spectrometrelor optice (doar n cazul spectrometrelor electronice), este existena unui sistem de vidare, care menine o presiune joas (ntre 10-4 i 10-8 torri), n toate componentele aparatului, mai puin n sistemul de procesare i redare a semnalului.
III.2.2.1. Sistemul de introducere a probelor

In functie de volatilitatea si stabilitatea termica a probei, precum si de tipul sursei de ionizare, aparatul este prevazut cu diverse sisteme de introducere. Cantitatea de proba necesara pentru trasarea spectrului variaza intre 10-6 si 2mg in functie de tipul si caracteristicele aparatului, sistemul de introducere a probelor, masa moleculara, tipul sursei de ionizare. Prin cuplarea cromatografiei de gaz cu spectrometria de masa, gazele si lichidele pot fi introduse in aparat fara a mai fi izolate.
III. 2.2.2. Surse de ionizare utilizate n sistemul GC-MS

39

Spectrele de mas date de speciile moleculare sunt n strns legtur cu metoda folosit pentru producerea gazului ionic. Iniial formarea gazului ionic se baza pe bombardarea componenilor gazoi cu un fascicol de ioni. n ciuda ctorva dezavantaje ale acestei metode ea este nc de o importana major, mai ales c toate spectrele de mas care se gsesc n literatura de specialitate au fost realizate prin aceast tehnic. n ultimii ani, au fost realizate mai multe tipuri noi de surse, care ofer cteva avantaje fa de sursa clasic, (fascicul de electroni). n tabelul III.2 sunt prezentate cteva din sursele noi folosite n spectrometria de mas. n mod curent, spectrometrele de mas sunt echipate cu accesorii care permit utilizarea mai multor tipuri de surse.
Tabelul III.2. Surse de ionizare utilzate n spectrometria de mas Numele sursei Abrevierea Tipul de surs faz gazoas EI Ionizare cu fascicol de electroni faz gazos CI Ionizare chimic faz gazoas FI Cmp de ionizare desorbie FD Cmp de desorbie desorbie FAB Bombardare cu atomi rapizi desorbie LD Desorbie laser desorbie PD Desorbie n plasm Desorbie termic Ionizarea electrohidrodinamic Ionizare tip termospray EHMS ES ESI desorbie desorbie

Agentul de ionizare electroni energici ionii reactivului electrozi cu potenial nalt electrozi cu potenial nal atomi energici raza laser energia nalt de fisiune a 252 Cf temperatura cmp electric nalt difuzia de sarcini pozitive n picturile de soluie a probei

Functie de tipul sursei, ionizarea moleculelor organice se poate realiza pe mai multe ci. Cele mai importante tehnici de ionizare, care pot fi utilizate n tandem cu separarea cromatografic, includ: - ionizarea electronic (EI); - ionizarea chimic (CI); - ionizarea prin pulverizare in cimp electrostatic (ESI); - tehnici de desorbtie: - ionizarea prin bombardarea cu atomi rapizi (FAB); - ionizare prin desorbtie laser (LD); - ionizare prin desorbtie laser in prezenta unei matrici (MALDI);

40

- ionizare prin desorbtie in cimp electrostatic (FD); - ionizare prin desorbtie in plasma (PD). Efectul diferitelor tehnici de ionizare asupra fragmentarii moleculelor organice este diferit dar complementar (ceea ce sugereaza utilizarea a cel putin doua tehnici de ionizare pentru aceiasi molecula), asa cum se poate observa din figura de mai jos:

Ionizarea electronica (Electron impact ionization, EI)

Metoda de ionizare prin impact cu un fascicol energetic de electroni a fost mult timp singura utilizata in spectrometria de masa si inca se foloseste cu succes, mai ales in cazul compusilor nepolari, cu mase moleculare relativ mici (pana la 1000), volatili si stabili termic.
Sursele cu impact electronic (Figura III.2), se bazaez pe nclzirea unui

filament (Wolfram sau Reniu) aflat ntr-o camer vidat, care genereaz un fascicol de electroni cu energii foarte apropiate.

41

Figura III.2. Schema de principiu a unei camere cu ionizare cu impact de electroni

Electronii odata generati sunt apoi accelerati spre anod, urmind traiectorii elicoidale (datorita miscarii in cimpul magnetic generat de un magnet permanent):

Moleculele de gaz intalnite in incinta de ionizare interactioneaza cu fascicolul de electroni, cu formare de ioni ce pot fi separati si detectati pe baza raportului m/z. Energia fascicolului de electroni poate fi reglata intre 5-100 eV. Energia electronilor este controlat prin intermediul unui potenial de accelerare stabilit ntre catod i surs. Daca energia fascicolului de electroni este de 5-15 eV, din molecula este smuls un electron, luand nastere ionul molecular M+. Potenialul la

42

care apare ionul M + (eventual ali ioni dac M + este instabil) se numete potenial de apariie si este diferit in functie de structura compusului organic.

M + e M + + 2e Electronii rmai se distribuie ct mai uniform posibil pentru ocuparea orbitalei rmas vacant, slbind n acelai timp diferite legturi ale ionului molecular. Pentru realizarea spectrului de mas, proba este bombardat cu un fascicol de electroni cu energia de 70 eV. n aceste condiii, timpul de via al ionului molecular variaz ntre 10-14-10-4 secunde, el scindndu-se foarte repede la nivelul celor mai slabe legturi, dnd natere la un numr mare de fragmentri. Cu cat energia fascicolului de electroni este mai mare, cu atat numarul fragmentelor este mai mare, astfel incat pentru reproductibilitatea spectrelor este necesar sa se mentina aceeasi intensitate a fascicolului de electroni. Modurile de fragmentare sunt adesea dictate de structura ionului molecular ( M + ). Deoarece muli compui organici au potenialele de ionizare de la 7 la 20 eV, energia transferat n urma coliziunii dintre electroni i moleculele neutre este suficient s determine att ionizarea ct i fragmentarea multipl. Majoritatea ionilor formai prin acest proces au o singur sarcin, dar pot apare i fragmente moleculare cu sarcini multiple i chiar ioni cu sarcini negative. n cele mai multe cazuri ionii negativi reprezint doar o fraciune foarte mic din numrul total de ioni formai. Temperatura din aria de ionizare asigur meninerea n stare de vapori a probei, la o presiune de cca 10-5 torri. La aceast presiune drumul mediu liber al ionilor este suficient de mare, pentru ca numrul de coliziuni dintre ionii moleculari i molecule s fie ct mai redus la ieirea acestora din surs. Ionii pozitivi sunt scoi din aria de ionizare prin respingere electrostatic, electrodul avnd un potenial pozitiv mic, care i direcioneaz direct spre fanta de intrare n analizor. Fascicolul de ioni rezultat, focalizat, colimat i accelerat sub forma unui fascicol de ioni cu energii egale (sau foarte apropiate), este trimis spre analizorul spectrometrului. n spectrometrele moderne sursa de ionizare i analizorul operez la presiuni diferite. n aceste instrumente presiunea sursei de ionizare este mai mare

43

dect cea a analizorului, pentru care cea mai optim valoare a presiuni este de cca 10-7 torri. Avantajele EI: - tehnica de lucru foarte bine bine pusa la punct si cunoscuta; - exista deja baze de date privind fragmentarea compusilor organici; - se poate cupla cu GC; - se preteaza si pentru compusii insolubili sau nepolari. Dezavantajele EI: - necesita compusi volatili si termic stabili; - uneori nu furnizeaza ionul molecular; - nu se poate cupla cu LC; - se preteaza compusilor cu mase moleculare mici (<1000). Bombardarea moleculelor neutre cu un fascicol de electroni cu energii nalte, conduce la formarea de ioni-radicali moleculari cu exces de energie. Ionul molecular furnizeaz informaii utile despre identitatea moleculei definit prin masa molecular. Din pcate, n condiiile ionizrii electronice aceti ioni pot fi n unele situaii instabili pentru a putea genera un spectru, chiar i atunci cnd sunt utilizate fascicole cu energii joase (15-20 eV). n aceste condiii este necesar utilizarea unei alte metode de ionizare, mai puin energic, cum ar fi ionizarea chimic, n vederea obinerii informaiilor privind masa molecular.
Ionizarea chimica (Chemical Ionization, CI)

Ionizarea chimic este probabil cea de-a doua procedur foarte des ntlnit, pentru producerea ionilor n spectrometria de mas. Principiul metodei consta in utilizarea unui gaz reactant (CH4, NH3, NO, izobutan, etc), care este ionizat sub energia unui fascicol de electroni, iar ionii astfel formati, reactioneaza in continuare cu moleculele probei de analizat. Pentru obinerea ionizrii chimice, este nesesar modificarea ariei fluxului de electroni, artat n figura III.2. Practic, n aria de ionizare trebuie s se obin o presiune de cca 1 torr pentru gazul reactiv, n timp ce n analizor trebuie s se

44

menin o presiune mult mai scazuta, de cca 10-5 torri i totodat trebuie modificat i diametrul fantei de intrare n analizor. Cu aceste modificri, gazul reactiv este introdus n interiorul regiunii de ionizare n aa fel nct acesta s fie ntr-o concentraie de 103-104 mai mare dect concentraia probei.

Deoarece concentraia gazului reactiv este aa de mare, fascicolul de electroni va reaciona n exclusivitate cu moleculele gazului reactiv. n condiiile de presiune corespunztoare sursei de ionizare chimic, este favorizat producerea electronilor termali, care pot fi captai de moleculele sau fragmentele ion moleculare, cu o afinitate mare pentru electroni, conducnd la apariia ionilor moleculari cu sarcin negativ. Numrul de ioni negativi n acest caz poate fi cu dou sau chiar trei ordine de mrime mai mare dect n ionizarea cu impact de electroni (EI), facnd practic posibil utilizarea spectrometriei de mas prin ionizare chimic negativ ca o tehnic analitic viabil. Deoarece muli compui care sunt predispui la formare de ioni negativi sunt biologic activi sau substane toxice, spectrometria de mas cu ionizarea chimic negativ este o tehnic foarte important n studiile biomedicale i de mediu.

45

Unul din cei mai utilizai reactivi chimici de ionizare este metanul, care interacioneaz cu un fascicol de electroni cu energii mari (70eV), conducnd la o
+ + serie de ioni de tipul: CH 4 , CH 3+ , CH 2 , C 2 H 3+ . Aceti ioni, interaionez mai

departe cu moleculele neutre de metan conform schemei de mai jos:

CH4 e CH4 -H CH3 -H CH2

+ CH 4 + CH 4 CH 5+ + CH 3

CH 3+ + CH 4 C 2 H 5+ + H 2
+ CH 2 + CH 4 C2 H 3+ + H 2 + H

C2 H 3+ + CH 4 C3 H 5+ + H 2
Introducerea unor cantiti mici de prob n interiorul sursei (CI), declaneaz reacia dintre ionii gazului reactiv i moleculele neutre ale probei. Cele mai importante reacii sunt: - transferul de proton de la ionul gazului la molecula
+ neutr a probei, rezultnd astfel ionul molecular de tip XH 2 : + XH + CH 5+ XH 2 + CH 4

- transfer de sarcina:

XH + Y+ XH+ + Y
- adiia electrofil a ionilor gazului la moleculele neutre ale probei:

XH + Y + XH Y

- transferul anionului hidrur ( H ) de la molecula neutr a probei la ionul gazului reactiv:

XH + C2 H 5+ X + + C2 H 6

Ionii probei rezultai prin acest tip de ionizare conduc la un numr mult mai mic de fragmentri dect n cazul EI. Astfel ionizarea chimic (CI) este mult mai utilizat pentru determinarea maselor moleculare dect EI. Apariia i reproductibilitatea spectrelor de mas obinute prin ionizare chimic depind de o serie de factori i anume: condiiile de ionizare, temperatura

46

(n principal), presiunea i puritatea gazului reactiv. n general spectrele obinute prin CI nu sunt la fel de reproductibile ca cele date de sursele EI. Sursele de ionizare la presiunea atmosferic difer de celelalte surse deoarece n acest caz ionizarea se realizeaz la presiune atmosferic, n condiiile n care se stabilete un echilibru ntre ioni i moleculele neutre. Ionii reactivi sunt generai prin bombardarea unui gaz inert (N2), cu electronii generai de o placu de
63

Ni. Rezultatul este formarea unei plasme ce

conine ioni i electroni formai din ionizarea gazului purttor i de la reaciile ionmoleculelor urmelor de impuriti ce pot exista n acest gaz ( ap, O2, moleculele de solvent intrate n surs). Ionizarea moleculelor probei se realizeaz fie prin reacia direct cu electronii din plasm fie prin reacia ion-moleculelor impuritilor. n aceste condiii se pot forma, att ioni negativi ct i ioni pozitivi, prin adiia sau substituia anionului hidrur, prin schimbarea sarcinilor, prin captur de electroni i prin formarea de aduci cu ioni tip cluster.

Avantaje:
- furnizeaza ionul molecular; - permit cuplare cu GC; - se preteaza compusilor insolubili.

Dezavantaje:
- necesita compusi volatili si termic stabili; - se preteaza compusilor cu mase moleculare mici (<1000); - nu furnizeaza fragmentari ale probei. Tehnicile de ionizare prezentate mai sus necesit mai nti o vaporizare a probelor, excluznd practic posibilitatea analizei compuilor nevolatili i cu instabiltate termic ridicat precum i a probelor ionice. Pentru aceste tipuri de probe este indicat folosirea altor tehnici de ionizare i anume: bombardarea cu atomi rapizi (FAB), termosprayul i electrosprayul.
Ionizare prin bombardare cu un fascicol de atomi rapizi (Fast Atomic Bombardment, FAB)

47

n cazul bombardrii cu atomi rapizi, proba este mai nti dizolvat ntr-un solvent vscos (matrice), i apoi este bombardat cu un fascicol de particule cu vitez mare. Cel mai adesea aceste particule sunt atomi ai gazelor rare, argon (Ar) sau xenon (Xe), cu o energie cuprins ntre 2-10 KeV (Figura III.3). Fascicolul de atomi neutri rapizi de gaz rar se obtine intr-un tun, prin schimb de sarcina intre un fascicol accelerat de ioni si gaz neionizat, ex.: Ar Ar+ + eAr+ + Ar0 Ar0 + Ar+ Ulterior s-a apelat la utilizarea unui fascicol primar de ioni de Cs+ in locul fascicolului neutru de gaz (se obtine prin evaporarea unei sari de Cs). Fascicolul primar (atomi de gaz rar, sau ioni Cs+) cade pe suprafata probei sub un unghi de 60-70, iar ionii produsi sunt apoi extrasi si focalizati in analizor. Proba de analizat este dizolvata in matricea respectiva si se depune pe un suport metalic (cupru sau inox). Rezultatul impactului este difuzia materialului n faz gazoas printr-un moment de transfer, n care o parte din proba desorbit poate trece att n ioni pozitivi dar i n ioni negativi. Aceti ioni sunt apoi extrai din aria de ionizare i direcionai spre analizorul spectrometrului. Spectrul de mas este datorat formrii unor ioni de tipul [M + H ] i
+

[M H ]

uneori fiind posibil i formarea i unor ioni tip cluster, aceste specii

rezultnd din implicarea ionilor pseudomoleculari combinai cu un numr variabil de molecule neionizate din matricea solventului sau cu moleculele neutre ale probei.

48

Figura III.3. Schema unei surse de ionizare cu atomi rapizi

n cele mai multe cazuri difuzia i ionizarea produc un numr mic de fragmente ionice, dar suficiente pentru a obine informaii cu privire la structura i la masa molecular a probei. Ca matrice se folosesc lichide cu vascozitate mare si volatilitate scazuta, cu o presiune de vapori mica si in care proba sa fie cat mai solubila: alcool meta-nitro benzilic (MNBA), glicerol, tioglicerol, dietanolamina, trietanolamina, etc.

Avantaje:
- furnizeaza ionul molecular; - se preteaza compusilor labili termic; - se preteaza la compusi cu mase moleculare mari (>10000).
Practic metoda permite analiza unor compusi ionici, compusi cu mase moleculare mari si polimeri. Metoda este convenabila si pentru compusii instabili termic sau cu volatilitate scazuta, compusii fiind investigati in solutie.

Dezavantaje:
- necesita compusi solubili in matrix;

49

- sensibilitate scazuta; - nu furnizeaza fragmentari ale probei; - operare dificila.

Ionizarea prin pulverizare in camp electrostatic (Electrospray ionization, ESI)

Este o metoda recenta de ionizare, iar descoperirea acestei tehnici a condus la obtinerea premiului Nobel in chimie in 2002 de catre John Bennett Fenn. Pentru acest tip de ionizare este necesar ca substanta de analizat sa fie dizolvata intr-un solvent polar si volatil, de exemplu MeOH, MeCN, etc. Desorbtia ionilor din solutie se realizeaza prin pulverizarea si formarea unor picaturi foarte fine sub actiunea unei surse de energie termica, aerodinamica, electrica, sau o combinatie a acestora. Gazul care inconjoara picaturile furnizeaza energia termica necesara evaporarii solventului. Metoda opereaza la presiune atmosferica si temperatura mediului ambient. ESI presupune crearea unui camp electric prin aplicarea unei diferente de potential la nivelul capilarei prin care se pulverizeaza lichidul, cu ajutorul unor electrozi situati in imediata vecinatate. Fluxul de lichid va capata astfel o forma conica la iesirea din capilara (con Taylor), din care se vor desprinde apoi picaturile. Initial, la potential scazut, prin pulverizare se obtin picaturi de dimensiuni relativ mari, care nu permit desorbtia ionilor. Crescand potentialul aplicat capilarei, are loc o pulverizare continuu, sub forma unui grup de picaturi foarte fine de ioni pozitivi sau negativi, desprinse din conul de lichid format la capatul capilarei.

50

Avantaje:
- furnizeaza ionul molecular; - poate fi cuplata cu HPLC; - se preteaza compusilor labili termic; - operare usoara; - se preteaza la compusi cu mase moleculare mari (>100000).

Dezavantaje:
- necesita compusi polari solubili in solventi polari (MeOH, acetona, acetonitril); - metoda este sensibila la saruri; - nu furnizeaza fragmentari ale probei.
Ionizare prin desorbtie laser (LD) Ionizare prin desorbtie laser in prezenta unei matrici (MALDI)

In aceasta metoda, atat desorbtia, cat si ionizarea au loc sub influenta unei radiatii laser, fie in absenta, fie in prezenta unei matrici. Se utilizeaza doar tehnica

51

in pulsuri, in astfel de procese fiind mai probabila detectia speciilor [M+ metal alcalin]+ decat a speciilor [M + H]+. Formarea de cationi are loc prin reactii in faza gazoasa intre ioni si molecule. Ionizarea si desorbtia au loc printr-o combinatie de procese de excitare in faza solida, a unor procese de excitare electronica individuala si a unor reactii fotochimice. Cresterea puterii radiatiei laser are ca efect absorbtia ulterioara de energie de catre ioni, ceea ce poate conduce la un proces de fragmentare controlat.

In cazul analizei unor biomolecule cu mase moleculare foarte mari prin tehnica MALDI, substanta este inglobata intr-o matrice care trebuie sa absoarba puternic la lungimea de unda a laserului aplicat (acid nicotinic, p-nitroanilina, etc).

Avantaje:
- furnizeaza ionul molecular; - se preteaza compusilor labili termic; - se preteaza la compusi cu mase moleculare mari (>100000); - operare usoara.

Dezavantaje:
- necesita o mare varietate de matrice; - nu furnizeaza fragmentari ale probei.
Ionizare prin desorbtie in camp electrostatic (FD)

52

Metoda blanda de ionizare si desorbtie a ionilor formati pe suprafata unui anod metalic. Proba de analizat este depusa initial pe suprafata filamentului, ionizata sub aceasta forma, iar ionii formati de desorb ulterior. Formarea ionilor poate avea loc prin: - interactiunea cu electronii sub influenta campului electric - aditie de protoni sau cationi - ionizare termica-necesita incalzirea filamentului
Ionizare prin desorbtie in plasma (PD)

Pricipial metoda consta in desorbtia ionilor din substanta de analizat depusa pe o folie de aluminiu sau poliester acoperit cu aluminiu, sub influenta fragmentelor de fisiune generate de o sursa 252Cf plasata in spatele foliei respective. Particulele sub actiunea carora are loc ionizarea si desorbtia ionilor au energii foarte mari, aprox 100 MeV, fata de energiile de ordinul keV in cazul tehnicii FAB. Metoda se poate utiliza pt analiza unor compusi cu mase moleculare mai mari decat in cazul metodelor FAB. Moleculele de proteine fixate pe nitroceluloza se desorb fara fragmentare sau cu un grad mai redus de fragmentare decat in absenta acesteea.

III.2.2.3. Tipuri de analizoare utilizate n sistemul GC/MS

Ionii rezultai n sursa de ionizare trebuie mai nti separai n funcie de raportul m/z nainte ca acetia s ajung la detector. Aceast selecie este realizat cu ajutorul unui analizor de mas. Se cunosc mai multe tipuri de analizoare de mas care sunt utilizate frecvent n tandemul GC/MS, dintre care cele mai importante sunt: analizorul magnetic cu o singur focalizare, analizorul cu dubl focalizare, analizor tip quadrupol i analizor ion trap.In tabel sunt prezentate principalele tipuri de spectrometre de masa care difera ca principiu constructiv si functional intre ele.

53 Analizor Sectorial magnetic Quadrupol Triplu quadrupol Trapa de ioni TOF Q-TOF FTICR Pret + +++ ++ ++ ++ + Gabarit + +++ +++ +++ ++ ++ + Rezolutie ++ + + + ++ ++ +++ Domeniu de analiza ++ + ++ ++ +++ +++ ++

In ultimul timp s-au dezvoltat metode de analiza care folosesc doua sau mai multe spectrometre de diferite tipuri, inseriate intre ele, fie doua principii constructive diferite, incorporate in acelasi analizor si care opereaza consecutiv asupra ionilor formati, astfel incat performantele realizate sa fie cat mai bune. Separarea ionilor funcie de raportul m/z se realizez prin aciunea unui cmp electric i/sau magnetic. Puterea de rezolvare a spectrometrelor este o msur a abilitii acestor analizoare s fac distincie ntre dou fragmente ionice cu valorile raporturilor m/z foarte apropiate(rezoluia- relaia III.1). Spectrometrele de mas utilizate n tandemul GC/MS, sunt de dou tipuri : cu rezoluii medii ( R: 500-2.000) i cu rezoluii nalte (R: 10.000-75.000).

R=

M M

(III.1)

unde este diferena ntre masele corespunztore celor dou picuri adiacente, i

M este masa nominal corespunztoare primului pic.

Asupra ionilor pozitivi formai se exercit o for proporional cu sarcina lor i cu diferena de potenial dintre electrozi. Conform acestei dependene, putem scrie pentru un ion oarecare cu masa m:
F = e V = m v2 2 (III.2)

Din aceast relaie putem observa c ionii diferii care rezult n urma fragmentrilor vor avea energii cinetice egale. Posibilitatea variaiei n limite largi a

54

potenialului dintre electrozi permite reglarea cu precizie ridicat a vitezelor de ieire a ionilor din camera de ionizare. Analizorul de mas cu o singur focalizare (Figura III.5), este aezat ntre polii unui cmp magnetic Cmpul magnetic de intensitate H, este orientat perpendicular pe direcia de deplasare a ionilor i acioneaz asupra acestor cu o fora magnetodinamic centripet Fcp: Fcp = H z v (III.3) deteminnd curbarea traiectorie acestora. Acestei fore i se opune fora centrifug Fcf: Fcf = m v2 r (III.4)

unde r este raza de curbur a arcului de cerc descris de traiectoria particulei. Parametrii acestei traiectorii pot fi dedui prin egalarea celor dou fore: H zv = m v2 r (III.5) v= H zr m (III.6)

innd cont de relaia III.2 se obine: H 2 z2 r2 z V = 2m (III.7)

r=

2m V H2 z

(III.10)

m H 2 r2 = z 2V

(III.11)

Din realia III.11 se poate oserva c pentru anumite valori ale lui H i V, vor ajunge la fanta de ieire numai ionii cu un anumit raport m/z. Ionii cu m/z mai mari vor parcuge traiectorii cu raze mai mari, iar cei cu m/z mai mici vor parcurge traiectorii cu raze mai mici dect raza de curbur a aparatului, ciocnindu-se de pereii lui, ceea ce va determina descrcarea acestora. Prin varierea lui H sau a lui V se poate obine tot spectrul de mas. De obicei se variaz poteialul de accelerare V, care este fcut s scad continuu, ceea ce conduce la traversarea analizorului de ctre ioni cu mase din ce n ce mai mari. n acest mod cmpul magnetic, prin focalizarea ionilor pozitivi cu aceeai energie cinetic i clasific i difereniaz n fascicule dup raportul m/z.

55

Figura III.5 Schema unui analizor magnetic cu un singur fascicol

n general rezoluia unui spectrometru cu o singur focalizare este dat de relaia :

R= r s+w

(III.12)

unde: r este raza de curbur a tubului analizor ; s i w sunt diametrele fantelor de intrare i ieire din tubul analizor. Practic puterea de rezoluie a acestor spectrometre este mai mic dect 10000. Pentru decelarea defectelor de mas mici, n cazul unor fragmente grele, aceast rezoluie este insuficient. Spectrometrele cu o nalt rezoluie sunt cele cu dubl focalizare (Figura III.6), n care fascicolul de ioni de la surs, este mai nti focalizat printr-un analizor electrostatic, care micoreaz practic dispersia energiilor ionilor i apoi acetia sunt

56

focalizai ntr-un analizor magnetic, care realizeaz separarea ionilor n funcie de raportul m/z. Pentru ca dou fragmente cu m/z identice s ias exact n acelai timp din analizor, acestea trebuie s aib energii cinetice, respectiv viteze strict egale, la intrarea n tub. Datorit producerii ionizrii la distane diferite de sistemul de accelerare, precum i a vitezelor de translaie diferite ale moleculelor nainte de ionizare, energiile lor cinetice difer ntre anumite limite. Din acest motiv ionii cu acelai m/z nu vor focaliza exact n acelai punct, iar picurile oinute se vor li, conducnd n cazul a doi ioni de mase M i M+M la suprapunerea mai mult sau mai puin avansat a lor, n funcie de valoarea raportului M/M. ncepnd de la o anumit valoare a acestui raport cele dou semnale se vor suprapune complet.

57

Figura III.6. Schema de principiu a unui spectrometru de mas cu dubl focalizare de tip NilerJohnson

Pentru decelarea acestor ioni, ar trebui ca nainte ca ionii s ajung la analizorul de mas, acetia s fie separai n fascicule cu energii cinetice diferite. Aceasta se realizeaz prin trecerea fascicolului de ioni, dup accelerare, printr-un cmp electrostatic produs de armturile curbe ale unui condensator (Figura III.6). Raza de curbur a fascicolului de ioni n cmpul electrostatic este: rc = 2 V U (III.13)

unde U este tensiunea dintre plcile condensatorului i V este potenialul de accelerare al ionilor. Se poate observa c n realia III.13 nu apare masa ionului, deci rezult c traiectoria unui ion , pentru un U dat, depinde numai de V i prin

58

urmare numai de energia eV a ionului respectiv. n acest mod cmpul electrostatic, denumit i analizor electrostatic, clasific ionii numai funcie de energia lor. Variind potenialul de accelerare, vor ajunge la fanta de intrare n analizorul magnetic numai ionii ce posed aceeai energie (prima focalizare). Analizorul magnetic va separa n continuare aceti ioni funcie de masa m/z (a doua focalizare). Spectrometrele cu dubl focalizarea au o rezoluie de cca 70.000. Un alt tip de spectrometru de mas foarte rspndit n tehnic GC/MS, este spectrometrul cu timp de zbor sau spectrometrul impuls (Figura III.7).

Figura III.7. Schema unui spectrometru cu timp de zbor

Prin iradierea intermitent i instantanee (~ 2s) a probei cu un fascicol de electroni, se formeaz pulsuri de ioni cu aceeai energie cinetic. Aceti ioni zboar printr-un tub rectiliniu vidat, de o anumit lungime (cca. 1m). Timpul de zbor din punctul de pornire pn la colector este dat de expresia: tz = s v (III.14)

unde: s este spaiul de zbor i v viteza.innd cont de relaia III.3 obinem:

59

tz = s

m 2 zV

(III.15)

Meninnd constante s i V pe tot parcursul efecturii spectrului, tz se poate scrie ca fiind:

tz = K m z

(III.16)

unde K = s

1 2V

Timpul de zbor fiind proporional cu m/z, vor ajunge primii la detector, ionii care au masa cea mai mic. Puterea de rezoluie a acestor aparate este de cca. 1500. Viteza mare de efectuare a spectrului genereaz condiii optime de cuplare cu cromatografele de gaze. n ultimul timp linia tehnologic de producere a aparatelor de tip GC/MS sa concentrat n utilizarea ca detectori pentru spectrometrul de mas, a unor sisteme mai compacte i mai exigente privind scanarea i decelarea fragmentelor ionice ale probei ionizate, i anume analizorul quadrupol i analizorul ion trap. Analizorul quadrupol (Figura III.8) funcioneaz ca un filtru de mas, avnd un principiu de funcionare complet diferit fa de analizoarele magnetice. Acest tip de analizor, are avantajul unui timp de scanare foarte mic (mai mic de 100 ms), ceea ce l face foarte util pentru tandemul GC/MS, permind scanarea timpilor reali ai picurilor cromatografice. Este similar cu monocromatoarele utilizate n spectrometria optic, deoarece permite transmiterea la detector numai a ionilor cu m/z foarte aproiate, n timp ce ceilali ioni sunt neutralizai i transportai n alt direcie, ca molecule neutre.

60

Figura III.8. Schema unui detector tip quadrupol.

Prin variaia curentului electric ce trece prin analizor este posibil transmiterea unui pachet de ioni cu m/z variabile, astfel putndu-se realiza spectrul de mas prin scanare. Analizorul este alctuit din patru electrozi cilindrici conectai i dispui paralel, ntr-o arie circular sau hiperbolic (cazul ideal), conectai la o surs de radio frecve (RF) i curent continuu (CC). Electrozii opui au aceei polaritate. Micarea ionilor n interiorul acestor electrozi poate fi descris cu ajutorul unei ecuaii difereniale de ordinul II (realaia III.17). d 2x 2 z (U + V0 cos t )x = 0 (III.17) 2 dt m r2 unde termenul V0 cos t caracterizeaz sursa de radiofrecven i U este curentul de la surs. Aceast ecuaie este un exemplu tipic de ecuaie tip Mathieu, pentru care forma general este:

61

d 2x (a x + 2 q cos 2 )x = 0 d 2

(III.18)

unde este o funcie de timp (t/z).Aceast ecuaie are urmtorele soluii: a = 8 zeU mr 2 2 (III.19)

q = 4 zeV mr 2 2 (III.20) cu precizarea c 2r reprezint spaiul dintre electrozilor. Parametrii a i q sunt folosii mai ales n partea de construcie, n aa fel nct s se stabileasc i s se definesc exact spaiul n care ionii au o traiectorie stabil. Relaia dintre cei doi parametrii i raportul m/z se poate vedea printr-o reprezentare grafic ntr-un sistem de coordonate a i q (Figura III.9). Masele din interiorul ariei haurate sunt transmise la detector iar masele din afara acestei regiuni sunt pierdute, fie prin cderea lor direct pe electrozii quadrupolului , fie trecnd printre acetia.

62 Figura III.9. Diagrama stabilitii pentru analizorul quadupol i ion trap

n interiorul acestei regiuni, valorile m/z cresc odat cu scderea lui a iar la a =0 (n acest caz opereaz doar sistemul de radio frecven) sunt transmise toate masele. Maximul diagramei (punctul X), este caracterizat prin ndeplinirea condiiei de rezoluie maxim, deoarecece n aceste condiii sunt transmise doar cteva mase. Dac s-ar lucra n condiiile date de acest maxim, ar trebui s se aleag practic ntre transmiterea tuturor ionilor i ntre o rezoluie nalt. n cazul analizorului quadrupol puterea de rezolvare este o simpl multiplicarea a masei (de obicei 2m), astfel c acest analizor este n esen un dispozitiv cu rezoluie medie. Linia de scanare (AB), reprezint intervalul n care variind U i V n aa fel nct raportul acestora s rmn constant, ionii ajuni n spaiul quadrupolului au o traiectorie stabilizat i direcionat spre detector. Analizoarele tip quadrupol, pot separa i mase peste 3000-4000 m/z. Aceste instrumente separ ionii ca diferene de mas printr-o unitate. Progresele n tehnologia ion trap au revoluionat tehnica i aparatura n sistemele integrale de tipul CG/MS. n mecanismul ion trap (Figura III.10) anionii i cationii n faz gazoas pot fi formai i meninui pentru un inteval de timp, cu ajutorul unui cmp electric i /sau magnetic. n ultimul timp au fost realizate mai multe tipuri de astfel de analizoare, dar dintre toate doar dou sunt curent utilizate n spectrometrele de mas. Dintre acestea ca detector n tehnica cuplat GC/MS se folosete analizorul ion trap simplu. Practic analizorul ion trap este un analizor quadrupol n dou dimensiuni. De altfel principiul de funcionare poate fi explicat tot cu ajutorul relaiei III.18, cu referire la parametrii a i q ce caracterizeaz diagrama de stabilitate (Figura III.9). Acest tip de analizor const din cte dou perechi de electrozi de forme diferite i roluri diferite (doi electozi circulari i doi electrozi end-cap). Ionii sunt formai n interiorul capcanei prin pulsuri electronice generate de un filament, i sunt

63

Figura III.10. Shema unui analizor ion trap

reinui n aceast regiune stabil (n lungul liniei a=0). Spectrul de mas este obinut prin generarea condiiei de instabilitate, prin creterea potenialului V, fiecrui ion, peste valoarea de stabilitate (q = 0,91- linia de scanare AC). Astfel, ionii sunt eliminai secvenial prin unul din electrozii end-cap direct spre detector. Aceasta este n contrast cu modul de operare al quadrupolului, unde ionii dup ce urmeaz traiectorii stabile sunt detectai. Prezena unui gaz purttor la o presiune de cca 10-3 torri, ajut la meninerea unei rezoluii adecvate (He, folosit drept faz mobil pentru cromatografia de gaze capilar este foarte bun n acest scop) n trap este posibil i producerea reaciilor de ionizare chimic3. Astfel, reactivul gazos de ionizare chimic este introdus la o presiune relativ joas i plasma format poata fi inut n trap pentru o perioad mai mare de timp.

64

III.2.2.4. Detectorii de ioni.

Cei mai utilizai detectori n spectrometrul de mas se bazeaz n general pe fenomenul de multiplicare electronic (Figura III.11).

Figura III.11. a) detector cu ir discret de diode b) detector cu diod continu

65

Acestea pot fi constituite fie dintr-un ir discret de diode, fie din diode continue. Ambele tipuri utilizeaz emisia de electroni secundari pentru amplificarea semnalului dat de ioni. O serie de diode pe baza unor alije de Be-Cu (n mod obinuit 12-20) sunt aranjate aa cum este prezentat n figura III.11. Fascicolul de ioni ajunge pe prima diod din aceast serie discret, i produce electroni secundari, care sunt accelerai ctre urmtoarea diod producndu-se astfel o cascad de electroni secundari,care sporesc cu mult semnalul ionic iniial. Diodele sunt meninute la un potenial pozitiv prin intermediul unei reele de rezistori. Curentul obinut este apoi convertit i trimis la un amplificator. Amplificatorul este de asemenea constituit dintr-un sistem de diode, fiecare dnd natere uneii emisii de electroni (multiplicatori electronici). Dup amplificare, curentul obinut este trimis la un sistem de procesare i conversie, urmnd ca apoi s se nregistreze spectrul propriu-zis. Vizualizarea spectrului rezultat se poate face fie prin intermediul unui nregistrator, fie cu ajutorul ecranului unui calculator.
IIII.2.2.5. Tipuri de interfee pentru sistemul GC/MS

Partea cea mai important pentru aceste categorii de sisteme este interfaa care realizeaz legtura dintre cele dou instrumente. Problemele care apar n interpunerea coloanei cromatografice la spectrometrul de mas sunt legate de diferenele de curgere ale gazelor purttoare din cele dou instrumente i de necesitatea obienrii unor informaii despre probe n afar interferenelor date de faza mobil n care aceasta este diluat. Sistem integral GC/MS este unul din cei mai favorizai n aceast privin, deoarece, de multe ori faza mobil (comun n multe cazuri) nu nflueneaz observarea spectrelor, i existena probei n faz gazoas, este compatibil cu varietatea tehnicilor de ionizare utilizate n spectrometria de mas. Prima incompatibilitate n acest caz este diferena de presiune la care lucreaz cele dou instrumente. Astfel, introducerea probei n coloana

66

cromatografic se face la presiunea atmosferic iar sursele de ionizare din spectrometru opereaz de regul n intervalul 2-10-5 torri, pentru ionizarea chimic i respectiv, electronic. De aceea interfaa trebuie s fie capabil s realizeze o scdere adecvat a presiunii ntre cele dou instrumente i de asemenea s sporeasc trecerea probei meninut n faz mobil n raport cu presiunea de operare a sursei de ionizare. Interfaa ar trebui s nu permit introducerea unui volum suplimentar de gaz purttor de la coloana cromatografic i n acelai timp s nu degradeze sau s modifice chimic constituienii probei. Spectrometrele de mas moderne cu sistem de vacuum diferenial, permit utilizarea unor coloane n care vitezele de curgere spre sursele de ioni variaz ntre 1-2 mL/min. Aceste viteze de curgere sunt compatibile cu cele corespunztore coloanelor tubulare deschise din cromatografia de gaze, dar sunt mai mici dect vitezele tipice ale coloanelor tip pachet. Au fost realizate mai multe tipuri de interfee care ndeplinesc destul de bine condiiile mai sus menionate. Utilizarea acestora n sistemul GC/MS depinde n mare msur de circumstanele experimentale. Coloanele care asigur debite de 1-2 mL /min, spre sursa de ioni sunt compatibile cu sistemele de vacuum ale spectrometrelor de mas moderne. Acestea sunt, de asemenea, debite optime pentru coloanele capilare deschise de tip tubular, de dimensiuni convenionale i de aceea cuplarea unor asemenea coloane la un spectrometru de mas prezint foarte puine probleme. Datorit flexibilitii, ineriei chimice i rezistenei crescute, coloanele din silice topit cu faz imobilizat, adeseori sunt cuplate direct la sursa de ioni prin intermediul unui dispozitiv foarte simplu de cuplare la vid i unui suport pentru susinerea coloanei. Acest dispozitiv permite ajustarea poziiei coloanei fa de sursa de ioni pentru obinerea unei ionizari eficiente. Proba este transferat cantitativ la sursa de ionizare, dar performaa coloanei capilare poate fi compromis de cderea de presiune, timpii de reinerea ai componenilor variind cu modificarea presiunii sursei. O alt modalitate de realizare a cuplrii ntre cele dou instrumente se bazeaz pe un reductor al debitului la intrarea n spectrometrul de mas i a unei

67

valve speciale care acioneaz ca un divizor de debite. Aceast interfa este mult mai viabil dect cea descris anterior deoarece poate opera cu o varietate de viteze de curgere, permind schimbarea coloanelor cu uurin i sunt prevzute cu o cale secundar de ndeprtare a unor volume mari de solveni sau reactivi corozivi din spectrometrul de mas. Dezavantajele acestor interfee sunt date de posibilitatea introducerii unui volum suplimentar de gaz purttor precum i de posibilitatea degradrii compuilor termic instabili, pe suprafeele metalice fierbini ale valvelor. De cele mai multe ori este preferabil utilizarea unor sisteme de cuplare de tip open split n locul interfeelor de tip valv. Interfaa de tip open split n esen const dintr-un tub cu volum suplimentar mic, interpus ntre coloana capilar sau reductorul capilar i spectrometrul de mas, formnd practic o fant de trecere ntre cele dou instrumente. n unele cazuri reductorul capilar pentru spectrometru, are un diametru foarte apropiat cu cel al diametrului interior al coloanei cromatografice astfel c este posibil cuplarea direct a celor dou capilare printr-o simpl etaneizare. Acest fapt face posibil o minimalizare a proceselor de adsorbie la interfa i nltur fenomenul de diluie realizat de eluentul coloanei n reductorul capilar al spectrometrului. Acest tip de cuplare permite meninerea unei viteze de curgere constant a gazului purttor de la coloan cromatografic, independent de viteza de curgere prin aceasta. n aceste condiii, cantitatea de prob care intr n spectrometru depinde de raportul dintre viteza de admisie n sursa de ionizare, (care este fixat n functie de capacitatea de admisie a capilarei cromatografice, de conductana sursei, de temperatur i de gazul purttor) i viteza de curgere n coloana cromatografic, a eluentului. ntreaga cantitate de prob este transferat n spectrometrul de mas doar dac viteza de curgere la ieirea din coloana cromatografic este egal cu viteza de curgere la intrarea n reductorul capilar al spectrometrului. Dac viteza de curgere din coloan este mai mare dect la intrarea n sursa de ionizare, o parte din prob este pierdut la interfa i nu mai ajunge n spectrometru. Dac viteza de curgere este mai mic, apare fenomenul de diluie prin creterea cantitii de gaz intrat in spectrometru, iar masa de prob ajuns la sursa de ionizare este mult mai redus.

68

Interfaa poate opera ca o fant conectat la un detector secundar. Un alt avantaj al interfeei de tip open split este dat de faptul c, ntotdeauna captul coloanei se afl la presiune atmosferic ceea ce face ca timpii de reinere s fie reprobuctibili. Aceste tipuri de interfee au o fiabilitate mare, permind utilizarea mai multor tipuri de coloane i diferite viteze de curgere. Coloanele pot fi uor schimbate fr a afecta parametrii de funcionare ai spectrometrelor de mas. Cantitatea de prob care rmne la interfa este constan indiferent de programul de temperatur folosit pentru separare, dac viteza de curgere a gazului purttor este foarte atent controlat prin intermediul unui flow controler, i dac interfaa este nclzit cu aceeai vitez ca i coloana cromatografic (interfa se gsete n termostatul cromatografului de gaze). Practic interfaa trebuie s aib un rol de separator molecular. Performaele separatorilor moleculari sunt date de eficiena (Y) i capacitatea de separare (N) a acestora. Eficiena este definit ca raportul dintre cantitatea de prob intrat n spectrometru i cea intrat n coloan (n procente), i reprezint capacitatea acestora de a permite trecerea probei n interiorul sursei de ionizare a spectrometrului. Factorul de separare (N) este definit ca raportul dintre concentraia probei n faza mobil la intrare n spectrometru, i concentraia probei n faza mobil la intrare n coloana de separare. Factorul de separare variaz n raport cu tipul de separator folosit, cu viteza de trecere a fazei mobile prin coloana cromatografic i depinde de eficiena sistemului de vacuum a sursei de ionizare i de masa molecular a probei. ntre cei doi factori ce caracterizeaz performaa unui separator molecular, exist relaia : N = (Y 100)(VGC VMS ) volumul gazului purttor la intrarea n spectrometru. Cei mai obinuii separatori moleculari utilizai n acest sistem integral sunt separatorul prin efuzie (Watson-Biemann), separatorul tip jet i separatori cu membrane(Figura III.12). (III. 21)

unde VGC este volumul fazei mobile care intr n coloana cromatografic i VMS

69

Figura III.12 Tipuri de interfee utilizate n sistemele integrale GC/MS. A) Separator prin efuzie; B) Separator tip jet; C) Separator membran.

Separatorul Watson-Biemann, const dintr-un tub de sticl sinterizat cu o porozitate ultrafin, introdus ntr-o incint vidat i termostatat. Tubul este prevzut cu capilare din sticl la ambele capete prin intermediul crora se realizeaz reducia debitului de gaz purttor. Presiunea din interiorul incintei este

70

de civa torri i debitul la care proba efuzeaz prin porii fritei este invers proporional cu masa molecular la 1/2 i proporional cu presiunea parial a fiecrui component din prob.Variind viteza de curgere a gazului purttor prin acest tub, se poate realiza o separare a probei din faza mobil, prob care ajunge apoi la spectrometrul de mas. Separarea n acest caz este influenat att de temperatur ct i de debit, optimizarea acestor parametri fcndu-se empiric. Separatorul tip jet este foarte mult utilizat n cazul separatorilor cu pachet de coloane. Efluentul de care vine de la cromatograf este obturat prin intermediul unui orificiu foarte fin, cnd practic el expandeaz n interiorul unei camere vidate nclzite. n timpul acestui proces de expandare, moleculele gazului purttor difuzeaz rapid, departe de centrul jetului supersonic, separndu-se de moleculele mai grele ale probei. Poziia i diametrul acestui orificiu, precum i spaiul relativ de expansiune al jetului sunt deosebit de importante pentru o separare corespunztoare. Normal acest separator este realizat ntr-o manier care permite obinerea un maxim de separare doar pentru debite apropiate ale gazului purttor, n ambele instrumente. Seperatorul cu membran siliconic funcioneaz pe principiul permeabilitii difereniate, dintre moleculele solutului organic i a gazului purttor. Cantitatea de prob transmis prin membran este direct proporional cu solubilitatea i difuzia solutului prin membran, cu aria membranei, cu presiunea de la suprafaa membranei i invers proporional cu grosimea membranei. Trecerea moleculelor organice prin memebran, poate fi cu dou ordine de mrime mai mare dect a moleculelor gazului purttor. Suprafaa membranei care vine n contact direct cu eluentul gaz cromatografic, este expus la o presiune ridicat. Pentru a nu periclita rezoluia coloanei cromatografice nainte de a ajunge la membran, eluentul este mai nti introdus ntr-o camer mic care vine n contact direct cu membrana. Rolul acestei caviti este de a minimaliza presiunea la suprafaa membranei. Suprafaa membranei, grosimea i timpul de contact sunt parametrii critici ai acestor membrane iar temperatura reprezint un parametru operaional deosebit de

71

important. O separare eficient se obine la o temperatur relativ joas a separatorului, nsoit totodat i de meninerea integritii coloanei de separare. Pn n prezent nu s-a gsit un separator ideal pentru toate situaiile. Aa cum se poate vedea i n tabelul III.3, la prima vedere separatoarele tip membran pot fi considerate ca fiind foarte utile. Acestea sunt caracterizate printr-un factor de separare destul de mare i totodat permit coloanelor s funcioneze separat de spectrometru de mas, astfel c ambele instrumente pot fi optimizate individual.
Tabelul III.3 Performanele separatorilor moleculari Proprieti specifice Efuzie (Waston-Bieman) Eficiena (%) 20-30 Factorul de separare 4-7 Viteza de curgere a gazului 10-30 purttor (mL/min) Temperatura. 350 (limita superioar 0C)

Jet 30-70 6-14 15-25 300

Membran 30-80 10-30 1-60 255

Din pcate, perfomanele acestor membrane sunt critic influenate de temperatur. Acestea au o temperatur optim de transmisie pentru fiecare compus organic prin seciunea lor. La o temperatur mai sczut dect temperatura optim poate apare condiia de distorsionare a picurilor cromatografice iar operarea la o temperatur relativ joas exclude practic analiza compuilor cu o volatilitate sczut. Separatoarele tip jet i prin efuzie, necesit un echipament auxiliar de vacuum i sunt eficiente doar pentru viteze de curgere apropiate pentru ambele instrumente.
IIII.2.2.6. Puterea de rezolutie a spectrometrelor de masa

Rezolutia in spectrometria de masa se refera la posibilitatea de a distinge ionii cu mase apropiate, respectiv un ion cu masa m, fata de unul cu masa m+m. Spectrometrele de masa cu rezolutii bune permit separarea semnalelor cu mase foarte apropiate.

72

Exista mai multe posibilitati de caracterizare a rezolutiei unui spectrometru de masa, cea mai des intalnita fiind ca raport m/m, unde m este masa ionului al carui semnal il consideram si m diferenta de masa, respectiv distanta fata de un semnal vecin de aceeasi intensitate cu care se intrepatrunde, astfel incat minimul curbei se situeaza la 10% din inaltimea celor doua semnale.

In figura de mai sus m = 900 si m = 0,208, ceea ce determina o rezolutie m/m = 4327. Rezolutia se mai poate exprima si in functie de un singur semnal, respectiv largimea acestuia la 5% sau 50% din intensitate, iar in cazul instrumentelor TOF si a celor cu trapa de ioni se ia in calcul largimea semnalului la jumatate din intensitatea maxima. In functie de rezolutie, spectrometrele pot fi: -cu rezolutie scazuta (m/m~ 200); - cu rezolutie medie (m/m= 500-5000); - cu rezolutie inalta (m/m >10000) permit determinarea masei moleculare exacte.

73

Pentru a separa doua molecule cu masele de 400 si 401, este nevoie de un aparat cu rezolutia de m/m = 400/1 = 400. Pentru a separa semnalele O2 (M = 31,9898) si S (M = 31,9721): m = 0,0177, deci necesita un aparat cu o rezolutie m/m = 31,9898/0,0177 = 1806. Pentru a separa semnalele C8H13N (M= 123,094799) si C7H11N2 (M= 123,092223): m = 0,002576, deci este necesar un aparat cu o rezolutie m/m = 123,094799/0,002576 = 47748.

III.3. Monitorizarea datelor n spectrometria de mas

Cele mai moderne spectrometre de mas cu sistem de introduce a probelor tip coloan cromatografic sunt prevzute cu calculatoare de mare putere sau microprocesoare. Acestea sunt alctuite din: sistemul de achiziie a datelor i instrumentul de control; procesorul de date care permite realizarea: substragerii automate a backgroundului, normalizarea parametrilor, formatarea, calibrarea, tiprirea i afiarea precum i identificarea spectrelor de mas cu ajutorul metodei de cutare n banca de date din memoria calculatorului. Componentele tipice ale unui spectrometru de mas /sistem de date sunt prezentate n figura III.3.1. Convertizorul digital analog (ADC) are rolul de a transforma semnalul primit de la amplificatorul spectrometrului ntr-un ir de semnale digitale discrete, compatibile cu procesorul calculatorului (conversia maselor i intensitilor). Aceste semnale sunt apoi sortate pentru editarea i vizualizarea rspunsului, prin intermediul unui monitor, n timpul achiziionrii datelor, asfel c procesele pe care le sufer proba pot fi uor urmrite chiar n timpul analizei. De asemenea rspunsul poate fi tiprit prin intermediul unei imprimante, n diferite variante (spectrul de mas, mass-cromatogram, tabel de date cu masele fragmentelor i intensitatea curentului ionic total).

74

Figura III.3.1. Diagrama bloc a unui sistem GC/MS

Un astfel de sistem integral GC/MS, ntr-o singur operaie poate genera cteva sute de spectre de mas, cu acces consecvent i rapid la placa de baz, n vederea nregistrrii spectrelor de mas pentru procesri secveniale. Multe din sistemele de date nu sunt doar simple uniti funcionale, pasive la informaiile achiziionate Aceste sisteme sunt prevzute i cu o unitate de control care opereaz n regim invers cu sistemul analog digital de conversie (DAC) fcnd practic posibil trecerea instruciunilor de la calculator la spectrometrul de mas. Viteza de scanare, intervalul de mas studiat, rezoluia, programul de temperatur pentru coloana cromatografic, modul de ionizare, viteza de curgere a gazului inert sunt doar civa din parametrii operaionali care pot fi selectai i optimizai prin intermediul keyboardului calculatorului.

III.4. Interpretarea spectrului de masa

Un spectru de masa este o interpretare grafica a ionilor detectati de spectrometrul de masa. Spectrul apare sub forma unui grafic in axele de coordonate

75

x,y, unde pe axa x este redat raportu masa/sarcina (m/z) iar pe axa y intensitatea generata de ion. Odata inregistrat, spectrul de masa se analizeaza dupa anumite reguli, furnizind informatii importante cu privire la structura substantei analizate. In prima instanta se determina abundentele relative ale semnalelor prin masurarea inaltimilor lor, se identifica ionul molecular (acolo unde exista), picul de baza si principalele fragmente. Picul de baza este semnalul cel mai intens si i se atribuie conventional valoarea 100%. El da indicatii asupra principalei reactii de fragmentare din molecula. Intensitatile celorlalte semnale se exprima in procente fata de picul de baza. De obicei, ultimul semnal important este ionul molecular (M), care ne da masa moleculara a substantei. Intotdeauna, dincolo de M, apar semnale si la M+1, M+2, si in unele cazuri si M+4, M+6, etc. Aceste semnale isi au originea in prezenta izotopilor mai grei in structura compusilor respectivi. Intensitatea acestor semnale se considera in raport cu intensitatea lui M, care de aceasta data se considera ca are valoarea 100. Nu se vor omite o serie de semnale mici sau mijlocii care sunt caracteristice unor fragmente deosebit de importante pentru interpretarea spectrului (fragmente cheie). Nu se omit de asemenea picurile furnizate de ionii metastabili si ionii dublu incarcati. Regla azotului: o molecula a carei masa moleculara este un numar par trebuie sa contina un numar par (sau nul) de atomi de azot; o masa moleculara impara dovedeste ca in molecula avem un numar impar de atomi de azot. In figura III.4.1. este prezentat spectrul de masa al acetofenonei, ca exemplu reprezentativ. Se observa ca ionul molecular apare in spectru la m/z 120, avind o intensitate mare (37%). Picul de baza (100%) apare la m/z 105 si se datoreste unei fragmentari alfa la nivelul gruparii functionale carbonil. Acelasi tip de fragmentare, dar in partea opusa a gruparii carbonil, explica si picul da la 77 (86%). Ionii cu intensitate mai mica de la m/z 51, 43 si 39 se datoresc fragmentarii nucleului aromatic.

76
O CH3 m/z 120 105 77 Int. 37 100 86

Figura III.4.1. Spectrul de masa al acetofenonei

Se observa ca ionul molecular apare in spectru la m/z 120, avind o intensitate mare (37%). Picul de baza (100%) apare la m/z 105 si se datoreste unei fragmentari alfa la nivelul gruparii functionale carbonil, cind se genereaza un ion benzoil. Acesta din urma elimina o molecula neutra ce CO si genereaza picul intens de la m/z 77 (86%). Acest din urma pic se poate explica si printr-o fragmentari alfa tot la nivelul gruparii carbonil, dar in partea opusa fragmentarii anterioare (care explica si explica si picul da la mz 43). Ionii cu intensitate mai mica de la m/z 51 si 39 se datoresc fragmentarii nucleului aromatic, figura III.4.2.
O CH3 m/z= 120 - CH3 O + - CO m/z= 105 m/z= 77

- H3C C O m/z= 43

Figura III.4.2. Schema reactiei de fragmentare a acetofenonei

77

Tipuri de ioni 1. Ioni metastabili

In functie de propria energie, un ion cu masa m1 format in camera de ionizare poate sa se comporte in urmatoarele moduri: a) ajunge la detector fara a suferi procese de fragmentare si este detectat ca ionradical cu masa m1; b) sufera un proces de fragmentare in interiorul camerei de ionizare, cu formarea unui ion m2, care va fi detectat ca atare; c) sufera procesul de fragmentare dar dupa accelerare si inainte de detectare. Astfel de ioni se numesc ioni metastabili, ca urmare a comportamentului lor din punct de vedere a stabilitatii, intermediar intre ionii de tip a) si b). Ionii metastabili determina aparitia in spectru a unor semnale metastabile, corespunzatoare unei mase m* data de expresia: m* = (m2)2/m1 unde: m1 masa ionului initial; m2 masa ionului nou format. Ionii metastabili dau de obicei semnale de mica intensitate si semnalu este largit, ceea ce-i face usor de recunoscut in spectru si dau informatii cu privire la modul de fragmentare a unui compus, fig. III.4.3.

Figura III.4.3. Semnalele datorate unor ioni metastabili (*) in spectru EI-MS.

78

Din valorile lui m*, tinand cont si de celelalte picuri existente in spectru, se pot determina valorile lui m1 si m2. Beynon a intocmit tabele cuprinzand toate perechile de m1 si m2 care corespund aceleeasi m*, pentru valori cuprinse intre 1 si 500.
2. Ioni cu sarcina multipla

Atunci cand energia furnizata de fascicolul de electroni este suficient de mare, compusii cu electroni sau p pot furniza ioni cu mai multe sarcini pozitive. M + e- Mn+ + (n+1) e- , n3 Cei mai importanti ioni sunt cei dublu incarcati, acestia putand fi recunoscuti astfel: - cei cu mase impare vor furniza semnale la mase fractionare; - cei cu mase pare vor furniza semnale datorate izotopului 13C la 0,5 unitati de masa mai sus decat valoarea masei lor (exista un raport bine stabilit si intre intensitatile celor doua semnale).
Picuri izotopice

Aceste semnale isi au originea in prezenta izotopilor mai grei in structura compusilor respectivi. Izotopii vor intra in componenta moleculelor in aceeasi proportie in care sunt raspanditi in natura. In tabelul de mai jos sunt prezentate abundentele relative ale elementelor ce intra in structura compusilor organici.

79

Elementele care contribuie semnificativ la aparitia semnalelor M+1 sunt izotopii

2

H,

13

C,

15

N si

33

S, iar pentru semnalele M+2 sunt izotopii

18

O,

34

S,

37

Cl si

81

Br.

Cum izotopii hidrogenului sunt in foarte mica proportie raspanditi in natura, se poate neglija influenta pe care o au asupra spectrelor de masa. In general pentru o molecula cu n atomi de carbon, abundentele relative ale semanlelor M+1 si M+2, pot fi calculate prin rezolvarea binomului (a+b)n, Unde: a abundenta izotopului 12C b abundenta izotopului 13C Facand calcule pentru n=3 si impartind prin 10000 pentru ca suma lor totala sa fie 100, obtinem: Ioni Intensitati relative Numarul atomilor de 13C Cu cit numarul de atomi de carbon (si de azot) din molecula este mai mare, cu atit abundenta maximului M+1 este mai mare, vezi tabelul de mai sus. 0 1 2 3 M 96,712 M+1 3,25 M+2 0,0364 M+3 0,136 x 10-3

80

Asa dupa cum am mai spus, elementele care contribuie semnificativ la aparitia semnalelor M+2 sunt izotopii
18

O,

34

S,

37

Cl si

81

Br. Un compus care

contine clor va contine un maxim M+2 cu o intensitate de aproximativ o treime din intensitatea ionului molecular M ( comform abundentei izotopilor 35Cl si 37Cl), iar o substanta cu brom un maxim M+2 cu o intensitate aproape egala cu intensitatea ionului molecular M (abundenta izotopilor 79Br si 81Br este aproape egala). In ceea ce priveste semnalele de la masele M+4, M+6, etc, acestea se datoreaza prezentei mai multor atomi de S, Cl sau Br si sunt prezentate in tabel in precente % fata de intensitatea ionului molecular. Halogen prezent Br Br2 Br3 Cl Cl2 Cl3 BrCl Br2Cl BrCl2 100 100 100 100 100 100 100 100 100 97,7 195,0 293,0 32,6 65,3 99,8 130 228 163 95,5 186,0 10,6 31,9 31,9 159 74,4 93,4 3,47 31,2 10,4 M% M+2 M+4 M+6

Tinind cont de datele de mai sus pentru picuri izotopice si utilizind tabelele lui Beynon pentru formule moleculare posibile, se poate determina formula moleculara probabila pentru un compus. Beynon a calculate valorile lui M+1 si M+2 pentru compusi continand in molecula C, O, H, N si cu mase mergand pana la 250. Calculele au fost facute atat pentru formule cu o anume semnificatie, cat si pentru formule care nu au o semnificatie rationala. In tabelul de mai jos sunt citeva exemple.

81

82

IV. REGULI GENERALE DE FRAGMENTARE IN SPECTROMETRIA DE MASA

IV. 1. Introducere IV.2. Reactii de fragmentare IV.2.1. Fragmentari simple IV.2.2. Fragmentari insotite de transpozitia unui atom de hidrogen IV.2.3. Fragmentari complexe IV.2.4. Fragmentari insotite de transpozitia a doi atomi de hidrogen IV.2.5. Fragmentari insotite de transpozitii de schelet IV.2.6. Ioni importanti rezultati in urma reactiilor de fragmentare

83

IV. REGULI GENERALE DE FRAGMENTARE IN SPECTROMETRIA DE MASA

IV. I. Introducere
Ionii moleculari se pot fragmenta in diferite moduri, viteza fragmentarii fiind in functie de structura acestora, si de taria legaturilor prezente, acestea nescindandu-se cu aceeasi usurinta. Fie E energia de ionizare si E +E energia de fragmentare: - daca E +E >> E , ionul molecular este stabil si furnizeaza un semnal important in spectrul de masa. - daca E +E ~ E, ionul molecular odata format se va scinda foarte repede, furnizand diferite fragmente. Prima alternativa o intalnim in cazul compusilor care se pot stabiliza prin delocalizarea sarcinii pozitive, iar cea de-a doua, in cazul compusilor la care sarcina pozitiva este greu de stabilizat. Numarul si abundentele diferitelor fragmente ionice ce apar in spectrul de masa depind de: - instabilitatile relative ale legaturilor din ionul molecular (taria relativa) - stabilitatile relative ale fragmentelor ionice ce se formeaza - stabilitatea unor fragmente neutre care se elimina din ioni - probabilitatea tranzitiilor care decurg printr-un proces ciclic de rearanjare, implicand deplasari de legaturi si transferuri de atomi de hidrogen - probabilitatea formarii ionilor de coliziune Exista o asemanare intre procesele care se produc in spectrometrul de masa si descompunerea termica a compusilor organici. Cateva reguli generale care permit sa se intrevada modul in care se vor fragmenta compusii organici au fost enuntate tinand cont de efectele inductive, electromere, de polarizabilitate cunoscute din chimia organica.

84

Se va nota cu

-deplasarea unui singur electron -deplasarea a doi electroni

1. Intensitatea relativa a semnalului furnizat de ionul molecular este maxima la compusii liniari si scade proportional cu cresterea gradului de ramificare, fragmentarile producandu-se mai usor si preferential la atomii de carbon cei mai substituiti. Aceasta este in concordanta cu seria stabilitatii carbocationilor: Cp < Cs < Ct; 2. Dintre mai multi substituenti legati de acelasi atom de carbon, se fragmenteaza preponderent cel cu masa mai mare; 3. Intr-o serie omoloaga, intensitatea relativa a semnalului ionului molecular scade odata cu cresterea masei moleculare. Probabilitatea de a avea loc o fragmentare creste odata cu cresterea numarului de legaturi; 4. Legaturile multiple, ciclurile aromatice, cele heteroaromatice, chiar si heteroatomii, stabilizeaza ionii moleculari, facand ca acestia sa aiba intensitati mai mari. Aceasta se explica prin aceea ca este mai usor de smuls un electron sau p, decat unul , iar sarcina se localizeaza mai puternic in prezenta electronilor sau p;
n> > n: H3C OH - eH3C OH

- e-

H3C CH2 CH3

- e-

H3C CH2 CH3

Figura 4.1. Exemplificari ale locului unde are loc initial ionizarea

5. Dublele legaturi, chiar si triplele legaturi favorizeaza fragmentari ce conduc la cationi de tip alilic stabilizati prin conjugare:

85

R1 H2C

CH2 CH CH2

CH2 CH CH2 cation "alilic"

H2C HC H2C + R1 H2C

6. Ciclurile benzenice si in general cele aromatice favorizeaza fragmentari care conduc la cationi de tip tropilic:
CH2 R -R CH2 CH2 cation "tropilic"

7. Combinatiile ce contin heteroatomi se fragmenteaza preferential in pozitia fata de legatura C=X, furnizand ioni stabilizati prin conjugare, de tip oniu, exemplu la cetone:
R1 H2C C O R R1 H2C + O C R fragment "oniu"

8. Reactiile de fragmentare sunt adesea insotite de eliminarea unor molecule neutre cu masa moleculara mica, cum ar fi oxid si dioxid de carbon, olefine, acetilena, H2O, NH3, SH2, HCN, mercaptani, CH2=O, alcooli. Aceste molecule sunt recunoscute in mod indirect prin prezenta fragmentelor ionice care se obtin din ionul molecular, avind valori caracteristice:

(M - 15) M (M - 17) (M - 18) (M - 28)

+ CH3 + NH3 + H2O + CO

IV.2. REACTII DE FRAGMENTARE

86

Marea diversitate a reactiilor de fragmentare a ionilor pozitivi, consecinta directa a diversitatii structurale si functionale a compusilor organici, creaza dificultati majore in clasificarea lor. Cea mai intalnita clasificare a reactiilor de fragmentare este urmatoarea: 1. fragmentari simple; 2. fragmentari insotite de transpozitia unui atom de hidrogen; 3. fragmentari complexe; 4. fragmentari insotite de transpozitia a doi atomi de hidrogen; 5. fragmentari insotite de transpozitii de schelet.

IV.2. 1. Fragmentari simple

In general, procesul fragmentarii simple implica ruperea unei legaturi, formandu-se ioni si radicali sau ioni si molecule neutre. In maniera cea mai generala, acest proces arata astfel: I+ I1+ + R I+ I2+ + Din categoria fragmentarilor simple fac parte mai multe tipuri de fragmentari: - fragmentarea alchilica; - fragmentarea legaturii carbon-heteroatom; - fragmentarea in fata de legatura carbon-heteroatom C-X sau C=Y (fragmentarea de tip oniu); - fragmentarea in fata de dubla legatura C=C (fragmentarea alilica); - fragmentarea in fata de un sistem aromatic. Fragmentarea tropilica.

1. Fragmentarea alchilica

Caracteristicile principale ale acestei fragmentari sunt:

87

- ionul molecular sau un fragment ionic se scindeaza furnizand carbocationi alchilici; - se intalneste la toti compusii organici care contin in molecula lor un numar de atomi de carbon 2; - schema reactiei de fragmentare este:
C C C C C C C C C C + C C

C C C C

C C

C C

- in cazul normal alcanilor: fragmentele alchilice de formula generala CnH2n+1+ vor furniza semnale la masele: 29 (etil), 43 (propil), 57 (butil), 71 (pentil), 85 (hexil),etc. (picuri despartite de 14 unitati); 100

ionul molecular scade in intensitate odata cu cresterea mase moleculare, dar este inca detectabil la C40; in fig. IV.4.2 este prezentat spectrul de masa al n-tetradecanului, M= 198.
57

43 71 50

85

29 99 0 10 20 30 40 (m ainlib) Tetradecane 50 60 70 80 113 127 141 155 169 198

90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210

Figura IV.4.2. Spectrul de masa al n-tetradecanului

88

Se observa ionul molecular (m/z= 198, intensitate 7%), fragmentele principale (57, 43, 71, 85, 29, 99) sunt picuri despartite de 14 Daltoni, iar picul de baza este un fragment n-butilic (m/z= 57, 100%); schema reactiei de fragmentare este prezentata in fig. IV.4.3.a.;
57 (PB) 141 85 43 155 113 57 (PB) 141 85 113 183 15 29 169 71 127 99 43 155 127

99

71

a.

b.

Figura IV.4.3. Schema reactiei de fragmentare al n-tetradecanului (a) si 7-metil-tridecanului (b)

- in cazul alcanilor ramificati: au tendinta de fragmentare la nivelul ramificatiei; o pierdere de masa de 15 unitati (M-15) indica un metil (CH3) ramificat; ionul molecular scade in intensitate odata cu cresterea ramificarii si poate sa nu apara in spectru; in fig. IV.4.4 este prezentat spectrul de masa al 2-metil-tridecanului, M= 198.
100 43 57

71 50 85 29 155 113 0 127 141 183 198

99

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 (m ainlib) Tridecane, 2-m ethyl-

89

Figura IV.4.4. Spectrul de masa al 2-metil-tridecanului

Ionul molecular abia se observa (m/z= 198, 1%), apare M-15 (m/z= 183, 3%), pozitia ramificatiei este indicata de fragmentele de la m/z 155 (17%) si 43 (98%) (intensitatea picurilor este mult mai mare ca la compusul neramificat); fragmentele principale (29, 57, 71, 85, 99) sunt picuri despartite de 14 Daltoni, iar picul de baza este un fragment butilic (m/z= 57, 100%); schema reactiei de fragmentare este prezentata in fig. IV.4.3.b.
2. Fragmentarea legaturii carbon-heteroatom

In cazul acestui tip de fragmentare, sunt posibile si cunoscute doua moduri uzuale de scindare:
a). R3C X R3C + X X= - halogen; - NR'2; - OR'; - SR'

b). R3C X

R3C

+ X

Din cauza si in masura electronegativitatii heteroatomilor, tipul de fragmentare a) este preponderent. Fragmentarea dupa schema a) mai este favorizata si de efectele +I ale resturilor R, precum si de apartenenta carbonului adiacent heteroatomului la un sistem capabil sa stabilizeze sarcina pozitiva (de exemplu sistemul aromatic). Exemple: 2-clorobutanul (spectrul de masa este prezentat in fig IV.4.5), si etilizobutiltioeterul.

90

Cl

m/z=57, I=100%, PB Cl b C + Cl

m/z=35/37, I= sub 1%
100 57

41 50 29 63

Cl

39 15 18 36 40 49 50 60

65 77 70 80 90 100

10 20 30 (m ainlib) Butane, 2-chloro-

Figura IV.4.5. Spectrul de masa al 2-clorobutan

CH m/e= 57, I=18%

S C H + S

m/e= 61, I=40%

Comparativ cu derivatii clorurati, cei iodurati si tioeterii, datorita stabilizarii sarcinii pozitive de catre iod sau sulf se scindeaza mai abundent dupa schema b).
3. Fragmentarea in fata de legatura carbon-heteroatom C-X sau C=Y (fragmentarea de tip oniu)

91

In afara de scindarea legaturii C-X, compusii care contin heteroatomi se fragmenteaza usor in pozitia fata de aceasta legatura. Procesul decurge conform schemelor: R' R' C R'' R C R' Y -R' R C Y R C Y X -R'' R' C R'' X R'' R' C X

unde X= halogen, NH2, NHR, NR2, OH, OR, SH, SR Y= O, S, NH, NR Aceasta scindare fiind de obicei preponderenta, furnizeaza in majoritatea cazurilor picurile de baza. Ionii rezultati prin fragmentari in furnizeaza picuri la masele minime: CH2=NH2+ m/z = 30 CH2=OH+ m/z = 31 sau 31 + 14n CH2=SH+ m/z = 47 sau 47 + 14n CH2=X+ m/z = Mhalogen+ 14 sau Mhalogen + 14n Dintre radicalii alchil, cel mai mare se va scinda mai usor. De exemplu, fragmentarea in a alcoolului butilic secundar (spectrul de masa este prezentat in fig IV.4.6),:

92

H C HO a C b c H a b

OH

+ CH3CH2

m/z= 45 I=100% H C c OH + CH3

m/z=59 I=19% HO C m/z=73 I=1.2% + H

Abundentele mai mici ale ionilor proveniti din fragmentarile (b) si (c), se datoresc instabilitatii mari a radicalilor CH3 si H, ceea ce face ca stabilitatea ionilor sa fie in acest caz invers proportionala cu abundenta lor.
100 45

HO

50

27 18 0 10 15 20 (m ainlib) 2-Butanol 25 28

31 43 57 30 35 40 45 50 55

59 73 60 65 70 75 80

Figura IV.4.6. Spectrul de masa al 2-butanol

Prin inregistrarea spectrelor de masa la compusi cu structuri de tipul XCH2CH2-Z, X si Z fiind heteroatomi, s-a gasit urmatoarea ordine a stabilitatii: CH2=NH2+ > CH2=SH+ > CH2=OH+ > CH2=F+

93

De exemplu, pentru etanolamina (spectrul de masa este prezentat in fig IV.4.7), s-a obtinut:
OH H2C NH2 + H2C OH m/z=30 I=100%
100 30

H2N

m/z=31 I=10%

NH 2 50 HO

15 0

18

28 27 29 31 26 30 34 38

42 42 46 50 54 58

61 62 66 70

10 14 18 22 (m ainlib) Monoethanolam ine

Figura IV.4.7. Spectrul de masa al etanolaminei

Prin inlocuirea atomilor de hidrogen cu diversi radicali, stabilitatile relative si deci, abundentele acestor ioni pot fi mult modificate. Sensul acestor modificari va depinde de efectele inductive si electromere ale radicalilor. De exemplu, in cazul 1hidroxi-2-amino-2-metilpropanului s-au obtinut urmatoarele abundente:

H2N

OH

NH2 + m/z=58 I=100%

H2C OH m/z=31 I=2%

Prin efectul lor +I, gruparile alchil maresc stabilitatea fragmentelor incarcate pozitiv in care se gasesc. Deoarece aceleasi grupari sunt raspunzatoare si de cresterea bazicitatii heteroatomilor de care sunt legate, s-au putut studia comparativ bazicitatile aminelor pure (in absenta influentei solventilor si a

94

factorilor sterici) prin intermediul abundentelor relative ale fragmentelor rezultate prin scindari in . S-a gasit ca abundentele ionilor cresc in ordinea: R2C=NH2+ < R2C=NHR+ < R2C=NR2+ Prin urmare si bazicitatea reala a aminelor creste in ordinea: amine primare < amine secundare < amine tertiare. Acolo unde se este cazul, exista o concurenta intre scindarile in si scindarea legaturii C-X, aceasta poate fi determinata din abundentele picurilor furnizate. De exemplu, daca consideram cazul 2-cloro-2-metilbutanului (spectrul de masa este prezentat in fig IV.4.8), se observa ca fragmentarea in este preponderenta (intensitate 100%):
a C Cl + m/z=91/93 I=71% Cl C Cl + m/z=77/79 I=100%
100 41 55 71 77

CH3

CH3CH2

Cl 50 29 79 39 91 15 0 10 20 30 40 (m ainlib) Butane, 2-chloro-2-m ethyl50 60 70 80 90 100 110 120 36 53 63 93

Figura IV.4.8. Spectrul de masa al 2cloro-2-metil-butan

Fragmentarile oniu ale compusilor de tip R(R)C=Y se intalnesc la aldehide, cetone, amide, esteri, cloruri acide, chinone, tioesteri, etc. In functie, in

95

primul rand, de stabilitatile fragmentelor care se formeaza, se fragmenteaza preponderent unul din cei doi radicali. De exemplu, fragmentarea oniu a esterului metilic al acidului n-butanoic si a aldehidei propionice decurg dupa schemele de mai jos (spectrele de masa sunt prezentate in fig IV.4.9 si IV.4.10).
a O OCH3 b CH3O + C O m/z=71 I=54%
100 43 74 O 71 50 41 59 27 15 0 10 20 30 40 (m ainlib) Butanoic acid, m ethyl es ter 50 29 57 60 39 55 69 70 80 90 102 100 110 87 O

H3CO C O m/z=59 I=23%

Figura IV.4.9. Spectrul de masa al esterului metilic al acidului n-butanoic

96

a O H b

CH3CH2

H C O m/z=29 I=100%

C O m/z=57 I=12%

100

29 28 58

27 50

26 15 0 18 22 25 26 30 30 34 37 39 38 42 46 50 54 57

59

10 14 18 (m ainlib) Propanal

58

62

66

70

Figura IV.4.10. Spectrul de masa al aldehidei propionice

Prin inlocuirea oxigenului aldehidic cu

+

18

O s-a stabilit ca semnalul de la m/z=29

este dat de fragmentul HCO si nu de CH3CH2+.

4. Fragmentarea in fata de dubla legatura C=C (fragmentarea alilica)

Prezenta unei duble legaturi in ionul molecular, favorizeaza scindarea legaturii simple din pozitia . Exemplu, cazul izopentenei (fig. IV.4.11), se observa ca picul de baza (m/z= 55, 100%) rezulta prin fragmentare in pozitia a unui radical metil:

97

55 (PB) 15
100 55

50 27 39 42 53 20 30 40 50 60 70 80 70

15 0 0 10 (m ainlib) 1-Butene, 3-m ethyl-

Figura IV.4.11. Spectrul de masa al izopentenei

Totusi nu se poate stabili pozitia dublei legaturi intr-un lant hidrocarbonat deschis, decat in anumite cazuri. Se constata ca oricare dintre legaturile C-C din molecula se poate scinda aproximativ cu aceeasi probabilitate. Fenomenul poate fi explicat daca se admite ca timpul necesar producerii scindarii este mai mare decat cel de migrare succesiva a unor ioni hidrura si atomi de hidrogen.
H H H H C C C C C C H H H H H H H H H C C C C C C H H H H H H H H H C C C C C C H H H H H

H H H H H H H H C C C C C C H C C C C C C H H H H H H H H H Intr-adevar substituirea hidrogenilor din pozitia alilica cu resturi alchil,

blocheaza migrarile amintite permitand localizarea dublei legaturi. Acelasi lucru este valabil si pentru olefinele cu carboni dublu legati complet substituiti.

98

H H2C C R3

R2 R1

C C

si

R3 R2 C C C C R1

R4

S-a gasit de exemplu ca ionul molecular de mai jos furnizeaza semnale foarte intense la masele 71 si 73.

HO CH3 H3C H3C C C CH3 HO CH3 H3C m/z= 71 H3C CH2

CH3 H3C m/z= 73 Evident formarea ionului cu masa 71 este facilitata si de structura oniu a lui.
5. Fragmentarea in fata de un sistem aromatic. Fragmentarea tropilica.

Ciclurile aromatice substituite cu cel putin un rest alchil sau care fac parte dintr-un sistem ciclic, favorizeaza fragmentarea legaturii C-C din pozitia fata de ciclul aromatic. Prin marcare cu
13

C si D s-a dovedit ca in locul ionului benzil se

formeaza de fapt ionul tropiliu (m/z= 91). Exemplu: fragmentarea tropilica a npropilbenzenului (din fig. IV.4.12 se observa ca ionul tropiliu este chiar pic de baza).
CH3 H CH2 CH2 CH3 m/z= 91 ion tropiliu + C2H5

H C H

99
100 91

50 120 65 60 70 78 80

27

39 40

51 50

89 90 100

105 110 120 130

10 20 30 (m ainlib) Benzene, propyl-

Figura IV.4.12. Spectrul de masa al n-propilbenzenului

Transpozitii similare se produc si la sistemele heteroaromatice cu 5 si 6 atomi in ciclu. Heterociclii cu 6 atomi cum ar fi alchil-piridinele conduc la ioni de azotropiliu, iar cu cei 5 atomi isi largesc ciclul, conform schemei de fragmentare de mai jos:
R CH2 X H R X

H R X +R

Exemplu: 1-butil-1H-pirol (spectrul de masa este prezentat in fig IV.4.13); se observa ca fragmentele de la 80 (76%) si 81 (100%, PB) se pot explica tocmai prin largirea de ciclu.

100

H N H N H C3H7 C3H7 N H m/z= 80 C3H7

N H
100 81

50 N 39 53 67 78 0 15 40 50 60 70 80 90 10 20 30 (m ainlib) 1H-Pyrrole, 1-butyl94 100 108 110

123

27

120

130

Figura IV.4.13. Spectrul de masa al 1-butil-1H-pirol

Indiferent de pozitia substituientului se obtine acelasi ion, tropiliu. Fragmentarile tropilice sunt adesea preponderente furnizand picurile de baza. Studiul intensitatii stabilizarii sarcinii pozitive de diferite fragmente rezultate in urma scindarilor alilice si tropice au condus la urmatoarele rezultate:

101

m/z= 91, 40%

m/z= 57, 100%

m/z= 13, 23%

m/z= 43, 100% O

m/z= 41, 23% m/z= 57, 100%

m/z= 91, 100% m/z= 41, 9%

m/z= 91, 10% m/z= 20, 100% NH 2 m/z= 91, 60% O m/z= 43, 100% m/z= 91, 100% OH m/z= 31, 10%

In consecinta, se poate aprecia ca ordinea descrescatoare a stabilizarii sarcinii pozitive de catre diferiti ioni furnizati la fragmentarile simple poate fi redata prin seria:
H2C NH2 > C C > C C C C OH C H > H2C C CH > 2 > C C OH > H3C C O H >

>

C CH C

> H2C OH > C CH2

IV.2.2. Fragmentari insotite de transpozitia unui atom de hidrogen

O serie de picuri care apar in spectrele de masa a unui numar mare de compusi organici, nu pot fi explicate decat admitand transpozitia unui atom de hidrogen. Ionii rezultati in urma transpozitiei unui hidrogen in cursul scindarii unei legaturi se numesc ioni de transpozitie. In modul cel mai general aceasta transpozitie poate fi redata prin ecuatiile:

102

I I2

scindare si transpozitie scindare si transpozitie

I1

unde molecula neutra -

I3 +

Posibilitatea producerii acestui proces este conditionata de urmatoarele aspecte: a. Stereochimia ionului: transpozitia se produce intre centre apropiate spatial, printr-o stare de tranzitie ciclica care implica trecerea unei bariere energetice mici; b. Molecula si ionul format sau ce putin unul dintre ei trebuie sa fie deosebit de stabil. In functie de rezultatul final sau de mecanism, aceste fragmentari se pot clasifica dupa cum urmeaza: - transpozitia unui proton insotita de eliminarea grupei functionale; - transpozitia unui proton insotita de retroaditie 1,4; - transpozitia Mc Lafferty; - transpozitia hidrogenului in lanturi ionice de tip oniu; - transpozitii ion-dipol.

1. Transpozitia unui proton insotita de eliminarea grupei functionale

Acest proces implica transpozitia unui hidrogen la grupa functionala in cursul fragmentarii acesteea:
C X C n C H C nC C + HX

unde X= -OH, -OR, -NH2, -NHR, -NR2, -X, -SH, RCOO-, RCONH- si CN.

103

Abundenta

fragmentelor

ionice

rezultate

este

proportionala

cu

electronegativitatea gruparii functionala. Astfel, daca pentru X= F, Cl, OH, picurile de la masele M+-(X+1) sunt intense, pentru X= NH2, NHR, NR2, Br si I in multe cazuri lipsesc din spectru. Se observa ca aceste picuri au masele cu o unitate mai mica decat cele rezultate prin fragmentare simpla. Prin marcari cu deuteriu s-a stabilit ca eliminarile se produc din pozitiile 1,2, 1,3, 1,4, etc, preponderente fiind cele din 1,3 si 1,4. De exemplu scindarea apei din n-butanol (spectrul de masa este prezentat in fig IV.4.14) conduce la ionul-radical de
la m/z= 56, care este si pic de baza.

1,3 OH 1,4 m/z= 56

+ H2O

+ H2O m/z= 56
100 31 41 43 27 50 29 28 15 19 0 10 15 20 (m ainlib) 1-Butanol 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 33 39 38 45 73 75 80 55 OH 56

Figura IV.4.14. Spectrul de masa al n-butanol

2. Transpozitia unui proton insotita de retroaditie 1,4

Ionii moleculari sau de fragmentare ai olefinelor 1,2-cis-disubstituite si ai derivatilor aromatici orto-disubstituiti care contin cel putin un hidrogen pe unul din

104

substituienti, pot elimina o molecula neutra conform schemei: Y X Z H R Y + RXH Z

unde X, Y, Z pot fi C, N, O, S iar R = alchil, aril, acil. Aceasta fragmentare are urmatoarele caracteristici:

decurge printr-o stare de tranzitie ciclica intre sase atomi incluzand si hidrogenul; hidrogenul se transpune intotdeauna de pe atomul 1 pe atomul 5 in timpul fragmentarii acestuia; rezulta ioni-radicali cu structura di-sau polienica, mai mici cu o unitate de masa decat ionii rezultati prin fragmentare simpla; permite distingerea izomerilor orto de meta si para, precum si a celor cis de
trans in cazul olefinelor. Numai izomerii orto si cis pot da stari de tranzitie

ciclica care furnizeaza eliminarea. Astfel, daca consideram drept exemplu cazul esterilor metilici al acidului metil-benzoic, din analiza spctrelor de masa (fig. IV.4.15), se obsera ca intensitatea ionului de masa 118, care corespunde starii de tranzitie ciclica de sase atomi (schema de mai jos), este mare in cazul de esterului metilic al acidului o-metil benzoic (58%):
O O CH3 C O + i-C3H7OH

CH2 m/z= 118 (58%)

105
100 O 119

O 91 50 57 41 29 77 0 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 (m ainlib) Benzoic acid,2-m ethyl, (2-m ethylpropyl)es ter
100 91 137 O 50 56 51 119

136

65 105 192

41 29 0

65

77

105

149

192

20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 (m ainlib) Benzoic acid,3-m ethyl, (2-m ethylpropyl)es ter 100 O 91 O 50 65 137 119

39 29 0 51

56

69 77

105

20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 (m ainlib) Benzoic acid, 4-m ethyl-, 2-m ethylpropyl es ter

Figura IV.4.15. Spectele de masa ale esterilor metilici al acidului metil-benzoic(o, m, p)

106

Pentru izomerul meta intensitatea ionului de masa 118 este de 1.6% iar pentru izomerul para de 1%, deoarece acestia nu pot adopta starii de tranzitie ciclica de sase atomi. In cazul izomerilor cis-trans olefinici diferentele intre intensitatile ionilor proveniti din aceasta fragmentare sunt mai mici (dar intotdeauna sesizabili) datorita transformarii. Astfel, daca consideram drept exemplu cazul esterilor izopropilici al acidului 2-metil-2-butenoic, din analiza spctrelor de masa (fig. IV.4.16), se obsera ca intensitatea ionului de masa 82, care corespunde starii de tranzitie ciclica de sase atomi (schema de mai jos), este mai mare in cazul de Z(cis)-esterului izopropilic al acidului 2-metil-2-butenoic (16%) comparativ cu E(trans)- (13%):
H3C O O H3C C O + i-Pr-OH

CH3 Z (cis) 100 55

CH2 m/z= 82 (16%)

83 O

43 50 27 101 41 45 59 85

127 142

31

69 100

109 110 120 130 140 150

20 30 40 50 60 70 80 90 (m ainlib) 2-Butenoic acid, 2-m ethyl-, 1-m ethylethyl es ter, (Z)-

107
100 83 O

55 50 43 27 59 15 31 40 45 53 50 60 69 70 80 90 100 85 101

127 142 109 110 120 130 140 150

10 20 30 (m ainlib) Is opropyl tiglate

Figura IV.4.16. Spectrele de masa ale esterilor benzilici al acidului 2-metil-2-butenoic, Z (sus) si E(jos)

3. Transpozitia Mc Lafferty

Acest mod de fragmentare se intalneste la ionii-radicali si intr-o masura mai mica la ionii cu un numar par de electroni, care contin cel putin o legatura multipla sau un sistem analog si pot adopta stari ciclice de tranzitie incluzand 6 atomi. In modul cel mai general, transpozitia McLafferty poate fi redata prin schemele:
H A B G H A B G H A B G K D F L -L H A B G X A B + G K D F H K A B + D F G E D A B + F G H E D F X C C H H G E D F

108

unde A, B, D, E, F, G, K, L pot fi atomi sau grupe de atomi de diferite naturi, cu conditia ca molecula sa fie constituita rational. X poate fi O, N sau S. Caracteristicile principale ale acestei fragmentari sunt:

este necesara prezenta unui hidrogen pe atomul din pozitia 5; daca atomul din pozitia 5 este un carbon care poseda legaturi multiple transpozitia nu mai are loc; transpozitia si fragmentarea sunt strict sincrone, fapt dovedit prin lipsa efectului izotopic la compusii deuterati; sistemul trebuie sa permita o apropiere de cel putin 1,8 intre hidrogen si atomul pe care se transpune; usurinta cu care se transpune atomul de hidrogen creste in seria: H-C primar < H-C secundar < H-C tertiar se elimina intotdeauna o molecula neutra; daca in urma unei rearanjari McLafferty rezulta un fragment ionic cu o structura corespunzatoare, acesta poate suferi o noua transpozitie McLafferty;

Din cele aratate rezulta ca transpozitia McLafferty se intalneste la olefine, sisteme aromatice cu catene laterale, compusi continand cicluri de 3 atomi, aldehide, cetone, acizi, esteri, amide, nitrili, etc. Mecanismul acestei transpozitii a fost studiat pe compusii deuterati corespunzatori conform schemei:

109

R CH D2C

R O C _ R CH CD2 H H2C O C M D _ R' R CD CH2 H2C _ R CH CH2

H CH H2C

R' C H2 compus deuterat D CD

R'

C R' C H2 compus nedeuterat

R H2C

O C

O C M
'

R'

C H2 compus deuterat RCH H2C H O C

H _ R' R CH CH2 D2C

O C

C D2

R'

M''

compus deuterat

unde: R= alchil, aril R1= -H, -R, -OH, -OR, -NH2, -NHR, -NR2, etc M, MI, MII sunt masele celor 3 fragmentari ionice. Deoarece in toate cazurile s-a gasit ca M= MI-1= MII-2 rezulta ca transpozitia este starea specifica, hidrogenul migrand din pozitia fata de gruparea functionala. Fragmentarea McLafferty furnizeaza picuri la urmatoarele mase minime: pentru aldehide 44, cetone 58, acizi 60, amide 59, esteri 74, etc. Eventualii substituienti la atomii fragmentului ionic conduc la mase diferite de cele indicate, dar usor previzibile. Exemplu: cazul 2-hexanonei; din analiza spctrului de masa (fig. IV.4.17), se observa existenta unui pic semnificativ la masa minima 58, caracteristic pentru fragmentarea McLafferty a cetonelor.

110

H3C CH

O C CH3
43

H H2C

O C

H3C + CH3

H CH2

m/z= 58
100

O 50 58

29 15 0 10 20 (m ainlib) 2-Hexanone 30

41 39 40 50

55 60

71 70 80

85 90

100 100 110

Figura IV.4.17. Spectrul de masa al 2-hexanonei

Prin compararea abundentelor fragmentelor ionice de transpozitie McLafferty furnizate de azometine si esterii -aminoacizilor se remarca favorizarea acestui proces de catre ionii radicali.
RCH H2C H N CH3 C _ H R CH CH2 H H2C N C CH3 H

C H2

I= 20-35% RCH H CH3 N CH 3 C H CH3 N CH 3 C H H2C H I= 0.2 - 2%

H CH C H2

N CH

CH3 CH3 COOR' - COOR'

H2C

H2C

C H2

_ R CH CH 2

In general picurile furnizate de transpozitia McLafferty sunt intense, in unele cazuri fiind picuri de baza.

111

4. Transpozitia hidrogenului in lanturi ionice de tip oniu

O serie de fragmente ionice de tip oniu pot suferi fragmentari insotite de transpozitiile unor atomi de hidrogen. Schema generala a reactiei de fragmentare este:
R'' H R X CH R' H cale 1 H -R'' cale 1 cale 2 H

R X CH R'

cale 2

HX CH R' a

H + R-H

R X CH2 + R' - H b -(R - H)

-(R '- H) unde: X= O, S, NH, NR; R, R- resturi alchilice;

HX CH2

R un rest care se scindeaza usor sub forma de radical. Desi rezultatul final este acelasi, calea 1 este preponderenta (in spectru apar semnale furnizate de ionii de tip a). Fragmentarea dupa calea 2 devine importanta numai daca R=H, CH3 sau daca daca R>>R. Fragmentarile in continuare ale ionilor a si b conform schemei au loc numai daca R si R sunt resturi alchilice mai mari decat CH3. Existenta acestor fragmentari este dovedita de prezenta picurilor furnizate de fragmentele de masa minima: CH2=NH2+ m/z = 30 - in cazul aminelor secundare si tertiare; CH2=OH+ m/z = 31 -in cazul alcoolilor secundari, tertiari si a eterilor; CH2=SH+ m/z = 47 tioeterilor. (47 + 14n) in cazul tiolilor secundari, tertiari si a

112

Daca consideram ca si exemplu cazul fragmentarii butil-isopropil- aminei (schema de mai jos), din analiza spctrului de masa (fig. IV.4.18), se observa existenta unui pic semnificativ la masa minima 30 (6%), caracteristic pentru fragmentarea de tip oniu.
H N m/z= 100 (35%)

H N

- CH3

- CH4 H2N m/z= 58 (24%) H2N H N m/z= 85 (nu se observa in spectru) CH2 m/z= 30 (42%)
72 NH

m/z= 43 (13%)

100

28

50

30 44 32 39 70 80 90 58

100

115 100 110 120 130

0 20 30 40 50 60 (m ainlib) 1-Butanam ine, N-(1-m ethylethyl)-

Figura IV.4.18. Spectrul de masa al butil-izopropil- aminei

Se va observa ca aceleasi fragmente se obtin si in cazul fragmentarii simple in a alcoolilor, aminelor si tiolilor primari. Marcarea cu deuteriu a aratat ca in acest sens transpozitia hidrogenului este nespecifica.

113

6. Transpozitii ion-dipol

Fragmentarile care includ transpozitii specifice ale hidrogenilor de la centre ion-radicalice sau ionice la grupari dipolare se numesc transpozitii ion-dipol. Schematic ele se reprezinta dupa cum urmeaza:

XH Y C C CH2 n

XH -R C

Y C CH2 n

YH C C CH2 n

X - YH C C CH2 n

unde: X= OH, NH; Y= OH, OR, NH. Transpozitiile de acest tip se intalnesc la diamine, dialcooli, esteri metilici ai hidroxi- si cetoacizilor, etc. Daca consideram ca si exemplu cazul fragmentarii esterului metilic al acidului 3-hidroxibutanoic (schema de mai jos), din analiza spctrului de masa (fig. IV.4.19), se observa existenta unor picuri semnificative la 103 (19%) si 71 (32%), caracteristice pentru fragmentarile de tip ion-dipol.

H3C

CH OH

CH2

O - CH3

OCH 3 CH2

HC OH

CH2

C O

OCH 3

HC O

CH2

OCH 3

HO

m/z= 103 C O + CH3OH

HC O

m/z= 71

114
100 43

O 45 50 71 27 31 0 61 63 69 70 77 80 87 85 90 103 100 100 110 74 O

OH

117 120 130

20 30 40 50 60 (m ainlib) Butanoic acid, 3-hydroxy-, m ethyl es ter

Figura IV.4.19. Spectrul de masa al esterului metilic al acidului 3-hidroxibutanoic

Prin marcare cu deuteriu s-a stabilit ca aceste transpozitii sunt specifice in privinta hidrogenului care migreaza si nespecifice in raport cu numarul gruparilor CH2 care separa cele doua centre intre care are loc migrarea. Ca si exemplu consideram tor cazul unui hiroxi-ester:
O CH3(CH )m CH (CH )n C 2 2 OCH OD 3 O O CH (CH )n C 2 O-CH 3 D O DO CH (CH )n C 2 OCH 3

-CH3(CH2)m

-CH OD 3

O CH (CH )n C O 2

IV.2.3. Fragmentari complexe

Ionii-radicali proveniti de la compusii ciclici substituiti cu heteroatomi, de la cicluri nesaturate sau continand un nucleu aromatic, cat si de la unii heterocicli aromatici, pot suferi o dubla sau tripla scindare insotita in multe cazuri de transpozitia unui hidrogen.

115

Intrucat in spectru nu apar decat picuri furnizate de ionii de fragmentare finali, numai prin marcari cu deuteriu si 13C s-au putut deduce mecanismele acestor fragmentari. In multe cazuri mecanismele fragmentarii s-au dedus pe baza regulilor generale de fragmentare si a unor analogii. Exista doua tipuri de fragmentari caracteristice: - fragmentarile complexe ale ciclurilor alifatice substituite; - fragmentarea retro-Diels-Alder.

1. Fragmentarile complexe ale ciclurilor alifatice substituite

Schematic, fragmentarea compusilor care contin cicluri de atomi poate fi redata astfel: R X R X R X C1 R H + + CH3

C2

X H

R X +

unde: X= O, S, NH, NR Ambele cai de fragmentare sunt posibile deoarece pot fi justificate prin consideratii de ordin energetic, iar fragmentele ionice finale sunt aceleasi. Un model pe care s-a studiat fragmentarea complexa a fost N-etil-ciclohexil amina si derivatul ei 2,6-tetradeuterat. Asa dupa cum se observa din spectrul de masa al aminei nedeuterate (fig. IV.4.20), in urma unei reactii de fragmentare complexe (schema de mai jos) rezulta fragmentul de la m/z= 84 (care este si pic de baza) iar

116

in cazul aminei deuterate acelasi tip de fragment are masa mai mare cu o unitate (m/z= 85, pic de baza):
H3CH2C NH H3CH2C NH H3CH2C NH D2C m/z=84, I%=100
100 84

H3CH2C NH D m/z=85, I%=100

CD2

HN 50

41 44 0 30 40 50 60 (m ainlib) Cyclohexylam ine, N-ethyl55

71 98 70 80 90 100 112 110 120

127

130

140

Figura IV.4.20. Spectrul de masa al esterului etil-ciclohexil-aminei

Doua caracteristici ale acestei fragmentari sunt mai importante: - transpozitia hidrogenului este in toate cazurile specifica (din 6 in 2 sau invers); - intensitatea picurilor este in general foarte mare. In mod analog se fragmenteaza si compusi cu heteroatomul dublu legat:
X X H X + + CH3

Si compusii care contin un ciclu de 5 atomi heterosubstituit se fragmenteaza complex. Un exemplu studiat in amanuntime pentru stabilirea mecanismului de

117

fragmentare a acestor cicluri l-a constituit N-etil-ciclopentilamina (I, fig. IV.4.21) si cei trei derivati deuterati ai sai (II, III si IV): H3C H2C NH H3C D2C NH D3C H2C NH H3C H2C NH D2C
I
100

CD2
IV

II

III
84

HN 50 41 27 15 0 10 20 30 40 (m ainlib) Cyclopentanam ine, N-ethyl50 60 44 58 67 56

70

113 98 82 70 80 90 100 110 120

Figura IV.4.21. Spectrul de masa al esterului etil-ciclpentil-aminei

Schema generala a fragmentarii N-etil-ciclopentilaminei este urmatoarea:

118

+ H3C H2C NH H C1

+ H3CH2C NH +

CH3 H2C

I: m/z=84, 100%, PB m/z=29, 14% II: m/z=86, 100%, PB III: m/z=87, 100%, PB IV: m/z=85, 100%, PB + H3C H2C NH CH3 - CH2=CH2 m/z=28, 13% + HN m/z=83, lipseste CH3 + HN + CH3

H3C H2C NH

C2

C3 + H3C H2C NH

I: m/z=70, 60% II: m/z=72 III: m/z=70 IV: m/z=72 + CH2 HN + I: m/z=56, 32% II: m/z=58 III: m/z=56 IV: m/z=58 + NH2 + I: m/z=56, 32% II: m/z=56 III: m/z=57 IV: m/z=57 CH3 H2C CH3

+ H2C HN

- CH2=CH2

C4

m/z=42, 16% I: m/z=71, 18% II: m/z=73 III: m/z=71 IV: m/z=73 + + NH2 NH2

I: m/z=85, 14% II: m/z=85 III: m/z=86 IV: m/z=89

Numarul de unitati de masa cu care se deplaseaza picurile de aproximativ aceeasi intensitate, din spectrele compusilor permite stabilirea ionilor cu schelet identic, dar cu continut diferit de deuteriu. Structurile si masele principalilor ioni pozitivi care rezulta prin fragmentarea complexa a unor compusi organici mai des intalniti sunt:

119

OH

OR

SH

SR

NH2

NHR

NR2

m/z: 57

57 si MR-1

73

73 si MR-1

56

56 si MR-1 56 si 2MR-1

55

unde MR este masa restului R. Datorita prezentei, intensitatii si prin urmare a importantei lor pentru stabiliri de structura, aceste fragmente au fost numite fragmente cheie.
2. Fragmentarea retro-Diels-Alder

Este data de compusii ciclici care contin o dubla legatura sau un ciclu aromatic in locul acesteia:

Acest mod de fragmentare a fost intens studiat deoarece este des intalnit in clasa terpenelor si alcaloizilor. Un exemplu tipic il constituie fragmentarea ciclohexenei (schema de mai jos):
H - CH3 m/z=67, I=100

_ H C CH 2 2 m/z=54, I= 68% + CH2 CH2 CH2 CH2 m/z=28, I= 2%

120

Spectrul de masa al ciclohexenei este prezentat in fig. IV.4.22.

100 67

54

50

39 41 27 14 29 30 40 50 60 65 70 82

0 10 20 (m ainlib) Cyclohexene

74 80 90

Figura IV.4.22. Spectrul de masa al esterului ciclohexenei

Daca in structura unor astfel de compusi sunt prezenti substituenti care pot conduce la modificarea intensitatilor acestor picuri, se poate ajunge pana la aparitia in spectru a unor picuri intense corespunzatoare fragmentelor etilenice. De exemplu, in cazul trans-2-octalinei si 9-metil- trans-2-octalinei rezulta: R + R R + m/z= M-54 Intensitatile relative ale celor doi ioni sunt: m/z 54 M-54 I% cand R=H 3,04% 1,9% I% cand R=CH3 1,18% 19,1% m/z=54 R R

121

IV.2.4. Fragmentari insotite de transpozitia a doi atomi de hidrogen

Prezenta in spectrul de masa a unor picuri cu doua unitati de masa mai mari decat cele prevazute prin fragmentarile simple previzibile in cazul compusilor respectivi, a condus la presupunerea confirmata ulterior prin studii sistematice, ca in timpul fragmentarii, doi atomi de hidrogen se transpun de la fragmentul neutru la cel ionic. Compusii la care se intalneste aceasta fragmentare sunt multi, dar pot fi impartiti in doua clase mai importante: - compusi mono- sau polifunctionali cu legaturi ; - compusi mono- sau polifunctionali cu duble legaturi.
1. Compusi mono- sau polifunctionali cu legaturi

Procesul de frag,mentare poate fi redat prin urmatoarea schema:

H C R''' H unde: X= O, S; Y= O, S, CH2 (in multe cazuri X = Y = O, S); R, R, R, R grupe alchil sau atomi de hidrogen. Se vor fragmenta in acest mod, prin urmare: alcoolii, tiolii, 1,2-tiolii, 1,2tiol-alcoolii, derivatii lor alchilati precum si unii epoxizi. Un exemplu ilustrativ il constituie fragmentarea 1,2-propandiolului (spectru de masa este redat in fig/ IV.4.23) prezentata mai jos: Y R X R' C R'' H H + Y C R'''

R X R' C R''

122

OH H3C CH H
100

H C H O
45

H O H2C

H CH3 + O CH

m/e=47; 1,2%

HO 50 OH 27 18 30 31 33 43 41 40 50 57 61 60 70 80 90

15 0

10 20 (m ainlib) Propylene Glycol

Figura IV.4.23. Spectrul de masa al 1,2-propandiol

Ionul format este tocmai etanolul protonat a carei formare si stabilitate in mediul acid este bine cunoscuta.
2. Compusi mono- sau polifunctionali cu duble legaturi

Marea majoritate a fragmentarilor de acest tip decurg conform urmatoarei scheme de fragmentare:

O R C O H

H C B R' A n R

OH + OH

R' C B A n

unde: R poate fi: alchil, aril, heteroaril (adesea R = OR1);

123

A poate fi: -CH2-, -CHR-, -S-, -O-; n= 1, 2, 3; (adesea A = -CH2-CH2-CH2-, CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-O-) ; B poate fi: -CH2-, >CHR, O si S; R si R1 radicali hidrocarbonati cu diferite structuri. In multe cazuri, datorita concurentei altor procese de fragmentare, intensitatile picurilor furnizate de ionii de dubla transpozitie sunt mici sau foarte mici. Totusi, cand ionul rezultat are o structura care stabilizeaza puternic sarcina pozitiva, acesta poate furniza picul de baza sau un pic cu intensitate mare. Asa se intampla in cazul unor esteri ai acidului carbonic. Stabilitatea mai mare a ionilor de dubla transpozitie rezultati din carbonati in comparatie cu ionii analogi proveniti din esterii acizilor organici se datoreaza puternicei lor stabilizari prin rezonanta.
OH R OH R OH OH R OH OH

OH R O C OH R O C

OH R OH O C

OH R OH O C

OH OH

IV.2.5. Fragmentari insotite de transpozitii de schelet

Aceste fragmentari sunt insotite de transpozitii ale unor grupari alchil, aril, alcoxi, etc. Ele conduc la modificari profunde ale structurii compusilor organici si la eliminarea concomitenta a unor radicali sau molecule neutre cum ar fi: CO2, CO, olefine, H2C=O, HCN, S, SH2, SO2, etc Acest mod de fragmentare se intalneste la foarte multe clase de compusi care contin legaturi duble, sisteme conjugate de legaturi duble sau cicluri mici si in marea majoritate a cazurilor hateroatomi. Daca consideram cazul ciclurilor mici, fragmentarea epoxizilor decurge dupa schema de mai jos; ca si exemplu se considera cazul fragmentarii 2,2-dimetil-

124

3-propil-oxiranului, care conduce la un fragment cu intensitate mare la m/z=85 (spectru de masa in fig. IV.4.24) :

O H

H R' R

O H C

H + C R R'

R R' R, R' - alchil, aril O

O H

O H C

m/z= 85, 86%

100 41

43

59 85 O

50 55 72 53 0 40 50 60 (m ainlib) Oxirane, 2,2-dim ethyl-3-propyl70 99 69 81 80 90 100 110 114 120

Figura IV.4.24. Spectrul de masa al 2,2-dimetil-3-propil-oxiranului

Studiul sistematic al fragmentarii 4-hidroxi-ciclohaxanonei si a unor eteri ai sai a pus in evidenta transpozitia unei grupari OH sau OR (schema de mai jos). Daca consideram ca si exemplu chiar cazul fragmentarii 4-hidroxi-ciclohaxanonei, aceasta va conduce la un fragment cu intensitate mare la m/z=60 (spectru de masa in fig. IV.4.25) :

125

OR

O OR HO + CH2 OR

O R O

OH

O OH HO + CH2 OH

O H
100 29 27

H
55 57

m/z= 60, 78%

OH 114

43 50 41 31 39 68 73 81 86 70 80 90 96 O

50 0 20 30 40 50 (m ainlib) Cyclohexanone, 4-hydroxy60

65

100

110

120

130

Figura IV.4.25. Spectrul de masa al 4-hidroxi-ciclohaxanonei

Esterii acidului carbonic, unii esteri ,-nesaturati (mai rar) elimina usor CO2 concomitent cu transpozitia restului legat de oxigenul grupei esterice (schema de mai jos). Daca consideram ca si exemplu cazul fragmentarii etil-2-metoxifenilcarbamatului, aceasta va conduce la un fragment la m/z=152 (spectru de masa in fig. IV.4.26) :

126

O R O O

O O O

OR

+ CO2

O O

+ CO2

m/z= 152
100 O 109 124

50

O O

29 41 0 52 65

77

95

196 152

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 (m ainlib) Carbonic acid, ethyl 2-m ethoxyphenyl es ter

Figura IV.4.26. Spectrul de masa al etil-2-metoxifenil-carbamatului

Monoxidul de carbon rezulta prin fragmentarea cetonelor alifatice, aromatice, chinonelor, fenolilor, eterilor fenolici, etc. Daca consideram ca si exemplu ilustrativ cazul 1-metil-antrachinonei (schema de mai jos), fragmentarile de acet tip (eliminari succesive de CO) vor conduce la fragmentele semnificative de la m/z=194 si 166 (spectru de masa in fig. IV.4.27) :

O -CO O m/z=222, 100%, PB

O -CO m/z=194, 24% m/z=166, 21%

127

100 O 165

222

50

39 0

50

63

82 89 97

O 115 126 139 150 177

194 207

30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 (m ainlib) 9,10-Anthracenedione, 1-m ethyl-

Figura IV.4.27. Spectrul de masa al 1-metil-antrachinonei

Eliminarea acidului cianhidric prin fragmentarea aminelor aromatice sau a unor amidine, a sulfului si a acidului sulfhidric prin fragmentarea sufurilor sau disulfurilor au loc de asemenea concomitent cu transpozitii de schelet.

128

V. APLICATII IN MEDICINA JUDICIARA

V.1. Probe care se utilizeaza in medicina judiciara. Generalitati Modalitatea transportat Tipurile de impuritati, produsi de degradare, produsi secundari sau solventi care sunt prezenti in probele de drog/toxic Modalitatea in care proba drogul/toxicul se prezinta: in forma pura, amestec cu alte droguri, cu excipienti, cu adaos de produsi denaturati sau falsificati V.2. Probe biologice V.2.1. Introducere Metabolizarea drogurilor/toxicelor Administrare, transport, absortie, distributie si excretie V.2.2. Fluide biologice Singe, plasma, ser. Urina. Saliva V.2.3. Tesuturi si fluide postmortem Ficat, creier, bila, umoarea vitroasa, continut stomacal V.2.4. Probe neconventionale V.3. Pregatirea probelor V.3.1. Extractia si cromatografia in strat subtire V.3.1.1. Extracia V.3.1.2. Cromatografia in strat subtire V.3.2. Pretratamentul si prepararea probelor V.3.3. Derivatizarea chimica in medicina judiciara V.3.3.1. Reactii chimice utilizate in procesul de derivatizare in care drogul/toxicul este conditionat si

129

V.3.3.2. Metode practice de derivatizare V.4. Droguri din opiu si derivati

V.4.1. Introducere V.4.2. Metabolizarea opiaceelor V.4.3. Analiza prin GC-MS in cazul opiaceelor
V.5. Canabioide, marijuana si derivati

V.5.1. Introducere V.5.2. Metabolizarea canabioidelor V.5.3. Analiza prin GC-MS in cazul canabioidelor
V.6. Amfetamine si derivati

V.6.1. Introducere V.6.2. Metabolizarea amfetaminelor V.6.3. Analiza prin GC-MS in cazul amfetaminelor
V.7. Cocaina si derivati

V.7.1. Introducere V.7.2. Metabolizarea cocainelor V.7.3. Analiza prin GC-MS in cazul cocainelor
V.8. LSD si derivati

V.8.1. Introducere V.8.2. Metabolizarea LSD si derivati V.8.3. Analiza prin GC-MS in cazul LSD si derivati

130

V. APLICATII IN MEDICINA JUDICIARA

In toxicologia medico-legala, separarea, identificarea si dovedirea structurii diverselor substante, a capatat o importanta hotaritoare atit in cazul drogurilor ilegale cit si in cazul otravurilor (introduse accidental sau cu scopuri criminale). Evolutia permanent ascendenta a prformantelor instrumentelor folosite in chimia analitica pe parcursul ultimilor ani, a avut o influenta determinanta asupra dezvoltarii tehnicilor de laborator din medicina judiciara. Asa dupa cum s-a mai spus, printre metode instrumentale cele mai utilizate de catre specialistii in medicina judiciara, se numara gaz cromatografia cuplata cu spectrometria de masa (GC-MS). In cele ce urmeaza, pe linga tratarea notiunilor de baza folosite in medicina judiciara in domeniul GC-MS, un accent deosebit se va pune judiciara pe informatiile in domeniu din ultimii 10 ani. Sunt vizate atit metodele de detectare si de analiza a drogurilor cit si a metabolitilor lor in diversele fluide biologice si tesuturi. In prezent pe linga GC-MS, o raspindire destul de larga incepe sa aiba LCMS si GC-MS-MS.

V.1. Probe care se utilizeaza in medicina judiciara. Generalitati

Marea diversitate a probelor utilizate in medicina judiciara (probe biologice, de apa, de sol, etc), rigurozitate impusa de practica judiciara, impune o anumita conduita in prelevarea si pregatirea probelor ce urmeaza a fi analizate. Indiferent ca sunt prezentate ca dovezi in procese, in anchete criminalistice, in depistarea cazurilor de dopaj la sportivi, in accidente de munca, etc., probele trebuie sa indeplineasca anumite standarde si rigori, fara de care nu pot avea valoare judiciara.

131

Pregatirea probelor pentru analiza in medicina judiciara impune prelevarea adecvata a probelor, conversia analititilor din probele de studiat in forma necesara analizei, efectuarea cel putin a unei masuratori analitice ( dar de obicei sunt efectuate doua) si in final analiza, corelarea si interpretarea datelor obtinute. Procesul de pregatire este complicat si de faptul ca probele utilizate sunt mai intodeauna amestecuri complexe si din acest motiv este necesara o cunoastere aprofundata a caracteristicelor lor principale, care sa permita alegerea metodei de analiza cea mai potrivita si pe cale de consecinta si o interpretare corecta a datelor obtinute. Orice greseala in procesul de prelevare si manipularea a probelor poate duce la compromiterea lor. Consumul de droguri a fost si este una dintre provocarile majore ale societatii moderne, atit din punct de vedere social si juridic cit si din punct de vedere al sistemului de sanatate. Costurile globale legate de de abuzul de droguri (costurile cu sanatatea si sociale, costurile legate de criminalitate), au fost estimate a fi de sute de miliarde de euro anual! Si sunt in continua crestere. In cazul drogurilor si toxicelor, ca reguli general valabile pentru toate laboratoarele de criminalistica, trebuie sa se aiba in vedere urmatoarele aspecte: 1. Modalitatea in care drogul/toxicul este conditionat si transportat; 2. Tipurile de impuritati, produsi de degradare, produsi secundari sau solventi care sunt prezenti in probele de drog/toxic; 3. Modalitatea in care proba drogul/toxicul se prezinta: in forma pura, cu excipienti, cu adaos de produsi denaturati sau falsificati.
Modalitatea in care drogul/toxicul este conditionat si transportat

Practica criminologica a demonstrat ca drogul/toxicul poate fi conditionat si transportat in cele mai variate moduri, aceste modalitati fiind limitate doar de imaginatia infractorilor. Asa spre exemplu: extasy ca si tablete, capsule, pudra, mici bolovani; metamfetamina se poate prezenta ca si cristale transparente (Gheata); heroina ca si solutie injectabila, pulbere; clorhidratul de cocaina ca si

132

fulgi, cristale mari, pulbere fina, caramizi; LSD-ul ca si solutie injectabila sau impregnat in hirtie cu porozitate mare (hirtie de filtru); etc.
Tipurile de impuritati, produsi de degradare, produsi secundari sau solventi care sunt prezenti in probele de drog/toxic

O problema importanta ridicata in consumul de droguri ete calitatea lor, deoarece multe droguri contin impuritati. Aceste impuritati pot fi produsi de degradare, produsi secundari sau produsi initiali de sinteza (in cazul drogurilor sintetice), solventi. Identificarea impuritatilor este importanta din punct de vedere al efectelor toxice asupra organismului uman, unele dintre aceste impuritati producind boli grave sau chiar moartea. Asa spre exemplu, in procesul de sinteza a unui analgezic-narcotic (opioid) numit 1-metil-4-fenil-propionilpiperidina (MPPP) apare ca produs secundar (impuritate) 1-metil-4-fenil-1,2,5,6-tetrahydropiridina (MPTP) care este un toxic grav pentru organism, producind simptome ca si in boala Parkinson si moarte. H3C N H3C N

O O MPPP Analgezic-narcotic MPTP Produce moarte

Determinarea provenientei impuritatii nu este intodeauna usor de facut. Asa spre exemplu, in cazul heroinei exista inca diferente de opinii cu privire la provenienta monoacetilmorfinei (MAM). In general este admis ca 6-MAM este produsul de hidroliza al heroinei (produs de degradare) iar 3-MAM este un produs secundar de sinteza care rezulta prin acilarea incompleta a morfinei. Cu toate

133

acestea, s-a demonstrat ca 6-MAM poate fi sintetizat iar 3-MAM poate fi obtinut si prin hidroliza heroinei. Identificarea impuritatilor este importanta si din punct de vedere al investigatiilor criminalistice, deoarece poate furniza informatii importante cu privire la: provenienta probei: sintetica sau naturala; modalitatea de sinteza a drogului; zona din care provine, circulatia drogului.

Daca consideram cazul cocainei, existenta unor impuritati in probe furnizeaza informatii pretioase dupa cum urmeaza: prezenta cis- sau trans- cinamoil-cocainei indica o proba ilicita extrasa din surse naturale; prezenta acidului cinamic indica o proba licita extrasa din surse naturale; prezenta ecgoninei, si/sau metilecgoninei, si/sau benzoilecgoninei, si/sau acidului benzoic, si/sau ecgonidinei, si/sau metilecgonidinei, etilecgonidinei, si/sau metilpseudoecgoninei indica o proba licita extrasa din surse naturale si/sau produsi de degradare; prezenta (+) cocainei, si/sau pseudococainei, si/sau alococainei, si/sau pseudoalococainei indica ca proba de cocaina este de natura sintetica. Zona din care provine drogul, poate fi si ea dedusa din compozitia si cantitatea impuritatilor. Exemplu, compozitia (procentual, %) probelor de heroina (heroina si impuritatile prezente) functie de zona geografica de unde provine este prezentata in tabelul 1.

Tabelul 1. Compozitia hrionei functie de aria geografica de provenienta

Compus Heroina 6-Monoacetil -morfina Acetilcodeina Asia SE 81 2,7 6,2 India 75 4,4 3,0

Tara, compozitie % Pakistan Turcia 51 72 2,2 4,6 4,9 3,7

Iran 72 1,8 5,4

Nigeria 87 4,9 2,2

134

Cit priveste prezenta solventilor in probele de analizat, acestia exista atit in probele licite cit si ilicite, dar in cantitati mai mari in acestea din urma. Cei mai utilizati solventi in izolarea si/sau prepararea drogurilor sunt acetona, eterul si mai rar etanolul, si se gasesc in probele de analizat in proportii variabile, dar mici (sub 1%). S-a constata si o tendinta de a inlocui eterul cu metil etil cetona.
Modalitatea in care proba drogul/toxicul se prezinta: in forma pura, amestec cu alte droguri, cu excipienti, cu adaos de produsi denaturati sau falsificati

Din dorinta de a obtine efecte narcotice mai puternice sau alte tipuri de efecte, adesea drogurile se combina fie intre ele fie cu alte substante. De asemenea in practica criminologica trebuie sa se tina cont si de existenta produsilor de denaturare din probe si de posibilitatea ca anumite anumite droguri sa fie falsificate prin inlocuire cu alti produsi. Amestecul de droguri si respectiv droguri-medicamente, este frecvent intilnit, si are in vedere complementaritatea efectelor halucinogene (sau de alta natura) a substantelor amestectecate. Printre cele mai frecvente combinatii amintim: - heroina penciclidina (PCP) (Sunshine); heroina cocaina (Speedball); heroina - fentermin (Bam);

135

H N

"Sunshine"

"Speedball"

Penciclidina (PCP) Anestezic narcotic + H3 C N O O + O O O O H H H O H O + NH 2

"Bam"

Cocaina Narcotic

Heroina Analgezic narcotic

Fentermine Antiobezitate; efecte secundare: euforic, halucinogen

- morfina tripelenamina (Blue Velvet); pentazocina tripelenamina (Ts and Blues); cocaina metamfetamina (Hits or Loads);
H3C N Morfina H H Analgezic narcotic HO O H H OH + N N Tripelenamina Antihistaminic; efecte secundare: sedativ HO Pentazocina Analgezic nacotic "T's and Blues" N N "Blu Velvet"

136

- exatasy LSD ("candy flipping"); extasy PCP ("elephant flipping"); "candy flipping" O C N N HN LSD CH3 + O H N "elephant flipping" H N

+ O MDMA Penciclidina (PCP) (3,4-Methylenedioxymethamphetamine) Anestezic narcotic (componenta principala a Extasy)

- marijuana (canabis) metaqualona; marijuana penciclidina; droguri alcool; droguri deprimante ale sistemului nervos. O OH + O Tetrahidrocanabinol (componenta principala a Marijuana) N Metaqualone Hipnotic Sedativ efect secundar: halucilogen N

Amestecul de droguri cu excipienti sau cu produsi care denatureaza probele este de asemenea un caz de interes in in medicina judiciara. Ca si excicpienti se folosesc diversi componenti (in diverse forme de agregare) cum ar fi: diluanti, lubricanti, lianti, coloranti, dezintegranti si odorizanti. Iata citeva exemple de excipienti mai des intilniti: zaharuri (glucoza, lactoza, sucroza, fructoza, etc.), caolinul (sulfat de bariu), talc, amidon, celuloza, vitamina C, sulfat de calciu, carbonat de calciu, bicarbonat de sodiu, etc. De exemplu in cocaina de calitate inferioara (crack cocaine) se gaseste o cantitate importanta de bicarbonat de sodiu.

137

Produsi care denatureaza probele sunt destul de utilizati pe piata ilicita a drogurilor pentru a pacali consumatorii. Exemple: in heroina se adauga chinina care da gustul amar al probelor de heroina (pe care de obicei consumatorii il asociaza cu probele autentice); in cocaina contrafacuta se adauga acid benzoic care da miros specific asociat cu probele autentice.

V.2. Probe biologice

V.2.1. Introducere

In mod obisnuit probele biologice utilizate in medicina judiciara sunt fluide biologice si tesuturi. O caracteristica esentiala a probelor biologice o constituie faptul ca ele au o compozitie extrem de complexa iar concentratia drogurilor/toxicelor este extrem de mica. Mai mult de atit, o parte din aceste droguri/toxice sunt metabolizate (partial sau total) ceea ce duce la aparitia in fluidele biologice a unor metaboliti. Exista situatii in care drogul/toxicul se combina cu alte substante prezente in probele biologice facind si mai complicata situatia. Din aceste motive atunci cind un specialist in medicina judiciara analizeaza o proba biologica, trebuie sa aiba in vedere totalitatea acestor aspecte altfel proba devine inutilizabila in medicina judiciara. Cle mai comune fluide biologice sunt singele, plasma sau serul, urina si in ultima perioada saliva. Tesuturile si fluide postmortem (toate tipurile) sunt utilizate atunci cind este posibil iar analiza lor este adeseori dificila. Probele neconventionale, in special par, unghii si oase, au inceput si ele sa cistige teren in medicina judiciara. Alegerea tipului de proba pentru analiza judiciara trebuie facuta cu atentie si nu trebuie subestimata. In tabelul 2 prezentam un exemplu pentru alegerea tipului de proba.

138

Tabelul 2. Probe biologice: alegerea tipului de proba

Tip de proba Bila Continut gastric Creier Ficat Grasimi Muschi Oase Plamini Rinichi Singe Urina Umoare vitroasa

Tipul de drog/toxic Narcotice Drog/toxic ingerat oral Deprimante ale SNC; etanol Toate tipurile Solubile in grasimi; insecticide Toate Intoxicatii cronice cu metale Inahalanti Metale grele Toate Toate Toate

Metabolizarea drogurilor/toxicelor

Odata patruns intr-un sistem biologic, drogul/toxicul sufera procese de metabolizare si degradare (reactii chimice si enzimatice). Acest proces de metabolizare are loc la nivelul anumitor organe si sisteme ale organismului si poate fi considerat ca un proces de autoapara re al organismului, prin care drogurile/toxicele sunt transformate in substante mai putin toxice, cu structura mai simpla (unii autori il considera ca un proce de detoxifiere). In prezent, pentru cvasimajoritatea drogurilor uzulale, caile lor de metabolizare si degradare precum si structura produsilor de metabolizare, sunt cunoscute. Metabolizarea drogurilor este impartita in doua etape: faza metabolica I sau faza reactiilor metabolice, cuprinde reactiile de hidroliza, oxidare si reducere; faza metabolica II sau faza reactiilor de conjugare, care cuprinde procesele de conjugare ale substantelor cu diversi compusi din organism cum ar fi aminoacizi (glutation, glutamina, etc) si acidul glucuronic.

139

HOOC HO HO

O OH

HO Acid glucuronic
(toti substituientii sunt in ecuatorial)

HOOC N H O HS Glutation (GSH)

O H N

NH2 COOH

De obicei in faza I se produc grupari fuctionale care dau reactii de conjugare in faza II. Aceste biotransformari se pot opri la grupari functionale si conjugati ai drogului/toxicului si/sau pot fi mult mai profunde, conducind la produsi cu structura mult mai simpla. Exemplu: metabolizarea benzilpiperazinei (BZP; drog analog morfinomimetic), fig. V.2.1. Astfel, hidroxilarea sau dubla hidroxilare a BZP conduce la metabolitii 1, 2 si 6. Acesti metaboliti sub actiunea enzimei pirocatehin-

O-metil-transferaza (COMT) sufera un proces de metilare conducind la 4-hidroxi3-methoxi-BZP, 7. Toti produsii de hidroxilare ai BZP (1, 2 si 7), sunt transformati in O- glucuronoconjugati 8. Acest proces este realizat sub actiunea coenzimei UDP- acid glucuronic (acid uridin 5-fosfo--D-glucuronic) si este catalizat de enzima UDP-glucuroniltransferaza. Oxidarea BZP conduce initial la aldehida benzoica (8), care este oxidata mai departe la acid benzoic, 10. Acidul benzoic poate rezulta si prin dezaminarea oxidativa a aminelor 4 si 5 (cind initial se formeaza benzaldehida). Acesti produsi de metabolizare se elimina prin urina si se pot determina prin GC-MS. Spectrele de masa ale BZP, piperazinei, benzilaminei si acidului benzoic sunt prezentate in fig. V.2.2-5, sunt usor de recunoscut si interpretat, existind in toate bazele de date.

140

HOOC HO HO HO HO HO HO HOOC O O O P O P O O O O O OH

N O O

HO 8 O- Glucuronoconjugati ai 1, 2, 7
UDP

N N O

O
UDP-glucuroniltransferaza UDP - acid glucuronic

UDP - acid glucuronic

NH N NH
enzima COMT

NH

OH N NH

HO OH
6

O OH
7

HO
2

NH
3

HN

NH NH2

BZP

H N

NH2

COOH

10 Figura V.2.1. Schema reactiei de metabolizare a BZP

141
100 91

134

50

N 56 28 42 51 60 65 71 77 70 80 90 85 104 120 NH 146

176

15

10 20 30 40 50 (m ainlib) 1-Benzylpiperazine

100 110 120 130 140 150 160 170 180 190

Figura V.2.2. Spectrul de masa al BZP

100 44

HN 50 29 NH 56 86 42 15 0 10 20 (m ainlib) Piperazine 30 40 50 60 70 80 83 90 100

Figura V.2.3. Spectrul de masa al piperazinei

100 106

H2N 50 79 30 39 0 20 30 (m ainlib) Benzylam ine 40 50 60 70 51 65 77 74 80 91 89 90 100 104 110 120

Figura V.2.4. Spectrul de masa al benzilaminei

142

100 77 HO O

105

122

51 50

39 27 0 20 30 (m ainlib) Benzoic Acid 40 50 60 70 45 65

74 94 80 90 100 110 120 130

Figura V.2.5. Spectrul de masa al acidului benzoic

In tabelele 3 si 4 prezentam principalele biotransformari corespunzatoare fazelor metabolice I si II.

Tabelul 3. Probe biologice: biotransformari corespunzatoare fazei I

Tip de ractie Oxidare ArH -CH3 -CH2-R -C-O(S)-R - CH2-NH2 - CHR-NH2 -NH-R R-C(=S)-R R-S-R Reducere -CH(R)=O -NO2 R-S-S-R Ar-N=N-R Hidroliza -COOR -CONR2

Transformare Hidroxilare Idem Iden O(S)- Desalchilare Desaminare Idem N-Desalchilare Desulfurare Sulfoxidare Reducere aldehide Reducere nitroderivati Reducere sulfuri Reducere azoderivati Hidroliza esteri

Produs care rezulta Ar-OH -COOH -CH(OH)-R C-O(S)-H -CHO -COR -NH2 R-C(=O)-R R-S(=O)-R -CH2-OH(R) -NH2 R-SH R-NH2 -COOH + HO-R -COOH + HNR2

143

Hidroliza amide

Tabelul 4. Probe biologice: biotransformari corespunzatoare fazei II

Gruparea functionala -O(S)H

Reactia conjugata Glucuronoconjugare Glicozidoconjugare Sulfoconjugare Metilare Acetilare

Agentul de conjugare Acid glucuronic Glucoza Sulfate S-Adenozilmetionina; acid tetrahidrofolic-5metilat Acetil coenzima A Acid glucuronic Glucoza Glicina; Glutamina; Ornitina; Taurina Acid glucuronic Sulfate S-Adenozilmetionina; acid tetrahidrofolic-5metilat Acetil coenzima A Glutation

-COOH

Glucuronoconjugare Glicozidoconjugare Aminoacidconjugare Glucuronoconjugare Sulfoconjugare Metilare Acetilare

-NH2

ArX

Glutationconjugare

Administrare, transport, absortie, distributie si excretie

Orice substanta (drog/toxic/medicament, etc) poate patrunde intr-un organism viu pe diverse cai, cele mai importante fiind orala (ingestie), parenterala (intravenos, intramuscular, subcutan, etc), respiratorie, contact cu pielea sau mucoasele. Odata introdus in organism aceste substante sufera fenomentul de absortie, transport, distributie, metabolizare, eliminare. Procesul de absortie a unei substante incepe practic din momentul in care substanta a fost introdusa in tesutul viu, si depinde de tipul substantei (hidrosolubila, liposolubila, marime, pH, etc), modul de administrare, mecanismul de absortie si de locul unde este absorbita majoritar substanta, dupa cum urmeaza:

144

- ingetia orala coduce la o absortie majoritar la nivelul stomacului si intestinului, prin mecanism de difuzie; - inhalarea coduce la o absortie majoritar la nivelul plaminilor, prin mecanism de difuzie si/sau filtrare; - administarea parenterala coduce la absortia cea mai eficienta, administarea intravenoasa introduce direct substanta in circulatie iar administrarea intramusculara si subcutanata presupune difuzia substantei prin muschi sau

tesuturi urmata de intrarea ulterioara in circuitul sanguin; - administarea la nivelul tegumentelor si mucoaselor, coduce la absortia prin difuzie a substantei. Din aceste motive in medicina toxicologica este necesar a se tine cont de aceste aspecte atunci cind se recolteaza probe pentru analize. Este unanim acceptat astazi ca majoritatea substantelor pot fi detectate din probe de singe, dar in functie si de perioada de timp care a trecut de la administrarea substantei. Odata ajunse in singe substantele sunt distribuite spre diverse tesuturi. Procesul de distributie dpinde din nou de tipul substantei, de tipul tesutului, etc. In tabelul 5 este prezentat un exemplu privitor la distributia (procentual) a cocainei si amfetaminei in diverse organe (valori medii).
Tabelul 5. Probe biologice: distributia cocainei si amfetaminei in singe, diverse organe si urina

Drog Amfetamina Cocaina

pKa drog 9,9 8,6

Singe 9 5

Creier 3 7

Ficat 30 5

Rinichi 17 15

Urina 35 50

Practic, majoritatea substantelor ajung prin singe in ficat, unde fie sunt metabolizate fie sunt excretate ca atare inapoi in singe sau in bila, de unde sunt eliminat prin materii fecale si urina. In principiu, substantele hidrosolubile se elimina in bila si apoi in fecale, pe cind cele liposolubile sunt retrimise in singe si se elimina prin urina.

145

V.2.2. Fluide biologice

Fluidele biologice sunt practic cele mai utilizate probe specialistii in domeniu.

in medicina

judiciara si de aceea buna lor cunoastere este o sarcina obligatorie pentru toti Analiza acestor probe depinde de mai multi factori, dar in general este admis ca cu cit o proba este mai fluida cu atit este mai usor analizata. In tabelul 6 este presentata ordinea descrescatoare a scaderii fluiditatii probelor biologice. Se observa ca cel mai usor de anlizat va fi lichidul cefalorahidian (LCR) si cel mai greu sunt oasele. Singele se afla undeva in a doua jumatate, si de aceea ait cit se poate este de evitat.
Tabelul 6. Fluide biologice: ordinea descrescatoare a scaderii fluiditatii

Lichide

LCR Lacrimi Sudoare Saliva Urina Bila Plasma/ser Singe Materii fecale Inima/ficat/rinichi Plamini/muschi Oase
Singe, plasma, ser

Amestec

Singele este un fluid cu o compozitie extrem de complexa, fiind, datorita utilitatii si accesibitatii lui, cel mai utilizat tip de proba in medicina judiciara moderna. Principalii constitenti ai singelui, eritrocitele (singele rosu) si fluidul clar (plasma sau serul), pot fi separati cu usurinta prin centrifugare. In practica

146

toxicologica este preferata utilizarea plasmei, desi sunt cazuri in care este necesara utilizarea ambelor componente majore ale singelui. Chiar in cazul utilizarii plasmei, deoarece ea contine un amestec complex de proteine si adeseori substantele se leaga de proteine, analiza directa a plasmei nu va da continutul total in substanta. Din acest motiv, adesea proteinele plasmatice se denatureaza inainte de a fi extrase cu un solvent organic.
Urina

Spre deosebire de singe/plasma, urina are un continut mult mai mic de proteine ceea ce o face mult mai usor de analizat (in prealabil se face extractie din urina cu un solvent organic). Desi mult mai usor de analizat, folosirea probelor urinare ridica o serie de probleme, deoarece interpretarea rezultatelor este complicata de mai multi factori cum ar fi: cantitatea de urina, pH-ul acesteia, si timpul care a trecut de la administrarea substantei. Cu toate acestea folosirea probelor de urina este larg folosita in special in cazul tetarilor de medicamente si la determinarea dopingului la sportivi.
Saliva

Folosirea probelor de saliva prezinta avantaje si dezavntaje comparativ cu probele clasice de singe si urina. Probele de saliva se utilizeaza fara a fi nevoie de extractie, pot fi determinate atit substantele cit si metabolitii lor, colectarea lor este mai putin invaziva, degradarea probelor decurge mai greu.
V.2.3. Tesuturi postmortem

Alegerea unui tesut postmortem pentru analiza depinde de tipul de drog/toxic/medicament cautat. Asa spre exemplu, in cazul in care se suspecteaza o moarte datorita unei supradoze de morfinomimetice este recomandata folosirea ca si proba de analizat a bilei, in cazul otravirilor cu cianuri si solventi se prefera probele de creier iar pentru otraviri cu metale grele se prefera probe din rinichi.

147

Cele mai utilizate tesuturi postmortem pentru analize sunt recoltate din ficat, creier, bila, umoarea vitroasa, singe, continut stomacal precum si muschii si rinichii (mai putin utilizati).
Ficatul si bila

Ficatul este unul din organele preferate in analiza forensica, in special in cazul drogurilor. Fiind un organ vascularizat puternic, concentratia drogurilor este in general egala cu cea din plasma. Unele droguri pot fi gasite ca atare sau sub forma de metaboliti in bila, cazul opiaceelor.
Creierul

In cazul otravirilor cu cianuri si solventi creierul este organul preferat pentru analize. De asemenea, creierul fiind relativ rezistent la putrefactie, este organul preferat in analiza de droguri atunci cind analiza se face la citeva zile dupa moartea persoanei.
Umoarea vitroasa

Ca si in cazul creierului, umoara vitroasa este rezistenta la putrefactie si in consecinta probele sunt mai usor de analizat. Trebuie sa se tina cont ca umoarea vitroasa este slab acida si in consecinta substantele usor bazice se vor gasi in concentratii marite.
Continut stomacal

Continutul stomacal da informatii atit asupra tipului de substanta ingerata cit si asupra modului de adminstrare. Preznta de urme sau lipsa unui drog/toxic/medicament indica ca ruta de administrare este alta decit cea orala. Folosirea probelor de tesuturi postmortem este limitata de o serie de dificultati datorate procesului de putrefactie a celulei. Cele mai importante dificultati sunt: 1. Datorita procesului de putrefactie se produc compusi care pot interfera cu substanta (drog/toxic/medicament) de analizat; 2. Exista substante care se descompun in urma procesului de putrefactie; 3. Pretratamentul probelor postmotem poate presupune proceduri mai dure care face ca substanta de analizat sa nu reziste;

148

4. Substantele si metaolitii pot suferi procese de redistributie in tesuturile postmortem, ceea ce ingreuneaza interpretarea datelor obtinute. Substantele rezultate in urma procesului de putrefactie pot avea caracter bazic (amine biogene in special), acid (acizi organici inferiori) sau neutru. De exemplu, din categoria substantelor avind caracter bazic rezultate in urma procesului de putrefactie, unul dintre compusii reprezntativi este feniletilamina, care pot interfera cu substante din clasa amfetaminelor dind reactii fals pozitive.

NH2 Amfetamina

NH2 -Feniletilamina

V.2.4. Probe neconventionale

Sub denumirea de probe neconventionale sunt cunoscute acele probe care sunt utilizate mai rar in medicina judiciara. Aici intra o serie de probe cum ar fi parul, unghiile, oase, o serie de fluide biologice cum ar fi probe de transpiratie, saliva, lichid seminal. Desi extrem de utile, informatiile furnizate din analiza acestor probe pierd mult din valoare datorita faptului ca inca nu exista o standardizare unanim acceptata a metodelor lor de analiza. Dintre aceste tipuri de proba, parul este de departe proba judiciara cea mai utilizata.
Parul

Astazi, GC / MS-ul este deja metoda preferata de analiza a probelor de par, tinzind sa devina una de rutina. Exlicatiia utilizarii pe scara din ce in ce mai larga a firelor de par ca probe in medicina judiciara, consta in avantajele pe care le prezinta: practic toate tipurile de drog/toxic se acumuleaza in par si pot fi detectate ca atare (nu ca metaboliti sau produsi de degradare), perioada de remanenta a

149

drogului in par este mare (saptamini sau chiar luni), probele de par sunt se recolteaza si se pastreaza usor, etc. In Tabelul 7 sunt prezentate sintetic avntajele si dezavantajele utilizarii probelor de urina si par.
Tabelul 7. Avntajele si dezavantajele utilizarii probelor de urina si par

Drog Compus majoritar Perioada de detectie Grad de invazivitate Pastrare probe Risc de alterare a probei

Urina Toate (cu exceptia unor steroizi) Metaboliti 2-5 zile Ridicat 20 oC Mare

Par Toate (cu exceptia hormonilor) Drogul parinte Saptamini, luni Mic Temperatura camerei Mic

Cu toate avantaje incontenstabile pe care le prezinta utilizarea parului in medicina judiciara, utilizarea lui este inca limitata datorita unor neajunsuri: nu se cunosc cu exactitate procesele biochimice de absortie si metabolizare a drogurilor in par; influenta contaminantilor externi. In prezent este admis ca drogurile/toxicele pot intraS in par pe doua cai: incorporarea in procesul de crestere (din singe) si adsorbtie din mediul extern (secretiile din transpiratie si seebum, expunerea la aerosoli, fum, etc); procedurile de colectare pentru analiza firului de par nu au fost standardizate. In majoritatea studiilor publicate, probele sunt obtinute din puncte aleatorii de pe scalp, cel mai adesea din zona de la partea din spate a capului, numit vertex posterior .

150

V.3. Pregatirea probelor

Pregatirea probelor reprezinta o etapa de important cruciala in analiza GC/MS. Pregatirea probelor este o operatiune complexa care necesita din partea specialistului care efetueaza aceasta operatiune cunostinte avansate de separatologie, si in special o temeinica stapinire a operatiilor/metodelor de baza privind izolarea si purificarea compusilor organici. Doua dintre aceste metode sunt indispensabile pentru specialistii in medicina judiciara: extractia si cromatografia.

V.3.1. Extractia si cromatografia in strat subtire

Pregatirea probelor pentru analizele medicolegale GC-MS (si nu numai) presupune cunoasterea notiunilor fundamentale privitoare la extractie si cromatografie, ca metode de baza pentru izolarea si purificarea compusilor.
V.3.1.1. Extracia

Extracia este una din operaiile de baz ale practicii chimiei organice fiind una din principalele metode de separare i purificare a substanelor organice. Extracia este operaia prin care unul sau mai muli componeni ai unei faze (lichide sau solide) sunt transferai ntr-o alt faz (lichid), nemiscibil sau parial miscibil, adus n contact cu prima. n funcie de starea de agregare a produsului din care se face extracia, se deosebete: 1. extracia solid lichid (elutriere); 2. extracia lichid lichid; 3. extracia gaz lichid.

151

Repartiia unei substane dizolvate n doua faze este dat de legea de distribuie a lui Nernst ce const n raportul concentraiilor la echilibru a substanei n cele dou faze lichide (A i B) nemiscibile ce este constant la o temperatur dat.

CA = K , unde K coeficient de repartiie. CB

ns, legea lui Nernst nu este valabil la concentraii mari ci numai la concentraii mici (comportare ideal) n care substana dizolvat n ambele faze formeaz asocieri identice. Extracia unei substane se realizeaz cu succes atunci cnd substana de separat este mult mai solubil ntr-una din faze dect n cealalt, adic K difer mult de valoarea 1. Astfel atunci cnd K<100 o singur extracie nu mai poate fi eficient i trebuie repetat de mai multe ori cu o soluie proaspt. n cazul n care avem de-a face cu dou substane ai cror coeficieni de repartiie (K1 i K2) sunt net diferii, atunci separarea se realizeaz printr-o extracie simpl.
K1 K2

Atunci cnd 100 substanele se pot separa mulumitor dintr-o singur extracie, iar cnd 100 se apeleaz la un procedeu multiplicativ. Deoarece, schimbul de substan se realizeaz numai la interfaa de separaie a celor dou faze, pentru a mri viteza de repartiie este necesar o agitare energic i o interfa ct mai mare. Din pcate, n majoritatea cazurilor (n special n cazul substanelor solide) echilibrul de repartiie nu poate fi atins n totalitate.
Extracia solid lichid

Extracia solid-lichid urmrete separarea unei substane organice ntr-un anumit solvent n care componentul este solubil. Un solvent bun pentru extracie

152

trebuie s ndeplineasc urmtoarele condiii: s solubilizeze cu uurin substana de extras; s fie selectiv; s nu reacioneze cu substana de separat; s asigure o ndeprtare facil dup extracie; s fie ieftin i disponibil comercial. Se cunosc diverse procedee de extracie a solidelor cu solveni. Extracia din substane solide cu ajutorul solvenilor se realizeaz cu ajutorul mai multor tipuri de operaii:
Macerarea i digerarea Macerarea este cel mai simplu procedeu de extracie ce const n

amestecarea fazei solide cu solventul urmat de filtrarea soluiei obinute. Acest procedeu necesit o dispersare ct mai accentuat a substanei solide prin adugare repetat de solvent i agitare continu.
Digerarea este de fapt macerarea la cald.

Ambele operaii pot fi realizate cu uurin deoarece nu necesit aparatur complicat, avnd nevoie doar de un pahar Berzelius n care se face extracia i plnie Bchner i flacon Erlenmeyer de vid pentru realizarea filtrrii. Cele dou procedee sunt des folosite n extracia substanelor organice din plante sau organele animale.
Procedeul Soxhlet
3

Pe scar larg se aplic extracia continu n aparatur special (extractoare Soxhlet) n care, de obicei, solventul proaspt este furnizat prin fierberea extractului. Extractorul Soxhlet se compune dintr-un balon (1), un corp de extracie (2) i un refrigerent ascendent (3), legate ntre ele. Materialul solid, mrunit n prealabil pentru ca solventul

Extractor Soxhlet

153

s vin n contact cu o suprafa ct mai mare, se aeaz n spaiul de extracie, fie introdus ntr-un cartu special de hrtie de filtru, fie vrsat direct n spaiul de extracie prevzut cu un fund de sticl poroas. Faza extractoare (solventul) din balonul de fierbere distil printr-un tub lateral, prevzut eventual cu o izolaie termica, iar vaporii condensai n refrigerentul de reflux picur peste materialul din cartu. Cnd spaiul de extracie se umple pn la nlimea stratului de preaplin, soluia cu extract trece prin sifonare n balonul de fierbere i procesul se repet. Uneori sunt suficiente cteva ore pentru extracia complet, ns la substanele care trec mai greu n soluie sunt necesare chiar cteva zile. La unele aparate Soxhlet, de construcie imperfect, se ntmpl ca, dup umplerea tubului de preaplin, soluia cu extract s nu se scurg dintr-o dat, ci numai n picturi, n ritmul n care picur dizolvantul din refrigerentul de reflux. Acelai defect apare i atunci cnd cartuul de extracie este greu permeabil, sau dac este lipit de gura sifonului. Acest defect nrutete extracia. El se poate nltura suflnd n refrigerent. Principalii factori care influeneaz o extracie solid lichid sunt: solubilitatea solidului n solvent; viteza de transfer a solidului n faz lichid.

Solubilitatea solidului n solvent poate fi influenat din exterior prin alegerea unor solveni adecvai. Viteza de transfer a solidului n faza lichid depinde de mai multe fenomene i mrimi fizice, ca de exemplu mrimea granulelor solidului, sistemul cristalin, viteza de ptrundere a solventului n solid, difuzia substanei solide n lichid, etc. Extraciile uzuale de laborator vizeaz influenarea, n sens favorabil, a trecerii solidului n solvent, de exemplu prin mrirea suprafeei solide, prin extracie continu cu solvent proaspt, prin agitare viguroas. Ridicarea temperaturii mrete att solubilitatea compusului (fenomen termodinamic), ct i viteza sa de transfer n faza lichid (fenomen cinetic). Extracia alcaloizilor din frunze, a substanelor aromate din semine, a esenelor de parfum din flori, a zahrului din trestia de zahr se constituie drept

154

exemple de extracii solid lichid, utilizate n industria chimic organic pentru separarea i izolarea substanelor din amestecuri naturale. Solvenii utilizai n mod frecvent sunt: CH2Cl2, CHCl3, CS2, CH3COCH3, alcooli, apa.
Extracia lichid lichid

Extracia lichid-lichid operaia este cea mai des aplicat, n laborator i industrie, n scopul separrii i concentrrii unor componeni din faza iniial, unde acetia se aflau alturi de impuriti. Aceast operaie are la baz diferena de solubilitate a componentului extras n unul sau mai muli solveni nemiscibili sau parial miscibili ntre ei. Faza care conine iniial componenii interesai se numete faz de extras, iar faza cu care aceasta se aduce n contact poart numele de faz extractoare sau
solvent. La terminarea extraciei, faza care a preluat componenii se numete extract iar faza rmas rafinat.

Alegerea unui solvent bun pentru extracie, nu se face ntmpltor, impunndu-se urmtoarele condiii: s solubilizeze foarte bine substana de extras; s fie, pe ct posibil, nemiscibil cu solventul din care substana trebuie extras; s extrag ct mai puine impuriti; s fie uor de eliminat dup terminarea extraciei; s nu reacioneze cu substana ce trebuie extras; s fie accesibil i la un pre de cost ct mai redus.
Echilibre de repartiie. Coeficient de repartiie

Se consider un compus de extras A ce este solubil n doi solveni nemiscibili sau parial miscibili ntre ei. ntr-o prim etap peste soluia iniial a compusului A se adaug cel de-al doilea solvent curat i astfel moleculele compusului de extras A

155

vor strbate suprafaa de separaie, trecnd n cel de-al doilea solvent. Pe msur ce concentraia de A n cel de-al doilea solvent crete, ncepe i procesul invers de trecere a moleculelor de A napoi n primul solvent. Dup un timp viteza celor dou procese este egal, compoziia n cele dou faze rmnnd constant, i astfel se stabilete un echilibru dinamic de repartiie atunci cnd compusul de extras A se gsete distribuit n anumite proporii n ambii solveni. Prescurtrile uzuale, cele mai des ntlnite, sunt urmtoarele: R rafinat; S extract; CR Concentraia componentului A n stratul R; CS Concentraia componentului A n stratul S; Coeficientul de repartiie K reprezint raportul dintre concentraia CS a componentului A n stratul S i concentraia CR a componentului A n stratul R.
K= CS CR

n condiiile n care considerm AS i AR ca fiind cantitile absolute de component A dizolvate n cei doi solveni, iar VS i VR volumele solvenilor respectivi, atunci concentraiile CS i CR se pot exprima astfel:
CS = AS A i respectiv CR = R VR VS

i n aceste condiii coeficientul de repartiie K va lua urmtoarea form:

AS V A V K= S = S R AR AR VS VR

Deoarece coeficientul de repartiie K nu indic mrimea cantitilor de component A distribuite n cei doi solveni, ntruct acestea depind i de volumele de solvent, prin rearanjarea relaiei de mai sus se obine:
AS V = K S = G , unde G este cifra de repartiie. AR VR

n calcule, cantitile absolute AS i AR sunt nlocuite cu cantitile relative p i q, cu remarca c p+q = 1:

156

p=

AS A 1 G = ; q= R = Atotal G + 1 Atotal G + 1

Extracia lichid-lichid n laborator

Pentru o extracie ct mai eficient se recomand se recomand efectuarea mai multor extracii succesive cu poriuni mici din cantitatea total de solvent de extracie. n laboratoare extraciile se efectueaz prin agitarea soluiei cu solventul de extracie n plnii de separare, care datorit formei specifice ofer o suprafa de separaie mare se fac prin agitarea soluiei cu solventul de extracie. Este recomandat ca umplerea cu lichid a plniei de separare s nu se fac mai mult de din volumul su. Pentru o extracie eficient este necesar asigurarea unui contact optim ntre cele dou faze este necesar agitarea intens a plniei timp de 3-5 minute, dup care aceasta se las n repaus pn la separarea complet a celor dou faze. n cazul apariiei de emulsii nu mai este recomandat agitarea, ci n acest caz este suficient efectuarea unor micri circulare n plan orizontal. Din timp n timp este necesar efectuarea aerisirii, prin inversarea poziiei plniei i deschiderea temporar a robinetului. Aceast operaie este absolut necesar mai ales n cazul solvenilor extrem de volatili (eter etilic, eter de petrol etc.). Dup separarea complet a celor dou faze, se scoate dopul de la partea superioar a plniei i faza inferioar este separat cu grij ntr-un flacon Erlenmeyer sau Berzelius. Chiar dac numai una din faze prezint interes, dup terminarea separrii
Stativ Pahar Berzelius Palnie de separare
robinet corpul plniei dop rodat

157

vor fi pstrate ambele faze pn cnd avem dovezi certe c substana vizat se gsete acolo unde trebuie. Faza apoas poate fi uor deosebit de faza organic nemiscibil pe baza densitilor celor dou faze (faza cu densitatea cea mai mare va constitui faza inferioar), sau i mai simplu prin efectuarea unui simplu test de laborator, prin adugarea ctorva mililitri de ap ntr-o eprubet i colectarea ctorva picturi din faza inferioar, astfel faza apoas va forma o soluie omogen , iar faza organic un sistem bifazic. Atunci cnd limita de separaie dintre cele dou faze se apropie de robinet, se reduce mult viteza de separaie. La final, pentru a se evita o eventual impurificare, faza superioar se toarn prin gura plniei ntr-un alt flacon, faza organic se usuc utiliznd un agent de deshidratare convenabil (Na2SO4 anh., CaCl2 anh., MgSO4 anh. etc.), iar ulterior se ndeprteaz solventul prin distilare.
V.3.1.2. Cromatografia in strat subtire - metode cromatografice

Cromatografia este o metod de separare i purificare a substanelor organice, introdus relativ recent n practica de laborator. Denumirea de cromatografie a fost dat de botanistul rus vet i n limba rus nseamn culoare. vet a aplicat aceast metod la separarea coloranilor vegetali (clorofile, carotinoide) printr-o coloan cu carbonat de calciu. Cromatografia se bazeaz pe repartiia diferit a moleculelor ntre o faz staionar i o faz mobil. n funcie de afinitatea fa de faza staionar i cea mobil, diferitele specii moleculare ale unui amestec sunt antrenate cu viteze diferite, prin deplasarea fazei mobile, realizndu-se astfel separarea lor. n funcie de natura solid, lichid sau gazoas a acestor faze, au fost dezvoltate mai multe tehnici cromatografice. Dintre acestea cele mai utilizate de chimistul organician sunt: 1. Cromatografia n strat subire (Thin layer chromatography, TLC);

158

2. Cromatografia solid-lichid pe coloan (Liquid column chromatography, LC); 3. Cromatografia gaz-lichid (Gas liquid chromatography, GLC sau GC); 4. Cromatografia lichid de nalt performan (High performance liquid
chromatography, HPLC)
1. Cromatografia n strat subire

Primele ncercri n acest domeniu dateaz din anul 1938 i aparin lui Izmailov i Schraiber, iar prima carte a fost publicat n 1962 de ctre Stahl. Dei intrat relativ trziu n practica de laborator, cromatografia n strat subire s-a dezvoltat foarte rapid. Astfel ntr-un timp foarte scurt ea s-a impus ca o extrem de util att n cercetare ct i n producie. Ca principiu i ca tehnic, cromatografia n strat subire se aseamn foarte mult cu cromatografia pe coloan. n acest caz, faza staionar este un adsorbant (silicagel, alumin) dispus pe un suport plan din sticl sau metal, iar faza mobil circul de obicei prin capilaritate. Cromatografia n strat subire este o metod util, utilitatea acesteia rezid din urmtoarele avantaje: Permite separri pentru cantiti foarte mici de substan (0,01 g); Este o metod accesibil i uor de realizat; Se efectueaz ntr-un timp scurt; Permite separarea substanelor instabile; Permite analiza simultan a mai multor probe; Permite analiza stadiului unei reacii chimice; Direct pe placa cromatografic se pot efectua reacii chimice, cum ar fi: oxidri, reduceri, deshidratri, etc.
Tehnica general a cromatografiei n stat subire

Aceast tehnic a fost pus la punct de Stahl i const n obinerea unui strat

159

de adsorbant (silicagel, oxid de aluminiu) de aproximativ 250 m grosime pe o plac de aluminiu sau sticl de dimensiuni variabile. Numrul adsorbanilor folosii ca faz staionar este relativ redus. Adsorbanii se pot clasifica n adsorbani anorganici i adsorbani organici. Dintre acetia, adsorbanii anorganici sunt cel mai des folosii deoarece sunt adsorbani puternici comparativ cu adsorbanii organici ce sunt n general adsorbani slabi. Adsorbantul trebuie s aib o suprafa specific mare, respectiv o granulaie fin, (sub 100 m) i numr mare de pori pe diametru mic.
Pregtirea plcuelor

ntr-un flacon Erlenmeyer de 200 ml se introduc 25 g silicagel G (cu gips) peste care se adaug o soluie format din 50 ml ap i 0,5 g amidon. Se agit flaconul 1-2 minute i apoi coninutul se toarn pe o plac din sticl de mrime 20/20 cm i se omogenizeaz ct mai bine prin micri de translaie (balansare), iar la sfrit se poate da i cu o baghet din sticl pentru o omogenizare mai bun. Se las placa s se usuce 24 ore la temperatura camerei i apoi se usuc timp de 30 minute n etuv la temperatura de 105 - 110C. Se las apoi la rcit i se utilizeaz ct mai repede.
Modul de lucru:

Pentru realizarea cromatografiei n strat subire trebuiesc parcurse urmtoarele etape: a) Se traseaz cu creionul linia de start pe care ulterior va fi aplicat substana. Linia de start se traseaz la aproximativ 1 cm de captul inferior al plcuei cromatografice. b) Se taie placua cromatografic n funcie de numrul de probe ce urmeaz a fi aplicate. c) Se taie cu foarfecele colurile colurile plcuei la un unghi de aproximativ 45o, pentru ca migrarea solventului sa fie uniform n linie dreapt.

160

d) Amestecul de substan de analizat se dizolva ntr-un solvent ct mai nepolar i uor volatil. Folosirea solvenilor volatili prezint un dublu avantaj: pe de o parte evit efectele nedorite de difuzie i pe de alt parte permite creterea concentraiei substanei n punctul de aplicare, datorit evaporrii rapide a solventului. e) Aplicarea substanei pe plcua cromatografic se realizeaz cu ajutorul tuburilor capilare pentru a se realiza concentrarea substanei pe o suprafa minim. n toate cazurile, indiferent de solventul folosit, este necesar ndeprtarea complet a dizolvantului nainte de nceperea eluiei.
Elueni folosii

Deoarece viteza de migrare a unei substane pe un adsorbant ct i rezoluia separrii depind de eluentul sau amestecul de elueni folosii, acesta trebuie s ndeplineasc mai multe condiii: S permit oinerea valorilor Rf ale componentelor de separat ntre 0,05 i 0,9; S separe complet toate componentele din amestec; S nu produc transformri chimice ale substanelor de separat; Nu trebuie s reacioneze cu reactivii de identificare. In tabelul 8 sunt prezentate citeva amestecuri eluotrope mai des utilizate in cromatografie.
Tabelul 8. Amestecuri uzuale de solveni pentru cromatografie

Hexan Hexan clorur de metilen =5:2 Benzen Benzen cloroform = 1:1 Cloroform Ciclohexan acetat de etil = 8:2

Cloroform metanol = 95:5 Cloroform aceton = 7:3 Benzen acetat de etil = 1:1 Acetat de butil metanol = 99:1 Benzen eter = 1:9 Eter metanol = 99:1

161

Cloroform aceton = 95:5 Benzen aceton = 9:1 Ciclohexan acetat de etil = 1:1 Ciclohexan ester pentru testri = 8:2 Benzen aceton = 8:2 Cloroform metanol = 9:1 Cloroform aceton = 4:6 Benzen acetat de etil = 1:1 Cloroform eter = 6:4 Acetat de butil
Developarea

Eter Eter dimetil formamida = 99:1 Acetat de etil Acetat de etil metanol = 99:1 Benzen aceton = 1:1 Cloroform metanol = 9:1 Dioxan Aceton Metanol Dioxan ap = 9:1

Dup ce a fost pregtit plcua cromatografic, aceasta se introduce n cuva cromatografic (de forma paralelipipedic sau cilindric). Plcua cromatografic se imerseaz n cuva cu eluent cu captul la care s-au aplicat probele, iar cuva se acoper pentru a asigura n interiorul cuvei o atmosfer saturat n vapori de eluent. Este recomandat ca stratul adsorbant s fie imersat ct mai puin posibil (3-4 mm, astfel nct eluentul s nu depesc linia de start). Oprirea developrii se realizeaz atunci cnd frontul solventului ajunge la aproximativ 1 cm de marginea superioar a plcua cromatografice. Se scoate placua cromatografic din cuv i se marcheaz cu un creion frontul solventului (linia pna la care a urcat solventul pe plcu). Plcua cromatografic se usuc dup developare n curent de aer liber sau n curent de aer cald (feon), n funcie de volatilitatea eluentului.
Identificarea compuilor dup developare

Cel mai simplu caz este cel al compuilor colorai, care se observ direct pe cromatogram, ns se ntlnesc situaii n care compuii, pentru a putea fi vizualizai, trebuie expui radiaiei ultraviolete (UV).

162

Exist i compui care trebuiesc scoi n eviden prin reacii de culoare specifice gruprilor funcionale. n aceast situaie pe cromatogram se aplic reactivii de culoare, fie prin pulverizare, fie prin imersia plcuei cromatografice n soluia acestora. Dup uscare se observ diferite spoturi, corespunztoare componentelor din amestecul de analizat.
Determinarea valorilor Rf

Poziia unui spot pe plcua cromatografic se exprim printr-o mrime ce caracterizeaz substana, i o difereniaz de celelalte, mrime numit factor de vitez (Rf) i care se definete ca raportul dintre distana parcurs de spotul substanei i distana parcurs de developant (vezi Figura V.3.1.). Rf=XS/XD 0 Rf 1 Unde: XS reprezint distana parcurs de la zona de start pn la punctul unde ea se gsete n momentul opririi developrii. XD reprezint distana parcurs de la zona de start, de frontul developantului n acelai interval de timp.
Linia developantului Rf 1= Xs 1 / X D Rf 2=Xs 2/X D

XD Xs1 Xs2

Linia de start

Figura V.3.1. Separarea izomerilor geometrici prin cromatografie n strat subire

2. Cromatografia solid-lichid

Mecanismul de separare a substanelor

163

Se bazeaz pe repartiia diferit a componenilor unui amestec ntre o faz staionar (solid adsorbant sau lichid depus pe suprafaa unui adsorbant) i o faz mobil (lichid, eluent). Faza mobil strbate faza staionar, iar astfel componenii amestecului de separat vor fi repartizai diferit n funcie de viteza lor de migrare. Cu ct componentul este mai puin adsorbit pe faza staionar cu att viteza de migrare este mai apropiat de cea a fazei mobile, iar cu ct componentul va fi mai puternic adsorbit pe suprafaa fazei staionare cu att moleculele sale vor sta un timp mai ndelungat imobile. Afinitatea diferit a componentelor dintr-un amestec fa de faza staionar difer n funcie de capacitatea de adsorbie a fazei solide. Substana solid care adsoarbe se numete adsorbant. Astfel, se deosebesc adsorbani polari i nepolari: adsorbani nepolari: crbune activ, anumite rini organice (de exemplu wofatit EW); adsorbani polari: oxid de fier (Fe2O3), oxid de aluminiu (Al2O3), silicagel, hidrai de carbon (amidon, zahr, celuloz). Dintre aceti adsorbani o importan deosebit o au cei polari. Adsorbanii polari au afinitate mare fa de componentele polare din amestec, acestea fiind puternic adsorbite pe suportul solid, iar componentele nepolare sunt antrenate foarte uor de faza mobil. Pe lng polaritate, adsorbabilitatea substanelor organice depinde i de mrimea moleculelor i polarizabilitatea lor. Astfel se pot ordona substanele organice n ordinea cresctoare a afinitii lor fa de adsorbanii polari: derivai halogenai ai hidrocarburilor < eteri < amine teriare, nitroderivai < esteri < cetone, aldehide < amine primare < amide acide < alcooli < acizi carboxilici. Aceleai consideraii sunt valabile i pentru solveni adic o substan organic se adsoarbe mai puternic dintr-un solvent nepolar dect dintr-unul polar. Astfel substana adsorbit va fi dezlocuit de moleculele de solvent, dac acestea au afinitate mai mare fa de adsorbant dect de substan.

164

Pentru o selecie cat mai uoar au fost stabilite serii eluotrope, corespunztor cu creterea polaritii (Tabelul 9).
Tabelul 9. Seria eluotrop

1) eter de petrol 2) hexan, ciclohexan 3) sulfur de carbon 4) tetraclorur de carbon 5) dicloretilen 6) toluen 7) benzen 8) clorur de metilen 9) cloroform 10) eter etilic

11) tetrahidrofuran 12) acetat de etil 13) aceton 14) metiletilceton 15) n-butanol 16) etanol 17) metanol 18) ap 19) acid acetic glacial 20) piridin

Condiia principal impus solvenilor este anhidritatea complet, deoarece urmele de ap reduc semnificativ calitile de adsorbie ale fazei staionare.

V.3.2. Pretratamentul si prepararea probelor

Conversia analititilor din probele de studiat in forma necesara analizei este cunoscuta in literatura de specialitate ca si operatiunea de pretratament. Este o opreratiune dificila si laborioasa in special datorita faptului ca drogul/toxicul se gaseste aproape intodeauna impreuna in amestec cu alte substante, in asa zise matrici. In cazul compusilor de sinteza drogul/toxicul se gaseste combinat cu diversi excipienti si/sau substante falsificate, iar pentru compusii naturali din plante cu alte substante din planta. In plus, in plante cantitatea de drog/toxic este foarte mica, in cele mai multe cazuri sub 1% din masa plantei.

165

In cazul probelor biologice (singe, urina, etc) drogul/toxicul se gaseste fie sub forma conjugata (ex. glucuronoconjugat) fie ca metabolit, si doar foarte rar ca atare. In plus, ca si la plante, cantiatea de drog/toxic din probe biologice este - este mica. Din aceste motive, in cazul probelor biologice, de obicei, sunt necesari mai multi pasi in pregatirea probelor: se realizeaza intii scindarea substantei din conjugat. Aceasta se realizeaza prin hidroliza acida (metoda este rapida), enzimatica (metoda este lenta) si foarte rar bazica (posibila doar ca conjugatii de tip esteric); urmeaza apoi izolarea. Aceasta se face fie prin extractie, fie cromatografic, fie, foarte rar, prin cristalizare. Date pe larg despre aceste aspecte au fost prezentate anterior la V.3.1. ; in unele cazuri este necesara o etapa suplimentara denumita derivatizare. Mai precis atunci cind compusii sunt polari (compusi contin grupari carboxilice, hidroxilice, tiolice, amino primare si secundare, etc.) sau au o grupa puternic electronegativa (ex. CF3; halogen, etc), derivatizarea se impune cu necesitate. Principalele procedee de derivatizare sunt : a. Pentru droguri/toxice avind caracter bazic: acetilarea, trifluoroacetilarea, pentafluoropropionilarea, heptafluorobutirilarea, trimetilsililarea; b. Pentru droguri/toxice avind caracter acid: metilare, pentafluoropropionilarea, trimetilsililarea, tert-butildimetilsililare. Asupra derivatizarii vom reveni pe larg in capitolul urmator. Referitor la extractia drogurilor/toxicelor din probe, mai trebuie precizat ca uneori este necesara modificarea pH-ului probei astfel incit sa se realizeze trecerea drogului in faza organica. pH-ul necesar se poate calcula cu ajutorul ecuatiei Henderson-Hasselbach: pH = pKa + log ( [A-]/[HA] ) unde: pH- este pH-ul solutiei analizate; pKa- este pKa-ul drogului/toxicului; A- - este forma bazica (ionizata) a drogului/toxicului;

166

HA este forma acida (neionizata) a drogului/toxicului. Cunoscind pKa-ul drogului/toxicului si valoarea pe care o dorim pentru concentratia drogului/toxicului in forma neionizata (HA), se poate calcula cu usurinta pH-ul optim pentru trecerea in faza organica. Prezentam mai jos (Tabele 10, 11) citeva sisteme extractive mai des utilizate pentru droguri si pentru si pentru extractii din materii prime vegetale (plante).
Tabelul 10. Sisteme extractive pentru droguri, in mediu acid sau bazic

Drogul extras Morfina; hydromorfona; pentazocina; cocaina

Sistem extractiv folosit NH4OH-saturat/cloroform

Amfetamina; metamfetamina; 3,4-metilen- NH4OH-saturat/hexan dimetoxiamfetamina; meperidida; efedrida Herona; cocaina; pentazocina; meperidina; HCl-saturat/cloroform penciclidina Cocaina NH4OH-saturat/eter de petrol

Tabelul 11. Sisteme extractive pentru izolarea drogurilor din materii prime vegetale

Material din plante Canabis

Drog Solventul si procedeul de extractie Canabioide Cloroform (temperatura camerei); Eter petrol (temperatura camerei); Etanol (Soxhelet) Cocaina Morfina Cloroform/eter de petrol/metanol (temperatura camerei) (2:1:1)

Frunze coca Opiu

Metanol (reflux); Sonicare in prezenta acid acetic 5%, apoi extractie cu cloroform/metanol (3:1) la pH 8,5

V.3.3. Derivatizarea chimica in medicina judiciara

Derivatizarea se defineste ca fiind procesul de conversie a unui analit dintr-o

167

proba de studiat in o forma diferita a sa, care poate fi analizata prin diverse metode fizico-chimice. Ideal, in medicina judiciara, analitii din probe trebuie testati in forma lor originala intrucit aceasta permite identificarea calitativa si cantitativa fara nici un dubiu. Din nefericire, in multe cazuri, acest lucru nu este posibil si este necesar procesul de derivatizare chimica; ea este folosita pe scara larga in medicina judiciara, deoarece exista compusi (in special cei cu polaritate mare) ce nu pot fi analizati prin GC-MS in starea lor originala. Derivatizarea poseda o serie de avantaje si dezavantaje, de care trebuie sa se tina cont. Dintre dezavantaje citam: presupune o reactie suplimentara care poate introduce impuritati sau transformari secundare, costuri suplimentare in bani si timp. Insa, avantajele derivatizarii substantelor sunt incontestabile: imbunatatirea unora din proprietatile fizice; imbunatatirea proprietatilor cromatografice, in special a capacitatii de separare; imbunatatirea capacitatii de detectie prin spectrometrie de masa.

V.3.3.1. Reactii chimice utilizate in procesul de derivatizare

In principiu atunci cind se efectueaza o derivatizare se are in vedere ca reactia chimica utilizata sa fie cit mai simpla, rapida, sa nu dea produsi secundari, sa decurga cu randamente mari in produsul final si sa nu necesite purificari costisitoare ale acestuia. Cele mai utilizate reactii chimice utilizate in procesul de derivatizare sunt alchilarea, acilarea si sililarea.
1. Sililarea

Sililarea este cel mai utilizat procedeu de derivatizare. Cei mai utilizati reactanti de derivatizare sunt:
a. Trimetilclorosilan (TMSC)

168

TMCS este folosit ca agent de derivatizare pentru compusi de tipul R-H, unde R este un radical organic. Reactia de derivatizare poate fi reprezentata shematic astfel:
CH3 H3C Si Cl + CH3 TMCS R H R TMS Produs de derivatizare + HCl

Reactia este mai rar utilizata in prezent, fiind destul de nespecifica. Se observa ca in acest caz ca si produs secundar se obtine acidul clorhiric, care se poate elimina usor prin adaugarea unei baze slabe (trietilamina sau piridina, de obicei).

b. N-O-Bis(trimetilsilil) acetamida (BSA)

BSA este folosit ca agent de derivatizare pentru compusi de tipul R-Y-H, unde: Y este un heteroatom (altul decit carbon) iar R este un radical organic. Reactia de derivatizare poate fi reprezentata shematic astfel:
N H3C C O TMS BSA TMS + R Y H TMS HN R Y TMS + H3C C O Produs de TMS-acetamida derivatizare

CH3 TMS= Si CH3 CH3

Produsul de derivatizare rezultat este stabil, iar conditiile de reactie sunt blinde. Se observa ca in acest caz ca si produs secundar se obtine TMS-acetamida, care poate fi indepartata usor din mediul de reactie.

c. N-O-Bis(trimetilsilil) trifluoroacetamida (BSTFA)

BSTFA este folosit ca agent de derivatizare tot pentru compusi de tipul R-Y-H, avid avantajul ca reactioneaza mai rapid si practic cantitativ. Reactia de derivatizare poate fi reprezentata shematic astfel:

169

N F3C C

TMS + R Y H

O TMS BSTFA

TMS HN R Y TMS + F3C C O Produs de TMS-trifluoroacetamida derivatizare

Se observa ca in acest caz ca si produs secundar se obtine TMS-trifluoroacetamida, care poate fi indepartata usor din mediul de reactie.

d. N-Metiltrimetilsilil trifluoroacetamida (MSTFA)

MSTFA este folosit ca agent de derivatizare tot pentru compusi de tipul R-Y-H, putind fi utilizat inclusiv pentru compusii mai volatili. Reactia de derivatizare poate fi reprezentata shematic astfel:
O F3C C N MSTFA TMS CH3 + R Y H CH3 HN R Y TMS + F3C C O Produs de Metil-trifluoroacetamida derivatizare

Se observa ca in acest caz ca si produs secundar se obtine metil-trifluoroacetamida, care este voatila si poate fi indepartata usor din mediul de reactie.

e. Trimetilsililimidazol (TMSI)
TMSI este folosit ca agent de derivatizare tot pentru compusi de tipul R-Y-H, in special pentru cei cu hidroxil, inclusiv impiedecat steric (nar nu pentru amino). Reactia de derivatizare poate fi reprezentata shematic astfel: TMS N N + R Y H R Y TMS + Produs de derivatizare HN N

TMSI

Imidazol

Se observa ca in acest caz ca si produs secundar se obtine imidazolul, care este netoxic si se poate indepartata usor din mediul de reactie.

170

f. Trimetilsilildietilamina (TMS-DEA)
TMS-DEA este folosit ca agent de derivatizare tot pentru amine si acizi carboxilici. Reactia de derivatizare poate fi reprezentata shematic astfel:

TMS N

R Y H

R Y TMS + Produs de derivatizare

HN DEA

TMS-DEA

g. N-Metil-N-(tert-butildimetilsilil) trifluoroacetamida (MTBSTFA)

MTBSTFA este folosit ca agent de derivatizare tot pentru compusi de tipul R-Y-H, avind avantajul ca produsul de derivatizare este extrem de stabil la hidroliza. Reactia de derivatizare poate fi reprezentata shematic astfel:
CH3 F3C C Si N CH3 CH3 MTBSTFA O + R Y H CH3 R Y Si CH3 Produs de derivatizare CH3 HN + F3C C O Metil-trifluoroacetamida

h. Hexametildisilazanul (HMDS)
HMD este folosit ca agent de derivatizare pentru compusi de tipul R-Y-H. Reactia de derivatizare poate fi reprezentata shematic astfel:
TMS NH TMS HMDS + R Y H R Y TMS + TMS NH2 Produs de derivatizare

Este mai rar utilizat.

2. Alchilarea
Alchilarea este un alt procedeu de derivatizare, dar cu utilizarea mai limitata, in special pentru gruparile hidroxil. Cei mai utilizati reactanti de derivatizare sunt:

171

a. Dimetilacetalul dimetilformamidei (DMF-dialkyla)

Diacetalul dimetilformamidei este folosit ca agent de derivatizare pentru compusi de tipul R-Y-H, in special pentru compusii carboxilici, dar fi pentru fenoli, amine, aminoacizi. Reactia de derivatizare poate fi reprezentata shematic astfel:
H3C H3C O CH2 CH3 n R Y H H3C N CHO + HO CH2 CH3 R Y CH2 CH3 + n n H3C DMF Produs de derivatizare

N CH

O CH2 CH3 n n= 1,2,3 DMF-dialkyla

In functie de masa moleculara (controlata prin valoarea lui n) se controleaza timpii de retentie in GC.

b. BF3 metanol (sau n-butanol)

Amestecul BF3 metanol sau BF3 n-butanol este folosit ca agent de derivatizare pentru compusii carboxilici. Reactia de derivatizare poate fi reprezentata shematic astfel: O R O BF3 + R' C OH R' C H R= Me; n-Bu O O R Produs de derivatizare

c. Hidroxid de tetrabutilamoniu (TBH) si hidroxid de trimetilanilinium

(TMAH) Ambele substante sunt folosite cu precadere ca agenti de derivatizare pentru compusi carboxilici. Reactia de derivatizare poate fi reprezentata shematic astfel:

172

C4H9

C4H9 N C4H9 C4H9

O OH + R' C OH R' C

O O Produs de derivatizare

TBH

CH3 N CH3 OH CH3

O + R' C OH R' C

O O CH3 Produs de derivatizare

TMAH

3. Acilarea
Acilarea este un procedeu de derivatizare cu specificitate mai mare, in special pentru gruparile hidroxil si amino. Cei mai utilizati reactanti de derivatizare sunt:

a. Anhidrida acetica (Ac-Anh)

Anhidrida acetica este folosita ca agent de derivatizare pentru compusi de tipul RY-H, in special pentru pentru alcooli, fenoli si amine. Reactia de derivatizare poate fi reprezentata shematic astfel: O H3C C H3C C O Ac-Anh O + R Y H O C CH3 R Y Produs de derivatizare + H3C C OH O

b. N-Metil-N-bis(trifluoroacetamida (MBTFA)
MBTFA este folosita ca agent de derivatizare pentru compusi de tipul R-Y-H, in special pentru pentru alcooli, fenoli, tioli si amine. Reactia de derivatizare poate fi reprezentata shematic astfel:

173

O F3C C F3C C O MBTFA N CH3 + R Y H

O R Y C CF3 + F3C C

O N CH3 H Metil-trifluoroacetamida

Produs de derivatizare

Produsul de derivatizare rezultat este stabil, iar conditiile de reactie sunt blinde. Reactia mai posda avantajul ca reactia decurge rapid cu aminele (primare si secundare) si mai greu pentru, alcooli, fenoli, tioli. Se observa ca in acest caz ca si produs secundar se obtine metil-trifluoroacetamida, care este voatila si poate fi indepartata usor din mediul de reactie.
c. Heptafluorobutirilimidazol (HFBI)

HFBI este folosita ca agent de derivatizare pentru compusi de tipul R-Y-H, in special pentru pentru alcooli, fenoli si amine. Reactia de derivatizare poate fi reprezentata shematic astfel:
O F3C F2C F2C C N HFBI N O + R Y H R Y C C3F7 + HN N

Produs de derivatizare

Imidazol

Produsul de derivatizare rezultat este stabil, iar conditiile de reactie sunt blinde. Ca si produs secundar se obtine imidazolul, care este netoxic si se poate indepartata usor din mediul de reactie.
d. Anhidride fluorurate (TFA; PFPA; HFBA)

Anhidridele

fluorurate

[anhidrina

trifluoroacetica

(TFA),

anhidrida sunt

pentafluoropropionica (PFPA) si anhidrida heptafluorobutirica (HFBA)] derivatizare poate fi reprezentata shematic astfel:

folosite ca agenti de derivatizare in special pentru compusi hidroxilici. Reactia de

174

O F3C C F3C C O TFA F3C F2C C F3C F2C C O PFPA F3C F2C F2C C F3C F2C F2C C O HFBA O + R OH O + R OH

O R O C CF3 + F3C C

O OH Acid trifluoroacetic

Produs de derivatizare O R O C C2F5

O OH Acid pentafluoropropionic O OH Acid heptafluorobutiric + C3F7 C + C2F5 C

O O + R OH

Produs de derivatizare O C C3F7 R O Produs de derivatizare

Se observa ca in acest caz ca si produs secundar se obtin acizi organici fluorurati, care se pot neutraliza (si elimina) prin adaugarea unei baze slabe (trietilamina sau piridina).
e. Clorura de pentabluorobenzoil (PFBCl)

PFBCl este folosit ca agent de derivatizare pentru compusi de tipul R-Y-H, in special pentru pentru alcooli, fenoli si amine. Reactia de derivatizare poate fi reprezentata shematic astfel:
F F F F PFBCl F COCl + R Y H F F F CO Y R F F Produs de derivatizare + HCl

PFBCl este foarte reactiv. V.3.3.2. Metode practice de derivatizare Practic, in acest moment, exista metode de derivatizare bine puse la punct

175

pentru toate clasele de compusi de interes din medicina judiciara si toxicologie. In cele ce urmeaza vom prezenta sintetic citeva metode de lucru experimentale de derivatizare pentru principalele tipuri de functiuni.
1. Functiunea amino, primara (-NH2) si secundara ( -NH-R)

Pentru functiunea amino sunt utilizate mai multe proceduri de derivatizare: derivatizare prin procedee de sililare: TMS, TBDMS; derivatizare prin procedee de acilare: TFA, Ac-Anh; drivatizare prin procedeul metilare: DMF-dimetha.

a. Derivatizare prin procedeul TMS

Si in acest caz, hidrogenul gruparii functionale amino dintr-un compus organic este inlocuit cu o grupare trimetilsilil, si in consecinta in spectrul GC-MS se va inregistrea o crestere de masa cu 72 unitati pentru fiecare grupare amino. Ca agenti de sililare se pot folosi MSTFA, BSTFA, BSA.
CH3 H3C Si CH3
MSTFA BSTFA BSA

NH2 sau NH R

CH3 Si CH3 Y= H, R CH3 Produs de derivatizare

Y N

Procedeu experimental:

Intr-un recipient potrivit, se adauga cu o micropipeta 50 L MSTFA (sau: BSTFA, BSA) peste o cantitate de 1-5 mg proba de analizat. Se adauga apoi 50

L solvent (acetonitril, piridina, THF, DMF). Se inchide cu un capac etans

recipientul si apoi se agita bine vasul, pentru a realiza o omogenizare cit mai buna a amestecului. Se incalzeste apoi vasul continind proba de analizat timp de 5 minute la 600C, pe baie de apa sau ulei. Se raceste apoi proba si se injecteaza 1-2 L din proba in GC-MS.

176

b. Derivatizare prin procedeul TBDMS

In acest caz hidrogenul gruparii functionale dintr-un compus organic este inlocuit cu o grupare tertbutil-dimetilsilil, si in consecinta in spectrul GC-MS se va inregistrea o crestere de masa cu 114 unitati pentru fiecare amino. Ca agent de sililare se poate folosi TBDMS. CH3 CH3 H3C C Si CH3 CH3 TBDMS + NH2 sau NH R CH3 CH3 C CH3 Si Y= H, R CH3 CH3 Produs de derivatizare Y N

Procedeu experimental:

Intr-un recipient potrivit, se adauga cu o micropipeta 50 L solvent (acetonitril, piridina, THF, DMF) peste o cantitate de 1-5 mg proba de analizat. Se adauga apoi 50 L TBDMS. Se inchide cu un capac etans recipientul si apoi se agita bine vasul, pentru a realiza o omogenizare cit mai buna a amestecului. Se incalzeste apoi vasul continind proba de analizat timp de 15 minute la 600C, pe baie de apa sau ulei. Se raceste apoi proba si se injecteaza 1-2 L din proba in GC-MS.
c. Derivatizare prin procedee de acilare: TFA, Ac-Anh

In acest caz hidrogenul gruparii functionale dintrun compus organic este inlocuit fie cu o grupare trifluoroacetil (si in consecinta in spectrul GC-MS se va inregistrea o crestere de masa cu 96 unitati pentru fiecare grupare amino) fie cu o grupare acetil (si in consecinta in spectrul GC-MS se va inregistrea o crestere de masa cu 42 unitati pentru fiecare grupare amino). Ca agenti de acilare se pot folosi fie anhidrida trifluuoroacetica (TFA) fie anhidrida acetica (Ac-Anh).

177

O F3C C F3C C O TFA NH2 O + sau NH R

O C CF3 R N Y Y= H, R Produs de derivatizare O C CH3 R N Y Y= H, R Produs de derivatizare

O H3C C O + H3C C O Ac-Anh

NH2 sau NH R

c.1. Derivatizare prin procedee de acilare cu Ac-Anh

Intr-un recipient potrivit, se adauga cu o micropipeta 40 L solvent (cel mai adesea piridina) peste o cantitate de 1-5 mg proba de analizat. Se adauga apoi 60 L AcAnh. Se inchide cu un capac etans recipientul si apoi se agita bine vasul, pentru a realiza o omogenizare cit mai buna a amestecului. Se incalzeste apoi vasul continind proba de analizat timp de 30 minute la 600C, pe baie de apa sau ulei. Se evapora la sec trecind un curent de azot peste solutie. Se dizolva rezidiu in 25 L solvent (piridina sau acetonitril). Se raceste apoi proba si se injecteaza 1-2 L din proba in GC-MS.
c.2. Derivatizare prin procedee de acilare cu TFA

Intr-un recipient potrivit, se adauga cu o micropipeta 200-500 L solutie toluenica 0,05 M de trietilamina peste o cantitate de 1-5 mg proba de analizat. Se adauga apoi 50 L TFA. Se inchide cu un capac etans recipientul si apoi se agita bine vasul, pentru a realiza o omogenizare cit mai buna a amestecului. Se incalzeste apoi vasul continind proba de analizat timp de 5 minute la 450C, pe baie de apa sau ulei. Se raceste si apoi se adauga 400-1000 L solutie apoasa 5% de bicarbonat de

178

sodiu. Se agita bine pina cind stratul superior devine clar si apoi se centrifugheaza. Se injecteaza 1-2 L din stratul superior al probei in GC-MS.
d. Procedeul cu dimetil acetalul N,N-dimetilformamidei (DMF-dimetha).

Intr-un recipient potrivit, peste o cantitate de maxim 0,1 mg proba de analizat se adauga cu o micropipeta 50 L dimetil acetal al N,N-dimetilformamidei si 50 L acetonitril. Se inchide cu un capac etans recipientul si apoi se agita bine vasul, pentru a realiza o omogenizare cit mai buna a amestecului. Se incalzeste apoi vasul continind proba de analizat timp de 30 minute la 600C, pe baie de apa sau ulei. Se injecteaza 1-2 L din proba in GC-MS .
2. Functiunea hidroxil, -OH

In acest caz sunt preferate 3 proceduri de derivatizare: derivatizare prin procedeul TMS derivatizare prin procedeul TBDMS derivatizare prin procedeul acetil

a. Derivatizare prin procedeul TMS

In acest caz hidrogenul gruparii functionale dintr-un compus organic este inlocuit cu o grupare trimetilsilil, si in consecinta in spectrul GC-MS se va inregistrea o crestere de masa cu 72 unitati pentru fiecare hidroxil. Ca agenti de sililare se pot folosi MSTFA sau BSTFA. CH3 H3C Si CH3 MSTFA sau BSTFA + O H CH3 H3C Si O CH3 Produs de derivatizare

Procedeu experimental:

Intr-un recipient potrivit, se adauga cu o micropipeta 100 L MSTFA (sau BSTFA) peste o cantitate de 1-5 mg proba de analizat. Se adauga apoi 50 L de

179

solvent (in functie de proba de analizat, cel mai adesa piridina sau acetonitril). Se inchide cu un capac etans recipientul si apoi se agita bine vasul, pentru a realiza o omogenizare cit mai buna a amestecului. Se incalzeste apoi vasul continind proba de analizat timp de 5 minute la 600C, pe baie de apa sau ulei. Se raceste apoi proba si se injecteaza 1-2 L din proba in GC-MS.
b. Derivatizare prin procedeul TBDMS

In acest caz hidrogenul gruparii functionale dintr-un compus organic este inlocuit cu o grupare tertbutil-dimetilsilil, si in consecinta in spectrul GC-MS se va inregistrea o crestere de masa cu 114 unitati pentru fiecare hidroxil. Ca agent de sililare se poate folosi MTBSTFA. CH3 CH3 H3C C Si CH3 CH3
MTBSTFA

O H

CH3 CH3 H3C C Si O CH3 CH3 Produs de derivatizare

Procedeu experimental:

Intr-un recipient potrivit, se adauga cu o micropipeta 100 L solvent (in functie de proba de analizat, cel mai adesa acetonitril) peste o cantitate de 1-5 mg proba de analizat. Se adauga apoi 100 L de MTBSTFA. Se inchide cu un capac etans recipientul si apoi se agita bine vasul, pentru a realiza o omogenizare cit mai buna a amestecului. Se incalzeste apoi vasul continind proba de analizat timp de 15 minute la 600C, pe baie de apa sau ulei. Se raceste apoi proba si se injecteaza 1-2

L din proba in GC-MS.

c. Derivatizare prin procedeul acetil

In acest caz hidrogenul gruparii functionale dintr-un compus organic este inlocuit cu o grupare acetil, si in consecinta in spectrul GC-MS se va inregistrea o

180

crestere de masa cu 42 unitati pentru fiecare hidroxil. Ca agent de acetilare se poate folosi anhidrida acetica.
O H3C C O + H3C C O Ac-Anh O H O C CH3 O Produs de derivatizare

Procedeu experimental:

Intr-un recipient potrivit, se adauga cu o micropipeta 40 L solvent (in functie de proba de analizat, cel mai adesa piridina) peste o cantitate de 1-5 mg proba de analizat. Se adauga apoi 60 L de Ac-Anh. Se inchide cu un capac etans recipientul si apoi se agita bine vasul, pentru a realiza o omogenizare cit mai buna a amestecului. Se incalzeste apoi vasul continind proba de analizat timp de 30 minute la 600C, pe baie de apa sau ulei. Se raceste apoi proba si se injecteaza 1-2 L din proba in GC-MS.
3. Functiunea carboxil, -COOH

Ca si in cazul hidroxilului, pentru functiunea carboxil sunt preferate 3 proceduri de derivatizare: derivatizare prin procedee de sililare: TMS, TBDMS; derivatizare prin procedeul de metilare: DMF-dimetha, Me-OH.

a. Derivatizare prin procedeul TMS

Si in acest caz, hidrogenul gruparii functionale carboxil dintr-un compus organic este inlocuit cu o grupare trimetilsilil, si in consecinta in spectrul GC-MS se va inregistrea o crestere de masa cu 72 unitati pentru fiecare carboxil. Ca agenti de sililare se pot folosi MSTFA, BSTFA, BSA. Pentru acizi cu mase moleculare mici se poate folosi si TMS-DEA.

181

CH3 H3C Si CH3

MSTFA BSTFA TMS-DEA BSA

O C O H

O C O

CH3 Si CH3 CH3

Produs de derivatizare

Procedeu experimental:

Intr-un recipient potrivit, se adauga cu o micropipeta 200 L MSTFA (sau: BSTFA, BSA) peste o cantitate de 1-5 mg proba de analizat. Se inchide cu un capac etans recipientul si apoi se agita bine vasul, pentru a realiza o omogenizare cit mai buna a amestecului. Se incalzeste apoi vasul continind proba de analizat timp de 15 minute la 600C, pe baie de apa sau ulei. Se raceste apoi proba si se injecteaza 1-2 L din proba in GC-MS.
b. Derivatizare prin procedeul TBDMS

In acest caz hidrogenul gruparii functionale dintr-un compus organic este inlocuit cu o grupare tertbutil-dimetilsilil, si in consecinta in spectrul GC-MS se va inregistrea o crestere de masa cu 114 unitati pentru fiecare carboxil. Ca agent de sililare se poate folosi TBDMS. CH3 CH3 H3C C Si CH3 CH3
TBDMS

O + C O H C

CH3 CH3 C CH3 Si O CH3 CH3 Produs de derivatizare

Procedeu experimental:

Intr-un recipient potrivit, se adauga cu o micropipeta 50 L TBDMS peste o cantitate de 1-5 mg proba de analizat. Se adauga apoi solvent, daca este necesar (acetonitril, piridina, THF, DMF). Se inchide cu un capac etans recipientul si apoi

182

se agita bine vasul, pentru a realiza o omogenizare cit mai buna a amestecului. Pentru acizii cu masa moleculara mare, se incalzeste apoi vasul continind proba de analizat timp de 5-20 minute la 600C, pe baie de apa sau ulei. Pentru acizii cu masa moleculara mica, se lasa la temperatura camerei vasul continind proba de analizat timp de cca 30 minute. Se raceste apoi proba si se injecteaza 1-2 L din proba in GC-MS.
c. Derivatizare prin procedeul metilare

In acest caz hidrogenul gruparii functionale dintrun compus organic este inlocuit cu o grupare metil, si in consecinta in spectrul GC-MS se va inregistrea o crestere de masa cu 14 unitati pentru fiecare carboxil. Ca agent de metilare se poate folosi metanolul (MeOH) sau dimetil acetalul N,N-dimetilformamidei (DMFdimetha).
O H3C OH MeOH + C O H H+ O O CH3 Produs de derivatizare O O CH3 Produs de derivatizare C C

H3C H3C

OCH3 N CH OCH3 + C

O O H

DMF-dimetha

Procedee experimentale 1. Procedeul cu metanol anhidru si acid sulfuric concentrat

Intr-un recipient potrivit, peste o cantitate de 1-5 mg proba de analizat se adauga cu o micropipeta 250 L MeOH si 50 L H2SO4 concentrat (ca si catalizator al reactiei de esterificare). Se inchide cu un capac etans recipientul si apoi se agita bine vasul, pentru a realiza o omogenizare cit mai buna a amestecului. Se incalzeste

183

apoi vasul continind proba de analizat timp de 45 minute la 600C, pe baie de apa sau ulei. Se adauga apoi 500 L cloroform sau clorura de metilen si se agita timp de 2 min. Se injecteaza 1-2 L din proba in GC-MS (din patura inferioara organica ce contine proba). Acest procedeu permite identificarea urmelor de acid. Ca si produs secundar se obtine dimetilsulfatul (DMS), usor de identificat dupa fragmente in MS.
15 (36%) CH3 O 31 (67%) O S O H3C DMS
100 O 31 29 50 15 45 48 0 10 20 30 40 50 (m ainlib) Sulfuric acid, dim ethyl ester 60 68 70 66 79 81 80 90 100 110 120 125 130 140 O O S O 95

O 95 (10%, BP)

Figura V.3.2. Spectrul de masa al dimetilsulfatului

2. Procedeul cu metanol anhidru si acid clorhidric concentrat

Intr-un recipient potrivit, peste o cantitate de 1-5 mg proba de analizat se adauga cu o micropipeta 250 L solutie metanolica 3N de HCl (MeOH anh. si HCl conc.). Se

184

inchide cu un capac etans recipientul si apoi se agita bine vasul, pentru a realiza o omogenizare cit mai buna a amestecului. Se incalzeste apoi vasul continind proba de analizat timp de 20 minute la 600C, pe baie de apa sau ulei. Se injecteaza 1-2 L din proba in GC-MS .

3. Procedeul cu metanol anhidru si BF3

Intr-un recipient potrivit, peste o cantitate de 1-5 mg proba de analizat se adauga cu o micropipeta 250 L solutie metanolica (5-10%) de BF3 (MeOH anh. si HCl conc.). Se inchide cu un capac etans recipientul si apoi se agita bine vasul, pentru a realiza o omogenizare cit mai buna a amestecului. Se incalzeste apoi vasul continind proba de analizat timp de 20 minute la 600C, pe baie de apa sau ulei. Se raceste pe baie de apa cu gheata si apoi se adauga 2 mL apa distilata. Se transvazeaza amestecul intr-o pilnie de separare, se adauga 2 mL clorura de metilen si se agita timp de 5 min. Se separa patura organica (inferioara) si apoi in patura apoasa se adauga din nou 2 mL clorura de metilen, se agita timp de 5 min. Si apoi se separa din nou patura organica. Extractele reunite de clorura de metilen se usuca pe sulfat de sodiu anhidru. Se filtraza si apoi solutia de clorura de metilen se concentreaza prin evaporare pina la 100 L, fie trecind un curent de azot fie se evapora normal. Se injecteaza 1-2 L din proba in GC-MS (din patura inferioara organica ce contine proba).

4. Procedeul cu dimetil acetalul N,N-dimetilformamidei (DMF-dimetha).

Intr-un recipient potrivit, peste o cantitate de 1-5 mg proba de analizat se adauga cu o micropipeta 100 L dimetil acetal al N,N-dimetilformamidei. In cazul in care proba nu se dizolva bine, se poate adauga 100 L solvent (cloroform, clorura de metilen, piridina, THF sau DMF). Se inchide cu un capac etans recipientul si apoi se agita bine vasul, pentru a realiza o omogenizare cit mai buna a amestecului. Se incalzeste apoi vasul continind proba de analizat timp de 15 minute la 600C, pe baie de apa sau ulei. Se injecteaza 1-2 L din proba in GC-MS .

185

V.4. Droguri din opiu si derivati

V.4.1. Introducere Opioid (greac i - asemntor opiului) este un termen care defineste o grupa de substante chimice heterogene naturale si sintetice inrudite cu morfina.
H3C CH3 N HO O OH Morfina
2 1

N
9 15 14 8

H H H OH

HO

O 5 H

Morfina, structura spatiala

Opioidele sunt substante cu actiune deprimanta asupra sistemului nervos central (SNC) iar spectrul lor de actiune al este foarte complex si diferit, cel mai important rol al lor fiind actiunea intens analgezica. In acelasi timp opidele au o serie de efecte secundare nedorite, de departe efectul secundar cel mai nedorit fiind efectul de dependenta. Dintre celelalte efecte secundare citam: deprimarea respiratiei (hipoventilatie pulmonara, hipoxie), scaderea peristaltismului intestinal, efecte hipnotice, anxiolitice, halucinogene si euforie. Ultimele doua efecte secundare constitue efectele narcotice, nedorite ale opioidelor. Acest ansamblu de actiuni face ca opioidele sa fie incadrate in clasa de substante analgezice narcotice. Compusii din clasa opioidelor pot fi clasificati dupa mai multe criterii. Tinind cont de provenienta lor, opioidele se impart in mai multe grupe:

186

1. tebaina; 2. 3. 4.

alcaloizi naturali din opiu - care cuprinde morfina, codeina si derivati semisintetici de morfina; derivati sintetici de morfina; antagonisti ai morfinei - substante folosite ca antidot pentru droguri.

Produsii naturali ai clasei sunt reprezentati de alcaloizi din opiu. Opiul este constituit din latexul uscat obtinut din fructele necoapte de mac (Papaver

somniferum). In opiu se gasesc circa 25 de alcaloizi (alaturi de alti compusi), intre

care si alcaloizii cu nucleu fenantrenic, cel mai important dintre acestia, pentru proprietatile analgezice narcotice, fiind morfina. Opiul se obtine numai pe cale manuala. Recoltarea are loc la circa 12 zile de la caderea petalelor florilor, atunci cand capsulele ajung la dimensiunea maxima; ea se face prin intermediul scarificarii (capsulele de mac sunt incizate cu nite lame speciale numai pan la jumtatea capsulei), operatie desfasurata numai pe timp frumos. Datorita inciziilor, latexul din capsulele de mac, alb la inceput se brunifica si se coaguleaza. Astfel coagulat, se racleaza cu ajutorul unui razuitor din lemn sau din metal. Latexul rezultat se usuca la soare cu atenie pana cand capata consistenta unei paste foarte dense si este brunifiact complet. Este strans in bucati de dimensiuni variabile si presat in forme variabile. Latexul astfel obtinut constituie asa numitul opiu baza si contine circa 1012% alcaloizi, 1015 % apa, acizi organici, rezine etc. Prin inclzirea opiului baza la temperaturi scazute se obtine o solutie de culoare maronie care supusa filtrarii (pentru indepartarea reziduurilor vegetale) si apoi evaporarii, conduce la formarea unei pudre care reprezinta forma opiului de fumat, cu un continut mult mai mare de morfina fata de latex. Alcaloizii morfinici sunt compusi organici naturali cu schelet fenantrenic care provin formal din morfina, cei mai importanti fiind morfina, codeina si tebaina:

187
CH3 N HO O Morfina OH H3CO O Codeina OH CH3 N H3CO O Tebaina OCH3 CH3 N

Pentru specialistii in medicina judiciara o importanta deosebita o are clasificarea opioidelor dupa structura chimica, tinind cont de numarul de cicluri care se pastreaza din alcaloidul baza, morfina: - derivati pentaciclici (seria morfinei); - derivati tetraciclici (seria morfinanului); - derivati triciclici (seria benzomorfanului); - derivati monociclici (seria piperidinei). [mai exista o clasa admisa, derivati hexaciclici (seria buprenorfinei), dar care nu prezinta importanta pentru practica judiciara intriucit acesti compusi nu sunt utilizati ca si droguri] Desi derivatii monociclici piperidinici aparent nu au nimic in comun cu morfina, ei sunt derivati opioidici de sinteza care provin formal prin distrugerea legaturilor dintre ciclurile initiale din morfina:
N A O E O B D O C C Seria morfinanului, derivati tetraciclici R1 A B D N A R3 D B R2 Seria benzomorfanului, derivati triciclici N

Seria morfinei, derivati pentaciclici

N A R D Seria piperidinei, derivati monociclici

188

Antagonisti narcotici Antagonistii narcotici reprezinta o grupa de morfinomimetice care au proprietatea de a inversa majoritatea actiunilor farmacologice de natura narcotica a drogurilor. Antagonistii narcotici sunt larg utilizati in curele de dezintoxicare a toxicomanilor avind avantajul ca nu produc dependenta si nici sindrom de abstinenta. Principalele medicamente antagonist narcotice sunt Nalorfina,

Naltrexona, Levalorfanul, Butorfanol si Xorfanolul.

N HO HO O OH Nalorfina Naltrexona HO O O

N HO

Levalorfan

HO HO Butorfanol

N HO

N CH3

Xorfanol CH2

V. 4.2. Metabolizarea opioidelor Asa dupa cum s-a aratat anterior, intr-un sistem biologic orice drog sufera procese de metabolizare si degradare. Acest proces de metabolizare are loc in doua etape conducind la produsi cu structura mai simpla pe care organismul viu ii elimina fie ca atare (in cantitate mica) fie ii transforma in produsi de conjugare(in cantitate mare): faza metabolica I sau faza reactiilor metabolice, cuprinde reactiile de hidroliza, oxidare si reducere; faza metabolica II sau faza reactiilor de conjugare, care cuprinde procesele de conjugare ale substantelor cu diversi compusi din organism cum ar fi

189

aminoacizi (glutation, glutamina, etc) si acidul glucuronic. In practica toxicologica, prin procesul de preparare si pretratament al probelor, se realiza nu numai izolarea drogului si a produsilor de metabolizare si clivajul produsilor de conjugare in metaboliti. Din aceste motive cunoasterea produsilor de metabolizare a drogurilor este de importanta cruciala pentru specialistii in medicina judiciara. 1. Metabolizarea derivatilor pentaciclici (seria morfinei) In aceasta grupa intra morfina si analogii ei pentaciclici. Cele mai cunoscute droguri din aceasta clasa sunt Morfina si Heroina, a caror schema de metabolizare este prezentata mai jos:
CH3 N H3CCOO O Heroina OOCCH3 HO O CH3 N OOCCH3 6-Monoacetil-Morfina (6-MAM) Hidroliza partiala Hidroliza partiala CH3 N

Hidroliza

NH Demetilare HO O Normorfina OH HO O Morfina OH

Demetilare Hidroliza CH3 partiala N H3CO O OOCCH3 Acetilcodeina H3CO O Codeina OH CH3 Demetilare N H3CO O Norcodeina OH

NH

190

In organismul viu heroina este rapid metabolizat la 6-MAM. Datorit timpului relativ scurt de detectare a 6-MAM, de obicei in probe se detecteaza morfina si codeina, respectiv produsii lor de N-demetilare (normorfina si norcodeina). Acetilcodeina este un produs secundar rezultat la fabricarea ilicita a heroinei, si poate fi el gasit in probele biologice. 2. Metabolizarea derivatilor tetraciclici (seria morfinan) Cele mai cunoscute droguri din aceasta clasa sunt Levorfanolul si

Dextrometorfanul , a caror schema de metabolizare este prezentata mai jos:

Demetilare N HO Levorfanol (N-Metil-3-hidroximorfinan) Hidroliza N H3CO Dextrometorfan (N-Metil-3-metoximorfinan) HO Norlevorfanol (3-Hidroximorfinan) Demetilare si hidroliza NH

3. Metabolizarea derivatilor triciclici (seria benzomorfan) Cele mai cunoscute droguri din aceasta clasa sunt Pentazocina si Fenazocina. Schema si produsii de metabolizare a pentazocinei este prezentata mai jos:
OH Oxidare N HO Pentazocina HO Cis-hidroxipentazocina Trans-hidroxipentazocina N + HO N OH

191

HOOC N HO Trans-carboxipentazocina

4. Metabolizarea derivatilor monociclici (seria piperidinei) Cele mai cunoscute droguri din aceasta clasa sunt Petidina (Meperidine,

Demerol), -Prodine, Profadol si Fentanil. Schema si produsii de metabolizare a

petidinei este prezentata mai jos:
HO N N-Demetilare N-Oxidare O N-Oxidare O N-Hidroxinorpetidina H 3C N para-Hidroxilare O O HO p-Hidroxi-petidina Petidina O-Hidroliza H 3C N O-Hidroliza H N N-Demetilare OH O Acid norpetidinic O Norpetidina H 3C N O Petidin-N-oxid H N N-Demetilare O O O O H 3C N O

OH O Acid petidinic

192

V. 4.3. Analiza prin GC-MS in cazul opiaceelor Atit drogurile in sine cit si produsi de metabolizare ai opiaceelor se pot determina prin GC-MS. Din acest motiv cunoasterea modului de fragmentare, identificarea fiecarui fragment si in final identificarea structurii acestor metaboliti, constituie dovezi solide in medicina judiciara si trebuiesc cunoscute de catre specialistii in domeniu. Spectrele de masa ale opiaceelor se regasesc, liber (fara a fi necesar plata), in mai toate bazele de date. Ceea ce nu exista in aceste baze de date, sunt reactiile de fragmentare si corelatiile intre ele, pe care noi le vom prezenta in continuare in acest curs, si care permit identificarea su relativa usurinta a spectrelor de masa. 1. Seria morfinei In aceasta grupa intra morfina si analogii ei pentaciclici. Prezentam in continuare spectrele de masa (GC-MS, Electron Impact) ale principalelor droguri si produsi de metabolizare din aceasta clasa: Morfina, Heroina, 6-Monoacetil-

Morfina (6-MAM), Codeina, Acetilcodeina(6-MAC):

100 HO 285

O 50 42 17 0 10 30 50 (m ainlib) Morphine 70 90 110 130 150 170 190 210 230 250 270 290 31 HO 59 70 65 124 81 94 115 174 131 197 N

162

215 228 242 256 268

Figura 1. Spectrul de masa al morfinei

193
100 O 369 O O 50 O 43 N 70 81 15 0 10 40 70 (m ainlib) Diacetylm orphine 100 130 160 190 220 250 280 310 340 370 124 146 162 115 204 284 O 268 310 327

94

Figura 2. Spectrul de masa al heroinei

100 N 43 50 HO O O 146 94 105 124 162 174 O 215 204 197 226 252 270 284 290 310 330 327

268

59 70 81 65 0

152

30 50 70 90 110 130 150 170 190 210 230 250 (m ainlib) Morphinan-3,6--diol, 7,8-didehydro-4,5--epoxy-17-m ethyl-, 6-acetate

Figura 3. Spectrul de masa al 6-MAM

100 O O OH 50 42 31 0 20 40 (m ainlib) Codeine 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 59 70 81 94 65 N 124 115 146 188 175 214 162 229 242 282 299

256

Figura 4. Spectrul de masa al codeinei

194
100 O 43 O O 50 59 81 31 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 (m ainlib) Morphinan-6-ol, 7,8-didehydro-4,5-epoxy-3-m ethoxy-17-m ethyl-, acetate (es ter), (5,6)340 70 65 94 N 124 115 162 188 103 204 240 298 282 O 229 341

266

Figura 5. Spectrul de masa al acetilcodeinei

Asa dupa cum se observa de mai sus, toti acesti compusi poseda spectre de masa asemanatoare, dar cu anumite particularitati. Din spectrul heroinei se observa ca ionul molecular este foarte intens [M+ (77%), m/z= 369)iar in urma unei fragmentari de tip la nivelul grupei functionale esterice (insotita de transferul unui proton) rezulta 6-MAM (care este pic de baza, 100%, m/z= 327), iar din acesta din urma, tot printr-o fragmentare de tip la nivelul grupei functionale esterice (insotita de transferul unui proton), rezulta morfina (M+, m/z = 285), Fig. 6:
CH3 N O C O O Heroina CH3 N

H2C H

- H2C

C O HO m/z= 42 (28%)

- H2C
O

C O m/z= 42 (28%)

O O C CH3 m/z= 369 (M+, 77%)

CH3 N

O O C CH 6-Monoacetil-Morfina 3 (6-MAM) m/z= 327 (BP, 100%)

HO O Morfina OH m/z= 285 (4%)

Figura 6. Schema reactiei de fragmentare a heroinei la morfina

195

Din spectrul 6-MAM, se observa ca observa ca ionul molecular este foarte intens fiind chiar pic de baza (M+= BP, 100%), si tot printr-o fragmentare de tip la nivelul grupei functionale esterice(insotita de transferul unui proton), rezulta morfina, Fig. 7:
CH3 N HO O 6-Monoacetil-Morfina O (6-MAM) m/z= 327 (M+=BP=100%) O C CH2 H C O m/z= 42 (40%) CH3 N

- H2C

HO O Morfina OH m/z= 285 (4%)

Figura 7. Schema reactiei de fragmentare a 6-MAM la morfina

Din spectrul 6-MAC, se observa ca observa ca ionul molecular este de asemenea foarte intens fiind pic de baza (M+= BP, 100%), si tot printr-o fragmentare de tip la nivelul grupei functionale esterice (insotita de transferul unui proton), rezulta codeina ( m/z = 299, 4%). Fragmentarea de tip la nivelul grupei functionale esterice a codeinei conduce la un radical al morfinei (m/z= 284, 6%), Fig. 7.
CH3 N O O HO CH2 H 6-Monoacetil-Codeina (6-MAC) m/z= 341 (M+=BP=100%) Codeina m/z= 299 (4%) O OH Morfina (radical) m/z= 284 (6%) CH3 N

H3C O O O

CH3 N

H3C

C O O m/z= 42 (40%) O C

- H2C

- CH3

Figura 7. Schema reactiei de fragmentare a 6-MAC la morfina

196

In continuare, principalele reactii de fragmentare sunt sunt comune, iar pentru simplificare, le vom prezenta doar la morfina. Principalele reactii de fragmentare sunt fragmentarile complexe de tip si la nivelul grupei functionale aminice tertiare, insotite de transferul unuia sau mai multor protoni si electroni. Astfel, picurile de la m/z= 215 (22%) si m/z= 70 (17%) sunt picuri datorate fragmentarilor complexe de tip si la nivelul grupei functionale aminice tertiare, insotite de transferul a 2 protoni si a mai multor electroni; picurile de la m/z= 204 (3%) si m/z= 81 (15%) sunt picuri datorate fragmentarilor complexe de tip si la nivelul grupei functionale aminice tertiare, insotite de transferul a 3 protoni si a mai multor electroni, Fig. 8.
CH3 N HO H H O CH2 CH3 + H C N 2 CH

H2C OH m/z= 215 (M-70, 22%) m/z= 70 (17%) Fragmentarile CH3 N HO HO Morfina O m/z= 285 H H N H O OH CH3 OH m/z= 204 (M-81, 3%) + HC C CH3 N CH H2C m/z= 81 (15%)

Fragmentarile

Figura 8. Fragmentari complexe de tip si la nivelul grupei functionale aminice tertiare, in cazul morfinei

197

Fragmentele de la m/z= 226 (8%) si m/z= 59 (17%) si respectiv m/z= 228 (10%) si m/z= 57 (8%) sunt explicate tot prin fragmentarile complexe de tip si la nivelul grupei functionale aminice tertiare, insotite de transferul a 2 protoni si a mai multor electroni (Fig. 9).
H CH2 N H HO O OH m/z= 228 (10%) Fragmentarile + CH2 N CH2 H3C m/z= 57 (8%)

CH3 N HO O OH H N H CH3 HO O m/z= 226 (8%) OH +

CH3 HN CH2 H3C m/z= 59 (17%)

Fragmentarile

Figura 9. Fragmentari complexe de tip si la nivelul grupei functionale aminice tertiare, insotite de transferul a 2 protoni si a mai multor electroni in cazul morfinei

Fragmentele de la m/z= 216 (9%), 162 (25%), 124 (19%), 70 (17%) si 42 (25%), sunt explicate printr-o succesiune de reactii de fragmentare: fragmentarile complexe de tip si la nivelul grupei functionale aminice (insotite de transferul

198

unora sau mai multor protoni si electroni), fragmentare retro Diels-Alder, transpozitii de schelet, Fig. 10.
CH3 N HO O OH Morfina CH3 N HO HO O OH O m/z= 70 (17%) OH CH3 HO O H OH O m/z= 216 (9%) CH3 N N HO m/z= 124 (19%) CH3 + HO CH3 + HO CH3 N HO CH3 N O HC OH CH3 CH3 O OH CH2 CH3 N CH3 H HO O HO HO O OH CH3 N CH2 CH2 CH3 N Fragmentare retro Diels Alder CH3 N

HO

CH2 H2+ H2C N CH2 C m/z= 42 (25%) HO O m/z= 174 CH2

O m/z= 162 (25%)

OH OH m/z= 124 (19%) m/z= 162 (25%) Figura 10. Fragmentari complexe la morfina

Fragmentul de la m/z= 268 (12%) se datoreste fragmentarii de tip la nivelul grupei functionale fenolice, Fig. 11.

199
CH3 N HO O OH - HO m/z= 17 + O OH m/z= 268 (12%) CH3 N

Figura 11. Schema reactiei de fragmentare la nivelul grupei functionale fenolice din morfina

Caracteristici comune si deosebiri in spectre

ionii moleculari sunt fie foarte intensi fie, cel mai adesea, picuri de baza. Ei sunt urmati de picuri M+1 (intense) si precedati de M-1 (mai putin intense); principala reactie de fragmentare este fragmentarea de tip si la nivelul grupei functionale aminice tertiare; spectrele contin picuri specifice la m/z= 42, 59, 70, 81 (si cele aferente de la M-42, M-59, M-70, M-81), caracteristice fragmentari de tip si la nivelul grupei functionale aminice tertiare; pentru codeina si 6-MAC apar 2 picuri specifice la m/z= 282 si m/z= 229
CH3 N O O m/z= 299 CH2 O O m/z= 229 OH + H2C OH CH3 N CH - HO m/z= 17 O O m/z= 282 + CH3 N

H2C m/z= 70

Figura 12. Schema reactiei de fragmentare la nivelul grupei functionale alcoolice si fragmentarile complexe de tip si la nivelul grupei functionale aminice tertiare, insotite de transferul a 2 protoni si a mai multor electroni in cazul codeinei si 6-MAC

200

care se datoresc fragmentarii de tip la nivelul grupei functionale alcoolice si respectiv fragmentarii de tip si la nivelul grupei functionale aminice tertiare, fig. 12.

2. Seria morfinanului In aceasta grupa intra analogii tetraciclici de morfina. Prezentam in continuare spectrele de masa (GC-MS, Electron Impact) ale principalelor droguri din aceasta clasa: Levorfanolul si Dextrometorfanul:
100 59 O 271

50 N 31 0 10 30 50 70 (m ainlib) Dextrom ethorphan 90 110 130

150 214 171 42 70 91 115 128 150 170 185 190 210 228 242 256 230 250 270

Figura 13. Spectrul de masa al dextrometorfanului

100 OH 150 257

50 59 N 128

157

200

189 171 140 160 180 200 214 228 242 240 260

30 42 0

82 91

115

20 40 60 80 100 (m ainlib) Morphinan-3-ol, 17-m ethyl-

120

220

Figura 14. Spectrul de masa al levorfanolului

201

Asa dupa cum se observa de mai sus, si acesti compusi poseda spectre de masa asemanatoare, prezentind asemanari cit deosebiri atit intre ele cit si comparativ cu seria morfinei. Principalele reactii de fragmentare sunt tot fragmentarile complexe de tip si la nivelul grupei functionale aminice tertiare, insotite de transferul unuia sau mai multor protoni si electroni. Astfel, in spectrele de masa ale dextrometorfanului (fragmentarile vor fi exemplificate in cazul dextrometorfanului, pentru levorfanol fiind similare) fragmentele de la m/z= 212 (15%) si m/z= 59 (90%) si respectiv m/z= 214 (37%) si m/z= 57 (3%) sunt explicate tot prin fragmentarile complexe de tip si la nivelul grupei functionale aminice tertiare, insotite de transferul a 2 protoni si a mai multor electroni, Fig. 15.
H CH2 N H O m/z= 214 (37%) Fragmentarile CH3 N O m/z= 272 (BP, 100%) H N H CH3 H3C H3C O m/z= 212 (15%) + + CH2 N CH2 H3C m/z= 57 (3%)

CH3 HN CH2 H3C m/z= 59 (90%)

Fragmentarile

Figura 15. Fragmentari complexe de tip si la nivelul grupei functionale aminice tertiare, insotite de transferul a 2 protoni si a mai multor electroni in cazul dextrometorfanului

202

Fragmentele de la m/z= 171 (19%), 150 (51%), 42 (10%) si 31 (11%), sunt explicate printr-o succesiune de reactii de fragmentare: fragmentarile complexe de tip si la nivelul grupei functionale aminice (insotite de transferul unora sau mai multor protoni si electroni), Fig. 16.
CH3 N O O CH2 O CH3 N CH2 H CH3 N CH3 N + CH2

O m/z= 150 (51%) m/z= 121 (4%)

CH2 O m/z= 216 (3%) CH2 + H2C

CH3 N H2C N CH2 m/z= 42 (10%) CH -HC CH H2C m/z= 70 (2%)

+ H2C OH m/z= 31 (11%) m/z= 171 (19%)

Figura 16. Fragmentari complexe in cazul dextrometorfanului

Fragmentul de la m/z= 256 (8%) se datoreste fragmentarii de tip la nivelul grupei functionale metoxi, Fig. 17.
CH3 N H3C O - CH3 m/z= 15 O m/z= 256 (8%) CH3 N

203 Figura 17. Schema reactiei de fragmentare la nivelul grupei functionale metoxi in cazul dextrometorfanului

Caracteristici comune si deosebiri in spectre

ionii moleculari sunt fie foarte intensi fie, cel mai adesea, picuri de baza. Ei sunt urmati de picuri intense M+1 (intense) si precedati de M-1 (intense); principala reactie de fragmentare este fragmentarea de tip si la nivelul grupei functionale aminice tertiare; spectrele contin picuri specifice la m/z= 42, 59 (si cele aferente de la M-42, M-59), caracteristice fragmentari de tip si la nivelul grupei functionale aminice tertiare; spre deosebire de seria morfinei picurile de la m/z= 59 si m/z= 150 sunt foarte intense. 3. Seria benzomorfanului In aceasta grupa intra analogii triciclici de morfina. Prezentam in continuare spectrele de masa (GC-MS, Electron Impact) ale principalelor droguri din aceasta clasa: Pentazocina si Fenazocina.
100 217

45 N 50

70

110 OH 159 146 174 188 160 180

202 270 230 242 256 200 220 240 260 280 300 285

55 0

82 91 100

115 120

131 140

40 60 80 (m ainlib) Pentazocine

Figura 18. Spectrul de masa al pentazocinei

204

100

230

N 50

44 0

58 69

91 105 100 120

158 173 187 131 145 140 160 180 200 220

OH 320 240 260 280 300 320

40 60 80 (m ainlib) Phenazocine

Figura 19. Spectrul de masa al fenazocinei

Asa dupa cum se observa de mai sus, acesti compusi poseda spectre de masa mai degraba diferite, prezentind totusi ceva asemanari intre ele si asemanari mult mai putin evidente comparativ cu seria morfinei si morfinanului. Aceste aspecte sunt datorate in primul rind modului diferit de fragmentare: in timp ce in seria morfinei si morfinanului principalele reactii de fragmentare sunt tot fragmentarile complexe de tip si la nivelul grupei functionale aminice tertiare, in seria benzomorfanului principalele reactii de fragmentare sunt diferite: in cazul pentazocinei principala reactie de fragmentare este o fragmentare de tip ipso la nivelul grupei functionale aminice tertiare insotita de transferul unui proton si de migrarea mai multor electroni, si care justifica fragmentele de la m/z= 217 (BP, 100%) si m/z= 68 (9%), Fig. 20; in cazul fenazocinei principala reactie de fragmentare fie o fragmentare de tip la nivelul grupei functionale aminice tertiare, care corespunde in acest caz cu o fragmentare tropilica, si care justifica fragmentele de la m/z= 230 (BP, 100%) si m/z= 91 (5%), Fig. 21.

205
H

N HO Pentazocina m/z= 285 (M+, 19%) HO m/z= 172 (21%) HO

NH + m/z= 68 (9%)

m/z= 217 (BP, 100%)

H2N + H3C CH2

m/z= 45 (74%)

N HO Pentazocina H HO

CH2 + H2C

CH3 N CH +

m/z= 56 (11%) H2C m/z= 159 (23%) m/z= 70 (44%) +

N HO Pentazocina - CH3 HO

m/z= 270 (24%)

Figura 20. Schema reactiei de fragmentare in cazul pentazocinei

Fragmentele de la m/z= 172 (22%), 159 (23%), 70 (44%), 56 (11%) si 45 (74%), sunt explicate printr-o succesiune de reactii de fragmentare: fragmentarile complexe de tip si la nivelul grupei functionale aminice (insotite de transferul unora sau mai multor protoni si electroni), Fig. 20. Fragmentul de la m/z= 270 (22%), se explica printr-o fragmentare a metilului din fata de dubla legatura.

206

N HO Pentazocina m/z= 321 (M+, 1%) + H2O m/z= 173 (6%) HO

CH2 N +

m/z= 91 (5%) m/z= 230 (BP, 100%) HN + H3C m/z= 58 (12%) CH2 N + H2C H HO H2C H2 C HO m/z= 158 (5%) CH3 N CH CH2 + CH2 H2C N CH2 m/z= 42 (6%)

HO

Figura 21. Schema reactiei de fragmentare in cazul fenazocinei

Fragmentele de la m/z= 173 (6%), 158 (5%), 58 (12%) si 42 (6%), sunt explicate printr-o succesiune de reactii de fragmentare: fragmentarile complexe de tip si la nivelul grupei functionale aminice (insotite de transferul unora sau mai multor protoni si electroni), Fig. 21.

4. Seria piperidinei In aceasta grupa intra analogii monociclici analogi morfinei. Prezentam in continuare spectrele de masa (GC-MS, Electron Impact) ale principalelor droguri din aceasta clasa: Petidina (Meperidine, Demerol), -Prodine, Profadol si

Fentanil.

207

100

71

O O 50 42 29 0 10 30 50 70 90 110 130 150 (m ainlib) 4-Piperidinecarboxylic acid, 1-m ethyl-4-phenyl-, ethyl ester 170 190 210 230 250 57 91 77 N 103 115 131 158 190 202 172 218 232 247

Figura 22. Spectrul de masa al petidinei

100

172

O 50 84 187 N 42 29 0 20 40 60 (m ainlib) Alphaprodin 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 57 77 91 105 129 144 158 204 261 O

Figura 23. Spectrul de masa al alfa-prodinei

208
100 57

OH

50

42 65 0 77 91 107 133 147 177 219

40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 (m ainlib) Phenol, m -(1-m ethyl-3-propyl-3-pyrrolidinyl)-

Figura 24. Spectrul de masa al profadolului

100

245

N 50 O N

146

189 29 42 57 77 105 91 132 158 0 10 30 50 (m ainlib) Fentanyl 70 90 110 130 150 170 190 210 230 250 270 290 310 330 350 202

Figura 25. Spectrul de masa al fentanilului

Asa dupa cum se observa de mai sus, acesti compusi poseda spectre de masa mai degraba diferite, prezentind totusi ceva asemanari intre ele si asemanari mult mai putin evidente comparativ cu primele 3 serii anterioare de morfinomimetice (care tin de fragmentarile scheletului amini). Din acest motiv fiecare spectru va fi interpretat semarat. Datele furnizate de spectrul de masa al petidinei permit elaborarea unei scheme a reactiilor de fragmentare ca cea din Fig. 26, si pot fi interpretate dupa cum urmeaza:

209

- ionul molecular M+ apare la m/z= 247 cu o intensitate mare, de 50%, caracteristic pentru esteri; - picul de baza (BP), apare la m/z= 71 (100%) si se datoreaza unei fragmentari fata gruparea functionala esterica; aceiasi fragmentare explica si picul de la m/z= 174 (19%); fragmentarea ulterioara a ultimului fragment (fragmentarile complexe de tip si la nivelul grupei functionale aminice insotite de transferul a 2 protoni si unora sau mai multor electroni) genereaza fragmentele de la m/z= 57 (29%) [ din care ulterior se genereaza m/z= 42 (25%)] si m/z= 117 (2%); fragmentul de la m/z= 117 sufera ulterior o fragmentare tropilica generind cationul tropiliu de la m/z= 91 (19%) sau o fragmentare fata de dubla legatura care genereaza cationul fenil la m/z= 77 (10%); tot prin fragmentarea lui m/z= 117 (fragmentare la nivelul dublei legaturi) se genereaza si fragmentul m/z= 103 (24%);
H3C N CH2 N O + O H O H m/z= 174 (19%) - CH3 H CH2 N + m/z= 103 (24%) + m/z= 77 (10%) m/z= 91 (19%) + m/z= 117 (2%) CH2 - CH3 H2C N CH2 m/z= 42 (25%) H O m/z= 71 (BP, 100%) H

Petidina m/z= 247 (50%)

H3C m/z= 57 (29%)

Figura 26. Schema reactiei de fragmentare pentru petidina

210
H3C N H3C N

H3C N - CH3 O O Petidina - C2H5 m/z= 29 (9%) O O m/z= 218 (29%) O

O CH2 O - H2C O m/z= 232 (10%) H3C N H3C N - CO m/z= 202 (4%)

- CO2

m/z= 174 (19%)

Figura 26. Schema reactiei de fragmentare pentru petidina (continuare)

- picul de la m/z= 218 (29%) si cel ulterior de la m/z= 174 (19%) se datoresc unor fragmentari fata gruparea functionala esterica; fragmentarea metilului (din gruparea etil esterica) genereaza fragmentul de la m/z= 232 (10%) din care ulterior se genereaza m/z= 202 (2%) (tot fragmentari fata gruparea functionala esterica) iar in final se genereaza m/z= 174 (19%). Datele furnizate de spectrul de masa al alfa-prodinei permit elaborarea unei scheme a reactiilor de fragmentare ca cea din Fig. 27, si pot fi interpretate dupa cum urmeaza: - ionul molecular M+ apare la m/z= 261 cu o intensitate mica, de 11%; - picul de baza (BP), apare la m/z= 172 (100%) si se datoreaza unor fragmentari complexe in pozitia fata gruparea functionala esterica insotite de transferul a 2 protoni si unora sau mai multor electroni; fragmentarea ulterioara a ultimului fragment (fragmentarile complexe de tip ipso la nivelul grupei functionale aminice insotite de transferul unora sau mai multor electroni si protoni)

211

genereaza fragmentul de la m/z= 144 (17%); ulterior, printr-o fragmentare alchilica a gruparii etil, din m/z= 144 se genereaza fragmentul m/z= 117 (2%); fragmentul de la m/z= 117 sufera ulterior o fragmentare tropilica generind cationul tropiliu de la m/z= 91 (13%) sau o fragmentare fata de dubla legatura care genereaza cationul fenil la m/z= 77 (14%); tot prin fragmentarea lui m/z= 117 (fragmentare la nivelul dublei legaturi) se genereaza si fragmentul m/z= 105 (13%).
H3C N H3C N H + O H O H - CH4 m/z= 188 (14%) O O m/z= 71 (BP, 100%) H3C N

Alfa-prodina m/z= 261 (15%) N +

- HC NH
m/z= 28

m/z= 144 (17%) m/z= 172 (BP, 100%) m/z= 77 (14%)

m/z= 84 (37%)

H CH2 N + CH2 - CH3 H2C N CH2 m/z= 42 (8%)

m/z= 105 (13%) + m/z= 77 (14%)

m/z= 117 (2%)

H3C m/z= 57 (14%)

+ m/z= 91 (13%)

Figura 27. Schema reactiei de fragmentare pentru alfa-prodina

212

Datele furnizate de spectrul de masa al profadolului permit elaborarea unei scheme a reactiilor de fragmentare ca cea din Fig. 28, si pot fi interpretate dupa cum urmeaza: - ionul molecular M+ apare la m/z= 219 cu o intensitate foarte mica, de 3%, caracteristic pentru fenoli; - picul de baza (BP), apare la m/z= 57 (100%) si se datoreaza unor fragmentari complexe de tip si la nivelul grupei functionale aminice tertiare insotite de transferul unui proton si unora sau mai multor electroni; aceiasi fragmentare explica si picul de la m/z= 162;
H N CH2 HO Profadol m/z= 219 (M+, 3%) H N H HO m/z= 219 (M+, 3%) HO m/z= 177 (7%) CH2 + HO m/z= 162 N CH2 H3C m/z= 57 (BP, 100%) H2C N CH2 m/z= 42 (8%)

H CH2 CH2 + H H2C N CH2 m/z= 42 (8%)

HO m/z= 107 (2%) m/z= 91 (2%)

m/z= 77 (2%)

Figura 28. Schema reactiei de fragmentare pentru profadol

213

fragmentarile complexe de tip ipso si fata de grupa functionala aminica insotite de transferul unora sau mai multor electroni si protoni) genereaza fragmentele de la m/z= 177 (7%) si m/z= 42 (6%); ulterior, printr-o fragmentare complexa a fragmentului de la m/z= 177 se genereaza fragmentul m/z= 107 (2%), din care ulterior printr-o fragmentare tropilica se genereaza cationul tropiliu de la m/z= 91 (2%) si ulterior se genereaza cationul fenil la m/z= 77 (2%). Datele furnizate de spectrul de masa al fentanilului permit elaborarea unei scheme a reactiilor de fragmentare ca cea din Fig. 29, si pot fi interpretate dupa cum urmeaza: - ionul molecular M+ (m/z= 336) lipseste; - picul de baza (BP), apare la m/z= 245 (100%) si se datoreaza unor fragmentari tropilice (care explica si prezenta cationului tropiliu de la m/z= 91 (17%) si cationul fenil la m/z= 77 (20%); - fragmentarile complexe de tip si la nivelul grupei functionale aminice insotite de transferul a 2 protoni si unora sau mai multor electroni in fragmentul m/z= 245, genereaza fragmentele de la m/z= 189 (38%) si m/z= 57 (23%) [din care ulterior se genereaza m/z= 42 (28%)]; - fragmentarea de tip la nivelul grupei functionale cetonice insotite migrarea dublei legaturi in fragmentul m/z= 189, genereaza fragmentele de la m/z= 132 (16%) si m/z= 57 (23%) [din care ulterior se genereaza m/z= 29 (26%)];

214

N N

CH2 H

m/z= 77 (20%)

H N N O O Fentanil m/z= 336 (M+, 1%)

+ m/z= 91 (17%)

m/z= 245 (BP, 100%)

CH2 N O m/z= 189 (38%) + N CH2 H3C m/z= 57 (23%) - CH3 H2C N CH2 m/z= 42 (28%)

N +

+ HC O m/z= 29 (26%)
m/z= 57 (23%)

m/z= 132 (16%)

Figura 29. Schema reactiei de fragmentare pentru fentanil

215

BIBLIOGRAFIE

Referinte bibliografice Web 1. UNODC, World Drug Report 2007. Website: http://www.unodc.org/pdf/research/wdr07/WDR_2007.pdf 2. World Drug Report 2007, United Nations, Office of Drugs and Crime, 2007. Website: http://www.unodc.org/unodc/index.html 3. Drugs of Abuse, Regional Laboratory for Toxicology. Website: http://www.toxlab.co.uk/dasguide.htm#OPIATES 4. Drugs of Abuse, Regional Laboratory for Toxicology. Website: http://www.toxlab.co.uk/dasguide.htm#CANNABIS. 5. Understanding the Spice phenomenon. European Monitoring Centre for Drugs and Drug Addiction, Lisbon, 2009. Website: http://www.emcdda.europa.eu/html.cfm/index90917EN.html 6. C. Steup, Untersuchung des Handelsproduktes Spice. Note from THC Pharm GmbH. Website: http://usualredant.de/drogen/download/analyse-thc-pharmspice-jwh-018.pdf 7. Synthetic cannabinoids and Spice. European Monitoring Centre for Drugs and Drug Addiction, Lisbon, 2009. Website: http://www.emcdda.europa.eu/html.cfm/index90414EN.html

Idex alphabetic carti si manuale de referinta Drummer, O.H. The Forensic Pharmacology of Drugs of Abuse, Oxford University Press, New York, 2001. Giddings, J.C.. Unified Separation Science. New York: Wiley, 1991

216

Grob, R.L.; Barry, E.F. Modern Practice of Gas Chromatography, Wiley, Hoboken, 2004 Gross, J.H. Mass Spectrometry - A Textbook, Springer, Heidelberg, 2004 Harvey, D. Modern Analyiticalt Chemistry, McGraow Hill, London, 2000 Hbshmann, H.J. Handbook of GC/MS: Fundamentals and Applications, 2nd ed.,Wiley-VCH, Weinheim 2009 Kitson, F.G.; Larsen, B.S.; McEwan, C.N. Gas Chromatography an Mass Spectrometry A prasctica Guide, Academic Press, San Diego, 1996 Liu, R.; Gadzala, D.E. Handbook of Drug Analysis, CRC PRESS, Washinton, DC, 1997. Mangalagiu, I. Alcaloizi morfinici si analogy de sinteza, Ed. Dossoftei, Iasi, 2000. Maurer, H.H.; Pfleger, K.; Weber, A.A. Mass Spectral and GC Data of Drugs, Poisons, Pesticides, Pollutants and their Metabolites, Wiley-VCH, Weinheim, 2007. McLafferty, F.W.; Turecek, F. Interpretation of Mass Spectra, 4-thy Ed., University Science Books, Sausalito, California, 1993 Mc Master, M.C. GC/MS: a Practical User,s Guide, Wiley, Hoboken, 2008 Rood, D. A Practical Guide to the Care, Maintenance, and Troubleshooting fo Capillary Gas Chromatograpy Systems, 2nd Edition, Heidelberg, 1995 Settle, F, Handbook in Instrumental Techniques for Analytical Chemistry- Section II, Prentice Hall, New Jersey, 1997 Spiehler, V. Clarkes Analysis of Drugs and Poisons in Pharmaceuticals, in: Body Fluids and Postmortem Material, Pharmaceutical Press, London, 2004. Yinon, J. Advances in Forensic Applications of Mass Spectrometry, CRC PRESS, New York, 2004. Idex alphabetic lucrari stiintifice Beyer, J.; Peters, F.T.; Maurer, H.H. Ther. Drug Monit. 27 (2005) 151. Chen, B.H.; Taylor, E.H.; Papas, A.A. J. Anal. Toxicol. 14 (1990) 12.

217

Felinger, A,; Guiochon, G. Trends in Analytical Chemistry 14 (1995) 6. Khanna, N., Varshney, I.C., Banerjee, S., Singh, B.B. Analyst 108 (1983) 415. Lee, M.S.; Kerns, E.H. Mass Spectrom. Rev. 18 (1999) 187. Maurer, H.H. Anal. Bioanal. Chem. 388 (2007) 1315. Maurer, H.H.; Tenberken, O.; Kratzsch, C.; Weber, A.A.; Peters, F.T. J. Chromatogr. A 1058 (2004) 169. Meadway, C.; George, S.; Braithwaite, R. Forensic Science International 127 (2002) 136. Micaya, A.I., Zaikin, V.G. Mass Spectrom. Rev. 9 (1990) 115. Nourse, B.D.; Cooks, R.G. Anal. Chem. Acta, 228 (1990) 1. Ohta, H.; Suzuki, S.; Ogasawara, K. J. Anal. Toxicol. 23 (1999) 280. ONeal, C.; Poklis, A. J. Anal. Toxicol. 21 (1997) 427. Overton, E.B.; Carney, K.R. Trends in Analytical Chemistry 13 (1994) 252. Staacka, R.F.; Fritschib, G.; Maurera, H.H. Journal of Chromatography B 773 (2002) 35. Tracqui, A.; Kintz, P.; Mangin, P. J. Forensic Sci. 40 (1995) 254. Zbancioc, Ghe.; Moldoveanu, C.; Gradinaru, R.; Drochioiu, G.; Olteanu, G.; Mangalagiu I.I. International Journal of Criminal Investigation 1 (2011) 17. Weinmann, W.; Wiedemann, A.; Eppinger, B.; Renz, M.; Svoboda, M. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 10 (1999) 1028.