REPLICAREA ADN

ADN polimeraza necesit: - prezena celor 4 precursori nucleotidici activai (dATP, dGTP, dTTP, dCTP) i a ionilor de Mg2+; - prezena unui primer care s furnizeze o grupare 3-OH liber; - prezena unui tipar ADN. (ADN)n + dNTP (ADN)n+1 + PP

Caracteristicile procesului de replicare

Procesul de replicare se desfoar dup modelul semiconservativ. NH4Cl a fost folosit ca unic surs de azot la creterea coloniilor de E.coli. Experimentul lui Meselson i Stahl (1958)

16

Replicarea este semidiscontinu i se desfoar n mod diferit pe cele dou catene ADN (catena avansat leading i catena ntrziat lagging).

Enzimele replicrii
Exist o serie ntreag de enzime implicate n procesul de replicare.

Denatureaz dublul-helix ADN

Elimin suprarsucirile ADN

Sintetizeaz noile catene ADN

Diger primerii ARN

Blocheaz renaturarea ADN

Sintetizeaz primerii ARN

Ataeaz ADN polimeraza la tipar

Sudeaz fragmentele Okazaki

17

ADN polimerazele la Procariote La procariote au fost identificate trei ADN polimeraze implicate n procesele de replicare i/sau de reparare: I, II i III. ADN polimeraza I prezint un fragment mare (Klenow) cu activitate ADN polimerazic i 3-5 exonucleazic (proofreading) i un fragment mic cu activitate 5-3 exonucleazic. Situsurile active pentru aceste trei tipuri de activiti enzimatice sunt separate.

Activitatea 3-5 exonucleazic crete marcant fidelitatea replicrii. Activitatea 5-3 exonucleazic joac un rol cheie n mecanismele celulare de reparare a ADN.

Revers-transcriptaza sau transcriptaza invers este o ADN polimeraz ARN dependent caracteristic retrovirusurilor care sintetizeaz ADN pornind de la un primer, folosind un tipar ARN.

ADN polimerazele la Eucariote Celulele eucariotelor superioare conin mai multe tipuri de ADN polimeraze: , , i . ADN polimeraza apare n nucleu, este alctuit din mai multe subuniti i particip direct n procesul de replicare al ADN. Enzima are o procesivitate limitat i este considerat replicaza catenei ntrziate (lagging). ADN polimeraza apare tot la nivelul nucleului i este foarte asemntoare cu varianta , dar difer de aceasta datorit absenei activitii 3-5 exonucleazice. Varianta are o procesivitate practic nelimitat i de aceea se consider c este enzima care sintetizeaz catena avansat (leading) a furcii de replicare. ADN polimeraza are mas molecular mult mai mic dect celelalte dou variante, se regsete tot la nivelul nucleului i se pare c intervine n procesele de reparare a materialului genetic. ADN polimeraza apare exclusiv la nivelul mitocondriilor i are rolul de replicare a ADN mitocondrial.

18

Topoizomerazele: sunt enzime care modific numrul de suprarsuciri ntr-un dublu helix ADN. Pn n prezent se cunosc dou tipuri de topoizomeraze: de tip I (acioneaz prin scindarea unei singure catene ADN i nu necesit ATP) i de tip II (acioneaz prin scindarea ambelor catene de ADN i necesit ATP). Helicazele i proteinele de legare (SSBs Single Strand Binding Proteins): sunt implicate n despiralizarea helixului ADN. Aciunea acestora este asistat i facilitat de topoizomeraze. n E. coli exist dou helicaze diferite: proteina rep are structur monomeric i helicaza II structur hexameric. Ambele enzime realizeaz desfacerea dublelor catene cu consum de ATP. Proteinele SSB: au o structur multimeric, fiecare subunitate component participnd la blocarea procesului de reanelare a ADN. Practic, mai multe copii ale proteinei SSB nvelesc monocatenele de ADN blocnd procesul fiziologic de refacere a punilor de hidrogen i deci a structurii dublu helicale. Ribonucleaza H: are rolul de digera la finalul procesului de replicare primerii ARN. Aciunea enzimei se desfoar cu precdere la nivelul catenei ntrziate unde fiecare fragment Okazaki prezint cte un primer. ARN polimeraza ADN dependent i primaza: sunt cele dou enzime de la E. coli care particip la procesul de sintez a primerilor ARN necesari n iniierea replicrii.

Mecanismul de aciune al topoizomerazelor de tip I

1. Tierea unei catene ADN: este realizat la nivelul legturii fosfodiester. Este eliberat gruparea 3-OH, iar gruparea fosfat din 5 este esterificat cu un rest de tirozin prezent n centrul catalitic activ. Aceast reacie de transesterificare creeaz un complex tranzitoriu ADN-topoizomeraz. Catena eliberat se poate roti liber n jurul catenei intacte. 2. Resudarea catenei ADN: legtura fosfodiester este restabilit utiliznd energia conservat de legtura fosfotirozinic.

19

Asocierea ADN polimerazei cu o protein specific numit sliding clamp crete foarte mult procesivitatea enzimei. Acesta i permite polimerazei s alunece de-a lungul monocatenelor de ADN, adernd practic la acestea.

In vitro, ADN polimerazele sunt capabile s sintetizeze catene de cteva sute de nucleotide lungime. In vivo, datorit asocierii cu proteinele sliding clamps, lungimea catenelor crete enorm.
Proteina Sliding clamp prezint o deschidere central de circa 35 care permite ptrunderea unei monocatene de ADN cu diametrul de 20 i a dou molecule de ap care asigur un strat fin pe care se desfoar alunecarea de-a lungul tiparului a complexului enzimatic polimeraz-sliding clamp. O clas special de proteine (sliding clamps loaders) ajut la ncrcarea sliding clamps la nivelul jonciunii primer-matri.

ADN ligaza: enzima catalizeaz formarea unei singure legturi fosfodiesterice la nivelul unei catene de ADN dintr-un duplex. Enzima este implicat i n procesele de reparare. Sursa de energie pentru reacia enzimatic este furnizat de NAD+ la procariote i de ATP la eucariote sau n bacteriofagul T4.

20

Etapele procesului de replicare

Iniierea replicrii la procariote - o protein specific (Dna A) leag n prezena proteinelor HU o regiune din locusul oriC (originea replicrii). Se formeaz un complex n care ADN din regiunea oriC nconjoar proteina de legare.

are loc topirea succesiv a segmentelor repetate n tandem de la nivelul regiunii oriC cu formarea unui complex deschis. - la complex se leag mai multe proteine printre care helicazele i proteinele SSB. - Are loc despiralizarea ADN, iar apoi ptrunderea primazei i polimerazei la nivelul furcii de replicare.

Sinteza ADN Se realizeaz la nivelul furcii de replicare prin mecanisme diferite pentru cele dou catene: catena avansat este sintetizat continuu, iar catena ntrziat este sintetizat discontinuu, cu ajutorul fragmentelor Okazaki.

21

Terminarea replicrii la procariote Nu este pe deplin elucidat, iar la E. coli are loc la nivelul unei regiuni n care ntlnim un cluster de secvene ter. La final are loc degradarea primerilor ARN, umplerea regiunilor libere i sudarea fragmentelor Okazaki de ctre ligaz.

n cazul cromozomului circular de la E. coli, topoizomerazele de clas II sunt eseniale pentru a asigura separarea celor dou molecule ADN fiice.

Exist multe similitudini ntre replicarea de la procariote i eucariote. La EK decizia ireversibil privind proliferarea celulelor se ia n faza G1 a ciclului celular, iar replicarea propriu-zis are loc n faza S. n cazul cromozomilor liniari lungi de la eucariote apare problema finalizrii complete a procesului de replicare (end replication problem) pe catena ntrziat.

La fiecare rund de replicare, catena ntrziat este incomplet sintetizat, iar regiunile telomerice de la capetele cromozomilor vor fi din ce n ce mai scurte.

22

Problema finalizrii replicrii telomerilor de la eucariote este rezolvat de telomeraz. Aceast enzim deosebit are n compoziie att o parte proteic ct i o molecul de ARN. Telomeraza nu necesit un primer pentru desfurarea activitii de sintez a noilor catene de ADN. Aceasta poate sintetiza noi regiuni de ADN monocatenar utiliznd molecula proprie de ARN drept primer intern. La om, molecula intern de ARN conine 1,5 copii complementare ale secvenelor telomerice: 5 TAACCCTAA 3. Aceast molecul de ARN hibridizeaz specific cu ADN monocatenar din captul 3 al telomerilor formnd o jonciune primer-matri. Ulterior, folosind drept tipar molecula de ARN, telomeraza sintetizeaz noi secvene de ADN complementare prin translocri repetate.

TRANSCRIPIA sinteza ARN

Procesul prin care o gen conduce producerea unei proteine este numit expresie genic. Genele sunt exprimate prin transcriere din ADN n ARNm i prin traducerea acestuia n proteine.

Excepii: genele pentru celelalte tipuri de ARN.

23

SINTEZA PROTEINELOR TRANSLAIA

Ribozomii la PK i EK
Ribozomii reprezint sediul sintezei proteice i sunt agregate multimoleculare de proteine i ARN. Sunt formai din dou subuniti diferite ca mrime i compoziie care se pot separa reversibil. PK subunitate mic (30S) ARNr16S + 21 de proteine diferite ntr-o singur copie; subunitate mare (50S) ARNr5S, ARNr23S + 34 de proteine, dintre care 30 ntr-o singur copie, iar una n 4 copii. EK subunitate mic (40S) ARNr18S + 33 de proteine diferite ntr-o singur copie; subunitate mare (60S) ARNr5S, ARNr5,8S, ARNr28S + 45 de proteine ntr-o singur copie. Ribozomii din mitocondriile celulelor eucariote conin ARNr16S, ARNr12S i proteine.

42

Activarea aminoacizilor
Ataarea fiecrui aminoacid la ARNt corespunztor se face cu ajutorul unor enzime cu nalt specificitate: aminoacil-ARNt sintetaze. Exist cel puin cte o sintetaz i cte un ARNt specific pentru fiecare dintre cei 20 de aminoacizi din structura proteinelor. n cazul aminoacizilor codificai de mai muli codoni exist o singur sintetaz care catalizeaz ataarea acestora la moleculele diferite de ARNt.

Sintetazele prezint situsuri separate recunoatere pentru aminoacizi i pentru ARNt.

de

Recunoaterea Sintetaze ARNt = al doilea cod genetic Complexul aminoacil-ARNt odat format nu mai este verificat la intrarea pe ribozom i n timpul sintezei proteice propriu-zise. Orice modificare ulterioar a aminoacidului activat se va solda cu o eroare n molecula proteic nou sintetizat.

Reacia de activare a aminoacizilor se realizeaz n dou etape:

1. Adenilarea aminoacidului la nivelul gruprii COOH terminale. 2. Aminoacidul adenilat este transferat la nivelul extremitii CCA a ARNt cu formarea unei legturi macroergice. Exist dou clase de sintetaze: cele de clas I sunt monomerice i ataeaz aminoacidul la nivelul gruprii 2-OH; cele de clas II sunt multimerice i ataeaz aminoacidul la nivelul gruprii 3-OH. n final, prin transesterificare, aminoacizii vor fi legai numai la nivelul gruprii 3-OH.

43

ARNt are rolul unui adaptor molecular fcnd legtura ntre codonul din ARNm i aminoacidul specificat de acesta.

Regiunea codificatoare din fiecare ARNm este compus dintr-o niruire continu de codoni nesuprapui numit open reading frame (ORF). Translaia ncepe dinspre captul 5 al ORF i se continu ctre captul 3. Primul i ultimul codon dintr-un ORF se numete START, respectiv STOP. La procariote, codonul START este de obicei AUG, dar mai pot fi folosii i codonii GUG sau UUG. La eucariote codonul START este AUG. n celulele PK moleculele de ARNm prezint mai multe ORF, n timp ce la EK prezint unul singur. Sensul de citire al codonilor este ntotdeauna 5 ctre 3.

Codonul START i iniierea translaiei

La PK toate proteinele sintetizate ncep cu formil-metionin. Aceasta este obinut prin modificri enzimatice n dou etape: Met-ARNtfMet + AMP + PP Met + ARNtfMet + ATP N10formiltetrahidrofolat + Met-ARNtfMet tetrahidrofolat + fMet-ARNtfMet A doua etap este catalizat de enzima transformilaz. La PK exist dou molecule de ARNt diferite pentru Met, respectiv fMet, n timp de la EK exist o difereniere ntre moleculele de ARNtMet care recunosc codonul START i cele care recunosc codonii specifici metioninei din interiorul ARNm.

44

Iniierea translaiei la PK necesit urmtorii factori: subunitatea ribozomal mic, ARNm, fMet-ARNtfMet, proteinele factori de iniiere IF1, IF2, IF3, GTP, Mg2+ i subunitatea ribozomal mare. Recunoaterea i legarea ARNm la nivelul ribozomului se face prin interacia dintre secvena Shine-Dalgarno de la nivelul ARNm i o regiune din ARNr16S de pe subunitatea ribozomal mic.

Procesul de iniiere de la EK este asemntor, dar aici intervin cel puin 9 proteine factori de iniiere. Recunoaterea i legarea ARNm la nivelul ribozomului se face prin interacia structuri cap din poziie 5 cu factorii proteici eIF3 i eIF4.

PK IF1 previne leagarea ARNt ncrcat cu aminoacizi la situsul A n timpul iniierii; IF2 faciliteaz legarea fMet-ARNtfMet la subunitatea ribozomal 30S; IF3 previne asocierea prematur a subunitilor ribozomale.

EK

eIF2 - faciliteaz legarea Met-ARNtMet la subunitatea ribozomal 40S; eIF2B, eIF3 - leag subunitatea ribozomal 40S i faciliteaz desfurarea pailor urmtori; eIF4A datorit activitii helicazice nltur structurile secundare din ARNm i permite legarea acestuia la subunitatea 40S; eIF4B realizeaz scanarea ARNm i localizeaz codonul START; eIF4E leag structura 5-cap din ARNm; eIF4G se leag de eIF4E i de proteina de legare a cozii poliA (polyA binding protein-PAB); eIF5 produce disocierea factorilor de iniiere de la nivelul subunitii 40S; eIF6 faciliteaz disocierea ribozomilor inactivi 80S n subunitile componente.

45

Etapele iniierii (PK): 1. IF1 i IF3 interacioneaz cu subunitatea ribozomal 30S i faciliteaz legarea ARNm. IF3 mpiedic adiionarea subunitii ribozomale mari (50S). IF1 leag situsul ribozomal Aminoacil (A). 2. Prin interacia ARNm-ARNr16S, codonul START este poziionat la nivelul situsului Peptidil (P). IF2 legat de GTP ghideaz legarea fMet-ARNtfMet la situsul P. Acesta este singurul ARNt ncrcat care se prinde n acest situs, ceilali legndu-se iniial la situsul A. 3. Are loc hidroliza GTP ceea ce va conduce la eliberarea celor trei factori de iniiere i, ulterior, la legarea subunitii ribozomale mari. La finalul acestei etape vom regsi ribozomul activ, avnd legat ARNm i fMetARNtfMet la nivelul situsului P. n urma asamblrii ntre cele dou subuniti ribozomale se formeaz un canal care permite alunecarea moleculei de ARNm. Ribozomii activi prezint trei situsuri: A, P i E (exit). Situsul E este dispus pe subunitatea mare, n timp ce A i P apar pe ambele subuniti.

Elongarea prin adiionarea aminoacizilor la molecula nascent

Pentru etapa de elongare sunt necesare urmtoarele componente: ribozomul activ (activat n etapa de iniiere), proteine factori de elongare, aminoacizi-ARNt i GTP. Etapa de elongare la PK se desfoar n trei pai: 1. Legarea aminoacil-ARNt corespunztor, conform ordinii codonilor din ARNm. 2. Formarea legturii peptidice. 3. Translocarea.

Cei trei pai ai etapei de elongare se repet pn la atingerea codonului STOP, deci pn la sinteza integral a catenei polipeptidice.

46

Etapa de elongare la PK

1. Legarea aminoacil-ARNt la situsul A. - Aminoacil-ARNt corespunztor formeaz un complex cu factorul de elongare EFTu legat la GTP. - Factorul Tu plaseaz aminoacil-ARNt la nivelul situsului A de pe ribozomul activ. - Prin hidroliza GTP la GDP, EFTu este eliberat de la nivelul ribozomului. - Factorul EFTs realizeaz reciclarea i reactivarea EFTu prin eliberarea GDP i ncrcarea cu o nou molecul de GTP.

2. Formarea legturii peptidice. - Aminoacilul legat la ARNt din situsul P este ataat la aminoacilul din situsul A printr-o legtur peptidic. Concomitent are loc ruperea legturii esterice dintre aminoacil i ARNt. - Reacia este catalizat de o enzim atipic situat la nivelul subunitii mari a ribozomului: peptidil-transferaza. Actul catalitic n sine este realizat de molecula de ARNr23S, parte a acestei ribozime. - Dup realizarea legturii peptidice, ARNt din situsul P i A sufer modificri conformaionale astfel nct capetele 5 i 3 terminale sunt propulsate spre situsul E, respectiv P. - La situsul A vom avea o oligopeptid legat la ARNt al ultimului aminoacid adugat, iar n situsul P un ARNt liber.

47

3. Translocarea. - n acest pas ribozomul se deplaseaz de-a lungul moleculei de ARNm ctre captul 3 terminal. - Deplasarea se realizeaz cu ajutorul factorului EF-G (translocaza) i cu consum de GTP. Aceast enzim, prin hidroliza GTP, produce o modificare conformaional la nivelul ribozomului, fapt care conduce la deplasarea acestuia. - La final, n situsul E se va regsi ARNt nencrcat, care ulterior va fi eliberat de pe ribozom, iar n situsul P se va regsi ARNt avnd legat la captul 3 peptida nascent. Situsul A devine liber i este pregtit pentru un nou ciclu de elongare. - Pe msur ce crete n lungime, peptida nascent este ghidat printr-o fant de la nivelul subunitii mari a ribozomului ctre exteriorul acestuia.

Terminarea translaiei la ntlnirea codonului STOP

Terminarea translaiei este semnalizat de prezena unuia dintre codonii STOP la nivelul situsului A. La PK, terminarea sintezei este asistat de factorii proteici de eliberare RF (Releasing Factors).

n momentul n care un codon STOP ptrunde n situsul ribozomal A factori de eliberare sunt cooptai i asist desfurarea mai multor reacii. Exist dou clase de factori de terminare: I i II.

48

La PK, RF1 recunoate codonii STOP UAG i UAA, iar RF2 codonul UGA. La EK, eRF1 recunoate toi trei codonii STOP. Factorii de eliberare de clas II au rolul de a recicla factorii de eliberare de clas I. Factorii de eliberare interacioneaz cu o regiune de pe subunitatea ribozomal mare numit factor binding site. - Odat recunoscui codonii STOP, RF se leag la acetia i ocup situsul A. - Legarea n situsul A a RF blocheaz activitatea peptidil transferazei. Ulterior, RF hidrolizeaz legtura dintre ultimul aminoacid i ARNt, elibernd proteina nascent. - Eliberarea proteinei nascente i activitatea RF conduc la eliberarea moleculelor de ARNt libere din situsurile E i P. Concomitent are loc i disocierea subunitilor ribozomale 30S i 50S.

La finalul translaiei proteinele nou sintetizate vor fi ghidate ctre alte compartimente celulare unde vor suferi modificri posttranslaionale. -n final, reciclarea ribozomilor este un proces extrem de important n celul. Acesta permite reutilizarea acestora ntr-un nou ciclu de translaie.

Recycling Factor (RRF) i, probabil, IF3.

-Reciclarea implic mai muli factori proteici printre care EF-G, Ribosome

- Aciunea conjugat a RRF i EF-G conduc la eliminarea moleculelor de ARNt libere de la nivelul acestuia. RRF are rolul de se lega la situsul A i prin aciunea EF-G (translocaza) elibereaz situsurile P i E de moleculele de ARNt. Sursa de energie a procesului complex de sintez proteic este furnizat de GTP!

49