DHEA si imbatranirea creierului : aruncarea unei monede in Fantana tineretii

Marco Racchi, Carla Balduzzi and Emanuela Corsini

Cuvinte cheie: Imbatranire-Creier-Dehidroepiandrosteron-DHEA-semnal transducie REZUMAT Rolul fiziologic al DHEA si esterul say sulfa tat DHEA(S) a fost studiat aproximativ 2 decade si inca necesita o clarificare finala. Interesul major in DHEA deriva din pattern-ul sau unic al activitatii. Nivelurile sale prezinta un dramatic declin legat de varsta care sustin implicarea semnificativa a DHEA(S) in procesul imbatranirii. In mod particular relevant pentru procesul imbatranirii este declinul functional care implica memoria si abilitatile cognitive. DHEA este derivat in principal din sinteza glandelor adrenale si gonadelor. Poate fi de asemenea detectat in creier unde este derivat din sinteza care este independenta de sursa de steroizi periferica. Din acest motiv DHEA si alte molecule de steroizi au fost numite neurosteroizi. Studii farmacologice pe animale ofera dovezi ca neurosteroizii pot fi implicati in procesele de invatare si memorie deoarece pot afisa proprietatile de crestere a memoriei la rozatoarele in varsta. Totusi, studiile umane au raportat rezultate contradictorii care pana acum nu sprijina in mod direct utilizarea DHEA in conditii relationate imbatranirii. Ca atare, este important de amintit ca nivelurile plasmatice de DHEA(S) pot sa nu reflecteze nivelurile in SNC, datorita abilitatii intrinseci a creierului de a produce neurosteroizi. Astfel, importanta neurosteroizilor in procesul memoriei si in tulburarile cognitive legate de varsta nu ar trebui sa fie respinsa. In plus, faptul ca, componentul este vandut in cele mai multe tari ca si supliment alimentar sanatos este impiedicata de evaluarea stiintifica riguroasa a potentialului sau. Vom descrie efectele neurosteroizilor, in particular DHEA, a mecanismelor neurochimice implicate in memorie si invatare. Ne vom axa pe un efect de roman, pe un semnal de transductie, mecanism implicand o kinaza cognitiva clasica cum ar fi protein-kinaza C. Obiectivul final este a furniza instrumentele aditionale pentru a intelege rolul fiziologic si potentialul terapeutic al neurosteroizilor in imbatranirea normala si/sau patologica, cum ar fi boala Alzheimer. INTRODUCERE DHEA-ul si esterul sau sulfatat [DHEA(S)] este cel mai abundent hormon circulant la oameni. Aceste molecule sunt sintetizate in principal in glandele adrenale si gonade. Totusi, pot fi produse in creier si in nervii periferici, fie prin metabolizarea hormonilor circulanti sau prin sinteza de novo din colesterol ( 11, 12, 14, 133, 134 ). Datorita ultimelor date, au fost numiti neurosteroizi (13). In sistemul nervos central, neurosteroizii actioneaza via mecanismele receptor-mediate intracelular clasic care regleaza transcriptia genelor specifice. In plus fata de actiunile clasice genomice steroidiene, neurosteroizii pot modula functii cerebrale, comportandu-se ca modulatori alosterici a canalelor ionice si altor receptori neurotransmitatori (122), cum ar fi glutamatul (42) si receptorii GABA (84, 85). In plus, au aratat efecte presupuse ca si agenti neuroprotectori (66,67). Prin aceste actiuni DHEA(S) poate afecta functii centrale

precum memoria si invatarea, protectia neuronilor impotriva excitatiei neurotoxice indusa de aminoacizi si reducerea riscului tulburarilor neurodegenerative legate de varsta (163). In plus fa de activitile de la nivelul creierului, variate alte proprietati incluzand metabolice, imunomodulatoare si antitumorale au fost atribuite acestor steroizi. Interesul in crestere pentru DHEA deriva din faptul ca nivelul sau urmeaza un anume pattern legat de varsta. In particular, nivelurile DHEA sunt foarte ridicate la adultii tineri si scad semnificativ cu varsta (55,115), asa cum la unii oameni, nivelurile DHEA scad in proportie de 95% pe parcursul vietii. Datorita acestor anumite caracteristici ale DHEA, combinate cu efectele sale pleiotrope asupra multor functii celulare si tisulare, la fel ca si corelatia intre nivelurile DHEA i starea general de sntate bun, exista un interes in crestere in terapia substitutiva cu DHEA la vrstnici (65). In media uneori DHEA a fost numit fantana tineretii. Astfel de cerere este o exagerare i faptul c DHEA este vandut in cele mai multe tari ca si supliment alimentar sanatos mpiedic evaluarile stiintifice riguroase a potentialului sau. CHIMIE SI CAI DE BIOSINTEZA DHEA este un hormon steroidian format din 19 atomi de carbon clasificat ca si androgen adrenal. Este derivat din transformarea colesterolului in pregnenolon printr-o reacie n lan de clivaj a partii oxidative catalizata printr-o enzima specifica localizata la interiorul membranei mitocondriale. Aceasta clivare in lant citocrom P450 ( citocrom P450scc ) inlatura partea lantului din 6 atomi de carbon de la molecula colesterolului. Ulterior, caile de biosinteza implica activitatea citocromului P450 microzomal cu 17hidroxilaza: activitatea c17,20-liazei cunoscuta ca si citocrom P450c17, care converteste pregnenolonul ( a 21 carbon steroid ) in DHEA (Fig.1). In final, conversia DHEA in derivatul sau sulfatat DHEA(S) este catalizata de fosfo-adenozil-fosfosulfat-dependenta hidroxisteroid sulfotransferaza. DHEA(S) este metabolic neconvertibila la DHEA prin hidroliza de catre sulfataza. PATTERNUL BIOSINTEZEI DHEA(S) SI PRODUCTIA IN TIMPUL IMBATRANIRII Locul principal de producer al DHEA circulanta la oameni este cortexul adrenal, care este histologic impartit in 3 zone distincte producatoare de clase diferite de hormoni steroidieni. Androgenii adrenali cum ar fi DHEA(S) sunt produsi in zona reticularis. Productia de glucocorticoizi are loc in zona fasciculata, in timp ce corticoizii minerali sunt derivati din stratul exterior, zona glomerulosa (1, 59, 118). In afara de adrenale, gonadele (113, 187) de asemenea produc DHEA in mici cantitati (10 pana la 20% din hormonii circulanti). DHEA este bine cunoscut pentru modelul sau specific de dezvoltare a produciei sale. Este produs la nivele inalte de catre glandele adrenal la fetus si apoi nivelurile sale scad brusc dupa nastere la nivele care sunt virtual nedetectabile (40). Nivelurile DHEA arata o crestere semnificativa in anii nainte de pubertate (adrenarha), si ajung la un varf in a 3-a decada de viata (1, 118). Nivelurile de varf ale DHEA apar a fi diferite la barbati fata de femei, la care sunt niveluri circulatorii hormonale mai scazute. Urmand varful la tinerii adulti nivelurilor sale scad in mod constant cu aproximativ 2% pe an. Diferentele bazate pe sex in nivelurile DHEA indica ca nivelurile hormonale la femeile tinere sunt cu 10 pana la 30% mai scazute decat la barbatii tineri si sunt progresiv in scadere cu imbatranirea (154). Modelul scaderii legate de varsta al DHEA(S) este marcat in constast cu modelul glucocorticoizilor adenali (GCs); nivelurile lor raman neschimbate sau usor crescute pe toata durata vietii (83,135). Alterari

in producerea DHEA in timpul imbatranirii pot, prin urmare, sa fie dependente de schimbarile selective afectand celulele functionale in zona reticularis. Fie numarul de celule functionale este redus (45) sau alterari functionale mai complexe iau locul (118). O scadere selectiva in expresia si activitatea CYP450c17 poate de asemenea sa aiba loc (82). Este interesant in mod particular de observat ca numai oamenii si primatele arata un model specific legat de varsta al productiei de DHEA(S). Nivelurile de DHEA sunt foarte scazute la obolani i oareci (158), datorita absentei sau expresiei foarte scazute al enzimei adrenale responsabila de conversia pregnenolonului in DHEA (CYP450c17). Este important sa consideram aceste diferente cand aducem in discutie rezultatele contradictorii raportate pentru efectele DHEA la roztoare si oameni. Cu toate acestea, rozatoarele au fost un model de studiu valoros al sintezei steroizilor, precum DHEA, in sistemul nervos central. CAILE DE BIOSINTEZA SI ENZIMELE IN SISTEMUL NERVOS CENTRAL De la observaiile pivot ale lui Baulieu i colegilor acestuia in anii 1980, dovezi convingatoare s-au acumulat n biosinteza i activitatea steroizilor n SNC. Constatarea originala demostreaza ca steroizii, precum pregnenolonul si DHEA, au fost prezente in tesuturile din sistemul nervos al rozatoarelor ( incluzand creier si nervi periferici ), la concentratii depasind nivelurile lor plasmatice. Chiar mai mult, aceste nivele raman in SNC pentru o perioada de timp semnificativa (36, 37, 87) chiar dupa indepartarea sursei steroidiene periferice ce urmeaza castrarii sau adrenalectomiei. Acum este clar faptul ca steroizii pot fi sintetizati de novo in sistemul nervos central sau periferic si se poate acumula in aceste structure independent de sursele adrenale sau gonadale. Termenul neurosteroizi a fost utilizat pentru a desemna steroizi direct sintetizati din cholesterol in sistemul nervos (13). Enzimele neurosteroidogenice includ citocrom P450 si enzime non-P450. Formarea se gaseste in principal in mitocondrii sau microzomi. Sinteza steroizilor si a neurosteroizilor depinde mai ales de sinteza tisulara specifica si celulara specifica a unei game speciale de enzime steroidogene. Sistemul nervos central nu este nici o exceptie deoarece enzimele steroidogene sunt produse atat in glii cat si in neuroni. In plus, multiple tipuri de celule gliale, precum astrocitele si oligodendrocitele, pot exprima diferentiat unele din aceste enzime. Localizarea imunohistochimica a clivajului lantului partii citocrom P450 (scc) in oligodendrocitele obolanilor si observatia ca enzimele au fost biologic active au fost primele demonstratii ca steroizii pot fi sintetizati n SNC (74). Urmand aceasta fundamentala descoperire, eforturi intense ulterioare de cercetare s-au stabilit fr echivoc in expresia i localizarea enzimelor sintetice steroidiene in sistemul nervos al mamiferelor si altor specii animale (138). Pentru o revizuire cuprinztoare a complexitatii cailor de biosinteza implicate in sinteza tuturor neurosteroizilor facem referire cititorului la comentariile recente mai cuprinztoare (99, 100). Aici vom discuta rezultatele legate de enzimele majore implicate in sinteza DHEA si DHEA(S), numite enzime citocrom P450: P450scc si P450c17 la fel de bine si sulfataze si sulfotransferaze. CITOCROM P450scc Clivajul lanului lateral de colesterol ce duce la formarea de prgnenolon este catalizata de un complex enzimatic compus din citocrom P450scc (P450scc sau CYP11A1 conform nomenclaturii CYP) care poseda

activitate -hidroxilaza, adrenodoxin sau feredoxin, si adrenodoxin reductaza, localizata in interiorul membranei mitocondriale. Urmand demonstratia initiala a prezentei P450scc in creierul uman ( 75, 76 ), prezenta enzimei a fost demonstrate in alte vertebrate incluzand amfibieni ( 101, 146 ) si pasari ( 145, 148 ). P450scc a fost detectata in cele mai multe tipuri de celule ale sistemului nervos precum astrocite de tipul I (98), oligodendrocite (64), si neuroni ( 54, 149 ). La embrionii de rozatoare in dezvoltare P450scc este exprimata in mod specific in linii celulare derivate din creasta neurala si in structuri senzoriale ale sistemului nervos periferic (PNS) (31). Ukena si colaboratorii au aratat prezenta P450scc in celulele Purkinje ale sobolanilor nou-nascuti si adulti, indicand ca gena nu numai ca este exprimata in celulele gliale ci si in neuroni (149). Kimoto si colaboratorii au raportat localizarea citocrom P450scc in neuronii piramidali si granulele neuronale din hipocampusul sobolanilor (68). Ei de asemenea au observat colocalizarea P450scc cu hidroxisteroid sulfotransferaza. In plus, a fost aratat ca procesul neurosteroidogenezei active a fost stimulat de agonisti NMDA glutamate sugerand ca in neuronii hipocampici sinteza neurosteroida poate fi stimulate si reglata de comunicarea sinaptica glutamatemediata (68). Distributia P450scc ARNm pare a fi similara in creierul femelelor si al masculilor sobolani (31, 98). Watzka si colaboratorii demonstreaza ca in creierul uman nivelurile de expresie ale P450scc ARNm sunt aproximativ de 200 de ori mai scazute in lobul temporal, lobul frontal si hipocamp decat in tesutul adrenal (156). In mod remarcabil, ei au observat ca in timpul copilariei nivelurile P450scc ARNm cresc marcat in lobul temporal ajungand la niveluri adulte la pubertate. In plus, P450scc ARNm este semnificativ crescut in cortexul temporal si cortexul lobului frontal al femeilor comparativ cu barbatii sugerand o expresie dependenta de varsta si sex a CYP11A1 ARNm in creierul uman (19). CITOCROM P450c17 Sistemul enzimatic 17-hidroxilaza/17,20 liaza (citocrom P-450c17) este responsabil de formarea steroizilor C-19 (DHEA) din steroizii C-21 (precum pregnenolon). Aceasta reactie este catalizata de catre o singura enzima microzomala cuplata la o citocrom reductaza, citocrom P-450c17. Aceasta enzima poseda activitati de 17-hidroxilaza si 17,20 liaza. Existenta activitatii P-450c17 in SNC la mamifere a fost dedusa din observatii precoce ca, creierul sobolanilor contine niveluri crescute de DHEA (36). In anii urmatori, totusi, studiile menite demonstrarii directe a prezentei enzimei in creier raman fara success pentru o perioada lunga de timp (16, 75, 98). In 1994, activitatea enzimei steroidiene 17-hidroxilaza a fost demonstrata la probe hipotalamice de broasca (101). Aceasta observatie ofera prima dovada a prezentei P-450c17 in SNC, in timp ce munca ce a urmat a lui Compagnone si colaboratorilor sai (32) demonstreaza prezenta P-450c17 in embrionii sobolanilor. In plus, enzima de asemenea a fost detectata in creierul adult de sobolan, totusi, cu cateva rezultate contradictorii. Compagnone si colaboratorilor sai (32) au sugerat ca P-450c17 este exprimata numai in sistemul nervos periferic in timp ce alte studii au indicat prezenta sa in creierul adult al rozatoarelor (138). In plus, datele recente sugereaza ca astrocitele si neuronii exprima P450c17 si sinteza DHEA din pregnenolon dar ca formarea sa este inhibata in prezenta microgliei (170). Astrocitele au de asemenea capacitatea de a metaboliza DHEA in hormoni sexuali steroidieni (170,171). S-a propus ca DHEA poate fi produs in sistemul nervos de cartre o reactie chimica care nu necesita prezenta enzimei P450c17 si care implica formarea de hidroperoxizi. Aceasta ipoteza este bazata pe observatia ca DHEA este format de celulele C6 ale gliei sobolanilor. Aceste celule nu exprima citocrom P450c17 dupa adaugarea FeSO4 in mediul de cultura (25). Aceasta observatie a

fost mai departe extinsa de unii autori (26) folosind culturi primare de diferentiere a celulelor gliale de sobolani. Au esuat in a detecta proteine P450c17 in astrocite, dar au demonstrate prezenta lor in oligodendrocite. Totusi, rezultatele lor au condus la propunerea ca in diferenierea intre oligodendrocitele i astrocitele din creierul de sobolan, DHEA este format via P450c17-independent si calea alternativa dependenta de stresul oxidativ. Kohchi si colaboratorii sai au investigat contributiile relative ale astrocitelor, oligodendrocitelelor si neuronilor la neurosteroidogeneza (69). Ei arata ca astrocitele exprima scindarea lantului citocrom P450 (P450scc) si 17-hidroxilaza / C17-20-liaza (P450c17) printre alte enzime neurosteroidogenice, si sunt capabile de a produce pregnenolon, DHEA si alti androgeni si estrogeni. Oligodendrocitele nu par sa exprime P450c17 si sunt, prin urmare, incapabile de a produce DHEA. Neuronii exprima P450scc, P450c17 si pot produce DHEA. Totusi, lipsa enzimei cheie (17-HSD) nu permite productia de testosteron. Devine evident ca neurosteroidogeneza poate fi indeplinita prin contributia coordonata a diferitelor tipuri celulare in creier. In plus, expresia acestor enzimenu numai variaza printre tipurile celulare dar de asemenea poate fi gasita in multiple locatii in interiorul neuronilor. De exemplu, P450c17 este gasit atat in corpul celulei dar si in fibre (axoni sau dendrite) extinzandu-se de la corpul celular (32). Deoarece aceste fibre pot face conexiuni cu alti neuroni departe de corpul celulei, exista o posibilitate ca neurosteroizii sa fie sintetizati si eliberati in arii la distanta de corpul celulei. SULFATAZE SI SULFOTRANSFERAZE Efectul pregnenolon si al DHEA difera conform conjugarii lor cu sulfat. De exemplu, DHEA si DHEA(S) exercita diferite efecte asupra cresterii neuronale in culturile neuronilor corticali cerebrali de soarece (33). Steroizii liberi pot pot trece cu usurinta bariera de sange a creierului in timp ce sulfoconjugatii steroizi nu pot, de aceea sulfatarea steroizilor este mai probabil sa ii ia locul in creier. Conjugarea sulfatata a steroizilor este catalizata de sulfotransferaze sau sulfokinaze, o familie de enzime citosolice care transfera partea de sulfat de pe molecula donorului universal 3-fosfoadenozina 5-fosfosulfat (PAPS) la o grupare hidroxil a substantelor steroide. Clonarea sulfotransferazei steroide umane a relevant existenta a multiple izoforme exprimate intr-o maniera tesut-specifica cu diferite afinitati pentru substante steroide variate. Sulfotransferaza steroida majora implicata in conjugarea DHEA este un membru al familiei de sulfotransferaze hidroxisteroide (HST) care actioneaza pe alcoolii primari si secundari ai hidroxisteroizilor precum colesterol si DHEA (140, 157). In ciuda dovezilor pentru activitatea sa (116), detectarea sulfotransferazei in creierul mamiferelor a fost problematica. Mai recent activitatea sa a fost direct demonstrate in creierul sobolanilor homogenate (124). ARNm ce codeaza sulfataza steroidiana, enzima care converteste steroizii sulfatati in steroizi liberi, a fost detectat in diferite regiuni in creierul de sobolan embrionar prin hibridizare in situ (35). Folosind imunohistochimie enzima a fost localizata in creierul de broasca (18). In final, prezenta si localizarea sulfotransferazei dehidroepiandrosteronului a fost demonstrata in creierul de sobolan adult (2). In particular, proteina a fost detectata in hipocamp si girusul dintat, si in neuronii mari din mezencefal. Enzima responsabila de hidroliza steroizilor sulfatati conducand la formarea steroizilor neconjugati este o sulfataza. La oameni, gena pentru sulfataza steroidiana a fost localizata in cromozomul X (5). Sulfataza

sobolanului (81) si sulfataza soarecelui ADNc (132) au fost de asemenea clonate. Prezenta sulfatazei mARNs a fost descrisa in cortex, creierul mic, si talamusul fetusului de soarece in timpul ultimei saptamani de gestatie (35). Situsurile de expresie sunt similare cu acelea ale P450c17, sugerand ca aceste 2 enzime pot avea actiuni comune in procese functionale similare. ACTIUNI NEUROCHIMICE ALE DHEA SI NEUROSTEROIZI INRUDITI Modul clasic al actiunii endocrine implica secretia hormonului in fluxul de sange cu actiunea care se petrece in celulele tinta de la distanta. Totusi, steroizii care sunt produsi in SNC pot actiona local printrun mecanis autocrin/paracrin. Este important de notat ca acest mechanism poate fi operativ la niveluri hormonale care sunt mai inalte decat concentratiile fiziologice ale hormonilor steroidieni circulanti. Steroizii influenteaza functiile celulare traditional prin asa numitele actiuni genomice care implica interactiuni ale steroizilor cu receptorii lor intracelulari si reglarea transcriptiei a genelor hormonsensibile. In plus la actiunile genomice clasice, neurosteroizii sunt cunoscuti a actiona in SNC printr-o serie de interactiuni cu receptori neurostransmitatori si alte cai neurochimice, toate incluse in definitia actiuni membranare sau actiuni non-genomice. Numeroase efecte membranare ale steroizilor in sistemul nervos au fost raportate in decadele trecute. Acestea include schimbari in excitabilitatea neuronala, eliberarea de neuropeptide si neurotransmitatori si modularea receptorilor neurotransmitatorilor si canalelor ionice (15, 16, 133). De exemplu, unul din cele mai bine documentate efecte ale DHEA(S) in SNC este legata de modularea complexului de receptori GABAA. A fost prezentat initial (84) ca DHEA si DHEA(S) ( cu DHEA(S) fiind de 3-4 ori mai potent decat DHEA) sunt modulatori negativi ai receptorilor GABAA din moment ce ei inhiba non-competitiv curentii GABA-indusi in culturile neuronale de sobolani (61, 84). Receptorul GABAA este un membru al familiei de canale ionice ligand-dependente, si contine diferite subunitati cu subtipurile , , si fiecare incluzand situsuri diferite de legare pentru GABA, benzodiazepine, barbiturice si convulsivante. Este probabil ca, desi absolut nici o specificitate nu a fost determinate, subunitatile si nu sunt implicate in nici o neuromodulare pozitiva sau negativa de catre steroizi. Mecanismul modularii GABAergic in functie de neurosteroizi pare a fi in legatura cu afectarea in frecventa si durata deschiderii receptorului (56, 57, 85) si in modularea desensibilizarii kinetice a receptorului (169). Mai multe detalii cu privire la modularea receptorilor GABAA de catre neurosteroizi pot fi gasite n alt parte (73, 121). DHEA, DHEA(S) si pregnenolonul sulfat au de asemenea activitate modulatoare asupra receptorilor Nmetil-D-aspartat (NMDA) (33, 34). In paricular, pregnenolonul sulfat (117) actioneaza ca un modulator negativ, in timp ce DHEA, pregnenolonul si esterii lor sulfatati se considera a fi modulatori alosterici pozitivi ai receptorilor NMDA. Totusi, in dezacord cu interactiunile receptorilor GABAA, interactiunea neurosteroizilor cu receptorii NMDA nu a fost concludent documentata (131). DHEA(S) afecteaza de asemenea receptorii sigma. Acesti receptori sunt prezenti in densitate mare in SNC (155) si se considera a fi importanti modulatori functionali ai activitatii glutamatergica in hippocampus (41, 43, 141, 142, 143). De fapt, primul raport al rolului modulator al DHEA(S) pe receptorii sigma demonstreaza ca eliberarea norepinefrinei indusa de HMDA in hippocampus a fost semnificativ

crescuta de adaugarea DHEA(S) la 30nM sau concentratii mai mari (108). Aceste descoperiri au fost replicate (20, 93, 94, 108) in variate sisteme si datele globale sunt consistente cu activitatea DHEA(S) ca si agonist de receptor 1. Prin acest mechanism excitabilitatea neuronala NMDA-indusa este mai probabil a fi potentate (42). Cateva studii la rozatoare arata ca agonistii GABAA deterioreaza invatarea si memoria, in timp ce antagonistii GABAA cresc memoria (29, 62). Este de asemenea cunoscut ca la oameni benzodiazepinele pot afecta cunoasterea (46, 71, 86). Pe de alta parte, agonistii receptorilor cresc performantele memoriei la tinerele rozatoare si in tulburarile cognitive la modelele de rozatoare (89, 90, 92-94, 136). In final, receptorul NMDA este implicat in dezvoltarea potentarii pe termen lung (63, 127). Aceste observatii documenteaza abilitatea DHEA(S) de a modula receptorii neurotransmitatori in SNC care sunt implicati in principal in invatare si memorie. EFECTUL DHEA(S) ASUPRA MECANISMULUI DE TRANSDUCTIE A SEMNALULUI COGNITIV La toate animalele procesele implicate in memorie si invatare includ mecanisme celulare fundamentale ale fosforilarii proteinelor (103). Cateva studii au demonstrat implicarea pritein-kinazei C (PKC) calciufosfolipid-dependenta in schimbarile pe termen lung care reflecta afectarea persistenta biochimica si morfologica ce caracterizeaza mecanismele de invatare si memorie (21, 63, 119). PKC este o familie de multigene de enzime cu cel putin 12 diferite izoforme (44, 114). Mecanismele activarii sale necesita translocatia PKC de la citosol la diferite situsuri intracelulare (70) unde are loc fosforilarea substantelor specific (147). Studii recente (105, 106, 129) au accentuat rolul receptorilor proteici intracelulari pentru activarea C kinazei (RACKs), in complementarizarea PKC. Si mai interesant, activitatea PKC-de fosforilare pare a fi afectata in creierul rozatoarelor senescente (7, 8, 51, 97, 123). Totusi, important este ca, in ciuda diferentelor legate de tulpina in creier, activitatea PKC bazala, procesul de translocatie pare a fi componentul comun al masinariei functionale defective in imbatranirea creierului (8, 9, 51, 70). Rezultatele obtinute de la investigatia acestui subiect au aratat ca translocatia PKC afectata asociata cu afectarea cognitiva dependenta de varsta pot fi corelate cu o expresie redusa a proteinei de ancorare RACK-1 (9, 105, 106, 120, 130). In final, de asemenea in boala Alzheimer, poate fi observata in creierul pacientilor afectati o conditie neurovegetativa semnificativa ce afecteaza cognitia si memoria, un nivel scazut al proteinei RACK-1, poate fi observat in creierul pacientilor afectati (10). In lumina observatiilor subliniate mai sus este interesant in mod particular de a observa ca DHEA(S) poate afecta aceste mecanisme de transductie a semnalului. De fapt, am aratat ca la rozatoarele in varsta, tratate cu DHEA pentru 2 saptamani, folosind pompe osmotice implantate subcutanat, efectul tratamentului a fost o restaurare completa a nivelelor RACK-1 la acelea gasite la sobolanii tineri, atat la nivelele proteinelor cat si ARNm (123). Merita notat ca acelasi efect al proteinei RACK-1 a fost observat in macrofagele alveolare a sobolanilor varstnici (39). Corsini si colaboratorii au demonstrat (38) ca schimbarile imunologice asociate varstei rezulta , in parte de la o scadere in capacitatea functionala a macrofagelor care este data de afectarea translocatiei PKC corelata cu reducerea expresiei RACK-1. Suplimentarea DHEA poate aduce nivelurile RACK-1 la acelea observate la animalele tinere si poate de asemenea functional salva functia imunologica dependenta de macrofage la sobolanii in varsta. Aceste date globale indica ca efectul DHEA, si posibil al altor neurosteroizi, asupra cognitiei si memoriei in imbatranire este exercitata prin restaurarea masinariei de transductie a semnalului PKC defectiv. In plus, efectele paralele asupra

sistemului imun pot acoperi efectul pleiotropic al neurosteroizilor la diferite deficite legate de varsta (Fig. 2). STUDII PRECLINICE LA ANIMALELE IN VARSTA Pe langa demonstrarea clara a activitatilor biochimice si neurochimice ale DHEA(S) si alti neurosteroizi, informatia cheie despre efectele cognitive ale acestor molecule provine din studiile animale. Acestea au fost efectuate in mare parte pe rozatoare si cheia interpretarii corecte a rezultatelor este identificarea testului comportamental aplicat. Acestea include paradigme pe baza de evitare, in care animalele invata un comportament de evitare a stimulilor nocivi, si teste de memorie spatiala implicand diferite tipuri de labirinturi, de exemplu labirintul Y si labirintul de apa Morris (95). Primii care au atat ca DHEA si DHEA(S) au efecte de imbunatatire a memoriei au fost Flood si colaboratorii sai, care au demonstrat ca efectul DHEA asupra paradigmei pe baza de evitare la soareci fie tineri sau varstnici (47, 48, 49, 128). Efectul de imbunatatire a memoriei a fost replicat in paradigma memoriei de scurta durata, evaluate cu labirintul T rezultat in observatiile ca atat DHEA si DHEA(S), administrate i.p. , cresc memoria (96). In alte serii de experimente administrarea DHEAS, inainte sau direct dupa antrenament, creste memoria, desi acelasi efect nu a fost vazut daca drogul a fost dat inainte de testarea retentiei. Aceste rezultate sugereaza ca DHEA(S) creste stocajul si / sau consolidarea materialului de invatat, dar nu imbunatateste regasirea (128). Efectul de imbuatatire al memoriei al DHEA(S) a fost de asemenea confirmat la sobolani folosind teste comportamentale: labirintul de apa Morris si labirintul Y (52). In plus fata de DHEA(S), pregnenolonul si esterul sau sulfatat au fost testate intr-o serie de sarcini cognitive la rozatoare. Niveluri ale pregnenolonului sulfat sunt reduse selectiv in hipocampusul sobolanilor cu varsta de 2 ani (151), si corelate cu deficite de memorie testate in labirintul de apa Morris si labirintul Y. Deficitele de memorie ale sobolanilor varstnici afectati cognitiv pot fi temporar corectate dupa injectii cu pregnenolon sulfat fie intraperitoneale sau bilateral intrahipocampice, confirmand rolul acestui steroid in memorie (151). Administrarea cronica de pregnenolon sulfat la sobolanii adulti masculi a fost obtinuta prin infuzie intracerebroventriculara (i.c.v.) folosind o minipompa osmotica. Efectul administrarii steroidului a fost apoi studiat asupra performantelor memoriei pe un brat al testului de discriminare labirint-Y. Din moment ce un nivel bazal de steroizi este present continuu in sistemul nervos, aceasta abordare s-a asteptat sa aproximeze mai apropiat conditiile fiziologice. Folosind sarcini de memorie spatiala non-stresanta la soarece, cercetatorii au demonstrat ca infuzia cronica de pregnenolon sulfat are efecte de imbunatatire a memoriei (72). Studiile initiale ale lui Flood si colaboratorilor sai au fost extinse la o paradigma de memorie diferita de catre Melchior (96), si neurosteroizii au fost prezentati a reduce efectul tratamentelor amnezice. Utilizarea antagonistilor NMDA dizocilpina la rozatoare induce un deficit cognitiv amnezic care este antagonizat de pregnenolon si metabolitii sai (30, 88). In plus, in timp ce administrarea subcutanata de scopolamina dependenta de doza afecteaza invatarea in timpul unei sarcini de discriminare vizuala apetit consolidata, prin administrarea pregnenolonului sulfat i.c.v. dependent de doza blocand deficitele de invatare induse de scopolamina si a avut un efect aditiv de imbunatatire a memoriei (102). Efectele de ameliorare ale DHEA(S) la soarecii tratati cu scopolamine pot fi blocate de antagonistii selectivi D1 NE-100 (150). Efectele benefice ale pregnenolonului si DHEA(S) la soarecii tratati cu proteina b-amiloid

pot fi prevenite prin haloperidol (91), sugerand un rol semnificativ a receptorilor in activitatile cognitive ale acestor steroizi. De vreme ce interconversia intre formele nesulfatate si cele sulfatate ale DHEA si pregnenolon este un proces reversibil, sortarea semnificatiei sulfatarii in procesul pro-amnezic a fost dificila. Inhibitorii sulfatazei steroide s-au dezvoltat recent. Administrarea inhibitorilor de sulfataza steroida p-O(sulfamoil)-N-tetradecanoiltriamina (DU14) produce inhibitia activitatii sulfatazei steroide si creste inversarea amneziei DHEA(S) (80). Alt inhibitor al sulfatazei steroide, estron-3-O-sulfamat (EMATE), potentiaza efectul DHEA(S) privind pastrarea memoriei asa cum doze scazute de DHEA(S) au fost suficiente pentru a obtine efecte semnificative. EMATE, administrat periferic, potenteaza efectul administrarii central DHEA(S), dar nu al pregnenolonului sulfat, asupra pastrarii memoriei (50). Ar trebui oferita consideratie dependentei de doza a efectelor steroizilor precum DHEA(S). Doza necesara pentru a observa imbunatatirea memoriei variaza considerabil intre diferite studii ceea ce face dificil de a decide fara echivoc cu privire la doza optim pentru acest steroid. Variate cai de administrare au fost utilizate. De fapt, dozele efective i.c.v. au fost mai degraba scazute adesea, in timp ce dozele administrate pe cale periferica (i.p. sau s.c.) variaza considerabil, de la 0.05 la 24 mg/kg. Ar trebui notat ca doza de substitutie comun utilizata la oamenii varstnici variaza de la 0.5 la 1 mg/kg. Este de asemenea de interes faptul ca toate studiile despre raspunsurile dozelor au aratat un pattern in forma de U inversat pentru curba raspunsurilor dozelor. Rezumand studiile mentionate mai sus, exista o dovada importanta in literatura despre rolul neurosteroizilor in mentinerea functiilor cognitive si posibil in restaurarea acestor functii la animalele in varsta. Cea mai dificila sarcina este acum de a demonstra rezultate similare la oameni si transferul probelor preclinice in eficacitate clinica. STUDII CLINICE LA OAMENI De vreme ce multe studii animale convingatoare demonstreaza efectul benefic al DHEA si DHEA(S) in prevenirea deficitelor de memorie legate de varsta, multi cercetatori au adus in discutie ipoteza existentei unei corelatii directe intre schimbarile degenerative asociate cu imbatranirea umana si deficitul progresiv in DHEA si DHEA(S) circulant. De la aceste speculatii ideea unei fantani a tineretii s-a formulat si DHEA si-a asumat un rol oarecum supraevaluat de drog miraculos pentru varsta inaintata (12). Dat fiind ca cele mai multe studii experimentale preclinice au fost efectuate la rozatoare, este necesar de amintit ca sobolanii si soarecii au intradevar foarte putin DHEA circulant. De aceea extrapolarea datelor de la rozatoare la oameni nu este pe deplin corecta. De fapt, cateva studii incercand sa coreleze nivelurile plasmatice DHEA si DHEA(S) si functiile cognitive la oamenii varstnici produc rezultate conflictuale. Unele studii au raportat asocierea deficitelor cognitive cu niveluri DHEA(S) fie scazute (168) sau ridicate (104, 110, 111), in timp ce alte studii nu au gasit nici o corelatie (6, 22, 27, 28, 78, 107, 110, 125). Memoria si performantele cognitive la varstnicii sanatosi au fost evaluate prin teste neuropsihologice evaluand memoria vizuala (memoria pe termen scurt si lung), memoria verbal (amintiri immediate si intarziate), memoria spatiala si testul atentiei/concentratiei. Riscul declinului cognitiv la subiectii varstnici sanatosi nu a fost corelat cu nivelurile DHEA(S) masurate cu

multi ani inaintea testelor cognitive (6). In plus, schimbari longitudinale in performantele cognitive studiate in populatia femeilor varstnice (la varsta de 65 la 80 de ani) nu a fost corelata cu schimbari in nivelurile plasmatice DHEA(S) (167).Un studiu transversal (27) la fel ca si studiile longitudinale pe termen lung (107) si pe termen scurt (28) la barbatii si femeile sanatoase varstnice nu au raportat nici o asociere intre nivelurile plasmatice DHEA(S) si performantele cognitive. Nici rata declinului in concentratiile serice DHEA(S) la barbati si nici media concentratiilor DHEA(S) in cadrul indivizilor nu au fost legate de statusul memoriei sau declinul memoriei. Pe scurt, datele descrise sugereaza ca la varstnicii sanatosi nivelurile DHEA(S) nu par sa fie corelate cu performantele cognitive. Performantele cognitive ale pacientilor cu boala Alzheimer sunt adesea evaluate folosind testul de Examinare Minim al Starii Mintale. In ceea ce priveste subiectii varstnici sanatosi corelatia intre nivelurile DHEA(S) si performantele cognitive sunt minime. Cu toate acestea, rezultate interesante au fost raportate in ceea ce priveste modelul declinului DHEA si forma sa sulfatata. Un numar de studii au indicat ca la pacientii cu boala Alzheimer, nivelurile DHEA(S) sunt mai scazute comparative cu subiectii varstnici de control individual corespunzator varstei si genului (77, 112, 137, 144, 168). Aceste observatii au fost confirmate intr-un studio longitudinal pe 3 ani condus pe o populatie varstnica de la 70 la 104 ani (58). Rezultatele acestui studiu demonstreaza clar ca nivelurile DHEA(S) plasmatice au fost semnificativ mai scazute la pacientii cu Alzheimer comparativ cu subiectii de control. Aceste descoperiri sugereaza ca nivelurile plasmatice DHEA(S) scazute pot fi vazute ca si un factor de risc pentru boala Alzheimer. Pe neasteptate, un studiu longitudinal pe 6 luni a gasit ca nivelurile plasmatice DHEA scazute, masurate la barbate si la femei cu boala Alzheimer usoara pana la moderata, se coreleaza cu performante mai bune de memorie la inceputul studiului (104). Totusi, aceste nivele nu au fost predictive asupra ratei declinului cognitiv in timp. De vreme ce asa multa atentie medicala si media a fost afisata la beneficiile presupuse ale substitutiei DHEA(S) in imbatranire, cu accent special pe cunoastere, este important de a considera in detaliu rezultatele obtinute pana acum in trialuri clinice ale terapiei de substitutie (vezi table I). Primul studiu de caz singular a fost la o femeie in varsta de 47 de ani aratand o dizabilitate de invatare specifica cu o durata de termen lung si deficit in nivelurile DHEA si DHEA(S) circulante. Tratamentul DHEA cronic a dus la normalizarea nivelurilor plasmatice ale DHEA si DHEA(S) si a dus la recuperarea a unor functii de memorie (24). Trialuri clinice mai recente conduse de Wolf si colaboratorii sai nu au aratat imbunatatiri semnificative. O singura doza orala de DHEA (300mg) nu a avut nici un efect asupra performantelor in cateva teste acoperind diferite aspecte ale memoriei, cum as fi visual, verbal sau memoria declarative la indivizii tineri sanatosi (cu varsta de 25 ani) (160). Intr-un trial mare dublu-orb, controlat placebo implicand 40 barbati si femei sanatosi varstnici (media varstei, 69 ani) intr-o stare de bine psihologica si fizica la fel ca si performantele cognitive au fost evaluate folosind cateva chestionare si teste neuropsihologice. Substitutia de DHEA (50 mg zilnic timp de 2 saptamani) nu a avut nici un effect benefic important si nici unul din parametrii cognitive masurati cu tendinta nesemnificativa pentru femei spre o performanta mai buna in unul din sase teste cognitive (159). Acelasi grup nu poate demonstra un efect benefic al substitutiei DHEA in indicia electrofiziologici ai stimularii sistemului nervos central (161). In legatura cu posibila actiune antiglucocorticoida a DHEA, un efect benefic nu poate fi masurat folosind teste cognitive conform unui factor de stres psiho-social standard de laborator (Trier Social Stress Test; TSST) (162).

Pacientii deprimati au fost de asemenea tratati cu DHEA. Intr-un studiu al lui Wolkowitz si colaboratorilor sai (164, 165) sase de varsta mijlocie si pacienti varstnici cu depresie majora si niveluri plasmatice DHEA(S) scazute bazal au fost deschisi administrarii DHEA ( de la 30 la 90 mg/zi timp de 4 saptamani ). Tratamentul restaureaza niveluri plasmatice circulante adecvate observate la indivizii tineri sanatosi. Autorii observa o imbunatatire semnificativa in ceea ce priveste depresia, la fel ca si in anumite aspect ale performantelor memoriei. Aceste imbunatatiri au fost direct inrudite cu cresterea nivelurilor plasmatice ale DHEA(S) si cu cresterea raporturilor cu nivelurile cortisolului plasmatic. Aceeasi autori (166) ulterior au efectuat un studiu dublu-orb, controlat placebo desemnat sa evalueze efectele posibile antidepresive ale DHEA. 22 de pacienti cu depresie majora, luand antidepresive sau netratati, au fost subiectul unui tratament cu DHEA (pana la 90 mg/zi) timp de 6 saptamani. Tratamentul cu DHEA a fost asociat cu o imbunatatire semnificativa in evaluarile scalei de depresie, sugerand ca ar putea avea efecte antidepresive semnificative la unii pacienti cu depresie majora. Similar, un efect robust al DHEA in dispozitie (anhedonie, pierderea energiei, lipsa motivatiei, amorteala emotionala, tristete, inabilitatea de a face fata, si tendinta la ingrijorare) a fost observata la pacientii cu varsta intre 45 si 63 de ani cu distimie instalata la jumatatea vietii cand au fost tratati timp de 3 saptamani cu 90 mg/zi cu DHEA (23). Aceste rezultate au fost incluse intr-o revizuire sistematica de catre Huppert si Van Niekerk pentru baza de date Cochrane (60). Concluzia revizuirii indica ca datele nu ofera nici un sprijin pentru o imbunatatire a memoriei sau alte aspecte ale functiei cognitive urmand tratamentului cu DHEA la oamenii varstnici normali. Cu toate acestea, este posibil ca orice efect neuroprotector al DHEA(S) poate fi evident numai in trialurile pe termen lung. Asadar este necesar a intreprinde trialuri pe termen lung cu un numar de participanti sufficient pentru a permite detectarea efectelor DHEA, daca ele exista. Unul din cele mai mari trialuri completate recent (17) a studiat efectul substitutiei timp de un an al DHEA la 280 de indivizi sanatosi (cu varsta intre 60 si 79 ani) intr-un studio dublu-orb controlat placebo. Datele prezentate includ imbunatatiri semnificative in aspectele privitoare la turnoverul osos la femei, parametrii libidoului si statusul pielii. Nici o data nu a fost inca prezentata pentru parametrii cognitivi. Mai recent van Niekerk si colaboratorii au condus un trial clinic intr-o proba non-clinica de 46 de barbati cu varsta intre 62 si 76 de ani unde subiectii au fost tratati intr-un model de trial ramdomizat dublu-orb cu 50 mg DHEA zilnic pentru 13 saptamani. O analiza coreland datele comportamentale de baza cu datele hormonale arata o corelatie complexa semnificativa intre DHEA circadian si nivelurile de cortizol (inclusiv raportul) si confuzie, anxietate, perturbari ale starii generale si performantele memoriei. Totusi, analiza efectului tratamentului nu arata nici un efect semnificativ al DHEA si oricare din rezultatele studiului (152). REGIMURI DE DOZAJ LA OAMENI SI STUDII FARMACOCINETICE Cateva studii farmacocinetice au stabilit intervalul de doze optime pentru substitutia DHEA in imbatranire. Trialuri clinice variate (indicate mai sus) au utilizat adesea o doza variabila de DHEA, cu valori intre 25 450 mg/zi. Dozarile hormonale variaza, totusi, mai putin decat in studiile animale. Aceasta este probabil datorita optiunii universale al administrarii oralevin trialuri umane. Arlt si colaboratorii sai (3) au studiat farmacocinetica si biotransformarea administrarii orale DHEA la 14 barbati voluntari sanatosi pentru a defini o doza convenabila pentru substitutia DHEA la barbatii varstnici. Nivelurile DHEA la voluntari a fost sub 1500 ng/ml. 50 mg DHEA cresc DHEA(S) seric la valorile medii ale barbatilor tineri-adulti, in timp ce dupa 100 mg DHEA nivelurile au fost suprafiziologice. Arlt si

colaboratorii sai de asemenea au demosntrat ca nivelurile sanguine ale androgenilor raman neschimbate dupa administrarea DHEA, in timp ce nivelul estrogenilor cresc semnificativ intr-o maniera dependenta de doza, dar inca in limitele normale superioare pentru barbate. Legrain si colaboratorii sai (79) au folosit studii farmacocinetice pentru a alege regimul de dozaj ulterior folosirii in trialurile lor clinice (17). Tablete de DHEA de 50 si 25 mg au fost administrate oral zilnic la 24 barbati sanatosi si femei in imbatranire timp de 8 zile. Datele obtinute demonstreaza restabilirea nivelurilor DHEA ale tinerilor cu ambele doze. Interesant, timpul de injumatatire aparent al DHEA a fost mai lung de 20 de ore sugerand o hidroliza de rezerva semnificativa a unor cantitati mari de DHEA(S) in vivo. Testosteronul circulant si estrogenii cresc in limitele nivelurilor tinerilor adulti normali cum a fost indicat anterior n studiul lui Arlt si colaboratorilor sai. Alte studii (4, 53, 109, 153) confirma substantial aceste date si concluzioneaza ca doza umana optima pentru terapia de substitutie a DHEA este 50 mg/zi sau mai scazuta. CONCLUZII Datele din literature revazute aici ofera dovada ca DHEA, printre alti neurosteroizi, au efecte semnificative asupra sistemului nervos central. Printre cateva efecte potentiale ale DHEA sunt acelea care implica modularea performantelor cognitive. Cercetarile preclinice si clinice demonstreaza o dihotomie intre rezultate semnificative masurabile obtinute la animale, in mare parte rozatoare, si vag si adesea rezultate nesemnificative obtinute la oameni. La acest nivel al cercetarii, exista o limitare a dovezilor din trialurile controlate in care DHEA imbunatateste functia cognitive la oamenii normali de varsta medie sau varstnici la fel ca si la indivizii cu dementa. Motivele teoretice pentru un efect benefic al DHEA asupra functiilor cognitive la persoanele varstnice sau oamenii care sufera de dementa sunt persuasive. Cheia de baza, totusi, este modelul studiilor perfecte si complete fata de o clarificare finala a potentialului DHEA in declinul cognitiv legat de varsta si dementa. Desi aceste studii nu sustin ideea ca DHEA este un potentator cognitiv la varstnicii sanatosi, avem nevoie de mai multe cercetari la indivizii dementi. In cercetare am putea detecta fie o imbunatatire a performantelor sau o reducere in rata declinului cognitiv. Un esantion de suficient de mare dimensiune este necesar pentru a detecta schimbari daca acestea sunt prezente si, in plus, tratament pe termen lung este necesar. Efecte adverse pe termen scurt nu au fost evidentiate in trialuri clinice pana acum. Cu toate acestea, utilizarea tratamentelor pe termen lung (mai mult de 12 luni) este in mod particular importanta pentru a stabili daca exista consecinte adverse pe termen lung ale tratamentului. In final, va fi important sa evaluam dozajul efectiv, calea de administrare acceptabila si durata administrarii. Desi cele mai multe trialuri au indicat un regim oral cu doza optima de 50 mg/zi, aceasta doza nu a fost aprobata de nici o agentie guvernamentala. DHEA este vandut in mod curent in magazinele de alimentatie sanatoasa, mai ales in USA. Mai multa atentie ar trebui oferita in studiile viitoare prepararii farmaceutice si farmacocinetice ale formulelor DHEA.