Sunteți pe pagina 1din 19

STRUCTURA COVALENT A ACIZILOR NUCLEICI

Acizii nucleici sunt polinucleotide realizate prin stabilirea de legturi covalente ntre nucleotidele ce se succed n lan. Gruparea 5'-OH a unui nucleotid este legata la gruparea 3'-OH a nucleotidului urmtor printr-o legtur fosfodiesteric. De remarcat ca orice caten polinucleotidic are o direcie (o polaritate) specific, n sensul c, toate legturile internucleotidice au aceeai orientare de-a lungul lanului. Fiecare caten are dou capete: captul 5' la care gruparea OH de la C5' este liber i captul 3' la care gruparea OH de la C3' nu este angajat ntr-o legtur internucleotidic. Prin convenie, stuctura unei catene polinucleotidice este scris ntotdeauna cu captul 5' n stnga i cel 3' n dreapta. De exemplu succesiunea ACGCAC semnific faptul c adenina are grupa 5'-OH neangajat ntr-o legtur cu alt nucleotid spre deosebire de citozin la care gruparea 3'-OH este liber. Dou lanuri polinucleotidice sunt antiparalele atunci cnd unul evolueaz n direcia 5'-3', iar cellalt n direcia 3'-5'. n stabilirea structurii secundare a ADN-ului decisive au fost cercetrile ntreprinse de Chargraff, Rosalind Franklin i Wilkins, ale cror concluzii le vom rezuma n cele ce urmeaz: Analiza cromatografic, efectuat de ctre Chargraff pe moleculele de ADN izolate din diverse specii stabilete o anumit relaie cantitativ ntre cele patru baze azotate. n toate tipurile de ADN studiate numrul de reziduuri de adenin este egal cu cel al reziduurilor de timin, iar cel al reziduurilor de guanin cu cel de citozin;
1

numrul de baze purinice este egal cu cel de baze pirimidinice (A+G=T+C); Difracia razelor X efectuat pe cristale de ADN de ctre Rosalind Franklin i Maurice Wilkins a demonstrat existena a dou perioade de identitate de-a lungul axei lungi a moleculei: una mare, de 3,4 nm i una mic de 0,34 nm. Pornind de la aceste date Watson i Crick au elaborat un model tridimensional al macromoleculei de ADN cu urmtoarele caracteristici: Dou lanuri polideoxiribonucleotidice antiparalele se rsucesc helicoidal i n acelai sens n jurul unui ax comun, formnd un dublu helix cu orientare spre dreapta. Inelele glucidice, legate prin resturi fosfat constituie scheletul extern al dublului helix, n timp ce bazele azotate hidrofobe, sunt orientate spre interior i perpendicular pe axa helixului. Toate gruprile fosfat la pH= 7 sunt ionizate i ncrcate negativ; Solubilitatea ADN-ului n ap se datoreaz tocmai orientrii gruprilor fosfat spre exteriorul duplexului . Stabilitatea dublului helix e asigurat att de interaciunile hidrofobe dintre bazele azotate ct i de legturile de hidrogen ce se stabilesc ntre bazele azotate de pe o caten i cele complementare de pe cealalt caten; multitudinea de legturi van der Waals, stabilite ntre bazele azotate suprapuse, stivuite (stacked), prin suprafeele lor de contact, contribuie major la stabilitatea moleculei. Legturile de hidrogen se stabilesc, invariabil, ntre o baz azotat purinic de pe o caten i una azotat pirimidinic de pe cealalt caten.
2

Imperecherea a dou baze purinice este exclus deoarece s-ar depi spaiul oferit de dublul helix, iar mperecherea a dou baze pirimidinice ar face imposibil stabilirea legturilor de hidrogen, bazele azotate fiind situate prea departe una de alta. Bazele pereche sunt adenina-timina i guanina-citozina, ntruct numai acestea pot stabili numrul maxim de legturi de hidrogen, asigurnd astfel conformaia cu energia libera cea mai mic, deci cea mai stabil conformaie a moleculei de ADN. Adenina se leag de timin prin dou legturi de hidrogen, iar guanina de citozin prin trei legturi. Cele dou catene polinucleotidice nu sunt identice ci complementare, n sensul c, adeninei dintr-o caten i va corespunde ntotdeauna timina din cealalt caten, iar guaninei-citozina. O caten este replica celeilalte.

DENATURAREA I RENATURAREA ADN


La variaii mari de pH sau de temperatur are loc ruperea legturilor de hidrogen din structura ADN-ului. Acest proces se numete denaturarea ADN-ului i e nsoit de o modificare a absorbiei la 260 nm, maxim de absorbie caracteristic bazelor azotate libere i a celor din structura ADN-ului (la pH=7). Cantitatea de lumin absorbit de ADN-ul nativ dublu helicoidal este mai mic dect cea absorbit de bazele purinice i pirimidinice izolate. Acest efect hipocrom se datoreaz mascrii pariale a bazelor stivuite care interacioneaz ntre ele.
3

Denaturarea are ca efect previzibil hipercromicitatea, respectiv creterea capacitii de absorbie n UV la 260 nm i poate fi monitorizat urmrind modificarea absorbiei n cursul procesului. Suprimarea progresiv a interaciunilor dintre bazele azoatate culmineaz cu separarea complet a catenelor. Denaturarea ADN-ului este perfect reversibil prin restabilirea condiiilor de pH i temperatur la valori fiziologice. Catenele, fie i complet separate, pot reface dublul helix originar prin renaturare (annealing). Renaturarea termic se produce la temperaturi sub temperatura de topire (ideal cu 20C mai mici ca aceasta), prin rcire progresiv.

ADN - ELECTROFOREZA N GEL DE AGAROZ


4

Electroforeza este o metod simpl i eficient pentru separarea, identificarea i purificarea fragmentelor de ADN de 0,5-25 Kb. La aplicarea unui cmp electric moleculele de ADN vor migra ctre anod (polul ncrcat pozitiv) datorit sarcinii negative a gruprilor fosfat. Protocolul de lucru cuprinde trei etape: 1. Prepararea gelului se prepar volumul necesar de tampon pentru electroforez TAE 1x (dintr-o soluie stoc TAE 50x ); se cntrete cantitatea necesar de agaroz gel de concentraie 0,5 - 1,5%; se dizolv agaroza n tamponul de electroforez la fierbere; se toarn gelul n cuva de migrare i se ndeprteaz aerul nainte de ntrirea gelului; 2. 3. timp; 4. Vizualizarea ADN-ului prin Colorarea gelului Expunere direct la UV a gelului, n care a fost ncorporat bromura de etidium Materiale: Incrcarea probelor de ADN n godeuri; Migrarea gelului la un anumit voltaj i o anumit perioad de

Tampon pentru electroforez (TAE-tris/acetat/EDTA

sau TBE-tris/borat/EDTA) Soluie de bromur de etidium Agaroz Loading buffer Marker de mas

Observaii: ADN-ul este ncrcat negativ datorit gruprilor fosfat care la pH=7 sunt ionizate i ncrcate negativ. Bromura de etidium agent mutagen i cancerigen (se insereaz ntre bazele azotate din structura ADN-ului); sarcina global a moleculei este pozitiv; se adaug n gel pn la o coloraie slab roz; Agaroza polimer linear compus din reziduuri alternative de D i Lgalactoz reunite prin legturi (1-3) i (1-4) glicozidice; Loading buffer-ul
6

conine sucroz care va da o anumit greutate ADN-ului meninndu-l n gel; albastru de brom fenol la adaugarea soluiei care conine ADN-ul se permite vizualizarea frontului de migrare n gel. coloreaz n albastru datorit schimbrii de pH;

FACTORII CARE INFLUENEAZ ELECTROFOREZA ADN-ului 1. Mrimea moleculei de ADN - moleculele de ADN moleculele mai mari vor migra mai ncet prin reea

vor migra n funcie de mrimea lor

comparativ cu moleculele mai mici 2. Concentraia gelului Rezoluie bun pentru Agaroz % 0.5 0.7 1.0 1.2 1.5 fragmente de ADN (Kb) 30-1 12-0.8 10-0.5 7-0.4 3-0.2

3.

Conformaia ADN-ului

plasmidul circular se observ trei benzi plasmidul linearizat dup digestia cu o enzim de restricie - se va observa o singur band care va migra mai greu prin reea.

4.

Prezena bromurii de etidium n gel

intercalarea bromurii de etidium, care este ncrcat pozitiv, ntre bazele azotate din ADN va duce la o scdere a sarcinii negative a ADN-ului i a ratei de migrare a complexului ADNcolorant; 5. Buffer-ul (tamponul) - TAE este cel mai utilizat; - TBE capacitate de tamponare mai mare, dar nu se folosete dac se urmrete purificarea ADN-ului din gelul de agaroz; 6. Voltajul aplicat - rata de migrare a fragmentelor de AND depinde direct proportional de voltajul aplicat. Pentru o rezoluie ct mai bun- 5-8 V/cm; 7. Citirea probelor - Transluminator UV.

CLONAREA ADN

Recombinarea genetic reprezint un schimb de informaie genetic ntre dou genoame avnd ca rezultat crearea de molecule de ADN recombinat. Experienele de inginerie genetic (tehnologia ADN recombinat) vizeaz inseria unor gene de provenien animal sau vegetal (ADN recombinat) ntr-un vector potrivit i introducerea ntrun mediu celular care s-i permit replicarea autonom i chiar exprimarea fenotipic. Tehnologia ADN recombinat face apel la tehnicile de clonare. n clonarea ADN-lui un fragment de ADN care conine gena de interes e inserat n genomul purificat al unui virus sau ntr-un plasmid.

GENOM = totalitatea genelor cuprinse n cromozomii unei celule. VECTOR = plasmid sau virus n al crui ADN se introduce un fragment de ADN strin.

A CLONA = a face copii identice dintr-o singur celul sau molecul parental; se obine o clon celular sau molecular. PLASMID = molecul mic de ADN circular, dublu catenar care se replic independent de cromozomul celulei gazd. Spre deosebire de virusuri plasmidele nu pot avea o hain proteic i nu pot trece dintr-o celul n alta.

Plasmidul circular este tiat cu una sau mai multe enzime de restricie i ligat in vitro cu un fragment de ADN strin care conine gena de interes i care are capete compatibile. Apoi prin transfecie este utilizat la transformarea unei tulpini de Escherichia coli obinndu-se pe aceast cale un numr mare de copii de ADN recombinat. Pentru a selecta clonele de interes se face screeningul (trierea) coloniilor prin digestie cu enzime de restrictie, PCR etc. Apoi, prin tehnici specifice, microorganismul folosit este determinat s produc proteina de inters, codificat prin insert.

ENZIMELE DE RESTRICIE sunt endo-deoxiribonucleaze care acioneaz asupra unei secvene specifice de ADN dublu catenar prin hidroliza unei legturi fosfodiesterice pe cele dou catene de ADN. LIGAREA este un proces de unire a dou fragmente de ADN folosind o enzim specific numit ligaz i susinut energetic de ATP. TRANSFECIA este procedeul de introducere a ADN-ului recombinat n celulele bacteriene.

10

ENZIME DE RESTRICIE Sunt endodeoxiribonucleaze care acioneaz asupra unei secvene specifice de ADN dublucatenar prin hidroliza unei legturi fosfodiesterice pe cele dou catene de ADN. Aceste enzime fac parte din sistemul de restricie-modificare al celulelor bacteriene, sistem care le confer protecie mpotriva invaziei unui ADN strin. n cazul clonrii, dac ligarea celor dou fragmente de ADN nu are loc cu formarea unui plasmid recombinat circular, atunci fragmentul de ADN introdus n bacterii va fi digerat de enzimele de restricie ale gazdelor. Protecia mpotriva distrugerii propriului ADN se realizeaz de ctre ADN-metiltransferaze care transfer grupri metil la adenin i citozin.

CLASE DE ENZIME DE RESTRICIE


Exist 3 clase de enzime de restricie. Cele din clasa a 2-a sunt importante pentru procesul de clonare. Ele recunosc secvene de 4, 5 sau 6 nucleotide. Au ca secven de recunoatere un PALINDROM = ordinea bazelor de pe una din catene este opus cu cea a bazelor de pe catena complementar. Ex. BamH I: 5'-GGATCC-3' 3'-CCTAGG-5' Unele enzime de restricie genereaz capete drepte (BLUNT ENDS) Ex. EcoR V: 5'-GATATC-3' 3'-CTATAG-5' Alte enzime de restricie genereaz capete coezive (CHOESIVE ENDS). Ex. BamH I: 5'-GGATCC-3' 3'-CCTAGG-5'

11

Exist enzime care au situsuri de recunoatere formate din: - mai mult de 6 pb (perechi de baze) - palindroame ntrerupte - secvente nepalindromice n condiii de reacie neadecvate, n general, enzimele pot avea o specificitate de secven mai redus, adic pot tia nespecific (STAR ACTIVITY). Enzimele de restricie izolate din organisme diferite, dar cu secvene de recunoatere identice se numesc IZOSCHIZOMERI. Izoschizomerii pot avea poziii de clivare diferite unul fa de cellalt. Ex. GGTACC- Kpn I GGTACC- Kpn I GGTACC-Asp 718 GGTACC-Asp 718

FACTORII DE CARE DEPINDE RESTRICIA 1. ENZIMA 2. TAMPONUL 3. TIMPUL 4. TEMPERATURA - dac se lucreaz cu 2 enzime care taie la temperaturi diferite (37C i 62C) se vor face restricii separate.

12

AMESTECUL DE RESTRICIE ADN TAMPON+/-BSA ENZIMA AP VOLUM TOTAL


1.

PROBA 5 L 2 L 1 L 12 L 20 L

CONTROL 5 L 2 L 13 L 20 L

ENZIMA ESTE LIVRAT DE PRODUCTOR I PSTRAT N GLICEROL 50% glicocol, glicogen (ca s nu nghee; enzimele sunt proteine i la temperaturi sczute se denatureaz); 2. CANTITATEA DE ENZIM DIN AMESTECUL DE RESTRICIE trebuie sa fie <10% din volumul total al amestecului; 3. Ex. Firma PROMEGA Tampon 10 x (este de 10 ori mai concentrat); BSA 100 x - Albumin Seric Bovin este de 100 de ori mai concentrat dect concentraia final; Se face un amestec Tampon + BSA - 9 l Tampon + 1 l BSA. Pentru 10 l amestec final de restricie se pune 1 l Tampon + BSA; Activitatea unei enzime se exprim n uniti enzimatice. Conform indicaiilor Uniunii Internaionale de Biochimie (IUB), activitatea unei enzime se poate exprima n dou feluri: a) o unitate (U = unitate) este cantitatea de enzim care catalizeaz transformarea a 1 mol substrat / minut; b) o unitate catalitic (Kat = Katal) este cantitatea de enzim care catalizeaz transformarea a 1 mol substrat / secund; c) o unitate de enzim de restricie reprezint cantitatea de enzim care ntr-o or diger un microgram de ADN ntr-un amestec final de reacie de 50 L.

13

Etapele CLONRII
I. CULTIVAREA CELULELOR ex. E. coli DH5 dureaz 14-16 ore mediu cu antibiotic (ampicilin, kanamicin, tetraciclin etc). II. PURIFICAREA PLASMIDELOR cel care va servi drept vector cel care conine insertul se face prin precipitare cu izopropanol III. RESTRICTIA 3-4 ore sau overnight IV. MIGRAREA ELECTROFORETICA V. PURIFICAREA DIN GEL A VECTORULUI I A INSERTULUI VI. LIGAREA 16 ore la 16 grade. VII. TRANSFORMAREA CELULELOR CU AMESTEC DE LIGARE se poate folosi E. coli VIII. DETECTAREA CLONELOR POZITIVE preluarea unui anumit numr de colonii de pe placa de ligare IX. CULTIVAREA n mediul lichid cu antibiotic se poate folosi mediul ex. Luria Bertani X. PURIFICAREA PLASMIDELOR I VERIFICAREA ACESTORA prin restricie prin PCR.

14

PCR POLYMERASE CHAIN REACTION ADN polimeraza este o enzim care sintetizeaz catena complementar a unui fragment de "ADN monocatenar matri" n direcia 5' - 3' pornind dintr-o regiune dublucatenar. Aceasta reprezint PRIMER EXTENSION REACTION. PCR-ul utilizeaz acelai principiu, dar implic doi primeri. PCR este o tehnic de amplificare in vitro a unor secvene specifice de ADN prin extensia simultan a celor 2 primeri complementari ai lanului de ADN. Permite amplificarea unui fragment de ADN dintr-o regiune selectat a genomului, ceea ce presupune c cel puin o parte a secvenei de nucleotide este deja cunoscut. Iniial se face designul primerilor. Fiecare primer este complementar cu regiunea adiacent fragmentului de ADN ce va fi amplificat.

15

Amplificarea reprezint o cretere cantitativ a unui fragment de ADN de interes (50 ng ADN 1 g ADN) Extensia se face n direcia 5`- 3` de ctre ADN-polimeraz care adaug nucleotidele complementare ADN-ului matri unitate cu unitate pornind de la primer. Primer oligonucleotid complementar cu o secven adiacent regiunii care va fi amplificat aparinnd ADN-ului matri .

16

Fiecare ciclu de reacie are trei etape: ORDINEA Denaturarea ADN-ului separarea celor dou catene ale dublului helix de ADN 95C, 15 sec.-2 min. Annealingul (prinderea) primerilor cuplarea primerilor la secvenele complementare de pe ADN-ul monocatenar 40-60C, 30 sec.-1 min. Sinteza ADN-ului In aceast etap este sintetizat regiunea cuprins ntre cei doi primeri n prezena ADN-polimerazei i a celor 4 dNTPuri (deoxinucleozidtrifosfai) 72 C, 1-2 min. Cnd se reia ciclul fragmentele nou sintetizate vor servi ca template (matri) la rndul lor i dup cteva cicluri produsul predominant va fi secvena de ADN cuprins ntre cei doi primeri. n general 25-30 de cicluri sunt suficiente pentru o amplificare optim. Amestecul de reacie cuprinde: - ADN-ul template - cei doi primeri - dNTP-uri - ADN polimeraza - tampon cu magneziu - ap fr nucleaze Etape: 1. Denaturarea ADN-ului 95C, 2 min. 2. Denaturarea ADN-ului 95C, 15sec.-2 min. 3. Annealingul primerilor 40-60C, 30-60 sec. 4. Sinteza ADN-ului la 72C, 1-2 min. 5. Desvrirea sintezei ADN-ului 72C, 5 min.

6.

Meninerea probelor la 4C,

Designul primerilor : - captul 3'-OH liber; - 18-24 nucleotide; - coninutul n GC sa fie ntre 40-60%; - la capete s existe GC; - Melting temperature (Tm) este temperatura la care 50% din moleculele de ADN sunt denaturate; - Tm trebuie s fie cuprins ntre 50-65C; - Tm trebuie s fie de cel mult 5C; - annealingul se face la o temperatur cu 5-10C mai mic dect Tm primeri; - distana optim ntre punctele de annealing ale primerilor este de 100-1000 perechi de baze; - aceasta semnific faptul c poriunea optim de amplificat este de 100-1000 perechi de baze; ADN polimeraze: - excesul de enzim nu va crete randamentul i va duce la apariia unor artefacte; Taq-polimeraza - izolat din Thermus aquaticus; - stabil la temperaturi nalte; - activitate polimerazic 5' - 3'; - activitate exonucleazic 5' - 3'; nu are posibilitatea de a se autocorecta (proofreading) i pot aprea mutaii n timpul amplificrii; Pfu-polimeraza activitate polimerazic 5' - 3'; activitate exonucleazic 3' - 5' motiv pentru care are proofreading; este format din dou subuniti (una polimerizeaz i cealalt corecteaz erorile); nu va aduga o alt nucleotid dac apare o eroare pn cnd nucleotida greit ncorporat nu va fi nlturat;

n absena dNTP-urilor poate degrada primerii i ADN-ul template; Magneziul : - polimerazele sunt inactive n absena magneziului; - proteinele, dNTP-urile pot lega magneziul afectnd astfel concentraia magneziului liber din amestecul de reacie; - la concentraii mari de magneziu scade fidelitatea enzimei i apar produi nespecifici; ADN template: - trebuie s nu conin inhibitori de polimeraz (sruri, SDS, solveni organici); - n concentraii mari poate s inhibe reacia.
-

UTILIZARE n scop diagnostic Medical Beta talasemie Hemofilia A i B TBC HIV Antrax Criminalistic PCR-ul este o metod foarte sensibil care permite detectarea unei singure molecule de ADN din prob.