LP IMUNOLOGIE 1

REACIILE ANTIGEN - ANTICORP

Reacia Ag Ac = asociere ntre cele 2 molecule prin legturi necovalente; aceast reacie nu determin modificri chimice ireversibile n nici una dintre cele 2 molecule. Ac = anticorp Ag = antigen Ac = receptor specific i solubil pentru un anume Ag. Legturile necovalente ntre cele Ag i Ac: - legturi de hidrogen - legturi ionice - legturi hidrofobe - reacii van der Waals Legturile se realizeaz ntre epitopul antigenului (determinantul antigenic) i CDR ale regiunilor variabile ale lanurilor H i L ale Ig (VH i VL) CDR = complementarity-determining regions = regiuni de determinare a complementaritii. Aceste legturi necovalente sunt relative slabe (comparativ cu cele covalente) i se realizeaz dac moleculele se afl la distane mici una fa de cealalt; astfel c o legtura puternic ntre Ag i Ac depinde de o potrivire ntre domeniile Ac i Ag = o complementaritate care s asigure aceasta distan mic i care s asigure realizarea unui numr mare de astfel de legturi. Aceasta complementaritate ntre Ac i Ag determin specificitatea legturii. Legturile ntre Ag i Ac nu sunt ireversibile. Reacia dintre Ac i Ag este cu dublu sens, asociere i disociere: Reacia Ag-Ac poate fi influenata de mai muli factori: Afinitatea, aviditatea Ac fata de Ag Titrul Ac Concentraia Ag Starea Ag: Ag solubile/corpusculate Condiii de mediu: pH, temperatura

Caracteristici ale legturii ntre Ac i Ag:

1. SPECIFICITATE = Ac recunoate n mod ideal un singur tip de antigen fa de care are complementaritate. 2. AFINITATEA = puterea combinat a legturilor necovalente ntre un singur situs combinativ (Fab) al Ac i un singur determinant antigenic/epitop al Ag. 3. AVIDITATEA = suma afinitilor ntre situsurile de legare ale Ac i toi determinanii Ag pe care i leag. Este o msur mai buna de evaluare a capacitii de legare a Ac in vivo. Aviditatea crescut poate compensa pentru o afinitate sczut n cazul antigenelor polivelente: ex. IgM au afinitate mai sczut dect IgG dar avnd mai multe situsuri de legare (n forma lor pentameric) pot lega eficient Ag. Not: Ag polivalent sau multivalent = care are repetat de mai multe ori acelai determinant antigenic CROSS-REACTIVITATE = n practic, uneori, un Ac[1] poate recunoate un alt Ag[2] dect cel specific(Ag[1]), dac acest Ag[2] are un epitop identic sau asemntor cu Ag[1]. *De obicei aviditatea Ac[1] pentru Ag[2] este mai mic dect pentru Ag[1].

IMUNOSEROLOGIA
1

LP IMUNOLOGIE 1

=domeniul imunologiei care studiaz reaciile Ag-Ac in vitro Aplicaii diagnostice: serotipie (=caracterizarea unei celule normale/tumorale//bacterii etc. prin evidenierea unor Ag specifice de suprafa); dg imunologic al unor afeciuni (infecioase, imune/autoimune). Componente eseniale ale reaciilor serologice: Ag, Ac Ag Se utilizeaz pentru: - imunizarea animalelor de laborator n scopul obinerii serurilor imune - reacii imune de serodiagnostic. Metode de preparare a Ag: Purificarea Ag prin electroforeza - SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) cu transfer ulterior pe nitroceluloz; pentru extragerea proteinelor de pe nitroceluloz e necesar folosirea unor reactivi de disociaie puternici i care pot contamina Ag; dac acest Ag este ulterior utilizat pentru imunizarea animalului de experien pot apare reacii adverse importante la acesta din cauza reactivilor de disociere. Purificarea Ag prin affinity chromatography: principiul metodei: Ac specific antigenului este fixat pe particule sintetice (ex. de Sepharose); aceste particule de sefaroz cu Ac specifici fixai se amestec cu soluia n care se gsete i Ag de extras; Ag se va fixa pe Ac, respectiv pe particulele de sefaroz; restul soluiei se va spla; ulterior legturile Ag-Ac se rup prin modificarea pH-ului mediului. Producere de epitopi prin ADN recombinat n culturi de celule. Serurile imune = conin Ac. Se pot obine i utiliza seruri policlonale/monoclonale: Seruri POLICLONALE = prin imunizarea (unui animal de experien) cu un Ag se obine de obicei un ser policlonal = care conine mai multe tipuri de Ac, fiecare din ei specific pentru unul din mai mulii determinanii antigenici ai Ag respectiv. Serurile policlonale pot fi: - monospecifice = conin mai multe tipuri de Ac care recunosc epitopi diferii ai unui singur antigen - polispecifice = conin anticorpi pentru mai multe tipuri de antigene Se pot obine: - de la pacieni (bolnavi/convalesceni) - prin imunizarea animalelor (se pot folosi animale mari pentru utilizarea serurilor pe scar larg, comercializare; sau animale mici pentru cercetare) Ac/seruri MONOCLONALI/e = un singur tip de Ac mpotriva unui singur tip de epitop, secretat de o singur clon de LB (limfocit B). Tehnica de obinere a acestora n laborator: celule numite hybridomas = rezultate din fuziunea unei celule normale secretante de Ig (prelevate de la un animal imunizat n prealabil cu Ag specific) i celule tumorale de mielom multiplu; aceti hibrizi, spre deosebire de plasmocitele normale cresc i se nmulesc pe medii de cultura i pot avea o via lung; prin procese de selecie se obine o clona care produce 1 singur tip de Ac. Avantaje/dezavantaje seruri poli/monoclonale: Pentru a fi eficient un ser policlonal trebuie s fie ct mai puin contaminat de Ac nenecesari i s fie de o specificitate nalt. Serurile policlonale variaz ntre ele n ceea ce privete specificitatea, afinitatea, aviditatea. Dac epitopul specific unui Ac monoclonal a fost denaturat n cursul procesului de purificare, el nu va mai fi recunoscut de serul monoclonal. Folosirea unui ser policlonal, cu Ac care recunosc mai muli epitopi ai aceluiai Ag e mai puin probabil s fie afectat de aceasta condiie. Un ser monoclonal obinut dintr-un anume hybridom are proprieti standard n ceea ce privete structura, specificitatea, afinitatea.
2

LP IMUNOLOGIE 1

Serurile pot fi folosite pentru: teste diagnostice tehnici de cercetare terapia/profilaxia unor afeciuni, ex : - Ac monoclonali (mab) n poliartrita reumatoid, SM, diverse tipuri de tumori - Seruri polivalente n s. Guillan-Barre, imunodeficiena primar, secundar; profilaxie pre- i postexpunere la virusul hepatitei A Evidenierea reaciei Ag-Ac poate fi realizat prin: Reacii de neutralizare imun Reacii de fixare a complementului Reacii de precipitare Reacii de aglutinare Reacii cu liganzi marcai Tipul de reacie folosit depinde de tipul, starea, concentraia antigenului, respectiv ale anticorpului.

REACII DE NEUTRALIZARE IMUN

= o reacie Ag-Ac n care efectele (negative) ale unei exotoxine bacteriene sau ale unui virus (= Ag) sunt blocate de ctre anticorpul specific care recunoate i leag antigenul. Ex. hemaglutinoinhibarea viral, reacia de neutralizare a SLO,etc. ASLO = Ac anti-streptolizina O Streptolizine = exotoxine produse de streptococi; cu funcie de hemolizin determin liza hematiilor (i a altor celule ex. leucocite - neutrofile). Streptolizina O (SLO) se leag de colesterolul membranar, polimerizeaz i formeaz canale transmembranare. Streptolizina O produs de streptococi -hemolitici grup A (=Streptococcus pyogenes), C, G; numit O pentru ca e inactivat de oxigenul atmosferic; este intens imunogenic.( streptolizina S stabil n oxigenul atmosferic, mai slab imunogenic).

Determinarea ASLO prin test de neutralizare

Testul se bazeaz pe faptul c, in vitro, Ac anti-SLO blocheaz activitatea acesteia de hemolizin. E utilizat pentru a evalua prezena ASLO n serul pacientului. Testul Todd: n eprubete se pune: serul pacientului n diluii seriate, buffer, SLO ; se amestec uor; se incubeaz 15 minute la 37C; apoi se adug suspensie de hematii (de om grup O sau de iepure) n concentraie de 5%, 0,5 ml; se amestec uor; se incubeaz la 37C timp de 45 minute i apoi se centrifugheaz la 1.500 rpm timp de 1 minut. Titrul ASLO n uniti Todd = inversul diluiei serului la care este neutralizat complet activitatea SLO = nu se mai produce hemoliza. 1 unitate Todd = cantitatea de Ac care blocheaz 2,5 x doza minim hemolitic de SLO Doza minim hemolitic = cantitatea de toxin care hemolizeaz complet 0,5 ml de suspensie de hematii de iepure n concentraie de 5%. Exist i alte design-uri de teste de determinare a ASLO bazate fie pe reacia de neutralizare, fie pe alte tipuri de reacie Ag-Ac: aglutinare, nefelometrie.

LP IMUNOLOGIE 1

Pentru teste care folosesc un standard OMS pentru SLO sau alte tipuri de reacii titrul se exprim n uniti internaionale (UI). 1 UI = activitatea coninut n 0,0213 mg din Standardul Internaional (un amestec de seruri de la pacieni cu infecie streptococic). Dup o infecie acut cu streptococ titrul ASLO ncepe s creasc la 7 10 zile; ajung la titru maxim la ~ 6 sptmni (~3 sptmni de la instalarea RAA); dup aceea titrul ASLO scade progresiv; la 12 luni de la infecie doar~ 20% din cei infectai mai au titru ASLO peste normal. Titrul ASLO e normal dac e < 200UI; < 125 U Todd exist ns variaii n funcie de vrst, expuneri anterioare la streptococ grup A, capacitatea de reactivitate imun, regiune geografic, anotimp etc. Un titru ASLO crescut e indicator de infecie streptococica recent. Alte proteine streptococice: - Proteina M = proteina a peretelui bacterian; mpreun cu acidul lipotecoic mediaz adeziunea S. pyogenes la fibronectina din celula epitelial a gazdei. E o protein stabila termic, sensibil la tripsin, format din 2 lanuri; captul N-terminal este hipervariabil determin specificitatea de tip a streptococilor. Proteina M reprezint proteina majoritar de suprafa a tulpinilor virulente de S. pyogenes reprezint factorul major de virulen: inhib depunerea de complement i astfel previne fagocitarea bacteriei. - Exotoxinele A i C ale lui S. pyogenis (SPE A i SPE C - streptococcal pyrogenic exotoxin) superantigene care induc activarea LT, inhib sinteza de Ac, poteneaz ocul toxic, induc apariia febrei, induc elaborare prompt de citokine proinflamatorii. - Enzime: 2 streptokinaze (imunogenice) care activeaz plasmina; 1 pn la 4 DNA-aze (cea mai comun DNA-aza B care e i cea mai imunogenic); hialuronidaze, neuraminidaze, fosfataze, etc.. Ac anti-streptococ: Protectivi = Ac anti-protein M (sunt ns specifici de tip = n funcie de proteina M a tipului; grupul A de streptococi > 120 tipuri de protein M); apar mai lent dect ali Ac; persist ani, posibil chiar toat viaa. Ac anti produse extracelulare: anti-SLO, anti-DNA-aza sunt doar markeri ai infeciei; nu protejeaz mpotriva infeciei streptococice. S. pyogenes determin afeciuni prin 3 mecanisme principale: - Supuraie: infecii determinate de S. pyogenes: faringit*, amigdalit*, limfadenit supurat*, sinuzit, abces peritonsilar, retrofaringeal*, pneumonie, empiem pleural, impetigo*, erizipel, celulit, limfangit, fasceit necrozant, meningita, septicemie, .a. - Elaborare de toxine: afeciuni mediate de toxine streptococice: scarlatina*, oc toxico-septic (STSS Streptococcal toxic shock syndrome). - Inflamaie mediat imun non-supurativ: afeciuni post-infecie streptococic = RAA*, glomerulonefrita acut(GNA) poststreptococic*. *mai frecvent sau exclusiv la copii, adolesceni.

RAA (reumatism [poli]articular acut; febra reumatic)

Susceptibilitate genetic: HLA-DR2, HLA-DR4; marker non-HLA - un marker al LB = D8/17 Mecanismul apariiei manifestrilor RAA: probabil cross-reactivitatea datorit mimetismului molecular ntre componente antigenice ale streptococilor -hemolitici grup A i proteine proprii ale organismului. Clinic: Manifestarea acut apare de obicei la copii, adolesceni, tineri (rar la copii < 4 ani sau la aduli ), la 2-3 sptmni dup o angin streptococic cu S. -hemolitic grup A (uneori paucisimptomatic, dificil uneori de identificat n anamnez).
4

LP IMUNOLOGIE 1

Simptomele se instaleaz tipic brusc: febr, stare de ru, paloare, artralgii i artrite migratorii ale articulaiilor mari (de obicei genunchi, umeri, glezne, coate, RCC). Clasic manifestarea articular este acut, dureroas, migratorie (afectnd de obicei > 5 articulaii). Rar manifestarea e monoarticular, sau la nivelul articulaiilor mici; excepional la nivelul coloanei vertebrale. Artrita reumatismal se vindec. O parte din pacieni prezint i manifestri de cardit reumatismal: dispnee, palpitaii, tahicardie, sufluri, frecturi pericardice, dureri precordiale. Afectarea cardiac reprezint cea mai serioas manifestare a RAA; pot fi afectate valvele, miocardul i pericardul (uneori toate n acelai timp). O parte din pacienii care prezint cardita la primul episod de RAA pot rmne cu sechele cardiace (mai ales St.Mi.); o mare parte ns se vindec, dar, fr profilaxie secundar au risc crescut de recuren i deci de sechele. Manifestri cutanate i subcutanate: eritema marginatum, noduli subcutanai (mai frecvent la nivelul genunchilor, cotului, umrului, occiputului). Coreea acut ( Sydenham) debuteaz de obicei mai tardiv dect celelalte manifestri ( la 6-8 sptmni dup infecie); manifestrile dispar de obicei dup 1-3 luni, dar pot recidiva. Laborator: teste care confirm infecia recent streptococic: - exudat faringian (la majoritatea pacienilor, dup episodul acut de faringit acut nu mai cresc culturi din exudatul faringian, mai ales dac au fost tratai cu antibiotice) - Ac anti-SLO (ASLO), Ac anti-DNA-aza markeri inflamatori prezeni n perioada RAA (reactani de faz acut; VSH i CRP care pot rmne crescute sptmni, luni) modificri EKG: cel mai frecvent tulburri de conducere, dar i supradenivelare de ST n cazul pericarditei ecocardiografie (lichid pericardic, FE..) Criterii Jones: Majore: Minore: - cardit - artralgii - artrit - febr - coree - VSH, CRP, ali reactani de faz acut - eritem marginat - PR prelungit - noduli subcutanai DG(+): 2 criterii majore sau 1 criteriu major + 2 minore + evidenta infeciei cu Streptococ grup A n antecedente: exudat faringian + cultur / sau markeri imunologici: ASLO cu titru etc.

GNA poststreptococic
Poate apare dup infecii faringiene (la 10 zile dup) sau cutanate (la 3 sptmni dup debutul piodermei) cu streptococ -hemolitic grup A (de obicei alte tulpini dect cele care se asociaz cu RAA); cea mai mare inciden la copii (vrful incidenei copii 2 6 ani); apare mai rar la aduli. Patogenie: depunere de CI la nivelul membranei bazale glomerulare (conin IgG i Ag) se activeaz complementul, eliberare de factori chemoatractani, infiltrat inflamator celular; Ag implicat este nc necunoscut: exist fie un Ag self fie un Ag nonself streptococic ajuns la acest nivel; n cazul ipotezei c Ag este self RIU anti-antigen self poate apare ca urmare a cross-reactivitii ntre unii epitopi a unor tipuri de protein M streptococic cu o protein self. Aspect anatomopatologic: de obicei GNAD (GNA difuz) proliferativ (proliferare de celule endoteliale i mezangiale locale, acumulare de leucocite, mai ales neutrofile). Microscopia cu imunofluorescen: depozite de CI (care conin de obicei IgG), C3. Clinic: de obicei sindrom nefritic = edeme, hematurie, frecvent HTA, oligurie; mai rar sd. nefrotic. Paraclinic: Urina:
5

LP IMUNOLOGIE 1

- hematurie micro-/macro-scopic, +/- cilindri (hialini, granulari, hematici), +/- piurie - proteinurie, (tipic < 3, 5 g/24h, dar aproximativ n 20% cazuri e de rang nefrotic) - de obicei funcie tubular pstrat (FE Na <1%) Plasma: - CH50, C3 tranzitor, prin consum - uree, creatinina (de obicei moderat) - VSH; Fbg. - n caz de sindrom nefrotic - hipoproteinemie cu hipoalbuminemie - n caz de disfuncie renal sever: acidoz metabolic, hiperpotasemie, hipercloremie, hiponatremie. De obicei e o afeciune autolimitant. Diagnosticul se pune pe elemente clinice i paraclinice de afectare glomerular acut + evidena de infecie Streptococica recent : ASLO, Ac anti-DNA-aza B, eventual izolarea germenului din faringe (vezi RAA) /piele (o cultur pozitiv din prelevri tegumentare nu face ns diferena ntre o infecie acut i purttor cronic de streptococ). Alte teste de neutralizare: Testul Schick: se injecteaz intracutan o mic doz de toxin difteric purificat; dac pacientul nu are Ac anti-toxin difteric circulani, la locul injectrii, dup 5 zile apare o zon roie, indurat i dureroas cu diametrul > 10 mm; dac pacientul are respectivii Ac atunci acetia vor neutraliza toxina difteric i nu apare inflamaie local. (exotoxina difterica inhib sinteza proteic a celulelor organismului gazd, este citotoxic i produce necroze tisulare). Testul de hemaglutinoinhibare viral REACII DE AGLUTINARE NON-IMUN = exist virusuri, toxine bacteriene, compui chimici, care induc hemaglutinare non-imun. HEMAGLUTINAREA VIRAL = Exista virusuri care pot determina aglutinarea hematiilor n absena unei reacii Ag-Ac: vir. urlian, rujeolei, gripal datorit prezenei unor proteine de suprafaa hemaglutinine. Acest tip de hemaglutinare poate fi inhibat de prezena Ac neutralizani ai virusului respectiv = HEMAGLUTINOINHIBARE VIRAL = e o reacie de neutralizare (= o reacie Ag-Ac n care efectele unui virus sunt blocate). Testul este folosit pentru subtiparea virusurilor gripale, detectarea Ac + evaluarea titrului acestora n serul pacienilor.

REACIA DE FIXARE A COMPLEMENTULUI

Se folosete pentru evidenierea unor anticorpi specifici (notai n acest text Ac [1]) n serul pacientului (sau n alte lichide biologice, ex. n LCR). Principiu: - Cnd IgG sau IgM fixeaz Ag specific, aceti anticorpi devin capabili s fixeze complementul. - Dac reacia are loc pe suprafaa hematiilor => liza hematiilor. Se folosete un sistem-indicator: eritrocite sensibilizate = eritrocite preincubate, opsonizate cu Ac specifici anti-hematie (notai n acest text cu Ac [2] )
6

LP IMUNOLOGIE 1

se folosesc concentraii de Ac [2] care nu produc aglutinarea hematiilor sistemul indicator NU conine complement

Sistemul test:

serul pacientului se nclzete la 56C pentru inactivarea complementului pacientului (pentru eliminarea unui eventual factor de confuzie nu cunoatem calitatea complementului pacientului), apoi este adsorbit cu hematii de oaie splate pentru a elimina din reacie eventualii Ac anti-hematie din serul pacientului (alt factor posibil de confuzie) apoi serul se amestec cu Ag [1] purificat (= antigenul specific Ac[1]) i o soluie standard de complement (din ser proaspt diluat de porcuor de Guineea). Amestecul se incubeaz 30 minute la 37C pentru a se lsa timp Ac [1] din serul pacientului s reacioneze cu Ag [1] i s fixeze complementul. se adug apoi sistemul-indicator (= eritrocitele sensibilizate)

1. Dac n serul pacientului exist Ac [1] specifici atunci acetia se vor ataa de Ag[1] specific i vor fixa complementul; astfel nct nu mai rmne complement liber n sistemul test. La adugarea sistemului indicator hematiile sensibilizate nu vor mai fi lizate.

Lipsa lizei hematiilor sistemului indicator = n sistemul test exist Ac [1] de determinat => test pozitiv. 2. Dac apare hemoliza eritrocitelor sensibilizate = n sistemul-test exist complement liber i acesta se va lega de Ac [2] anti-hematie care sunt fixai pe hematiile sensibilizate. Se declaneaz cascada complementului care determin liza hematiilor din sistemul indicator.

LP IMUNOLOGIE 1

Apariia lizei hematiilor = n sistemul test nu exist Ac [1] specifici = n serul pacientului nu exist Ac [1] specifici = test negativ. Aplicaii: reacia Wassermann pentru sifilis; detectarea Ac anti-Mycoplasma, Bordetella, Ricketssi, virusuri, fungi (Cryptococcus, Histoplasma). Reacia Wassermann folosete ca Ag fosfolipide (cardiolipin) pentru a detecta apariia unor Ac numii reagine; reagine = Ac care apar n cursul infeciei luetice, din motive necunoscute; nu sunt Ac anti-treponema! Reacii fals pozitive: alte boli infecioase (malarie, mononucleoza, etc.), infecii cu alte treponeme (ex. boala Lyme infecia cu Borrelia b.), sindromul APL (anticorpi antifosfolipidici), LES .a.