SEPTICEMII. BACTERIEMII. CONDUITA EXAMENULUI BACTERIOLOGIC 1.

Probleme generale
Delimitare notiuni

Bacteriemie - reprezinta prezenta bacteriilor viabile in sangele

periferic; poate fi tranzitorie ca urmare a unor traume sau manipulari iatrogene, sau recurenta ca rezultat al unei infectii. Bacteriemiile tranzitorii pot fi consecinta diferitelor manopere chirurgicale cum sunt extractii dentare, interventii chirurgicale gastrointestinale, urologice, ginecologice, cateterisme uretrale, vezicale etc. Bacteriile pot fi prezente tranzitoriu in sange in cadrul unor boli ca meningite, pneumonii, la bolnavi cu ciroza sau stari preagonice. Bacteriemiile intermitente, caracterizate prin prezenta inconstanta a microorganismelor in sange, se observa in cursul unor supuratii profunde ca flegmoane, abcese si in infectii care complica o obstructie a cailor biliare sau urinare. Bacteriemia continua corespunde septicemiei clasice, totdeauna clinic manifesta, care presupune preexistenta unei porti de intrare si a unui focar infectios, prezenta persistenta a bacteriilor in torentul sanguin, constituirea de metastaze, care pot amplifica rolul focarului infectios initial. Septicemie-notiune complexa : clinica, patogenica, microbiologica prezenta bacteriilor in sangele periferic cu diseminari secundare in diferite zone. Clinic se manifesta prin febra, alterarea starii generale, semne specifice in functie de localizarea secundara. Septicemia este produsa de un numar mare de microorganisme care intra si se multiplica activ in torentul sangvin. Pacientul septicemic prezinta adesea infectii focale in unele organe si poate deceda in situatia in care nu s-a introdus in timp util terapia antimicrobiana. Interventia chirurgicala poate fi necesara pentru eliminarea rezervorului infectiei ( de exemplu eliminarea unui abces). Septicemiile reprezinta in principal un model evolutiv al multor infectii umane produse cel mai adesea de bacterii aerobe sau anaerobe, fungi sau alte categorii de germeni conditionat patogeni (mycoplasme). Exista unii factori si agenti predispozanti care cauzeaza septicemia. (Tabel 1)(L.P.Samaranayake, 1996).

Factori predispozanti Sepsis abdominal Rani si arsuri infectate Osteomielite Pneumonii Dispozitive intravasculare Toxiinfectii alimentare Meningite

Agent Enterobacterii Bacteroides fragilis Streptococcus faecalis Staphylococcus aureus Streptococcus pyogenes Enterobacterii Staphylococcus aureus Streptococcus pneumoniae Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Enterobacterii Salmonella spp. Campylobacter spp. Streptococcus pneumoniae Neisseria meningitidis Haemophilus influenzae Enterobacterii, Staph. Aureus

Pacienti imunosupresati Tabel 1.

Pentru stabilirea agentului etiologic al starilor de bacteriemie sau septicemie se realizeaza cultivarea sangelui (hemocultura). Deoarece numarul microorganismelor circulante poate varia in timp depinzand de conditia bolii se recomanda chiar repetarea hemoculturii. 2. Hemocultura; principii tehnice.
a.Momentul si numarul recoltarilor In suspiciunea clinica privind prezenta unui agent infectios in circuitul sanguin se recolteaza de urgenta hemoculturi inainte de inceperea tratamentului cu antibiotice. Posibilitatea de a decela agentul infectios creste cu numarul hemoculturilor.In cazul bacteriiemiilor continue este necesara de obicei recoltarea a doua probe inainte de inceperea tratamentului, in primele 24 de ore. In cazul bolilor cu bacteriemie obligatorie dar pasagera este necesara prelevarea in primele zile de boala faza bacteriemica a cate 2-3 hemoculturi in 24 de ore, grupate in perioadele de crestere a temperaturii, la interval de 1-2 ore, intre ele. In bacteriemiile intermitente cu invazie sanguina premergatoare episoadelor de febra si frison sunt necesare 2-3
2

hemoculturi recoltate la intervale mai mari de o ora, astfel incat doua prize sa fie efectuate in perioada febrila. Pentru hemoculturile recoltate de la pacientii deja sub terapie cu antibiotice, daca nu poate fi suspendata cateva zile administrarea acestora, se vor recolta 4-6 hemoculturi in primele 48 ore. La nou-nascuti doua hemoculturi sunt suficiente pentru diagnosticul septicemiilor. Sansa izolarii germenului depinde de momentul recoltarii.De exemplu momentul optim poate fi reprezentat de primele zile de la debut in febra tifoida, tularemie, ciuma, antrax. ;se pot realiza recoltari frecvente, la intervale mici, pentru decelarea in sange a germenilor cauzali in endocardita bacteriana, mai ales, cea cu streptococ viridans sau recoltari in perioada de reactivare clinica: cum ar fi in bruceloza. b.Tratamente anterioare cu antibiotice -Micsoreaza sansa de izolare (trebuie cunoscute si specificate in cazul hemoculturilor negative). Neutralizarea sau inactivarea actiunii bactericide a sangelui si a agentilor antimicrobieni care pot fi prezenti in sange este deosebit de importanta pentru obtinerea in cultura a microorganismelor. (adaugarea de penicilinaza in mediu daca pacientul este sub terapie cu penicilina sau de acid paraamino benzoic pentru neutralizarea sulfamidelor). c.Conditii de recoltare Se recolteaza de obicei sange dintr-o vena a plicii cotului ; in caz de localizare a unei infectii se poate recolta din vena tributara focarului infectios. Pentru o hemocultura la adult se recolteaza de obicei 10 ml de sange, dar volumul recoltat depinde de sistemul folosit. -In sistem deschis (recoltare cu siringa, apoi trecere pe medii) riscantpentru contaminare. -In sistem inchis de preferat (cu dispozitiv care contine mediu cu anticoagulant sau nu). Foarte importanta precautia pentru a nu se contamina accidental proba. Este necesara o aseptizare strict a zonei de recolta, sterilizarea materialului de recoltare . d.Proportie proba/mediu: -cea mai utilizata : o parte sange la 9 parti mediu (10%) ; daca se recolteaza mai mult sange 20% s-a demonstrat ca se reduce semnificativ recuperarea microorganismelor. La copiii mici volumul de sange recoltat este de 1-2 ml. e.Compozitie mediu Se indica folosirea a doua tipuri de flacoane de hemocultura, respectiv pentru bacterii aerobe si anaerobe.

In majoritarea mediilor pentru hemocultura se adauga anticoagulant : polianetol sulfonat de sodiu (SPAS). Desi prezenta anticoagulantului in mediile de hemocultura faciliteaza recuperarea majoritatii microorganismelor, s-a demonstrat ca inhiba cresterea unor bacterii : Peptostreptococcus anaerobius, N. gonorrhoeae, N. meningitidis, Streptobacillus monilformis si Gardnerela vaginalis. In cazul ca se suspecteaza acesti germeni,efectul advers al anticoagulantului asupra fiecaruia din aceste microorganisme poate fi redus prin adaugarea de gelatina 1%. Neutralizarea sau inactivarea actiunii bactericide a sangelui si a agentilor antimicrobieni care pot fi prezenti in sange este deosebit de importanta pentru obtinerea in cultura a microorganismelor. Propietatile bactericide ale sangelui se nerutralizeaza prin simpla dilutie 1 :20. De obicei dilutia 1 :10 in medii care contin SPAS, este suficienta pentru indepartare acestei activitati. Dupa recoltarea sangelui flaconul de hemocultura pentru aerobi trebuie aerisit pentru ca sa se poata dezvolta bacteriile aerobe stricte. Exista sisteme de ventilare a hemoculturilor(ac cu filtru steril)- preparate comercial. Mediile pentru cultivarea anaerobilor nu trebuiesc aerisite.Calitatea mediului conditioneaza in cea mai mare masura eficienta hemoculturii. Trebuie folosit un mediu cu o valoare nutritiva ridicata, care sa permita cresterea de variate specii bacteriene : de regula, bulion glucozat cu sau fara anticoagulant (in absenta anticoagulantului, se agita foarte bine pentru defibrinare mecanica) -In cazul unor infectii cu germeni mai pretentiosi, problema se complica -sunt necesare medii complexe (exemple: leptospiroza, legionelloza, listerioza). In caz ca se suspecteaza anaerobi la primoizolare, se foloseste in paralel mediu cu thioglicolat f. Incubarea flacoanelor de hemocultura se va face la 35 37grade Celsius. Perioada de incubatie recomandata este in medie de 7 zile, putand fi prelungita la doua saptamani pentru germenii greu cultivabili. g.Treceri de pe mediul de primoizolare-obligatoriu: Flacoanele de hemocultura trebuiesc examinate zilnic pentru evidentierea cresterii microbiene. O prima examinare se poate efectua la 6 ore sau chiar mai putin. In cazul in care se constata aparitia unei turbiditati a mediului, hemoliza, producerea de bule de gaz, sediment, mici granule in stratul de sange sau la suprafata lui, colonii pe geloza in cazul mediului bifazic se efectueaza examinarea microscopica si subcultivarea probei Se amesteca in acest caz continutul flaconului, se decontamineaza dopul cu alcool de 70 de grade si se aspira cu o siringa sterila cu ac 0,25-0,5 ml. Se efectueaza un frotiu care se coloreaza cu Gram si se insamanteaza pe geloza chocolat,
4

geloza sange, geloza lactozata (AABTL), geloza sange pentru anaerobi. Mediile pentru subculturi aerobe se incubeaza in atmosfera obisnuita sau in CO2 timp de 48 de ore, iar pentru anaerobi se examineaza timp de 72-96 ore. Daca prin examinarea bacterioscopica se observa un singur fel de bacterii se poate efectua o antibiograma folosind ca inocul bulionul de hemocultura, cu specificatia ca a doua zi se repeta antibiograma din cultura dezvoltata. In absenta oricarei modificari a mediului din flacoanele de hemocultura este indicat sa se efectueze treceri oarbe la 24 de ore pt. flacoanele aerobe si la 48 de ore pt. anaerobi. Subculturile oarbe se fac pe din cate doua placi cu geloza chocolat aerob si anaerob. Subculturile oarbe sunt necesare deoarece bacterii ca H.influenzae, N.meningitidis, Pseudomnas sp., Streptococcus pneumoniae, Bacteroides si Fusobacterium pot creste in stratul de sange sedimentat fara ca sa produca o modificare vizibila a mediului. -Medii aerobe utilizate:-Geloza simpla- placa -Geloza simpla inclinata -Geloza sange -Geloza chocolat -Mediu cu lactoza (ABTL si LEIFSON sau ISTRATE-MEITERT). -Medii anaerobe : (placa parafinata continand amestec reducator in plic), geloza sange h.Identificarea ulterioara, in functie de categoria germenului izolat: Pentru o identificare rapida a agentilor patogeni crescuti in bulionul de hemocultura sau pe mediul solid in conditiile folosirii mediului bifazic, se va proceda la efectuarea unor teste specifice direct din cultura primara, in functie de aspectul bacterioscopic: - pentru cocii Gram pozitivi in diplo sau lanturi testul la optokin, bacitracina ; - pt. cocii Gram pozitivi in gramezi testul dezoxiribo-nucleazei termostabile care in decurs de 4 ore este pozitiv ; - pt. bacilii Gram negativi TSI, MIU, citrat, eventual testul oxidazei. In cazul culturilor pozitive, obtinute pe mediile insamantate din flacoanele de hemocultura, se va proceda la identificarea genului sau speciei, pe baza propietatilor morfologice, culturale, biochimice, serologice, de patogenitate, sensibilitate la bacteriofagi si la efectuarea antibiogramei. Bacteriemiile polimicrobiene sunt definite ca izolarea a cel putin doua sau mai multe microorganisme din aceeasi hemocultura, de cel putin doua ori intr-o perioada de 24 de ore. Bacteriemiile polimicrobiene apar mai ales la
5

pacienti cu boli severe de baza cu deficiente imunologice sau ca urmare a unor procese invazive. De obicei infectiile intraabdominale, ale tractului urinar si ale tesuturilor moi sunt cauza bacteriemiilor polimicrobiene. Dintre germenii Gram pozitivi cei mai frecventi sunt Streptococcus faecalis si Staphylococcus, iar dintre bacteriile Gram negative, E.coli si Klebsiella. La copii bacteriemiile polimicrobiene sunt mai putin frecvente ca la adulti; aparitia lor se datoreaza fie unei anomalii a barierelor anatomice, fie unor deficiente imunologice sau prezentei unor catetere.

3.Infectii septicemice umane mai importante

a.Pneumococ -20% din cazurile cu pneumonie pneumococica au bacteriemie cu pneumococ (adulti), la copii frecventa mai scazuta. -Uneori hemocultura pozitiva este unicul indiciu bacteriologic al pneumoniei pneumococice sau meningitei pneumococice. -Se impune efectuarea frotiului de la primo-izolare in primele 16-20 de ore (chiar inaintea aparitiei tulburarii nete a mediului). Observam, coci Gram pozitivi, lanceolati, asezati in diplo. -In cazul pozitivarii culturii la primo-izolare, se recomanda imediat trecerea pe mediul cu sange (pentru prevenirea fenomenului de autoliza). b.Streptococ Streptococ viridans -In special, in endocardita subacuta lenta- in perioadele febrile. -Probleme de izolare (uneori sunt tulpini nutritional deficiente). In caz de orientare probabila spre acest diagnostic, mediul de primo-izolare trebuie suplimentat cu unele vitamine din grupul B, mai ales B6 si L-cisteina. Se poate folosi ca mediu de primo-izolare bulionul suplimentat cu sange. -Pentru subculturi, se poate folosi geloza-sange pre-insamantata cu safilococi (pentru fenomenul de satelitism-colonii de streptococi viridans in jurul coloniei de stafilococ). Streptococ beta-hemolitic -Pretentios la primo-izolare, apoi se fac treceri pe geloza sange si identificare (beta-hemoliza; test bacitracina). Enterococi -In unele endocardite sau in septicemiile nou-nascutului.

-Izolare pe medii, apoi pe bila-esculina,etc c.Stafilococ Stafilococul aureu -Poate da septicemii asociate cu pneumonie, abcese cu diverse localizari, pe teren de rezistenta scazuta a organismului -Posibile bacteriemii si septicemii cu staphylococcus albus, coagulazapozitiv (endocardite). -Se recolteaza pe medii uzuale (primoizolare) apoi identificare (cultura, morfologice, teste de patogenitate in vitro, antibiograma obligatorie). d.Haemophilus -In special, H.Influenzae-asocierea: septicemie, meningita, insufic.resp.ac. -Izolare pe medii complexe (cu factor X si V) -Identificare cu metodologie specifica (mediul Levinthal), identificare serologica. e.Neisseria meningitidis -Se poate izola din sangele periferic pasager,pe medii complexe (cu sange chocolat sau altele) -Obligatoriu subcultura pe Mueller-Hinton sau Hill (dupa control prin frotiucoci, Gram negativ, reniformi , in diplo) f.Bacili Gram negativi -La gazde compromise (sau copii mici), speciile sau genurile incriminate: E.coli patogen, Klebsiella, Pseudomonas, Enterobacter, Proteus, Serratia. -Dupa primo-izolare se efect. control prin frotiu apoi subcultivare pe ABTL Identificare pe baza caract. de cultura, metabolice (TSI, MIU, alte teste), antigenice (la E.Coli se utilizeaza seruri OB sau OHK), de patogenitate. -O mentiune speciala pentru Salmonella (specii si serotipuri invazive S. Typhi) recoltare in primele zile de la debut (sansa maxima) apoi subcultivari pe mediu cu lactoza si identificare (inclusiv serologica pentru serotip si eventual lizotipie). g.Brucella -Recoltare-in perioadele de reactivare clinica - Sunt necesare medii complexe la primoizolare - Se constata un numar relativ mic de germeni in sange in perioadele de bacteriemie.

-Se pot folosi, ptr a surmonta aceste inconveniente, medii diferite: triptoza, soia cu tripticaza, sau alte medii speciale pentru Brucella, apoi subculturi si identificare prin caract.de cultura, incubare in CO2, crestere pe medii cu colorant (fuxina, tionina), H2S, etc. h.Germeni anaerobi -Bacteriemia se instaleaza -de la focare cu anaerobi (urinare, pulmonare, intestinale, genitale) prin diseminare sanguina, mai frecvent cu germeni nesporulati (Bacteroides fragilis, B.melaninogenicus, Fusobacterium necrophorum, peptococi, peptostreptococi) dar si sporulati (Cl. perfringens) Bacteriemie instalata la gazde compromise. -Primoizolarea se realizeaza pe mediu cu tioglicolat, apoi control obligatoriu prin frotiu si subcultivare pe geloza-sange -placa parafinata, cu amestec reducator (pirogalol), apoi identificare: cultura, morfologie, metabolice (lapte turnesolat, gelatina, etc), serologice (testul de seroneutralizare : pe mediul Nagler-ptr. Cl. Perfringens). i.Fungi -Suspiciunea clinica trebuie sustinuta prin inoculare sange pe medii adecvate (cu glucoza si maltoza)- mediul Sabouraud pt.Candida albicans (la gazde compromise) -Identificare: c.cultura, morfologice (levura + pseudomicelii, test filamentizare), metabolice (zimograma, auxanograma)si antifungigrama.

10