Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
La tecnologia dell'anticorpo monoclonale comprende l'isolamento di questi linfociti B, e la loro successiva fusione con cellule trasformate (cellule mielomatose). Molte delle risultanti cellule ibride manterranno l'immortalit, oltre a produrre grandi quantit dell'anticorpo monospecifico.
La tecnica degli ibridomi pu servire quindi a mantenere una scorta continua di anticorpo monospecifico puro, e l'obiettivo attuale consiste nel progettare e produrre anticorpi monoclinali umani dotati tanto di specifiche propriet immunoterapiche quanto di bassa immunogenicit potenziale.
L'immunizzazione passiva pu essere usata come profilassi (es. somministrazione di anticorpi diretti contro tossine di serpenti a persone che debbano viaggiare in luoghi dove tali serpenti si trovino comunemente) o come terapia (es. somministrazione di anticorpi antiveleno immediatamente dopo il morso di un serpente).
Preparazione di un antisiero
I preparati di anticorpi usati per indurre immunit passiva possono essere ottenuti da fonti animali o umane. I preparati di origine animale sono in genere chiamati "antisieri", mentre quelli di origine umana sono detti "immunoglobuline". In entrambi i casi gli anticorpi predominanti sono le IgG. Gli antisieri sono generalmente prodotti per mezzo dell'immunizzazione di animali sani con appropriati antigeni. Piccoli campioni di sangue sono successivamente prelevati dall'animale e su questi si fa un'analisi quantitativa della presenza degli anticorpi desiderati (enzyme-linked immunosorbent assay - ELISA). Il sangue viene raccolto usando una tecnica aseptica all'interno di contenitori sterili (in presenza di eparina o altro anticoagulante). La frazione anticorpale viene quindi purificata dal siero per mezzo di successive precipitazioni (etanolo e ammonio solfato) o di cromatografia ad alta risoluzione. Dopo questa purificazione si determina il titolo degli anticorpi, solitamente per mezzo di saggi biologici o immunologici. Spesso si aggiungono stabilizzanti come NaCl (0.9% w/v) o glicina (23% w/v). Come per tutti i preparati farmaceutici, ogni aspetto della preparazione di un antisiero devono sottostare alle regole di buona fabbricazione (GMP). Molte autorit regolatorie pubblicano linee guida che delineano le procedure di questi derivati del sangue.
Preparati di anticorpi policlonali di origine umana o animale usati per indurre immunit passiva contro specifici agenti biologici
Antibody Anti-D immunoglobulin Botulism antitoxin Diphteria antitoxin Diphteria immunoglobulin Haemophilus influenzae immunoglobulins Hepatitis A immunoglobulin Hepatitis B immunoglobulin Snake venom antisera Spider antivenins Tetanus antitoxin Tetanus immunoglobulin Source Human Horse Horse Human Human Human Human Horse Horse Horse Human Specificity Specificity against rhesus D antigen Specificity against toxins of type A, B or E Clostridium botulinum Antibodies raised against diphteria toxoid Antibodies exhibiting specificity for diphteria toxoid Antibodies raised against surface capsular polysaccharide of H.I. Specificity against hepatitis A surface antigen Specificity against hepatitis B surface antigen Antibodies raised against venom of various poisonous snakes Antibodies raised against venom of various spiders Specificity against toxin of Clostridium tetani Specificity against toxin of Clostridium tetani
Gli antisieri si sono dimostrati preziosi nel trattamento di molte patologie, ma possono anche indurre particolari effetti indesiderati, tra cui particolarmente degna di nota la loro capacit di 3
indurre reazioni di ipersensibilit, le quali possono arrivare fino allo shock anafilattico con la morte del paziente. A causa di questi rischi i preparati di anticorpi di origine umana (immunoglobuline) sono di solito i preferiti come agenti di immunizzazione passiva. Le immunoglobuline sono purificate dal siero (o dal plasma) di donatori umani con metodi similari a quelli usati per purificare gli anticorpi di origine animale. Sebbene reazioni di ipersensibilit possano verificarsi anche dopo somministrazione di preparati a base di immunoglobuline, l'incidenza di questi eventi nettamente minore rispetto al caso di preparati di origine animale. I preparati di anticorpi policlonali in uso terapeutico possono essere raggruppati secondo il loro target in: Anticorpi diretti contro specifici patogeni microbici o virali Anticorpi diretti contro tossine microbiche Anticorpi diretti contro il veleno di ragni e serpenti (antiveleno)
Immunoglobuline anti-D
Oltre agli antigeni dei maggiori gruppi sanguigni (es. A e B), noto un certo numero di altri alloantigeni (antigeni diversi tra individui della stessa specie) eritrocitari. Uno di questi l'antigene Rhesus (Rh), di cui esistono una serie di prodotti genici correlati; il pi importante antigene Rh conosciuto come antigene "D". In un feto proveniente da madre Rh-negativa e padre Rh-positivo, gli eritrociti saranno Rh positivi. Sebbene durante la gravidanza entrino nella circolazione materna piccole quantit di sangue fetale, queste non sono sufficienti per stimolare una forte reazione immunologia da parte della madre. Al momento del parto, invece, una significativa quantit di cellule del sangue fetale entra a contatto con la circolazione materna, e questo provoca l'immunizzazione della madre contro l'antigene Rh. Questo fatto mette in pericolo la salute del feto durante le successive gravidanze, poich gli anticorpi anti-Rh materni possono attraversare la placenta ed entrare nella circolazione fetale. Il legame degli anticorpi anti-Rh agli eritrociti fetali pu indurre emolisi, con conseguente eritroblastosi fetale del neonato. Questa situazione pu essere evitata mediante la somministrazione di anticorpi anti-Rh a madri Rh-negative immediatamente dopo la nascita di un neonato Rhpositivo. Gli anticorpi somministrati legano gli eritrociti fetali Rh-positivi e li marcano per la distruzione prima che venga innescata la reazione immunologia della madre. Di solito si somministra una dose di 200-300 g di anticorpi immediatamente dopo il parto. I preparati utilizzati sono purificati dal siero o dal plasma di individui Rh-negativi che siano stati immunizzati contro l'antigene D Rhesus. I preparati di anticorpi purificati possono essere commercializzati come liquidi (validit di due anni se conservati al freddo) o come liofilizzati (validit fino a cinque anni).
Immunoglobuline normali
Le immunoglobuline normali sono preparati di anticorpi purificati dal plasma, dal siero, o dalla placenta di donatori normali e sani. Il sangue ottenuto da questi individui conterr una vasta gamma di anticorpi specifici (prodotti nel corso degli anni, ogni volta che il sistema immunitario dell'individuo si sia trovato in contatto con vari antigeni, sia "naturalmente" -infezioni- che artificialmente -vaccini-). I preparati di immunoglobuline normali sono di solito purificati dal materiale raccolto da 1000 o pi donatori; tali preparati contengono in genere anticorpi contro difterite, morbillo, poliomielite, 4
epatite A, rosolia e varicella. Le immunoglobuline normali possono dunque essere usate per indurre immunizzazione passiva contro queste malattie.
Prodotto liquido
Liofilizzazione
Prodotto in polvere
ANTICORPI MONOCLONALI
La tecnologia degli anticorpi monoclonali si sviluppata negli anni '70, quando Kohler e Milstein riuscirono a fondere cellule mielomatose immortali con linfociti B produttrici di anticorpi. Una parte degli ibridi ottenuti risultava essere stabile, con caratteristiche cancerose e capace di produrre anticorpi. Queste cellule, dette ibridomi, rappresentavano dunque una inesauribile fonte di anticorpi monospecifici (monoclonali).
aggiunge nel pozzetto di un'altra piastra da microdosaggio preliminarmente rivestita con l'antigene bersaglio. Se il mezzo di coltura contiene un anticorpo (anticorpo primario) che riconosce un epitopo dell'antigene vi si legher, e i successivi lavaggi non lo allontaneranno. Ai pozzetti della piastra si aggiunge un secondo anticorpo (anticorpo secondario) specifico degli anticorpi murini (di topo): si legher a qualsiasi anticorpo primario fissato sull'antigene. Prima di adoperarlo nell'immunodosaggio si coniuga il secondo anticorpo con un enzima che trasforma un substrato incolore in un composto colorato. La presenza di colorazione in uno dei pozzetti dimostrer che il mezzo di coltura conteneva un anticorpo specifico per l'antigene. Ove il mezzo di coltura non avesse contenuto anticorpi specifici dell'antigene in esame il primo lavaggio avrebbe lavato tutti gli anticorpi, e in questo caso l'anticorpo successivamente agiunto non avrebbe avuto modo di legarsi e sarebbe stato eliminato dal secondo lavaggio. Nei pozzetti in cui le cose si svolgono in questo modo la soluzione del substrato rimane incolore. I pozzetti della piastra da microdosaggio originale il cui mezzo fornisce all'immunodosaggio risposta positiva (colorazione) possono contenere una miscela di cellule di fusione. Tali cellule perci vengono diluite con mezzo di coltura e inoculate in pozzetti vergini, onde impiantare linee cellulari da cellule individuali (cloni). Dopo avere coltivato i cloni se ne saggia il mezzo nuovamente per stabilire quali linee cellulari (ibridomi) producano molecole di anticorpi monoclonali atte a riconoscere l'antigene bersaglio. Se si isola pi di un ibridoma specifico si effettuano ulteriori saggi per stabilire se i diversi cloni producano anticorpi contro il medesimo determinante antigenico. Ciascun clone produttore di anticorpi monoclonali pu essere mantenuto in coltura pi o meno indefinitamente, inoltre si possono congelare i campioni in azoto liquido per potere disporre in seguito di una fonte di cellule. Produzione di un anticorpo monoclonale (Mab)
Iniezione dell'Ag purificato
Cellule di mieloma
Saggio del mezzo di coltura per ricercare MAb che reagisce con l'antigene
La produzione degli anticorpi monoclonali pu essere anche condotta mediante iniezione degli ibridomi nella cavit peritoneale di ratti, che servono dunque da camera di fermentazione vivente. Crescendo, le cellule di ibridoma trapiantate producono anticorpi. Molti dei primi preparati di anticorpi monoclonali venivano prodotti in questo modo, tra questi OKT-3, il primo anticorpo monoclonale approvato per l'uso terapeutico dalla Food and Drug Administration. Questo metodo presenta per degli svantaggi quali l'alto costo e il fatto che il prodotto sia contaminato da significativi livelli di varie proteine murine. Di conseguenza la coltura di cellule animali diventata il metodo di elezione per la produzione di anticorpi monoclonali ad uso farmaceutico. La rimozione delle cellule dal mezzo contenente gli anticorpi portata a termine mediante centrifugazione o filtrazione, e normalmente si fa anche una ultrafiltrazione per concentrare il filtrato, che viene poi sottoposto a diverse purificazioni di tipo cromatografico. A seconda dell'utilizzo previsto, l'anticorpo pu poi essere coniugato a specifiche molecole "segnale" (es. radionuclidi o tossine). Alla fine vengono aggiunti al prodotto degli agenti stabilizzanti come tamponi, glicina o anche albumina. Il prodotto viene poi liofilizzato e venduto confezionato in atmosfera di gas inerte.
Cromatografia di affinit
Preparato liquido Formulazione del prodotto finale Filtrazione sterile e infialamento asettico
Liofilizzazione
Preparato in polvere
Questo approccio, comunque, non ha dato i risultati sperati, dato che i preparati di anticorpi monoclinali usati erano di origine murina. La regione Fc di questi anticorpi un attivatore molto debole delle funzioni immunitarie umane. Gli sviluppi della tecnica, permettendo la produzione di anticorpi monoclonali umani, potranno, in futuro, rendere questo approccio terapeutico ancora pi interessante. Gli anticorpi monoclonali non coniugati sono particolarmente interessanti poich non danno effetti tossici, come invece accade per gli anticorpi legati a tossine o a traccianti radioattivi. Diversi studi clinici hanno valutato lattivit di anticorpi monoclonali coniugati con isotopi traccianti, che sono di solito usati come potenziali agenti antitumorali. Il razionale di questa terapia sta nel selettivo rilascio dellagente radioattivo direttamente al sito del tumore. Una applicazione affine degli anticorpi antitumorali radiomarcati quella della diagnostica per immagini (immunoscintigrafia). In questo caso il radioisotopo utilizzato deve essere -emittente (cosicch la radioattivit possa penetrare allesterno attraverso il corpo). Uno dei radioisotopi pi usati il 99Tc, che ha sufficiente energia di emissione e una emivita relativamente breve (6 ore), che minimizza i danni conseguenti allesposizione del paziente. Dopo la somministrazione, il 99Tc si concentrer al sito del tumore, che sar facilmente visualizzato usando un adatto equipaggiamento per la rivelazione dei raggi . Tra gli anticorpi monoclonali radiomarcati per la diagnostica dei tumori ci sono quelli legati allIndio, capaci di legare le cellule di tumori ovarici e del colon-retto, approvati dalla FDA nel 1992. In Europa lEMEA ha pi recentemente autorizzato limmissione in commercio di due agenti di diagnostica per immagini: CEA SCAN e Technemab-K-1 (marcati con 99Tc), che non consistono nellintero anticorpo murino, ma solo del frammento legante lantigene.
11
CEA-SCAN un frammento Fab di uno specifico anticorpo monoclonale murino diretto contro lantigene oncofetale umano (Carcino-Embryonic Antigen), espresso ad alti livelli da alcuni tumori, soprattutto del tratto gastrointestinale. Technemab-K-1 riconosce un antigene specifico presente sulla superficie dei melanomi, ed usato per visualizzare lestensione e la presenza di metastasi in casi accertati di melanoma. Produzione industriale di CEA-SCAN
Purificazione degli anticorpi (due cromatografie a scambio ionico ed una per affinit)
Gli anticorpi monoclonali antitumorali possono essere anche usati per rilasciare tossine al sito del tumore. Dopo il legame alla superficie cellulare, la tossina coniugata allanticorpo spesso internalizzata via endocitosi. Si presume che, prima di essere distrutta, la tossina sia resa disponibile allinterno della cellula, cos da poter esplicare il suo effetto tossico.
Drug-based immunotherapy
Oltre al rilascio selettivo di tossine e radioisotopi al sito del tumore, gli anticorpi possono anche essere usati per il rilascio di farmaci al tumore. Si possono accoppiare chemioterapici antitumorali (adriamicina, amminopterina, metotrexato e alcaloidi della vinca) ad anticorpi monoclonali specifici per le proteine situate alla superficie delle cellule tumorali. Solo un numero limitato di molecole, per, pu essere coniugato ad ogni molecola di anticorpo, e questo riduce notevolmente il carico del rilascio di farmaco.
12
Un approccio alternativo consiste nellutilizzare enzimi attivatori di un profarmaco accoppiati ad anticorpi monoclonali diretti contro antigeni specifici della superficie della cellula bersaglio. Profarmaco inattivi possono cos essere somministrati, per esempio, per via iniettiva, ed essere attivati solo alla superficie del tumore. Questo metodo stato chiamato Antibody-directed enzyme prodrug therapy (ADEPT) o Antibody-directed catalysis (ADC). A causa della sua natura catalitica, ogni anticorpo-enzima coniugato attiver molte molecole del profarmaco in questione, e molti degli agenti citotossico-attivi rilasciati alla superficie del tumore entreranno nelle cellule tumorali per diffusione semplice o per trasporto attivo mediato da carrier. I profarmaci usati per questa terapia dovrebbero essere poco costosi, prontamente biodisponibili e stabili alla degradazione chimica/enzimatica in vivo. Gli enzimi dovrebbero essere stabili in condizioni fisiologiche, manifestare un ragionevole numero di turnover in vivo e avere attivit indipendente da cofattore. Enzimi mammiferi sarebbero verosimilmente meno immunogenici di enzimi microbici. Tuttavia, luso di un profarmaco capace di essere attivato da un enzima mammifero potrebbe dare dei problemi nel caso in cui lenzima endogeno (umano) fosse capace di attivare il farmaco in siti distanti dal tumore.
Una strategia scontata per ovviare al problema dellimmunogenicit consisterebbe nella produzione ed uso di anticorpi monoclonali di origine umana, cosa possibile ma difficile. I linfociti umani produttori di anticorpi possono potenzialmente essere resi immortali per mezzo di : Trasformazione da infezione da virus di Epstein-Barr (EBV) Fusione con anticorpi monoclonali murini Fusione con linee cellulari linfoblastoidi umane Tuttavia restano alcuni ostacoli tecnici che impediscono la produzione di routine di preparati di anticorpi monoclonali umani. Questi includono: Fonte di cellule produttrici di anticorpi Metodi affidabili per limmortalizzazione dei linfociti Stabilit e capacit di produrre anticorpi delle risultanti cellule immortali Il primo stadio della produzione di anticorpi monoclonali murini prevede la somministrazione dellantigene al topo, cosa che chiaramente non pu essere fatta sull'uomo, mentre, per quanto riguarda i linfociti B, potrebbero essere prelevati dalla circolazione periferica, ma la maggior parte di questi non stimolata e il loro recupero dalla milza ovviamente impraticabile. Nonostante l'EBV sia capace di indurre trasformazione cellulare, pochi linfociti B presentano il recettore di superficie per questo virus, e quindi la maggior parte di essi risulta immune all'infezione. Anche dopo un'eventuale trasformazione, molti producono anticorpi IgM a bassa affinit, e le cellule sono spesso instabili. La fusione di linfociti umani con linee cellulari linfoblastoidi umane un processo molto poco efficiente, e la fusione di linfociti umani con cellule di mieloma murino porta a ibridi molto instabili. Questi ed altri fattori rendono la produzione di anticorpi monoclonali umani estremamente difficile e costosa.
14
Si dunque osservato che gli anticorpi chimerici: sono significamente meno immunogenici Hanno una prolungata emivita sierica Permettono l'attivazione di varie funzioni mediate dalla regione Fc Il grado di risposta immunitaria osservata dopo la somministrazione di una singola dose calato dall'80%, nel caso degli anticorpi murini, al 5% per gli anticorpi chimerici. Resta comunque la possibilit che ripetute somministrazioni di anticorpi chimerici portino a risposta immunitaria nel ricevente. L'"ibridazione" degli anticorpi monoclonali di topo e di ratto stata ulteriormente sviluppata, rispetto alla formazione delle molecole chimeriche appena viste, sostituendo negli anticorpi umani solo le CDR degli anticorpi monoclonali di roditore. Dato che possiedono affinit di legame per l'antigene simile a quella degli anticorpi monoclonali di roditore originali, questi anticorpi "umanizzati" potrebbero dimostrarsi utili come agenti terapeutici. L'umanizzazione degli anticorpi monoclonali umani si pu realizzare cos. Partendo da una linea di ibridomi di roditore, si possono isolare i cDNA per le catene L e H. La PCR servir ad amplificare le regioni variabili di tali cDNA. Gli inneschi oligonucleotidici adoperati per la suddetta amplificazione sono complementari alle sequenze delle estremit 5' e 3' del DNA che codifica le regioni variabili, dove le sequenze nucleotidiche si conservano in grado elevato da un gene anticorpale all'altro. In base alla sequenza nucleotidica dei cDNA delle regioni leggere e pesanti (VL e VH) si possono delimitare i confini delle CDR. Di solito si stabilisce immediatamente dove incominciano e terminano le CDR, giacch queste regioni presentano sequenza altamente variabile, laddove la sequenza delle regioni dell'intelaiatura tende relativamente a conservarsi. Sulla base della sequenza dei DNA che codificano le CDR di roditore si sintetizzano sei coppie di inneschi PCR oligonucleotidici. Ciascuna coppia di inneschi concepita per iniziare la sintesi del DNA di una delle CDR di roditore: tre provenienti dalla catena L, tre dalla catena H. Inoltre ogni innesco comprende alla estremit 5' 12 nucleotidi in pi, complementari alle regioni fiancheggiatrici interne al DNA dell'intelaiatura umana al quale indirizzato il DNA delle CDR di roditore. 15
Peptide segnale
FR 1
CDR 1 FR 2
CDR 2 FR 3 CDR 3 FR 4
P1 CDR 1
P2
A questo punto si utilizza la mutagenesi mirata agli oligonucleotidi per sostituire, una alla volta, le sequenze DNA complete di ognuna delle CDR umane con il DNA amplificato originante dai roditori. Cos facendo, per sostituire tutte le CDR occorrono sei cicli di mutagenesi mirata agli oligonucleotidi. Il procedimento "trapianta", di fatto, le CDR di roditore dentro l'intelaiatura dell'anticorpo umano. Successivamente si clonano i cDNA delle regioni variabili umanizzati in vettori di espressione che vengono poi introdotti in cellule ospiti idonee, di solito cellule di E. Coli o di mammifero, in modo da produrre gli anticorpi. Con questa tecnica sono gi stati umanizzati oltre 50 anticorpi monoclonali diversi; la tecnologia senza dubbio efficace e diffusamente applicabile, tuttavia costosa e lunga. Una strategia promettente comunque costituita da genoteche combinatorie a espressione fagica, costruite con mRNA provenienti da cellule B umane di donatori non immunizzati.
FRAMMENTI DI ANTICORPI
Una limitazione al trattamento dei tumori solidi per mezzo di anticorpi sta nella loro scarsa capacit di penetrazione nella massa tumorale, a causa delle loro dimensioni fisiche. Di conseguenza, stato di recente posto l'interesse sull'uso di frammenti di anticorpi, che mantengano la capacit di legare l'antigene. Frammenti come Fab, F(ab)2 e Fv possono essere prodotti facilmente per mezzo della tecnologia del DNA ricombinante, e sono stati legati, per esempio, a traccianti radioattivi per la diagnostica. Mentre la loro diminuita massa molecolare facilita la penetrazione del tumore, gli anticorpi chimerici o umanizzati interi si sono comunque dimostrati pi efficaci, soprattutto se usati per scopi terapeutici.
specificamente alle cellule che hanno l'antigene bersaglio, e questo tipo di prodotto potrebbe essere un trattamento eccezionalmente potente nei confronti del cancro e di malattie virali come l'AIDS. L'ingegneria degli anticorpi viene impiegata anche per costruire anticorpi bispecifici, nei quali ognuno dei due bracci riconosce un antigene differente, consentendo cos all'anticorpo di fare da ponte fra due antigeni; per esempio un anticorpo bispecifico potrebbe riconoscere una proteina di una cellula tumorale con un braccio e una proteina di superficie di un linfocita T con l'altro, mettendo cos il linfocita killer a diretto contatto con la cellula tumorale. (v. figura seguente)
Malattie cardiovascolari
Sono state sviluppate varie preparazioni di anticorpi che facilitano la visualizzazione di patologie cardiovascolari quali infarto del miocardio, trombosi, arteriosclerosi. Ad esempio, frammenti (Fab) di anticorpi monoclonali anti miosina marcati con 111In sono stati usati nella diagnostica per immagini, poich l'anticorpo dimostra specificit per la miosina intracellulare cardiaca, che viene "esposta" solo in caso di infarto del miocardio.
Malattie infettive
Gli anticorpi monoclonali "per immagini" possono essere anche usati per visualizzare i siti o l'estensione di infezioni batteriche localizzate. Questo pu essere fatto utilizzando anticorpi radiomarcati che mostrino affinit di legame per specifici antigeni batterici di superficie. Un approccio indiretto prevede, invece, l'uso di anticorpi capaci di rivelare granulociti e vari altri leucociti che si concentrano al sito di infezione.
Malattie autoimmuni
L'autoimmunit la condizione in cui il sistema immunitario di un organismo designa come bersaglio elementi di se stesso, e questo deriva da errori di vari sistemi di controllo immunologici che sono normalmente responsabili del mantenimento dell'auto-tolleranza. E' stato stimato che circa l'1-2 % della popolazione degli Stati Uniti soffre di malattie autoimmuni, tra cui l'artrite reumatoide, la sclerosi multipla e alcune forme di diabete. In molti casi la risposta autoimmune deriva dall'inappropriata attivazione di uno specifico sottoinsieme di linfociti B e/o T. 17
L'approccio immunoterapeutico pi comune per trattare queste patologie consiste nell'indurre la deplezione delle popolazioni cellulari T e B. Questo pu essere fatto mediante la somministrazione di un anticorpo diretto contro un antigene di superficie di tali cellule. I primi studi, per esempio, hanno dimostrato che l'iniezione di un anticorpo non coniugato anti CD-4 (glicoproteina di superficie presente su molti linfociti T) in sette giorni riduce significativamente i sintomi clinici dell'artrite reumatoide e l'effetto dura per diversi mesi.
ASPETTI COMMERCIALI
Dal punto di vista commerciale, gli anticorpi monoclonali hanno rappresentato una delle aree pi redditizie della nuova biotecnologia. Attualmente, circa il 30% dell'intero mercato dei prodotti per test diagnostici rappresentato dagli immunoassay, e si prevede che entro il 2000 le vendite arriveranno a toccare i 10 miliardi di dollari.
18