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Deteccin del efecto txico de un fungicida mediante bioensayo sobre Artemia salina Linnaeus, 1758

Cumpa, M; Daz, O.; Tenicela, P.; Velezvilla, G.

Resumen El objetivo fue aplicar un ensayo de toxicidad sobre Artemia salina mediante el uso del fungicida Clotrimazol (Roxfarma) a distintas concentraciones (C1= 100 mg.L-1),
(C2 = 50 mg.L-1), (C3= 25 mg.L-1), (C4= 12.5mg.L-1), (C5=6.25mg.L-1), (C6= 3.125mg.L-1), (C7= 1.563 m.L-1). Las distintas concentraciones del fungicida fueron clasificados segn el

porcentaje de mortalidad como: no txico (NT) (MR <25%), levemente txico (LT) (25%<MR <50%), txico (T) (50%<MR <75%), y muy txico (MT) (75%<MR <100%). A las 24 horas, las concentraciones a 100 mg/L son altamente toxicas (%MR=100%), a las 48 horas todas las concentraciones son altamente toxicas (%MR>75%). Palabras clave: Artemia, bioensayo, clotrimazol, fungicida, antimictico.

Abstract The Objective was to apply a toxicity test on Artemia salina fungicide using the Clotrimazol (Roxfarma ) at various concentrations (C1 = 100 mg.L-1), (C2 = 50 mg.L-1), (C3 = 25 mg.L-1), (C4 = 12.5mg.L-1), (C5 = 6.25mg.L-1), (C6 = 3.125mg.L-1), (C7 = 1563 mL -1). Different concentrations of the fungicide were ranked by the percentage of mortality as nontoxic (NT) (MR <25%), slightly toxic (LT) (25% <MR <50%), toxic (T) (50% <MR <75%) and very toxic (MT) (75% <MR <100%). At 24 hours, concentrations of 100 mg / L are highly toxic (% MR = 100%), at 48 hours all concentrations are highly toxic (% MR> 75%). Keywords: Artemia, bioassay, clotrimazol, fungicide, antifungal.

INTRODUCCIN Los antimicticos incluyen una amplia variedad de sustancias con diferentes estructuras qumicas y mecanismos de accin. (Susana y Valds, 2005). La clasificacin se realiza segn criterios convencionales que atienden a su estructura en: polienos, azoles, alilaminas, entre otros; de acuerdo con su origen en sustancias producidas por organismos vivos o derivados de sntesis qumica; de acuerdo con su espectro de accin en: amplio o restringido y de acuerdo con el sitio de accin (Gregory, 2005). Actualmente, el producto tpico ms utilizado por su alto grado de efectividad es el Clotrimazol, antimictico de amplio espectro, el cual es derivado de la alquilacin de imidazol con cloruro de oclorotritilo en acetona y con trietilamina como base. El Clotrimazol es un antimictico utilizado en el tratamiento de ciertos tipos de infecciones de la piel causadas por hongos (candidiasis, dermatofitosis, pie de atleta, etc.) El efecto antimictico de Clotrimazol acta inhibiendo la divisin y crecimiento, mediante la alteracin de la permeabilidad celular del hongo y la inhibicin de actividad de enzimas dentro de la clula. Artemia salina (Linnaeus, 1758) es un crustceo sensible a un amplio rango de compuestos con actividad biolgica y de muy diversas estructuras qumicas (Michael et al). Se propuso su uso con

diversas modificaciones para diferentes pruebas de toxicidad. (Vanhaecke et al) debido a su fcil manejo en el laboratorio y su cultivo relativamente sencillo y barato. El objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto toxico de Clotrimazol (solucin Tpica) a diferentes concentraciones en Artemia Salina. MATERIAL Y MTODOS Los bioensayos ecotoxicolgicos se realizaron en el Laboratorio de Ecofisiologa Animal (LEFA) de la Facultad de Ciencias Naturales y Matemtica (FCCNNM) de la Universidad Nacional Federico Villarreal (UNFV), El Agustino, Lima, Per. Eclosin de Artemia salina Los huevos de A. salina de se obtuvieron en Zoofarma ubicado en Santa Beatriz - Lima 1 Per. Se procedi a preparar las condiciones para la eclosin de los huevos, con el fin de obtener los individuos en estado nauplio II, los cuales sern usados en el presente experimento. Se incorporaron los huevos en un vaso de precipitado de 500ml conteniendo agua destilada y se expuso a luz intensa por un periodo de tiempo de 1 hora. Luego, se utiliz hipoclorito de sodio (leja Clorox) que tena una concentracin de 5,25%. En proporcin 100ml por 900ml de agua, se agit constantemente por espacio de 30 minutos con el fin de facilitar el descascaramiento de los huevos; fue importante apreciar el cambio de coloracin de los huevos de una coloracin marrn inicial a una

coloracin naranja. Seguido de enjuagar bien los huevos con agua destilada, se trasladaron a un vaso de precipitado de 1000ml conteniendo agua de mar filtrada y 7.5 g de bicarbonato de sodio (NaHCO3), y luego llevado este a la incubadora a 27C durante un periodo de 24 h. Pasado el tiempo de incubacin se sometieron los huevos a fuerte aireacin hasta su eclosin. Los cuales eclosionaron a temperatura ambiente (entre 19 C a 22C) 2 das despus de haber comenzado la fase de aireacin. Instalacin del bioensayo Una vez obtenidos los nauplios II, dentro de las 24 h de eclosin, se procedi a realizar los bioensayos de toxicidad. Se utilizaron 7 concentraciones ms un control con 4 repeticiones por concentracin. No se utiliz un control con solvente pues se dispuso del antimictico en solucin tpica. Se utiliz un total de 320 individuos de A. salina; distribuyndose al azar en cada envase diez formas inmaduras (nauplio II). Los nauplios no se alimentaron durante el bioensayo. Al contar ya con los nauplios de segundo estadio de A. salina, se dej pasar 20 h desde la eclosin, antes de ser utilizadas en los bioensayos. A continuacin 10 nauplios de segundo estadio de A. salina fueron llevados a cada uno de los envases de 25 mL de capacidad con 20 mL de solucin y en cada una de las cuatro rplicas. Se cont el nmero de nauplios vivos y muertos en cada una de las diluciones a las 24 y 48 horas. Los ensayos fueron considerados vlidos cuando la mortalidad

en el control no fue mayor al 10% segn el criterio estndar (Calow, 1993). Las diluciones calculadas usando un factor de 0,5, fueron: de 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.563 miligramos de Clotrimazol por Litro de agua. El agua de dilucin empleada para todos los casos fue agua de mar filtrada. Resultados y discusiones El clotrimazol es un derivado imidazlico, que se administra como mtodo de tratamiento de las infecciones fngicas, tanto cutneas como vaginales. Como derivado imidazlico, goza de un amplio espectro de actividad contra dermatofitos, levaduras y mohos. A diferencia de otros derivados de este tipo, tiene una propiedad aadida, su espectro alcanza tambin el patgeno del eritrasma y algunas bacterias gram-positivas como los estafilococos y los estreptococos, especies que pueden intervenir en sobreinfecciones y en infecciones vaginales. Con respecto a stas ltimas, Clotrimazol tambin cubre especies bacterianas gram-negativas (Proteus, Klebsiella, E. Coli y Pseudomonas) y bacterias anaerobias como Prevotella y la Gardnerella vaginalis. En concentraciones altas, incluso es eficaz frente a Trichomonas vaginalis. Sin embargo no se encontr evidencias bibliogrficas de anteriores bioensayos que demuestre su accin toxicolgica sobre A. salina. En la tabla 1 se precian los resultados obtenidos por la accin toxicolgica del clotrimazol a diferentes concentraciones, las cuales fueron sometidas para 10

individuos de estadio nauplio II por cada repeticin. La concentracin C0 fue la concentracin blanco, constituida por agua de mar filtrada, a esta concentracin solo se alcanz el 10% de mortalidad, no sobrepasando el lmite de mortalidad estndar para la concentracin blanco (20%) para bioensayos. Para la concentracin 1 (C1), se obtuvo el 100% de mortalidad para A. salina a las 24 h por lo que se catalog a esta concentracin como muy txica. Para la Concentracin 2 (C2), a las 24 h, se obtuvo un 28% de mortalidad siendo considerado como levemente toxico; para la misma concentracin, a las 48 h, el porcentaje de mortalidad (%MR) aumento a un 78% siendo considerado como Toxico a las 48 h de establecido el bioensayo. Las concentraciones C3, C4, C5, C6 Y C7, a las 24 horas, mostraron un porcentaje de mortandad menor al 20% por lo que las concentraciones a este intervalo de tiempo fueron consideradas como no toxicas sobre A. salina. A las 48 horas, las concentraciones C3, C4, C5, C6 Y C7, alcanzaron un porcentaje de mortalidad mayor e igual al 80% por lo que fueron consideradas como muy toxicas a las 48 horas de iniciado el bioensayo. CONCLUSIONES: Debido a que el porcentaje de mortalidad en el control es menor al 5 % consideramos que la calidad de los huevos de Artemia salina y la del agua de mar tratada son apropiadas en la

utilizacin de bioensayo. De los resultados de la evaluacin en la poblacin experimental de Artemia salina a las 24 horas las concentraciones mayores a 100 mg/L son altamente toxicas ya que el porcentaje de mortalidad es del 100% , para concentraciones menores del valor antes mencionado, dentro de este rango de tiempo, la poblacin estudiada presenta resistencia al efecto del fungicida, sin embargo pasada las 48 horas de iniciado el bioensayo, la mortalidad asciende a ms del 75 % en todas las concentraciones del fungicida, a partir de ello concluimos que el efecto del mismo es toxico. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 1. Borroto J., Trujillo R., de la Torre Y., Waksman N., Hernndez M., Salazar R. Actividad antimicrobiana y toxicidad frente a Artemia salina del extracto diclorometnico de races de Morinda royoc L. Rev Cubana Plant Med v.16 n.1 Ciudad de la Habana ene.-mar. 2011. 2. Bustos-Obregon E., lvaro Vargas A. Chronic toxicity bioassay with populations of the crustacean Artemia salina exposed to the organophosphate diazinon. Biol. Res. v.43 n.3 Santiago 2010. 3. Gonzlez A., Presa M., Latorre M., Lur M. Deteccin de metabolitos fngicos con actividad txica mediante bioensayo sobre Artemia salina. Rev Iberoam Micol 2007; 24: 59-61

4. Gregor B.S. Estructura y actividad de los antifngicos. Instituto Cubano de Investigaciones de Derivados de la Caa de Azcar. Rev Cubana Farm 2005; 39(2) 5. Gutirrez H., Gutirrez R., Herles E., Hernndez M., Horna, P., Hoyos P., Huby, C., Jimnez M., Jimnez L., Kollmann A., Castaeda, B., Ibez L., Scotto C. Anlisis comparativo de la toxicidad del extracto acuoso en cocimiento de la harina de maca (Lepidium meyenii, Walp) en tres especies de animales modelos: Artemia franciscana (Crustcea, Anostraca), pez Guppy (Poecilia reticulata) y ratn (Mus musculus). Revista Horizonte Mdico | Volumen 7, N2, Diciembre 2007 6. Iannacone J., Prez D. Efectos txicos de cuatro plantas amaznicas sobre Chironomus calligraphus Goeldi 1905 (Diptera: Chironomidae) y Artemia franciscana Kellog 1906 (Anostraca:

Artemiidae). Revista Brasileira de Toxicologia 21, n.1 (2008) 25 32 7. Jurado, C. Toxicologa Veterinaria. 2 ed., Barcelona: Editorial Salvat. 1989. 8. Lagarto, A.; Vega, R. Manual de ensayos de toxicologa alternativa. CIDEM. Cuba. 1990. 9. Michael AS, Thompson CG, Abramovitz M. Artemia salina as test organims for a bioassay. Science 1956; 123: 464. 10. Pino O., Jorge F. ENSAYO DE ARTEMIA: TIL HERRAMIENTA DE TRABAJO PARA ECOTOXICLOGOS Y QUMICOS DE PRODUCTOS NATURALES. Rev. Proteccin Veg. v.25 n.1 La Habana ene.-abr. 2010 11. Vanhaecke P, Persoone G, Claus C, Sorgeloos P. Proposal for a shortterm toxicity test with Artemia nauplii. Ecotoxicol Environ Saf 1981; 5: 382-387

Estadio Nauplio II de A. salina (40x)

ANEXOS Tabla 1. Nmero de individuos Nauplio II de Artemia salina sometido a diferentes concentraciones de Clotrimazol a las 24 y 48 horas.

24 HORAS A C0 B C D A C1 B C D A C2 B C D A C3 B C D A C4 B C D A C5 B C D A C6 B C D A C7 B C D V 9 10 9 10 0 0 0 0 3 6 4 3 7 7 8 7 8 7 8 9 9 8 9 8 8 9 8 9 9 9 8 9 I 0 0 0 0 0 0 0 0 3 2 5 3 1 1 2 0 0 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 VT 9 10 9 10 0 0 0 0 6 8 9 6 8 8 10 7 8 7 9 9 10 9 10 8 9 10 9 10 10 10 9 10 M 1 0 1 0 10 10 10 10 4 2 1 4 2 2 0 3 2 3 1 1 0 1 0 2 1 0 1 0 0 0 1 0 Total 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 V 9 10 9 10 0 0 0 0 2 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

48 HORAS I 0 0 0 0 0 0 0 0 2 2 1 0 2 2 2 1 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 VT 9 10 9 10 0 0 0 0 4 3 2 0 3 2 2 1 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 M 1 0 1 0 10 10 10 10 6 7 8 10 7 8 8 9 10 10 9 10 10 10 10 9 9 10 10 10 10 10 10 10 Total 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10

V= Vivos con movimiento I = Vivos casi inmviles (mueven algunos apndices) VT = vivos totales M = muertos

Grfico 1. Conteo de nauplios II de Artemia salina a las 24 h. de instalado el bioensayo a diferentes concentraciones de Clotrimazol. 12

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N DE INDIVIDUOS

VIVAS MUERTAS

0 C0 C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7
CONCETRACIONES

Grafico 2. Conteo de nauplios II de Artemia salina a las 48 h. de instalado el bioensayo a diferentes concentraciones de Clotrimazol.

12

10 N DE INDIVIDUOS

VIVAS MUERTAS

0 C0 C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 CONCETRACIONES (mg / L-1)

Tabla 2. Porcentaje de mortalidad a las 24 horas.

V C0 C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 9.5 0 7.25 8.25 8.25 9.25 9.5 9.75

M 0.5 10 2.75 1.75 1.75 0.75 0.5 0.25

%MR 5% 100% 28% 18% 18% 8% 5% 3%

%MR = Porcentaje de mortandad

Grafico 3. Variacin del porcentaje de mortalidad a las 24 horas.

Tabla 3. Porcentaje de mortalidad a las 48 horas.

V C0 C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 9.5 0 2.25 2 0.25 0.25 0.25 0

M 0.5 10 7.75 8 9.75 9.75 9.75 10

%MR 5% 100% 78% 80% 98% 98% 98% 100%

%MR = Porcentaje de mortandad

Grafico 4. Variacin del porcentaje de mortalidad a las 48 horas.