CINETICA PROCESELOR DE BIOSINTEZ

1. DINAMICA MULTIPLICRII BACTERIILOR. CURBA DE CRETERE

Procesul de cretere a microorganismelor se desfoar prin sinteza specific echilibrat a constituenilor celulari, pornind de la substane nutritive simple aflate n mediul de cultur [Gh. Zarnea]. Procesul de cretere a microorganismelor este controlat genetic. Pe de alt parte, acesta depinde n evoluia sa i de natura i concentraia substanelor nutritive n mediu, precum i de asigurarea cu energia necesar reaciilor de sintez. Creterea bacteriilor se realizeaz prin depunerea unisau tridimensional de substan nou, ceea ce determin mrirea celulei bacteriene n sensul uneia dintre dimensiunile ei sau n sensul celor trei dimensiuni. Mrirea volumului celular se face att prin sinteza de substan organic ct i prin mrirea coninutului n ap. Creterea microorganismelor nu are loc indefinit, ci se ntrerupe la un moment dat, cnd se produce diviziunea celular. Activitatea normal a microorganismelor este condiionat de existena unui anumit raport ntre volumul celulei i suprafaa ei, prin care se face absorbia substanei nutritive i eliminarea cataboliilor. n cursul creterii celulei, raportul suprafa/volum se modific datorit faptului c, n timp ce suprafaa crete cu o relaie ptratic, volumul ei se modific cu o relaie cubic, ceea ce determin o diminuare relativ a suprafeei celulare, fapt ce ngreuneaz schimbul de substane i, atunci cnd disproporia dintre suprafa i volum atinge un anumit punct critic, se produce diviziunea celular. n cadrul proceselor biotehnologice, studiul creterii i multiplicrii microorganismelor productoare are o importan deosebit pentru eficiena tehnologiilor industriale. Spre deosebire de organismele pluricelulare, la care multiplicarea celulelor duce la mrirea taliei individuale, la toate celelalte

organisme unicelulare, ea are ca rezultat creterea numrului de indivizi. Viteza de multiplicare a bacteriilor este excepional de mare. Durata unei generaii - interval de timp dintre dou diviziuni succesive - este tipic pentru fiecare specie, dar poate varia la aceeai specie n funcie de condiiile de mediu, fiind, n general, cuprins ntre 20 i 30 de minute. Procesul multiplicrii populaiilor bacteriene este bine cunoscut. Acesta cuprinde mai multe faze (fig. 1), care sunt descrise n continuare.

Fig. 1. Curba de cretere a unei populaii bacteriene [Gh. Zarnea]: A nsmnare; A-B - faza de lag\ B-C - faza de accelerare a ritmului de cretere; C-D - faza de multiplicare logaritmic; D-E - faze de ncetinire a ritmului de cretere; E-F - faza staionar; F-G - faza intermediar de declin; G-H - faza de declin; ---- numr de celule viabile (UFC - uniti formatoare de colonii); ____numr total de celule din mediul de cultur. Faza de laten sau lag. Este cuprins ntre momentul introducerii microorganismului n mediul de cultur (inoculare) i momentul n care celulele acestuia ncep s se multiplice. In aceast faz, numrul bacteriilor din inocul rmne neschimbat sau chiar scade temporar. Cultura nu este vizibil macroscopic. Aceast faz dureaz n medie cteva ore. Faza de laten apare ca o perioad de adaptare n noile condiii de cultivare. In aceast perioad bacteriile viabile din inocul i acumuleaz n celul metaboliii eseniali i sistemele enzimatice necesare creterii. La transvazarea inoculului ntr-un mediu nutritiv, se ntlnesc, n principal, dou situaii:

- dac inoculul bacterian provine dintr-o cultur aflat n curs de multiplicare i se transvazeaz ntr-un mediu nutritiv cu aceeai compoziie, multiplicarea bacteriilor i menine n continuare ritmul rapid (este cazul trans-vazrii inoculului n intermediar, operaie efectuat numai pentru obinerea de cantiti mai mari de inocul necesare fazei urmtoare de biosintez numit: faz de reg - dac bacteriile provin dintr-o cultur tot n faz exponenial de multiplicare dar se transvazeaz un mediu nutritiv cu alt compoziie, atunci ele au o perioad de adaptare, creterea lor nefiind evideniat de la nceput. Durata perioadei de laten variaz, deci, n funcie de noile condiii de mediu pe care microorganismele le gsesc la transvazare. Cu ct aceste condiii noi (mediu nutritiv, temperatur, p H , aeraie) sunt mai apropiate de cele anterioare, cu att perioada de lag este mai scurt. Faza de multiplicare exponenial sau de cretere logaritmic. Aceast faz este precedat de o perioad scurt (cea 2 h) de accelerare a ritmului de cretere, n care multiplicarea se produce cu o vitez progresiv mrit. Dup aceast perioad, diviziunile sunt bine sincronizate, astfel nct numrul celulelor viabile se dubleaz brusc i la intervale regulate dup o progresie geometric 2, 2 ,2', 2", 2" 2", adic are loc o cretere exponenial. Capacitatea ie cretere exponenial se manifest ca atare numai o scurt perioad de timp (2-3 ore). n continuare, tendina de multiplicare rapid scade progresiv, datorit epuizrii substanelor nutritive din mediu i acumulrii n el a produselor de catabolism n concentraii cu efect inhibitor. n faza de multiplicare exponenial, celulele considerate a fi de tip embrionar au dimensiuni mai mari dect cele specifice speciei de care aparin, citoplasm lor este omogen, nu conine materiale de rezerv i are o mare afinitate pentru coloranii bazici, datorit coninutului ridicat n ARN. ntruct aceast perioad corespunde unor transformri permanente, celulele aflate n

faze exponeniale de multiplicare sunt cele mai potrivite pentru lucrri de genetic efectuate n scopul obinerii de noi tulpini productoare. Spre sfritul fazei de multiplicare logaritmic apare o aa-numit perioad de post-/ag, n care are loc un fenomen de ncetinire i de sincronizare a creterii populaiei bacteriene, celulele aflndu-se n stadii diferite ale ciclului lor de dezvoltare. n aceast perioad cultura tinde spre un echilibru ntre diviziune i mortalitate. Din aceast faz sunt amorsate biosintezele n culturi continue. Faza staionar maximal. Este faza n care numrul celulelor viabile este maxim i rmne constant o perioad de timp care dureaz de la cteva ore, la cteva zile, n funcie de sensibilitatea bacteriilor la condiiile de mediu. Intrarea culturii n faza staionar este determinat, de obicei, de epuizarea substanelor nutritive din mediu sau de acumularea unor produi toxici. n aceast faz, celulele nu se mai multiplic, iar numrul total al indivizilor populaiei este constant i egal cu numrul celulelor viabile. n aceast faz celulele bacteriene sunt considerate mature, avnd caracteristici morfologice specifice speciei: dimensiuni mai mici dect n faza de cretere exponenial, citoplasm mai puin omogen datorit apariiei de incluzii i acumulrii unor substane de rezerv, afinitate normal pentru colorani i prezena sporilor la speciile sporogene. Faza de declin. Este faza corespunztoare unei scderi progresive a numrului celulelor viabile datorit morii unui numr foarte mare de celule. Celulele din aceast faz sunt btrne, aprnd fenomene de involuie: celulele mici, sferice, deformate, gigante sau ramificate, care se coloreaz slab sau capt afinitate fa de coloranii acizi, iar la speciile sporogene apar foarte muli spori. n unele cazuri se produc fenomene de autoliz, ceea ce determin scderea numrului total de celule din mediu.

Creterea unui microorganism se poate aprecia prin mai multe metode: (D.O.). De regul, pentru fiecare bacterie se determin creterea densitii optice (D.O.) pe parcursul ciclului de dezvoltare i se reprezint grafic n funcie de timp. Cinetica de cretere a levurilor este similar cu cea a bacteriilor. determinarea substanei uscate a masei celulare; determinarea concentraiei sursei de carbon din mediu; determinarea numrului total de celule, cu ajutorul celulei determinarea gradului de turbiditate al suspensiei bacteriene

microscopice de numrat; ntr-un mediu lichid. n raport c u o scar etalon sau la fotocolorimetru

1.1. Dinamica procesului de cretere Ia fungi

Spre deosebire de bacterii i drojdii, fungii cresc sub form de colonii, deoarece singurele celule individuale la aceste microorganisme sunt conidiile. In cazul lungilor, se dezvolt un miceliu ramificat a crui lungime poate atinge 10-15 m. Creterea unui miceliu pornind de la un inocul de spori sau de la un fragment micelian parcurge mai multe faze: faza iniial de log, care dureaz cteva ore. n aceast faz are loc germinarea sporilor (cnd inocularea s-a efectuat cu suspensie de spori) sau regenerarea hifelor rupte i lezate (cnd inocularea s-a efectuat cu inocul vegetativ); faza de cretere liniar, n care pe suprafaa mediului apare o colonie circular, care crete liniar cu timpul. Ea are forma unei reele

fine de hife ale crei mrime i grosime depind de compoziia mediului nutritiv; faza de nvechire, care corespunde ncetinirii vitezei de cretere determinat de efectul duntor al produilor de metabolism eliberai de colonie. ncetinirea ritmului de cretere apare mai repede cnd cultura se dezvolt pe medii bogate n substane nutritive, datorit acumulrii mai rapide a produilor de metabolism. Creterea coloniilor de mucegai se poate efectua pe medii solide sau lichide n culturi de suprafa sau submerse. Pe medii lichide. n culturi statice, fungii produc o pnz" micelian la suprafaa lichidului. n acest caz, diferitele pri ale culturii se gsesc n condiii diferite de mediu i capacitatea de biosintez a unui produs este diminuat. De aceea, n procesele biotehnologice industriale n care este necesar o dezvoltare abundent i egal a mucegaiului se utilizeaz cultivarea submers, cu agitare mecanic i aerare corespunztoare.

2. INFLUENTA FACTORILOR DE MEDIU ASUPRA CRETERII MICROORGANISMELOR

Creterea microorganismelor este influenat de o serie de factori de mediu, dintre care cei mai importani sunt: concentraia substratului; calitatea i cantitatea inoculului; temperatura; pH-ul mediului de biosintez; agitarea; concentraia oxigenului dizolvat.

2.1. Influena concentraiei substratului asupra procesului de biosintez

Celula microbiana, datorit volumului ei redus, este extrem de sensibil la variaiile locale ale parametrilor procesului de biosintez, n special la variaiile concentraiei de substrat. Mrirea concentraiei de substrat n mediul de cultur poate conduce la sporirea numrului de celule microbiene, dar numai pn la anumite limite, multiplicarea acestora fiind ncetinit de procese de inhibiie care au loc la nivelul celulei. Aciunea unui inhibitor asupra celulei microbiene se poate exercita prin: modificarea potenialului chimic al substratului, intermediarilor modificarea permeabilitii peretelui celular i reducerea metabolici sau a produsului finit; transportului substanelor nutritive; modificarea activitii enzimelor implicate n procesul metabolic; disocierea agregatelor metabolice; modificarea parametrilor funcionali ai celulei microbiene

(capacitatea de multiplicare, mobilitatea, biosintez unor metabolii). Mecanismele prin care se realizeaz inhibiia sunt: reacie chimic cu una sau mai multe componente celulare; adsorbia sau complexarea unor enzime sau coenzime; intervenia n secvene a reaciilor biochimice; intervenia n disocierea complexelor enzimatice; modificarea parametrilor fizico-chimici ai mediului de biosintez intervenia n funciile celulare de control.

(pH, trie ionic, constant dielctrica, capacitate de solvatare); Datorit acestor fenomene, concentraii mari de substrat inhib dezvoltarea microorganismelor ntr-un anumit grad ajungnd chiar la inhibiie

total. Din acest motiv, pentru un sistem de biosintez se stabilete concentraia optim a substratului att n momentul iniial ct i pe parcurs. De exemplu, pentru foarte multe bacterii, concentraia de 10-15% n surs de carbon (glucoza, zaharoz) este inhibitoare, ele dezvoltndu-se bine la valori ale sursei de carbon sub 10%. Acesta este motivul pentru care n soluii foarte concentrate de zahr (de exemplu dulceuri, siropuri) microorganismele, n general, nu se dezvolt, acestea putnd fi conservate pe o lung perioad de timp.

2.2. Influena dimensiunii inoculului

Calitatea i cantitatea inoculului joac un rol important pentru obinerea unor metabolii cu randamente dorite de biosintez. Cel mai adesea se utilizeaz o cantitate mare de inocul pentru a determina o declanare rapid a dezvoltrii culturii, concomitent cu reducerea riscului de contaminare. n majoritatea cazurilor este necesar ca inoculul s se situeze ntre 3 i 10% din volumul total al culturii. Pentru fiecare tehnologie n parte se stabilete aa-numitul raport optim de inoculare", care definete cantitile optime de inocul. Pentru asigurarea unei productiviti bune i pentru msurarea densitii inoculului, se extrag probe din cultura aflat ntr-un anumit stadiu de evoluie optim pentru obinerea unei producii maxime a metabolitului dorit i se determin parametrii specifici (numrul de germeni pe unitatea de volum, sau coninutul n biomas uscat raportat la unitatea de volum). Efectele determinate de cantitatea i vrsta inoculului sunt specifice pentru diferite microorganisme.

La bacterii, cnd se utilizeaz o cantitate mare de inocul, se micoreaz faza de lag. Aceasta se datoreaz formrii i acumulrii unor metabolii intermediari eseniali care pot difuza n celule i n mediul de cultur mai rapid dect n cazul utilizrii unui inocul mic. Uneori, ns, cantiti mari de inocul determin apariia unui fenomen de autoinhibiie, datorat sensibilitii celulelor bacteriene fa de unii produi metabolici intermediari. Cnd cantitatea de inocul este ns prea mic, faza de lag poate fi prelungit la infinit i aceasta nu poate conduce la o dezvoltare normal a culturii de microorganisme. S-a observat c n cazul bacteriilor, pentru iniierea dezvoltrii unui inocul, este necesar prezena n mediul de cultur a unei concentraii critice de metale grele. De exemplu, pentru un inocul de Bacillus subtilis este necesar prezena n mediul de cultur a unei concentraii minime de mangan, n vederea iniierii dezvoltrii. Aceste cercetri subliniaz importana ionilor metalelor grele pentru faza de lag la bacterii. Cantitatea de inocul la bacterii are influen mare asupra stadiilor ulterioare ale culturii, determinnd diferite stri fiziologice ale celulelor n funcie de care variaz capacitatea de biosintez a metabolitului dorit. n cazul Ierurilor, cantitatea de inocul poate influena, de asemenea, durata fazei de lag sau stadiile ulterioare de dezvoltare, similar cu cele descrise n cazul bacteriilor. In cazul fungilor, importana standardizrii inoculului vegetativ pentru acest grup de microorganisme este hotrtoare. Astfel, pentru obinerea unui ritm rapid de dezvoltare este necesar s se utilizeze un inocul sub form de suspensie de spori. De asemenea, poate s apar fenomenul de autoinhibiie sau autostimulare a germinrii sporilor, datorit prezenei unor substane produse n timpul germinrii sau n fazele ulterioare. Astfel c, n

cazul fungilor, cantitatea de inocul influeneaz mrimea i forma miceliului precum i randamentul n metabolii. Raportul de inoculare trebuie s fie stabilit astfel nct cantitatea de miceliu dezvoltat ulterior s nu fie prea mare n detrimentul secreiei metabolitului dorit. O dezvoltare abundent a masei miceliene conduce n acelai timp la un consum mare de surs de carbon, cultura fiind astfel ineficient.

2.3. Efectul temperaturii asupra creterii microorganismelor

Temperatura mediului n care are loc procesul de biosintez este un factor extrem de important pentru activitatea microorganismelor. Temperatura este un factor care acioneaz n mod direct asupra microorganismelor vii; diferena ntre temperatura mediului nconjurtor i cea din interiorul celulei trebuie s fie nul. Pentru un proces de biosintez industrial, temperatura poate fi considerat unul dintre parametrii fizici cei mai importani, care este implicat profund, prin efectele sale, n optimizarea procesului. Variaiile temperaturii au efect asupra randamentului de transformare a substratului n produsul dorit, asupra cerinelor nutritive ale microorganismului i compoziiei biomasei obinute precum i asupra vitezei de cretere microbian. n funcie de domeniul de temperatur n care microorganismele ating viteza maxim de cretere, acestea se clasific n: criofile, mezofile i termofile (fig. 2). Se observ c fiecare grup de microorganisme are un domeniu de cea 10C n care viteza de cretere este maxim. Microorganismele industriale sunt, n general, mezofile, astfel nct acest domeniu este plasat n intervalul 25...35C.

1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 Temperatur

Fig. 2. Influena temperaturii asupra creterii microorganismelor (Cooney, 1981). Efectul temperaturii asupra creterii microorganismelor se explic prin faptul c aceasta afecteaz multe procese metabolice din celul, precum i compoziia biomasei n proteine i lipide, coninutul n ARN al celulei. Este posibil ca structura lipidic a membranei celulare s se modifice continuu n funcie de variaiile de temperatur, astfel nct membrana s-i menin funcia reglatoare.

2.4. Efectul pH-ului asupra creterii microorganismelor

Valoarea pH-ului este, alturi de temperatur, un parametru important n procesele de biosintez. Influena valorii pH-ului asupra dezvoltrii culturilor microbiene se poate urmri n cteva direcii: n general, microorganismele au un domeniu optim de pH pentru dezvoltare, n care viteza specific de cretere atinge valoarea maxim. De exemplu, pentru anumite specii de drojdii domeniul optim de pH se situeaz ntre valorile 4 i 5. Exist ns i specii de drojdii care cresc la valori de pH n jur de 2 sau, dimpotriv, la valori ridicate ale pH-ului n jur de 8 (de exemplu, biosintez fenilalaninei cu o drojdie din genul Rhodotorida).

Cultivrile de microorganisme care decurg la valori ale pH-ului mai sczute (pH = 3-4) prezint avantajul unui risc mai sczut de contaminare, ceea ce este apreciat n mod deosebit n cazul unei cultivri industriale; efectul valoni pH-ului asupra randamentului de conversie a substratului la un anumit produs. Formarea produsului dorit n urma procesului de biosintez poate s fie legat de desfurarea bioprocesului ntrun domeniu foarte strict de pH. In timpul dezvoltrii unei culturi microbiene apar deviaii ale pH-ului de la valoarea considerat optim, care pot avea urmri nedorite asupra procesului de biosintez. Aceste modificri se pot datora fie consumrii unui nutrient (consumarea sursei de carbon sau consumarea sursei de azot), fie producerii unui acid organic de ctre microorganism. Pentru corectarea pH-ului la valoarea prescris se adaug diverse substane chimice (acizi sau baze) alese n funcie de mai muli factori; n cazul n care valoarea pH-ului este sub cea prescris, se pot folosi, pentru corecie, soluii de NaOH sau KOH n funcie de compoziia chimic a mediului i de necesarul n ionii de Na+ i K+ al microorganismului; n acelai scop este mult rspndit utilizarea amoniacului gazos sau soluie. n situaia n care valoarea pH-ului este peste cea prescris, se poate aduga acid clorhidric, acid sulfuric sau acid azotic, n funcie de caracteristicile microorganismului (ionul CI" s nu inhibe creterea), de compoziia chimic a mediului (adugarea de acid sulfuric ar putea conduce la formarea unor sruri greu solubile), precum i de materialul de construcie al vaselor de reacie i al bioreactoarelor (probleme de coroziune); prin efectul de disociere a acizilor i bazelor, pH-ul acioneaz asupra caracteristicilor suprafeei celulei, modificnd proprietile ei de aderare la diferite materiale (sticl, metale) precum i cele de floculare.

2.5. Concentraia de oxigen dizolvat

n culturile aerobe, este esenial s se realizeze dizolvarea n mediu a ntregii cantiti de oxigen necesare microorganismului n orice moment al

fermentaiei, prevzndu-se n general un oarecare exces fa de nevoi. De aceea, se urmrete n general obinerea unor aeraii ct mai eficiente, transferul de oxigen din faza gazoas n faza lichid (mediul de fermentaie) avnd loc cu viteze mari. In cazul n care procesul de biosintez se desfoar n laborator la flacoane agitate, aeraia depinde de urmtorii parametri: viteza de rotaie sau translaie a agitatorului; mrimea flacoanelor Erlenmeyer; volumul de mediu de cultur din flacon; creterea turbulenei prin icane.

Eficiena aerrii unui mediu de cultur este reflectat de concentraia de oxigen dizolvat. Exist mai multe metode de determinare a eficienei aeraiei : care intr. Pentru evaluarea cineticii transferului de 02 se utilizeaz de cele mai multe ori prima metod bazat pe oxidarea practic instantanee a sulfitului de sodiu catalizat de metale grele n prezena oxigenului dizolvat; n acest mod s-a stabilit ecuaia: v = KL x a ( C a - C L ) , n care: v este viteza de transfer a oxigenului prin filmul de lichid de la suprafaa bulei; KL - coeficient global de transfer; a - suprafaa interfacial metoda sulfit, care permite msurarea vitezei maxime de transfer a metoda polarografic de determinare a concentraiei oxigenului utilizarea electrodului cu membran pentru msurarea oxigenului din aer n mediu; dizolvat n mediu; concentraiei de O2 dizolvat i a consumului de 02; utilizarea analizorului paramagnetic de O2, care analizeaz compoziia aerului la ieirea din bioreactor i o compar cu compoziia celui

gaz - lichid; Ca - concentraia oxigenului la suprafa, egal cu valoarea de saturaie pentru sistemul aer - ep, la temperatura dat; CL - concentraia oxigenului n ap. Pentru sistemele intens aerate, valorile produsului KL a" sunt cuprinse ntre 70 i 400 mM 02 absorbit/l or. In cazul reactoarelor de biosintez, aerarea se aplic unui sistem deosebit de complex, coninnd numeroase substane dizolvate i avnd o concentraie ridicat de microorganisme suspendate. Alegerea parametrilor sistemului de aerare este determinat de necesitatea furnizrii unei cantiti de oxigen suficient pentru a asigura o valoare maxim a activitii metabolice n reactoarele de biosintez; n acest caz, un .anumit microorganism i un anumit mediu de cultur se caracterizeaz printr-o rat de utilizare a oxigenului specific. Pentru conducerea unui proces este esenial cunoaterea exact a modului de variaie n timp a necesarului de oxigen i a ratei consumului de oxigen. Rata consumului de oxigen sporete rapid pn la o valoare maxim nc din primele stadii ale procesului de biosintez, scznd apoi (fig. 4.3). Valoarea maxim a ratei de consum a oxigenului (Oi) coincide, de obicei, cu momentul atingerii concentraiilor ridicate de celule la microorganisme. Necesarul de oxigen al culturii este influenat de mediul de

Fig. 3. Modificarea concentraiei de 02, pH-ul i concentraia de biomas celular pentru Mycothecium verrucaria.

20

40 60 100 Timp

80

biosintez utilizat. De exemplu, datorit vitezei mari de utilizare a monozaharidelor fa de dizaharide, de ctre Penicillium, necesarul de oxigen este dublu la utilizarea glucozei ca surs de carbon fa de zaharoz.Ali factori care influeneaz transferul de 02 sunt : prezena n mediul de cultur a agenilor tensioactivi, care concentraia de microorganisme: la concentraii ridicate de determin o micorare a coeficienilor de transfer; microorganisme, vscozitatea mediului crete, iar eficiena sistemului de aerare scade, bulele tinznd s circule prin canale prefereniale, cu rezisten redus la naintare; sistemul de agitare al bioreactorului, care influeneaz sensibil concentraia oxigenului dizolvat, o agitare eficient a mediului de cultur conducnd la o dispersie corespunztoare a bulelor de aer i, deci, la mrirea coeficientului de transfer al oxigenului; echipamentul de aerare utilizat, care permite obinerea unei dispersii uniforme a bulelor de aer: conductele perforate constituie echipamentul preferat pentru reactoarele de biosintez, de volum mare; suprapresiunea, care favorizeaz mrirea concentraiei de oxigen n mediul de cultur, n general procesele biotehnologice fiind conduse la supra-presiuni cuprinse ntre 0,5 i 1 bar (n scopul micorrii riscului de infecie).