LABORATORIO DE BIOLOGA MOLECULAR

20 de Octubre de 2009

TRANSFORMACIN GENTICA DE E. coli POR INSERCIN DEL PLSMIDO PGLO E IDENTIFICACIN DE LAS NUEVAS CARACTERSTICAS DEL MICROORGANISMO Universidad Francisco de Paula Santander, Ingeniera Biotecnolgica, Adriana Bautista.

RESUMEN
En esta prctica se realiz un procedimiento para transformar bacterias con un gen que codifica la protena fluorescente (GFP). Tras el procedimiento de transformacin, las bacterias pueden expresar sus genes producir la protena fluorescente y generar un color verde brillante bajo luz ultravioleta, a la vez generar resistencia al antibitico ampicilina. El objetivo era mover genes de un organismo a otro con la ayuda de un plsmido permitiendo a las bacterias adaptarse a nuevos ambientes. El plsmido pGLO y el microorganismo a modificar E. coli se rehidrataron por medio de un choque trmico (caliente fro) y se utilizaron cuatro cajas de petri que contenan el medio Luria Bertani para crecimiento de microorganismos modificados genticamente. Dos cajas utilizadas como control sin el plsmido y con el microorganismo y las otras dos cajas, una con ampicilina y otra con ampicilina y arabinosa. Los resultados que se deben obtener para la seleccin de las clulas que han sido transformadas con ADN pGLO es generar el crecimiento en las placas de los antibiticos. Las clulas transformadas aparecen de color blanco (fenotipo de tipo salvaje) en cajas que no contengan arabinosa, y verde fluorescente cuando arabinosa est incluida en el medio de Agar nutriente. Para los medios LB con arabinosa y ampicilina y con ampicilina solamente no se report crecimiento debido a posibles fallas en la hidratacin del plsmido, para los controles hubo crecimiento del microorganismo solamente en una caja. INTRODUCCION Los mtodos de transformacin para las construcciones genticas son relativamente ms simples e incluyen los genes de inters y de seleccin con sus secuencias regulatorias respectivas. El ADN para ser clonado es incluido en plsmidos que son transferidos completos durante el bombardeo a las clulas, o bien de forma de molcula lineal (el plsmido cortado en un punto). Tambin es muy comn que una vez obtenida la construccin gentica dentro de un plsmido (en el cual se clona y se obtienen muchas copias para trabajar), luego se extrae el fragmento del mismo para slo tener la secuencia con los genes de inters y de seleccin (incluidas las secuencias regulatorias) y as reducir el fragmento de ADN a transferir. La Transformacin gentica literalmente significa un cambio causado por los genes, e implica la insercin de un gen en un organismo para cambiar un rasgo en particular, Recordemos que un gen es un fragmento de ADN que proporciona las instrucciones para hacer (cdigos) protenas. En esta prctica se llevar a cabo un procedimiento de transformacin gentica. Actualmente la transformacin gentica se utiliza en muchas reas de la biotecnologa. En la agricultura, los genes que codifican rasgos tales como heladas, plagas, o de descomposicin pueden ser transformados y causar resistencia gentica en las plantas. En la biorremediacin, las bacterias pueden ser transformadas genticamente con genes que les permiten digerir los derrames de petrleo. En medicina, las enfermedades causadas por genes defectuosos estn empezando a ser tratados con terapia gnica, es decir, por la transformacin gentica de las clulas de una persona enferma con copias sanas del gen defectuoso que causa la enfermedad.

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MARCO TERICO pGLO es un plsmido usado en biotecnologa como vector. Se utiliza como marcador de seres modificados genticamente. Como todo plasmido, pGLO tiene una estructura circular en la que se expresan diversos genes. Entre ellos encontramos la -Lactamasa, que proporciona resistencia al antibiotico Ampicilina. Tambin aparece el gen de la Arabinosa. Sin embargo, el gen ms importante, y por el cual pGLO se usa como marcador, es el gen de GFP: Green Fluorescence Protein. GFP proporciona al ser transgnico fluorescencia al exponerlo a luz Ultravioleta. La protena verde Fluorescente fue aislada de la medusa Aequorea victoria. Para que se produzca fluorescencia es necesario que el medio de cultivo contenga Arabinosa. Los plasmidos pGLO nicos de BioRad contienen adems un gene de resistencia al

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antibitico ampicilina (amp). El pGLO tambin incorpora un sistema especial de regulacin gentica. Este sistema puede ser usado para el control de la expresin de la protena fluorescente en clulas transformadas. El gene para GFP puede ser activado o prendido en clulas transformadas al aadir el azcar arabinosa al medio de cultivo donde crecen las clulas. Luego de realizar la transformacin se crecen las clulas en medio LB y en presencia de ampicilina. La ampicilina evita que bacterias no transformadas crezcan en el plato de cultivo. Las colonias de clulas transformadas aparecen de color blanco en los platos que contienen medio LB y ampicilina. Para inducir la expresin del gene de GFP tenemos que crecer las bacterias en presencia de arabinosa. Las bacterias crecidas en LB con arabinosa y con ampicilina se vern fluorescentes de color verde en lugar de blancas.

METODOLOGA 1. Preparacin de los medios Adicionar 500 mL de agua destilada en un erlenmeyer de 1L. adicionar todo el contenido del paquete de agar nutritivo LB. Agitar el erlenmeyer para ayudar a disolver y calentar en la plancha hasta que el agar se disuelva. Dejar enfriar un poco el medio. Mientras tanto, etiquetar las cajas de petri y preparar la ampicilina y la arabinosa.

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2. Preparar la arabinosa y la ampicilina La arabinosa se encuentra en un pequeo vial. Con una pipeta estril, adicionar 3 mL de solucin transformadora directamente al vial para rehidratar el azcar. Mezclar el vial con un vrtex. La ampicilina se rehidrata tambin aadiendo 3 mL de solucin transformadora. El calor debe estar entre 5 y 27 C, de otra forma el agar se solidifica. 3. MARCADO DE LAS CAJAS Las cajas se marcan de la siguiente manera: 1 caja LB LB/AMP LB/ARA/AMP 4 SERVIR LOS MEDIOS: Primero, se sirve el medio LB preparado en algunas cajas de petri. Luego de esto se adiciona ampicilina al medio restante y se sirve el medio LB+AMP en cajas. Finalmente se adiciona arabinosa al medio y se sirven las restantes cajas de petri. Se dejan durante dos das a temperatura ambiente y envueltas en envoplast. Luego de esto los medios se refrigeran hasta su posterior uso.

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2. Luego de esto, usando un asa estril se toma una colonia de la caja inicial de E. Coli y se lleva hasta el tubo pGLO (+). Se agita un poco hasta que la colonia quede dispersa en la solucin transformadora. Se realiza el mismo procedimiento con otra asa estril en el tubo pGLO (-).

METODOLOGA TRANSFORMACIN 1. Marcar dos microtubos: uno con pGLO (-) y otro con pGLO (+). Con una pipeta estril, adicionar a cada tubo 250 microlitros de la solucin transformadora (CaCl2). Poner los tubos en hielo

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5. Etiquetar las cajas de la siguiente manera: pGLO (+)

3. Con otra asa estril, adicionar el plsmido al tubo pGLO (+) pGLO (-)

6. Choque trmico: Transferir los dos tubos a bao mara a 42C por 50 segundos. Seguidamente llevar al hielo durante dos minutos.

4. Incubar los tubos en hielo durante 10 min asegurando que los tubos estn en contacto con el hielo.

7. Remover los tubos del hielo y con una pipeta estril adicionar 250 microlitros de

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caldo nutritivo LB a cada uno. Luego incubar a temperatura ambiente durante 10 min. 8. Cerrar los tubos y agitar. Luego de esto, con una pipeta estril para cada tubo se toman 100 microlitros y se siembran en los respectivos medios.

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9. Extender las suspensiones celulares con un asa en cada caja. Cambiar de asa cada vez que se vaya a realizar el extendido en las cajas. 10. Envolver las cajas y marcarlas con los respectivos nombres. Llevar a incubacin a 37C hasta el da siguiente. RESULTADOS No se observ crecimiento del microorganismo en ninguna de las cajas pGLO (+), ni en la caja que contena LB + AMP, ni en la caja que contena LB + AMP+ARA. En las placas control los resultados fueron los esperados. Se observ crecimiento abundante en medio LB y no hubo crecimiento en la caja con LB+AMP.

pGLO (+)

LB+AMP

LB+AMP +ARA

pGLO (-)

LB

LB+AMP

LABORATORIO DE BIOLOGA MOLECULAR DISCUSIN DE RESULTADOS

Esta prctica tuvo en cuenta el manual de transformacin bacteriana pGLO de BIO RAD. Para la insercin del plsmido se utiliz una colonia de E.coli liofilizada, se rehidrat y se insert un plsmido que tambin vena liofilizado; la activacin e insercin del plsmido, fue realizado en dos prcticas por 3 grupos de laboratorio, la caracterstica fundamental es que el plsmido confiere brillo a la bacteria en presencia de arabinosa y a la vez genera resistencia a la ampicilina. El procedimiento se repiti debido a contaminacin, se realiz la siembra de la bacteria con el plsmido en dos medios: uno con ampicilina y otro con ampicilina y arabinosa, se sembraron otras dos cajas control con E. coli a las cuales no se adicion el plsmido, una caja con LB y otra con LB y ampicilina. Al obtener los resultados no se observ crecimiento posiblemente debido a la inactivacin del plsmido. Las posibles causas por las cuales no se activ el plsmido posiblemente se deben a errores en el procedimiento, manipulacin en la hidratacin del plsmido liofilizado, o en el choque trmico de las partculas, tambin pudo haber fallas en la manipulacin del kit, descartamos que el medio LB pudiera estar contaminado ya que es un medio slido nutritivo utilizado para crecimiento de microorganismos modificado genticamente o fallas en el aislamiento de la bacteria, solamente hubo crecimiento de E. coli en una caja control con LB lo que significa que la bacteria no insert el plsmido.

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BIBLIOGRAFA
Transformacin bacteriana. Disponible en http://bc.inter.edu/facultad/amlugo/ LAB%20DESTREZAS%20III/TRANSFOR MACIN%20%20%20BACTERIANA.ht m pGLO.2007. Disponible en http://www.worldlingo.com/ma/en wiki/es/pGLO pGLO TRANSFORMATION. Disponible en http://www.ebbep.org/docs/pglo/pg lostudent.pdf Genetic transformation of bacteria with the gene for green fluorescent protein (gfp). Disponible en http://www.westminster.edu/acad/s im/pdf/SpGLOTransformation.pdf

LABORATORIO DE BIOLOGA MOLECULAR PREGUNTAS

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1. Para transformar genticamente un organismo completamente, se debe insertar el nuevo gen en cada clula del organismo. Cul organismo est mejor adaptado para una trasformacin gentica total: uno compuesto de muchas clulas o un organismo unicelular? Rta: El mejor organismo sera el unicelular, ya que slo se debe insertar el nuevo gen en una clula, facilitando el trabajo del investigador. 2. los cientficos frecuentemente desean conocer si el organismo genticamente transformado puede pasar sus nuevos rasgos a las futuras generaciones. Para conseguir esta informacin, quin sera un mejor candidato para la investigacin: un organismo en el que cada generacin crece y se reproduce rpidamente, o uno que lo hace ms lentamente? Rta: El mejor candidato sera un microorganismo que se reproduzca rpidamente, para as ser ms fcil y rpido observar si las siguientes generaciones adquirieron la nueva caracterstica. 3. La seguridad es otra consideracin importante escoger un organismo para experimentos. Qu caractersticas debe tener o no tener un organismo para asegurar que no produce dao a los investigadores o al ambiente? Rta:El organismo con el que se desee trabajar no debe producir toxinas u otros componentes dainos al ser humano o a la naturaleza. El organismo debe crecer exponencialmente en condiciones de laboratorio, pero no debe sobrevivir fuera de este. Adems no debe ser capaz de infectar plantas o nimales. 4. Basado en pregunta anterior, quin debe ser la mejor eleccin para una transformacin gentica: una bacteria, una lombriz de tierra, un pez o un ratn? Rta: La mejor eleccin sera la bacteria, debido a que son organismos unicelulares que se reproducen rpidamente.

LABORATORIO DE BIOLOGA MOLECULAR PREGUNTAS DE CONSIDERACIN

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1. El objetivo de la transformacin gentica es cambiar los rasgos caractersticas de un organismo (fenotipo) antes de que cualquier cambio en el fenotipo pueda ser detectado se debe realizar un examen exhaustivo de su usual fenotipo. Observe las colonias de E. coli en el cultivo inicial y describa sus caractersticas. Rta: Crecimiento abundante, colonias de color crema, incontables. 2. Describa cmo podra usar dos cajas de agar nutritivo, E. coli y ampicilina para determinar cmo las clulas de E. coli son afectadas por la ampicilina. Rta: Se realiza la siembra de E. coli en los dos platos: uno que slo contenga agar nutritivo y otro que contenga agar nutritivo mas la ampicilina. Lo que se realizar ser la comparacin de los crecimientos. Si la ampicilina afecta negativamente a la bacteria, sta no crecer o crecer muy poco- en el medio con ampicilina. Si la ampicilina no tiene efecto en la bacteria, se observar un buen crecimiento en las dos cajas. 3. Qu resultado esperara que indicara su experimento sobre el efecto de la ampicilina en clulas de E. coli? Rta: Debido a que la ampicilina es un antibitico, el resultado que se esperara sera que ste matara a la bacteria. Si hay crecimiento del microorganismo quiere decir que ste es resistente a la ampicilina. LECCIN DOS: PREGUNTAS DE REPASO 1. En qu cajas esperara encontrar colonias parecidas al crecimiento original (sin transformar) de E. coli? Rta: Esperara encontrar ese crecimiento en la caja de LB en la que se sembr el microorganismo sin el plsmido pGLO. 2. Si hubieran algunas clulas transformadas de la bacteria, en qu caja se encontraran? Rta: Se encontraran en dos cajas: en la que tiene medio LB con ampicilina, o en la que contiene LB, ampicilina y arabinosa. Esto se debe a que el plsmido se insert con xito y le confiri resistencia a la ampicilina a la bacteria.

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3. Qu cajas se deberan comparar para determinar si ocurri la transformacin gentica? Rta: Las cajas que se deben comparar son las de los dos crecimientos (E. coli sin el plsmido y E. coli con el plsmido) en el medio LB con ampicilina. Las clulas que no fueron trasformadas no deben crecer en medio LB con ampicilina, mientras que las clulas en las que se insert el plsmido deberan crecer en el medio con ampicilina ya que ste les confiere resistencia al antibitico. 4. Qu significa caja control? Para qu sirve? Rta: Una caja control ayuda al momento de interpretar los resultados. Por ejemplo, en este caso, las cajas control seran las sembradas con la bacteria E. coli sin transformar, es decir, pGLO negativas. stas nos sirven al momento de leer las cajas sembradas con el microorganismo transformado, as se comparan las cajas positiva y negativa del microorganismo en medio LB con ampicilina. Sin las cajas control no se podra observar la diferencia entre las clulas que insertaron el plsmido y las clulas que no. LECCIN TRES: RECOLECCIN DE DATOS Y ANLISIS 1. Observar y dibujar lo que se ve en cada una de las cuatro cajas. 2. Cunto crecimiento de la bacteria se observa en cada caja? No se observ ningn crecimiento en las cajas de LB con ampicilina y LB con ampicilina y arabinosa. La nica caja en la que creci E. coli fue en la de LB negativo, es decir, en la que no se insert el plsmido. 3. De qu color es la bacteria? Rta: En la caja en que creci la bacteria se observaron colonias color crema, lo que se espera normalmente pues es E. coli sin transformar. NOTA: De aqu en adelante no es posible seguir respondiendo las preguntas debido a que no se pudo observar ningn crecimiento en las cajas que contenan los medios en los que se llevaron a cabo las pruebas de laboratorio.