Anlisis Microbiolgico del agua

- Anlisis microbiolgico del agua -

Pgina Parmetros biolgicos del agua. 2 Determinacin de microorganismos aerobios mesfilos....... 4 Determinacin de Coliformes Totales y Fecales ....... 5 Determinacin de Estreptococos Fecales...12 Determinacin de Clostridios Sulfito Reductores...15 Conclusiones del anlisis...17

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Anlisis Microbiolgico del agua Parmetros biolgicos del agua:

El agua es un recurso natural necesario para el desarrollo de un gran nmero de actividades humanas. Su creciente degradacin por disminucin de su calidad implica la reduccin del nmero de usos que se le da; es por ello, lo que se hace necesario la realizacin de estudios que permitan determinar la calidad de ese agua. Los anlisis que se pueden realizar al agua para controlar su calidad son: fsicos, qumicos y microbiolgicos, en esta ocasin se har una determinacin microbiolgica. Todos los organismos que se encuentran en el agua son importantes en el momento de establecer el control de la calidad de la misma sin considerar si tienen su medio natural de vida en el agua o pertenecen a poblaciones transitorias introducidas por el ser humano; si su crecimiento lo propician los nutrientes presentes en el escurrimiento natural y en aguas residuales municipales o lo frenan los venenos procedentes de la actividad agrcola o industrial; y si tienen capacidad para intoxicar a las personas y a los animales superiores. Se debe conocer la forma de los patgenos hdricos y determinar su presencia y origen, la magnitud y oscilacin de su nmero, el curso de su ciclo vital y el ndice de su supervivencia. Los parmetros biolgicos en las aguas potables son de mucho inters, los microorganismos que puede haber en el agua son virus, bacterias, hongos, algas y protozoos. Aquellos que son inocuos para el hombre no tienen significacin sanitaria, por lo que el control microbiolgico del agua se va a centrar en las especies patgenas para el hombre. Dado que buscar todo tipo de microorganismos patgenos, por su diversidad, es costoso y complicado y como la relacin patgenos/no patgenos es muy pequea, se realiza un control del agua a travs de indicadores microbiolgicos de contaminacin. Hay muchos seres vivos que se emplean como indicadores de la calidad de un agua. As, segn predominen unos organismos u otros, podremos saber el estado de un agua. Para que un microorganismo sea considerado como indicador microbiolgico ha de reunir unas condiciones que son:

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Debe ser incapaz de desarrollarse en el agua. Debe tener una supervivencia en el agua superior a los organismos patgenos. Debe soportar mejor a los desinfectantes. Deben ser fciles de aislar, identificar y contar. Deben ser muy abundantes en heces y escasos en otros medios.

La normativa recoge una serie de anlisis microbiolgicos segn se efecte sobre el agua un anlisis mnimo: Coliformes Totales y Fecales; uno normal: los anteriores ms: bacterias aerobias a 37 C, Estreptococos Fecales y Clostridios Sulfito-Reductores; o completo: los anteriores ms aerobias a 22 C, microoganismos parsitos y/o patgenos; el anlisis realizado ha sido el normal.

El agua problema procede de un manantial, vamos a realizar un anlisis microbiolgico normal y el objetivo va a ser determinar la contaminacin microbiolgica que puede existir, buscar las causas de esa contaminacin y proponer soluciones al problema.

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Anlisis Microbiolgico del agua Determinacin de microorganismos aerobios mesfilos:

Se determinarn estos microorganismos que son los que se encuentran a temperatura ambiente en el agua.

Procedimiento:
El mtodo consiste en filtrar a vaco una determinada cantidad de agua que va a ser de 100 mL sobre una membrana filtrante estril depositada con la cuadrcula hacia arriba. Una vez filtrada el agua, se retira la membrana y se deposita con pinzas estriles sobre una placa Petri con medio P.C.A., se incuba 37 C horas. Tras la incubacin se realiza un recuento de las colonias aparecidas, expresndose el resultado en u.f.c. en 100 mL. 24 -48

Resultados obtenidos: recuento de colonias:

Al transcurrir el perodo de incubacin establecido se saca la placa de Petri de la estufa y se recuentan las colonias crecidas. El nmero de colonias aparecidas es 270 u.f.c. por cada 100 mL de agua problema.

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Anlisis Microbiolgico del agua Determinacin de Coliformes Totales y Fecales:

Los Coliformes Fecales son un subgrupo de los Coliformes totales, capaz de fermentar la lactosa a 44 C en vez de 37 C como lo hacen los totales. Aproximadamente el 95% del grupo de los Coliformes presentes en heces estn formados por Escherichia Coli y ciertas especies de Klebsiella. Ya que los Coliformes Fecales se encuentran casi exclusivamente en las heces de los animales de sangre caliente, se considera que reflejan mejor la presencia de contaminacin fecal. stos ltimos se denominan termotolerantes por su capacidad de soportar temperaturas ms elevadas. Esta es la caracterstica que diferencia a Coliformes Totales y Fecales. La capacidad de los Coliformes fecales de reproducirse fuera del intestino de los animales homeotrmicos es favorecida por la existencia de condiciones adecuadas de materia orgnica, pH, humedad Desde hace mucho tiempo se han utilizado como indicador ideal de contaminacin fecal. Su presencia se interpreta como una indicacin de que los organismos patgenos pueden estar presentes y su ausencia indica que el agua se halla exenta de organismos productores de enfermedades.

Procedimiento:
Vamos a seguir el mismo mtodo para la determinacin de los dos tipos de Coliformes, lo nico que variar ser la temperatura de incubacin de cada determinacin, que para los Coliformes Totales ser de 37 C y para los fecales ha de ser de 44 C.

Prueba presuntiva:
Para determinar estos Coliformes se va a utilizar el medio de cultivo BGBB (dispuesto en tubo), que es un medio selectivo y de enriquecimiento ya que inhibe el crecimiento de microorganismos distintos de los del grupo de los Coliformes a la vez que permite que stos crezcan sin restriccin, se distribuye el medio en nueve tubos (tres series de tres tubos) con diez mililitros cada uno de medio de cultivo y echando 10 ml de el agua a la primera serie de tubos, 1 ml de agua a la segunda serie, y 0,1 ml a la tercera. Colocaremos en cada tubo

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una campana Durham para recoger el gas producido y al medio de cultivo se le habr aadido un indicador cido-base. Estos tubos se incuban a la temperatura correspondiente segn se trate de Coliformes Totales Fecales durante 24 horas. Los Coliformes son lactosa positiva, es decir, son capaces de fermentar a la con produccin de cido y gas, estos signos sern los que buscaremos. La reaccin ser positiva cuando se produce desprendimiento de gas en la campana Durham por lo menos en un 10% de su capacidad, y el medio vira a color amarillo debido a formacin de cido. Una reaccin positiva por dbil que sea, indicar la presencia y

coliformes y habr que hacer las pruebas confirmativas de IMViC. Se aplicar la tcnica del nmero ms probable (NMP).

Prueba confirmativa: siembra en EMB Levine:

En los tubos donde se introdujo 0,1 ml de agua problema, o resultados positivos en la prueba presuntiva ,se introduce un asa de siembra estril y se toma una porcin que va a sembrarse en estra en una placa Petri con medio EMB Levine. El EMB Levine contiene eosina y azul de metileno que inhiben parcialmente el crecimiento de los microorganismos Gram negativos, adems la combinacin de azul de metileno y eosina permitirn diferenciar microorganismos lactosa positiva de los negativos. Se incuban los tubos 24 - 48 horas a la temperatura correspondiente segn se trate de Coliformes Totales Fecales. Los Coliformes apareceran como violetas oscuros y si hubiera microorganismos lactosa negativos apareceran como colonias incoloras.

Pruebas IMViC:
Las bacterias pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae, pueden identificarse a travs de una serie de pruebas bioqumicas, que permiten determinar la presencia o ausencia de ciertas enzimas y a veces incluso permiten determinar la existencia de una secuencia metablica. Con este fin se han desarrollado diversos esquemas de clasificacin, uno de los ms

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conocidos y utilizados corresponde al IMViC que se desarroll para clasificar especies de la familia antes mencionada y correspondientes al grupo de bacterias coliformes (bacterias aerbicas o anaerbicas facultativas, Gram negativos, bacilares, no esporgenas que producen cido y gas durante la fermentacin de la lactosa). Consiste en las siguientes pruebas: Indol:

El triptfano, aminocido suministrado por una peptona adecuada, se descompone en indol por accin de algunos microorganismos. La prctica va a consistir en observar si el microorganismo es capaz de producir indol cuando est en presencia de agua de peptona. El indol producido es detectado por indol de kovacs que produce una coloracin al reaccionar con l. Se coge con un asa de siembra, colonias de la placas de EMB y se siembra en un tubo con agua de peptona. Se incuba horas a la temperatura correspondiente segn se trate de Coliformes Totales Fecales, 24-48 horas, pasado el tiempo de incubacin se sacan los tubos de la estufa y se les aade 1 mL de reactivo indol de Kovacs y se deja reposar. Si aparece una coloracin roja indica que la prueba es positiva, el microorganismo produce indol. Rojo de metilo:

Esta es una prueba cualitativa de la acidez producida por el crecimiento de una bacteria en agua de peptona glucosa con tampn fosfato. Debido a la acidez producida, el medio virar de amarillo a rojo considerando la prueba positiva al aadir un reactivo. El procedimiento es el mismo que el del indol, con la diferncia que, en vez de aadir indol de kovacs, aadimos Rojo de Metilo.

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Voges Proskauer:

Algunas bacterias producen acatilmetilcarbimol (producto intermedio en la degradacin de la glucosa de los hidratos de carbono), que en presencia de KOH y aire, se oxida para dar diacetilo, que reacciona con -naftol y un producto de descomposicin de la arginina de la peptona, para producir un color rojo. En un tubo con agua de peptona y glucosa se siembran colonias aparecidas en las placas EMB Levine. Se incuba a 37 44 C 24-48 horas, luego se aade 1 mL de reactivo de Voges Proskauer,que contiene -naftol y KOH, se aade seis gotas de reactivo omehara y dos de reactivo de Barry, se agita, se deja reposar 10-15 minutos y si aparece una coloracin roja la prueba es positiva. Citrato:

Esta prueba determina la capacidad que presenta el microorganismo problema para utilizar el citrato como nica fuente de carbono. En un tubo con agar inclinado con Citrato de Simmons, se siembra una colonia de las aparecidas en EMB en picadura y estra. Si aparece crecimiento en el slam y si el medio vira de verde a azul (debido a la produccin de amonaco que lo alcaliniza), el microorganismo es citrato positivo.

Tincin de Gram:
La coloracin de Gram tiene fundamental importancia en la

diferenciacin morfolgica y taxonmica de las bacterias. Las bacterias se clasifican en dos grandes grupos segn retengan o no el colorante de base usado en la tincin, que es el violeta de genciana o el cristal violeta:

Las bacterias Gram positivas aparecen con el citoplasma teido

uniformemente de color azul o violeta.

Las bacterias Gram negativas se tien de rojo por el colorante

usado como contrastador, fuchina, safranina.

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La diferencia entre unas y otras radica en la composicin qumica de la pared celular y su permeabilidad. La pared de las Gram negativas es ms delgada y presenta un contenido en lpidos, grasas, diez veces superior que el de las Gram positivas, lo cual dificulta la tincin y la retencin del colorante en el citoplasma. Tomamos una colonia de las aparecidas en EMB Levine y realizamos una tincin diferencial, a continuacin observamos con el microscopio.

Resultado de la determinacin:
Se han obtenido idnticos resultados tanto en la determinacin de coliformes totales como fecales y stos han sido:

Prueba presuntiva:
En los tubos ha aparecido un viraje del color del medio de cultivo de violeta a amarillo debido a la produccin de cido y en la campana Durhan puede apreciarse con bastante gas en su interior. Los resultados son positivos en 2 de los 3 primeros tubos,2 de los 3 sundos y 1 de los 3 ltimos (viraje del medio y gas); con estos datos vamos a las tablas del nmero ms probable (NMP) y tenemos: Ms de 20 u.f.c. por cada mL de agua problema. Como sta prueba ha sido positiva, realizaremos las pruebas confirmativas, de haber resultado negativas las primeras, daramos por terminado el anlisis.

Prueba confirmativa: siembra en EMB Levine:

Tras la incubacin han aparecido colonias de color violeta, tal y como se esperaba. Se pasa a las pruebas de IMViC para determinar el microorganismo existente.

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Pruebas IMViC:
- Indol: Aparece un anillo rojo bordeando al tubo: Indol positivo:el microorganismo produce indol. En la figura aparecen de izquierda a derecha: tubo sin inoculacin de bacterias, resultado negativo y resultado positivo a la derecha. - Rojo de Metilo: Tras la incubacin de cuatro das, se aade el reactivo y el tubo se colorea de rojo: Rojo de metilo positivo; el microorganismo produce acidez en su crecimiento. En la figura aparecen de izquierda a derecha: tubo sin inoculacin de bacterias, resultado negativo y resultado positivo a la derecha. - Voges-Proskauer: El microorganismo no produce acetilcarbimol al aadirle el reactivo que se detecta con la aparicin del color rojo, en este caso el resultado es negativo, (tubo del medio). En la figura aparecen de izquierda a derecha: tubo sin inoculacin de bacterias, resultado negativo y resultado positivo a la derecha.

- Citrato: Tras la incubacin se observa que el microorganismo no ha crecido en el slam del tubo (tubo del centro) y el medio no ha virado de color, por lo que no es capaz de obtener su fuente de carbono del citrato.

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El viraje del color del medio se debera a una produccin de amonaco que alcalinizara el medio y se habra detectado este aumento de pH con el viraje del color del indicador que incorpora el medio de cultivo. En la figura aparecen de izquierda a derecha: tubo sin inoculacin de bacterias, resultado negativo y resultado positivo a la derecha. El resultado de las pruebas IMViC son: ++--; con esta combinacin vamos a una tabla y como resultado tenemos que el microorganismo presente en nuestro agua es la Escherichia Coli.

Escherichia Coli

I +

M +

VI -

C -

Tincin de Gram:
Con esta prueba, hemos observado bacterias bacilares Gram negativas con lo que podemos confirmar la presencia de Escherichia Coli que responde a estas caractersticas y es el mayor indicador de contaminacin fecal en el agua.

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Anlisis Microbiolgico del agua Determinacin de Streptococcus Fecales:

Los Streptococcus Fecales son bacterias anaerbias o aerbias facultativas, conocidas como bacterias del cido lctico, integrantes de la flora normal de los animales homeotrmicos. Actualmente se considera que pertenecen al gnero Enterococcus . Todos los Enterococos presentan alta tolerancia a condiciones ambientales adversas altas o bajas temperaturas, deshidratacin, salinidad, luz solar), por lo que se suelen emplear para determinar la contaminacin fecal en aguas de bao martimas, pues son las que mejor soportan esas condiciones de salinidad. Los Streptococcus son abundantes en heces de animales, por lo que son muy utilizadas en zonas donde sea abundante la cra de ganado. Nuestra muestra de agua problema est tomada en este ambiente por lo que es importante realizar esta prueba.

Procedimiento: Prueba presuntiva:

Para determinar los Streptococcus Fecales se va a utilizar el medio de cultivo KAA caldo (Canamicina-Esculina-Azida), que es un caldo de enriquecimiento para Streptococcus D de Lancefield. En ese medio de cultivo el sulfato de Canamicina y la Azida sdica inhiben el crecimiento de la flora acompaante, mientras que los Streptococcus crecen sin restriccin. A su vez los Streptococcus hidrolizan la Esculina produciendo glucosa y esculetina la cul reacciona con el NH4+ que lleva el medio y Fe+3 para dar un complejo verde negruzco. Vamos a sembrar en dos tubos con nueve mL de KAA 1 mL de muestra problema y lo incubamos 24 horas a 37 C. Si aparece ennegrecimiento, la prueba presuntiva es positiva y se pasar a las confirmativas.

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Prueba confirmativa: Siembra en KAA Agar:

De los tubos positivos de las pruebas presuntivas se hace una siembra en estra mltiple en placas KAA Agar, las que se incuban a 37 C 24-48 horas. Si pasado el periodo de incubacin aparecen colonias rodeadas de halos negros debido a la hidrlisis de la esculina confirmaremos la presencia de Streptococcus Fecales.

Otras pruebas confirmativas:

- Tincin de Gram: En el caso de la presencia de Streptococcus Fecales se observarn cocos Gram positivos. - Crecimiento de colonias crecidas en KAA agar en caldo de cultivo BHI: Se trata del caldo Cerebro-corazn que tiene la caracterstica que contiene una concentracin en NaCl de 6,5%. Los Streptococcus crecen en medios con elevada concentracin en sales minerales, es por lo que son ndice de contaminacin fecal en agua marina, como ya se ha comentado anteriormente. - Prueba de la catalasa: Consiste en observar si un microorganismo es capaz de descomponer el agua oxigenada (H2O2) produciendo agua (H2O) y oxgeno (O2). Los Streptococcus Fecales son catalasa negativos luego no metabolizan el H2O2 y no se produce burbujeo debido al desprendimiento de oxgeno lo que nos indicara que se ha reaccin se ha producido. Para realizar esta prueba se efectuar un frots con las colonias aparecidas en el caldo BHI con Streptococcus, en un portaobjetos y nunca con colonias de medios que contengan Azida sdica. Una vez fijada la extensin se aade H2O2, si aparece un burbujeo, la prueba de la catalasa ser positiva.

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Resultado de la determinacin: Prueba presuntiva:

Aparece un ennegrecimiento en el tubo, la prueba es positiva. Los Streptococcus han hidrolizado la esculina produciendo glucosa y esculetina, la cul reaccionan con el NH4+ que lleva y Fe+3 para dar un complejo verde negruzco.

Prueba confirmativa: Siembra en KAA Agar:

La prueba resulta positiva: Aparecen colonias rodeadas de halos negros debido a la hidrlisis de la esculina por ello confirmaremos la presencia de Streptococcus Fecales.

Otras pruebas confirmativas:

- Tincin de Gram: Se observan cocos Gram positivos que teido uniformemente de color azul o violeta. - Crecimiento de colonias crecidas en KAA agar en caldo de cultivo BHI: La prueba es positiva, aparece en el medio de cultivo, los Streptococcus han crecido en este medio rico en NaCl. - Prueba de la catalasa: La prueba ha resultado negativa, es decir, los Streptococcus no tienen la enzima catalasa que consigue metabolizar el H2O2 a H2O y O2. aparecen con el citoplasma

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Anlisis Microbiolgico del agua Determinacin de Clostridios Sulfito Reductores:

Los Clostridios son un gnero de bacterias que se caracterizan por producir esporas terminales que deforman los bacilos. Son anaerobias y Gram positivos. Estos microorganismos son importantes por los daos que pueden provocar en las personas y por los beneficios econmicos que reportan. Los gneros pertenecientes al gnero Clostridium tienen la caracterstica comn de poder reducir el sulfito a sulfuro, los Clostridios sulfito reductores se usan en ocasiones como ndice de contaminacin fecal, sobretodo para apreciar la calidad higinico-sanitaria del agua y productos animales de origen animal. Este tipo de microorganismos pueden esporas, lo que les confiere una gran resistencia. La deteccin se basa en el crecimiento de este tipo de bacterias en medios que contienen Na2SO3 y en su capacidad para reducicirlo a sulfuro, dando lugar, en presencia de hierro, sulfuro de hierro que es de negro, con lo que la aparicin de este color nos indica que existen Clostridios Sulfito reductores. La deteccin y recuento de Clostridios Sulfito reductores se puede hacer de dos formas: Investigando la presencia de formas de vida vegetativas y esporuladas conjuntamente. Investigando la presencia de formas esporuladas.

Se va a determinar la presencia de formas de vida vegetativas y esporuladas conjuntamente.

Procedimiento: Determinacin de formas esporuladas y viables:

Se va a utilizar como medio de culltivo el Agar Sulfito-PolimixinaSulfadiazina (SPS). Lo primero ser preparar una serie de diluciones decimales.

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Se preparan dos tubos con medio, donde se sembrar con pipeta estril en un tubo, un mL de la dilucin 10-2 y en otro tubo un mL de la dilucin 10-3. La siembra se efectuar introduciendo la pipeta hasta el fondo del tubo y depositando el inculo lentamente hasta antes de llegar a la superficie. Una vez solidificado el medio de cultivo se aaden 2 mL de ese mismo medio para crear anaerobiosis. Se incuba a 37 C 48 horas, y pasado el periodo de incubacin se cuentan las colonias negras aparecidas, ese nmero multiplicado por el factor de dilucin ser el nmero total de formas vegetativas y esporuladas por gramos mL de muestra.

Resultado de la determinacin:
En el tubo sembrado a partir de la dilucin 10-1 se observa 1 colonia negruzca. En el tubo sembrado a partir de la dilucin 10-2 no se observa ninguna colonia. El nmero total de formas vegetativas y esporuladas ser:

1 colonia * 10 (Inverso del factor de dilucin) = 10 formas vegetativas y esporuladas por cada mL de agua problema.

El color negro de estas colonias es debido a que los Clostridios han reducido el sulfito a sulfuro, que reacciona con el Fe+2 del medio formando FeS que es negro, por eso las colonias aparecidas son negras.

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Anlisis Microbiolgico del agua Conclusiones del anlisis:

El agua constituye un elemento esencial, ya que es indispensable para la vida, por lo que es necesario llevar un seguimiento de la calidad. Con este anlisis se ha querido determinar la calidad de un agua tomado de un manantial. El reglamento que regula la calidad de las aguas (R.D. 140/2003 del 7 de Febrero (B.O.E. n 45 de 21/2/2003)) establece unos lmites de contaminacin que no pueden ser superados y como puede observarse con los resultados obtenidos, el lmite se supera ampliamente.

BACTERIAS A. M. : 200 u.f.c. / mL COLIFORMES: 0 u.f.c. / 100 mL. E. COLI: 0 u.f.c. / 100 mL. ESTREPTOCOCOS FECALES : 0 u.f.c. / 100 mL. CLOSTRIDIOS SULFITO REDUCTORES: 0 u.f.c. / 100 mL.

Como resultado hemos obtenido una gran contaminacin microbiolgica del agua, donde no debera aparecer ningn tipo de contaminacin puesto que se trata de un agua que en tiempos pasados se ha utilizado para consumo humano, aunque actualmente se conoca la no potabilidad de la misma. Durante aos se ha hecho un seguimiento de la calidad del agua analizado y comparando resultados vemos que los parmetros biolgicos se alejan notablemente de los permitidos a partir de un determinado momento. La causa presumible es la ubicacin de unas grandes instalaciones ganaderas, a pocos metros de distancia, de donde se encuentra el manantial del agua analizado que originaran la contaminacin. Es normal que aparezca una contaminacin fecal en el agua y la presencia de Escherichia Coli, que es el mejor indicador de este tipo de contaminacin, as lo confirma.

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El problema de la no potabilidad del agua sera solucionado con una buena gestin de los residuos de las instalaciones ganaderas y someter al manantial a un tratamiento de potabilizacin.

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