TTULO DO PROJETO: Estudo da eliminao de hidrocarbonetos policclicos aromticos (PAHs) em solos atravs de biossurfactante produzido por Lactobacillus pentosus.

RESUMO O objetivo principal deste projeto o tratamento de lodo de esgoto e solo contaminados com hidrocarbonetos aromticos policclicos (PAHs). Para isso se usar biossurfactante produzido por Lactobacillus pentosus, aps a fermentao de resduos de lignocelulsicos. Objetivos parciais: 1-) Caracterizao do lodo de esgoto contaminado com hidrocarbonetos aromticos policclicos. 2-) Caracterizao de solos e sedimentos contaminados com PAHs. 3-) Produo, recuperao e extrao de biossurfactantes. 4-) Estudo da capacidade de biossurfactantes produzidos por Lactobacillus pentosus para estabilizar emulses aquosas que contm PAHs. 5-) O tratamento de lodo de esgoto, solo e sedimento em lote, utilizando biossurfactantes, e acompanhamento da biodegradao de PAHs. 6-) No caso em que a flora microbiana presentes no lodo e do solo no seja suficiente para biodegradar PAHs adicionado juntamente com biossurfactantes, compost de resduos slidos urbanos ou bagao compostado, permitindo o incio do processo de biodegradao. 7-) Lavar coluna de lodo de esgoto, solo e sedimentos com biossurfactantes e monitorar o processo de extrao de PAHs. 8-) No caso em que no processo de extrao de PAHs utilizando o biossurfactante proposto no seja observada eficcia se far adio de cidos orgnicos, juntamente com o biossurfactante, para facilitar o processo de extrao.

PROJECT TITLE: Study of the elimination of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in soils and sewage sludge using a biosusurfactant obtained by Lactobacillus pentosus SUMMARY

The objective of this project is the treatment of sewage sludge and soil contaminated by polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs). This treatment will be carried out using a biosurfactant obtained from Lactobacillus pentosus by fermentation of lignocellulosic residues. For this purpose several partial objectives will be carried out: 1) Characterization of sewage sludge contaminated with PAHs. 2) Characterization of soil or sediments contaminated with PAHs. 3) Production, recovery and extraction of biosurfactants. 4) Study of capacity of the biosurfactant from L. pentosus to stabilize PAHs emulsions with water. 5) Treatment of sewage sludge, soil and sediments in batch, using biosurfactants and study of the kinetic biodegradation of PAHs. 6) In case that the sewage sludge or soil do not have enough microbial biomass to degrade PAHs, urban solid waste compost, or grape marc compost, will be added together with the biosurfactant, in order to start the biodegradation process. 7) Sewage sludge, soil or sediments will be placed in a column and washed using a solution containing the biosurfactant. Samples will be taken periodically. 8) In the case that the extractive process, using the biosurfactant, is not efficient, organic acids will be added together with the biosurfactant in order to improve the extractive process.

2. INTRODUO Esta seo destaca o propsito do projeto e o estado atual do conhecimento cientfico e tcnico, incluindo a literatura mais relevante. O objetivo deste projeto o tratamento de lodo de esgoto e sedimentos que contm altos teores de hidrocarbonetos aromticos policclicos (PAHs), utilizando um biossurfactante obtido a partir de bactrias lcticas. Para isso h duas alternativas: 1) Processos que procuram o solubilizar (PAHs) na presena de biossurfactantes produzidos por Lactobacillus pentosus de modo que a flora microbiana presentes no lodo e solo seja capaz de aceder a estes contaminantes altamente hidrofbicos e os possa biodegradar. A ao do biossurfactante em (PAHs) simplesmente solubilizar de modo que uma vez que se solubilizem, os microorganismos na lama ou solo possam degradar. Neste trabalho, no caso em que a flora microbiana presentes no lodo ou solos no seja adequada, se adicionar juntamente com o biossurfactante, compost de resduos urbanos ou compost de bagao de uva como iniciador do processo biodegradativo. 2) Alm disso prope-se utilizar biossurfactantes como extratores de PAHs em processos de lavagem em coluna de lamas e dos solos. Neste caso no se pretende biodegradar e sim simplesmente sua extrao. Baseado em estudos includos na bibliografia, no caso em que o biossurfactante somente no seja capaz de realizar o processo de extrao de PAHs de forma eficaz, se considera adicionar cidos orgnicos, como o cido lctico, conjuntamente com o biossurfactante. O grupo de pesquisa que quer desenvolver este projeto otimizou a produo de biossurfactantes e cido lctico pela fermentao de resduos lignocelulsicos por meio de bactrias lcticas. O biossurfactante utilizado, e os cidos orgnicos utilizados neste projeto seriam obtidos no laboratrio do Departamento de Engenharia Qumica, Universidade de Vigo. Os hidrocarbonetos aromticos policclicos so uma famlia particular de compostos de hidrocarbonetos que contm um nmero de anis de benzeno condensados atravs de dois ou mais tomos de carbono. Devido a suas caractersticas particulares de origem, estrutura e comportamento ambiental, muitas vezes considerado e estudado como um conjunto diferenciado de hidrocarbonetos (Orozco et al., 2005). Estes contaminantes tm uma longa persistncia no meio ambiente, baixa biodegradabilidade e elevada lipofilia, alguns deles tornando-se compostos altamente txicos (Villar et al., 2004). Devido a os seus coeficientes de partio elevadas e baixa solubilidade em gua, PAHs podem ser facilmente adsorvidos na fase orgnica de partculas slidas (Pine et ai., 2003). PAHs so compostos txicos formados geralmente como um resultado da combusto incompleta de matria orgnica. A combusto de hidrocarbonetos a temperaturas relativamente elevadas (acima de 500C) e com o oxignio insuficiente para a combusto completa, ocasionam a formao de hidrocarbonetos aromticos policclicos (Orozco et al., 2005). Estes compostos podem surgir a partir de fontes naturais ou antropognicas (CRIADO et al., 2004) sendo fontes antropognicas que resultam em maior contribuio desses compostos perigosos ao meio ambiente. Estes compostos tm sido amplamente estudados devido aos efeitos adversos que se originam sobre os diferentes organismos, incluindo os seres humanos. Na verdade, segundo a classificao da Agncia Internacional para Pesquisa sobre Cncer (IARC) (IARC, 1991), alguns PAHs so agentes mutagnicos e cancergenos. Dada a atividade carcinognica destes, 16 PAHs foram coletados pela US-EPA (Agncia de Proteo Ambiental) como prioridade dos Poluentes Orgnicos (EUA EPA, 1997). Hidrocarbonetos aromticos policclicos so tambm graves poluentes da gua. PAHs so gerados em quantidades substanciais na produo de derivados de alcatro de hulha, tais como creosote, um conservante de madeira. A lixiviao de PAHs de creosoto utilizada para preservar as madeiras envolvidas nos cais de pesca e outros, representa uma importante fonte de contaminao para crustceos como lagostas. PAHs tambm entram no ambiente aqutico, devido a descargas de reservatrios de petrleo e refinarias (Baird, 2001; Chen et al, 2004).

Esses poluentes esto tambm em solos e sedimentos. A contaminao do solo com PAHs podem vir de vrias fontes, incluindo derrames de hidrocarbonetos, produtos de combusto incompleta do combustvel, a queima de madeira, etc. No entanto, uma das principais vias de contaminao a deposio atmosfrica, o que mostra que os PAHs podem viajar longas distncias na atmosfera. Como mencionado acima, PAHs podem ser encontrados em partculas atmosfricas, gua, solos, sedimentos, e tambm de lamas. Sua ampla distribuio em grande parte devido s vrias fontes de emisso desses poluentes. As reas urbanas so as principais fontes de PAH, devido queima de combustveis domsticos, emisses industriais, fumaa de escapamento de carros, e da deposio atmosfrica. Como resultado, a gua da chuva e esgoto das reas urbanas, atingem as estaes de tratamento com uma quantidade elevada de poluentes, incluindo PAHs. Devido sua natureza hidrofbica, tendem a ser adsorvido biomassa no tratamento de gua. O resultado a formao de lamas, contendo entre 0,02 e 25 mg / kg (peso seco) de cada PAH nico. O fato de que o lodo utilizado em prticas de agricultura um grande risco de contaminao do solo com PAHs. A nova diretriz da Unio Europeia prev a regulamentao de compostos, tais como metais pesados e compostos orgnicos, a fim de evitar riscos para a sade humana, animais e plantas, bem como assegurar a qualidade do solo e da biodiversidade (Abad et al., 2005). A presena de PAHs em lodo de esgoto recentemente despertou grande interesse, e estabeleceram concentraes mximas aceitveis para alguns PAHs nas lamas que sero usados na agricultura. Em Frana, a regulao da 08 de janeiro de 1998 indica o limite mximo aceitvel para trs HAP: fluoranteno (5 mg / kg (peso seco)), benzo (b) fluoranteno (2,5 mg / kg (peso seco)) e benzo (a) pireno (2,0 mg / kg (peso seco)) (Flotron et al., 2003). A diretiva da Unio Europeia em 2000, estabeleceu que o limite de 6 mg / kg (peso seco) para a soma dos PAHs seguinte: Acenafteno, fenantreno, fluoreno, fluoranteno, pireno, benzo (b) fluoranteno, benzo ( j) fluoranteno, benzo (k) fluoranteno, benzo (a) pireno, benzo (g, h, i) perileno e o indeno (1,2,3c, d) pireno (Villar et al., 2006, Pena et ai .., 2007) Outros pases tem outros limites, por exemplo, o mximo permitido pela lei dos EUA de 4,6 mg / kg (peso seco) para a soma dos HAP seguinte: o benzo (a antraceno), criseno , benzo (b) fluoranteno, benzo (k) fluoranteno, benzo (a) pireno, dibenz (a, h) antraceno e indeno (1,2,3-c, d) pireno, mas no exceda a concentrao admissvel de 1 , 0 mg / kg para o benzo (a) pireno (Villar et al., 2006, Pena et ai., 2007). Em anos recentes aumentaram estudos sobre a utilizao de tensoativos para aumentar a biodegradao ou favorecer a remoo de PAH s dos solos. Assim, por exemplo um et al. (2011) prope o uso combinado de cido orgnico (cido actico, cido oxlico, cido tartrico, cido ctrico) e um rhamnolpido biossurfactante comercial composto de um fenantreno para extrair a partir de solo contaminado, notando que a biossurfactante utilizado produziu melhores percentagens extrao de PAHs quando cido ctrico foi acompanhado. Por outro lado vrios investigadores Zhu e Aitken et ai. (2010) observaram como tensoativos qumicos diferentes podem favorecer a biodegradao de PAHs em solo, embora se deva notar que a maioria destes agentes tensoativos no so biodegradveis e podem constituir um risco para a sade pblica, de modo que a soluo para um problema poderia conduzir a um novos problemas ambientais. Este projeto prope a utilizao de um biossurfactante obtido naturalmente a partir de uma bactria cidolctica, que tem a vantagem de ser biodegradvel, no txico e altamente estvel mudanas de temperatura e pH em comparao com os tensoativos sintetizados forma qumica (Portilla Rivera et al., 2008, Hatch-Rivera et al., 2009). Alm disso, o biossurfactante utilizado neste trabalho se obtm da fermentao de acares hemicelulsicos a partir de resduos lignocelulsicos seguindo a metodologia utilizada em estudos anteriores (Portilla Rivera et al., 2008, Hatch-Rivera et al. 2009). Globalmente, entre os anos 2005-2012, foram publicado 55 artigos em peridicos de alto impacto, relacionado com a remoo de PAHs utilizando biossurfactantes. Note-se que os pases onde os estudos foram realizados sobre a aplicao de biossurfactantes no tratamento da HAP foram ndia (15 trabalhos), China (10 empregos), EUA (5 artigos), Brasil, Venezuela, Turquia e Tailndia, (com 3 trabalhos cada um) e, em seguida, Frana, Itlia, Sua e Japo, com 1 trabalho cada. Por exemplo Sponza e Gok (2011) avaliaram trs biosurfanctantes (rhamnolpido, emulsano e surfactina)
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observando que o rhamnolpido foi o que funcionou melhor, capaz de remover 90% de PAHs no lodo depois de 25 dias de tratamento. A este respeito Zhao et al (2011) tambm avaliaram uma rhamnolpido consistindo de um biossurfactante produzido por Pseudomonas aeruginosa para aumentar a biodegradao de HAP, obtendo-se uma percentagem de biodegradao de 92,7%. A maioria dos biosurfantantes avaliados so obtidos de amostras que no so considerados GRAS (Generally recognize as safe) pela FDA (American Food and Drug Administration) e tambm utilizam acares comerciais como fonte de carbono para a sua produo, o que aumenta o custo do processo. Ao contrrio dos trabalhos publicados, neste projeto, para a remoo de HAP, se pretende utilizar um biossurfactante obtido a partir de bactrias lcticas completamente inofensivas para a sade pblica e um microorganismo considerado GRAS pela FDA e tambm pode ser utilizado como uma fonte de carbono para a produo de biossurfactantes os resduos lignocelulsicos da indstria do vinho, cuja produo e aquisio j foram feitas em um projeto anterior (Hatch-Rivera et al., 2009).
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3. OBJETIVOS DO PROJETO 3.1 Hiptese de partida na qual se sustentam os objetivos do projeto Pontos em que se baseiam o interesse deste projeto e a hiptese de partida do mesmo: 1) Os PAHs so agentes mutagnicos e cancergenos, reconhecidos pela US-EPA (Environmental Protection Agency) como contaminantes orgnicos prioritrios. 2) Alguns solos tem un elevado contedo de PAHs. 3) A maiora das tcnicas de eliminao utilizam surfactantes sintetizados qumicamente, os quais podem chegar a ser txicos dado que a maioria deles no so biodegradveis. 4) O grupo solicitante tem experincia na produo de biossurfactantes e cido orgnicos biodegradveis, a partir de residuos lignocelulsicos utlizando bactrias lcticas. Tambm este grupo aplicou com xito o biossurfactante obtido com L. pentosus na biocorreo de solos contaminados com octano. Portanto em funo dos dados expostos previamente, o objetivo principal deste projeto consiste em aplicar o biossurfactante obtido a partir de L. pentosus a solos contaminados com PAHs para sua extrao ou biodegradaao segundo a tcnica selecionada. Destacar que em Espanha no h nenhuma empresa produtora de biossurfactantes e que a nivel mundial este mercado est ocupado por uns pocos, o que faz com que o preo dos biossurfactantes seja muito elevado. Ressaltar tambm que o biossurfactante proposto neste projeto, para o tratamento de solos contaminados con PAHs se obtm por fermentao de resduos lignocelulsicos, o que rebaixaria o custo de produo do mesmo.

3.2. Antecedentes e resultados previos, da equipe na qual se integraria a solicitante, que avaliam a validez da hiptese de partida A hiptese de partida deste projeto se baseia em que os biossurfactantes obtidos atravs de uma bacteria lctica, mediante fermentao de resduos lignocelulsicos possam funcionar como agente surfactante, biodegradvel, para a eliminao de hidrocaronetos aromticos poilicclicos PAHs. Portanto para que esta hiptese se cumpra, em primero lugar necesita-se obter estes biossurfactantes. Neste sentido o grupo EQ10 do Departamento de Engenharia Qumica da Universidad de Vigo no qual se pretende integrar a solicitante de esta bolsa, tem uma ampla experincia na produo e extrao de biossurfactantes, obtidos por fermentao de resduos agroindustriais utilizando bacterias lcticas1-6.
(1) Portilla-Rivera, O.M., Torrado-Agrasar, A., Carballo, J., Domnguez, J.M., Moldes, A.B. Development of a factorial design to study the effect of the major hemicellulosic sugars on the production of surface-active compounds by L. pentosus (2009) Journal of Agricultural and Food Chemistry, 57 (19), 9057-9062. (2) Portilla, O.M., Rivas, B., Torrado, A., Moldes, A.B., Domnguez, J.M. Revalorisation of vine trimming wastes using Lactobacillus acidophilus and Debaryomyces hansenii (2008) Journal of the Science of Food and Agriculture, 88 (13), 2298-2308. (3) Rivera, O.M.P., Moldes, A.B., Torrado, A.M., Domnguez, J.M. Lactic acid and biosurfactants production from hydrolyzed distilled grape marc (2007) Process Biochemistry, 42 (6), 1010-1018. (4) Moldes, A.B., Torrado, A.M., Barral, M.T., Domnguez, J.M. Evaluation of biosurfactant production from various agricultural residues by Lactobacillus pentosus (2007) Journal of Agricultural and Food Chemistry, 55 (11), 4481-4486. (5) Bustos, G., de la Torre, N., Moldes, A.B., Cruz, J.M., Domnguez, J.M. Revalorization of hemicellulosic trimming vine shoots hydrolyzates trough continuous production of lactic acid and biosurfactants by L. pentosus (2007) Journal of Food Engineering, 78 (2), 405-412. (6) Rodrigues, L., Moldes, A., Teixeira, J., Oliveira, R. Kinetic study of fermentative biosurfactant production by

Lactobacillus strains (2006) Biochemical Engineering Journal, 28 (2), 109-116.

Ademais deve existir algum indcio de que os biossurfactantes propostos neste projeto tenham capacidade para solubilizar compostos hidrofbicos. A equipe investigadora avaliou a capacidade do biossurfactante produzido por L. pentosus para solubilizar e emulsionar compostos hidrofbicos obtendo-se resultados comparveis aos obtidos com o dodecil sulfato sdico (SDS) e melhores que a surfactina7-8. Cabe dizer que o SDS um surfactante qumico amplamente utilizado no tratamento de solos e guas contaminadas com substncias hidrofbicas, mas que tem o inconveniente que no biodegradvel a diferena dos biossurfactantes obtidos a partir de bactrias lcticas. Por outra parte, a surfactina um biossurfactante comercial produzido por Bacillus subtilis, mas que atualmente apresenta um elevado custo (50 mg custam ao redor de 800 euros) que faz sua utilizao inacessvel para fins de meio-ambiente.
(7) Portilla-Rivera, O.M., Torrado, A.M., Domnguez, J.M., Moldes, A.B. Stabilization of kerosene/water emulsions using bioemulsifiers obtained by fermentation of hemicellulosic sugars with lactobacillus pentosus (2010) Journal of Agricultural and Food Chemistry, 58 (18),10162-10168. (8) Portilla-Rivera, O., Torrado, A., Domnguez, J.M., Moldes, A.B. Stability and emulsifying capacity of biosurfactants obtained from lignocellulosic sources using Lactobacillus pentosus (2008) Journal of Agricultural and Food Chemistry, 56 (17), 8074-8080.

Tambm importante que o biossurfactante proposto neste projeto no seja txico para plantas nem animais, fato que a equipe investigadora deste projeto comprovou, observando que no nem fitotxico nem ecotxico9.
(9) Paradelo R; Devesa-Rey R; Moldes A. B; Barral M.T. 2009. Toxicity study of a biosurfactant obtained from L. pentosus and comparison with commercial surfactants. 42nd Congress: Chemistry Solutions. Formulation for the Green Renewable Age.

Por outro lado a equipe investigadora desse projeto tambm conhece muito bem o comportamento destes biossurfactantes quando so adicionados ao solo, observando-se que a nvel de adsoro no solo, se comporta como um surfactante no inico, de forma similar al Tween 80, e diferente do dodecyl sulfato sdico (SDS)10.
(10) Devesa-Rey, R., Vecino, X., Barral, M.T., Cruz, J.M., Moldes, A.B. Study of the sorption of biosurfactants from L. Pentosus on sediments (2011) Proceedings of World Academy of Science, Engineering and Technology, 79, 187-189

Alm de que este biossurfactante produzido por L. pentosus tem sido provado com xito na biocorreo de um solo contaminado com octano conseguindo porcentagens de biocorreo de 90%. Com o qual se pode esperar que este surfactante possa dar lugar tambm a bons resultados na eliminao de PAHs em solos11.
(11) Moldes, A.B., Paradelo, R., Rubinos, D., Devesa-Rey, R., Cruz, J.M., Barral, M.T. Ex situ treatment of hydrocarboncontaminated soil using biosurfactants from lactobacillus pentosus (2011) Journal of Agricultural and Food Chemistry, 59 (17), pp. 9443-9447.

Portanto baseado nos trabalhos expostos anteriormente e na experincia do grupo no qual quer se integrar a solicitante desta convocatria, na obteno de biossurfactantes a partir de bactrias lcticas e sua aplicao na biocorreo de solos contaminados com hidrocarbonetos, como o octano, se poderia esperar que durante o desenvolvimento deste projeto se conseguisse avanar na eliminao de PAHs em solos contaminados, utilizando o biossurfactante produzido por L. pentosus, o qual totalmente biodegradvel e cujo custo de produo poderia ser acessvel a nvel industrial j que se obtm fermentando acares que constituem um resduo.

3.3. Objetivos concretos que se almejam nos que se destacam a novidade e relevncia dos objetivos.

1. Demonstrar que o biossurfanctante produzido por L. pentosus, obtido por fermentaao de resduos lignocelulsicos, pode ser utilizado em processos de biodegradao de solos contaminados com PAHs, facilitando a biodegradao destes contaminantes. 2. Se pretende utilizar tambm este biossurfactante como extrator em processos de lavagem de solos contaminados com PAHs. 3. Se pretende com isso avanar no conhecimento de tcnicas amigveis com o meio ambiente que impliquem na eliminao de compostos txicos e problemticos como os PAHs.

4. METODOLOGIA E PLANO DE TRABALHO Nos seguintes tpicos se descrevem o plano de trabalho proposto e a metodologia para a eliminao de hidrocarbonetos aromticos policclicos (PAHs) em solos contaminados. 4.1 Produo de Biossurfactantes O biossurfactante se produzir de forma contnua, conforme se necessite para os tratamentos de eliminao de PAHs. Baseados em trabalhos prvios se utilizaro podas de sarmento para a obteno de biossurfactantes (Portilla et al., 2009). Para isto, estes resduos se submetero a um processo de hidrlise cida com H2SO4 a 130 C durante 15 minutos que permitir a solubilizao dos acares hemicelulsicos. Posteriormente estes licores ricos em xilosa, glucosa e arabinosa, se fermentaro em cultivo submerso em regime descontinuo em presena de Lactobacillus pentosus para a obteno de biossurfactantes e cido lctico. Destaca-se que o cido lctico se encontra de forma extracelular no meio de fermentao, enquanto que os biossurfactantes se encontram aderidos membrana plasmtica de L. pentosus pelo que necessria sua extrao a partir da clula. 4.2 Recuperao e Isolamento de Biossurfactantes Depois da fermentao, as bactrias lcticas se separaro do meio de cultivo por centrifugao, se lavaro duas vezes com gua destilada e se ressuspendero em tampo fosfato salino (PBS: 10 mM KH2PO4/K2HPO4 y 150 mM NaCl com pH ajustado a 7.0). As bactrias permanecero a temperatura ambiente durante 2 h com agitao com o fim de liberar os biossurfactantes. Durante o processo de extrao, as bactrias se eliminaro por centrifugao e no sobrenadante, com os biossurfactantes, se determinar a tenso superficial (Rodrigues et al., 2006). A concentrao de biossurfactantes se determinar com base na reduo da tenso superficial gerada nos meios de cultivo ou no PBS depois da extrao. Naqueles casos em que a concentrao do biossurfactante seja superior a concentrao micelar crtica (CMC), se calcular e se ter em conta a diluio necessria para alcan-la. A tenso superficial se medir com um tensimetro baseado no mtodo do anel (Rodrguez et al., 2006). 4.3 Estudos de estabilidade e de capacidade de biossurfactantes de formar emulses com os PAHs A capacidade dos biossurfactantes obtidos para formar emulsoes se medir em funo de dois parmetros: EV (% volume de emulsao relativo) y ES (% estabilidade dos biossurfactantes para manter a emulsao quando se mesclam os PAHs selecionados). Como controle se utilizar um surfactante qumico: SDS (dodecil sulfato sdico) e um biossurfactante comercial: a surfactina. Os parmetros que dizem a estabilidade dos biossurfactantes (EV y ES), se calcularo aps 48h de contato entre os hidrocarbonetos e os biossurfactantes seguindo as equaes que se especificam a continuao (Das et al., 1998):

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4.4 Amostragem de solos e lodos Se tomaro amostras de diferentes solos e lodos procedentes de diferentes esgotos e se avaliar o contedo em PAHs. A continuao se especificam alguns dos PAHs que se avaliaro:

4.5 Anlise qumico do solo e de lodos Com a finalidade de poder calcular as concentraes de PAHs nos materiais referidos a peso seco, se determinar a umidade dos solos e lodos avaliados gravimtricamente. Ademais se far uma anlise bsica do solo e de lodos, j que para que os processos de biodegradao dos PAHs funcionem, alm do biossurfactante se necessita condies de pH e nutrientes essenciais adequados para o crescimento microbiano. Assim o pH e a condutividade elctrica se analisar em gua, o C total se analisar por oxidao com dicromato e se valorizar com sulfato amnico ferroso, o N total se analisar utilizando o mtodo Kjeldahl, o Ca, Mg e K disponvel se extrair com NH4AcO 1M a pH 7. O P disponvel se extrair com NaHCO3 0,5 M seguindo o mtodo de Olsen y Sommers (1982) e se determinar espectrofotomtricamente por formao do complexo fosfomolibdtico. Por outra parte para a anlise dos PAHs no solo e lodos, requer um protocolo de anlises, onde primeiro se far uma extrao dos PAHs da amostra a analisar e posteriormente uma vez realizada a extrao, os PAHs se analisaro por cromatografa lquida de alta eficcia (HPLC) com um detector de fluorescncia. A continuao se procede ao desenvolvimento de mtodo analtico dos PAHs j que uma boa metodologia de anlise dos mesmos fundamental no desenvolvimento deste projeto. Extrao dos PAHs Para a extrao dos PAHs da amostra de solo ou lodo se aplicar a tcnica proposta por Barker (2000), a qual produz a irrupo da amostra enquanto tambm se gera um material que possui carcter cromatogrfico para a extrao de compostos de uma amostra dada. Esta tcnica, conhecida como Matrix solid-phase dispersion (MSPD) e permite realizar simultaneamente vrios passos (Barker,
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1998). A MSPD tem sido aplicada frequentemente a extrao de drogas, herbicidas, pesticidas e outros contaminantes em tecidos animais, frutas e vegetais. Estas aplicaes do mtodo implicam geralmente uma pequena quantidade de amostra (aproximadamente 0,5 g) mesclada em um morteiro de uns 2 gramas de fase slida, normalmente C8 o C18. O morteiro e a mo de morteiro utilizados deveriam ser de vidro ou de gata, j que a porcelana ou outros materiais porosos podem originar perdas da amostra e de analitos. A MSPD est desenhada para fragmentar e dispersar os componentes de amostras slidas utilizando uma fase orgnica ligada a um suporte slido, atuando esta ademais como material de recheio atravs da qual os componentes so eludos da amostra. Esta tcnica tem varias vantagens como tem uma grande eficincia de extrao, baixo volume de dissolvente (5-10 mL); no necessria etapa de filtrao nem de clean up. Autores tem aplicado com xito esta tcnica para a determinao de PAHs em solos (Pena et al., 2007) y lodos (Snchez-Brunete et al., 2007; Pena et al., 2008). Determinao dos PAHs O principal problema associado determinao de PAHs em matrizes meio-ambientais so os baixos limites de deteco requeridos e a diversidade de interferncias presentes na matriz da amostra. Neste projeto, para a anlise de PAHs nas amostras de lodos e solos, aps a extrao pelo mtodo MSPD exposta acima, se utilizar a cromatografa lquida de alta resoluo (HPLC) seguida de deteco de fluorescncia. A cromatografa lquida de alta resoluo tem sido extensamente utilizada para a anlise de PAHs em diversos tipos de amostras. Muitos investigadores tem empregado procedimentos analticos baseados em uma extrao de hidrocarbonetos, purificao e separao mediante HPLC com detector de fluorescncia o UV/Visvel. O detector ms habitual utilizado nos laboratorios analticos o de absoro UV/Vis. E os detectores de fluorescncia so os menos usuais posto que so muito mais seletivos e, portanto, restritos em suas aplicaes. Entretanto, para certas espcies (espcies fluorescentes) extraordinariamente sensvel, por exemplo, o caso dos PAHs (Cela et al., 2002). As dissolues padres utilizadas para construir as retas de calibrado, de cada um dos PAHs em estudo, se preparam por diluio, em acetonitrilo-agua (1:1).
A anlise dos extratos obtidos se far nas condies que se detalham a continuao: Fase mvil binaria: acetonitrilo-agua. Fluxo da fase mvel: 1,5 mL/ min. Fluxo de hlio (para desgasificao das fases): 100 mL/ min. Volume de injeo: 20 L (bucle lleno). Tempo de aquisio: tempo necessrio para eluir todos os compostos da coluna, so suficientes 30 minutos. Temperatura do forno: 35 C. Por outra parte o detector de fluorescncia permite a programao de distintos pares de longitudes de onda de excitao/emisso. Como cada composto apresenta um mximo de excitao e emisso caractersticos, ao selecionar pares de longitudes de onda distintos, se pode variar a sensibilidade e seletividade da deteco.

4.6 Experimentos de incubao As amostras de solo contaminadas com PAHs se incubaro com biossurfactantes em experimentos em laboratrio em condies controladas simulando condies naturais, e se compararo com experimentos feitos com surfactantes de origem qumica como o dodecil sulfato sdico (SDS) e com um controle sem adio de surfactantes. Os experimentos se realizaro em triplicata aplicando a
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metodologia proposta por Moldes et al., (2011) em trabalhos anteriores, onde se fez com xito a biocorreo de um solo contaminado com octano. Para isso se utilizar uma relao lquido/slido 1:5, correspondente ao biossurfactante/solo. O surfactante se adicionar ao solo a sua concentracin micelar crtica (CMC) diludo em PBS (ClNa+Tampo fosfato). Os experimentos se realizaro a 25 C e a biodegradao dos PAHs em presena do biossurfactante se faria em estado slido, mantendo uma umidade adequada que favoreceria o processo biodegradativo, a qual seria objeto de estudo. Os experimentos de biodegradao se fariam durante vrios dias at que se produza a biodegradao dos PAHs, tomando-se amostra cada 1 ou 2 dias conforme evolua a degradao dos mesmos. O contedo em PAHs em cada amostra de solo se determinar por HPLC com detector de fluorescncia seguindo a metodologia descrita no apartado 4.5. No caso de que a biodegradao dos PAHs no fosse efetiva, se adicionaria ao princpio do processo de incubao compost de resduos slidos urbanos ou compost de bagao de uva para incorporar biomassa microbiana, ao solo ou lodo contaminado, iniciadores do processo degradativo. 4.7 Experimentos de extraccin de los PAHs Se encher uma coluna com o sedimento ou lodo contaminado e se lavar com uma dissoluo de biossurfactante dissolvido em PBS. Se provaro distintas concentraes de biossurfactante at conseguir a adequada. No caso de que o biossurfactante no seja de todo eficaz se provar a adicionar, conjuntamente com o biossurfactante, algum cido orgnico como o cido lctico. Assim por exemplo An et al. (2011) prope a utilizao conjunta de cido orgnicos (cido actico, cido oxlico, cido tartrico, cido ctrico) e um biossurfactante comercial consistindo em um rhamnolpido para a extrao de fenantreno a partir de solo contaminado, observando que o biossurfactante utilizado rendeu melhores porcentagens de extrao de PAHs quando acompanhado de cido ctrico. Neste sentido temos a vantagem que durante a produo do biossurfactante, Lactobacillus pentosus produz tambm cido lctico como metabolito primrio, pelo que se poderia utilizar este cido lctico como aditivo para potencializar o efeito do biossurfactante durante o processo de extrao dos PAHs. Destacar que o cido lctico produzido, neste projeto seria biodegradvel, diferente do cido lctico sintetizado quimicamente. Os PAHs uma vez eliminados do solo se determinaro por HPLC com detector de fluorescncia, ainda que previamente a sua anlise estes sero extrados, da corrente aquosa utilizada para a lavagem do solo. Por outra parte uma vez finalizado o processo de lavagem se avaliar a presena de restos de PAHs no solo ou lodo seguindo a metodologia de anlise descrita no apartado 4.5. Referencias
Barker, S. A. Matrix solid-phase dispersin (2000). J. Chromatogr. A 885, 115-127. Barker, S.A. Matrix solid-phase dispersin (1998). LC-GC Int. 11, 719-722. Cela, R., Lorenzo, R.A., Casais, M. C. Tcnicas de separacin en qumica analtica. Ed. Sntesis, Madrid (2002). Das, M., Das, S. K., Mukherjee, R. K. Surface active properties of the culture filtrates of a Micrococcus species grown on n-alkenes and sugars (1998). Bioresource Technol. 63: 231-235. Olsen, S. R., Sommers, L. E. Phosphorus. En: A. L. Page (Ed.), Methods of Soil Analysis. Part 2. Chemical and microbiological properties, American Society of Agronomy, (1992) Madison Pena, M. T., Casais, M.C. Mejuto, M. C., Cela, R. Development of a matrix solid-phase dispersion method for the determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in sewage sludge samples (2008). Anal. Chim. Acta 626, 155-165.

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 Pena, M.T., Casais, M.C. Mejuto, M.C., Cela, R. Optimization of the matrix solid-phase dispersion sample preparation procedure for analysis of polycyclic aromatic hydrocarbons in soils: Comparison with microwave-assisted extraction (2007). J. Chromatogr. A 1165, 32-38 Portilla-Rivera, O.M., Torrado-Agrasar, A., Carballo, J., Domnguez, J.M., Moldes, A.B. Development of a factorial design to study the effect of the major hemicellulosic sugars on the production of surfaceactive compounds by L. pentosus (2009) Journal of Agric. and Food Chem., 57 (19), 9057-9062. Rodrigues, L., Moldes, A. B., Teixeira, J., Oliveira, R. Kinetic study of fermentative biosurfactant production by Lactobacillus strains (2006). Biochemical Engineering Journal. 28 (2): 109-116. Snchez-Brunete, C., Miguel, E., Tadeo, J.L. Analysis of 27 polycyclic aromatic hydrocarbons by matrix solid-phase dispersion and isotope dilution gas chromatography-mass spectrometry in sewage sludge from the Spanish area of Madrid (2007). J. Cromatogr. A 1148, 219-227

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5. CAPACIDADE FORMATIVA DO PROJETO E DA EQUIPE SOLICITANTE ONDE SE INTEGRAR A SOLICITANTE DE ESTA BOLSA Este projeto se realizaria no laboratorio que o grupo EQ10, do Departamento de Engenharia Qumica da Universidad de Vigo, tem na Escola Tcnico Superior de Engenheiros Industriais. Este grupo est liderado pelos professores contratados doutores Ana Beln Moldes e Jos Manuel Cruz Freire e principalmente nele se desenvolvem duas linhas de investigao principais: uma de tratamento de residuos aplicando tcnicas amigveis con o meio ambiente e outra de obteno de compostos antioxidantes naturais e sua incorporao em plsticos para a elaborao de envases ativos. A primeira delas est coordenada pela professora Ana Moldes e a segunda linha de investigao est coordenada pelo professor Jos Manuel Cruz. A continuao, se mostram as ajudas conseguidas por ambos doutores que permitiram, nos ltimos anos consolidar este grupo de investigao e equip-lo com o material suficiente para desenvolver perfeitamente as linhas de investigao mencionadas anteriormente e com capacidade de receber um bolsista. Somente se citam aquelas ajudas em que os solicitantes de este projeto foram os IP.
TITULO DEL PROYECTO: Gestin medioambiental de suelos contaminados con hidrocarburos utilizando biosurfactantes ENTIDAD FINANCIADORA: Universidad de Vigo (Ref.:2007INOU-13) ENTIDAD PARTICIPANTE: Universidad de Vigo DURACION DESDE: 01-01-2007 HASTA: 31-12-2007 SUBVENCIN: 5.700 INVESTIGADOR/A PRINCIPAL: Ana Beln Moldes Menduia TITULO DEL PROYECTO: Biocorrecin de suelos contaminados utilizando biosurfactantes obtenidos por fermentacin de sueros lcteos con bacterias lcticas (Proyecto Ramn y Cajal). ENTIDAD FINANCIADORA: Ministerio de Ciencia e Inovacoin ENTIDAD PARTICIPANTE: Universidad de Vigo DURACION DESDE: 15-12-2006 HASTA: 15-12-2008 SUBVENCIN: 15.000 INVESTIGADOR/A PRINCIPAL: Ana Beln Moldes Menduia TITULO DEL PROYECTO: Obtencin de biosurfactantes ENTIDAD FINANCIADORA: Xunta de Galicia Ayudas para la consolidacin de grupos emergentes (Ref.: 2009/070) ENTIDAD PARTICIPANTE: Universidad de Vigo DURACION DESDE: 01-01-2009 HASTA: 31-12-2011 SUBVENCIN: 90.000,00 INVESTIGADOR/A PRINCIPAL: Ana Beln Moldes Menduia TITULO DEL PROYECTO: Estudio de la aplicacin de biosurfactantes obtenidos a partir de residuos agroindustriales, para la biocorreccin de suelos contaminados con hidrocarburos ENTIDAD FINANCIADORA: Ministerio de Ciencia e Innovacin (Ref.: CTM2008-01608) ENTIDAD PARTICIPANTE: UNIVERSIDAD DE VIGO DURACION DESDE: 01-01-2009 HASTA: 31-12-2011 SUBVENCIN: 111.320,00 EUROS INVESTIGADOR/A PRINCIPAL: Ana Beln Moldes Menduia TITULO DEL PROYECTO: FUTURAL Futuros alimentos: ms seguros, ms nutritivos, ms convenientes, ms inteligentes. ENTIDAD FINANCIADORA: Ministerio de Educacin y Ciencia (Programa CENIT) DURACION DESDE: 01-01-2007 HASTA: 31-12-2010 CUANTA DE LA SUBVENCIN: 260.800 Euros. INVESTIGADOR/A PRINCIPAL: Jos Manuel Cruz Freire TITULO DEL PROYECTO: Desarrollo de envases activos liberadores de antioxidantes o antimicrobianos naturales para productos pesqueros: evaluacin de la eficacia del envase ENTIDAD FINANCIADORA: Xunta de Galicia (PGIDIT09TAL015CT) DURACION DESDE: 06-08-2009 HASTA: 31-10-2012 CUANTA DE LA SUBVENCIN: 78.775,00 Euros. INVESTIGADOR/A PRINCIPAL: Jos Manuel Cruz Freire TITULO DEL PROYECTO: Participacin en la red de antioxidantes naturales (2006/6) ENTIDAD FINANCIADORA: Xunta de Galicia. Consellera de Educacin e Ordenacin Universitaria PGIDT - EDU DURACION DESDE: 14-12-2006 HASTA: 13-12-2008 CUANTA DE LA SUBVENCIN: 12.666 Euros. INVESTIGADOR/A PRINCIPAL: Jos Manuel Cruz Freire TITULO DEL PROYECTO: Desarrollo de polmeros de impronta molecular (Molecular Imprinted Polymers) para su aplicacin en el campo alimentario MIPFOOD. Subprograma INNPACTO del Ministerio de Ciencia e Innovacin

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ENTIDAD FINANCIADORA: Ministerio de Ciencia e Innovacin. Subcontratacin por la Universidad de Santiago de Compostela (CO-0029-11) ENTIDAD PARTICIPANTE: Universidad de Vigo DURACION DESDE: 01-01-2011 HASTA: 31-12-2012 CUANTA DE LA SUBVENCIN: 52.398,00 INVESTIGADOR/A PRINCIPAL: Jos Manuel Cruz Freire TITULO DEL PROYECTO: Desarrollo de polmeros de impronta molecular (Molecular Imprinted Polymers) para su aplicacin en el campo alimentario MIPFOOD. Subprograma INNPACTO del Ministerio de Ciencia e Innovacin ENTIDAD FINANCIADORA: Ministerio de Ciencia e Innovacin. Subcontratacin por la Universidad de la Universidad Complutense de Madrid (CO-0035-1 ENTIDAD PARTICIPANTE: Universidad de Vigo DURACION DESDE: 20-01-2011 HASTA: 31-12-2013 CUANTA DE LA SUBVENCIN: 60.000,00 INVESTIGADOR/A PRINCIPAL: Jos Manuel Cruz Freire Establecemento de umbrais de calidade (sensoriais e qumicos) para espcies obxectivo pesqueiro non contempladas no marco lexislativo ENTIDAD FINANCIADORA: Xunta de Galicia. Subcontratacin por CETMAR (CO-0176-10) ENTIDAD PARTICIPANTE: Universidad de Vigo DURACION DESDE: 27-12-2010 HASTA: 30-09-2012 CUANTA DE LA SUBVENCIN: 23.805,00 INVESTIGADOR/A PRINCIPAL: Jos Manuel Cruz Freire

Ademais, a continuacao se adjuntam aqueles projetos de final de graduao, Teses de licenciatura e Teses Doutorais dirigidas pelos Professores Ana Beln Moldes e Jos Manuel Cruz Freire, que garantem a capacidade formativa do grupo de investigao no qual se integraria a solicitante:
TESIS DOCTORALES DIRIGIDAS por Ana Beln Moldes Menduia TITULO: Aprovechamiento de residuos agroindustriales para la obtencin de medios nutritivos econmicos y de cido lctico DOCTORANDO/A: Maria Guadalupe Bustos Vzquez UNIVERSIDAD: Universidad de Vigo AO: 2005 CALIFICACION: Sobresaliente cum laude TITULO: Produccin de Biosurfactantes y Bioemulsionantes a partir de residuos agroindustriales utilizando bacterias lcticas DOCTORANDO/A: Oscar Manuel Portilla Rivera UNIVERSIDAD: Universidad de Vigo AO: 2008 CALIFICACION: Sobresaliente cum laude TITULO: Compostaje de residuos de la industria vitivincola y aplicacin del compost de bagazo de uva en restauracin de escombreras de pizarra DOCTORANDO/A: Remigio Paradelo Nez UNIVERSIDAD: Universidad de Santiago de Compostela AO: 2009 CALIFICACION: Sobresaliente cum laude TESIS DOCTORALES DIRIGIDAS por Jos Manuel Cruz Freire TTULO: Desarrollo y evaluacin de sistemas barrera activos y pasivos y su aplicacin en el campo alimentario DOCTORANDO/A: David Antonio Pereira de Abreu UNIVERSIDAD: Universidad de Santiago de Compostela FACULTAD/ESCUELA: Farmacia AO: 2011 CALIFICACIN: Sobresaliente Cum Laude PROYECTOS FIN DE MSTER Y FIN DE CARRERA DIRIGIDOS por Ana Beln Moldes Menduia 1. 2. 3. 4. 5. Optimizacin del proceso de sntesis biotecnolgica de cido lctico a partir de residuos agrcolas. D. Sandra Rivas Siota. Proyecto Fin de Carrera. Facultad de Ciencias de Ourense. Universidad de Vigo (2003). Las de vinificacin como nutrientes de bajo coste para la produccin de cido lctico. D. Nuria de la Torre Sayns. Proyecto Fin de Carrera. Facultad de Ciencias de Ourense. Universidad de Vigo (2003). Produccin de cido lctico a partir de maz por sacarificacin y fermentacin simultneas. D Patricia Gulln Estevez. Proyecto Fin de Carrera. Facultad de Ciencias de Ourense. Universidad de Vigo. (2003) Aprovechamiento de residuos agroindustriales para la produccin en continuo de cido lctico. D Felipe Periscal Trillo. Proyecto Fin de Carrera. Facultad de Ciencias de Ourense. Universidad de Vigo. (2004) Evaluacin de residuos vitivinicolas para la produccin de cido lctico por Lactobacillus pentosus. D Matildez Martnez Bouzn. Proyecto Fin de Carrera.

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Facultad de Ciencias de Ourense. Universidad de Vigo (2004). Evaluacin de residuos vitivincolas para la produccin de cido lctico por Lactobacillus pentosus. D. Noelia Rodriguez Pazo. Proyecto Fin de Carrera. Facultad de Ciencias de Ourense. Universidad de Vigo (2005). 7. Recuperacin del cido tartrico presente en las lias de vinificacin y empleo de estas las como nutrientes econmicos en procesos biotecnolgicos. D Jos Manuel Salgado Seara. Proyecto Fin de Carrera. Facultad de Ciencias de Ourense. Universidad de Vigo (2005). 8. Produccin de cido lctico y biosurfactantes a partir de cscara de nuez y avellana. D Javier Vaqueiro Rodrguez. Proyecto Fin de Carrera. Facultad de Ciencias de Ourense. Universidad de Vigo. (2007) 9. Utilizacin de compost en la elaboracin de sustratos para cultivo de plantas ornamentales Mara Rodrguez de la Fuente. Proyecto Fin de Carrera. Facultad de Biologa. Universidad de Santiago de Compostela (2006). 10. Aprovechamiento de residuos de la industria vitivincola para la obtencin de compost Desire Gonzlez Cardoso. Proyecto Fin de Carrera. Facultad de Biologa. Universidad de Santiago de Compostela (2006). 11. Biocorrecin de suelos contaminados con octano mediante el empleo de biosurfactante producido por L. pentosus Javier Caneda Abelenda. Proyecto Fin de Carrera. Facultad de Qumica. Universidad de Santiago de Compostela (2006). 12. Floculacin de partculas en suspensin con lactato clcico Nlida Fernndez Lpez. Proyecto Fin de Mster. Escuela Superior de Ingenieros Industriales. Universidad de Vigo (2010). 6. TESIS DE LICENCIATURA DIRIGIDAS por Ana Beln Moldes Menduia 13. Produccin de cido lctico a partir de cebada. D Yolanda Domarco Lpez. Facultad de Ciencias de Ourense. Universidad de Vigo (2003). 14. Aprovechamiento de sarmiento para la obtencin de cido lctico por procesos en discontinuo y continuo. D Arturo Casares Guzmn. Facultad de Ciencias de Ourense. Universidad de Vigo (2004). PROYECTOS FIN DE DE CARRERA DIRIGIDOS por Jos Manuel Cruz Freire 1. 2. 3. 4. 5. Autohidrlisis de residuos agroforestales para la obtencin de extractos con capacidad antioxidante" . Proyecto Fin de Carrera de Cristina Romero lvarez. Universidad de Vigo. 24 de Julio de 2002. Sobresaliente Alternativas para el aprovechamiento del bagazo de alcoholera como fuente de antioxidantes". Proyecto Fin de Carrera de Mara Jess Rey Moraleja. Universidad de Vigo. 24 de Julio de 2002. Sobresaliente Optimizacin del proceso de obtencin de antioxidantes basado en hidrlisis cida de madera de eucalipto". Proyecto Fin de Carrera de Mara Trinidad Pereiro Jorge. Universidad de Vigo. 10 de Octubre de 2002. Sobresaliente Aprovechamiento de los residuos de cebada para la obtencin de antioxidantes". Proyecto Fin de Carrera de Silvia Lpez Romero. Universidad de Vigo. 31 de Enero de 2003. Sobresaliente Fraccionamiento de extractos antioxidantes procedentes de residuos agrodindustriales". Proyecto Fin de Carrera de Montserrat Gonzlez Mosquera. Universidad de Vigo. 23 de Julio de 2003. Sobresaliente Estudio de la estabilidad de antioxidantes naturales procedentes de residuos agroindustriales". Proyecto Fin de Carrera de Enma Conde Pieiro. Universidad de Vigo. 3 de Octubre de 2003. Sobresaliente Evaluacin de la actividad antimicrobiana de extractos procedentes de residuos agrcolas e industriales". Proyecto Fin de Carrera de Lourdes Lorenzo Salgado. Universidad de Vigo. 24 de Octubre de 2003. Sobresaliente Separacin y purificacin de oligosacridos de soja mediante tecnologa de membranas". Proyecto Fin de Carrera de Silvia Gonzles Gonzlez. Universidad de Vigo. 20 de Septiembre de 2005. Sobresaliente Produccin de probiticos a partir de efluentes de una planta de concentrados de soja". Proyecto Fin de Carrera de Mercedes Romn Cajaraville. Universidad de Vigo. 20 de Septiembre de 2005. Sobresaliente

6. 7. 8. 9.

TESIS DE LICENCIATURA DIRIGIDAS por Jos Manuel Cruz Freire

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10. Aprovechamiento de residuos agroindustriales para la obtencin de aditivos alimentarios". Memoria de Tesis de Licenciatura de Jos Diz Figueiras. Universidad de Vigo. 22 de Marzo de 2002. Calificacin : Sobresaliente

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