Sunteți pe pagina 1din 55

Sincere mulumiri i recunotin pentru sprijinul acordat n realizarea acestei lucrri: Domnului Prof. Dr. Ing.

Marcel Popa, conductor tiinific Doamnei Conf. Dr. Ing. Liliana Veretiuc Doamnei Dr. Bioing. Ctlina Peptu Soului meu, familiei mele, colegilor i prietenilor mei Tuturor celor cu care am colaborat i care m-au ajutat

Micro i nanoparticule cu poteniale aplicaii biomedicale

Cuprins
Introducere STUDIU BIBLIOGRAFIC Capitolul I. Micro i nanoparticule lipidice lipozomi

I.1. Introducere I.2. Aspecte generale I.2.1. Moleculele amfifile I.2.2. Clasificarea i caracteristicile lipozomilor I. 3. Metode de obinere a lipozomilor I.3.1. Metode de preparare a MLV-urilor i SUV-urilor I.3.2. Metode de omogenizare I.3.3. Metode de obinere a lipozomilor cu ajutorul solvenilor organici I.4. Stabilizarea lipozomilor I.5. Aplicaii medicale ale lipozomilor I.5.1. Aplicaii biomedicale ale lipozomilor convenionali I.5.2. Aplicaii ale lipozomilor cu circulaie prelungit I.5.3. Aplicaii ale lipozomilor cu intire specific I.5.4. Aplicaii ale lipozomilor sensibili la stimuli externi
Capitolul II. Sisteme polimere particulate cu aplicaii n eliberarea controlat de principii active

7 8 9 9 11 11 12 14 16 18 19 21 22 23

II.1. Introducere II.2. Aspecte generale II.2.1.Clasificarea sistemelor particulate II.2.2. Metode de obinere a micro i nanoparticulelor II.3. Metode de caracterizare II.3.1. Caracterizarea structural II.3.1.1. Difracia cu Raze X (XRD) II.3.1.2. Spectroscopia IR II.3.1.3. Spectroscopia RAMAN II.3.1.4. Rezonana electromagnetic nuclear (RMN) II.3.2. Caracterizarea morfologic i dimensional II.3.2.1. Microscopia electronic de baleiaj (SEM) II.3.2.2. Microscopia electronic de transmisie (TEM) II.3.2.3. Spectroscopia de corelaie fotonic II.3.2.4. Difractometria LASER II.4. Aplicaii medicale ale micro i nanoparticulelor polimere

25 25 27 28 30 30 30 32 34 35 36 37 39 40 42 42

II.4.1. Avantajele principale ale utilizrii acestui tip de sistem pentru eliberarea controlat de medicamente II.4.2. Aplicaii n ingineria tisular II.4.3. Aplicaii oftalmologice II.4.4. Aplicaii n imunologie II.4.5. Aplicaii n terapia antitumoral
REZULTATE ORIGINALE Capitolul III. Sisteme complexe de tipul polimer-lipozomi-principiu activ

43 44 46 47 49

III.1. Hidrogeluri dublu reticulate pe baz de chitosan i gelatin utilizate pentru imobilizarea lipozomilor III.1.1. Obinerea i caracterizarea hidrogelurilor pe baz de gelatin i chitosan dublu reticulate III.1.1.1. Hidrogeluri pe baz de gelatin i chitosan reticulate cu aldehid glutaric i sulfat de sodiu III.1.1.1.1. Materiale utilizate III.1.1.1.2. Metoda de preparare a hidrogelurilor III.1.1.1.3. Caracterizarea hidrogelurilor III.1.1.1.4. Rezultate i discuii III.1.1.1.5. Concluzii III.1.1.2. Hidrogeluri pe baz de gelatin i chitosan reticulate cu aldehid glutaric i TPP III.1.1.2.1. Obinerea i caracterizarea hidrogelurilor III.1.1.2.2. Modelarea III.1.1.2.3. Rezultate i discuii III.1.1.2.4. Concluzii III.1.2. Imobilizarea lipozomilor n hidrogeluri pe baz de chitosan i gelatin III.1.2.1. Materiale utilizate III.1.2.2.1. Prepararea lipozomilor III.1.2.2.2. Prepararea sistemelor complexe de tipul polimer-lipozomiprincipiu activ III.1.2.3. Caracterizarea lipozomilor i a sistemelor polimer-lipozomi III.1.2.4. Rezultate i discuii III.1.2.5. Concluzii III.2. Hidrogeluri dublu reticulate pe baz de chitosan i PAV utilizate pentru imobilizarea lipozomilor III.2.1. Hidrogeluri pe baz de PAV i chitosan reticulate cu aldehid glutaric i sulfat de sodiu/TPP III.2.1.1. Materiale utilizate III.2.1.2. Metoda de preparare a hidrogelurilor

53 53 54 55 56 58 64 74 75 76 77 79 90 91 91 94
97 97 102 109

109 110 110 112

Micro i nanoparticule cu poteniale aplicaii biomedicale

III.2.1.3. Caracterizarea hidrogelurilor III.2.1.4. Rezultate i discuii III.2.1.5. Concluzii III.2.2. Imobilizarea lipozomilor n hidrogeluri pe baz de chitosan i PAV III.2.2.1. Materiale utilizate III.2.2.2.1. Prepararea lipozomilor III.2.2.2.2. Prepararea sistemelor complexe de tipul polimer-lipozomiprincipiu activ III.2.2.3. Caracterizarea lipozomilor i a sistemelor polimer-lipozomi III.2.2.4. Rezultate i discuii III.2.2.5. Concluzii
Capitolul IV. Sisteme particulate pe baz de polimeri naturali i sintetici

113 116 122 123 123 123 123 124 124 129

IV.1. Sisteme polimer-principiu activ sub form de micro i nanoparticule pe baz de chitosan i gelatin IV.1.1. Materiale utilizate IV.1.2. Metoda de obinere IV.1.3. Caracterizarea particulelor obinute IV.1.4. Rezultate i discuii IV.1.5. Concluzii IV.2. Sisteme micro i nanoparticulate pe baz de chitosan i poli(alcool vinilic) IV.2.1. Materiale utilizate IV.2.2. Metoda de obinere a microparticulelor IV.1.3. Caracterizarea particulelor obinute IV.2.4. Rezultate i discuii IV.2.5. Concluzii Concuzii generale
Referine bibliografice

130 133 135 137 142 156 157 158 159 161 162 175 177 181

Introducere
Scopul tuturor sistemelor de eliberare controlat este ca medicamentul s ajung intact la zona intit, ntr-un mediu care s poat controla administrarea principiului activ pe ci de declanare chimice sau fiziologice. Pentru a realiza acest scop, cercettorii i ndreapt atenia spre lumea micro i nanotehnologiei. n ultimul deceniu, micro i nanosferele, micelele polimerice, materialele de tip hidrogel, nanocapsulele s-au artat a avea efect n mbuntirea intirii specifice a medicamentelor, scderea toxicitii sistemice a acestora, mbuntirea ratei tratamentului i protecia substanelor active mpotriva degradrii biochimice. Prezentul studiu a avut drept scop realizarea de noi biomateriale pe baz de polimeri naturali i sintetici, care s rspund cerinelor eliberrii controlate de principii biologic active. S-a propus obinerea de sisteme micro i nanoparticulate, dat fiind posibilitatea administrrii acestora n organism pe diverse ci: oral, parenteral, intraperitoneal, respiratorie, transdermal. O categorie aparte de microparticule capabile de a include cantiti mari de principii active, att hidrofile ct i hidrofobe, o constitue lipozomii. Aplicaiile acestora ca sisteme de eliberare controlat este ns limitat de stabilitatea lor redus n medii fiziologice. Originalitatea tezei const n conferirea unei stabiliti ridicate lipozomilor prin includerea lor n matrici polimere de tip hidrogel. Matricea polimer protejeaz pe de o parte lipozomii i constitue i o barier suplimentar pentru principiile active incluse n acestea modelnd astfel cinetica de eliberare. Pentru ndeplinirea acestui scop, cercetrile au fost desfurate pe urmtoarele direcii: Obinerea de noi hidrogeluri printr-o metod original i caracterizarea acestora din punct de vedere al structurii, stabilitii mecanice, capacitii de umflare n medii apoase i capacitii de ncrcare/eliberare a principiilor active; Obinerea de lipozomi i includerea acestora n matrici polimere urmrind capacitatea sistemelor astfel formate de a elibera principiul activ inclus n lipozomi; pe baza rezultatelor obinute s-a propus i un mecanism de eliberare a principiului activ din astfel de sisteme; Obinerea de micro i nanoparticule polimere cu caracter de hidrogel i caracterizarea acestora din mai multe puncte de vedere (structural, morfologic, umflare n mediu apos, ncrcare/eliberare de principii active) n perspectiva utilizrii lor ca matrici pentru includerea de lipozomi, aspect care face subiectul unei cercetri viitoare. Lucrarea este structurat n patru capitole, i anume: Studiu bibliografic Capitolul I. Micro i nanoparticule lipidice lipozomi Acest capitol reprezint un studiu privind caracteristicile lipozomilor, metodele specifice de preparare i aplicaiile biomedicale ale acestora. Capitolul II. Sisteme polimere particulate cu aplicaii n eliberarea controlat de principii active n acest capitol sunt prezentate succint noiunile teoretice cu privire la caracteristicile sistemelor particulate polimere, metodele de preparare, o parte din metodele de caracterizare precum i aplicaiile biomedicale ale acestora.

Micro i nanoparticule cu poteniale aplicaii biomedicale

Rezultate originale Capitolul III. Sisteme complexe de tipul polimer-lipozomi-principiu activ Rezultatele originale din acest capitol conin cercetri privind posibilitatea imobilizrii lipozomilor de tip MLV n matrici polimere pe baz de gelatin/chitosan i chitosan/poli(alcool vinilic) dublu reticulate (covalent i ionic). A fost realizat un studiu complex privind att influena parametrilor reaciei de reticulare ct i a compoziiei MLV-urilor asupra parametrului de integritate lipozomal. Un obiectiv al acestui studiu a fost elucidarea mecanismului de eliberare a unui principiu activ hidrofil inclus n lipozomii imobilizai n matricile polimere. Capitolul IV. Sisteme particulate pe baz de polimeri naturali i sintetici Acest capitol conine rezultatele originale obinute din prepararea unor sisteme particulate pe baz de gelatin/chitosan i chitosan/poli(alcool vinilic). Micro i nanoparticulele au fost preparate prin dubl reticulare (ionic i covalent) n emulsie invers i au fost caracterizate att din punct de vedere structural i morfologic, ct i din cel al interaciunii cu soluiile apoase cu pH diferit (acid i bazic) i cu soluii de medicamente. Pentru sistemele particulate pe baz de gelatin i chitosan au fost efectuate teste in vivo de biodistribuie pentru determinarea potenialelor aplicaii medicale. Lucrarea se ncheie cu Concluzii Generale i Referine bibliografice. Teza de doctorat intitulat Micro i nanoparticule cu poteniale aplicaii biomedicale cuprinde circa 192 pagini, conine 128 figuri, 14 ecuaii sau formule matematice, 27 tabele, 2 scheme i 215 referine bibliografice, majoritatea de actualitate. Rezultatele originale obinute au constituit subiectul a 5 lucrri tiinifice publicate n reviste (2 n ar i 3 n strintate) i a 8 comunicri i postere la manifestri naionale (2) i internaionale (6). n continuare vor fi prezentate, ntr-o form succint, o parte dintre acestea, pstrndu-se numerotarea din tez a capitolelor, figurilor, tabelelor, schemelor, precum i a bibliografiei.

Capitolul III. Sisteme complexe de tipul polimer-lipozomi-principiu activ III.1. Hidrogeluri dublu reticulate pe baz de chitosan i gelatin utilizate pentru imobilizarea lipozomilor n ultimii ani, sistemele polizaharide-proteine au prezentat un interes crescut din punct de vedere al aplicaiilor biomedicale [112-116]. Obinerea unor hidrogeluri pe baz de gelatin i chitosan cu proprieti mecanice bune i cu caracteristici specifice de umflare pentru aplicaii medicale a constituit o adevrat provocare. n acest subcapitol va fi descris obinerea si caracterizarea unor hidrogeluri dublu reticulate pe baz de gelatin i chitosan utilizate pentru imobilizarea lipozomilor. III.1.1. Obinerea i caracterizarea hidrogelurilor dublu reticulate pe baz de gelatin i chitosan Hidrogelurile pe baz de G i CS obinute far ageni de reticulare prezint slabe proprieti mecanice [117]. Este deja cunoscut faptul c ageni de reticulare precum formaldehida [118] i glutaraldehida [119] prezint grade de toxicitate mai mari dect diferii ageni de reticulare ionici precum sulfatul de sodiu, sulfatul de magneziu sau tripolifosfatul de sodiu. Pe de alt parte, hidrogelurile reticulate covalent prezint proprieti mecanice superioare celor reticulate ionic, ns proprietile de umflare i capacitile de ncrcare/eliberare sunt inferioare [120]. O metod original de preparare a unor hidrogeluri dublu reticulate (reticulare covalent urmat de ionic) a fost utilizat pentru a reduce cantitatea de agent de reticulare covalent (toxic) pstrnd ns stabilitatea mecanic a hidrogelurilor obinute. Hidrogeluri pe baz de G i CS dublu reticulate cu aldehid glutaric/sulfat de sodiu i aldehid glutaric/tripolifosfat de sodiu au fost studiate din punct de vedere al morfologiei, gradului de umflare, capacitii de ncrcare/eliberare a unor principii active model i caracteristicilor mecanice. III.1.1.1. Hidrogeluri pe baz de gelatin i chitosan reticulate cu aldehid glutaric i sulfat de sodiu Obinerea hidrogelurilor pe baz de G i CS prin dubl reticulare (covalent i ionic) are loc datorit reaciei dintre gruprile carbonil ale glutaraldehidei i gruprile aminice libere ale celor doi polimeri, precum i a interaciunilor dintre anionii sulfat i gruprile aminice protonate ale polimerilor solubilizai n acid acetic. III.1.1.1.2. Metoda de preparare a hidrogelurilor Hidrogelurile pe baz de G i CS (GCS) au fost preparate printr-o reticulare covalent parial cu AG urmat de o reticulare ionic cu Na2SO4, utiliznd un plan experimental centrat, rotitor, compus, de ordinul II cu trei variabile (Tabelul III.2). Pentru obinerea hidrogelurilor s-a urmrit planul experimental prezentat n Tabelul III.3.
Tabelul III.2. Variabilele planului experimental n termeni reali i codai Variabile Cod Real Codat -1,682 -1 0 1 1,682 Raportul dintre polimeri G/CS (g/g) X1 0,11 1,92 4,56 7,2 9
Cantitatea de agent de reticulare ionic (1 mol Na2SO4/ 2 moli NH2 liber) Timpul de reticulare ionic (minute)

X2 X3

0,3 60

0,361 97

0,45 150

0,539 204

0,6 240

Micro i nanoparticule cu poteniale aplicaii biomedicale

S-au obinut 20 de probe (6 dintre ele au fost preparate n condiii identice pentru a evalua reproductibilitatea planului experimental) dup cum urmeaz: 0,5 g polimer (n diferite rapoarte G/CS) au fost dizolvate n 25 mL soluie acid acetic 2% (v/v). Cantitatea specific de AG Tabelul III.3. Planul experimental ce utilizeaz necesar pentru a reticula 20% dintre variabilele n termeni codai gruprile aminice libere a fost adaugat Codul peste soluia de polimeri, n picturi, sub X1 X2 X3 probei agitare energic. Gruprile aminice libere GCS-1 -1 -1 -1 ale gelatinei au fost calculate innd cont de compoziia aproximativ a GCS-2 1 -1 -1 aminoacizilor diamino monocarboxilici din GCS-3 -1 1 -1 gelatina de tip B [124]. Cantitatea minim GCS-4 1 1 -1 optim de AG pentru ca filmele sa fie GCS-5 -1 -1 1 stabile a fost fixat n urma unor teste GCS-6 1 -1 1 preliminarii. Amestecul obinut a fost GCS-7 -1 1 1 transferat cu grij n Petri-uri cu diametrul GCS-8 1 1 1 de 90 mm, ultrasonicat pentru a se GCS-9 -1,682 0 0 ndeprta aerul i a evita astfel formarea GCS-10 1,682 0 0 de goluri, i apoi introduse n etuv timp GCS-11 0 -1,682 0 de 1 or, la o temperatur de 50 C. Hidrogelurile reticulate covalent au fost GCS-12 0 1,682 0 imersate n soluii apoase de Na2SO4 de GCS-13 0 0 -1,682 concentraii diferite (Tabelul III.3.) i GCS-14 0 0 1,682 meninute acolo intervale de timp precise GCS-15 0 0 0 pentru definitivarea reticulrii ionice. GCS-16 0 0 0 Ulterior, probele au fost splate succesiv GCS-17 0 0 0 cu aceton i ap bidistilat pentru a GCS-18 0 0 0 elimina produii nereacionai; GCS-19 0 0 0 hidrogelurile au fost uscate parial i GCS-20 0 0 0 pstrate la o temperatura de 5 C. III.1.1.1.4. Rezultate i discuii Reticularea covalent a celor doi polimeri cu AG are loc predominant la gruprile aminice libere cu formarea de legturi de tip imin, datorit reactivitii crescute a acestor grupri fa de gruprile hidroxil, reacia fiind favorizat i de mediul acid. Reticularea ionic are loc prin intermediul ionilor sulfat din sulfatul de sodiu i a gruprilor aminice aflate sub forma ionului amoniu [125]. Caracteristici structurale Structura chimic a hidrogelurilor GCS obinute a fost analizat cu ajutorul spectroscopiei FTIR. Chitosanul prezint ca benzi caracteristice: 3417 cm-1 specific grupelor -OH, 1635 cm-1 specific gruprii -C=O, aceasta fiind dovada faptului c chitosanul este un produs parial deacetilat i 1114 cm-1 band specific structurii polizaharidice, la 1539 cm-1 este banda caracteristic grupelor -NH2 libere. Gelatina prezint ca benzi caracteristice: 1641 cm-1 specific benzii amidice I, 1521 cm-1 specific benzii amidice II i grupelor aminice libere.

Gruparea iminic format n urma reticulrii covalente absoarbe ntr-o zon n rii care mai absorb i alte grup funcionale i de aceea a fost necesar o deconvoluie i grupri i spectral ntre 1500-1800 cm-1. Banda de absorbie specific pentru legtura iminic a leg fost gsit la 1668 cm-1 [126]. Reticularea ionic a fost confirmat de prezena peak-ului de absorbie specific confirmat absorb -2 -1 pentru SO4 (~ 619cm ) [127]. Caracteristici morfologice Structura hidrogelurilor a fost pus n eviden cu ajutorul microscopiei elecronice de baleiaj (Figura III.15.). n seciune (Figura III.15.A.), hidrogelurile prezint o structur fibrilar, probabil, iune prezint fibrilar datorit macromoleculelor de chitosan care sunt predominante n compoziia probei compozi analizate; suprafaa hidrogelului (Figura III.15.B.) prezint o structur omogen i a prezint poroas, porii fiind formai de spaiile dintre fibrilele din structura hidrogelului. i spa iile

Figura II.15. Micrografii electronice pentru proba GCS-1: A seciunea transversal a iunea hidrogelului i B suprafa hidrogelului suprafaa A B

Gradul maxim de umflare Variaiile gradului maxim de umflare n soluie tampon fosfat sunt expuse n iile solu ie Figura III.16. ca reprezentarea grafic a suprafeelor de rspuns pentru a putea grafic spuns determina setrile optime ale parametrilor experimentali.
Gradul maxim de umflare la pH=7.4

Gradul maxim de umflare la pH=7,4 1700 1600 1500 1400 1300 1200 1100 1000 900 800 700
1600-1700 1500-1600 1400-1500 1300-1400 1200-1300 1100-1200 1000-1100 900-1000 800-900 700-800

1800 1700 1600 1500 1400 1300 1200 1100 1000 900 800

1700-1800 1600-1700 1500-1600 1400-1500 1300-1400 1200-1300 1100-1200 1000-1100

Qmax,%

0.3 0.4 0.4 0.5

0.5

0.6

Qmax %

60

96

132

168

204

240
X2=0,45

X3=150 min

Figura III.16. Gradul maxim de umflare la pH=7,4 pentru hidrogelurile GCS: A suprafaa de rspuns Qmax estimat, Qmax=f(X1, X2) cnd X3=150 i spuns B - suprafaa de rspuns Qmax estimat, Qmax=f(X1, X3) cnd X2=0.45 a

Micro i nanoparticule cu poteniale aplicaii biomedicale i poten

Variaia gradului maxim de umflare n funcie de parametrii variabili au condus la ia func ie cteva concluzii interesante: Qmax variaz n general ntre 850 i 1700% n funcie de raportul iniial dintre ie ini cei doi polimeri (G/CS); Qmax crete cnd raportul G/CS < 4, pentru orice cantitate de agent de te reticulare ionic (Figura II.16.A.). Acest lucru poate fi atribuit hidrofiliei crescute a gelatinei care va influena capacitatea maxim de umflare a hidrogelurilor. Pe de alt influen alt parte, CS are cte o grupare aminic la fiecare unitate structural i G are de obicei mai amini puine grupri aminice numrul gruprilor aminice vor determina densitatea reelei rilor re finale, astfel se explic gradele mari de umflare n cazul probelor ce conin mai mult con G; o comportare neatepta a fost observat pentru un raport G/CS>4 cnd s-a teptat nregistrat o tendin de scdere a Qmax; sc O cantitate crescut de CS n amestecul iniial i o cantitate crescut de crescut crescut Na2SO4 conduce la Qmax sczute datorit densitii crescute de reticulare (Figura ii II.16.A.); n funcie de timpul de reticulare ionic, pentru diferite rapoarte G/CS, s-au ie ionic , nregistrat comportamente diferite ale Qmax: o cantitate crescut de CS n amestecul iniial i un timp de reticulare crescut are ca rezultat un Qmax sczut iar o cantitate iniial i zut crescut de G conduce la o cretere a Qmax din aceleai motive explicate mai sus. cre i Capacitatea de ncrcare/eliberare utiliznd un medicament model ncrcare/eliberare Eficiena de eliberare a cafeinei a fost cuprins ntre 92.6% and 96.9% ceea ce a cuprins indic faptul c aproape toat cantitatea de cafein ncrcat a fost eliberat. toat eliberat Cantitatea maxim de cafein eliberat (dupa 24 h) de hidrogelurile GCS n soluie tampon fosfat cu pH=7,4 este reprezentat n Figura III.18. Eliberarea cafeinei ie reprezentat are, n general, aceeai comportare ntlnit i la Qmax ceea ce confirm caracterul confirm difuzional al eliberrii medicamentului hidrofil din acest material nou. Este de asemenea rii confirmat i influena densitii reelei polimerice asupra capacitii de i influen elei capacit ncrcare/eliberare a medicamentelor. rcare/eliberare
mg CF eliberate / g hidrogel mg Cf eliberata/g hidrogel
Cantitatea maxima de cafeina eliberata la pH=7,4 300 Cantitatea maxima de cafeina eliberata la pH=7,4 220

270 240 210 180 150 120 90 60


270-300 240-270 210-240 180-210 150-180 120-150 90-120 60-90

200 180 160 140 120 100


200-220 180-200 160-180 140-160 120-140 100-120

0.3

60

0.36

96

0.42

132

0.48

168

0.54

204 204

0.6

240

X3=150 min

X2=0.45

Figura III.18. Cantitatea maxim de cafein eliberat pentru hidrogelurile GCS: maxim A suprafaa de rspuns Cf eliberat estimat, Cf=f(X1, X2) cnd X3=150 a r B - suprafaa de rspuns Cf eliberat estimat, Cf=f(X1, X3) cnd X2=0.45 a r

Cinetica de eliberare a cafeinei indic faptul c majoritatea probelor ating cantitatea indic maxim de cafein eliberat dup dou ore n soluie tampon fosfat iar curbele cinetice eliberat ie sunt tipice pentru sistemele de eliberare controlat prin difuzie. controlat

Studii de reologie Caracteristicile vscoelastice ale materialelor pot fi eficient evaluate cu ajutorul testelor oscilatorii reprezentate prin urmtoarele mrimi: urm a) Modulul de acumulari (G) care este o msur a energiei de deformaie deforma acumulat n prob n cursul procesului de forfecare. Dup ndeprtarea solicitrii aceast forfeca rtarea solicit energie este disponibil, acionnd ca for motoare a procesului de reformare. Deci G , caracterizeaz comportarea elastic a materialului analizat. elastic b) Modulul de pierderi (G) este o msur a energiei de deforma utilizat de deformaie prob n cursul procesului de forfecare i, de aceea, este complet pierdut la ndeprtarea i, pierdut solicitrii. G caracterizeaz comportarea vscoas a materialului [128, 129]. vscoas c) Factorul de pierderi, tan() = G''/G' caracterizeaz contribuiile poriunilor contribu elastice i vscoase n comportarea global a probei analizate. n general, pentru starea i global lichid tan() > 1 (G > G), pentru starea de gel (solid) tan() < 1 (G > G), iar la punctul de tranzitie (gelifiere) tan() = 1 (G = G) [128]. d) Vscozitatea complex * complex, n cazul acestor teste sunt valabile urm urmtoarele relaii : G * = (G' )2 + (G" )2 i * = (' )2 + (" )2
Testele reologice n regim oscilatoriu ofer posibilitatea msurtorilor nedestructive. ofer Astfel, au fost efectuate trei tipuri de teste n regim dinamic: Testul de baleiaj de amplitudine (AS), la o frecven unghiular constant de 10 rads-1, a fost utilizat pentru determinarea limitei domeniului de vscoelasticitate liniar liniar (LVE) i pentru determinarea stabilit i stabilitii mecanice a probei. Figura III.20. prezint variaia G prezint and G pentru dou hidrogeluri (GCS-1 i GCS-3) cu cantiti diferite de agent de reticulare i ionic (vezi Tabelul III.2. i Tabelul III.3.). Amplitudinea a variat ntre 0,01 i 100%. Din i testele de baleiaj de amplitudine au fost selectate valorile deformaiei i a tensiunii aplicate. deforma iei Toate testele au fost efectuate la o temperatura de 37oC (temperatura corpului uman). De obicei, testele de baleiaj de amplitudine sunt folosite doar pentru a determina limitele domeniului de vscoelasticitate liniar (LVR), ns uneori acestea pot aduce informaii cu liniar informa privire la stabilitatea structural i mecanic a probelor analizate, n acest caz a structural hidrogelurilor GCS. Limitele domeniului de vscoelasticitate liniar ofer indicii cu privire la liniar capacitatea gelului de a rezista la sinerez (la suprafaa gelului se formeaz un strat lichid). sinerez a formeaz

Figura III.20. Baleiajul de amplitudine pentru probele GSC-1 i GSC-3

Creterea cantitii de agent de reticulare ionic genereaz valori crescute ale G i ii genereaz G i n consecin mrete limitele LVR, sugernd structuri mai stabile. Pentru a verifica te te

Micro i nanoparticule cu poteniale aplicaii biomedicale i poten

aceast observaie s-au folosit frecven diferite pentru testele de baleiaj de amplitudine. frecvene u Chiar dac o cretere a frecvenei reduce puin limitele LVR, influena general a cantitii tere frecven in influen de agent de reticulare asupra stabilitii mecanice se pstreaz Raportul G/CS are si el stabilit streaz. influen asupra limitelor LVR; creterea raportului G/CS reduce limitele LVR. Pentru o cre terea cretere a acestui raport de la valoarea minim la cea maxim (GCS-9 i GCS-10) se tere minim nregistreaz o scdere semnificativ a LVR (de la 5,0 la 0,1%). dere semnificativ Baleiajul de frecven, adesea folosit ca test standard n reologia polimerilor, ofer frecven ofer informaii utile legate de structura intern i masa molecular a polimerului. n cazul acestor ii intern teste se aplic o tensiune sinusoidal cu o amplitudine constant (caracteristic pentru fiecare prob, ntre limitele LVR) i se variaz frecvena oscilatorie (ntre 10-2 i 102s-1). , a

Figura III.21. Baleiajul de frecven frecven pentru probele GCS-1 GCS-3 i

n Figura III. 21. sunt prezentate comport comportrile G, G i ale vscozitii complexe vscozit (|*|) funcie de frecven pentru aceleai dou probe. Curbele sunt caracteristice pentru ie materialele solide, cu G> G pe un domeniu larg de frecvene. Au fost observate structuri frecvene. stabile de gel pentru toate probele analizate, G i G fiind aproape independente de i frecven pe mai bine de trei decade [129]. Valorile modulului de acumulri i diferenele acumul dintre G and G indic faptul c reeaua hidrogelului este stabil prezint o elasticitate c eaua i ridicat [129]. Gradul crescut de elasticitate a hidrogelurilor este, de asemenea, eviden elasticitate evideniat prin valorile sczute ale tan , n jur de 0,1 pentru toate probele analizate. zute

Figura III.22. Baleiajul de temperatur temperatur pentru probele GCS-1 i GCS-3

Atunci cnd crete cantitatea de agent de reticulare ionic (probele GCS-1 i GCS-3) se observ o cretere a G ceea ce poate indica o cretere a densitii reelei hidrogelului (observaia este valabil i pentru probele GCS-6 i GCS-8 sau probele GCS-11 i GCS12). Testele de baleiaj de temperatur au nceput dup ce proba a fost adus la o temperatur de echilibru de 10oC. Probele au fost apoi nclzite de la 10oC la 40oC cu 0,5oC/min la o frecvena unghiular de 1 s-1 i o tensiune constant n limitele LVR (ntre 0,1 and 5,0 % pentru toate probele). Baleiajul de temperatura (Figura III.22.) indic faptul c hidrogelurile GCS sunt stabile pe domeniul de temperatur ales pentru analiz (10-40C). Pe curba G apare n jurul temperaturii de 37oC un peak care poate indica o reorganizare a reelei, ns acest fenomen va trebui analizat n viitor mai n profunzime. III.1.1.2. Hidrogeluri pe baz de gelatin i chitosan reticulate cu aldehid glutaric i TPP Obiectivul acestui studiu a fost obinerea i caracterizarea unor hidrogeluri pe baz de gelatin i chitosan dublu reticulate cu glutaraldehid i TPP utiliznd un plan experimental centrat rotitor de ordinul II cu trei variabile (Tablelul III.2. cu dou modificri: raportul ntre polimeri este acum CS/G fa de G/CS utilizat n cazul hidrogelurilor reticulate cu AG/Na2SO4, iar agentul de reticulare ionic este TPP-ul) [141]. Prepararea hidrogelurilor a urmrit planul experimental prezentat n Tabelul III.3. (agentul de reticulare ionic este TPP-ul iar codul probelor este nlocuit GCS devine CSG). Caracterizarea acestora a constat n evaluarea morfologiei, caracteristicilor de umflare i ncrcare/eliberare a unor medicamente hidrofile. n acelai timp s-a ncercat utilizarea reelelor neuronale pentru optimizarea principalelor caracteristici ale hidrogelurilor (gradul de umflare n soluie tampon citrat (CBS), gradul de umflare n soluie tampon fosfat (PBS), cantitatea maxim de cafein eliberat n CBS i cantitatea maxim de cafein eliberat n PBS) n funcie de parametrii reaciei (raportul CS/G, cantitatea de agent de reticulare ionic, timpul de reticulare ionic). Modelrile directe i inverse utiliznd reele neuronale permit evaluarea procesului n ambele direcii: se pot efectua predicii pentru valorile caracteristicilor finale ale hidrogelurilor i se pot identifica condiiile iniiale optime care vor conduce la valori finale impuse. S-a propus i utilizat o metod general de modelare, cu posibilitatea de a fi aplicat i altor sisteme complexe dublu reticulate. III.1.1.2.4. Rezultate i discuii Caracteristici structurale Spectrele FTIR pentru cei doi polimeri de plecare i pentru hidrogelurile preparate au evideniat faptul c cele dou tipuri de reticulri au avut loc. Morfologia hidrogelurilor CSG Cu ajutorul microscopiei elecronice de baleiaj s-a putut observa morfologia compact a hidrogelurilor (Figura III.26.), fr pori evideni. Aceast morfologie poate fi atribuit densitii crescute de reticulare avnd n vedere numrul mare de grupri aminice i reactivitatea agentului de reticulare ionic fa de aceste grupri, respectiv funcionalitatea sa ridicat.

Micro i nanoparticule cu poteniale aplicaii biomedicale i poten

Figura III.26. Microscopie electronic de electronic baleiaj pentru proba CSG-2

Gradul maxim de umflare Gradele de umflare ale hidrogelurilor CSG nu au fost foarte mari, comparativ cu cele ale hidrogelurilor GCS.
Gradul maxim de umflare in pH=3
1000 800 600
Qmax (%)

Gradul maxim de umflare in pH=7,4


1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 -1.682 x1 x2 x3

400 200 0 -1.682 x1 x2 x3

x1 x2

Qmax (%)

1.682

x1
x2

1.682

x3

x3

Figura III.27. Gradul maxim de umflare la pH=3 cnd unul din parametri este variabil i ceilali doi sunt constani i constan

Figura III.28. Gradul maxim de umflare la pH=7,4 cnd unul din parametri este variabil i ceilali doi sunt constani i constan

Gradul maxim de umflare (Qmax) determinat n mediul slab bazic (pH=7,4) (Figura III.28.) a fost, n general, mai mic comparativ cu cel m msurat n mediul acid (pH = 3) (Figura III.27.), cu o excep ie n cazul probelor cu un raport CS/G sczut, adic o excepie sc cantitate crescut de G n amestecul ini ial. n mediul alcalin se formeaz anionii iniial. carboxilat din protein care vor determina respingeri electrostatice i vor permite ptrunderea soluiilor apoase n reea. iilor re Gradul maxim de umflare n mediul acid cre crete cu creterea cantitii de agent de terea cantit reticulare iar n mediul bazic cantitatea de agent de reticulare ionic nu are o influen cantitatea ionic notabil asupra Qmax. Remunan-Lopez Bodmeier au raportat faptul c filmele chitosan-TPP sunt i sensibile n mediul acid, se umfl foarte tare i n final se dizolv [146]. Aceast umfl i dizolv observaie ne ajut s nelegem de ce gradele de umflare ale hidrogelurilor cresc o nelegem dat cu creterea cantitii de agent de reticulare ionic. n cazul utilizrii unei cantiti terea cantit . utiliz mici de agent de reticulare, dup 24 de ore n mediul acid, hidrogelul ncepe deja s se dup s dizolve. n cazul utilizrii unei cantiti crescute de TPP vom avea o reea mult mai rii cantit i re dens i deci desfacerea tuturor legturilor ionice va necesita un timp mai lung de 24 de i leg turilor ore n mediul acid.

Timpul de reticulare ionic nu manifest o influen semnificativ asupra gradului maxim de umflare a hidrogelurilor CSG n mediul bazic; reactivitatea crescut a TPPului face ca reticularea s aib loc n primele 60 minute. Capacitatea de ncrcare/eliberare a Cafeinei Eficiena de eliberare a Cafeinei a avut valori crescute n mediul alcalin, ntre 83 i 94%, i valori medii n acid, ntre 46 i 62%. Cantitatea maxim de cafein eliberat dup 24 h din hidrogelurile CSG n mediul bazic a fost cuprins ntre 17 - 115 mg/g hidrogel iar n mediul acid ntre 9 - 59 mg/g hidrogel. Comportarea hidrogelurilor CSG la eliberarea unui medicament model, hidrofil, a fost similar cu comportarea acestora la umflare att n mediul bazic ct i n mediul acid. Cantitatea maxim de Cafein eliberat n mediul acid a fost mai mic comparativ cu cantitatea eliberat n mediul bazic.
70
Cf eliberata /g hidrogel

70 60
Cf eliberata /g hidrogel

60 50 40 30 20 10 0 0 50 100 150 200 250 300 Timp (min)


CSG-9 CSG-10 CSG-15

Cf eliberata /g hidrogel

50 40 30 20 10 0 0 50 100 150 200 Timp (min)

CSG-11 CSG-12 CSG-15

70 60 50 40 30 20 10 0
CSG-13 CSG-14 CSG-15

250 300

50

100 150 200 250 300 Timp (min)

Figura III.32. Cinetica de eliberare a cafeinei la pH=3 pentru hidrogelurile: A CSG-9, CSG-10,CSG-15; B CSG-11, CSG-12, CSG-15; C CSG-13, CSG-14, CSG-15.

Modelarea cu ajutorul reelelor neuronale Modelarea cu ajutorul reelelor neuronale are drept scop stabilirea influenei condiiilor de reacie asupra caracteristicilor finale ale hidrogelurilor. Prin urmare, reeaua proiectat are ca variabile de intrare: x1 - CS/G (g/g), x2 - moli TPP/ 2 moli NH2 libere, x3 timpul de reticulare ionic (minute), iar ca variabile de ieire: y1 gradul maxim de umflare n PBS (pH = 7.4) (SDPBS) (%), y2 gradul maxim de umflare n CBS (pH = 7.4) (SDCBS) (%), y3 cantitatea maxim de cafein eliberat n PBS (CfPBS) i y4 - cantitatea maxim de cafein eliberat n CBS (CfCBS). Fiecare ieire este corelat prin modelare cu cele trei intrri i, de aceea, au fost proiectate patru modele. Modelele neuronale s-au obinut prin antrenri bazate pe date reprezentate de perechi intrare/ieire, urmrindu-se realizarea valorilor impuse ca ieiri. Corecia ntre prediciile reelelor neuronale i datele experimentale (procesul de nvare sau antrenare) se bazeaz pe o procedur de regresie neliniar. Antrenarea presupune evaluarea ieirilor reelei i calcularea abaterii fa de datele experimentale. Cnd aceste abaterile devin prea mari, trebuiesc ajustate ponderile neuronilor, iar procesul reia evaluarea ieirilor reelei. O problem major n proiectarea modelelor cu ajutorul reelelor neuronale este determinarea arhitecturii reelei, reprezentat prin numrul straturilor ascunse i numrul neuronilor de pe fiecare strat ascuns. Se utilizeaz metoda ncercare i eroare

Micro i nanoparticule cu poteniale aplicaii biomedicale

pentru testarea ctorva topologii (arhitecturi ale reelei) i pentru compararea abaterilor prediciilor. Abaterile minime indic o arhitectur corespunztoare, cu poteniale rezultate bune n fazele de antrenare i validare. Rezultatele antrenrii reelelor neuronale sunt evaluate pe baza abaterii medii ptratice (MSE), corelaiei (r) (concordana ntre datele experimentale i prediciile reelei neuronale) i eroarea procentual (Ep). n cazul procesului abordat, cele mai bune performane au fost nregistrate de MLP(3:5:1), o reea de tip percepron multistrat, cu trei neuroni n stratul de intrare corespunztor celor trei variabile de intrare (x1, x2, x3), un strat ascuns cu 5 neuroni i un strat de ieire cu un neuron pentru y1, y2, y3 i y4 (n cazul celor 4 modele neuronale). Chiar dac numrul datelor experimentale nu este prea mare, s-a putut obine un model bun de reea neuronal deoarece datele sunt uniform distribuite pe domeniul analizat. Experimentele au fost planificate astfel nct s se pregteasc un numr minim de probe, dar care s acopere uniform ntreaga arie investigat. Pentru acest studiul s-au folosit reele neuronale feedforward (cu reacie pozitiv) cu o arhitectur (3:5:1). Acestea au fost obinute prin metoda ncercrilor succesive i au fost antrenate cu binecunoscutul algoritm backpropagation. Performanele obinute n faza de antrenare, respectiv MSE, r i Ep sunt prezentate n tabelul III.6. Tabelul III.6. Performanele reelelelor neuronale n faza de antrenare Parametri de ieire SDPBS (y1) SDCBS (y2) CfPBS (y3) CfCBS (y4)
1600 1400 1200

MSE 0,00021 0,000055 0,00067 0,000048


120

r 0,99942 0,99979 0,98087 0,99997

Ep % 1,4932 0,56361 2,16925 0,66138

Y1_experimental Y1_retea neuronala


100

Y3_experimental Y3_retea neuronala

80
1000

Y1

800 600

Y3

60

40
400 200 0

20

7 8 Probe

10 11 12

13 14 15

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Probe

Figura III.36. Valorile experimentale SDPBS (y1) comparate cu rezultatele reelei neuronale pentru etapa de antrenare

Figura III.37. Valorile experimentale CfPBS (y1) comparate cu rezultatele reelei neuronale pentru etapa de antrenare

Valorile prezise de reeaua neuronal sunt n concordan cu valorile experimentale pentru toi cei patru parametri, ceea ce demonstraz c modelul

neuronal a nvat bine comportamentul procesului. Figurile III.36. i III.37. prezint dou exemple pentru parametrii de ieire SDPBS (y1) i CfPBS (y3).
520 500 1000 950

y2 retea neuronala
400 420 440 460 480 500 520

y1 retea neuronala

900 850 800 750 700 650 600 600 650 700 750 800 850 900 950 1000

480 460 440 420 400

y1 experimental

y2 experimental

60

47 45

y3 retea neuronala

y4 retea neuronala
35 40 45 50 55 60

55 50

43 41 39 37 35 35 37 39 41 43 45 47

45 40 35

y3 experimental

y4 experimental

Figura III.38. Datele experimentale comparate cu rezultatele reelei neuronale pentru faza de validare

Principalul avantaj al reelelor neuronale const n capacitatea acestora de a generaliza, respectiv de a furniza predicii fa de valori de intrare pe care nu le-a vazut nc. ase probe experimentale au fost pstrate pentru etapa de validare pentru a verifica dac modelul neuronal prezint capacitate de generalizare. n Figura III.38. este prezentat comparaia ntre datele experimentale (neincluse n setul de antrenare) i prediciile modelului MLP(3:5:1) pentru toate ieirile reelelor neuronale. O eroare maxim relativ de 6 % arat faptul c prediciile modelelor neuronale sunt corecte. n consecin, modelele neuronale pot fi folosite pentru a face predicii pentru date de intrare neincluse n setul experimental, nlocuind experimente sau furniznd informaii practicii experimentale. Modelarea neuronal direct permite estimarea cantitii de cafein eliberat i a gradului de umflare pentru diferite condiii de reacie. Informaii suplimentare se pot obine prin modelare neuronal invers, aceasta fiind o problem de optimizare ce const n identificarea condiiilor de reacie care conduc la valori finale impuse pentru y1, y2, y3 sau y4. Pot fi formulate diverse probleme de optimizare pentru a fi rezolvate cu ajutorul modelrii neuronale inverse.

Micro i nanoparticule cu poteniale aplicaii biomedicale

De exemplu, dac avem x2 (moli TPP/ 2 moli NH2), x3 (timpul de reticulare ionic) i y1 (gradul de umflare n PBS) impuse, se poate afla x1 (CS/G). O reea neuronal care rspunde la o asemenea problem are ca valori de intrare x2, x3 i y1 i ca valoare de ieire x1. Mai multe teste n modelarea neuronal invers au condus la o arhitectur optim de tipul MLP (3:12:4:1) cu MSE = 0.000006, r = 0.99991 i Ep = 0.181415 % pentru faza de antrenare. n Figura III.39. sunt prezentate predictiile modelului MLP (3:12:4:1) pentru o serie de date pentru care modelul nu tie rspunsurile experimentale (faza de validare).
6.50

6.00

X1 retea neuronala

5.50

5.00
4.50

4.00
3.50

Figura III.39. Validarea modelului neuronal invers: datele experimentale comparate cu prediciile reelei neuronale pentru date nevzute de reea

3.00
3,00 3.50 4,00 4.50 5,00 5.50

6,00

6.50

x 1 experimental

Un alt exemplu este reprezentat de urmtoarea problem: dac avem x1 (CS/Gel), x3 (timpul de reticulare) i y3 (cantitatea de cafein eliberat n PBS) impuse se poate afla x2 (moli TPP/ 2 moli NH2). Rspunsul la ntrebarea de mai sus este dat de o reea neuronal cu dou straturi ascunse de tipul MLP(3:33:11:1), cu x1, x3 i y3 intrri ale reelei i x2 ieirea modelului. Rezultatele simulrii sunt n concordan cu datele experimentale (Figura III.40.), avnd o eroare relativ maxim de 9%.
x2 experimental x2 retea neuronala
0.5

Figura III.40. Datele experimentale i prediciile reelei neuronale pentru faza de validare a modelrii inverse

moli TPP/ 2 moli NH2

0.4

0.3

0.2

0.1

0 0.45 0.45 0.4055 0.4945 0.45 0.45

Datele de validare

III.1.2. Imobilizarea lipozomilor n hidrogeluri pe baz de chitosan i gelatin Dup cum s-a observat n cadrul subcapitolului anterior, hidrogelurile pe baz de G i CS prezint grade de umflare i capaciti de includere/eliberare ridicate, bineneles n funcie de cantitatea i de tipul agentului de reticulare ionic utilizat. n schimb, aceste tipuri de hidrogel nu se preteaz la eliberarea pe termen lung a principiului activ tocmai datorit proprietilor enunate anterior. n partea bibliografic, au fost prezentate i dezavantajele lipozomilor din punctul de vedere al utilizrii lor ca sisteme de eliberare controlat. Printre acestea, cel mai important din punct de vedere al studiului efectuat, l constituie stabilitatea lipozomilor n timp. n cadrul acestui subcapitol s-a studiat posibilitatea controlului eliberrii principiului activ din sisteme complexe de tip hidrogel lipozomi. Pentru comparaie au fost studiate dou tipuri de hidrogeluri hidrogeluri pe baz de G i CS dublu reticulate cu AG i Na2SO4 i hidrogeluri pe baz de G i CS dublu reticulate cu AG i TPP, ambele tipuri preparate dup un plan experimental centrat, rotitor, compus, de ordinul II cu trei variabile. Din punctul de vedere al lipozomilor analizai, a fost studiat un singur tip de lipozomi din punct de vedere morfologic, i anume: lipozomi multilamelari mari (Multilamelar Vesicles - MLV) i dou tipuri de lipozomi diferii din punct de vedere al compoziiei acestora. Principalele direcii de cercetare ale acestui studiu au fost: studiul stabilitii lipozomilor imobilizai n filmele polimere i capacitatea sistemelor polimeri lipozomi de a elibera principiul activ. III.1.2.2.1. Prepararea lipozomilor Pentru imobilizarea lipozomilor n hidrogeluri polimere au fost preparate n scopul comparrii dou tipuri de lipozomi multilamelari (MLV) ce difer prin compoziiile de plecare, i anume: MLV-uri cu o compoziie de plecare pe baz de PC MLV-uri cu o compoziie de plecare pe baz de PC/Chol (raport molar 2:1) Pentru prepararea lipozomilor multilamelari a fost utilizat metoda hidratrii filmelor lipidice [148], aceasta fiind una dintre cele mai utilizate tehnici de obinere a acestui tip de lipozomi. III.1.2.2.2. Prepararea sistemelor complexe de tipul polimer-lipozomiprincipiu activ Sistemele polimer-lipozomi au fost realizate sub form de hidrogeluri n care au fost imobilizai lipozomi de tip MLV ncrcai cu calcein. Au fost alese cte patru probe din fiecare set de hidrogeluri prezentate n primele dou subcapitole, dup cum urmeaz: Tabelul III.7. Codul sistemelor de tip polimer-lipozomi Agent de Agent de Cod prob Cod prob reticulare ionic reticulare ionic GCS-3-L CSG-3-L GCS-10-L CSG-10-L Na2SO4 TPP GCS-12-L CSG-12-L GCS-15-L CSG-15-L

Micro i nanoparticule cu poteniale aplicaii biomedicale i poten

Prepararea hidrogelurilor a urmat acelai protocol ca cel prezentat n primele acela i dou subcapitole, cu meniunea c toate cantitile au fost reduse de 4 ori (de exemplu, men ile n loc de 0,5g vom avea 0,125g amestec polimeri). Pentru obinerea sistemelor complexe de tipul polimer-lipozomi, o suspensie de lipozomi n ap a fost adugat n fiecare soluie de polimeri naintea aldehidei glutarice [149]. ie III.1.2.4. Rezultate i discuii n cadrul acestui subcapitol vor fi prezentate rezultatele obinute n urma ob preparrii unui sistem complex de tipul polimer-lipozomi-principiu activ. Se va face rii referire att la caracterizarea lipozomilor ct i a sistemului complex din diferite puncte i de vedere. Determinarea dimensiunii lipozomilor Dimensiunile lipozomilor multilamelari att pentru cei pe baz de PC ct i pentru baz cei pe baz de PC/Chol sunt prezentate n Tabelul III.8. Tabelul III.8. Diametrul mediu al lipozomilor

Compoziia lipozomilor PC PC/Chol

Diametrul mediu al MLV-urilor (m) 1,0500,237 2,4070,217

Lipozomii de tip MLV sunt vezicule mari cu dimensiuni ce variaz n funcie de variaz compoziia acestora, lipozomii din PC/Chol sunt mai mari dect cei numai din PC. ia dect Studiul distribuiei lipozomilor n filmele polimere Aceste studii au fost realizate cu ajutorul microscopiei confocale de fluorescen, fluorescen cu ajutorul creia s-a putut pune n eviden prezena lipozomilor n interiorul matricilor eviden a polimere. Au fost preparai lipozomi n care a fost inclus rodamina, ca principiu fluorescent i inclus hidrofob, pentru a se evita difuzia acestuia n afara lipozomilor i modificarea proprietilor fluorescente ale ntregului sistem. Aceti lipozomi au fost apoi imobilizai n ilor Ace ti hidrogelurile polimere. Pentru comparaie s-au preparat i probe-martor fr lipozomi compara imobilizai. Imaginile de fluorescen au fost fcute pe seciuni de hidrogel de ~ 100 m fluorescen iuni grosime, n stare uscat, la o m rire de x10. n Figura III.54.A este prezentat imaginea mrire de fluorescen a lipozomilor MLV imobilizai n hidrogelul CSG-3. Lipozomii sunt imobiliza i omogen distribuii n aproape toat masa hidrogelului. i toat

Figura III.54. Imagini de fluorescen fluorescen pentru lipozomi MLV imobilizai n imobiliza hidrogelul CSG-3 (A) comparativ cu hidrogelul martor CSG-3 (B) pentru o mrire x10 m

Studiul capacitii de eliberare a calceinei din sistemele complexe polimerlipozomi-principiu activ Calceina, un principiu activ hidrofil, a fost inclus n lipozomi mari de tip MLV de diferite compoziii (PC i PC/Chol). Lipozomii ncrcai cu calcein au fost apoi imobilizai n hidrogeluri pe baz de gelatin i chitosan dublu reticulate. Comportamentul hidrogelurilor fr lipozomi a fost studiat n cele dou subcapitole anterioare. Acestea au prezentat grade de umflare ridicate, n funcie de compoziie i agentul de reticulare ionic utilizat, i cantiti crescute de cafein ncrcate/eliberate. Cinetica de eliberare a principiului activ hidrofil a indicat faptul c acesta a fost eliberat aproape complet dup 2-3 ore de la imersarea hidrogelurilor ncrcate n soluii apoase cu pH diferit. Pentru a surmonta acest dezavantaj al hidrogelurilor s-a recurs la realizarea sistemului complex polimer-lipozomi-principiu activ. n acest fel s-a ncercat i rezolvarea problemei legat de instabilitatea lipozomilor n timp.
30 calceina eliberata (%) 25 20 15 10 5 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Timp (zile) GCS-3 (PC) GCS-10 (PC) calceina eliberata (%) GCS-12 (PC) GCS-15 (PC) 30 25 20 15 10 5 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Timp (zile) GCS-3 (PC/CHOL) GCS-10 (PC/CHOL) GCS-12 (PC/CHOL) GCS-15 (PC/CHOL)

Figura III.56. Cinetica de eliberare a calceinei n pH=7,4 pentru hidrogelurile pe baz de G i CS dublu reticulate cu AG/Na2SO4 ncrcate cu lipozomi din PC (A) i PC/CHOL (B)
12 10 calceina eliberata (%) 8 6 4 2 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Timp (zile) CSG-3 (PC) CSG-10 (PC) CSG-12 (PC) CSG-15 (PC) 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Timp (zile) 12 10 8 6 4 2 CSG-3 (PC/CHOL) CSG-10 (PC/CHOL) CSG-12 (PC/CHOL) CSG-15 (PC/CHOL)

calceina eliberata (%)

Figura III.57. Cinetica de eliberare a calceinei n pH=7,4 pentru hidrogelurile pe baz de G i CS dublu reticulate cu AG/TPP ncrcate cu lipozomi din PC (A) i PC/CHOL (B)

Micro i nanoparticule cu poteniale aplicaii biomedicale

n hidrogelurile GCS (reticulate cu AG i Na2SO4) i hidrogelurile CSG (reticulate cu AG i TPP) au fost imobilizai lipozomi mari de tipul MLV cu compoziii diferite (PC i PC/Chol) ncrcai n prealabil cu calcein. Cinetica de eliberare a calceinei din aceste hidrogeluri este prezentat n Figura III.56. i Figura III.57. Din curbele cineticii de eliberare se poate observa c eliberarea calceinei este influenat att de compoziia hidrogelurilor i tipul agentului de reticulare ionic ct i de compoziia lipozomilor. Influena compoziiei este similar cu cea descoperit n cazul eliberrii unui principiu activ hidrofil din filmele martor pe baz de G i CS dublu reticulate (Capitolul III.1.1.1. i Capitolul III.1.1.2.). Filmele reticulate ionic cu TPP elibereaz mai greu lipozomii/calceina iar acest lucru se datoreaz reactivitii crescute a TPP comparativ cu Na2SO4. Lipozomii ce au n compoziia iniial PC/CHOL sunt mai stabili [153], i elibereaz mai greu calceina. Cantitile reduse de principiu activ hidrofil eliberat comparativ cu cele msurate pentru filmele martor, constituie dovada faptului c lipozomii au rmas intaci n timpul proceselor de reticulare a G i CS. Determinarea integritii lipozomilor Lipozomii aflai n straturile superficiale ale hidrogelului sunt eliberai treptat n mediul apos n care este imersat hidrogelul. O parte din aceti lipozomi se destabilizez elibernd astfel principiul activ. ns nu numai lipozomii eliberai n mediul apos se pot destabiliza ci i cei aflai nc n interiorul reelei polimere iar principiul activ este n acest caz eliberat prin difuzie din hidrogel. Procentele de calcein eliberat, calculate nainte i dup adugarea detergentului (Triton X-100), pentru proba GCS-10-L sunt reprezentate n Figura III.58. Integritatea lipozomilor din afara hidrogelurilor pe baz de G i CS dublu reticulate cu AG/Na2SO4 i AG/TPP a fost calculat i este reprezentat n Figura III.59 i Figura III.60.
20 18
calceina eliberata (%)

16 14 12 10 8 6 4 2 0 0 10 20 30 Timp (zile) 40 50 60 GCS-10 (PC) - IT GCS-10 (PC) - DT GCS-10 (PC/CHOL) - IT GCS-10 (PC/CHOL) - DT

Figura III.58. Procentele de calcein eliberat, calculate nainte i dup adugarea detergentului, pentru proba GCS-10-L

Dup 60 de zile se nregistreaz o scdere considerabil, pn la 1-2%, a parametrului de integritate lipozomal ceea ce indic faptul c lipozomii ce au fost eliberai din matricile polimere s-au dezintegrat aproape n totalitate, astfel cantitile de

calcein calculate nainte i dup adugarea detergentului sunt foarte apropiate ca valoare (Figura III.58.).
parametrul de integritate lipozomala (%) Parametrul de integritate lipozomala (%) 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Timp (zile) GCS-3 (PC) GCS-10 (PC) GCS-12 (PC) GCS-15 (PC) 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Timp (zile) GCS-3 (PC/CHOL) GCS-10 (PC/CHOL) GCS-12 (PC/CHOL) GCS-15 (PC/CHOL)

Figura III.59. Variaia parametrului de integritate lipozomal pentru hidrogelurile pe baz de G i CS dublu reticulate cu AG/Na2SO4 ncrcate cu lipozomi din PC (A) i PC/CHOL (B)

Parametrul de integritate lipozomal este mai mic pentru hidrogelurile dublu reticulate cu AG/TPP (Figura III.60.) comparativ cu cel al hidrogelurilor dublu reticulate cu AG/Na2SO4 (Figura III.59.), demonstrnd astfel c lipozomii se dezintegreaz n interiorul hidrogelului iar calceina este apoi eliberat prin difuzie. Colesterolul are influen asupra stabilitii lipozomilor, fapt demontrat de valorile mai mari ale parametrului de integritate pentru lipozomii ce au n compoziie PC/CHOL.
Parametrul de integritate lipozomala (%) 16 parametrul de integritate lipozomala (%) 14 12 10 8 6 4 2 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Timp (zile) CSG-3 (PC) CSG-10 (PC) CSG-12 (PC) CSG-15 (PC) 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Timp (zile) CSG-3 (PC/CHOL) CSG-10 (PC/CHOL) CSG-12 (PC/CHOL) CSG-15 (PC/CHOL)

Figura III.60. Variaia parametrului de integritate lipozomal pentru hidrogelurile pe baz de G i CS dublu reticulate cu AG/TPP ncrcate cu lipozomi din PC (A) i PC/CHOL (B)

Micro i nanoparticule cu poteniale aplicaii biomedicale

Mecanismul de eliberare a calceinei din sistemele complexe de tipul polimer-lipozomi-principiu active Lipozomii ncrcai cu calcein ce se afl la suprafaa hidrogelului i care au dimensiuni corespunztoare pentru a iei prin porii reelei (dup umflare) sunt eliberai din hidrogel iar n acest caz calceina este eliberat dup dezintegrarea lipozomilor. Restul de calcein va rmne n matricea polimer (n compartimentul apos al veziculelor) pn cnd o parte din lipozomi se vor dezintegra, caz n care calceina va fi eliberat prin difuzie din hidrogel, sau pn cnd hidrogelul se va descompune. Compoziia hidrogelului precum i dimensiunea veziculelor nglobate n hidrogel sunt parametri importani ce influeneaz eliberarea calceinei din sistemele complexe studiate. III.2. Hidrogeluri dublu reticulate pe baz de chitosan i PAV utilizate pentru imobilizarea lipozomilor n acest subcapitol vor fi prezentate obinerea i caracterizarea unor sisteme complexe polimer-lipozomi-principiu activ cu poteniale aplicaii biomedicale. Suportul polimeric este constituit din hidrogeluri dublu reticulate (reticulare covalent urmat de reticulare ionic) pe baz de chitosan i poli(alcool vinilic). Lipozomii imobilizai n matricea polimer sunt reprezentai de dou tipuri MLV-uri diferii din punct de vedere al compoziiei acestora. III.2.1. Hidrogeluri pe baz de PAV i chitosan reticulate cu aldehid glutaric i sulfat de sodiu sau tripolifosfat de sodiu n cadrul acestui subcapitol a fost studiat influena parametrilor variabili (raportul masic CS/PVA), tipul i concentraia agentului de reticulare ionic) asupra morfologiei hidrogelurilor, a proprietilor de umflare, a capacitilor de ncrcare/eliberare a cloramfenicolului. Obinerea hidrogelurilor pe baz de CS i PAV prin dubl reticulare (covalent i ionic) are loc datorit reaciei dintre gruprile carbonil ale glutaraldehidei i gruprile aminice libere ale CS precum i gruprile hidroxil ale PAV i a interaciunilor dintre anionii sulfat i gruprile aminice protonate ale chitosanului. III.2.1.2. Metoda de preparare a hidrogelurilor Cantiti corespunztoare de CS i PAV (rapoarte masice diferite - Tabelul III.10.) au fost dizolvate n soluie de acid acetic 2% (v/v) la temperatura camerei [171]. Cantitatea specific de AG necesar pentru a reticula 20% dintre gruprile aminice i hidroxilice libere a fost adaugat, n picturi, sub agitare energic, peste soluia de polimeri. Cantitatea minim optim de AG pentru ca filmele s fie stabile a fost fixat n urma unor teste preliminarii. Amestecul obinut a fost transferat cu grij n Petri-uri cu diametrul de 90 mm, ultrasonicat pentru a se ndeprta aerul i a evita astfel formarea de goluri, i apoi introduse n etuv timp de 1 or, la o temperatur de 50 C. Hidrogelurile reticulate covalent au fost apoi imersate n soluii apoase de Na2SO4/TPP de concentraii diferite (Tabelul III.10.) i meninute acolo 30 minute. Ulterior, probele au fost splate succesiv cu aceton i ap bidistilat pentru a elimina produii nereacionai; hidrogelurile au fost uscate prin liofilizare i pstrate n exicatoare.

Tabelul III.10. Planul experimental utilizat pentru obinerea hidrogelurilor


Codul probei CPN-1 CPN-2 CPN-3 CPN-4 CPN-5 CPN-6 CPN-7 CPN-8 CPN-9 CPN-10 CPT-1 CPT-2 CPT-3 CPT-4 CPT-5 CPT-6 CPT-7 CPT-8 CPT-9 CPT-10 1 1 1 0,5 Masa amestecului de polimeri (g) % CS 95 90 85 80 75 95 90 85 80 75 95 90 85 80 75 95 90 85 80 75 % PAV 5 10 15 20 25 5 10 15 20 25 5 10 15 20 25 5 10 15 20 25 50 mL, 3%(w/w) 50 mL, 1%(w/w) 50 mL, 3%(w/w) 25 mL, 3%(w/w) Na2SO4 TPP

III.2.1.4. Rezultate i discuii Amestecul celor doi polimeri a fost supus mai nti unei reticulri covalente prin intermediul aldehidei glutarice. Reacia cu AG are loc att la gruprile aminice situate de-a lungul catenei chitosanului, cu formarea legturilor iminice, ct i la gruprile hidroxil ale poli(alcoolului vinilic) cu formarea unor noi legturi de tip acetal. Reticularea covalent este urmat de o reticulare ionic cu sulfatul de sodiu sau tripolifosfatul de sodiu. La aceast reacie particip gruprile funcionale de tip -NH2, aflate sub forma ionului amoniu, aparinnd chitosanului. Caracteristici structurale Produii de reticulare au fost analizai prin spectroscopie FTIR. Reticularea covalent a chitosanului a fost demonstrat de prezena benzii de absorbie caracteristic legturilor iminice la 1633 cm-1 n cazul hidrogelurilor CPN i la 1638 cm-1 n cazul hidrogelurilor CPT. Benzile de absorbie de la 1101 cm-1 din spetrul hidrogelurilor CPN, i de la 1062 -1 cm din spectrul hidrogelurilor CPT sunt caracteristice legturilor de tip acetal, prezena lor justificnd reticularea covalent a poli(alcoolului vinilic).

Micro i nanoparticule cu poteniale aplicaii biomedicale i poten

Reticularea ionic a fost confirmat de prezena peak-ului de absorbie specific absorb pentru SO4-2 (~ 616 cm-1) [127] n cazul hidrogelurilor CPN i de prezena peak-ului de prezen absorbie caracteristic leg legturii asimetrice P-O-P (~893 cm-1) n cazul hidrogelurilor CPT. Caracteristici morfologice Structura hidrogelurilor pe baz de CS i PAV dublu reticulate a fost pus n baz i pus eviden cu ajutorul microscopiei elecronice de baleiaj (Figura III.65.).

Figura III.65. Micrografii electronice pentru probele CPN-3 (A) i CPT-1 (B)

Structurile ambelor tipuri de hidrogeluri sunt omogene i poroase; porozitatea ridicat poate fi pus pe seama uscrii prin liofilizare. usc Determinarea con coninutului de azot din compoziia hidrogelurilor ia Aa cum era de ateptat coninutul de azot din hidrogeluri scade o dat cu a a inutul dat creterea cantitii de PAV n amestecul ini ial. Este evident faptul c PAV-ul particip ii iniial. c activ la reacia de reticulare covalent formnd mpreun cu chitosanul o reea polimer ia covalent re interpenetrat de tip interconectat.
65
% CS in hidrogel

60

55

50

CPN I CPT II

45 70 75 80 85 90 % CS in amestecul initial 95 100

Figura III.66. Influena compoziiei iniiale a amestecului de polimeri asupra compoziiei a compozi iale compozi hidrogelurilor

Se observ o diferen ntre coninutul de azot din hidrogelurile reticulate cu diferen inutul sulfat de sodiu i cele reticulate cu tripolifosfat de sodiu, pentru acelai raport de i acela polimeri n amestecul iniial, diferen ce provine din structura celor doi agen de ini ageni reticulare.

Gradul maxim de umflare Cinetica de umflare a hidrogelurilor (Figura III.67.) evideniaz faptul c att evideniaz cantitatea de PAV din amestecul ini iniial ct i tipul i concentraia agentului de reticulare ia influeneaz gradul de umflare. Hidrogelurile reticulate cu AG/Na2SO4 ating gradul maxim de umflare dup dup aproximativ 4 ore n PBS (Figura III.67.A.) n timp ce hidrogelurile reticulate cu AG/TPP se umfl mult mai repede, acestea atingng gradul maxim de umflare dup numai 2 ore dup (Figura III.67.B.).
9000 8000 7000 6000
Q (%)

1800 1600 1400 1200


Q (%)

5000 4000 3000 2000 1000 0 0 50 100 150 200 250 Timp (min) CPN-1 CPN-5 CPN-6 CPN-10 300 350

1000 800 600 400 200 0 0 50 100 150 200 250 CPT-1 CPT-3 CPT-6 CPT-10 300 350

Timp (min)

Figura III.67. Cinetica de umflare n PBS pentru hidrogelurile CPN (A) i CPT (B)

10000 8000
Q max (%)

2000
Q max (%)

1500 1000 500 0

6000 4000 2000 0

B
Figura III.68. Gradul maxim de umflare n PBS pentru hidrogelurile CPN (A) i CPT (B)

Cantitatea de PAV n amestecul ini iniial are i ea o influen pozitiv asupra i gradului de umflare; o cretere a cantitii de PAV n amestecul ini conduce la o tere cantit ii iniial cretere a gradului maxim de umflare a hidrogelurilor (Figura III.68.). Sc tere Scderea cantitii de chitosan n amestecul iniial de polimeri face ca densitatea de reticulare a reelei s ial re se reduc, reducndu-se numrul punilor de reticulare ionic. num Influena agentului de reticulare este evident i datorit faptului c hidrogelurile a evident c reticulate ionic cu TPP au grade de umflare mult mai mici comparativ cu cele reticulate cu Na2SO4 (Figura III.68.). Cantitatea de agent de reticulare ionic are de asemenea ionic influen asupra gradului de umflare; o cantitate crescut de agent de reticulare crete crescut cre densitatea reelei inducnd n acest fel un gradul de umflare sczut (Figura III.68.B.). elei sczut

Micro i nanoparticule cu poteniale aplicaii biomedicale i poten

De asemenea, s-a observat c o cretere n grosime a hidrogelurilor a crescut i c tere gradul de umflare (Figura III.68.A.). Grosimea hidrogelurilor a fost modificat prin modificat dublarea cantitilor de polimeri i ageni de reticulare cu pstrarea aceluiai tip de Petri ilor strarea aceluia (90 mm diametru) pentru prepararea acestuia. Acest lucru se datoreaz n principal datoreaz difuziei mai rapide a agentului de reticulare ionic n interiorul reelei n cazul unei grosimi reelei mai mici.
Capacitatea de nc ncrcare/eliberare a cloramfenicolului

Cantitatea de cloramfenicol nc ncrcat/eliberat n cazul hidrogelurilor pe baz de baz chitosan i poli(alcool vinilic) este redat n Figura III.69. i redat
400 350 300 250 200 150 100 50 0
mg CHL incarcat/g hidrogel mg CHL eliberat/g hidrogel

120 100 80 60 40 20 0

mg CHL incarcat / g hidrogel mg CHL eliberata/ g hidrogel

Figura III.69. Cantitatea de CHL nc ncrcat/eliberat pentru hidrogelurile CPN (a) i CPT (b)

Cantitatea de cloramfenicol ncrcat/eliberat (Figura III.69.) urmrete aceleai urm variaii i este influenat de aceeai parametri ca i gradul maxim de umflare. at i Cinetica de eliberare a cloramfenicolului n soluie tampon fosfat (pH=7,4) pentru solu ie o parte din hidrogelurile pe baz de CS i PAV este prezentat n Figura III.70. baz
mg CHL eliberata / g hidrogel

450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 0 50

mg CHL eliberata /g hidrogell

CPN-1 CPN-5 CPN-6 CPN-10

120 100 80 60 40 20 0 0

CPT-1 CPT-5 CPT-6 CPT-10

100

150

200

250

300

350

50

100

150

200

250

300

350

Timp (min)

Timp (min)

Figura III.70. Cinetica de eliberare a CHL n PBS pentru hidrogelurile CPN (a) i CPT (b)

Cantitatea de PAV din amestecul ini iniial, tipul i concentraia agentului de concentra reticulare influeneaz cantitatea de cloramfenicol eliberat n aceeai manier ca i cl aceea gradul de umflare al hidrogelurilor. Cinetica de eliberare urmre aceleai reguli de urmrete variaie ca i cinetica de umflare ceea ce demonstreaz caracterul difuzional al eliberrii i demonstreaz eliber cloramfenicolului la pH=7,4. Cinetica de eliberare a cloramfenicolului (Figura III.70.) indic faptul c indic majoritatea probelor ating cantitatea maxim eliberat dup dou ore n soluie tampon maxim fosfat pentru hidrogelurile CPT i patru ore pentru hidrogellurile CPN. i

III.2.2. Imobilizarea lipozomilor n hidrogeluri pe baz de chitosan i poli(alcool vinilic) Dup cum s-a observat n cadrul subcapitolului anterior, hidrogelurile pe baz de CS i PAV prezint grade de umflare i capaciti de includere/eliberare ridicate, n funcie de cantitatea i de tipul agentului de reticulare ionic utilizat dar i n funcie de raportul masic dintre CS i PAV n amestecul iniial. Aceste tipuri de hidrogel nu prezint potenial pentru eliberarea pe termen lung a principiului activ tocmai datorit proprietilor enunate anterior. Ca i n cazul hidrogelurilor pe baz de G i CS s-a ncercat surmontarea acestor dezavantaje prin includerea de lipozomi n aceste sisteme n timpul preparrii, chiar nainte de adugarea agentului de reticulare covalent. Au fost imobilizai n matricile polimere dou tipuri de lipozomi multilamelari (MLV) ce difer prin compoziiile de plecare: PC i PC/Chol (raport molar 2:1). III.2.2.2.2. Prepararea sistemelor complexe de tipul polimer-lipozomiprincipiu activ Sistemele polimer-lipozomi au fost realizate sub form de hidrogeluri pe baz de chitosan i poli(alcool vinilic) n care au fost imobilizai lipozomi de tip MLV ncrcai cu calcein. Au fost alese cte patru probe din fiecare set de hidrogeluri prezentate n subcapitolul anterior, dup cum urmeaz: Tabelul III.12. Codul sistemelor de tip polimer-lipozomi Cod prob CPN-6-L CPN-7-L CPN-8-L CPN-9-L Na2SO4 Agent de reticulare ionic Cod prob CPT-1-L CPT-2-L CPT-3-L CPT-4-L TPP Agent de reticulare ionic

Prepararea hidrogelurilor a urmat acelai protocol ca cel prezentat n subcapitolul anterior, cu meniunea c toate cantitile au fost reduse de 4 ori. Pentru obinerea sistemelor complexe de tipul polimer-lipozomi, o suspensie de lipozomi (ncrcai cu calcein) n ap a fost adugat n fiecare soluie de polimeri naintea aldehidei glutarice. III.2.2.4. Rezultate i discuii n cadrul acestui subcapitol vor fi prezentate rezultatele obinute n urma imobilizrii lipozomilor ncrcai cu calcein n hidrogeluri pe baz de chitosan i poli(alcool vinilic) dublu reticulate. Caracterizarea lipozomilor a fost prezentat n detaliu n Capitolul III.1.2. n acest subcapitol se va face referire doar la sistemul complex de tipul polimer-lipozomi. Studiul distribuiei lipozomilor n filmele polimere n Figura III.71.A este prezentat imaginea de fluorescen a lipozomilor MLV imobilizai n hidrogelul CPT-1 n comparaie cu hidrogelul martor fr lipozomi (Figura III.71.B). Lipozomii sunt omogen distribuii n toat masa hidrogelului.

Micro i nanoparticule cu poteniale aplicaii biomedicale i poten

Figura III.71. Imagini de fluorescen pentru lipozomi MLV imobilizai n hidrogelul CPT-1 (A) comparativ cu hidrogelul martor CPT-1 (B) pentru o mrire x10 m

Studiul capacitii de eliberare a calceinei din sistemele complexe polimercapacitii lipozomi-principiu activ Calceina, un principiu activ hidrofil, a fost inclus n lipozomi mari de tip MLV de inclus diferite compoziii (PC i PC/Chol). Lipozomii ncrcai cu calcein au fost apoi ii i calcein imobilizai n hidrogeluri pe baz de chitosan i poli(alcool vinilic) dublu reticulate. i baz ol Comportamentul hidrogelurilor pe baz de CS i PAV fr lipozomi a fost studiat n baz subcapitolul anterior. Acestea au prezentat grade de umflare ridicate, n funcie de func compoziie i agentul de reticulare ionic utilizat, i cantiti crescute de medicament i ionic i ncrcate/eliberate. Cinetica de eliberare a principiului activ din hidrogelurile martor a rcate/eliberate. indicat faptul c acesta a fost eliberat aproape complet dup 2-4 ore de la imersarea dup hidrogelurilor ncrcate n solu apoase cu pH bazic. Pentru a surmonta acest rcate soluii dezavantaj al hidrogelurilor s-a recurs la realizarea sistemului complex polimerlipozomi-principiu activ. n acest fel s-a ncercat i rezolvarea problemei legat de i legat instabilitatea lipozomilor n timp. n hidrogelurile CPN (reticulate cu AG i Na2SO4) i hidrogelurile CPT (reticulate cu AG i TPP) au fost imobilizai lipozomi mari de tipul MLV cu compoziii diferite (PC i i imobiliza i compozi PC/Chol) ncrcai n prealabil cu calcein . Cinetica de eliberare a calceinei din aceste i calcein. hidrogeluri este prezentat n Figura III.72. i Figura III.73.
30 25
calceina eliberata (%)

calceina eliberata (%)

20 15 10 5 0 0

CPN-6 (PC) CPN-7 (PC) CPN-8 (PC) CPN-9 (PC)

30 25 20 15 10 5 0

CPN-6 (PC/CHOL) CPN-7 (PC/CHOL) CPN-8 (PC/CHOL) CPN-9 (PC/CHOL)

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Timp (zile)

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Timp (zile)

Figura III.72. Cinetica de eliberare a calceinei n pH=7,4 pentru hidrogelurile pe baz de CS i baz PAV dublu reticulate cu AG/Na2SO4 ncrcate cu lipozomi din PC (A) i PC/CHOL (B) rcate

18 16 calceina eliberata (%) 14 12 10 8 6 4 2 0 0

18 CPT-1 (PC) CPT-2 (PC) CPT-3 (PC) CPT-4 (PC) 16 calceina eliberata (%) 14 12 10 8 6 4 2 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Timp (zile) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Timp (zile) CPT-1 (PC/CHOL) CPT-2 (PC/CHOL) CPT-3 (PC/CHOL) CPT-4 (PC/CHOL)

Figura III.73. Cinetica de eliberare a calceinei n pH=7,4 pentru hidrogelurile pe baz de CS i PAV dublu reticulate cu AG/TPP ncrcate cu lipozomi din PC (A) i PC/CHOL (B)

Din curbele cineticii de eliberare se poate observa c eliberarea calceinei este influenat att de compoziia hidrogelurilor i tipul agentului de reticulare ionic ct i de compoziia lipozomilor. Influena compoziiei este similar cu cea descoperit n cazul eliberrii unui principiu activ din hidrogelurile martor pe baz de CS i PAV dublu reticulate (Capitolul III.2.1.). Hidrogelurile reticulate ionic cu TPP elibereaz mai greu lipozomii/calceina iar acest lucru se datoreaz reactivitii i funcionalitii crescute a TPP comparativ cu Na2SO4. Lipozomii ce au n compoziia iniial PC/CHOL sunt mai stabili, aa cum s-a observat i n Capitolul III.1.2., i elibereaz mai greu calceina. Determinarea integritii lipozomilor Ca i n cazul sistemelor complexe de tipul polimer-lipozomi prezentat n Capitolul III.1.2., lipozomii aflai n straturile superficiale ale hidrogelului sunt eliberai treptat n mediu apos n care este imersat hidrogelul. O parte din aceti lipozomi se destabilizez elibernd astfel principiul activ. ns nu numai lipozomii eliberai n mediul apos se pot destabiliza ci i cei aflai nc n interiorul reelei polimere iar principiul activ este n acest caz eliberat prin difuzie din hidrogel. Integritatea lipozomilor din afara hidrogelurilor pe baz de CS i PAV dublu reticulate cu AG/Na2SO4 i AG/TPP a fost calculat i este reprezentat n Figura III.74 i Figura III.75. Parametrul de integritate lipozomal este mai mic pentru hidrogelurile dublu reticulate cu AG/TPP comparativ cu cel al hidrogelurilor dublu reticulate cu AG/Na2SO4, comportament ntlnit i la hidrogelurile dublu reticulate pe baz de G i CS, demonstrnd astfel c lipozomii se dezintegreaz n interiorul hidrogelului iar calceina este apoi eliberat prin difuzie. Dup 60 zile se nregistreaz o scdere considerabil, a parametrului de integritate lipozomal ceea ce indic faptul c lipozomii ce au fost eliberai din matricile polimere s-au dezintegrat aproape n totalitate, astfel cantitile de calcein calculate nainte i dup adugarea detergentului sunt foarte apropiate ca valoare.

Micro i nanoparticule cu poteniale aplicaii biomedicale


50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Timp (zile)

parametrul de integritate lipozomala (%)

CPN-7 (PC) CPN-8 (PC) CPN-9 (PC)

parametrul de integritate lipozomala (%)

CPN-6 (PC)

50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Timp (zile) CPN-6 (PC/CHOL) CPN-7 (PC/CHOL) CPN-8 (PC/CHOL) CPN-9 (PC/CHOL)

Figura III.74. Variaia parametrului de integritate lipozomal pentru hidrogelurile pe baz de CS i PAV dublu reticulate cu AG/Na2SO4 ncrcate cu lipozomi din PC (A) i PC/CHOL (B)
Parametrul de intergritate lipozomalla (%)

parametrul de integritate lipozomala (%)

14 12 10 8 6 4 2 0

CPT-1 (PC) CPT-2 (PC) CPT-3 (PC) CPT-4 (PC)

14 12 10 8 6 4 2 0 CPT-1 (PC/CHOL) CPT-2 (PC/CHOL) CPT-3 (PC/CHOL) CPT-4 (PC/CHOL) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Timp (zile)

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Timp (zile)

Figura III.75. Variaia parametrului de integritate lipozomal pentru hidrogelurile pe baz de CS i PAV dublu reticulate cu AG/TPP ncrcate cu lipozomi din PC (A) i PC/CHOL (B)

Colesterolul are influen asupra stabilitii lipozomilor, fapt demontrat de valorile mai mari ale parametrului de integritate pentru lipozomii ce au n compoziie PC/CHOL.

Capitolul IV. Sisteme particulate pe baz de polimeri naturali i sintetici IV.1. Sisteme particulate pe baz de Gelatin i Chitosan n continuare vor fi prezentate rezultatele experimentale privind obinerea unor sisteme microparticulate pe baz de gelatin i chitosan. Numeroasele avantaje pe care le prezint cei doi polimeri din punct de vedere al utilizrii lor n domeniul eliberrii controlate de principii biologic active au constituit principalul motiv pentru care s-a realizat un nou material care s mbine avantajele proteinelor cu cele ale polizaharidelor. Pentru valorificarea avantajelor celor doi polimeri, s-au studiat mai multe posibiliti de realizare a unor sisteme suport sub form de micro i nanoparticule realizate prin reticulare ionic sau covalent [175-178]. ns, puini cercettori au folosit pn acum dubla reticulare pentru obinerea sistemelor de eliberare a medicamentelor [179-185]. Metoda utilizat n cadrul acestui studiu a constat n dubla reticulare n emulsie invers a soluiei celor doi polimeri solubilizai n ap. Reticularea s-a realizat mai nti ionic cu ajutorul sulfatului de sodiu, i apoi, pentru stabilizarea particulelor s-a recurs la o reticulare covalent, interfacial, prin intermediul unei soluii saturate de AG n toluen. S-a recurs la aceast tehnic din urmtoarele considerente: Utilizarea reticulantului ionic are ca efect reducerea cantitii de reticulant covalent, adeseori toxic; Agentul de reticlare covalent nu poate fi total exclus, deoarece el asigur o stabilitate dimensional i mecanic particulelor obinute. Aceast metod a mai fost folosit pentru obinerea de microparticule dublu reticulate pe baz de chitosan i gelatin cu poteniale aplicaii n oftalmologie [186]. Rezultatele ce urmeaz a fi prezentate au fost obinute prin optimizarea parametrilor utilizai pentru realizarea sistemelor amintite anterior. Astfel, modificnd cantitatea de agent tensioactiv i raportul de faze al emulsiei s-a reuit stabilirea unor condiii optime pentru obinerea de microparticule cu dimensiuni variate i polidispersitate dimensional relativ ngust, potrivite pentru administrarea intravenoas i intraperitoneal. Pentru testele de incrcare/eliberare a fost folosit un medicament model (cloramfenicol) cu o solubilitate sczut n ap. IV.1.2. Metoda de obinere Metoda utilizat pentru prepararea microparticulelor pe baz de G i CS const n reticularea ambilor polimeri din soluie, proces ce s-a desfurat n emulsie invers, de tip ap n ulei. S-a realizat nti o reticulare ionic n emulsie cu sulfat de sodiu pentru gelifierea polimerilor, urmat de o reticulare covalent la interfa cu AG. Att cantitatea de sulfat de sodiu ct i cantitatea de AG au fost utilizate n exces. Pentru un mai bun control al reaciilor ce au loc n sistem, i pentru corelarea acestora cu proprietile particulelor obinute s-a realizat un program experimental, n care variabilele au fost: Compozitia amestecului (%G, %CS) Concentraia surfactantului, raportat la volumul de emulsie n tabelul IV.2. sunt redate codurile tuturor probelor obinute precum i valorile parametrilor variai.

Micro i nanoparticule cu poteniale aplicaii biomedicale i poten

Tabelul IV.2. Valorile parametrilor urmrii i codurile probelor preparate urm i

Codul probelor
2x10G90CS 2x30G70CS 2x50G50CS 2x70G30CS 2x90G10CS 3x10G90CS 3x30G70CS 3x50G50CS 3x70G30CS 3x90G10CS

%G 10 30 50 70 90 10 30 50 70 10

% CS 90 70 50 30 10 90 70 50 30 90

% Span80 (w/v)

% Tween80 (w/v)

Solutie Na2SO4 10%(ml)

Soluie saturat de AG n toluen (ml)

40

20

40

20

Figura IV.1. Metoda de ob obinere a particulelor G-CS: A - prepararea emulsiei; B transferul emulsiei pentru definitivarea reticul reticulrii covalente; C separarea particulelor prin centrifugare; D splarea produsului obinut

Pentru testele in vivo s-au preparat microparticule fluorescente (2x50G50CS-F). Chitosanul folosit n aceast sintez a fost mai nti modificat prin legarea de aceast fluorescein la grupele aminice prin activarea reaciei cu 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)reac carbodiimidei (EDAC) dup metoda publicat de Angela M. de Campos i colab. [187], pentru ca mai apoi s poat fi obinute microparticulele fluorescente conform inute protocolului enunat mai sus. Testarea in vivo a sistemelor particulate pe baz de chitosan i gelatin vivo Testele in vivo au avut drept scop obinerea unor biodistribuii la nivel de esuturi ob inerea biodistribu a microparticulelor fluorescente 2x50G50CS-F n eventualitatea utilizrii acestora n utiliz eliberarea controlat de medicamente i pentru a observa care cale este cea mai i

eficient pentru administrare. Aceste teste au fost realizate pe obolani Wistar albi, masculi, cu greuti cuprinse ntre 250 i 300 g. Suspensii de particule (1%), echivalentul a 0,4 ml/Kg corp obolan, ntr-o singur doz, au fost administrate pe dou ci: intraperitoneal (Lot I) i parenteral n vena cozii (Lot II). Lotul martor nu a primit suspenii de particule pentru a permite compararea rezultatelor. Fiecare lot a avut cte 10 obolani. Dupa 24 ore de la administrare, toate animalele din toate loturile au fost anesteziate cu Pentotal i apoi sacrificate prin secionarea arterelor carotide. Organe sau fragmente de organe ca: plamn, cord, creier, testicul, ficat, arcade gingivodentare, au fost recoltate n ser fiziologic. Imediat dup recoltare, din organele respective s-au realizat seciuni la ghea (criostat) cu grosime de 2 3 microni. Seciunile au fost recoltate n paraformaldehid i examinate apoi la microscop. Fiecare imagine a fost examinat prin microscopie obinuit, apoi prin microscopie pentru imunofluorescen, obinndu-se prin suprapunerea imaginilor o imagine compus la o mrire de 60x. IV.1.4. Rezultate i discuii ntre G i CS au fost realizate dou tipuri de reacii, n funcie de natura legturilor nou create. Mai nti, soluiile celor doi polimeri au fost supuse unei reticulri ionice prin intermediul ionilor sulfat din sulfatul de sodiu. La aceast reacie particip gruprile funcionale de tip -NH2, aflate sub forma ionului amoniu, aparinnd celor doi polimeri; reacia conduce la formarea unei reele polimere interpenetrate de tip interconectat [192].

Figura IV.7. Reeaua polimer de tip IPN nou-format

O reprezentare schematic a reelei nou-format este descris n figura IV.7. Reticularea ionic se manifest prin gelifierea soluiilor celor doi polimeri. n sistemul studiat, reacia de reticulare ionic este declanat prin adugarea unei soluii de Na2SO4 ntr-o emulsie invers de tip ap n ulei, n care raportul fazelor a fost 1:4. n acest mod a avut loc formarea particulelor de G / CS ce vor fi stabilizate ulterior prin reticulare covalent cu AG.

Micro i nanoparticule cu poteniale aplicaii biomedicale

Reacia cu AG are loc tot la gruprile aminice situate de-a lungul catenei ambilor polimeri cu formarea de legturi iminice [193]; ea se realizeaz prin ruperea legturilor ionice formate prin intermediul ionilor sulfat sau prin participarea grupelor aminice nc libere, de la suprafaa particulelor de gel ntruct AG a fost extras n toluen i deci este normal ca aceasta s reacioneze preponderent la suprafaa microparticulelor. Spectroscopia FTIR Produii de reticulare au fost analizai prin spectroscopie FTIR. Banda de absorbie caracteristic legturii iminice formate n urma reticulrii covalente este prezent n spectrul probei 2x50G50CS la 1654 cm-1. Peak-ul corespunztor ionilor sulfat se regsete n spectrul probei 2x50G50CS (619 cm-1) ceea ce demonstreaz reticularea ionic. Caracteristici morfologice ale particulelor Microparticulele preparate prin reticulare ionic i covalent au fost analizate din punct de vedere al morfologiei att prin studii de difractometrie laser ct i prin microscopie electronic, pentru determinarea formei i a aspectelor de suprafa. n scopul determinrii dimensiunii, microparticulele au fost analizate n aceton pentru a evita procesele de umflare i a obine astfel valori ct mai aproape de cele din stare uscat. Un rol important n obinerea unor particule sferice a fost determinat de prezena substanelor cu proprieti tensioactive n ambele faze ale emulsiei [194], asigurnd astfel o stabilizare mai bun a picturilor de soluie apoas i mai trziu a celor de gel ionic. n tabelul IV.3. sunt prezentate valorile diametrului mediu al microparticulelor preparate. Este important de menionat c valorile prezentate sunt cele medii afiate de aparat. Valorile reprezint media aritmetic a valorilor diametrelor medii msurate pentru cte 5 eantioane din fiecare prob. Tabelul IV.3. Valorile diametrelor medii ale particulelor preparate Codul probelor 2x10G90CS 2x30G70CS 2x50G50CS 2x70G30CS 2x90G10CS Diametrul mediu (m) 0,6650,091 0,7880,055 0,8040,056 0,8260,057 0,8970,041 Codul probelor 3x10G90CS 3x30G70CS 3x50G50CS 3x70G30CS 3x90G10CS Diametrul mediu (m) 0,5270,109 0,6730,091 0,7690,055 0,8020,057 0,8780,045

Valorea diametrului mediu al particulelor crete cu creterea cantitii de gelatin (Figura IV.11. i Figura IV.12.) fapt ce se poate explica prin aceea c reticularea ionic a CS este mult mai puternic i mai rapid dect a G; acest efect este determinat de prezena n structura chitosanului a unui numr mai mare de grupe aminice capabile de a forma reticulri ionice i covalente. O alt observaie desprins din curbele de distribuie este scderea diametrului mediu al particulelor cu creterea cantitii de surfactant.

Normalized Particle Amount q0 (%)

70 60 50 40 30 20 10 0 0.0 0.5 1.0 1.5 Particles Diameter (m) 2.0 2x10G90CS 2x30G70CS 2x50G50CS 2x70G30CS 2x90G10CS

Normalized Particle Amount q0 (%)

80

80 70 60 50 40 30 20 10 0 0.0 1.5 0.5 1.0 Particles Diameter (m) 2.0 3x10G90CS 3x30G70CS 3x50G50CS 3x70G30CS 3x90G10CS

Figura IV.9. Distribuia dimensional a ia dimensional microparticulelor preparate cu o concentraie a surfactantului de 2%

Figura IV.10. Distribuia dimensional a ia dimensional microparticulelor preparate cu o concentraie a surfactantului de 3% ie

Microscopia electronic de baleiaj a adus informaii suplimentare privind forma, ii aspectul suprafetei i dimensiunile particulelor. n figura IV.13. sunt prezentate imaginile i de microscopie electronic de baleiaj pentru o parte din probele analizate.

Figura IV.13. Microscopie electronica de baleiaj pentru: 2x50G50C (A), 2x90G10C (B) i 3x90G10C (C)

Din studiile de microscopie electronic s-au obinut urmtoarele informaii: electronic toarele informa Doar o parte din particule prezint o form sferic bine definit prezint definit; Pe migrografiile ob obinute se pot observa i aglomerate; Acestea se i redisperseaz ns n ap, prin agitare sau ultrasonare; Suprafaa particulelor variaz de la foarte neted la rugos; aceast observaie a variaz aceast este n concordan cu datele existente n literatur [195-197]. literatur Obinerea de particule fluorescente a fost demonstrat cu ajutorul microscopiei inerea demonstrat confocale de fluorescen (Figura IV.14.).

Micro i nanoparticule cu poteniale aplicaii biomedicale i poten

Figura IV.14. Microscopie confocal de confocal fluorescen pentru microparticulele marcate cu fluorecein fluorecein

Determinarea caracteristicilor de retenie a soluiilor apoase cu pH diferit reten iilor Capacitatea de retenie a soluiilor apoase a microparticulelor preparate a fost reten iilor studiat n dou medii diferite: soluie tampon acetat (pH=4) i soluie tampon fosfat solu (pH=7,4). Cantitatea de ap inclus n microparticule a fost cuantificat utiliznd variaia cuantificat diametrului mediu n timp, valori m surate prin difractometrie Laser. msurate Valoarea maxim a diametrului mediu al particulelor n mediu acid (Figura IV.15. a) scade o dat cu creterea cantit terea cantitii de gelatin n sistem, fiind comparativ mai mare dect cea n mediu bazic
Variatia maxima a diametrului mediu la umflare in mediu acid 1200 900 600 300 0 1200 900 600 300 0 Variatia maxima a diametrului mediu la umflare in mediu bazic

Figura IV.15. Variaia diametrului mediu maxim al particulelor n mediul acid (a) i n ia ia mediul bazic (b)

Proprietile de umflare sunt influen influenate de tria interaciilor ionice dintre lanurile iilor lan polimere care determin densitatea de reticulare a reelei. re
Capacitatea particulelor de nc rcare/eliberare a cloramfenicolului ncrcare/eliberare Cantitile de cloramfenicol ncrcate dup 24 ore sunt prezentate n tabelul IV.8. ile nc Datorit faptului c particulele au fost ncrcate ntr-un mediu diferit fa de cel n fa care s-au monitorizat gradele de umflare, nu poate fi fcut o corelaie ntre gradele de f corela umflare i cele de ncrcare. Cea mai mare cantitate de cloramfenicol ncrcat s-a rcare. rcare. nc nregistrat n cazul particulelor 2x10G90C - 35,63 mg CHL/100mg particule uscate iar cea mai mic n cazul particulelor 3x10G90C - 26,94 mg CHL/100mg particule uscate.

Tabel IV.8. Cantitatea de cloramfenicol ncrcat n 100 mg particule


Codul probelor 2x10G90CS 2x30G70CS 2x50G50CS 2x70G30CS 2x90G10CS mg CHL /100mg particule 35,63 27,47 35,19 28,65 28,76 Codul probelor 3x10G90CS 3x30G70CS 3x50G50CS 3x70G30CS 3x90G10CS mg CHL /100mg particule 26,94 29,45 32,07 30,16 29,58

Din analiza rezultatelor obinute se pot face o serie de observaii dup cum urmeaz: Eficiena de eliberare este mai mic n cazul eliberrii n mediu bazic dect n mediu acid, fapt explicat prin aceleai diferene aprute n cazul umflrilor; n cazul particulelor 2x10G90C i 2x90G10C s-a nregistrat o cretere semnificativ a absorbanei n soluia de supernatant la 4 ore de la nceperea eliberrii, cretere pus pe seama umflrii neateptate a particulelor; Rezultatele obinute n cazul includerii se coreleaz cu cele obinute n cazul eliberrii, att n mediu acid ct i n mediul bazic. n mediu acid se constat o eliberare mai lent a cloramfenicolului n cazul probelor 2x50G50C i 3x30G70C, efect pentru care nu s-a gsit nc o explicaie plauzibil.
Cinetica de eliberare a CHL in mediu acid 100 CHL eliberata (%) CHL eliberata (%) 80 60 40 20 0 2x10G90CS 2x30G70CS 2x50G50CS 2x70G30CS 2x90G10CS 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 Timp (min) 100 80 60 40 20 0 2x10G90CS 2x30G70CS 2x50G50CS 2x70G30CS 2x90G10CS 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 Cinetica de eliberare a CHL in mediu bazic

Timp (min)

Cinetica de eliberare a CHL in mediu acid 100 CHL eliberata (%) CHL eliberata (%) 80 60 40 20 0 3x10G90CS 3x30G70CS 3x50G50CS 3x70G30CS 3x90G10CS 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 Timp (min) 100 80 60 40 20 0

Cinetica de eliberare a CHL in mediu bazic

3x10G90CS 3x30G70CS 3x50G50CS 3x70G30CS 3x90G10CS 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 Timp (min)

Figura IV.16. Curbele cinetice de eliberare a cloramfenicolului din particule att n mediu acid (A i C) ct i n mediu bazic (B i D)

Micro i nanoparticule cu poteniale aplicaii biomedicale i poten

Testarea in vivo a sistemelor particulate Testele in vivo realizate au adus informaii foarte importante n ce privete informa ii prive biodistribuia particulelor marcate cu fluorescein la nivelul organismului: ia fluorescein Lotul II prezint mai mult activitate fluorescent pentru cord dect Lotul I; n ficat activitatea fluorescent este relativ similar pentru cele dou loturi; f dou La nivelul creierului activitatea imunofluorescent este mai puternic n cazul imunofluorescent puternic Lotului II; La nivelul gingiei activitatea este similar pentru cele dou loturi; similar n cazul testiculului activitatea imunofluorescent este slab, dar similar i slab pentru cele dou loturi; La nivelul plmnului se remarc activitate fluorescent mult mai accentuat remarc pentru Lotul II.

Imagine compus cord

Imagine compus cord Lotul II

Imagine cord Lotul Martor

Lotul I

Plana 1. Microfotografiile comparative pentru cord, ntre lotul martor i cele dou loturi investigate

Se constat c aceste nanoparticule au capacitatea de a ajunge la organe; organele care ar putea fi folosite ca i organe int pentru microparticule fiind creierul, cordul i ficatul. Calea de admnistrare optim pentru microparticule rmne, pentru majoritatea optim mne, organelor, calea sangvin (administrare intravenoas). IV.2. Sisteme particulate pe baz de Chitosan i Poli(alcool vinilic) baz Acest subcapitol prezin rezultatele experimentale obinute prin realizarea unor prezint inute sisteme microparticulate pe baz de chitosan i poli(alcool vinilic). Avantajele celor doi baz i polimeri din punct de vedere al utiliz utilizrii lor n domeniul eliberrii controlate de principii rii biologic active au reprezentat punctul de pornire pentru obinerea unui nou material obinerea capabil s ndeplineasc cerinele unui sistem de eliberare controlat de medicamente ele controlat pentru aplicaii oftalmologice. ii n literatur sunt deja publicate rezultate referitoare la amestecul chitosanului cu poli(alcoolul vinilic) [172, 173, 206-209] ns nu apar date referitoare la dubla reticulare a acestui tip de amestec. Metoda utilizat n cadrul acestui studiu a constat n dubla reticulare (ionic urmat de covalent) n emulsie invers a celor doi polimeri solubilizai n ap. ) invers solubiliza

Rezultatele obinute prin variaia unor parametri precum concentraia polimerilor n soluie, timpul de reticulare i cantitatea de agent tensioactiv vor fi prezentate n continuare. Pentru testele de incrcare/eliberare a fost folosit pilocarpina, un agent miotic utilizat pentru controlul presiunii intraoculare n glaucomul cronic simplu. IV.2.2. Metoda de obinere Metoda utilizat pentru prepararea microparticulelor pe baz de CS i PAV este similar metodei de obinere a microparticulor pe baz de chitosan i gelatin prezentat in capitolul IV.1. Att cantitatea de sulfat de sodiu ct i cantitatea de AG au fost utilizate n exces. Programul experimental realizat pentru obinerea microparticulor pe baz de CS i PAV a cuprins urmtoarele variabile: Compozitia amestecului (%PAV, %CS) Concentraia soluiei de polimeri (%) (w/v) Timpul de reticulare covalent (ore). n tabelul IV.9. sunt redate codurile probelor, precum i valorile parametrilor variai. Tabelul IV.9. Valorile parametrilor urmrii i codurile probelor preparate
% PAV 10 20 30 40 50 10 20 30 40 50 % CS 90 80 70 60 50 90 80 70 60 50 1 5 10 6 0,5 2,5 5 4 Concentratia solutiei de polimeri (%) (w/v) Solutie Na2SO4 10% (ml) Soluie saturat de AG n toluen (ml) Timpul de reticulare covalenta (ore)

Codul probelor

10P90CSx0,5 20P80CS x0,5 30P70CS x0,5 40P60CS x0,5 50P50CS x0,5 10P90CSx1 20P80CS x1 30P70CS x1 40P60CS x1 50P50CS x1

Experimentele debuteaz cu prepararea soluiei celor doi polimeri ntr-un pahar Berzelius de 100 ml; CS i PAV (cantiti corespunztoare raportului dorit ntre polimeri) sunt dizolvai n cantitatea corespunztoare concentraiei utilizate (0,5% sau 1%) n soluie de acid acetic (2%) (volumul soluiei de polimeri a fost de 50 ml). La aceasta s-a adugat ulterior cantitatea specific de Tween80 (mg) (2% fa de masa soluiei de polimeri). Amestecul se menine sub agitare magnetic pn la omogenizarea complet i dizolvarea tensioactivului. Separat, ntr-un alt pahar Berzelius de 500 ml s-au pus 200 ml toluen n care s-a adugat Span80 (mg) (2% fa de masa toluenului), dup care s-a agitat pentru omogenizarea soluiei.

Micro i nanoparticule cu poteniale aplicaii biomedicale

Prepararea emulsiei s-a realizat cu ajutorul ultraturaxului (6000 rpm) prin adugarea n picturi a fazei apoase n faza de toluen. Amestecul a fost lsat sub agitare 10 minute, dup care s-a adugat soluia de sulfat de sodiu, de concentraie10%(w/w), i s-a meninut agitarea nc 10 minute. Emulsia a fost transferat rapid ntr-un reactor cu fund rotund montat la un agitator mecanic. S-a pornit agitarea (500 rpm) i s-a adugat AG extras n toluen. Sistemul a fost meninut sub agitare nc 4/6 ore pentru definitivarea reticulrii covalente (s-a inut cont de faptul c PAV are nevoie de un timp mai mare pentru a reticula cu AG). Pentru separarea particulelor, emulsia a fost centrifugat 30 minute la 5000 rpm dup care a fost nlturat faza organic. Sedimentul a fost splat apoi cu aceton, ap i hexan (de 3 ori pentru fiecare tip de solvent), pentru ndeprtarea surfactanilor, a AG nereacionate, precum i a sulfatului de sodiu n exces. Ultima splare a fost realizat n hexan, un solvent foarte volatil ce permite uscarea n aer liber la temperatura camerei. IV.2.4. Rezultate si discutii Amestecul celor doi polimeri a fost supus mai nti unei reticulri ionice prin intermediul sulfatului de sodiu. La aceast reacie particip gruprile funcionale de tip NH2, aflate sub forma ionului amoniu, aparinnd chitosanului. Reticularea ionic (Figura IV.20.) este declanat prin adugarea unei soluii concentrate de Na2SO4 ntr-o emulsie invers de tip ap n ulei, n care raportul fazelor a fost 1:4. n acest mod a avut loc formarea particulelor de gel ce vor fi stabilizate ulterior prin reticulare covalent cu AG.

Figura IV.20. Reacia de reticulare ionic a chitosanului

- H2O + -2H

Figura IV.21. Reacia de reticulare covalent a chitosanului

Figura IV.22. Reacia de reticulare covalent a poli(alcoolului vinilic)

Reacia cu AG are loc att la gruprile aminice situate de-a lungul catenei chitosanului, cu formarea legturilor iminice, ct i la gruprile hidroxil ale poli(alcoolului vinilic) cu formarea unor noi legturi de tip acetal; reacia are loc la suprafaa particulelor de gel ntruct AG a fost extras n toluen, nemiscibil cu apa, i deci este normal ca aceasta s reacioneze preponderent la suprafaa microparticulelor. Reaciile de reticulare covalent a celor doi polimeri sunt reprezentate schematic n Figura IV.21. i Figura IV.22. Spectroscopia FTIR Produii de reticulare au fost analizai prin spectroscopie FTIR. Reticularea covalenta a chitosanului este demonstrat prin prezena benzii de absorbie caracteristic legturilor iminice la 1638 cm-1. Prezena benzii de absorbie la 1097 cm-1, caracteristic legturilor de tip acetal, justific reticularea covalent a poli(alcoolului vinilic). Banda de absorbie corespunztoare ionilor sulfat se regsete n spectrul probei 50P50CSx1 (619 cm-1) ceea ce demonstreaz reticularea ionic. Caracteristici morfologice ale particulelor Microparticulele pe baz de chitosan i poli(alcool vinilic) preparate prin dubl reticulare au fost analizate din punct de vedere al morfologiei att prin studii de difractometrie laser ct i prin microscopie electronic de baleiaj, pentru determinarea formei i a aspectului de suprafa. Tabelul IV.10. Valorile medii ale diametrelor particulelor preparate Codul probelor 10P90CSx0,5 20P80CS x0,5 30P70CS x0,5 40P60CS x0,5 50P50CS x0,5
Diametrul mediu (m) Diametrul mediu (m)

Codul probelor 10P90CSx1 20P80CS x1 30P70CS x1 40P60CS x1 50P50CS x1

3,9700,251 3,3310,254 2,8940,252 2,4060,333 2,3250,317

3,2160,279 2,8830,121 2,3280,273 1,9180,267 1,7000,274

Pentru a evita procesele de umflare i a obine astfel valori ct mai aproape de cele din stare uscat, dimensiunea microparticulelor a fost analizat n aceton. Un rol important n obinerea unor particule sferice l-a jucat prezena substanelor cu proprieti tensioactive n ambele faze ale emulsiei, care au asigurat astfel o stabilizare mai bun a picturilor de soluie apoas i mai trziu a celor de gel ionic. Valorile medii ale diametrelor particulelor scad cu creterea cantitii de PAV i implicit cu scderea cantitii de chitosan din amestecul iniial fapt ce se poate explica prin faptul c reticularea ionic are loc doar la CS; scderea cantitii de chitosan i pstrarea unei aceleai cantiti de agent de reticulare ionic crete gradul de reticulare. O alt observaie este aceea c timpul de reticulare covalent are i el o influen asupra diametrului mediu al particulelor; creterea timpului de reticulare covalent produce o scdere a dimensiunii microparticulelor.

Micro i nanoparticule cu poteniale aplicaii biomedicale i poten

Microscopia electronic de baleiaj a adus informaii suplimentare privind forma, ctronic ii aspectul suprafetei i dimensiunile particulelor. n figura IV.28. sunt prezentate imaginile i de microscopie electronic de baleiaj pentru o parte din probele analizate.

Figura IV.28. Microscopie electronica de baleiaj pentru: 50P50CS x0,5 (A i B) i 30P70CS x1 (C i D)


Din studiile de microscopie electronic s-au obinut urmtoarele informa electronic toarele informaii: Doar particulele cu timp de reticulare covalent mai mare prezint o form covalent prezint sferic bine definit. Efectul poate fi datorat faptului c poli(alcoolul vinilic) prezint . c prezint grupe funcionale OH mai puin nucleofile, i deci mai slab reactive dect cele aminice, pu i necesitnd prin urmare durate de reac mai mari pentru a participa n numr tot mai reacie num mare la reacia cu aldehida glutaric; ia glutaric

Particulele pe baz de CS i PAV prezint o polidispersitate crescut, crescut Suprafaa particulelor variaz de la foarte neted la rugos. a variaz Determinarea coninutului de azot din compoziia microparticulelor inutului compozi ia

Poli(alcoolul vinilic) este un polimer cunoscut pentru utilizarea ca tensioactiv n stabilizarea emulsiilor sau suspensiilor apoase de polimeri. n amestecul de polimeri studiat, el va avea deci un dublu rol: participant la formarea re reelei interpenetrate/interconectate, dar i agent stabilizant al sistemului; ca urmare, i participarea sa la reacia de reticulare va fi limitat. Aceasta poate explica de ce n ia limitat . compoziia microparticulelor se regsete CS-ul ca polimer majoritar. ia reg Pe de alt parte, creterea cantitii de PAV n amestecul de plecare (respectiv reducerea cantitii de CS) poate avea ca efect o mai bun stabilizare a particulelor, ii bun respectiv scderea derea dimensiunilor acestora (efect logic la creterea cantitii/concentraiei de tensioactiv ntr-o emulsie), ceea ce poate explica fenomenul iei semnalat anterior, aparent contrar ateptrilor. a Un alt aspect ce trebuie men menionat este c reticularea ionic are loc doar la grupele aminice libere ale chitosanului ceea ce favorizeaz pstrarea acestuia n favorizeaz strarea reeaua polimeric nou-format format. n compoziia microparticulelor s-au regsit valori ale coninutului de chitosan ia inutului cuprinse ntre 73,29 % i 93,23%, iar comparativ cu valorile de plecare se observ o i observ cretere a acestor valori o dat cu creterea cantitii de CS n amestecul iniial de tere ii ini polimeri (figura IV. 29):
94
% CS in microparticule

89 84 79 74 69 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95

% CS in amestecul initial de polimeri

Figura IV.29. Influena compoziiei iniiale a amestecului de polimeri asupra compoziiei a compozi iale compozi microparticulelor Determinarea capacitilor de umflare a microparticulelor n soluii apoase capacitilor solu cu pH diferit Capacitatea de umflare a microparticulelor preparate a fost studiat n dou umflare studiat medii diferite: soluie tampon acetat (pH=4) i soluie tampon fosfat (pH=7,4). Cantitatea ie ie de ap inclus n microparticule a fost cuantificat prin difractometrie Laser, msurnd cuantificat m variaia diametrului mediu n timp. Variaia diametrului mediu n timp la umflare att n mediu acid ct i n mediu ia bazic sunt prezentate n Figurile IV.30 IV.33. Variaia diametrului microparticulelor pe baz de chitosan i poli(alcool vinilic) n ia baz mediul acid indic scderea acestuia o dat cu scderea cantitii de chitosan din dat ii amestecul iniial; acesta este, comparativ, mai mare dect n mediul bazic. n mediul ial;

Micro i nanoparticule cu poteniale aplicaii biomedicale

acid are loc protonarea grupelor amino libere ale chitosanului conducnd astfel la repulsii electrostatice ntre lanurile polimere; o dat cu scderea cantitii de chitosan scade i intensitatea acestor respingeri, ceea ce explic valorile mai mici ale diametrului particulelor.
Variatia diametrului mediu (%) Variatia diametrului mediu (%) 2000 1600 1200 800 400 0 0 40 80 120 160 200 240 280 320 360 Timp (min) 10P90Cx0,5 20P80Cx0,5 30P70Cx0,5 40P60Cx0,5 50P50Cx0,5 2000 1600 1200 800 400 0 0 40 80 120 160 200 240 280 320 360 Timp (min) 10P90Cx1 20P80Cx1 30P70Cx1 40P60Cx1 50P50Cx1

Figura IV.30. Variaia diametrului mediu n timp la umflare n mediu acid pentru microparticulele obinute cu o concentraie iniial a soluiei de polimeri de 0,5%
600 Variatia diametrului mediu (%) 500 400 300 200 100 0 0 40 80 10P90Cx0,5 20P80Cx0,5 30P70Cx0,5 40P60Cx0,5 50P50Cx0,5 120 160 200 240 280 320 360 Timp (min)

Figura IV.31. Variaia diametrului mediu n timp la umflare n mediu acid pentru microparticulele obinute cu o concentraie iniial a soluiei de polimeri de 1%
600 Variatia diametrului mediu (%) 500 400 300 200 100 0 0 40 80 10P90Cx1 20P80Cx1 30P70Cx1 40P60Cx1 50P50Cx1 120 160 200 240 280 320 360 Timp (min)

Figura IV.32. Variaia diametrului mediu n timp la umflare n mediu bazic pentru microparticulele obinute cu o concentraie iniial a soluiei de polimeri de 0,5%

Figura IV.33. Variaia diametrului mediu n timp la umflare n mediu bazic pentru microparticulele obinute cu o concentraie iniial a soluiei de polimeri de 1%

Valoarea maxim a diametrului mediu la umflare al microparticulelor n mediul bazic crete o dat cu scderea cantitii de CS din amestecul iniial (Figura VI.32. i Figura IV.33.) i implicit cu creterea cantitii de PAV. Scderea cantitii de chitosan n compoziia particulelor face ca densitatea de reticulare a reelei s se reduc, reducndu-se numrul punilor de reticulare ionic. Prezena chitosanului n proporie tot mai mare n compoziia particulelor poate avea dou efecte contrare: pe de o parte, crete densitatea de reticulare a reelei, reducnd gradul de umflare i diametrul particulelor

pe de alte parte, n mediu acid produce creterea gradului de umflare, fenomen care nu se mai ntlnete n mediul bazic. Gradul de umflare al particulelor, att n mediu acid ct i n mediu bazic, atinge valoarea maxim dup 6 ore, pentru toate probele.

1800 1500 1200 900 600 300 0

1800 1500 1200 900 600 300 0

Dv (%)

mediu bazic mediu acid

Dv (%)

mediu bazic mediu acid

Figura IV.34. Variaia maxim a diametrului microparticulelor (Dv), dup 24h ia maxim dup

Capacitatea particulelor de ncrcare/eliberare a pilocarpinei nc rcare/eliberare Tabelul IV.11. Cantitatea de pilocarpin ncrcat n 100 mg particule pilocarpin

Codul probelor 10P90CSx0,5 20P80CSx0,5 30P70CSx0,5 40P60CSx0,5 50P50CSx0,5


35
mg Pn eliberata/100 mg particule

mg Pn /100mg particule

Codul probelor 10P90CSx1 20P80CSx1 30P70CSx1 40P60CSx1 50P50CSx1


35
mg Pn eliberata/100 mg particule

mg Pn /100mg particule

39,58 38,58 36,07 35,57 33,07

39,08 36,07 33,57 34,07 28,56

30 25 20 15 10 5 0 0 50 100 150 200 250 300 Timp (min) 350 400 10P90Cx0,5 20P80Cx0,5 30P70Cx0,5 40P60Cx0,5 50P50Cx0,5

30 25 20 15 10 5 0 0 50 100 150 200 250 Timp (min) 300 350 400 10P90Cx1 20P80Cx1 30P70Cx1 40P60Cx1 50P50Cx1

Figura IV.36. Curbele cinetice de eliberare a pilocarpinei din microparticulele obinute cu ob o concentraie iniial a soluiei de polimeri de 0,5%

Figura IV.37. Curbele cinetice de eliberare a pilocarpinei din microparticulele obinute ob cu o concentraie iniial a soluiei de ie polimeri de 1%

Micro i nanoparticule cu poteniale aplicaii biomedicale

Cantitile de pilocarpin ncrcate dup 24 ore sunt prezentate n tabelul IV.11. Observaiile ce reies din analiza rezultatele obinute sunt urmtoarele: Rezultatele obinute n cazul eliberrii pilocarpinei se coreleaz cu cele obinute n cazul includerii; Eficiena de eliberare este cuprins ntre 72,03 % n cazul probei 40P60CSx0,5 i 81,88 % n cazul probei 30P70CSx1. Concluzii generale Hidrogeluri pe baz de gelatin i chitosan cu aplicaii biomedicale au fost preparate folosind o nou metod (reticulare covalent urmat de reticulare ionic a celor doi polimeri); aceast metod folosete cantiti mici de glutaraldehid, cunoscut ca fiind un agent toxic, ns suficient ct s asigure o bun stabilitate mecanic hidrogelurilor ce urmez a fi supuse reticulrii ionice; Proprietile de umflare, ncrcare i eliberare a hidrogelurilor pe baz de gelatin i chitosan pot fi uor controlate prin ajustarea parametrilor studiai; Testele de reologie au demonstrat c hidrogelurile obinute sunt rezistente, elastice i stabile n timp; Proprietile reologice ale hidrogelurilor analizate sunt mbuntite prin creterea cantitii de agent de reticulare ionic; raportul G/CS i timpul de reticulare ionic au, de asemenea, infuen asupra stabilitii mecanice a hidrogelurilor; Toate probele au manifestat o stabilitate satisfctoare la temperatur. Procedura de modelare n cazul hidrogelurilor pe baz de gelatin i chitosan dublu reticulate cu AG/TPP a fost condus pe baza datelor experimentale i scopul acesteia a fost de a evalua influena condiiilor de reacie asupra gradului de umflare i a cantitii de cafein eliberate; Au fost propuse o reea neuronal cu un design simplu i metode simple de stabilire a structurii reelei i s-au obinut predicii bune cu toate modelele neuronale considerate, cu o medie a erorii mai mic de 9%; Modelele neuronale propuse au probat o bun reprezentare a procesului de sintez a hidrogelurilor dublu reticulate pe baz de chitosan i gelatin dublu reticulate cu AG/TPP. Lipozomii preparai au prezentat dimensiuni cuprinse ntre 1,050 i 2,407 m, n funcie de compoziia lipidelor de plecare, cele mai mari dimensiuni le-au avut lipozomii din PC/CHOL; Realizarea sistemelor complexe de tipul polimer-lipozomi-principiu activ s-a realizat prin amestecarea suspensiei de lipozomi, purttori de principiu activ, cu soluia de polimeri nainte de adugarea agentului de reticulare covalent; Studiile de microscopie confocal de fluorescen indic o distribuie uniform a lipozomilor de tip MLV n filmele pe baz de G i CS dublu reticulate; Calceina din lipozomii de tip MLV a fost eliberat n cantitate mai mic din hidrogelurile reticulate cu AG/TPP comparativ cu cantitatea eliberat din hidrogelurile reticulate cu AG/Na2SO4; Capacitatea de eliberare depinde i de compoziia lipozomi utilizai. Astfel, s-a nregistrat o cantitatea mai mare de calcein eliberat din lipozomii pe baz de PC fa de lipozomii pe baz de PC/CHOL

Parametrul de integritate lipozomal este minim pentru filmele pe dublu reticulate cu AG/TPP, demonstrnd astfel c eliberarea calceinei se realizeaz prin difuzie dup ce lipozomii s-au destabilizat n interiorul hidrogelului; Se poate afirma, deci, c sistemele complexe studiate elibereaz principiul activ hidrofil printr-un mecanism combinat: pe de o parte calceina este eliberat datorit destabilizrii lipozomilor n mediul exterior filmului i, pe de alt parte datorit destabilizrii lor n interiorul filmelor dup care aceasta se elibereaz prin difuzie din film n supernatant. Au fost preparate micro i nanoparticule pe baz de G i CS prin reacii de reticulare ionic cu Na2SO4 urmat de reticulare covalent cu AG. Procedeul a constat n reticularea n emulsie invers a soluiilor celor doi polimeri; Studiile de spectroscopie FTIR au demonstrat prezena celor doi polimeri n microparticulele analizate, precum i a celor dou tipuri de reticulri; Particulele au prezentat dimensiuni cuprinse ntre 0,527 m i 0,897 m; Particulele nu prezint o form sferic bine definit i formeaz aglomerate, care se redisperseaza ns relativ usor n medii apoase, prin agitare mecanic sau ultrasonare; Capacitatea de interacie cu soluiile apoase a fost determinat prin msurarea diametrului mediu al particulelor imersate n soluii cu pH acid i bazic. Particulele s-au dovedit sensibile att la pH acid ct i la pH bazic; Gelatina influeneaz variaia n diametru a particulelor, determinnd creterea acestuia, datorit hidrofiliei pe care o imprim materialului; Parametrii procesului nu influenteaz semnificativ dimensiunea i polidispersitatea particulelor, probabil i datorit utilizrii unui exces mare de anioni sulfat, care mascheaz influena altor factori. Particulele se comport similar att la ncrcarea ct i la eliberarea CHL; Testele de biodistribuie au dovedit c particulele marcate cu fluorescein au capacitatea de a ajunge la organele studiate; organele care ar putea fi folosite ca organe int pentru microparticule sunt creierul, cordul i ficatul. Calea de admnistrare optim pentru microparticule rmne, pentru majoritatea organelor, calea intravenoas. Au fost preparate microparticule pe baz de CS i PAV prin dubl reticulare (ionic i covalent) n emulsie invers a soluiilor celor doi polimeri; Particulele au prezentat dimensiuni cuprinse ntre 1,70 m i 3,97 m; Particulele prezint o form sferic bine definit dar formeaz i aglomerate, care se redisperseaz ns relativ uor n medii apoase, prin agitare mecanica sau ultrasonare; Capacitatea de umflare n soluii apoase cu diferite pH-uri a fost evaluat prin msurarea variaiei diametrului mediu n timp. Particulele s-au dovedit a fi sensibile att la pH acid ct i la pH bazic; Cantitatea de chitosan din amestecul iniial de polimeri influeneaz variaia n diametru la umflare a particulelor att n mediul acid ct i n mediul bazic; Particulele se comport similar att la ncrcarea ct i la eliberarea pilocarpinei.

Micro i nanoparticule cu poteniale aplicaii biomedicale

Referine bibliografice
112. L. Gan, S. H. Zhang, X.L. Yang, and X. HB. Immunomodulation and antitumor activity by a polysaccharideprotein complex from Lycium barbarum. International Immunopharmacology. 4(4):563-569, 2004. 113. R.L. Reis, N.M. Neves, J.F. Mano, et al., Natural-based polymers for biomedical applications. Cambridge: Woodhead Publishing;832, 2008. 114. Z. Chen, M.Y. Soo, N. Srinivasan, B. Kwong Huat Tan, and Chan SH. Activation of macrophages by polysaccharide-protein complex from Lycium barbarum L. Phytother. Res. 23(8):1116-22, 2009. 115. Y. Chang, L. Xiao, and Q. Tang, Preparation and Characterization of a Novel Thermosensitive Hydrogel Based on Chitosan and Gelatin Blends. Journal of Applied Polymer Science.113:400-407, 2009. 116. S.S. Silva, B.J. Goodfellow, J. Benesch, et al. Morphology and miscibility of chitosan/soy protein blended membranes. Carbohydrate Polymers.70:25-31, 2007. 117. S. KIM, M.E. NIMNI, Y. ZHI, and HAN B. Chitosan/gelatin-based films crosslinked by proanthocyanidin. Journal of biomedical materials research. 75B(2):442-450, 2005. 118. K. Solomons and J.W. Cochrane. Formaldehyde toxicity. Part II. Review of acute and chronic effects on health. S Afr Med J.66(3):103-6, 1984. 119. T. Takigawa and Y Endo. Effects of Glutaraldehyde Exposure on Human Health. Journal of Occupational Health. 48:75-87, 2006. 120. J. Berger, M. Reist, J.M. Mayer, et al. Structure and interactions in covalently and ionically crosslinked chitosan hydrogels for biomedical applications, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 57:19-34, 2004. 124. S. Reinhard and H. Gareis, Gelatine Handbook: Theory and Industrial Practice. Weinheim: WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA; 347, 2007. 125. A.N. Jtariu (Cadinoiu), M. Danu, C.A. Peptu, G. Ioanid, C. Ibanescu, M. Popa, Ionically and covalently crosslinked hydrogels based on gelatin and chitosan, acceptat pentru publicare la Soft materials. 126. B. Hoffmann, D. Seitz, A. Mencke, A. Kokott, G. Ziegler, Glutaraldehyde and oxidised dextran as crosslinker reagents for chitosan-based scaffolds for cartilage tissue engineering, J Mater Sci: Mater Med, 20:1495-1503, 2009. 127. L. Xiao, Z. Yu, C. Yang, H. Zhu, and D. Yu-min, Swelling Studies of ChitosanGelatin Films Cross-Linked by Sulfate. Wuhan University Journal of Natural Sciences. 9(2):247251, 2004. 128. T.G. Mezger, The Rheology Handbook, ed. Edition n. Hannover: Vincentz Network GmbH; 2006. 129. H.A. Barnes, Handbook of Elementary Rheology. University of Wales: Institute of Non-Newtonian Fluid Mechanics; 2000. 141. A.N. Jtariu, C.A. Peptu, M. Popa, C. Ibanescu, M. Danu, G. Ioanid, RESEAUX INTERPENETRES - INTERCONNECTES A BASE DE GELATINE ET CHITOSANE OBTENUS PAR DOUBLE RETICULATION, 9eme Colloque Franco-Roumain sur Polymres, 27-29 august 2009. 142. A.N. Jtariu (Cadinoiu), C.A. Peptu, S. Curteanu, M. Popa, DOUBLE CROSSLINKED INTERPENETRATED - INTERCONNECTED NETWORKS BASED ON CHITOSAN AND GELATIN, trimis pentru publicare la Biomacromolecules.

146. C. Remun-Lpez and R. Bodmeier, Mechanical, water uptake and permeability properties of crosslinked chitosan glutamate and alginate films, Journal of Controlled Release 44(2-3): 215-225, 1997. 148. A. ORTAN, GH. CMPEANU, C. DINU - PRVU, L. POPESCU, Studies concerning the entrapment of Anethum graveolens essential oil in liposomes, Roumanian Biotechnological Letters, 14(3):4411-4417, 2009. 149. C. Peptu, M. Popa, and S. G. Antimisiaris, Release of Liposome-Encapsulated Calcein from Liposome Entrapping Gelatin-Carboxymethylcellulose Films: A Presentation of Different Possibilities, Journal of Nanoscience and Nanotechnology, 8:1-10, 2008. 153. X. Liang, G. Mao, K.Y. Simon, Mechanical properties and stability measurement of cholesterol-containing liposome on mica by atomic force microscopy, Journal of Colloid and Interface Science, 278:53-62, 2004. 171. A.N. Jtariu, M. Popa, C. A. Peptu, Two Steps Crosslinked Hydrogels Based on Natural and Synthetic Polymers - Preparation and Characterization, 23rd European Conference on Biomaterials, Tampere, 11-15 September, 2010. 172. Y.H. Bae, and S.W. Kim, Hydrogel Delivery Systems Based on Polymer Blend Block Copolymer or Interpenetrating Networks. Advanced Drug Delivery Reviews, 11(1-2): 109135, 1993. 173. R. Morita, R. Honda and Y. Takahashi, Development of a New Dissolution Test Method for an Oral Controlled Release Preparation, the PVA Swelling Controlled Release System (SCRS). Journal of Controlled Release, 90(1):109-117. 2000. 175. A.K. Singla, M.L. Sharma, S. Dhawan, Nifedipine loaded chitosan microspheres: characterization of internal structure. Biotech. Histochem. 76: 165-171, 2001. 176. Y. Kato, H. Onishi, Y. Machida, Application of chitin and chitosan derivatives in the pharmaceutical field. Curr. Pharm. Biotechnol. 4: 303-309, 2003. 178. G. Xu, X. Huang, L. Qiu, J. Wu, Y. Hu, Mechanism study of chitosan on lipid metabolism in hyperlipidemic rats, Asia Pac J Clin Nutr.16 Suppl 1:313-7, 2007. 179. S.H. Yang, C.K. Hsu, K.C. Wang, S.M. Hou and F.H. Lin, Tricalcium phosphate and glutaraldehyde crosslinked gelatin incorporating bone morphogenetic protein - A viable scaffold for bone tissue engineering, J. Biomed. Mater. Res. - B 74 (1): 468-475, 2005. 180. J. Chen, Y. Maekawa, M. Asano and M.Yoshida, Double crosslinked polyetheretherketone-based polymer electrolyte membranes prepared by radiation and thermal crosslinking techniques, Polym. 48 (20): 6002-6009, 2007. 181. H. Gu, L. He , L. Liu and Y.C. Jin, Construction of dermal skeleton by double cross-linking with glutaraldehyde and ultraviolet radiation, Zhonghua ShaoShang Za Zhi , 24 (2):114-7, 2008. 182. S. Liang, L. Liu, Q. Huang and K.L. Yam, Preparation of single or double-network chitosan/poly(vinyl alcohol) gel films through selectively cross-linking method, Carbohyd. Polym. 19:718-724, 2009. 183. J. Lee, C.K.Yeom, C.U. Kim, B.S. Kim, K.J. Kim, S.B. Oh, Process for preparing controlled-released chitosan microcapsule, United States Patent 6228291, 2001. 184. K.B. Yoon, E. A. Lee, E. Jeon, Y.J. Lee, Process for preparing porous hybrid comprising zeolite and chitosan and porous hybrid prepared thereby, United States Patent 7601211, 2009. 185. X. Zhao, Process for the production of multiple cross-linked hyaluronic acid derivatives United States Patent 7514541, 2009.

Micro i nanoparticule cu poteniale aplicaii biomedicale

186. C.A. Peptu, G. Buhus, M. Popa, A. Perichaud, D. Costin, Double Cross-linked Chitosan-Gelatin Particulate Systems for Ophthalmic Applications, Journal of Bioactive and Compatible Polymers, 25 (1): 98-116, 2010. 187. A.M. de Campos, Y. Diebold, E.L.S. Carvalho, A. Snchez, M. Jos Alonso, Chitosan Nanoparticles as New Ocular Drug Delivery Systems: in Vitro Stability, in Vivo Fate, and Cellular Toxicity, Pharmaceutical Research, 21(5), 2004. 192. J. Berger, M. Reist, J.M. Mayera, O. Felt, N.A. Peppas and R. Gurny, Structure and interactions in covalently and ionically crosslinked chitosan hydrogels for biomedical applications, Eur. J. Pharm. Biopharm. 57, 19-34, 2004. 193. V.L. Gocavales, M.C.M. Laranjeira, V.T.Favere, R.C.Pedrosa, Effect of crosslinking agents on chitosan microspheres in controlled release of diclofenac sodium, Polimeros: Ciencia e Tecnologia, 15 (1), 6-12, 2005. 194. L.Y. Wang, Y.H. Gu, Q.Z.Zhou, G.H. Ma, Y.H. Wan and Z.G. Su, Preparation and Characterization of Uniform-Sized Chitosan Microspheres Containing Insulin by Membrane Emulsification and a Two-Step Solidification Process, Colloid Surface B. 50: 26-135, 2006. 195. A. P. Rokhade, N. B. Shelke, S. A. Patil and T.M. Aminabhavi, Novel interpenetrating polymer network microspheres of chitosan and methylcellulose for controlled release of theophylline, Carbohyd. Polym. 69: 678-687, 2007. 196. X.Z. Shu and K.J. Zhu, Chitosan/gelatin microspheres prepared by modified emulsification and ionotropic gelation. J. Microencapsul. 18: 237-245, 2001. 197. Y.J. Yin, F. Zhao, X.F. Song, K.D. Yao, W.W. Lu and J.C. Leong, Preparation and characterization of hydroxyapatite/chitosan-gelatin network composite, J. Appl. Polym. Sci. 77: 2929-2938, 2000. 206. G. Crini, Non-Conventional Low-Cost Adsorbents for Dye Removal: A review. Bioresource Technology, 97(9):1061-1085, 2006. 207. A.M. Stephen, G.O. Phillips and P.A. Williams, Food Polysaccharides and Their Applications. Marcel Dekker Inc, New York, Basel,1995. 208. M. Ratajska, and S. Boryniec, Physical and Chemical Aspects of Biodegradation of Natural Polymers. Reactive and Functional Polymers, 38(1): 35-49. 1998. 209. X. Yang, Z. Zhu, Q. Liu, X. Chen and M. Ma, Effects of PVA, agar contents, and irradiation doses on properties of PVA/WSChitosan/Glycerol Hydrogels Made by g-Irradiation Followed by Freeze-Thawing, Radiation Physics and Chemistry, 77(8): 954-960, 2008.

Valorificarea rezultatelor cercetrii Lucrri publicate n reviste cotate ISI 1. Anca N. Jtariu, Marcel Popa, and Ctlina A. Peptu, Different particulate systems-bypass the biological barriers? Journal of Drug Targeting, 18(4): 243253 2010; 2. Eugen Barbu, Liliana Veretiuc, Mihaela Iancu, Anca Jtariu, Adriana Lungu and John Tsibouklis, Hybrid polymeric hydrogels for ocular drug delivery: nanoparticulate systems from copolymers of acrylic acid-functionalized chitosan and Nisopropylacrylamide or 2-hydroxyethyl methacrylate, Nanotechnology, 20(22):225108 2009; 3. A.N. Jtariu (Cadinoiu), M. Danu, C. A. Peptu, G. Ioanid, C. Ibnescu, M. Popa, Ionically and covalently crosslinked hydrogels based on gelatin and chitosan, acceptat pentru publicare n Soft Materials.

Lucrri publicate n reviste BDI 1. Ctlina Peptu, Anca Jtariu, Anca Indrei, M.Popa, Noi tendine n eliberarea controlat de medicamente lipozomi imobilizai n matrici polimere, Revista Medico Chirurgical a Societii de Medici i Naturaliti din Iai, vol. 113, ianuarie-martie 2009; 2. Anca Jtariu, Ctlina Peptu. Anca Indrei, M. Popa, MICRO AND NANOPARTICLES MEDICAL APPLICATIONS, Revista Medico Chirurgical a Societii de Medici i Naturaliti din Iai, vol. 113, octombrie-decembrie 2009. Lucrri trimise spre publicare 1. A.N. Jtariu (Cadinoiu), C. A. Peptu, S. Curteanu, M. Popa, DOUBLE CROSSLINKED INTERPENETRATED INTERCONNECTED NETWORKS BASED ON CHITOSAN AND GELATIN, trimis spre publicare la Biomacromolecules; 2. A.N. Jtariu (Cadinoiu), M. Iancu (Holban), A. Indrei, M. Costuleanu, M. Popa, C. A. Peptu, Ionic and Covalent Crosslinked Microparticles Based on Chitosan and Gelatin for medical applications, trimis spre publicare la Journal of Bioactive and Compatible Polymers. Comunicri prezentate la manifestri tiinifice
1. A.N. Jtariu, C. A. Peptu, M. Popa, C. Ibnescu, M. Danu, G. Ioanid, RESEAUX INTERPENETRES - INTERCONNECTES A BASE DE GELATINE ET CHITOSANE OBTENUS PAR DOUBLE RETICULATION, 9eme Colloque FrancoRoumain sur Polymres, 27-29 august, 2009; 2. A.N. Jtariu, C. A. Peptu, M. Popa, C. Ibnescu, M. Danu, G. Ioanid, HYDROGELS A BASE DE GELATINE ET CHITOSANE OBTENUS PAR DOUBLE RETICULATION : SYNTHESE, CHARACTERIZATION, APPLICATIONS, 9eme Colloque Franco-Roumain sur Polymres, 27-29 august, 2009; 3. A.N. Jtariu, C. A. Peptu, M. Popa, Preparation And Properties Of The Two Steps Crosslinked Hydrogels Based On Gelatin And Chitosan, 22nd European Conference on Biomaterials, Lausanne, Switzerland, September 7-11, 2009; 4. A.N. Jtariu, M. Popa, C.A. Peptu, MICROPARTICULE CHITOSAN GELATIN RETICULATE IONIC I COVALENT, Zilele Facultii de Inginerie Chimic i Protecia Mediului, Ediia a-VI-a, Noi frontiere n chimie i inginerie chimic, Iai, 18-20 noiembrie, 2009; 5. A.N. Jtariu, M. Popa, C.A. Peptu, NOI HIDROGELURI DUBLU RETICULATE PE BAZ DE GELATIN I CHITOSAN, Zilele Facultii de Inginerie Chimic i Protecia Mediului, Ediia a-VI-a, Noi frontiere n chimie i inginerie chimic, Iai, 18-20 noiembrie, 2009; 6. A.N. Jtariu, M. Popa, C. A. Peptu, Two Steps Crosslinked Hydrogels Based on Natural and Synthetic Polymers Preparation and Characterization, 23nd European Conference on Biomaterials, Tampere, FI, September 11-15, 2010; 7. A.N. Jtariu, M Popa, A. Indrei, C.A. Peptu, Ionic and Covalent Crosslinked Microparticles Based on Chitosan and Gelatin, 23nd European Conference on Biomaterials, Tampere, FI, September 11-15, 2010;

Micro i nanoparticule cu poteniale aplicaii biomedicale

8. A.N. Jtariu, M. Popa, C. A. Peptu, Drug Loaded Particles Immobilized in Polymer Hydrogels, International Symposium Technology & Sustainable Development, Bethune, Frana, 20-23 octombrie 2010.

Contracte de cercetare 1. Membru al echipei de cercetare n cadrul proiectului Lipozomi imobilizai n matrici polimere reticulate - nou concept n eliberarea controlat de principii biologic active, Program PN II IDEI, COD ID_353, Contract nr. 708/2009.