Sunteți pe pagina 1din 27

CAPITOLUL VII NOTIUNI DE GENETIC BACTERIAN Genetica microorganismelor este un domeniu recent al Microbiologiei i al Geneticii, deoarece a existat ideia

preconceput c bacteriile nu sunt un material adecvat pentru astfel de studii. Studiile premergtoare cercetrilor de genetic molecular sunt cele referitoare la bacteriofag (Twort, l9l5, dHerelle, l9l7), dar n special studiile lui Griffith (l928), asupra transformrii genetice la pneumococ. Microorganismele au fost redescoperite pentru studiile de genetic molecular n anii 40, cnd Avery i colaboratorii au demonstrat c ADN este substratul informaiei genetice. S-au descris apoi mecanismele de transfer de material genetic la bacterii, s-au descoperit virusurile temperate (lambda i Mu) i ulterior, plasmidele. Un rol esenial n dezvoltarea geneticii microorganismelor l-a avut grupul fag, condus de M. Delbruck. Studiile referitoare la relaia de tip lizogen dintre virusul temperat lambda i bacteria E. coli au contribuit decisiv la fundamentarea biologiei moleculare i la nelegerea mecanismului transformrii maligne a celulelor animale, sub aciunea virusurilor oncogene ARN. Microorganismele sunt foarte mult utilizate n studiile de genetic din mai multe motive: - genomul bacterian i viral are organizare foarte simpl fa de genomul celulei eucariote, iar din punct de vedere chimic, este format exclusiv din acizi nucleici; - bacteriile sunt haploide, ceea ce favorizeaz studiile de genetic, deoarece o mutaie odat aprut se exprim fenotipic imediat; - ritmul de cretere foarte rapid al microorganismelor permite ca ntr-un interval foarte scurt s se poat urmri evoluia unui numr foarte mare de generaii. - microorganismele folosite n studiile genetice au necesiti nutritive simple i pot fi cultivate pe medii sintetice. Se pot astfel urmri modificrile chimice pe care le produc n mediul de cretere, dependena lor de substanele nutritive, capacitatea lor de a utiliza anumite substraturi; - la microorganisme s-a demonstrat existena mecanismelor de transfer de material genetic i a fenomnelor de recombinare genetic, care pot fi studiate mult mai uor dect la celula eucariot. Organizarea funcional a genomului bacterian Informaia genetic esenial este reprezentat de cromosomul bacterian. In raport cu funciile ndeplinite, n structura sa se ntlnesc mai multe tipuri de determinani genetici: 1. Genele structurale, care reprezint circa 90% din cantitatea informaiei genetice, determin structura primar a proteinelor, respectiv secvena aminoacizilor n lanul polipeptidic. Ele sunt grupate, de regul, n uniti de exprimare coordonat (transcriere sincron), denumite operoni, mpreun cu genele reglatoare. Uneori, ansamblul genelor supuse unui control unitar sunt dispersate n genom i formeaz mpreun un reglon. 2. Genele reglatoare au funcia de a controla activitatea genelor structurale, prin intermediul produsului lor de sintez (represor sau aporepresor). 3. Regiunea operator reprezint segmentul de ADN cromosomal din structura fiecrui operon care are rolul de receptor de semnale. Ele nregistreaz prezena substanelor cu funcie de represor sau de inductor n mediu i asigur funcionarea coordonat a operonului. 4. Regiunea promotor (iniiator) reprezint un fragment din structura operonului, adiacent genei operator. Are funcia de iniiere a transcrierii operonului, n molecula de ARNm. La nivelul su are loc legarea enzimei efectoare, ARN-polimeraza. 5. Secvenele de inserie (SI) sunt secvene nucleotidice scurte (800-l400 nucleotide), caracterizate printr-o mare mobilitate care decurge din capacitatea lor de transpoziie. Transpoziia este termenul care definete rearanjrile ADN, n care o secven de nucleotide se

elibereaz prin excizie din situsul lor de inserie cromosomal sau plasmidial i se reinser la un alt situs pe aceiai sau pe o alt molecul de ADN. 6. Gene pentru sinteza ARNr (l0-20) i ARNt (circa 50), situate n regiuni diferite ale cromosomului. Cromosomul conine de asemenea, secvenele ori care controleaz replicarea, precum i suprafee de legare cu mezosomul. Genetica bacterian s-a dezvoltat pe baza studiului bacteriilor enterice. Problema esenial este identificarea genelor i a funciilor lor. Multe dintre genele necunoscute (circa 1/3) sunt probabil importante pentru supravieuirea n condiiile mediului natural schimbtor: n apele curgtoare, n sol, pe resturi organice, n esuturile gazdei. Nu s-au identificat toate genele cu rol reglator, ca de exemplu: genele ce controleaz diviziunea celular, segregarea nucleoidului, asamblarea. Plasmidele Plasmidele sunt structuri genetice separate fizic de cromosomul bacterian, capabile de replicare independent de cromosom, adic entiti cu capaciti de replicare autonom sau repliconi. Ele conin informaie genetic neesenial pentru creterea i diviziunea celulei, care poate fi ctigat sau pierdut fr ca existena celulei s fie afectat. Autonomia lor fa de cromosom este relativ: sunt separate fizic de cromosom, dar n ceea ce privete replicarea, sunt permanent controlate de gene cromosomale. In categoria plasmidelor tipice intr factorii genetici F, Col, R, Tox etc., care probabil au o rspndire universal n lumea bacteriilor. S-au izolat peste l000 de tipuri de plasmide diferite, prezente n mod natural, n special la bacteriile Gram negative. Clasificarea plasmidelor Plasmidele se denumesc i se clasific dup efectul lor cel mai evident asupra celulei (conferirea proprietii de donor de material genetic, sinteza de colicine, rezisten la antibiotice etc.). Acest criteriu de clasificare nu este satisfctor, deoarece, uneori o plasmid confer mai multe proprieti celulei n care se gsete: de exemplu, plasmida R i confer rezisten la antibiotice, dar n acelai timp celula poate dobndi i calitatea de donor de material genetic. Din acest motiv se folosesc i alte criterii de clasificare. Plasmidele se grupeaz dup criteriul incompatibilitii lor, adic al capacitii de a exclude din celul alte plasmide cu aceiai secven de baze, sau una foarte apropiat. Altfel spus, plasmidele cu acelai tip de informaie genetic sunt incompatibile, adic nu pot coexista ntr-o celul. Clasificarea bazat pe compararea secvenei de baze este mult mai practic. In acelai scop se poate folosi comparaia secvenei de aminoacizi a proteinelor Rep, deoarece sunt codificate de majoritatea plasmidelor i au funcii comune. In funcie de capacitatea lor de a media transferul de material genetic prin conjugare, plasmidele se mpart n dou categorii. l. Plasmidele conjugative (transmisibile sau infecioase), denumite i factori de sex, sunt acelea care confer celulei purttoare de plasmid, proprietatea de donor de material genetic (celula mascul), n raport cu o celul care nu posed o astfel de plasmid i care se comport ca receptor (celul femel). Plasmidele conjugative se mai numesc conjugoni, factori de fertilitate sau transferoni. Ele au n structura genetic, pe lng genele de replicare autonom, determinanii genetici de transfer (tra). Din aceast categorie fac parte plasmidele de sex (F, F, Hfr), plasmidele Ent, unele plasmide Col i unele plasmide R. Plasmidele conjugative au cel puin 30 kbp. 2. Plasmidele neconjugative nu sunt autotransmisibile deoarece nu confer celulei purttoare proprietatea de donor de material genetic, neavnd determinanii genetici tra. Din aceast categorie fac parte celelalte plasmide Col i R. Ele se pot transfera de la o celul la alta, fie prin intermediul unui fag transductor, fie prin procesul de conjugare iniiat de o plasmid conjugativ, coexistent n aceiai celul.

Dup criteriul capacitii lor de a se integra n cromosomul celulei, se disting dou categorii de plasmide. l. Plasmidele episomale (episom = corp adugat) sau integrative pot exista n celul, att n stare autonom (fizic independent) de cromosom, fie n stare integrat n cromosomul bacterian. Din aceast categorie fac parte plasmidele F i Col E1. Cele dou stri sunt reversibile i alternative: dup integrare n structura cromosomului, ele pot trece din nou n stare autonom i redevin fizic independente, printr-o excizie corect, sau printr-o excizie incorect, cnd plasmida se desprinde din inseria cromosomal mpreun cu cteva gene ale acestuia. 2. Plasmidele neintegrative nu se integreaz n cromosomul bacterian, ci persist indefinit numai n stare autonom.

Structura molecular a plasmidelor Plasmidele sunt cromosomi miniaturali (minicromosomi) alctuii din molecule de ADN dublu catenare, circulare, nchise covalent, care reprezint l-2% din mrimea cromosomului. O plasmid poate s conin una sau cteva sute de gene. ADN plasmidial se gsete n celulele bacteriene n trei forme fizic diferite (fig. 114). l. Forma circular nchis covalent (denumit C C C)(Covalently Closed Circular), care prezint n plus 1-2 torsiuni ce dau moleculei aspectul de suprahelice. 2. Forma circular deschis, avnd o caten deschis i una nchis. 3. Plasmidele concatemere sau oligomere concatenate, sunt complexe supramoleculare formate din cteva plasmide i sunt rezultatul unor erori de replicare a monomerilor circulari sau a proceselor de recombinare interplasmidial. Dac ambele catene sunt nchise, componentele individuale ale complexului sunt suprahelicale, iar dac una dintre catene este deschis, forma este circular. Configuraia circular este o condiie a existenei lor n celul, cea care le confer rezisten la aciunea nucleazelor celulare. Totui, s-au identificat plasmide cu configuraie linear (la Streptomyces, Rhodococcus).

Fig. 108. Configuraii diferite ale ADN plasmidial. a. Plasmid circular cu o caten incizat. b, c. Plasmide covalent nchise superhelicale. d. Plasmide concatenate.

Structura genetic i funciile plasmidelor Plasmidele conin urmtoarele categorii de determinani genetici:

l. Gene eseniale pentru existena lor ca repliconi fizic independeni, adic genele implicate n replicarea acestor structuri genetice. 2. Gene de specificitate pentru incompatibilitate. Incompatibilitatea corespunde situaiei n care, dou plasmide omologe nu pot fi meninute stabil n aceiai celul, deoarece una o exclude pe cealalt. Tehnica hibridrii ADN-ADN evideniaz o omologie net ntre plasmidele din acelai grup de incompatibilitate i o foarte mic asemnare ntre plasmidele compatibile. Pe baza incapacitii de a coexista n aceiai celul, plasmidele au fost grupate n grupe de incompatibilitate. 3. Gene structurale, n numr variabil, care confer celulei proprieti noi. 4. Suprafaa de legare de mezosomi, care asigur corelarea replicrii plasmidelor cu ciclul celular, precum i repartizarea lor echilibrat n cele dou celule fiice. 5. Elemente genetice transpozabile (secvene de inserie i transpozoni). 6. Plasmidele conjugative au determinani genetici de transfer (tra). Plasmidele au dimensiuni variate: l 400 kb (echivalentul a l0% din cromosomul de E. coli). Cele mai mici au ADN echivalent pentru 2-3 gene. Genele plasmidiale nu confer un fenotip detectabil celulei purttoare i de aceea se numesc gene criptice. De cele mai multe ori, prezena plasmidelor confer celulelor purttoare, proprieti noi, concretizate ntr-o gam larg de funcii, dintre care, cele mai importante sunt urmtoarele: - rezistena la una sau la mai multe grupe de antibiotice (ampicilina, streptomicina, tetraciclina, kanamicina etc.) i la sulfamide; - rezistena la cationii metalelor grele (la ionii de Hg2+ i combinaiile sale orgnomercurice, la ionii de Ni, Co, Pb, Cd, Zn, Ag, At); - rezistena la anioni: arseniat, arsenit, telurit, borat, cromat; - rezistena la compuii de intercalare(acridin, etidiu) i la radiaiile UV; - proprieti noi de biosintez: sinteza antibioticelor i bacteriocinelor; - proprieti metabolice noi: metabolismul unor glucide simple (lactoza, sucroza, rafinoza), al compuilor compleci (octan, toluen, camfor, 2,4-diclor-toluen), al proteinelor (caseina, gelatina); - producerea de toxine (enterotoxina la E. coli, toxina exfoliativ la S. aureus, neurotoxina la C. tetani) i prin ele, proprieti noi de virulen; - sinteza antigenelor de colonizare la E. coli (antigenele fimbriale K88 i K99); - sinteza materialului capsular la B. anthracis; - inducerea tumorilor de colet la plante (plasmid Ti la A. tumefaciens) i sinteza de ctre celulele tumorii, a derivailor azotai din aminoacizi, denumii opine (octopina, derivat al argininei i nopalina); - infecia i nodularea plantelor leguminoase (plasmida Sym la Rhizobium); - proprieti conjugative: plasmide ce codific sinteza pilinei i asamblarea pililor (i implicit dobndirea sensibilitii la fagii ARN masculi, care se leag specific de pili); - alte proprieti: formarea vacuolelor cu gaz la Halobacterium, variaia translucid/opac a coloniilor de Mycobacterium, producerea H2S la Enterobacteriaceae. Genele localizate pe plasmide inhib exprimarea genelor cromosomale omologe. Controlul numrului de copii plasmidiale Intr-o celul bacterian se gsete un numr diferit de copii plasmidiale: una cteva/celul, sau un numr de l0-l00 copii. Numrul difer n funcie de tipul de control pe care l exercit cromosomul asupra replicrii plasmidelor, de starea fiziologic a celulei, de dimensiunile plasmidelor, dar, n esen, numrul de copii se regleaz prin controlul ratei de iniiere a sintezei ADN. Dac o celul este transformat cu o plasmid ce se afl ntr-un numr mic de copii n celula de origine, ea se va replica odat sau de dou ori nainte de diviziunea celulei. Dac transformarea se face cu o plasmid, care n celula de origine se gsete ntr-un numr mare de copii, ea se va replica n mod repetat pn este atins numrul caracteristic de copii.

Explicaia acceptat pentru reglarea numrului de copii este urmtoarea: plasmida codific un inhibitor, cu rol reglator negativ (inhibitor) asupra iniierii replicrii. Activitatea inhibitorului este dependent de concentraie. Pe msur ce celula crete, concentraia de inhibitor scade i replicarea nu mai este inhibat. Dup replicare, numrul moleculelor de ADN plasmidial se dubleaz. In acelai timp, se dubleaz numrul de gene codificatoare ale sintezei inhibitorului i prin sintez proteic, concentraia inhibitorului. Consecina este stoparea replicrii. Secvena de evenimente este aceiai pentru cazul n care transformarea celulei s-a fcut cu o plasmid ce realizeaz un numr mare de copii/celul. Probabil c, pentru plasmidele care se gsesc n numr mare de copii/celul, efectul inhibtor necesit o concentraie mai mare a factorului inhibitor, dect n cazul plasmidelor cu un numr mic de copii. Amplificarea numrului de copii plasmidiale/celul, semnific creterea major a numrului de copii, n raport cu situaia obinuit. Amplificarea este consecina tratamentelor chimice sau a manipulrilor genetice ale celulei bacteriene. Faptul este extrem de util n domeniul ingineriei genetice celulare cu scopuri biotehnologice. Se creeaz posibilitatea ca o gen util, transferat artificial sau existent n mod natural n structura plasmidei, s realizeze un numr mare de copii/celul i sinteza unui anumit produs, cu o rat corespunzator mai nalt. De exemplu, sinteza catalazei poate fi amplificat de pn la 25 de ori. Incompatibilitatea plasmidelor Cuplurile de plasmide strns nrudite nu pot fi meninute stabil n descendena unei celule, deoarce sunt incompatibile. Faptul este explicabil prin modelul inhibitorului, a crui concentraie este esenial pentru iniierea replicrii. De exemplu, o celul care conine dou plasmide, F i Col E 1 sintetizeaz inhibitori diferii. Replicarea fiecrui tip de plasmid se va desfura independent, deoarece inhibitorul unei plasmide nu regleaz replicarea celeilalte. Astfel, plasmidele F i Col E1 sunt compatibile i aparin unor grupe diferite de incompatibilitate. Invers, dou variante ale aceleiai plasmide nu pot fi meninute stabil n aceiai celul, adic sunt incompatibile. Explicaia const n faptul c, fiecare plasmid codific sinteza propriului inhibitor de replicare, care este activ nu numai asupra repliconului codifcator ci i asupra celuilalt replicon. Astfel, numrul moleculelor plasmidiale n celul, este meninut la un nivel inferior sumei copiilor poteniale ale celor dou plasmide. Plasmidele cu sisteme nenrudite de control al replicrii sunt compatibile. Ele aparin unor grupe diferite de incompatibilitate, iar cele incompatibile aparin aceluiai grup. Eliminarea plasmidelor Eliminarea plasmidelor din celula sau procesul de vindecare se poate realiza spontan sau cu o frecven superioar, prin tratarea celulelor cu substane care interfer selectiv cu replicarea lor, fr s modifice dinamica replicrii cromosomului. Pierderea plasmidelor nu afecteaz viabilitatea celulei, datorit caracterului neesenial al informaiei lor genetice. Eliminarea plasmidelor este realizat cu oarecare eficien de acriflavin, rifampicin, bromura de etidiu, ionii de cobalt. Unii ageni chimici au aciune selectiv, fiind foarte eficieni pentru eliminarea unor plasmide (acridina elimin plasmida F), fr s afecteze pe altele. Din punct de vedere practic, aciunea selectiv este important, n primul rnd pentru eliminarea plasmidelor de rezisten la antibiotice. Selectivitatea aciunii unor ageni chimici se explic prin compoziia diferit n baze, a plasmidelor fa de cromosom. Quinolonele sunt recunoscute pentru eficacitatea lor ca ageni de eliminare a plasmidelor, dar nu exist nici un agent chimic de vindecare a tuturor plasmidelor.

Replicarea plasmidelor Studiul replicrii plasmidelor a dus la descoperirea ARN antisens. Plasmidele au o regiune esenial ce conine genele implicate n replicare i controlul ei, care teoretic, sunt singurele gene obligatorii ale unei plasmide. In regiunea esenial a unei plasmide sunt concentrate cteva gene i secvene: - originea replicrii (ori), caracteristic fiecrui replicon. La nivelul regiunii ori se gsesc secvene specifice cu care interacioneaz proteina Rep(proteina de iniiere a replicrii). Aici, cele dou catene se pot separa pentru iniierea replicrii i ncepe sinteza catenei leading. In multe cazuri, originea replicrii conine secvene repetate direct denumite iteroni. Ele sunt situsurile de legare ale proteinei Rep, se gsesc i n afara originii replicrii, avnd i rol n controlul replicrii ; - gena codificatoare a proteinei Rep, existent la multe plasmide; - secvenele cu rol n controlul replicrii.

Fig. 109. Replicarea plasmidelor dup modelul cercului rotativ. Proteina Rep codificat de plasmid recunoate originea dublu catenar (dso) a ADN superhelical i produce o clivare situs specific, genernd un capt 3OH. Captul 3OH este alungit de proteinele de replicare, iar catena parental este dislocat. Cnd bifurcaia de replicare ajunge la situsul dso, proteina Rep catalizeaz o reacie de transfer a catenei, elibernd un intermediar monocatenar de ADN i o molecul dublu catenar, cu o caten parental i una nou sintetizat (cercul punctat). Pe molecula circular monocatenar este iniiat sinteza unei catene lagging, la situsul monocatenar de origine (sso), catalizat de ARN-polimeraz. Enzima va sintetiza un primer scurt de ARN, iar sinteza catenei lagging este catalizat de ADN-polimeraz. Produsele sintezei sunt dou molecule de ADN superhelicale (dupa Bennett, 1998).

Plasmidele se replic fizic autonom fa de cromosomul bacterian, dar funcional, replicarea este total sau parial dependent de proteinele codificate de genele cromosomale. Majoritatea plasmidelor sunt circulare. Plasmidele lineare s-au gsit la bacteriile Gram pozitive i Gram negative. Iniierea replicrii necesit asamblarea replisomului, format din ADN polimeraza III, o ADN helicaz i primaza (proteina Rep).

S-au propus 3 mecanisme generale de replicare ale plasmidelor circulare: replicarea dup modelul theta, replicarea prin deplasarea catenei i replicarea dup mecanismul cercului rotativ. Plasmidele circulare se replic semiconservativ i i pstreaz forma circular pe toat durata ciclului replicativ. Replicarea dup modelul theta (al cercului simplu) este foarte frecvent la plasmidele bacteriilor Gram negative i ncepe la un punct denumit originea replicrii (ori), prin incizia ambelor catene. Evenimentele timpurii sunt: - deschiderea celor dou catene la secvene specifice (ori), catalizat de proteina Rep; - sinteza primerilor ARN. De cele mai multe ori, iniierea replicrii necesit o protein iniiatoare, codificat de plasmid (proteina Rep). Proteina Rep recunoate specific i se asociaz cu secvena de origine a replicrii. Regiunea ori conine secvene de baze repetate n ordine direct, denumite iteroni. Iteronii sunt eseniali nu numai pentru replicare, dar i pentru controlul replicrii. Cele dou catene, dup incizie au rolul de matrie pentru sinteza catenelor noi. Bifurcaia de replicare se deplaseaz uni- sau bidirecional. Ambele catene se replic simultan. Replicarea prin deplasarea catenei necesit 3 proteine codificate de plasmid, pentru iniierea replicrii ADN. Replicarea este iniiat la origine i progreseaz n oricare din cele dou direcii prin mecanismul deplasrii catenei. Cele 3 proteine codificate de plasmid (Rep A, Rep B, Rep C) au rol de helicaz, primaz i respectiv de iniiere. Replicarea ncepe de la dou origini simetrice i adiacente monocatenare (ssi A i ssiB). Replicarea ncepe cnd aceste origini sunt accesibile ca regiuni monocatenare. Despiralizarea este dependent de dou proteine de replicare, Rep C i Rep A i este uurat de o secven bogat n A-T care precede regiunile ssi A i ssiB. Rep C recunoate secvenele repetate ale regiunii adiacente secvenei bogate n A-T, iar Rep A este o helicaz. Rep B are rol de primaz i este specific plasmidei. Sinteza fiecrei catene este continu i se face cu deplasarea catenei complementare. Replicarea catenei deplasate se iniiaz la originea ssi. Replicarea dup modelul cercului rotativ este unidirecional, deoarece sinteza celor dou catene este decalat n timp. Proteina Rep creeaz o bre la secvena dso (double strand origin) i genereaz gruparea 3OH, cu rol de primer terminal. Captul 3OH al catenei de polaritate negativ are rol de primer pentru sinteza catenei leading, fiind alungit prin polimerizare pe catena circular de polaritate opus, cu rol de matri. Catena negativ este ndeprtat, pe msur ce replicarea progreseaz. Alungirea captului 3OH al catenei negative continu pn cnd complexul enzimatic de replicare (replisomul) a parcurs ntregul cerc al matriei pozitive. Dup ce ntreaga caten circular pozitiv a fost copiat ntr-o caten complementar, proteina Rep catalizeaz o reacie de transfer i catena negativ este circularizat. Astfel, ntr-o prim etap, din procesul replicrii, rezult o molecul circular dublu catenar i catena negativ parental, de asemenea circular. Caten negativ circular este ulterior convertit la molecula dublu catenar, pornind de la o origine proprie a replicrii. Mecanismele de replicare a plasmidelor sunt comune i pentru replicarea genomului unor dezoxiribovirusuri. Plasmidele actinomicetelor La actinomicetele miceliene s-a identificat o larg varietate de plasmide diferite, majoritatea conjugative. Ele nu conin gene de rezisten sau pentru alte particulariti metabolice, ci conin numai gene de replicare i fertilitate. Unele conin genele codificatoare ale sintezei antibioticelor. Unele sunt plasmide mari (cteva sute de kbp) i adeseori codific pentru cile de biosintez ale antibioticelor. Ele se replic de la punctul de origine, localizat central i poart proteine legate de secvenele repetitive de la ambele capete. Aceste plasmide par s se recombine frecvent cu cromosomul linear, rezultatul fiind schimbul secvenelor terminale ale celor dou structuri. Extremitile cromosomului de Streptomyces nu conin gene eseniale i de aceea pierderea acestor gene nu interfer cu viabilitatea.

Schimbul fragmentelor de ADN plasmidial i cromosomal poate fi o cale foarte eficient de diseminare a genelor prin transfer pe orizontal. Plasmidele integrative de la Streptococcus pot fi excizate din cromosom i devin autonome. In stare autonom se replic dup modelul cercului rotativ sau dup modelul (theta). Integrarea se face prin recombinare la situs specific, mediat de o integraz codificat de plasmid, la un situs ce corespunde unei gene cromosomale pentru sinteza ARNt. Diferitele plasmide se integreaz n diferite gene pentru ARNt. Deoarece genele pentru ARNt sunt bine conservate la bacterii, spectrul de gazd al plasmidelor integrative este mai larg dect al celor care se replic autonom. Sinteza ADN linear necesit prezena unui primer, care n mod obinuit este generat de o ARNpolimeraz ce se asociaz cu ADN i sintetizeaz o molecul scurt de ARN. ARN-polimerazele nu copiaz secvena situsului la care ele se leag. Cum sunt copiate capetele acestor structuri ? Pentru cromosomii eucariotelor (care conin ADN linear), impedimentul este depit prin prezena secvenelor repetitive la capete (telomere). Copii ale acestei secvene pot fi adugate dup replicare, sub aciunea enzimelor specifice (telomeraze). La Streptomyces, replicarea ADN linear al plasmidei (fig. 110) este iniiat de o protein cu rol de primer, ataat la captul 5 al fiecrei catene (fig. 112). Capetele 3 sunt libere i sunt sensibile la degradarea cu exonucleaza 3. La diferite tulpini de Streptomyces productoare de antibiotice, s-au gsit plasmide gigante (180-590 kb), pe care sunt plasate genele codificatoare ale antibioticelor. Iniierea replicrii se face prin asocierea acestei proteine cu o a II-a molecul a aceleiai proteine, legat covalent cu o nucleotid. Nucleotidul formeaz legturi de H cu captul 3 al catenei complementare i ofer o grupare 3OH, cu rol de primer pentru sinteza ADN.

Fig. 110. Replicarea plasmidelor lineare la Streptomyces (dupa Dale, 1996).

Unele dovezi experimentale sugereaz c replicarea plasmidelor este iniiat de proteine de replicare, distincte de cele care iniiaz replicarea cromosomului. De exemplu, cloramfenicolul (sau un alt inhibitor al sintezei proteice) inhib iniierea replicrii ADN cromosomal, dar nu a ADN plasmidial. Numrul de plasmide/celul crete la circa l000. Replicarea plasmidelor continu dup inhibiia replicrii ADN cromosomal, deoarece ele utilizeaz proteine de replicare codificate de plasmide, stabile la aciunea agenilor chimici. Distribuia plasmidelor n procesul diviziunii

Replicarea este o condiie necesar, dar nu suficient pentru meninerea plasmidelor n celula bacterian. Prin diviziune, fiecare dintre cele dou celule fiice trebuie s dobndeasc cel puin o copie a plasmidei. Pentru plasmidele mari, cu un numr mic de copii/celul (plasmid F i unele plasmide R), distribuia este un proces activ, care implic funcii codificate de plasmid. Mecanismul distribuiei active este necunoscut. Se presupune c o secven de cteva sute de baze, echivalent unui centromer primitiv, mperecheaz plasmidele nainte de diviziune. Aceast secven, mpreun cu una sau mai multe proteine, codificate de plasmid sau de cromosom formeaz sistemul de distribuie sau de partiie. Sistemul poate orienta asocierea plasmidelor de membran sau lng zona de formare a septului de diviziune. Incompatibilitatea funcioneaz i la acest nivel: plasmidele asemntoare au acelai sistem de distribuie i se repartizeaz dezechilibrat n cele dou celule fiice. Plasmidele mici nu au sisteme de distribuie activ. Distribuia lor n celulele fiice este ntmpltoare. Ele realizeaz un numr mare de copii/celul (30-40), astfel nct ansa ca o celul fiic, s nu primeasc nici o copie plasmidial, este foarte mic. Recombinarea plasmidelor Recombinarea este definit de proprietatea plasmidelor de a se asocia prin mecanisme genetice, cu ali repliconi: cu cromosomul bacterian sau cu alte plasmide. Recombinarea este o proprietate limitat numai la plasmidele care au capacitate integrativ. Ca urmare a acestei proprieti, ele trec reversibil de la starea fizic autonom, la cea integrat. Plasmidele cu funcii episomale se pot integra reversibil, att n cromosomul bacterian, ct i ntro alt plasmid existent n celul. Integrarea n structura cromosomului este precedat de secionarea ambelor structuri genetice, sub aciunea unei nucleaze, urmat de reunirea lor prin extremitile libere, ntr-o singura molecula circular. Consecutiv recombinrii, plasmida nu se mai replic autonom, ci numai sincron cu ceilali determinani genetici cromosomali. Recombinarea genetic plasmid-plasmid se face prin acelai mecanism molecular al integrrii plasmid-cromosom i este deosebit de important prin consecinele sale. Fenomenul st la baza formrii plasmidelor mari, cu rol de conjugon, ca i la baza acumulrii pe aceiai plasmid, a unui numr mare de gene structurale, care confer, fiecare n parte, rezisten la un antibiotic diferit. Integrarea recombinatorie a plsmidelor este un proces reversibil. Printr-un proces de excizie (invers celui de recombinare), plasmidele se desprind din inseriile structurii genetice n care au fost integrate i revin la starea fizic autonom. Excizia poate fi corect, cu exactitate de la situsurile de integrare, astfel nct plasmida redevenit autonom, este identic cu cea dinainte de integrare. Uneori, excizia este incorect, caz n care, plasmida schimb cu cromosomul, prin procese de recombinare, o secven de nucleotide. Plasmida recombinat este modificat: a pierdut o parte din determinanii genetici proprii, dar a ctigat o secven echivalent, de origine cromosomal. Plasmidele F Plasmidele F (Fertility), denumite i plasmide de sex sunt uniti genetice extracromosomale cu proprieti episomale i funcie de conjugon. Prototipul plasmidelor de fertilitate este cel descris la E. coli K12, prezent ntr-un singur exemplar/celul bacterian, datorit sincronizrii replicrii sale cu replicarea cromosomului (fig.111). Mrimea sa este apreciat la 94,5 kbp, distribuite n 4 regiuni distincte: - regiunea genelor de incompatibilitate (inc) i a celor implicate n replicare (rep); - regiunea care cuprinde cele patru elemente genetice transpozabile (trei secvene de inserie (IS) i transpozonul Tn l000; - regiunea linitit, cuprins ntre IS2 i inc-rep; - regiunea tra, care cuprinde secvenele ori T (de origine a transferului) i nc cel puin 28 de gene structurale ale plasmidei.

Fig. 111. Harta genetic a factorului F de la E. coli. Amnunte in text.

Plasmidele F se replic fizic autonom, dar sincron cu cromosomul bacterian, datorit unei strnse asocieri fizice cu acesta. In funcie de prezena plasmidelor de sex F, de raportul lor cu cromosomul bacterian i de mecanismul n care este mediat transferul de material genetic, celulele bacteriene se pot grupa n patru categorii distincte: l. Celulele F-, lipsite de factorul F, echivalente fiziologic unor celule femele, care se comport ca receptoare de material genetic. 2. Celulele F+ poart plasmide F autonome i sunt fiziologic echivalente unor celule mascule sau donoare de material genetic, fiind capabile sa transfere o copie a plasmidei F, n timpul conjugrii. 3. Celulele Hfr posed plasmida F integrat n cromosom. Fiziologic, sunt considerate ca avnd un caracter de supermascul, deoarece se comport ca donoare de material genetic, realiznd procese de conjugare i recombinare cu o frecven mare. 4. Celulele F sunt purttoare ale unei plasmide F recombinat, care a ncorporat n structura sa, i gene ale cromosomului bacterian n care a fost iniial integrat i din care a trecut n stare autonom, printr-un proces de excizie eronat. Aceste celule au caracter mascul i se comport ca donoare de material genetic (transfer factorul F). Plasmidele R Plasmidele R (de rezisten transmisibil, cu caracter infecios), descrise de Watanabe (l960), sunt elemente genetice extracromosomale care confer celulei purttoare, rezisten simultan la mai multe antibiotice, la sulfamide, la cationii metalelor grele. El a demonstrat rezisten simultan a celulelor de Shigella (agentul dizenteriei, bacterie Gram negativ, enteric), la mai multe antibiotice, iar rezistena s-a dovedit a fi transmisibil la celule sensibile. Plasmidele R conin informaia genetic ce confer rezisten la mai multe antibiotice, la sulfamide (produi de sintez chimic, derivai ai acidului paraaminobenzoic) i la diferii ageni chimici. Datorit nrudirii chimice dintre diferite familii de antibiotice, o plasmid confer rezisten simltan, la un numr mare de antibiotice. Astfel, celula bacterian devine suprarezistent, att calitativ cat i

cantitativ. Datorit rezistenei plasmidiale, bacteriile patogene produc infecii foarte greu de controlat prin mijloacele terapeutice obinuite. Plasmidele R au fost evideniate la E. coli, Proteus, Salmonella, Pseudomonas, Erwinia, Yersinia, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium etc. Plasmidele R au o structur genetic complex i sunt alctuite din urmtoarele categorii de determinani genetici: - genele care confer rezisten la antibiotice (genele r ); - genele care confer plasmidei R, funcia de conjugon (transferon). Ele sunt grupate ntr-un transpozon, formnd factorul de transfer al rezistenei (FTR). Se numesc gene tra i codific sinteza proteinelor necesare transferului plasmidei prin conjugare; - secvene de inserie; - secvena de iniiere a procesului de replicare (ori); - genele ce asigur replicarea fizic autonom, a plasmidei. Genele r fac parte din structura unor transpozoni (fiind delimitate de secvene de inserie) i au o mobilitate foarte accentuat, adic se deplaseaz dintr-un situs n altul n structura plasmidei sau ntre plasmid i cromosom. Numrul genelor de rezisten ntr-o plasmid este variabil. Spre deosebire de plasmidele F, plasmidele R nu se integreaz n cromosomul bacterian. Cele dou categorii de determinani genetici, de rezisten i de transfer, pot s existe n stare recombinat sau se gsesc disociai n celula bacterian, ca uniti de sine stttoare (fig. 112): - factorul de transfer al rezistenei (FTR) ce poart gene reglatoare ale replicrii, genele de transfer i uneori gena de rezisten la tetraciclina (tet), cu gr. mol. de ll x l06 D; - cellalt component, care conine genele de rezisten la antibiotice i are dimensiuni foarte diferite, ntre cteva milioane - l00 milioane D. Cele dou plasmide mici se replic autonom.

Fig. 112. Harta genetic a unei plasmide R, cu gene de rezisten la diferite antibiotice i la diferii ageni chimici cu efect antibacterian. Unele plasmide R conin factorul de transfer al rezistenei (FTR) cu determinanii genetici de rezisten.

In celulele de E. coli, cele dou plasmide se recombin i formeaz o plasmid mare, care poart att genele de rezisten, cat i pe cele de transfer. In aceast stare, plasmid R se transmite prin conjugare cu o frecven foarte mare: l00% din celulele sensibile ale unei populaii celulare ce formeaz cupluri de conjugare, primesc o copie a plasmidei R i devin rezistente (aa numita rezisten infecioas sau transmisibil). Frecvena transmiterii conjugative scade treptat, datorit sintezei unui represor care blocheaz activitatea genelor tra i astfel este inhibat sinteza pilinei i implicit asamblarea pililor.

Dac plasmid R nu conine determinanii genetici tra (FTR), transferul su se face prin transducie mediat de un fag de dimensiuni mari, sau prin conjugare iniiat de alte plasmide conjugative. Bacteriofagii Bacteriofagii sunt virusuri care infecteaz celulele bacteriene (eubacterii). Cel mai adesea, rezultatul interaciunii este liza celulei gazd. Fenomenul lizei transmisibile a bacteriilor a fost descoperit de Twort (l9l5) i l-a atribuit unei enzime litice sau unui virus. DHerelle (l9l7) a descoperit independent fenomenul lizei bacteriene, a demonstrat natura particulat a agentului inductor i l-a denumit bacteriofag (mnctor de bacterii) sau prescurtat, fag. Denumirile fagilor deriv de la grupul de organisme gazd: actinofagi (infecteaz actinomicetele), cianofagi (pentru cianobacterii), micofagi (infecteaz fungii microscopici).

Fig. 95. Principalele tipuri morfologice de bacteriofagi.

Se disting trei tipuri morfologice de fagi (fig. 95): fagii n form de cirea cu coad: au cap i coad de lungimi diferite, flexibil sau rigid); fagii filamentoi fagii sferici, fr coad. Structura molecular este mai bine cunoscut pentru fagii din seria T, n special din grupul T-par (T2, T4, T6) i fagul , (infectioi pentru E. coli), fagul X l74. Anatomia molecular a fagilor din seria T-par Studiul fagilor la nivel molecular a fost iniiat n anii 40 de ctre M. Delbruck. Particula fagic matur din seria T-par, are gr. mol. de 2,2 x l08 D i este alctuit din ADN (40%)i proteine (60%).

Simetria fagului T4 este binar: capsomerele regiunii capului sunt aezate dup o simetrie icozaedric, iar la nivelul cozii, dup o simetrie helical. Capul fagului T4, cu o lungime de l00 nm i limea de 65 nm, pe imaginile electrono-optice ale preparatelor umbrite, are form poliedric*, iar n seciune longitudinal, are un contur hexagonal (fig. 96).
Forma geometric exact a capului nu este cunoscut, deoarece capsomerele nu se observ n structura sa intact, ci numai dup dezintegrarea parial. Pe baza formei umbrelor virionilor n preparatele umbrite, capul este descris ca o prism hexagonal bipiramidal. Cele dou piramide sunt decalate una fa de alt cu un unghi de 30 o. Din cauza decalajului, ar rezulta o configuraie geometric, denumit antiprism hexagonal bipiramidal.
*

In interiorul capului se gsete genomul fagic, o molecul de ADN dublu catenar, linear, cu o lungime de circa 50 m i aproximativ 200 de gene, mpachetat foarte strns, asociat cu alte tipuri de molecule: - o protein intern (300 l000 de molecule), cu gr. mol. mic; - un polipeptid acid (l000 3000 de molecule); - dou tipuri de poliamine (spermidina i putrescina). La vrful uneia dintre piramide se gsete un mic dop proteic, care face legtura ntre capsid (cu axe de simetrie de tip 5 i 2) i gt, un tub cilindric, cu simetrie helical. Dopul proteic ar avea rolul de adaptor de smetrie. Gulerul are forma unei plci hexagonale, cu un orificiu n zona central, strbtut de cilindrul axial al cozii, situat n continuarea gtului. Cilindrul axial al cozii are un diametru de 7,5 nm i un lumen canalicular de 2 nm. Prin acest canal, ADN fagic este transferat n celula bacterian. In jurul cilindrului axial este asamblat teaca contractil a cozii. Cilindrul axial este mai lung dect teaca cozii i proemin n raport cu ea, avnd rolul de a perfora peretele celulei bacteriene. Teaca cozii este alctuit din l44 de capsomere, dispuse pe 24 de rnduri, dup o simetrie helical. Prin contracie, teaca se scurteaz, datorit reaezrii spaiale a capsomerelor i elibereaz cilindrul axial pe o lungime de circa 50 nm, permindu-i s perforeze peretele celulei bacteriene. La extremitatea cozii se gsete placa bazal, cu aspectul uni disc hexagonal, cu diametrul de 40 nm, format dintr-un pivot central i 6 subuniti aezate dup o simetrie radial de tip 6. Orificiul central al pivotului este strbtut de cilindrul axial al cozii. Placa este prevzut cu 6 crlige, denumite croetele cozii, cte unul la fiecare vrf al hexagonului. Rolul croetelor este de a fixa ferm particula fagic pe suprafaa celulei bacteriene. Fibrele cozii, n numr de 6, sunt structuri filamentoase proteice, lungi de l30 nm i par a fi alctuite din 4 subuniti identice. Cu una dintre extremiti, fiecare fibr este fixat stabil la unul dintre vrfurile plcii hexagonale, iar cu extremitatea distal se leag lax de subunitile gulerului, formnd astfel nveliul extern al cozii, n jurul tecii contractile. Inainte de fixarea pe celul, fibrele se desprind din inseria lor distal pe guler i rmn legate numai de placa bazal. Fibrele cozii ar avea rolul unor structuri de ancorare a fagului de peretele bacterian, n cursul interaciunii primare. Genomul fagic. Fagii cei mai mici - fagi ARN masculi - (Q-beta, MS2 i f2) au genomul format dintr-o molecul de ARN monocatenar, de circa 3,5 x l03 baze, cu topologie linear. Adeseori, molecula de ARN formeaz structuri secundare dublu catenare n ac de pr(hairpin), prin intermediul punilor de H care reunesc 60-80% din totalul bazelor.

Fig. 96. Anatomia bacteriofgului T 4.

Fagii filamentoi (Ml3, f1, fd) i cei cu simetrie icozaedric, fr coad (X l74 etc.), au genomul format dintr-o molecul de ADN monocatenar, circular. Fagii din seria T-par (T2, T4, T6), T-impar (T1, T3, T5, T7), fagul , P2 au genomul format dintr-o molecul de ADN dublu catenar, linear. Exist deosebiri ale secvenelor terminale ale moleculei de ADN. Astfel, la fagii , P2 (cu genom ADN dublu catenar, linear), ambele extremiti se termin cu secvene monocatenare, complementare unele fa de altele, formnd capete aderente, coezive sau lipicioase. Prin legarea celor dou extremiti, pe baza complementaritii, genomul fagului, liber n celula gazd, se circularizeaz. Fagii din seria T-impar au ca genom, o molecul de ADN dublu catenar linear, iar la extremiti, au secvene nucleotidice repetate invers, de la 250 la l0000 de baze. Genomul fagului T4 conine circa 200 de gene. Peste 50 dintre ele au rol n procesul asamblrii, iar celelalte codific diferite proteine cu rol n ciclul de multiplicare. O mic parte dintre genele de multiplicare sunt eseniale, iar restul sunt neeseniale, deoarece au corespondent printre genele cromosomului bacterian. Fenomenele mutaionale ale genelor neeseniale nu blocheaz desfurarea ciclului de multiplicare, dar randamentul infeciei este net inferior (se asambleaz un numr mai mic de fagi progeni). Informaia genetic a fagilor, ca i a celulelor bacteriene are caracter continuu, adic, de regul lipsesc secvenele necodificatoare. Cteva gene ale fagului T4 conin cte un intron de circa l000 pb (de exemplu, gena timidilat-kinazei). Genomul fagic se deosebete de al virusurilor infecioase pentru celulele animale, prin coninutul n baze neobinuite: 5-hidroxi-metil-citozina, n locul citozinei la fagii din seria T-par sau 5-hidroxi-metiluracil i 5-4,5-dihidroxi-pentil-uracil.

Relaiile fag-bacterie Studiul relaiilor fag-bacterie a adus o contribuie major la fundamentarea i evoluia biologiei moleculare. Istoria cercetrilor interrelaiilor fag-bacterie se confund, pn n anii 70, cu nsi istoria biologiei moleculare. Studiul interaciunii fag-bacterie a fundamentat concepte i a permis demonstrarea unor mecanisme ale biologiei moleculare: - inducia sintezei enzimelor i proteinelor codificate de fagi; - colinearitatea gen-protein - natura nesuprapus a codului genetic - mecanismul semiconservativ al replicrii ADN - existena fenomenelor de restricie i modificare la bacterii - mecanismul traducerii informaiei genetice - mecanismele mutagenezei i aciunea fenomenelor reparatorii - reglarea activitii genelor - mecanismele oncogenezei virale. De cele mai multe ori, infecia fagic a unei culturi bacteriene sensibile, evolueaz n sensul sintezei constituienilor fagici. Se asambleaz i se elibereaz fagi progeni, rezultatul fiind liza celulei bacteriene. Studiul multiplicrii fagilor a nceput odat cu evidenierea formrii plajelor de liz, ntr-o pnz de celule bacteriene, crescute pe suprafaa unui mediu agarizat. Fiecare plaj de liz este iniiat prin multiplicarea unei singure particule virale fagice i este rezultatul repetrii ciclului litic al infeciei fagice, n perioada de cretere a culturii bacteriene. A II-a modalitate de evoluie a interaciunii fag-bacterie este caracteristic fagilor temperai i corespunde fenomenului de lizogenie. In interaciunea de tip lizogen, genomul viral se integreaz n structura cromosomului bacterian i se comport ca gene cromosomale. Ciclul litic al interaciunii fag-bacterie. Multiplicarea bacteriofagului Multiplicarea fagului are loc ntr-o serie de etape, identificate iniial pentru cuplul fag T4- E. coli. Inelegerea lor a avut un rol esenial pentru studiile privind interaciunea dintre virusuri i celulele animale. Multiplicarea propriu-zis este precedat de stabilirea contactului fizic dintre fag i celula sensibil. Adsorbia i fixarea fagului sunt rezultatul ciocnirilor ntmpltoare dintre particula fagic i celula bacterian, a cror frecven depinde de densitatea lor relativ. La densitatea de l0 8 bacterii/ml i l07-l09 fagi/ml, n cteva minute, 90% dintre fagi se adsorb pe suprafaa bacteriilor. Pentru fixarea fagilor din seria T-par, un rol esenial par s-l aib croetele plcii bazale, deoarece distana dintre placa bazal i peretele celular nu este niciodat mai mic de 5 nm. Fixarea particulei fagice pe celula bacterian, depinde de existena, la suprafaa celulei, a unor structuri chimice complementare denumite receptori de fag. Receptorii s-au evideniat pe membrana extern a peretelui celular i pe stratul capsular la bacteriile Gram negative, pe acizii teichoici ai bacteriilor Gram pozitive, pe flageli i pe pili. S-au descris 4 mecanisme principale de legare a fagilor, pe suprafaa celulei bacteriene: - fagii cu coad contractil din seria T, se fixeaz reversibil, prin intermediul fibrelor cozii, pe catenele glucidice ale LPS la bacteriile Gram negative, sau de acizii teichoici parietali (legai covalent de murein), la cele Gram pozitive. Fibrele cozii fagului T 4, prin captul lor distal, interacioneaz cu specificitate nalt, cu resturile glicozil ale LPS din membrana extern la E. coli. Fixarea ireversbil este rezultatul legrii croetelor plcii bazale, cu receptorii celulei;

fagii cu coad necontractil, se leag de componenta glucidic a LPS din membrana extern a peretelui celular. Imediat dup aceea, are loc degradarea parial a receptorilor sub aciunea unei endoglicozidaze virale. De obicei, capsula bacterian blocheaz fixarea fagilor pe structurile subiacente, dar uneori, fagii se leag de receptorii capsulari i infecteaz celula, dup degradarea parial a polizaharidelor; - fagii icozaedrici ARN masculi se leag pe suprafaa pilului. Sinteza proteinei componente a pilului (pilina) i asamblarea ei sunt codificate de plasmida F. Pilul este o structur caracteristic numai celulelor bacteriene cu potenialitate de donor de material genetic i de aici deriv denumirea de fagi masculi; - fagii filamentoi se fixeaz la extremitatea pilului, prin intermediul proteinei A (Attachment, engl. = ataare) a capsidei virale. Nu se cunoate mecanismul prin care genomul fagilor ARN masculi sau filamentoi ajunge n celula bacterian. Este puin probabil ca pilul s aib rol de conductor al genomului fagic. Se pare c pilul se retract i astfel fagii sunt orientai pn la un receptor al suprafeei celulare. -

Fig. 97. Ataarea bacteriofagului T 4 de peretele celular al E. coli i injectarea ADN viral. (a) Virion netaat. (b) Ataarea virionului prin fibrele cozii. (c) Fixrea ireversibil prin intermediul croetelor plcii bazale. (d) Contracia tecii cozii i injectarea ADN (dup Brock, 1988).

Infecia propriu-zis. Dup fixarea pe suprafaa celulei bacteriene, placa bazal i schimb conformaia i induce o modificare a modului de aranjare a capsomerelor tecii cozii. Ca urmare, teaca se contract i se scurteaz, uurnd ptrunderea cilindrului axial al cozii, prin peretele celular, cu o lungime de circa l2 nm. ADN din capul fagului, trece n celul pe calea cilindrului axial tubular (fig. 97). La fagii din seria T-par, coada contractil, injecteaz genomul n citoplasma celulei.

Capsida fagic rmne n ntregime la exterior, ndeplinind numai rolul unei microseringi, adaptat s injecteze genomul fagic n celul. Mecanismul injectrii genomului fagic nu este cunoscut cu certitudine. Membrana intern i cea extern, par s fuzioneze local, formnd un canal, sub aciunea presiunii pe care o exercit vrful cilindrului axial al cozii. Acidul nucleic fagic ptrunde direct, prin punctul de fuziune a membranelor. Genomul fagic ar fi orientat spre celula bacterian, de molecule proteice pilot asociate genomului. Ulterior, canalul membranar se nchide cu proteinele pilot, ataate la extremitatea proximal a ADN, cu rol n specificitatea i eficiena translocaiei ADN prin membranele celulei. Injectarea genomului fagic se realizeaz ntr-un interval foarte scurt (circa l5 secunde). n procesul transferului genomului fagic, celula bacterian ar fi pasiv, pentru c n capsid, ADN fagic este pliat i mpachetat foarte strns, ceea ce ar crea o presiune datorit creia ADN, n momentul contraciei cozii i al scoaterii dopului proteic, ar fi propulsat energic n celula bacterian. La aceasta sar aduga presiunea produs de agitaia termic a moleculelor mari, existente n capul fagului. Ali autori consider c celula ar exercita un efect de aspiraie, care ar facilita ptrunderea genomului fagic. Concomitent cu genomul, trec moleculele legate ionic de ADN: mici cantiti de proteine, oligopeptide bazice, poliamine. Genomul fagic liber n celul, corespunde strii de fag vegetativ i poate fi transcris i replicat. Infecia fagic a celulei bacteriene, determin o reorganizare profund a activitii sale biologice. Rezultatul interaciunii, de cele mai multe ori, este subordonarea ntregului aparat de biosinteza celular, n scopul producerii constituienilor virali. Programul genetic este transcris n dou etape: timpurie i tardiv, separate n raport de intervalul de timp al replicrii genomului. Programul timpuriu al genomului fagic codific urmtoarele categorii de proteine: - proteine de membran, destinate s astupe discontinuitile produse de cozile fagilor multipli care se fixeaz pe celula sensibil; - nucleaze care degradeaz cromosomul bacterian. Endonucleaza A creeaz bree monocatenare la secvenele cu citozin, iar endonucleaza B atac secvenele monocatenare care conin citozin. Rezult astfel, mici fragmente de ADN dublu catenare, iar o exonucleaz fagic desvrete procesul pn de dezoxi-nucleotidtrifosfai (dNTP). - proteine care catalizeaz sinteza bazelor specifice ADN fagic (5- HMC); - proteine reglatoare ale transcrierii ADN fagic. ARNm viral timpuriu este transcris de ARNpolimeraza bacterian, iar sinteza ARNm tardiv este catalizat de proteine virale. Unii fagi inactiveaz ARN-polimeraza celular i codific sinteza unei ARN-polimeraze timpurii proprii; - enzime care catalizeaz replicarea ADN fagic: ADN-polimeraza, polinucleotid-ligaza. Sinteza ARNm celular este blocat prin schimbarea specificitii ARN-polimerazei care trece sub controlul unui promotor viral. Sinteza proteinelor celulare este inhibat curnd dup infecie, deoarece ARNm bacterian are un timp de njumtire foarte scurt. Astfel, ribosomii bacterieni devin disponibili pentru traducerea ARNm fagic. Replicarea genomului fagic este mai bine cunoscut pentru fagii T4 i . ADN-T4 se sintetizeaz din nucleotidele rezultate din degradarea ADN celular, proces catalizat de endonuclezele den A i den B, codificate de fagul T4. Ele sunt active numai asupra ADN care conine citozina. Hidroxi-metil-citozina (HMC) este sintetizat de dou enzime fagice. In sinteza ADN T4 trebuie prevenit ncorporarea citozinei, deoarece o astfel de molecul este substratul endonucleazelor fagice care degradeaz ADN bacterian. Fagul trebuie s codifice sinteza enzimelor care s previn ncorporarea C, n molecula de ADN. E. coli posed o endonucleaz(restrictaz) care cliveaz secvenele cu HMC. Pentru a preveni degradarea ADN-T4 (cu HMC), resturile de HMC sunt glicozilate de dou enzime fagice ( i -glicoziltransferaza). ADN T4 devine imun fa de enzimele de restricie ale celulei bacteriene. Glicozilarea este o modificare post-replicativ, iar endonucleaza bacterian este inactiv fa de ADN-glicozilat.

5-hidroxil-citozina neglicozilat i glicozilat. Prin inlocuirea gruparii CH2OH cu H, rezult citozina.

ADN fagic, ntr-o prim etap, se replic dup modelul semiconservativ bidirecional, al cercului simplu. Se sintetizeaz copii ale genomului care vor fi transcrise pentru sinteza proteinelor tardive. Ulterior, ADN fagic se replic dup modelul cercului rotativ (fig. 98). Rezult o molecul poligenomic de ADN (genomuri multiple asociate n conexiunea cap-coad), un genom concatemer. O endonucleaz cliveaz concatemerul, n molecule de lungimea genomului, ce vor fi ncorporate n capsid, n procesul morfogenezei. Sinteza proteinelor tardive, devine predominant dup circa 20 de minute, dup ce ADN a atins rata maxim de replicare, iar transcrierea genelor timpurii este stopat. Proteinele tardive sunt grupate n trei categorii: - majoritatea sunt proteine structurale i intr n alctuirea capului, cozii i anexelor ei; - proteinele de morfogenez (de asamblare). Cele mai importante sunt proteinele de cofraj, definite ca proteine necesare n timpul asamblrii unei structuri, dar lipsesc din structura virionului; - proteinele enzimatice, necesare lizei celulei bacteriene i eliberrii fagilor progeni: o muramidaz de tipul lizozimului, ce hidrolizeaz mureina peretelui bacterian i o lipaz (holina), care atac membrana plasmatic a celulei, uurnd accesul lizozimului spre structura parietal. Liza celulei este condiionat de acumularea acestor proteine. Asamblarea i morfogeneza fagului s-a studiat la mutante fagice defective, care produc numai capete, numai cozi sau numai fibre. Fagul are o arhitectur complex i principiul autoasamblrii nu este funcional. S-au identificat 3 linii separate de asamblare a subunitilor structurale ale fagului: linia capetelor, a cozilor, a fibrelor i a proteinei 63, care catalizeaz legarea fibrelor la nivelul plcii bazale.

Fig. 98. Mecanismul replicrii ADN al fagului n cursul infeciei litice. a. Iniial, replicarea se face dup modelul cercului simplu (sintez bidirecional fa de punctul de origine al replicrii). B. Pentru asamblarea fagilor progeni, replicarea genomului se face dup modelul cercului rotativ (dup Watson, 1977).

Mai mult de 50 de gene ale fagului T4 sunt implicate n morfogenez. Ele codific proteinele structurale, dar i pe cele nestructurale, necesare asamblrii. Prima regul a morfogenezei, este c asamblarea se face pe module structurale. Capetele i cozile sunt primele care se asambleaz i formeaz complexe vizibile la microscopul electronic. Ulterior, fibrele cozii se adaug acestor complexe. Avantajul asamblrii fagului pe mai multe module, este acela c subunitile cu erori pot fi eliminate timpuriu, separat la fiecare linie. A II-a regul este c asamblarea se face de la captul terminal, spre punctul de jonciune cu restul virionului. De exemplu, pentru asamblarea cozii, primele sunt produse plcile bazale, apoi cilindrul axial, iar n final, teaca. In procesul asamblrii capului, prima structur care se formeaz se numete precap tip I, ce se asambleaz pe o structur proteic central, format din proteinele de cofraj, pe care sunt inserate capsomerele i nu conine ADN. Aceasta structur este convertit n precap de tip II, de asemenea lipsit

de ADN, dar mai consolidat prin apariia legturilor chimice ntre capsomere. Structura capului i dobndete proprietile structurale i funcionale depline, nainte de ptrunderea ADN (fig. 99).

Fig. 99. Ilustrarea schematic a mecanismului asamblrii fagului T 4. Asamblarea fagilor se face pe trei module: cap, coad i fibrele cozii (dup Davis, 1990).

Impachetarea ADN, ncepe prin legarea unui capt al moleculei de ADN poligenomic (concatemer), de o protein a capului fagic. Molecula de ADN s-ar rula pe un ax proteic, ntr-un mod particular, de la exteriorul spre interiorul axului. ADN ptrunde pe la unul din vrfurile icozaedrului, dup dislocarea unei capsomere. La acelai vrf se asambleaz coada.

Poliaminele i o protein de condensare, au rol n mpachetarea ADN. Molecula de ADN este secionat din concatemerii rezultai n replicare. In capul fagului T 4 intr o cantitate de ADN mai mare dect un genom complet (l02%). Din aceast cauz, n timpul mpachetrii ADN, secionrile din concatemeri, nu se fac la o secven unic de baze, ci la poziii determinate de cantitatea de ADN ce intr ntr-un cap. Probabil, captul liber al moleculei, intr n capul fagic i continu pn la umplere, dup care concatemerul este secionat. Acesta este mecanismul capului plin. Secvena terminal mpachetat este duplicat fa de secvena care a intrat iniial, adic ADN este redundant terminal. Deoarece n capsida fagului T4 este mpachetat o molecul de ADN mai mare dect genomul propriu-zis, secvena nucleotidelor n genomul particulelor virale ale unei populaii, este defazat cu un numr determinat de baze. De exemplu, dac ntr-o molecul de ADN genomic, secvena nucleotidelor este ABCD. XYZAB, n altele secvena este CDEF. XYZABCD. Toate moleculele de ADN genomic conin aceiai secven de nucleotide, dar secvena iniial a genomului se repet la captul terminal i difer de la un virion la altul. Datorit redundanei terminale, genomul fagilor este permutat ciclic. Redundana terminal este o proprietate individual a moleculelor de ADN fagic, iar permutarea ciclic este o proprietate a genomului populaiei de fagi. Pe msur ce genomul este ncorporat n capsid, proteinele de cofraj sunt eliminate prin spaiile dintre capsomere. Capul matur are un volum cu 40-l00% mai mare dect al precapului. Fagii maturi se acumuleaz n celula bacterian, iar cromosomul bacterian pierde treptat coordonarea activitii celulare i apare un dezechilibru funcional profund. Muramidaza se sintetizeaz foarte timpuriu, la 8 minute dup infecie, dar este ineficient atta timp ct celula este fiziologic activ. Enzima secioneaz moleculele de murein, dar celula activ repar leziunile. Cnd leziunile nu mai pot fi reparate n ritmul producerii, celula se lizeaz exploziv i elibereaz fagii progeni. Liza celulei necesit aciunea sinergic a dou produse genice: lizozimul i holina (o lipaz). Holina creeaz bree n membrana intern, permind lizozimului s ajung la structura sensibil. Fiecare virion progen poate s infecteze o nou celul. Repetarea de mai multe a ciclului litic pe o pnz de celule sensibile, produce o plaj de liz. Plaja de liz este echivalentul unei colonii de fagi. n cultura bacterian crescut ntr-un mediu lichid, fagii determin liza celulelor, astfel nct suspensia bacterian se clarific, mergnd pn la sterilizare. Fagii icozaedrici cu genom ADN monocatenar au dimensiuni mici (25-35 nm), sunt totdeauna viruleni ca i cei cu genom ADN dublu catenar i lizeaz celula n circa 30 de minute. Prototipul lor este fagul fi X l74. Capsida este alctuit din trei tipuri de proteine (F, G, H). Proteinele G i H se termin cu prelungiri n form de spiculi, necesar atarii pe suprafaa celulei. In celula infectat, ADN se tapeteaz cu proteina SSB (Single Stranded Binding) i ncepe s se replice. Iniial, se sintetizeaz o molecul de ARN scurt, catalizat de ARN-polimeraza celular, cu rol de primer. Complexul celular de replicare extinde primerul, iar ulterior ARN este digerat. Rezult o molecul ADN dublu catenar, care este forma replicativ. Fagii filamentoi (prototipul este fagul fd) au ca genom o molecul de ADN circular, care se dubleaz, prin pliere fa de sine nsi. Bazele nu sunt complementare, ceea ce nseamn c ADN este monocatenar. Virionul se adsoarbe la extremitatea unui pil F. Mecanismul ptrunderii ADN n celul nu se cunoate. ADN monocatenar este tapetat cu o protein codificat de fag, cu rol major, se pare, n mpachetare i nu n replicare. Impachetarea genomului n capsid, este concomitent cu ieirea virionului. Proteina major a capsidei helicale este inclus n membrana celular. Pe msur ce ADN fagic ptrunde n membran, este acoperit de proteina capsidei. Sunt singurii fagi care nu necesit liza celulei pentru eliberare. Celula continu s creasc, s se divid i s elimine cteva sute de virioni la fiecare generaie celular. Fagii ARN masculi (prototipul este MS2) au simetrie icozaedric. Genomul este o molecul de ARN monocatenar, de 4 kb lungime i conine 3-4 gene. Receptorii se gsesc pe suprafaa pilului F i de aceea infecteaz numai celulele bacteriene F+, cu potenialitate de donor de material genetic n cuplul de conjugare. De aici deriv denumirea de fagi masculi. Cele 4 gene codific o protein capsidal (C), o

ARN-polimeraz dependent de ARN (P), o lizin (L) i proteina A, reglatoare a asamblrii, prezent ntro singur copie n virion. Toate copiile de ARN sunt identice, fie c au rol de genom, fie c sunt mesagere. Importana fenomenului de bacteriofagie Bacteriofagii sunt foarte rspndii: se gsesc n mediile naturale n care triesc bacteriile sensibile care le pot fi gazd, adic n ap, sol, n tractul digestiv al omului i animalelor. Datorit efectului litic al interaciunii cuplului, fagii regleaz densitatea populaiilor bacteriene n mediile naturale. Interaciunea litic a cuplului fag-bacterie are cteva aplicaii practice majore. Fagul este utilizat n terapeutic, pentru tratamentul unor infecii rezistente la antibiotice i la agenii chimioterapeutici. Specificitatea relaiei fag-bacterie, a stat la baza elaborrii unui procedeu de identificare i clasificare a bacteriilor, n funcie de sensibilitatea lor la un fag sau la un grup de fagi, procedeu denumit lizotipie sau tipizare prin fag. Metoda este folosit pentru stabilirea diagnosticului bacteriologic n clinic, dar i n studiile de sistematic bacterian. Prin tipizare fagic se nelege identificarea unei tulpini bacteriene, utiliznd un set de preparate fagice purificate i standardizate, crora li se cunoate capacitatea de a liza anumite tulpini bacteriene. Tipizarea prin fag este o metod foarte util n studiile de epidemiologie, pentru a reconstitui originea i circulaia unei infecii ntr-o colectivitate, n cursul unei epidemii. Practic, toate tulpinile unei specii bacteriene patogene, izolate n cursul unei epidemii de la bolnavi, de la purttori, din alimente contaminate, din vectori sau de animalele care acioneaz ca izvor de infecie, avnd origine comun, aparin aceluiai lizotip (aceluiai tip fagic). Metoda se folosete pentru identificarea tulpinilor de Salmonella, Vibrio etc. In acest scop, tulpinile se nsmneaz n plci, dup tehnica n pnz. Se testeaz sensibilitatea lor fa de un numr ct mai mare de preparate fagice standardizate. In bioindustrie, fagii pot produce liza microorganismelor productoare de substane utile, provocnd pierderi economice importante. Ciclul lizogen Ciclul infecios lizogen este cunoscut, n primul rnd, pentru cuplul fag i celulele de E. coli (fig. 100). Fagul se deosebete de fagii din seria T (par i impar), att din punct de vedere morfologic, ct i al interaciunii sale cu celulele sensibile. Capul este un icozaedru aproape perfect, cu diametrul de 55 nm, iar coada este mai lung (l55 nm), mai subire i mai flexibil i se ngusteaz progresiv spre extremitatea liber. Este goal n interior, necontractil, format din 35 de discuri suprapuse. Genomul fagic este o molecul de ADN dublu catenar, linear i se termin cu secvene monocatenare, complementare, denumite cozi adezive sau coezive. n interiorul celulei bacteriene, molecula se circularizeaz devenind dublu catenar, circular nchis covalent, sub aciunea catalitic a unei polinucleotid-ligaze. Genomul fagului cuprinde circa 50 de gene. Cele din jumtatea stng (a moleculei lineare) codific proteine cu rol morfogenetic, iar cele din jumtatea dreapt codific factorii de interaciune ai genomului fagic cu cromosomul bacterian, fiind importante n evoluia lizogen a cuplului fag-bacterie. Corespunztor celor dou programe genetice, cuplul fag - E. coli are dou ci posibile de evoluie : - calea litic, ce implic sinteza proteinelor virale i morfogeneza fagului, urmat de liza celulei bacteriene; - calea lizogen, n cursul creia, replicarea genomului fagic este stopat. Genomul fagic se circularizeaz prin legarea capetelor sale adezive i se integreaz ca profag n cromosomul bacterian.

Fagii care dup infecie nu lizeaz celula se numesc temperai, iar o celul bacterian care conine un set de gene fagice se numete lizogen. ADN fagic se gsete fie integrat n cromosomul bacterian, fie n stare autonom (fizic independent).

Fig 100. Dup infecie, cuplul E. coli fag poate evolua litic sau lizogen.

Dintre celulele infectate de fagii temperai, numai o proporie mic evolueaz lizogen, marea majoritate fiind lizate. Fagul virulent, inoculat pe o pnz de celule bacteriene sensibile formeaz o plaj de liz clar, deoarece toate celulele sunt lizate. Fagul temperat formeaz o plaj de liz cu o zon central turbid (opalescent). Turbiditatea este determinat de multiplicarea bacteriilor lizogene, imune fa de fag. Decizia ntre liz i lizogenie este dat de un mecanism reglator, complex i subtil, influenat de structura genetic a fagului, a celulei i de factorii de mediu: concentraia nutrienilor n mediu i multiplicitatea de infecie. La o multiplicitate sczut de infecie se desfoar preponderent ciclul litic. Dar dup cteva cicluri litice, multiplicitatea de infecie devine nalt i un numr mic de celule sunt lizogenizate. Odat cu epuizarea nutrienilor din mediul agarizat, celulele bacteriene nceteaz s se divid, virusul nu se mai multiplic i plaja nceteaz s se extind. Deoarece n aria plajei, nutrienii sunt nc disponibili, datorit lizei timpurii a majoritii celulelor, cele lizogene continu s creasc i s se divid, rezultnd plaje cu un centru turbid. Oricare ar fi ponderea acestor factori, lizogenia este consecina blocrii transcrierii i traducerii informaiei genetice a fagului, a blocrii ciclului su de multiplicare, urmat de integrarea genomului ca profag, n cromosomul bacterian. Integrarea genomului fagului n cromosomul bacterian este rezultatul recombinrii ntre situsurile specifice de legare att (attchment, englez = ataare), situate pe cromosomul bacterian i pe cel fagic. Ele condiioneaz afinitatea de legare a celor dou genomuri.

Situsurile att bacterian i fagic au secvene omologe de baze i sunt alctuite din dou jumti situate simetric fa de o regiune median O, de circa l5 baze, n care omologia celor dou genomuri este total. Situsul fagic de legare are o secven de 3l7 baze i este notat POP (Phage), iar cel al cromosomului bacterian are o secven de 250 de baze i este notat cu BOB (Bacterium). Localizarea sa a fost identificat ntre gena gal (codific enzimele metabolizrii galactozei) i gena bio (codific sinteza biotinei). Recunoaterea celor dou genomuri se face prin intermediul regiunii O, la care particip secvenele PP i BB. Esena mecanismului de integrare este circularizarea cromosomului fagic. Pentru ca integrarea genomului fagic s aib loc, cele dou genomuri sunt secionate la nivelul situsului de legare, sub aciunea unei enzime fagice din setul timpuriu o terminaz cu funcie de endonucleaz, denumit integraz, o enzim ce recunoate situsurile de legare a ADN fagic i ADN bacterian i catalizeaz legarea recombinatorie a celor dou molecule. In procesul de integrare, zona central de omologie este cea care determin i condiioneaz integrarea, iar zonele laterale au un rol secundar n procesul de legare recombinatorie a celor dou genomuri. Integraza este o topoizomeraz I. Ea catalizeaz clivarea unei catene a dublului helix, rotete un capt al catenei clivate n jurul catenei ntregi, secioneaz i cea de a II-a caten i apoi reunete extremitile libere. Catenele secionate ale celor doi cromosomi, sunt aezate ntr-o continuitate perfect. Ca rezultat al integrrii, ordinea linear a genelor n molecula de ADN fagic este permutat. Apar dou noi situsuri de legare: BOP i POB. La sfritul procesului de integrare, cromosomul bacterian este mai lung cu echivalentul unui genom fagic, fapt demonstrat prin conjugare, prin msurarea intervalului de timp necesar transferului celor dou gene (gal i bio) n procesul conjugrii. Integrarea fagului n cromosomul bacterian corespunde unui proces unic, denumit recombinare integrativ sau recombinare la situsuri specifice (fig. 101). Omologia dintre situsurile de legare a celor dou genomuri, nu este perfect ca n recombinarea general, dar procesul este rezultatul aciunii unor enzime care recunosc anumite situsuri specifice i secioneaz decalat secvene relativ omologe ale celor dou genomuri, genernd extremiti adezive, care permit legarea ncruciat i integrarea genomului viral ca profag.

Fig. 101. Reprezentarea schematic a etapelor procesului de integrare a cromosomului fagic n cromosomul bacterian.

Dup integrare, genele fagice se comport ca i genele cromosomale: se replic sincron cu cromosomul bacterian i se transmit prin diviziune celular, generaiilor succesive, ca i genele cromosomale. Starea lizogen este controlat de represorul , o protein de 200 aminoacizi, codificat de profag, care se leag de regiunea operator a genomului fagic integrat. Astfel, represorul fagic, intr n competiie cu ARN-polimeraza, care, pentru iniierea transcrierii se leag de acelai situs al profagului. Legarea prompt a represorului de situsul de legare a operonilor virali are ca efect blocarea transcrierii tuturor genelor fagice, cu excepia celor care codific sinteza represorului.

Proprietile bacteriilor lizogene Bacteriile lizogene dobndesc proprieti noi, care deriv din nsi existena profagului n stare integrat: imunitatea i inducia litic. l. Imunitatea. Bacteriile lizogene sunt imune la suprainfecia cu un fag omolog (identic). Chiar dac genomul fagic este injectat n citoplasma sa, evoluia spre liz este stopat, deoarece represorul deja existent n celula lizogen va represa exprimarea funciilor genomice ale virusului suprainfectant. Suprainfecia unei celule lizogene cu un fag identic este abortiv. Fagul nu se multiplic i genomul su se dilueaz n populaia bacterian rezultat prin diviziunea succesiv a generaiilor de celule lizogene. Imunitatea fa de fagul suprainfectant este determinat de represor i, ca urmare, evoluia oricrui fag suprainfectant, depinde de sensibilitatea lui fa de represorul rezident n celula lizogen: dac este sensibil, infecia este abortiv, iar dac este rezistent, infecia evolueaz spre liz. Dac doi fagi manifest sensibilitate fa de acelai represor, se numesc fagi coimuni. Imunitatea bacterian, datorat represiei specifice a genelor fagice, prin intermediul proteinei represor, trebuie deosebit de rezistena bacterian la infecie, controlat genetic, fiind datorat absenei receptorilor pentru fag, sau pierderii capacitii de a face sinteza acestora, ceea ce transform bacteriile sensibile n bacterii rezistente. 2. Inducia litic. Bacteriile lizogene au, potenial, capacitatea de evoluie litic, denumit nc i inducie litic. Ele se pot liza spontan, fr intervenia unui fag suprainfectant de la exterior. In mod obinuit, fenomenul induciei litice se produce cu o frecven mic (l/l02 l07 celule), dar are o frecven mult mai mare dup expunerea bacteriilor lizogene inductibile, la aciunea unor ageni inductori: radiaiile UV sau X, peroxizi, azotiperita, ageni alkilani. Sub aciunea lor, majoritatea celulelor mor, iar cele care supravieuiesc sufer fenomenul de inducie, adic de trecere din starea lizogen spre ciclul litic. Agenii inductori, probabil inhib sinteza represorului. Profagul ieit de sub aciunea inhibitorie a represorului se excizeaz din cromosomul bacterian i trece n stare liber (vegetativ), evolund spre liz, cu eliberare de particule fagice progene. In mod normal, excizia ADN viral se face cu exactitate la nivelul situsurilor sale de integrare ca profag (att P i att B), astfel nct fagii eliberai sunt identici din punct de vedere genetic, cu fagul infectant originar. Cu o frecven mic (l/l05 l06 celule), excizia genomului fagic se face la nivelul altor situsuri ale cromosomului bacterian. Rezult astfel, o molecul de ADN circular, care conine o mic secven a ADN bacterian, adiacent situsului de inserie a profagului (n acest caz, gnele gal sau bio), din care lipsete o secven echivalent de ADN fagic, situat la captul opus al profagului. Genomul fagic, purttor al unei secvene a cromosomului bacterian este ncorporat n fagii maturi. Astfel de particule fagice sunt transductoare. Intr-un nou ciclu infecios, fagii transductori aduc n celula bacterian, att genomul viral, ct i secvenele de ADN bacterian pe care le transduc. Mecanisme celulare de aprare antifagic Bacteriile i-au elaborat mecanisme de rezisten fa de infecia fagic, iar fagii au elaborat strategii de contracarare, ceea ce reflect importana major pe care o are infecia fagic n mediile naturale. Mecanismul major de aprare a celulei este reprezentat de sistemul enzimatic de restriciemodificare. Enzimele de restricie hidrolizeaz ADN exogen care n-a fost modificat chimic (n special prin metilare) la situsurile specifice. Ele recunosc situsurile specifice ale ADN exogen, cliveaz molecula, iar exonucleazele nespecifice degradeaz fragmentele lineare rezultate (Vezi enzime de restricie). ADN celular este protejat de aciunea enzimelor de restricie prin modificare. ADN fagic care scap aciunii enzimelor de restricie, este modificat i fagul se multiplic. La ciclul infecios urmtor, teoretic, toate celulele tulpinii bacteriene vor fi sensibile la infecia fagic, deoarece ADN fagic este deja modificat. Fagii evit fenomenul restriciei bacteriene pe diferite ci. Prima modalitae este frecvena mic a secvenelor de recunoatere. De exemplu, fagii infecioi pentru Bacillus spp. au puine palindroame de 4

baze, recunoscute de enzimele bacteriene de restricie, iar colifagii au puine palindroame de 6 baze, pe care le recunosc restrictazele de E. coli. Importana studiului cuplului lizogen fag - E. coli Studiul cuplului fag-bacterie, dar n special studiul interaciunii lizogene fag E. coli (tulpina K12) a avut un rol esenial n fundamentarea conceptelor biologiei moleculare. Studiul aceluiai model a furnizat o explicaie logic cu privire la mecanismul genezei cancerului viral. In l952, A. Lwoff a emis ipoteza, demonstrat ulterior, c virusurile oncogene i datoreaz aciunea cancerigen, proprietii lor de a se integra ca provirus n genomul celulei gazd. Fagul este un factor care influeneaz semnificativ variabilitatea i evoluia populaiilor bacteriene n mediile naturale, deoarece o anumit categorie de fagi poate s asigure transferul materialului genetic de la o celul la alt, prin mecanismul transduciei genetice. Ciclul de multiplicare fagic are loc numai n celulele care cresc rapid. Concluzia este c n mediile aquatice, cei mai muli fagi (>90%) se menin i se propag sub form temperat n celulele lizogene, din urmtoarele motive : - cele mai multe bacterii din mediile aquatice nu ofer posibilitatea multiplicrii fagilor, deoarece se gsesc ntr-o stare de cretere lent sau de nfometare; - majoritatea mediilor aquatice sunt caracterizate printr-o densitate mic (<105 celule/ml) a celulelor bacteriene ; - n stare liber, fagii i pstreaz infeciozitatea un interval foarte scurt. ansa adsorbiei lor pe o celul bacterian sensibil i inierea unui nou ciclu de multiplicare este foarte mic. In absena acesteia, fagii se adsorb pe substane organice, pe diverse particule coloidale, pe resturi de celule bacteriene. Din aceaste cauze, modalitatea principal de propagare a fagilor n mediile naturale, este cea de genom integrat (profag) n cromosomul bacterian. Densitatea virionilor n mediile aquatice se schimb rapid. Creterea rapid a densitii virionilor se datoreaz, probabil, infeciei i lizei sincrone a celulelor sensibile. Printre cei circa 4000 de fagi cunoscui, regula general a interaciunii cu gazda este specificitatea. Un fag virulent, cu un spectru de gazd restrns va fi eliminat rapid dintr-un mediu n care bacteriile gazd cresc lent i au densitate mic. S-au identificat fagi polivaleni, cu spectru larg de gazd. Cei mai reprezentativi n acest sens sunt fagii a cror capsid conine lipide. Ei pot infecta bacterii Gram pozitive i Gram negative. Spectrul de gazd foarte larg se explic prin faptul c receptorul fagic este codificat de plasmide conjugative. Pseudolizogenia (starea de purttor) se aseamn cu lizogenia, prin aceea c dup infecie, fagul intr ntr-o faz de eclips, dar spre deosebire de lizogenie, genomul fagic rmne n stare fizic independent i nu se replic. De aceea, nu se distribuie n mod egal, n cele dou celule fiice rezultate din diviziune. Pseudolizogenia este determinat de condiiile de nfometare ale celulei. Energia disponibil pentru iniierea lizei sau lizogeniei este insuficient. De ndat ce energia celular devine disponibil, fagii intracelulari devin lizogeni sau iniiaz ciclul litic.