Sunteți pe pagina 1din 9

Manipularea artificiala a cromozomilor si genelor

Ingineria genetica aparuta in perioada anilor 70 este cea mai moderna ramura a biologiei, a revolutiei stiintifice si tehnice. Aparitia ing. genetice a fost determinata de aprofundarea cunostintelor de genetica la nivel celular si molecular , de folosirea metodelor eficiente de manipulare a cromozomilor si genelor si de transferarea lor de la o specie la alta. In alta ordine de idei prin ing. Gen. Se spera rezolvarea unor mari probleme ca: nevoile crescute de proteina alimentara, necesitati sporite de medicamente , de substante chimice si bioenergetice, problema profilasciei si terapeuticii a peste 3500 maladii ereditare umane .

Manipularea cromozomilor si transferul lor peste barierul de specie


Prima cercetare consta in realizarea unor hibrizi interspecifici la plante si in dublarea numarului de cromozomi hibrizi din prima generatie detinandu-se astfel amfidiploizii. Cel mai cunoscut este Triticale(2n=56) hibrid interspecific intre grau(Triticum aestivum 2n=42) si secara (2n=14) la care s-a dublat nr. de cromozomi cu colchicina. Pasul urmator l-a constituit amfiploidia partiala ce consta in transferul partial al unor genomuri in citoplasma straina.S-au obtinut: 1) liniile de aditie cromozomale care se bazeaza pe hibridarea intre speciile cultivate si unele salbatice in scopul obtinerii de amfiploizi care sunt apoi retroincrucisati repetat cu genitorul cultivat in vederea

eliminarii majoritatii cromozomilor speciei salbatice si pastrarea numai a unei perechi de cromozomi pe care se gasesc genele dorite. 2) liniile de substitutie cromozomala , sunt linii de plante cultivate la care s-a inlocuit o pereche de cromozomi proprii cu o pereche de cromozomi de la o specie inrudita , de regula din flora spontana. 3) liniile translocatie sunt cele la care se transfera numai un segment cromozomal pe care se gasesc anumite gene segment care este inclus prin translocatie in genomul speciei cultivate. Prin metoda translocatiei se pot crea cariotipuri sintetice experimentale. Transferul interspecific de gene prin recombinare genetica prin hibridare interspecifica la plante se obtin aloploiploizi , adica forma care inglobeaza genomurile speciilor genitoare. De pilda , specia de grau cultivat este un hexaploid (2n=6x=42) care inglobeaza genomuri de la 3 specii ce s-au inmultit intre el e si care erau diploide (2n=2x=14).Ca urmare graul cultivat hexaploid contine 3 genomuri diferite sub forma de perechi notate cu litere AABBDD, fiecare genom avand 7 cromozomi. S-a stabilit ca in genomul B pe perechea 5 de cromozomi , exista gene care determina comportarea de tip diploid a acestui hexoploid. Este vorba de sistemul genetic 5B.Datorita acestor gene in cursul diviziunii meiotice , cromozomii se separa echilibrat la polii celulei , astfel ca gametii au exact 21 de cromozomi. Tot din domeniul ingineriei genetice fac parte si obtinerea de himeri la plante si animale sau mozaicuri genetice. Un exemplu il constitue himera vegetala Bizzarie, rezultata din altoirea dintre lamai si portocal. Ca metode de obtinere a himerilor amintim:

iradierea unor tesuturi la plantele care se reproduc vegetativ fiind induse artificial mutatii somatice sau cultura in vitro de celule si tesuturi vegetale. Exista himere care poseda concomitent tipuri diferite de cloroplaste aparute prin mutatia plastidelor respective, plantele de acest tip manifestand fenomenul de variegare , adica sectoare de culoare verde se alterneaza cu sectoare verde deschis , galben sau alb(viermii de matase)

Tehnologia ADN-lui recombinat


Printre cele mai importante progrese tehnologice , ce au facut posibila tehnologia ADN-lui recombinat pot fi amintite: -metode pentru determinarea secventei nucleotidelor in ADN si ARN - descoperirea si izolarea enzimelor de restrictie, capabili sa rupa molecula de ADN in anumite locuri - utilizarea altor enzime ca: terminal-transferazele, ADNpolimerazele, ADN-lipazele, revers-transcriptazele -metoda pt sinteza chimica de oligonucleotide si de gene - metoda pt izolarea unor gene si clonarea lor -vectori utilizati pt transferul de gene -metoda pt includerea vectorilor in celula pro si eucariota

Metoda pt determinarea segventei nucleotidelor in ADN si ARN


Inca din 1964 in S.U.A. s-a reusit sa se descifreze pentru prima data segventa nucleotidelor la ARNt ce transfera alanine la locul sintezei protice. Cu ajutorul metodelor

moderne s-a putut cunoaste segventa a catorva mii de gene de virusuri,bacterii , plante si animale. De exemplu genomul mitocondrial uman ce este alcatuit dintr-o segventa de 16569 de perechi de nucleotide este complet cunoscut . Descoperirea si izolarea enzimelor de restrictie Aceste enzime in numar de peste 250, sunt capabile sa taie molecula de ADN in anumite locusuri caracteristice. Alte enzime utilizate in tehnologia ADN-lui recombinat
1)

ADN-polimerazele sunt un grup de enzime implicate in replicatia ADN-lui. Prima descoperita a fost ADNpolimeraza I capabila sa catalizeze sinteza ADN-lui in vitro. Ulterior s-a descoperit ADN-polimeraze II si III , ultima fiind cea mai utilizata in alungirea catenelor de ADN

2) Revers-transcriptazele sunt un grup de enzime care determina transcriptia inversa a informatiei genetice de la ARN->ADN
3)

Terminal-transferazele sunt un grup de enzime care adauga nucleotide la capul 3 al catenelor de ADN ADN-ligaza este o enzima implicata in replicatia ADNlui cu ajutorul ei se realizeaza nu numai legarea unor segmenti de ADN, dar si circularizarea unor molecule de ADN la diverse genomuri virale, plasmidice si bacteriene. Metode pt sinteza chimica de oligonucleotide si de gene

4)

Metoda de sinteza chimica a unor oligonucleotide se bazeaza pe abilitatea de a proteja specific capetele 5 si 3 ale unei mono sau oligonucleotide. Dupa aceia cu ajutorul unor acizi sau baze sunt eliminate grupele de blocare si dinucleotida reactioneaza cu o mono sau dinucleotida corespunzatoare. Ciclul acesta de condensare se poate repeta pana se obtine o oligonucleotida de lungimea dorita. Segvente de 12-20 nucleotide pot fi astfel sintetizate in 3-4 .Prin asigurarea primei nucleotide pe un suport solid a devenit posibila adaugarea automata de nucleotide in ordinea dorita.Pe aceasta baza s-au creat recent aparate automate de sintetizat gene. Metode pt izolarea unor gene si clonarea lor Cu ajutorul enzimelor de restrictie genomul unor virusuri , plasmide sau bacterii poate fi sectionat intr-un anumit nr. de segvente care contin una sau mai multe gene sau segmente de gene. Genomul uman pe aceasta cale a fost reactionat in segmente de dimensiuni variabile cu ajutorul unor enzime de restrictie , dupa care segmentele respective au putut fi clonate in plasmide. In acest fel s-au creat o multitudine de plasmide , hibride care pot fi utilizate in acest scop , prezinta de obicei ca markeri gene pentru rezistenta la antibiotice. Vectori utilizati pt transferul de gene Vectorii utilizati sunt reprezentati de : plasmide , virusuri si lipozomi. 1)Plasmidele necesare pt transferul de gene trebuie sa ponde cel putin o regiune sensibila la actiunea enzimelor de restrictie. In acest fel se poate realiza ruperea si apoi insertia de ADN exogen in plasmida.Prima plasmida

bacteriana folosita ca vector pt transferul de gene a fost realizata in 1973 votata pe SC 101, derivata din factorul pentru rezistenta de la E. Coli , capabila de repicare autonoma si avand o gena marker ce determina rezistenta la tetraciclina. Ca vectori plasmidici la plante se foloseste plasmido Ti(tumor inducing) de mari dimensiuni de la bacteria Agrobacterium tumefaciens care induc formarea de tumori la numeroase specii de plante dicotiledonate. 2) Vectorii virali , fagii de pilda , pot include segmente mari de ADN exogen fara sa-si piarda functionalitatea .Ei se pot repica repetat in celula gazda , astfel ca in aceasta se pot gasi pana la 200 copii ale genomului fagic fara ca celulele sa fie lizate. 3) Lipozomii sunt un tip particular de vectori .Acestia sunt picaturi foarte mici de lipide fabricate artificial in care pot fi incluse gene ,medicamente , enzime . In 1979 s-a introdus plasmidele de tip Ti de la bacteria Agrobacterium tumefaciens in lipozomi cara apoi s-a introdus in protoplasti. Transferul de gene in celula procariota
1)

Biosinteza insulinei umane .Pe glob exista 60 milioane de diabetici din care doar 4 mil. Sunt tratati cu insulina . Inca din 1916 s-a descoperit ca insulina este secretata de celulele ce alcatuiesc insulele lui Langhertians din pancreas= insulina. S-a reusit biosinteze de catre E. Coli a proinsulinei umane , care contine ambele catene , prin folosirea ARNm cu ajutorul invers-transcriptazei. Pe aceas cale celulele bacteriene pot sintetiza pana la 20% proinsulina din volumul total al celulelor . Se comercializeaza sub denumirea de humulina.

2)

Biosinteza somatotropinei sau hormonul de crestere: secretat de lobul anterior al hipolizei a carui absenta provoaca nanismul hipofizar.Tratamentul este de 6mg/persoana de la 4-5 ani pana la pubertate.Dintrun cadavru se extrage doar 4-6 mg de hormon .Pe baza tehnicilor de ing. genetica in 1982 s-a inceput sinteza hormonului de crestere in Suedia in bioreactoare de 1500 l mediu de cultura iar in 1983 a inceput comercializarea .

3) Biosinteza unor medicamente prin tehnica ADN recombinat. O remarcabila realizare a ing. gen. O constituie sinteza unor produse biomedicale pentru a trata kemofilic o maladie ereditara a sangelui . S-a izolat atat gene factorului VIII cat si gena factorului IX ,urmand a fi introduse in celule bacteriene care vor produce cantitati industriale. Ing. gen. Va face posibila diagnosticarea majoritatii maladiilor ereditare care se bazeaza pe compararea intre ADN normal si cel patogen. Transferul de gene in celula eucariota S. cerevisiol este folosita tot mai mult ca gazda pt transferul de gene de tip pro sau eucariot. Utilizarea drojdiei de bere in ing. genetica: S. cerevisiae este un eucariot utilizat pt faptul ca are un genom redus ca dimensiuni numai de 4 ori mai mult ADN ca la E. Coli, si pt ca se cultiva industrial foarte usor. Prezinta avantajul ca poate fi mentinuta in cultura sub forma haploida sau diploida. Peretele celulelor celulozic al drojdiei de bere poate fi eliminat enzimatic obtinandu se protoplasti sau sferoplasti ,celulele care sunt pentrabili pentru ADN mesager in prezenta clorurii de

calciu sau polietilenglicolului. Ulterior celulele isi refac peretele celular si incep sa se divida. Genele drojdiei de bere au fost clonate in proportie de 30% si au fost functionale in celulele bacteriene de E. Coli . Materialul genetic al drojdiilor a fost in totalitate clonat in plasmide si in felul acesta a fost transferat in celule bacteriene . Pt transferul de gene la drojdii se folosesc plasmidele naneta care contin segmenti de nucleotide care determina inceputul repicatiei la bacterii si drojdii . In acest fel ADN-ul de la drojdii a fost inserat in plasmion naveta si apoi transferat la E. Coli pentru multiplicare. Transferul de gene la eucariotele superioare Inca din 1907 s-a descoperit ca Agrobacterium tumefaciens determina formarea unor tumori cancerigene la plante.Mai tarziu s-a descoperit ca celulele tumorale sintetizeaza o anumita clasa de compusi chimici , denumita opinie ,care nu se gasesc in celulele normale ale plantelor. Este vorba de octopina , un compus al argininei si acidului piruvic , nopalina un compus al argininei si al acidului -keto glutaric si agropina un derivat al altui aminoacid. De asemenea s-a constatat ca o anumita susa bacteriana este capabila sa creasca pe un mediu ce octopina sau nopalina , dar nu pe ambele. Plasmida Ti(tumoral inducing) determina ca celula vegetala sa sintetizeze o substanta care nu-i este utila , dar pe care bacteria , inclusiv plasmida poate prolifera.Cu ajutorul unor endonucleaze care sectioneaza plasmida in numeroase segmenti s-a constatat ca numai un segment de ADN al plasmidei este transferat in celulele tumorale. In ultima vreme s-a realizat harta genetica a plasmidei Ti , a unor gene ce

confera rezistenta la erbicide si pesticide . De asemenea se urmareste ca plasmidele Ti si Ri(root inducing de la bacteria Agrobacterium rhigogenes ce creaza o proliferare a radacinilor) ce sunt limitate doar de dicodiledonati sa poata fi utilizata ca vector si la monocotiledonate.In prezent cele doua plasmide sunt singurele care pot fi folositi cu succes ca vectori la plantele superioare pentru transferul de gene. O deosebita imp. Pt transferul de gene o prezinta folosirea unor celule vegetale lipiti de peretele celulelor , numite protoplaste .Ele pot fi izolate din mezofilul frunzei din tesuturi epidermale , radacini si nodozitati ale radacinilor ,grauncioare de polen in curs de germinare ,fructe si tesuturi cultivate in vitro .Pt izolarea protoplastelor se folosesc 3 categorii de enzime : celuloze , pectinoze sau hemiceluloze . Dupa eliminarea enzimelor protoplastice cultivale pe un mediu adecvat isi refac peretele celular incep sa se divida si pot regenera o noua planta. In concluzie utilizarea protoplastelor si a unor vectori de tipul Ti si Ri constituie mijloace utile pt transferul de gene in celula vegetala .