Olga Martins Marques (Prof a UFPE - DEQ) Glria Maria Vinhas(Prof a UFPE - DEQ) Alexandra Amorim Salgueiro (Prof

a UNICAP -DQ) Maria Alice Gomes de Andrade Lima (Prof a UFPE- DEQ) Maria de Los Angeles Peres Palha (Prof a UFPE - DEQ) Sonia M a Souza Cavalcante de Albuquerque (Prof a UFPE -DEQ)

Recife - Pernambuco 1998

Apresentao
A inexistncia de um texto de prticas de Microbiologia Geral adaptado s nossas condies do nosso laboratrio, e destinado aos cursos superiores de Engenharia Qumica, Qumica Industrial e outros, nos motivaram realizao deste manual. Os experimentos foram selecionados de modo a englobar a maioria dos assuntos contidos no programa referente primeira unidade do curso e podem ser facilmente efetuados em laboratrios de recursos limitados. Cada experimento poder ser efetuado por um grupo de dois ou mais alunos. Muitas vezes o experimento pode ser dividido entre vrios grupos da classe, sendo que cada grupo deve fazer o experimento numa determinada condio. Neste caso, o instrutor dever fazer uma discusso a posteriores e globais do problema apresentado.

PRTICA N 1
OBJETIVOS: Discriminar as funes e/ou aplicaes Limpar Acondicionar

1. FUNES E/OU APLICAES LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA

DO

MATERIAL

DO

1.1. Material Permanente a. Autoclave - cmara de vapor com parede dupla, equipada com dispositivos que permitem o enchimento da cmara com vapor saturado e sua manuteno em determinadas temperatura e presso por quaisquer perodos de tempo. O autoclave um equipamento indispensvel ao laboratrio de microbiologia na esterilizao de meios de cultura, gua, suspenses etc.(ver modo de operao) b. Estufas de Esterilizao (Fornos de Pasteur) - esteriliza a seco toda vidraria convenientemente acondicionada, a temperatura de 170 a 200 o C por 1-2 horas. c. Refrigerador - utilizado na conservao de culturas de microrganismos sob baixa temperatura, diminuindo o tempo de gerao d. Estufa bacteriolgica - favorece o crescimento de microrganismos pela incubao na temperatura adequada. Incubao = manuteno do meio semeado em determinadas condies para promover o desenvolvimento dos microrganismos. e. Mesa agitad ora (rumbeira) - favorece o crescimento de microrganismos aerbios, pela dissoluo do oxignio no meio, atravs da agitao da mesa, em movimentos rotatrios. f. Cabine de fluxo laminar - cmara assptica, dotada de exaustor e lmpada fluorescente, sendo utilizada em repiques de microrganismos g. Fermentador - equipamento onde ocorrem as fermentaes, podendo ser dotado de sistemas de agitao, aerao, refrigerao.

4 1.2. Vidraria a. Tubo de ensaio (tubo de cultura) - utilizado no cultivo de microrganismos em pequeno volume de meio e na conservao de culturas puras de microrganismos. b. Placa de Petri - facilita o isolamento de microrganismos devido grande superfcie de crescimento que apresenta, possibilitando o aparecimento de colnias separadas. Colnia = aglomerado de clulas em meio slido, geralmente originadas de uma nica clula progenitora. c. Pipeta - para diluir preparaes diversas e inocular culturas lquidas
Inocular = inserir, introduzir.

Inoculo (ou semente) = concentrao de clulas suficientes para cultivar uma de meio com bom rendimento d. Pipeta Pasteur - um tubo de vidro espichado em capilar, utilizada para transportar pequenos volumes de lquido e. Ala de Drigalsky - obtida a partir de uma pipeta Pasteur longa, dobrada em ngulo reto e depois em 45C na chama. utilizada para espalhar microrganismos em meio de cultura slida. f. Balo de fundo chato - utilizado geralmente para guardar meios de cultura. g. Erlenmeyer - utilizado para propagao celular de microrganismos em meio lquido sob agitao em mesa agitadora. h. Fernbach - idem i. Lmina - para examinar microrganismos ao microscpio Lmina Escavada - possui uma ou duas depresses possibilitando observar a mobilidade de microrganismos suspensos numa gota de lquido (Ensaio em gota pendente) j. Lamnula - utilizada para recobrir preparaes microscpicas in vivo 1.3. Materiais utilizados em titul aes, destilaes, preparaes de soluo e de meios de cultura - Bquer, basto de vidro, bureta, funil, proveta, balo volumtrico, condensador dentre outros. 1.4. Diversos

a.Lpis dermatogrfico - utilizado para escrever em superfcie de vidro

5 b.Algodo bruto (ou cardado) - serve para proteger o material esterilizado, do contato com o ar ambiente. c.Cabo de Kolle - feito com material isolante, adaptado em trs formas (crculo, ele, agulha). Serve de suporte para um fio de platina ou uma liga nquel-cromo, sendo utilizado em inoculao de microrganismos. 2. DESINFECO a. Desinfeco do ar: - atravs da vaporizao de uma soluo de hipoclorito de sdio a 1%; - pelo uso de lmpadas de luz ultravioleta. - pode ser feita periodicamente com a vaporizao de uma soluo de formalina (formol a 40%), no entanto, esta soluo no se pode usar para a desinfeco de ambientes ocupados; b. Desinfeco da bancad a: Antes da realizao de um determinado trabalho de microbiologia, a bancada deve ser limpa com uma soluo detergente seguida de uma soluo alcolica a 70%. c. Desinfeco da vidraria: - vidraria contaminada - dever ser inicialmente esterilizada em autoclave para que toda flora presente seja destruda e, em seguida lavada com uma soluo detergente ou sabo neutro; - vidraria sem contaminao - idem ao anterior, porm sem necessidade de autoclavao. Observao: no costume se utilizar soluo sulfocrmica na lavagem dos materiais do laboratrio de microbiologia, uma vez que esta soluo contm cromo que um metal que pode intoxicar as clulas vivas e tambm por ser de difcil remoo no material

3. ACONDICIONAMENTO a. Placas de Petri - embrulhadas com papel, geralmente formando conjunto de 3 unidades. A quantidade depende da necessidade do trabalho.

6 b. Pipetas - obtura- se as boquilhas com mecha de algodo (1cm) para filtrar o ar soprado e para proteger o operador durante a manipulao; em seguida so enroladas uma a uma com papel, anotando a capacidade de cada uma. c. Tubos de ensaio, bales de fundo chato, Erlenmeyers, fernbachs so preparados introduzindo-se um tampo de algodo cardado na boca do recipiente. Esse tampo deve ser feito, enrolando o algodo no sentido da fibra em quantidade suficiente para facilitar o manuseio, isto , no deve ser nem muito apertado, nem muito frouxo. d. Lminas - mergulhadas em soluo alcolica, ficam aptas a serem utilizadas a qualquer momento, evitando paralelamente que sejam arranh adas. ATENO: Toda vidraria utilizada no laboratrio de microbiologia antes de ser preparada para esterilizao dever estar limpa e seca. ESTERILIZAO EM AUTOCLAVE Operao: ligar o aparelho rede eltrica. Aps a colocao do material dentro do autoclave, a tampa fechada e a torneira de remoo de ar ou vapor deixada aberta para remover todo o ar. Quando todo o ar for removido, deixe que um fluxo de vapor fluente persista por cerca de 5 minutos, antes de fechar a torneira. A partir de ento a presso internamente ir aumentar e chegar presso de esterilizao usada, que de 15 lb/pol 2 , ou 1atm, ou 1 kgf/cm 2 , correspondendo a uma temperatura de 121 0 C. O tempo de exposio do material no interior deste equipamento ir depender do volume de lquido a ser esterilizado. Para pequenos volumes, at 3 litros, podem ser esterilizados durante 20 a 30 minutos a uma presso de 15 lb/pol 2 . Com relao a maiores volumes, ser necessria, uma exposio mais prolongada. Quando a temperatura requerida para a esterilizao alcanada, deve-se comear a contar o tempo, usando um relgio de laboratrio (com alarme). Decorrido o tempo desliga-se o aparelho da corrente eltrica e mantm-se a autoclave e a torneira de ar e vapor fechados, at o manmetro voltar ao ponto zero, pois quando a presso da autoclave aliviada rapidamente, os lquidos dentro dos tubos e frascos fervem violentamente, fazendo com que os tampes sejam arremessados para fora dos mesmos. Concluda a esterilizao, abre-se a torneira de vapor; em seguida a tampa do autoclave levantada.

PRTICA N 2
OBJETIVOS: Trabalhar assepticamente Cultivar microrganismos Diferenciar macroscopicamente fungos, leveduras, bactrias.

7 INTRODUO O homem no seu meio ambiente convive com inmeras formas de vida. Os microrganismos ocupam lugar de destaque tanto pelos benefcios como pelos malefcios que proporcionam ao homem, sendo encontrados na natureza em abundncia e variedade de formas. Para que os mesmos sejam cultivados artificialmente necessrio conhecer suas exigncias nutricionais e suas condies fsicas de crescimento, trabalhar com material esterilizado e obedecer s normas de prtica assptica. Dependendo da finalidade da operao, os microrganismos podem ser cultivados em: lminas, placas, tubos, bales, fernbach ou recipientes de maior capacidade. O cultivo em lmina utilizado quando se deseja acompanhar microscopicamente o crescimento e reproduo de um microrganismo. Emprega- se o cultivo em placas quando se quer isolar espcies microbianas distintas, devido extensa rea de superfcie que apresenta. Porm, devido pequena quantidade de meio em exposio ao ar, com frequncia ocorre ressecamento e/ou ap arecimento de contaminaes. Cultivando os microrganismos em tubos, h facilidade de manipulao das culturas, alm da vantagem de economizar meio e espao fsico. Para se obter grandes volumes de cultura, o microrganismo cultivado inicialmente em bales, fernbach, para depois ser transferido para recipiente maior, cuja capacidade funo da necessidade do trabalho.

NORMAS DE PRTICA ASSPTICA

1. No trabalhar em corrente de ar, nem ambiente agitado pelo acmulo de pessoas; 2. No falar nem respirar em frente ao recipiente aberto contendo material de estudo; 3. Abrir o recipiente inclinado junto chama, onde o ar est rarefeito de formas vivas; 4. Retirar o tampo de algodo com o dedo mnimo e a palma da mo sem tocar na boca do recipiente e sem encostar o tampo em lugar algum; 5. Flambar a boca do recipiente sempre que for iniciar uma inoculao, para que uma corrente de ar quente seja formada de dentro para fora; 6. Introduzir o mais rpido possvel a ala ou pipeta sem tocar nas paredes do recipiente; 7. Ao terminar a inoculao, flambar a boca do recipiente e ajustar o tampo, conservando o material ao abrigo da poeira e umidade.

8 PROCEDIMENTO PRTICO Limpar a bancada; Marcar todo material (placa e tubos), especificando o tipo de meio e a fonte da inoculao; Fundir dois meios de cultura diferentes (por exemplo, AN e CZ); Distribuir os meios em placas de Petri e tubos (inclinar); Esperar solidificar; Fazer inoculaes nas superfcies dos meios distribudos em placas; Incubar na temperatura ambiente por 2 a 5 dias, no esquecendo de guardar placas sem inocular, uma de cada meio utilizado para controle da esterilizao e da eficcia da tcnica utilizada. FONTES: gua poluda, fermento de padaria, ar, garganta, mos, cabelo, suor etc. DIFERENCIAO MACROSCPICA DOS MICRORGANISMOS Os microrganismos crescem e reproduzem quando cultivados e inoculados adequadamente. Podemos fazer avaliao dos grupos aos quais eles pertencem, por observaes das caractersticas das colnias nos meios em que eles foram cultivados. O crescimento em meio lquido pode ser evidenciado pela turvao, pela formao de pequena massa de clula que flotam (velo) ou por sedimentao das clulas. Em placas de Petri estuda-se o crescimento dos microrganismos em meio slido, observando-se o aparecimento de colnias cujos aspectos macroscpicos auxiliam na diferenciao de grupos microbianos.

I) Descrio de colnias em placas de Petri:

Aps o perodo de incubao preestabelecido as colnias de microrganismos cultivados em placas de Petri podem ser descritas de acordo com os seguintes critrios:

9 a. forma:

circular

rizoide

irregular

filamentosa

b. quanto dimenso puntiforme com menos de 1 mm de dimetro

c. cromognese -cor do pigmento -pigmento solvel ou insolvel no meio

d. superfcie plana ,elevada, convexa, lisa, rugosa, seca, brilhante, translcida, opaca, pregueada, pulverulenta II) Descrio da cultura em caldo nutriente O crescimento em caldo de cultura pode apresentar- se sobre diferentes formas. a. turbidez: mais ou menos acentuada b. forma da pelcula: uma massa de clulas que flutua superfcie do caldo c. sedimento: depsito de clulas no fundo do tubo.

Observao:

10 . As colnias de fungos so geralmente grandes e filamentosas, algumas vezes ocupam toda a placa onde esto cultivadas. . As colnias de leveduras so pequenas e leitosas, enquanto as de bactrias so menores e brilhantes sendo algumas to pequenas que se denominam puntiformes.

PRTICA N 3
OBJETIVOS: Distinguir os diversos componentes de um microscpio tico composto Focalizar in vivo: clulas de leveduras em suspenso, microrganismos (algas, protozorios e bactrias mveis em gua) COMPONENTES DE UM MICROSCPIO TICO COMPOSTO I - PARTE MECNICA: 1. Base ou p - dispositivo de tamanho e peso suficiente para assegurar o equilbrio estvel do instrumento, evitando trepidaes; 2.Corpo, brao ou coluna - haste destinada a sustentar o tubo microscpico e conter os mecanismos de movimento; alguns apresentam articulao, facilitando a observao do pesquisador; 3.Tubo ou canho microscpico - cilindro oco que serve de suporte para os dois sistemas de lentes (oculares e objetivas); 4. Revlver - pea giratria onde ficam fixadas as lentes objetivas, permitindo que cada lente possa ser colocada em foco ( uma de cada vez), isto , em coincidncia com o eixo tico; 5. Platina - plataforma horizontal com uma abertura circular no centro por onde passam os raios luminosos. Existem platinas mveis; 6. Pina ou presilhas - alas flexveis e ajustveis, situadas na platina. So utilizadas para fixar a lmina; 7. Charriot - dispositivo facultativo que permite a movimentao da lmina em dois sentidos: horizontal e vertical, pela manipulao de dois parafusos; 8. Sistema de cremalheira - pea munida de dentes, controlada pelos parafusos macromtrico e micromtrico;

11 a) Macromtrico - ocasiona diferentes aproximaes entre a objetiva e a preparao, variando a distncia vertical de vrios centmetros. Serve para trazer o objeto ao foco aproximado; b) Micromtrico - permite mnimos deslocamentos verticais da ordem de centsimos de milmetros, sendo utilizado na focalizao final; Observao: Nos microscpios mais modernos existe parafuso que oferece o controle destes dois movimentos. um nico

II - PARTE TICA 1. Fonte luminosa: 1.1. Natural - luz solar 1.2. Artificial - lmpada 1.2.1. Direta - quando a lmpada est fixada no eixo tico 1.2.2. Indireta - quando se utiliza fonte luminosa microscpio.

anexa

ao

2. Espelho - girando em torno de um eixo, utilizado para refletir os raios luminosos; pode ser cncavo ou plano, aumentando ou diminuindo a intensidade da luz, respectivamente; 3. Diafragma - controla a extenso angular do feixe luminoso, reduzindo o ngulo do cone de luz, de modo que no exceda o dimetro da objetiva aps atravessar o objeto; 4. Condensador - conjunto de lentes convergentes que projeta sobre a preparao o feixe de luz em forma de um amplo cone; por deslocamentos verticais diminui ou concentra a luz no objeto; 5. Lentes objetivas - so as lentes que ficam prximas ao objeto, formando na parte superior do tubo microscpico uma imagem invertida e ampliada do objeto. Podem ser: a) a seco - quando o meio entre o objeto e a lente o ar, podendo ser de pequeno, mdio ou grande aumento; b) de imerso - quando a lente fica mergulhada numa camada de lquido; 6. Sistema de lentes oculares - apresenta um conjunto de lentes: lente de campo (corretora) que corrige a esfericidade da imagem e a lente ampliadora que atua em conjunto com o observador como uma simples lente de aumento, aumentando a imagem formada pela objetiva. MANIPULAO DO MICROSCPIO 1. Instalao do aparelho

12 Retirar o microscpio da caixa ou armrio pelo brao e coloc- lo na mesa apropriada (chumbada e nivelada); a seguir ligar a fonte luminosa e dispor a objetiva no revlver e regular a altura do banco, de maneira a permitir um trabalho confortvel. 2. Iluminao de campo Se a luz utilizada uma luz natural, usar a face plana do espelho, caso contrrio, a face cncava. Em qualquer caso, a luz deve cobrir completamente a superfcie do espelho e este deve estar centrado de maneira que o cone luminoso refletido atravesse completamente o condensador (que deve estar completamente levantado, com o diafragma aberto) bem como a abertura da platina, de tal sorte que o campo do microscpio (isto , o espao da platina visualizado com a ocular) fique totalmente iluminado. 3. Adaptao da preparao Colocar a lmina contendo a preparao sobre a platina e prendla, depois, com o auxlio do Charriot, deslocar o conjunto de tal forma que a preparao contida na lmina, fique sobre a abertura da platina, perfeitamente iluminada pelo cone luminoso. 4. Escolha da objetiva a) preparaes a fresco (In vivo): trabalhar apenas com objetivas a seco, comeando pela de menor aumento; b) preparaes coradas (In vitro): - focalizar inicialmente com a objetiva a seco de menor aumento; - girar o revlver de maneira que nenhuma das objetivas fique em uso; - colocar sobre a preparao uma pequena gota de leo de imerso; - colocar no eixo tico a objetiva de maior aumento (imerso) 5. Iluminao da preparao Para as preparaes coradas que do imagens por absoro, usar o mximo de iluminao com o condensador completamente elevado e o diafragma totalmente aberto. Para as preparaes a fresco, que do imagens por refrao, iluminar menos a fim de que o fenmeno seja mais perceptvel. Comear descendo o condensador, a uns dois teros da sua abertura, depois olhando pela ocular, regular o cone luminoso, fechando aos poucos o diafragma. 6. Focalizao

13 a operao que consiste em trazer o objeto para o foco da objetiva, formando a imagem que, ampliada pela ocular, ser vista pelo observador. A focalizao consta das seguintes etapas: a) girar o revlver colocando a objetiva de menor aumento no eixo tico; b) ajustar a iluminao de campo; c) centralizar a preparao; d) aproximar ao mximo a preparao, da objetiva de menor aumento, por meio do mecanismo de movimento. Durante este trabalho dever ser observada a aproximao diretamente com a vista, no devendo ser utilizado a ocular; e) observando ento pela ocular, imprimir movimento moderado de afastamento entre a preparao e a objetiva, at que seja distinguida a imagem do objeto; f) movimentar o micromtrico para focalizao final; g) regular o diafragma e o condensador para visualizar com mais nitidez; h) para trocar de objetiva basta o revlver e em seguida ajustar o foco imprimindo movimentos lentos no micromtrico; i) ao trmino da observao, girar o revlver at a menor objetiva e ap agar a luz. Retirar a lmina e colocar num recipiente com detergente. OBSERVAO: Quando o microscpio binocular deve-se ajustar a distncia inter-ocular de tal forma que o observador visualize um s campo de luz. Trabalhando com microscpio monocular, procurar man ter ambos os olhos abertos, a fim de evitar fadiga.

7. Causas de erro na observao a) Obscuridade total do campo - m centralizao do aparelho de iluminao b) Obscuridade parcial - revlver mal centrado, verificar se o ponto em que h resistncia no foi atingido ou foi ultrapassado. c) Falta de nitidez da imagem - preparao invertida ou com sujos; - ocular suja - verificar se rodando-a, o sujo acompanha o movimento; limpar a objetiva;

14 - objetiva suja ou com arranho - limpar com mistura xilol-ter; - ap arelho de iluminao - falta de centralizao, poeiras depositadas ou objetos estranhos interpostos na marcha dos raios; d) Dificuldade subjetiva Corpsculos de forma diversa que parecem deslocar- se no campo. Com alguma prtica, verifica-se que eles so independentes da preparao, e provm do observador; repousar um pouco e repetir a operao; e) Movimento Brauniano Quando os microrganismos deslocam- se num s sentido devido correntes lquidas formadas por evaporao da gua durante a observao nas preparaes In vivo. Salientando que o movimento dos microrganismos aleatrio. 8. Conservao dos microscpios O aparelho deve estar sempre protegido, seja com capa plstica, seja com caixa prpria e guardada em ambiente provido de luz artificial para evitar o crescimento de fungos. A cada utilizao o p do microscpio dever ser removido com um pano limpo. Evitar a ao de vapores cidos e contato com reativos; s manuse- lo com mos limpas; s observar preparaes limpas e ter o cuidado de no deixar escorrer nada sobre a platina ao adaptar a preparao. Se isto ocorrer, limpar imediatamente, se necessrio com gua destilada, enxugando a seguir. As oculares devem ser limpas externamente com papel de seda e internamente, por um tcnico, s quando necessrio. A objetiva de imerso limpa com papel de filtro ou algodo umedecido com uma mistura de xilol e ter na proporo de 1:1, que deve ser imediatamente removido com papel ou algodo limpo. A permanncia de xilol sobre a lente causa desvitrificao da mesma. Nunca deixe ficar leo na lente, pois ali resinifica e depois para limpar, exige excesso de dissolvente, podendo este penetrar no sistema, dissolvendo o blsamo que liga as diversas partes. As objetivas a seco so limpas com um linho ocasionalmente, com papel umedecido com gua destilada. A quando remover de pano macio e

parte interior das objetivas no deve ser limpa usualmente e feito dever ser praticada por pessoa habilitada. Deve-se a objetiva e passar suavemente um pincel macio ou uma bucha macio na extremidade de uma haste. No se deve assoprar para

15 evitar a umidade. Esta operao dever ser feita com muito cuidado para no descentralizar as objetivas. As lentes do aparelho de iluminao so limpas como as demais, com freqncia, pois delas depende a boa iluminao fornecida. A parte mecnica limpa e polida com uma flanela e a cremalheira com leo detergente fino. Para uma boa conservao do microscpio o operador dever seguir uma rotina diria que vai desde uma simples remoo do p at uma lubrificao mensal de todas as partes mveis com um leo fluido. A cada trimestre o aparelho deve ser enviado a um tcnico especializado para uma inspeo rigorosa, limpeza e lubrificao geral.

PRTICA N 4
OBJETIVOS: Realizar colorao simples Observar microrganismos diferentes sob objetiva de imerso Diferenciar leveduras de bactrias considerando o tamanho celular OBSERVAES IN VITRO Os microrganismos so usualmente transparentes, tornando difcil o estudo de detalhes morfolgicos quando so examinados em seu estado natural, assim torna-se necessrio a utilizao de tcnicas de color ao. As observaes microscpicas in vitro so realizadas com o microrganismo previamente fixado lmina. Nestas condies as clulas microbianas so observadas mortas. Aps a fixao, submete-se a preparao etapa de colorao pela adio de solues adequadas em funo da tcnica de colorao desejada. As tcnicas de colorao no s facilitam a visibilidade das clulas microbianas, como tambm, propiciam a visualizao de determinadas estruturas celulares em funo de afinidades especficas com determinados corantes, e facilitam identificao de microrganismos devido a comportamento diferentes frente ao de solues diferenciadoras. A menos que algum aspecto morfolgico especfico, dependente de idade da cultura, deva ser demonstrado, o microbiologista deve usar sempre cultura nova nas observaes microscpicas. As clulas com o tempo de cultivo modificam o metabolismo, alterando a afinidade com muitos corantes. Excluindo os organismos que tm um tempo de gerao especialmente grande, uma cultura com 24 horas de cultivo dar sempre bons resultados.

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SUBSTNCIAS CORANTES Segundo Langeron, corantes so substncias coradas que gozam da propriedade de transmitir cor a outros corpos. Muitas so as substncias corantes empregadas na rotina diria dos laboratrios, a maioria derivados da anilina, podendo ser classificados em naturais e artificiais. Entre os naturais destacam- se: o carmim, a hematoxilina. Os artificiais so agrupados em funo dos grupos qumicos presentes e da afinidade com estruturas celulares, podendo ser: a) Bsicos ou nucleares : violeta de genciana, cristal violeta, verde de malaquita, azul de metileno, fucsina bsica, azul de toluidina, verde de metila etc. b) cidos ou citoplas mticos : eosina, fluorescena, fucsina cida, orange G, vermelho congo, cido picrico etc c) Neutros : eosinato de azul de metileno e de azul AZUR, giensa etc.

PREPARAO E FIXAO DE ESFREGAO Em processos de colorao de rotina, uma boa observao microscpica depende tanto da preparao do esfregao como de sua fixao lmina. TCNICA . Flambar a ala de platina (em crculo) ao rubro, deixar esfriar, conservando-a prxima chama; . Depositar com o auxlio da ala, gotas da suspenso microbiana na lmina, se for o caso, suspender a amostra da cultura na prpria lmina; . Espalhar bem o material na lmina, empregando movimentos rotacionais na ala de platina (do centro para a periferia), a fim de se obter um esfregao de forma oval, bem fino e uniforme; . Secar a fina pelcula do material (esfregao) ao ar ou pela passagem na chama do bico de Bunsen; . Fixar o esfregao, passando o dorso da lmina trs vezes ou mais na chama, a fim de que o material fique bem aderido lmina; . Deixar a preparao esfriar ao ar e corar.

17 A fixao do esfregao com gua pode formar aerossis (partculas projetadas durante a fervura de lquidos); evita- se introduzindo a lmina no cone azul da chama (parte redutora, a mais quente), permanecendo alguns instantes a fim de secar o material. A preparao e fixao do esfregao requer cuidados evitando-se tratamentos bruscos, para que as clulas da amostra a serem observadas no fiquem aglomeradas dificultando a observao, como tambm no tenham seus arranjos caractersticos destrudos. COLORAO SIMPLES Denomina- se de colorao simples colorao em que se adiciona qualquer soluo corante ao esfregao fixado durante um determinado tempo (30s a 3 min) em funo do corante utilizado. Depois se lava a lmina em gua corrente, seca-se e observa-se usando a objetiva de imerso. Essa colorao tem a finalidade de nos d uma viso da forma, do tamanho e dos arranjos das clulas, bem como de outros detalhes estruturais. TCNICA 1. Preparar e fixar o esfregao; 2. Cobrir com algumas gotas de uma soluo corante (azul de metileno, cristal violeta, fucsina, safranina); 3. Deixar o corante agir por 60s; 4. Lavar em gua corrente; 5. Secar cuidadosamente na chama ou com papel absorvente; 6. Observar com a objetiva de imerso (no esquecer de colocar 1 gota de leo de imerso antes de adaptar a referida objetiva no eixo tico). Obsevao: No se deve facilitar com os papis absorventes usados, especialmente se os microrganismos em estudo forem patgenos.

PRTICA N 5
OBJETIVOS: Realizar colorao Diferencial de Gram Observar ao microscpio sob imerso as preparaes in vitro Diferenciar as formas de bactrias (cocos, bacilos) e arranjos celulares ( em cadeia, ttrades, cbicos, em cachos).

18 COLORAES DIFERENCIAIS As coloraes diferenciais distinguem grupos de microrganismos entre si, devido diferenas qumicas existentes entre as clulas microbianas. Nesta tcnica de colorao utiliza- se inicialmente solues de corantes e mordentes; numa segunda etapa um agente diferenciador; para finalmente realizar outra colorao que contrasta com a primeira. COLORAO DIFERENCIAL DE GRAM Em 1884, CHRISTIAN GRAM descobriu um mtodo de colorao, baseado no fato de que, quando certas bactrias so coradas pelo cristal de violeta e depois tratadas pelo iodo (soluo iodo-iodetada, dita lugol),forma-se um composto de colorao escura entre o iodo e o corante, o qual fortemente removido pelo tratamento subsequente com lcool (diferenciador). So as bactrias Gram positivas, as que tomam o corante de Gram (cristal violeta). Outras bactrias, ditas Gram negativas, deixam-se descorar facilmente pelo lcool. Assim sendo, se aps a ao do lcool, fizermos uma colorao de fundo pela safranina ou pela fucsina bsica, as bactrias Gram negativas aparecero vermelhas. MECANISMO DA COLORAO DE GRAM As bactrias Gram positivas e Gram negativas interagem com o corante cristal violeta devido s ligaes inicas entre os grupos bsicos dos corantes e grupos cidos dos constituintes celulares. O iodo em soluo penetra nos dois tipos de clulas e forma um precipitado com o corante. O agente descorante (lcool etlico ou acetona) nas clulas Gram negativas passa facilmente atravs da membrana celular dissolvendo o complexo corante- iodo, deixando a clula incolor. Nas clulas Gram positivas o lcool penetra com dificuldade e a dissoluo do complexo lenta. A maior parte do complexo corante- iodo permanece na clula que retm assim a sua colorao. Pela adio do contracorante (safranina ou fucsina bsica) as clulas Gram positivas permanecem violetas enquanto as Gram negativa interagem com o mesmo, ficando vermelhas. As diferenas qumicas entre os constituintes da parede celular das bactrias so responsveis pela reteno ou no do cristal violeta. Todas as clulas desprovidas de parede celular (certos protozorios), bem como as clulas artificialmente despojadas de parede celular (mesmo que sejam Gram positivas), comportam- se como Gram negativas. As bactrias Gram negativas contm uma concentrao elevada de lipdeos, e suas paredes so tambm mais delgadas com relao s bactrias Gram positivas. O descoramento extrai os lipdeos aumentando a porosidade ou permeabilidade da parede favorecendo a retirada do complexo cristal violeta- iodo. As paredes celulares das bactrias Gram. positivas em virtude de sua composio diferente (menos contedo lipdico, presena de cido

19 teicico, maior quantidade de peptoglicano (mucocomplexo) cujos aminocidos encontram- se mais intercruzados, deixando a parede mais compacta), tornam-se desidratadas durante o tratamento com o descorante; a porosidade diminui, a permeabilidade se reduz e o complexo cristal violeta- iodo no extrado. O mtodo de Gram dentre os processos de colorao para bactrias, o mais importante. Todas as leveduras quando submetidas a esta colorao comportam- se como Gram positivas, enquanto os fungos filamentosos e para os protozorios, geralmente no se aplica esta tcnica por no ser conveniente. REGRAS GERAIS DA COLORAO PELO MTODO DE GRAM 1 - Os cocos, so geralmente Gram-positivos, com exceo dos pertencentes ao gnero Neisseria (Gonococos , Meningococos ). 2 - Os bacilos, so geralmente Gram- negativos, excetuando- se os pertencentes aos gneros: Corynebacterium (bacilo diftrico); Bacillus (B. subtilis ), B. antracis (do carbnculo) e Clostridium (bacilo do ttano Cl . tetani ; Cl. botulinum (do botulismo). TCNICA DA COLORAO DE GRAM 1. Preparar um esfregao; 2. Depois de frio cobrir o esfregao com soluo de cristal de violeta (1 minuto); 3. Cobrir com soluo de lugol (mordente) - 1 minuto; 4. Lavar em gua corrente; 5. Descorar pelo lcool absoluto (evitar o descoramento deficiente ou em excesso); 6. Lavar em gua corrente; 7. Contrastar, rapidamente com safranina (30 segundos); 8. Lavar em gua corrente; 9. Secar com papel fino; 10. Examinar com objetiva de imerso. AMOSTRAS:

Bacillus subtilis Escherichia coli Aerobacter aerogenes Staphylococcus aureus Sarcina lutea Micrococcus

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PRTICA N 6
OBJETIVOS: Realizar colorao Especial de esporos Observar ao microscpio sob imerso as preparaes coradas

COLORAO DE ESPOROS Os esporos so clulas de resistncia, no sendo caracterstica predominante de todos os microrganismos. Algumas bactrias so capazes de formar esporos, como por exemplo: bactrias do gnero Bacillus e Clostridium. TCNICA 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Preparar o esfregao e fixar; Cobrir o esfregao com papel de filtro; Adicionar o corante verde malaquita; Aquecer at emisso de vapores; Repetir as operaes 3 e 4 por 3 minutos; Lavar em gua corrente; Adicionar safranina (0,5 a 1 minuto); Lavar em gua corrente; Secar e observar em imerso.

RESULTADO: Os esporos coram- se em verde e o resto da clula em vermelho.

PRTICA N 7
OBJETIVOS: Preparar meios de cultura de usos em prticas microbiolgicas Distribuir convenientemente, esterilizar em autoclave. PREPARAO DE MEIOS DE CULTURA

21 Meios de cultura so associaes de substncias que permitem o cultivo dos microrganismos fora do seu meio natural. Nas preparaes dos meios de cultura todos os nutrientes devem ser dissolvidos em gua para que possam ser absorvidos pelas clulas microbianas. Nos laboratrios geralmente utiliza-se gua destilada no preparo destes meios, no entanto nas unidades industriais costuma- se utilizar gua de rios ou poos. A gua deve ter boa origem e composio qumica constante; quando necessrio, deve ser devidamente tratada. Como constituinte bsico dos meios de cultura, alm da gua, pode-se especificar: as fontes de carbono, as fontes de nitrognio, os sais. Em meios de cultura solidificados, alm destes componentes devese introduzir agar, gelatina ou slica gel com a funo especfica de solificar esses meios. NORMAS DE PREPARAO Pesagem dos componentes: os diversos componentes dos meios de cultura podem ser pesados separadamente, ou consecutivamente num nico recipiente (Bquer). Para quantidades inferiores a 1g utiliza-se uma balana analtica (semianaltica). O Agar-agar geralmente pesado separadamente, sendo o valor da pesagem em funo da quantidade do meio a ser distribudo nos recipientes. Utiliza-se de 10 a 20g deste agente solidificante em p para cada litro de soluo nutriente. Solubilizao dos componentes: adicionar os nutrientes previamente pesados a um Bquer contendo gua destilada em quantidade suficiente para dissolv-los. Os extratos de carne e de leveduras podem ser aquecidos ligeiramente para facilitar a solubilizao. Deve-se evitar o uso de fogo direto e prolongado para no haver queima do material e consequente escurecimento do meio. O Agar no solvel a frio, devendo se necessrio ser solubilizado em um banho-maria ou em autoclave a vapor fluente.

Ajuste do pH nos meios: deve-se deixar resfriar ao mximo os meio lquidos, antes de acertar o pH. No caso dos meios solidificados ajustar na menor temperatura em que no haja solidificao. So empregadas para ajuste do pH solues de hidrxido de sdio ou cido clordrico a 0,1 N, conforme o caso. Na maioria dos casos pode-se verificar o pH atravs do uso de um papel de tornassol. Em meios solidificados, o pH cido s dever ser ajustado depois da esterilizao para evitar a hidrolise do Agar quando em temperatura elevada. Neste caso o pH cido ajustado com uma soluo estril de cido ltico. Clarificao: em alguns casos h necessidade de clarificao dos meios que durante o preparo tornam- se turvos. A clarificao pode ser feita simplesmente pelo calor ou pelo uso de clara ou albumina de ovo,

22 aquecendo em seguida at ebulio e filtrando-se em gaze ou algodo hidrfilo. Distribuio, esterilizao e conservao: os meios de cultura depois de preparados so distribudos em recipientes adequados (tubos, bales, Erlenmeyeres), especificando o respectivo nome ou sigla e a data do preparo dos mesmos. Terminada a distribuio, os tubos, bales ou Erlenmeyers so arrolhados com algodo ou tampas metlicas especiais, acondicionados em cestas e levados esterilizao em autoclave. A temperatura e o tempo de exposio neste equipamento dependem da composio e da quantidade de meio de cultura recipiente (vide esterilizao). Aps a esterilizao, os meios so resfriados espera- se 72 horas antes de us-los ou estoc- los em geladeira, a fim de que se possa detectar algum tipo de contaminao, ou falha de esterilizao.

COMPOSIO DE MEIOS DE CULTURA AGAR NUTRITIVO Extrato de carne..................................... 3,0g Pepton a................................................. 5,0g Agar..................................................... 20,0g gua destilada....................................... 1000ml pH = 6,8 - 7,0

BATATA GLICOSE AGAR - BGA Batatas descascadas e cortadas em fatias ..... 300g gua destilada.......................................... 1000ml As batatas devem ser manuseadas com o mnimo de exposio ao ar. Aquecer em 500ml de gua at completamente cozidas. Filtrar atravs de gaze, completar o volume para 1000ml e adicionar: Agar ........................................................ 15,0g Glicose..................................................... 20,0g pH = 6,8 - 7,0 CZAPECK (CZ) NaNO 3 (nitrato de sdio)........................... 3,0g K 2 HPO 4 (fosfato monocido de potssio)...... 1,0g MgSO 4 (sulfato de magnsio)...................... 0,5g KCl (cloreto de potssio).......................... 0,5g FeSO 4 (sulfato ferroso).............................. 0,01g

23 Sacarose.................................................. 30,0g Agar........................................................ 20,0g gua destilada..........................................1000ml pH = 6,6 CALDO GLICOSADO Extrato de carne....................................... 3,0g Pepton a................................................... 5,0g Glicose...................................................10,0g gua destilada.........................................1000ml pH = 6,8 - 7,0 CALDO LACTOSADO Pepton a.................................................. 5,0g Extrato de carne...................................... 3,0g Lactose.................................................. 5,0g gua destilada........................................1000ml pH = 6,8 - 7,0 GODOY Pepton a................................................. 1,0g Caldo de cana........................................ 500g Agar...................................................... 15g Juntar ao caldo de cana uma clara de ovo batida. Aquecer at fervura, filtrar completando o volume at 1000ml. Juntar a peptona e o Agar.

GLICOSE LEVEDURA (GL) Pepton a .................................................. 10,0g Extrato de carne....................................... 3,0g NaCl....................................................... 5,0g Extrato de levedura................................... 10,0g Glicose.................................................... 10,0g Agar........................................................ 12-15g gua destilada.......................................... 1000mL pH 6,9 -7,1 EMB Pepton a ................................................... 10,0g Lactose..................................................... 5,0g Sacarose................................................... 5,0g K 2 HPO 4 .................................................... 2,0g

24 Agar......................................................... 12-15g gua destilada........................................... 1000mL Dividir em bales de 250 mL, 100mL e 200mL de meio. Esterilizar a 120 o C por 20 minutos. Quando for distribuir em placas para uso, fundir e adicionar para cada 100 mL de meio, 1mL de soluo estril de eosina (4%) e 1mL de soluo estril de azul de metileno (0,65%). As placas podem ser guardadas por uma semana em refrigerador. GLICOSE AGAR (GA) Extrato de carne .................................... 3,0g Pepton a................................................. 5,0g Glicose................................................. 10,0 Agar..................................................... 20,0g gua destilada....................................... 1000ml pH = 6,8 - 7,0 VERDE-BRILHANTE Pepton a ................................................... 10,0g Lactose..................................................... 10,0g Bile de boi................................................ 20,0g Verde brilhante....................................... 0,0133g gua destilada........................................... 1000mL pH = 7,2 Autoclavar a 115 o C por 15 min. Para adicionar o verde brilhante pode-se preparar uma soluo a 0,1% em gua destilada (0,1g de verde brilhante em 100mL de gua destilada) e dela juntar 13,3 mL ao meio de cultura. Distribuir 10mL do caldo em tubos grande com tubinhos de Duhran. SORO DE LARANJA Triptona................................................ 10,0g Extrato de leveduras............................... 3,0g Glicose................................................. 4,0g Fosfato dipotssico................................ 15,0g Soro de laranja......................................200,0ml gua destilada.......................................800,0ml Preparar o soro de laranja aquecendo 1 litro do suco recmextrado, a aproximadamente 93C. Adicionar 30g de diatomcea e misturar. Filtrar com suco atravs de um funil de Buchner usando

25 papel de filtro grosseiro recoberto com o auxlio de filtrao. Refiltrar os primeiros mililitros. Ajustar o pH a 5,5 , distribuir em recipientes adequados.

PRTICA N 8
OBJETIVOS: Isolar bactrias, fungos filamentosos e leveduras de ambientes diversos Identificar morfologicamente as espcies isoladas

Os microrganismos em seus ambientes naturais (gua, solo, ar etc.) existem como uma populao mista. Para que possamos estudar uma determinada espcie de microrganismo nas suas caractersticas morfolgicas e bioqumicas individuais necessrio separ- la das diversas espcies contidas nessa populao, obtendo uma cultura pura e formada por microrganismos derivados de uma nica clula original. O isolamento de microrganismos requer tcnicas adequadas de inoculao destes microrganismos em meios de cultura adequados que possibilitem o seu rpido crescimento, livre de contaminaes. Para o cultivo, em condies laboratoriais, de microrganismos necessrio o conhecimento de suas exigncias nutritivas e das condies fsicas requeridas. Extensas pesquisas determinaram exigncias nutritivas de muitas espcies de microrganismos e esta informao resultou no desenvolvimento de numerosos meios de cultura. Por causa da grande variedade das necessidades nutritivas dos microrganismos h, tambm, grandes diferenas na composio dos meios utilizados. Do mesmo modo, existem amplas variaes no que se refere ao ambiente fsico que favorece seu crescimento. Alguns microrganismos, por exemplo, crescem abaixo de 0 C; outros exigem temperatura acima de 45C e podem desenvolver-se at mesmo a 70 C. certas bactrias necessitam do oxignio atmosfrico; outras so indiferentes ou inibidas pelo oxignio.

MTODO DE ISOLAMENTO DE CULTURAS PURAS Tcnica de sementeira em superfcie e de esgotamento do inculo:

26 - Com o uso de uma ala de platina, coloca-se uma poro de espcime na superfcie de um meio de cultura com Agar. Espalhar a amostra de lado a lado, na superfcie da placa, traando linhas de acordo com as figuras 1 e 2, de modo que as bactrias individuais se separem umas das outras.
-

- Incubar as placas na temperatura adequada - Examinar as placas que apresentarem colnias isoladas - Selecionar uma colnia caracterstica da espcie estudada e anotar seus aspectos macroscpicos, tais como: tamanho, forma, consistncia, cor da colnia e de seu reverso, se h pigmento solvel etc. - Transferir com a ajuda de uma ala de platina, material da colnia escolhida para um tubo contendo meio inclinado e incubar temperatura e tempo adequados. - Examinar as caractersticas do microrganismo atravs de observaes microscpicas in vivo e in vitro com coloraes especficas utilizando para isso um microscpio tico luminoso.

Tcnica da placa derramad a (pour-plate): O princpio da tcnica o da diluio do material em tubos de Agar liquefeito. - Transfere-se uma ala de platina da suspenso original para o tubo A (Agar fundido). O tubo rolado entre as mos, permitindo a mistura completa do inoculo com o meio. Transferncias similares so efetuadas do tubo A para o B e, deste, para o C. - Os contedos de cada tubo so derramados em placas separados - Incubar as placas na temperatura e perodo de tempo adequado - Examinar as placas que apresentarem colnias isoladas - Selecionar uma colnia caracterstica da espcie estudada e anotar seus aspectos macroscpicos, tais como: tamanho, forma, consistncia, cor da colnia e de seu reverso, se h pigmento solvel etc. - Transferir com a ajuda de uma ala de platina, material da colnia escolhida para um tubo contendo meio inclinado e incubar temperatura e tempo adequados.

27 - Examinar as caractersticas do microrganismo atravs de observaes microscpicas in vivo e in vitro com coloraes especficas utilizando para isso um microscpio tico luminoso. Tcnica das diluies sucessivas: se o microrganismo suspeito, numa populao mista, est presente em nmero maior do que outros germes podem ser obtidos em cultura pura por meio de uma srie de diluies em meios apropriados. - Transfere-se 1 mL ou 1g do material a ser examinado para um Erlenmeyer A contendo 99ml de gua estril. Homogeneizar- se permitindo a mistura completa do inoculo com a gua. A parir da, transfere-se 1mL para um tubo B com 9ml de gua estril, agita-se e repete a operao para os tubos restantes (C, D, E). Obtm- se assim uma srie de diluies decimais. - De cada tubo transferir para duas placas estreis, amostra de 1 mL, depois adicionar a cada placa cerca de 15 ml de meio fundido e resfriado a 45 o C; - Incubar as placas na temperatura e perodo de tempo adequado; - Examinar as placas que apresentarem colnias isoladas. Maiores detalhes sobre esta tcnica esto no esquema apresentado na figura 2.

FIGURA 2 - Esquema de diluio da tcnica das diluies sucessivas. Visando facilitar o entendimento e treinar os alunos nas tcnicas de isolamento acima referidas, foram selecionadas de algumas tcnicas sobre bactrias, bolores e leveduras. Estas tcnicas deveram ser realizadas em grupo de trs alunos e realizadas num perodo de 1 a 2 seman as.

ISOLAMENTO DE Streptomyces sp. DO SOLO

28

MATERIAL Amostra de terra seca Erlenmeyer com 99 ml de gua estril 4 tubos de ensaio contendo cada um 9 ml de gua estril 1 balo com meio de Czapeck (CZ) Placas de Petri esterilizadas Tubos de ensaio com meio Cz Placa com meio AVP TCNICA 1 o DIA Pesar um grama de terra e suspender no Erlenmeyer que contm gua estril. Agitar para obter uma suspenso dos microrganismos existentes. Transferir com pipeta estril, 1 ml da suspenso para um dos tubos de gua estril; agitar bem e deste tubo retirar 1ml e transferir para outro tubo com gua e assim sucessivamente sendo realizada uma srie de diluies 10 - 2 , 10 - 3 , 10 - 4 ,10 - 5 ,10 - 6 . De cada tubo transferir para duas placas estreis, amostra de 1 ml, depois adicionar a cada placa cerca de 15 ml de meio de CZ fundido e resfriado a 45 o C.

2 o DIA -

Agitar para homogenizar. Esperar o meio solidificar em repouso por mais ou menos 3 minutos, inverter as placas e incubar temperatura ambiente durante 5 a 7 dias. Observar as colnias que cresceram e escolher colnias tpicas de Streptomyces : pequenas, secas, de cores variadas. Na escolha da colnia devem ser anotados aspectos macroscpicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos, caractersticas da superfcie da colnia, brilho, presena de pigmento solvel. Transferir com ala de platina parte da colnia para um tubo com CZ e para uma placa com meio de CZ e para uma placa com AVP, fazendo nesta ltima uma

29 estria no centro com auxlio de uma ala em L. Incubar. 3 o DIA Observar o crescimento no tubo de cultura. Testar a atividade antimicrobiana da cepa utilizando a placa de AVP que apresenta uma estria central; inocular diferentes germes (bactrias, leveduras) fazendo estrias perpendiculares estria central, comeando a 30 mm da estria central e terminando junto mesma. Fazer placas testemunhas inoculando apenas as estrias de microrganismos-testes. Incubar as placas a 30 o C ou 37 o C dependendo da temperatura dos microrganismos-testes. Observar se houver inibio e medir (o halo correspondente) a distncia em milmetros do crescimento do microrganismoteste at a estria de Streptomyces.

4 o DIA -

OBSERVAO: A prtica dever ser encerrada mediante a entrega

do relatrio e do tubo de cultura isolada.

3 0

ISOLAMENTO DE BACILOS ESPORULADOS DO SOLO

MATERIAL Amostra de terra seca 1 Erlenmeyer com 99 ml de gua estril 1 tubos de ensaio contendo 10ml de caldo glicosado 4 tubos de ensaio contendo cada um 9 ml de gua estril 1 balo com meio de Agar Nutritivo (AN) Placas de Petri esterilizadas Tubos de ensaio com meio AN TCNICA 1 o DIA Pesar um grama de terra e suspender no erlenmeyer que contm gua estril. Agitar para obter uma suspenso dos microrganismos existentes. Transferir com pipeta estril, 1 ml da suspenso para um tubo de caldo glicosado. Imergir o tubo em gua fervente pelo espao de tempo de 5 minutos. Resfriar e transferir 1 ml do caldo para um tubo com 9ml de gua estril, agitar para homogenizar e repetir a operao para mais 3 tubos. Obtm- se assim uma srie de diluies decimais 10 - 4 ,10 - 5 ,10 - 6 . De cada diluio transferir para duas placas estreis, amostra de 1ml, depois adicionar a cada placa cerca de 15 ml de meio de AN fundido e resfriado a 45 o C.

2 o DIA -

Agitar para homogenizar. Esperar o meio solidificar em repouso por mais ou menos 3 minutos, inverter as placas e incubar temperatura ambiente durante 48 horas. Observar as colnias que cresceram e escolher colnias tpicas

31 de bacilos esporulados: grandes, com bordos irregulares, de superfcie rugosa. Na encolha da colnia devem ser anotados aspectos macroscpicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos, brilho, presena de pigmento solvel. Transferir com ala de platina parte da colnia para um tubo com AN e incubar temperatura ambiente. 3 o DIA Observar o crescimento no tubo de cultura em AN. Fazer lmina in vivo para observar se h movimento. Realizar uma colorao de Gram e uma de esporos.

OBSERVAO: A prtica dever ser encerrada mediante a entrega

do relatrio e do tubo de cultura isolada.

32

ISOLAMENTO DE BACTRIAS MESOFLICAS DE GUA

MATERIAL Amostra de gua poluda 1 Erlenmeyer com 99 ml de gua estril 4 tubos de ensaio contendo cada um 9 ml de gua estril 1 balo com meio de Agar Nutritivo (AN) Placas de Petri esterilizadas Tubos de ensaio com meio AN TCNICA 1 o DIA Pesar 1 mL da amostra e suspender no Erlenmeyer que contm 99mL de gua estril. Agitar para obter uma suspenso dos microrganismos existentes. Transferir com pipeta estril, 1 ml da suspenso para um dos tubos de gua estril; agitar bem e deste tubo retirar 1ml e transferir para outro tubo com gua e assim sucessivamente sendo realizada uma srie de diluies 10 - 3 , 10 - 4 ,10 - 5 ,10 - 6 . De cada diluio transferir para duas placas estreis, amostra de 1ml, depois adicionar a cada placa cerca de 15 ml de meio de AN fundido e resfriado a 45 o C.

2 o DIA -

Agitar para homogeneizar. Esperar o meio solidificar em repouso por mais ou menos 3 minutos, inverter as placas e incubar temperatura ambiente durante 48 horas. Observar as colnias que cresceram e escolher colnias tpicas de bactrias. Na escolha da colnia devem ser anotados

3 3 aspectos macroscpicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos, consistncia, caractersticas da superfcie da colnia brilho, presena de pigmento solvel. Transferir com ala de platina parte da colnia para um tubo com AN e incubar temperatura ambiente. 3 o DIA Observar o crescimento no tubo de cultura em AN. Fazer lmina in vivo para observar se h movimento. Realizar uma colorao de Gram e uma de esporos.

OBSERVAO: A prtica dever ser encerrada mediante a entrega

do relatrio e do tubo de cultura isolada.

3 4

ISOLAMENTO DE BACTRIAS MESOFLICAS DE SORVETE

MATERIAL Amostra de sorvete 1 Erlenmeyer com 90 ml de gua estril 4 tubos de ensaio contendo cada um 9 ml de gua estril 1 balo com meio de Agar Nutritivo (AN) Placas de Petri esterilizadas Tubos de ensaio com meio AN TCNICA 1 o DIA Pesar 10 mL da amostra e suspender no Erlenmeyer que contm 90 mL de gua estril. Agitar para obter uma suspenso dos microrganismos existentes. Transferir com pipeta estril, 1 ml da suspenso para um dos tubos de gua estril; agitar bem e deste tubo retirar 1ml e transferir para outro tubo com gua e assim sucessivamente sendo realizada uma srie de diluies 10 - 2 ,10 - 3 , 10 - 4 ,10 - 5 ,10 - 6 . De cada diluio transferir para duas placas estreis, amostra de 1 ml, depois adicionar a cada placa cerca de 15 ml de meio de AN fundido e resfriado a 45 o C.

2 o DIA -

Agitar para homogeneizar. Esperar o meio solidificar em repouso por mais ou menos 3 minutos, inverter as placas e incubar temperatura ambiente durante 48 horas. Observar as colnias que cresceram e escolher colnias tpicas de bactrias. Na escolha da colnia devem ser anotados

35 aspectos macroscpicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos, consistncia, caractersticas da superfcie da colnia brilho, presena de pigmento solvel. Transferir com ala de platina parte da colnia para um tubo com AN e incubar temperatura ambiente. 3 o DIA Observar o crescimento no tubo de cultura em AN. Fazer lmina in vivo para observar se h movimento. Realizar uma colorao de Gram e uma de esporos.

OBSERVAO: A prtica dever ser encerrada mediante a entrega

do relatrio e do tubo de cultura isolada.

36

ISOLAMENTO DE BACTRIAS COLIFORMES

MATERIAL Amostra de gua de banheiro, ou pedao de queijo coalho ou carne de sol; Tubos com meio de verde brilhante lactose bile (VB) Tubos de ensaio contendo caldo lactosado 1 balo com meio de Agar Nutritivo (AN) Placas de Petri com meios diferenciais (EMB ou Endo ou TTC) Tubos de ensaio com meio AN TCNICA 1 o DIA 2 o DIA Inocular o tubo de Verde-brilhante com o material a ser pesquisado, incubar a 35 o C por 48 horas. Inocular o tubo fermentado em placas de Petri com meio diferencial seguindo um dos esquemas abaixo.

3 DIA -

Incubar 35 o C durante 48 horas. Observar as colnias que cresceram e escolher colnias tpicas de coliformes. Na escolha da colnia devem ser anotados

3 7 aspectos macroscpicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos, consistncia, brilho, presena de pigmento solvel. Transferir com ala de platina parte da colnia para um tubo com AN e para um tubo com caldo lactosado (CL) incubar 35 o C. 4 o DIA Observar se o tubo de caldo lactosado fermentou e ento se o tubo tiver dado resultado positivo (presena de bolha de ar) prosseguir a anlise com o tubo de cultura com o meio de Agar nutritivo (AN). Realizar uma colorao de Gram e uma de esporos. Anotar os resultados e comparar com a literatura.

OBSERVAO: A prtica dever ser encerrada mediante a entrega

do relatrio e do tubo de cultura isolada.

3 8

ISOLAMENTO DE BACTRIAS DO IOGURTE

( Lactobacillus e Streptococcus )

MATERIAL
Uma amostra de Iogurte natural Placa de Petri com meio de Agar glicose levedura (GL) Tubos de ensaio com meio de leite desengordurado Tubos de ensaio com meio de Agar glicose levedura (GL) TCNICA 1 o DIA Fundir e resfriar o meio de cultura; em seguida distribuir em placas de Petri. Quando o meio solidificar fazer estrias com o material pesquisado na superfcie de cada uma das placas. Cada aluno dever realizar a tcnica de esgotamento utilizando apenas uma placa, segundo o desenho abaixo:

ou ento, com uma ala em L fazer estrias paralelas a partir da gota depositada na primeira placa e continuando em mais duas placas do mesmo meio, segundo o esquema abaixo:

Agitar para homogeneizar. Esperar o meio solidificar em

3 9 repouso por mais ou menos 3 minutos, inverter as placas e incubar em condies anaerbicas ou sob tenso de CO 2 (por exemplo, utilizando uma lata cuidadosamente no fundo da lata e a seguir fechar bem, por um perodo de 48 a 72 horas. 2 o DIA Observar as colnias que cresceram e escolher colnias distintas. Na escolha da colnia devem ser anotados aspectos macroscpicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos, consistncia, brilho, presena de pigmento solvel. Transferir com ala de platina parte da colnia para um tubo com meio de GL e para um tubo com meio de leite (o qual pode conter um corante indicador). Incubar. Observar o se h coagulao no tubo com meio de leite. Verificar se h crescimento no tubo de GL e realizar uma colorao de Gram. Incubar. Comparar com os dados obtidos na prtica com os fornecidos pela literatura.

3 o DIA -

OBSERVAO: A prtica dever ser encerrada mediante a entrega

do relatrio e do tubo de cultura isolada.

4 0

ISOLAMENTO DE BOLORES DO SOLO

MATERIAL
Uma amostra de terra seca Um Erlenmeyer com 99 ml de gua estril 4 tubos com 9 ml de gua estril Um balo com meio de Czapeck (CZ) fundido 8 placas de Petri estreis 4 tubos e quatro placas com meio de Czapeck TCNICA 1 o DIA Pesar um grama de terra e suspender no Erlenmeyer que contm gua estril. Agitar para obter uma suspenso dos microrganismos existentes. Transferir com pipeta estril, 1 ml da suspenso para um dos tubos de gua estril; agitar bem e deste tubo retirar 1ml e transferir para outro tubo com gua e assim sucessivamente sendo realizada uma srie de diluies 10 - 2 , 10 - 3 , 10 - 4 ,10 - 5 ,10 - 6 . De cada tubo transferir para duas placas estreis, amostra de 1ml, depois adicionar a cada placa cerca de 15 ml de meio de CZ fundido e resfriado a 45 o C.

2 o DIA -

Agitar para homogenizar e incubar temperatura ambiente durante 5 a 7 dias. ( 5 a 7 dias depois) Observar as colnias que cresceram e escolher colnias tpicas de bolores: filamentosas, grandes, de cores variadas. Na escolha da colnia devem ser anotados aspectos

41 macroscpicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos, consistncia, brilho, presena de pigmento solvel. Transferir com ala de platina parte da colnia para um tubo com CZ e para uma placa com meio de CZ. Incubar. 3 o DIA Observar o crescimento da colnia gigante na placa e a partir da cultura crescida no tubo, preparar um cultivo em cmara mida. Incubar Observar a lmina ao microscpio para determinar tipos de hifas, tipo de esporos assexuados, e se possvel a classe e o gnero do fungo em estudo

4 o DIA -

OBSERVAO: A prtica dever ser encerrada mediante a entrega

do relatrio e do tubo de cultura isolada.

42

ISOLAMENTO DE BOLORES DO MATERIAL MOFADO

MATERIAL
Uma amostra de po, queijo, fruta ou outro material mofado. Placa de Petri com meio de Czapeck (CZ) e Batata- glicose-agar (BGA) Tubos de ensaio com meio de CZ e BGA 1 o DIA Fundir e resfriar os meios de BGA e CZ; em seguida acidificar com cido ltico a pH 3,5. Distribuir em placas de Petri. Esperar solidificar. Com o auxlio de uma ala em agulha incubar material mofado no centro de cada um dos meios contidos em placas. Incubar temperatura ambiente durante 5 dias.

2 o DIA -

(5 a 7 dias depois) Observar as colnias que cresceram e escolher colnias tpicas de bolores: filamentosas, grandes, de cores variadas. Na encolha da colnia devem ser anotados aspectos macroscpicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos, consistncia, brilho, presena de pigmento solvel. Transferir com ala de platina parte da colnia para um tubo com CZ e para uma placa com meio de CZ. Incubar. Observar o crescimento da colnia gigante na placa e a partir da cultura crescida no tubo, preparar um cultivo em cmara mida. Incubar Observar a lmina ao microscpio para determinar tipos de hifas, tipo de esporos assexuados, e se possvel a classe e o gnero do fungo em estudo

3 o DIA -

4 o DIA -

4 3

OBSERVAO: A prtica dever ser encerrada mediante a entrega

do relatrio e do tubo de cultura isolada.

4 4

ISOLAMENTO DE FUNGOS DO ACAR CRISTAL

MATERIAL
Acar cristal Erlenmeyer com 99 ml de gua estril Balo com batata- glicose-agar (BGA) acidificado a pH 3,5 Balo com meio de Czapeck (CZ) Placas de Petri estreis Tubos de ensaio com BGA e CZ

TCNICA
1 o DIA Pesar 11g de acar e transferir para o Erlenmeyer com gua estril, agitando bem para dissolver. Transferir pores de 1 e 2 ml para placas de Petri. Os meios de cultura CZ e BGA devem ser fundidos, resfriados a 45 o C e em seguida acidificados com cido ltico a pH 3,5. Adicionar os meios de cultura s placas. Deixar esfriar para solidificar (2 a 3minutos) e incubar temperatura ambiente durante 5 a 7 dias.

2 o DIA -

(5 a 7 dias depois) Observar as colnias que cresceram e escolher colnias tpicas de bolores: filamentosas, grandes, de cores variadas. Na encolha da colnia devem ser anotados aspectos macroscpicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos, consistncia, brilho, presena de pigmento solvel. Transferir com ala de platina parte da colnia para um tubo com CZ e para uma placa com meio de CZ. Incubar. Observar o crescimento da colnia gigante na placa e a partir da cultura crescida no tubo, preparar um cultivo em cmara mida. Incubar Observar a lmina ao microscpio para determinar tipos de

3 o DIA 4 o DIA -

45 hifas, tipo de esporos assexuados, e se possvel a classe e o gnero do fungo em estudo.

OBSERVAO: A prtica dever ser encerrada mediante a entrega

do relatrio e do tubo de cultura isolada.

46

ISOLAMENTO DE LEVEDURAS DE FRUTA

MATERIAL
Fruta (uva, ma, abacaxi, mamo, caj etc.) Erlenmeyer com 50 ml de caldo glicosado (CG) Meio de glicose Agar (GA) cido ltico Placas de Petri estreis Tubos de ensaio estreis Tubos de ensaio para fermentao com caldo glicosado

TCNICA
1 o DIA Acidificar o caldo glicosado com cido ltico a pH 3,5. Cortar a fruta com casca e macerar com ajuda de uma faca. Transferir para o Erlenmeyer com o meio acidificado, agitar e incubar temperatura ambiente, durante 48 a 72 horas. Adicionar os meios de cultura s placas. Deixar esfriar em repouso para solidificar. Com uma ala de platina, depositar uma gota do caldo na superfcie do meio contido na placa de Petri e fazer estrias por esgotamento seguindo o esquema abaixo:

2 o DIA -

ou ento, com uma ala em L fazer estrias paralelas a partir da gota depositada na primeira placa e continuando em mais duas placas do mesmo meio, segundo o esquema a seguir:

4 7

Incubar temperatura ambiente por 48 horas. 3 o DIA Observar as colnias que cresceram e escolher colnias tpicas de leveduras. Na encolha da colnia devem ser anotados aspectos macroscpicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos, consistncia, brilho, presena de pigmento solvel. Transferir com ala de platina parte da colnia para um tubo com GA e para um tubo com meio de CG. Incubar. Analisar o crescimento no tubo com caldo glicosado e observar se a levedura fermentativa. Realizar uma observao in vivo e com colorao simples. Anotar os aspectos microscpicos do microrganismo em estudo, tais como: tipo de reproduo (fisso, gemulao, esporulao), presena de grnulos, de vacolos.

4 o DIA -

OBSERVAO: A prtica dever ser encerrada mediante a entrega

do relatrio e do tubo de cultura isolada.

4 8

ISOLAMENTO DE LEVEDURAS DE CALDO-DE-CANA

MATERIAL
Caldo de cana fermentado (24horas) Meio de glicose Agar (GA) 4 Placas de Petri estreis Tubos de ensaio estreis Tubos de ensaio para fermentao com caldo glicosado

TCNICA
1 o DIA - Adicionar os meios de cultura s placas. Deixar esfriar em repouso para solidificar. Com uma ala de platina, depositar uma gota do caldo na superfcie do meio contido na placa de Petri e fazer estrias por esgotamento seguindo um dos esquemas abaixo:

Incubar temperatura ambiente por 48 horas.

4 9 2 o DIA Observar as colnias que cresceram e escolher colnias tpicas de leveduras. Na encolha da colnia devem ser anotados aspectos macroscpicos, tais como: tamanho, cor, forma, bordos, consistncia, brilho, presena de pigmento solvel. Transferir com ala de platina parte da colnia para um tubo com GA e para um tubo com meio de CG. Incubar. Analisar o crescimento no tubo com caldo glicosado e observar se a levedura fermentativa. Realizar uma observao in vivo e com colorao simples. Anotar os aspectos microscpicos do microrganismo em estudo, tais como: tipo de reproduo (fisso, gemulao, esporulao), presena de grnulos, de vacolos.

3 o DIA -

OBSERVAO: A prtica dever ser encerrada mediante a entrega

do relatrio e do tubo de cultura isolada.

50

PRTICA N 9
OBJETIVOS: Determinar a densidade celular por turbidimetria Obter o nmero de clulas por contagem em placa Confeccionar uma curva de calibrao de uma espcie microbiana Um cultivo de bactrias ou leveduras em meio lquido, atua como uma suspenso coloidal, refletindo ou pondo obstculos a passagem da luz atravs do mesmo. At certo ponto, a luz que foi absorvida ou refletida proporcional a concentrao de clulas presentes na suspenso. A turvao que apresenta um tubo de ensaio contendo uma cultura em crescimento provocada pela absoro e reflexo da luz. Portanto, ao se medir a percentagem de absoro da luz (turbidimetria) ou a reflexo da luz (nefelometria) se pode estimar a concentrao de clulas presentes. Ficaremos restritos ao primeiro caso. Para as medidas turbidimricas da massa celular, podem ser utilizados instrumentos como um espectrofotmetro ou foto colormetro. Na turbidimetria, a capacidade do cultivo para deter a luz, se expressa como percentagem de luz transmitida, sendo esta percentagem inversamente proporcional concentrao de clulas. A percentagem da transmitncia (T) igual a I/I 0 , sendo I 0 , a intensidade da luz incidente e I, a intensidade da luz transmitida. Para verificar a relao direta proporcional entre a concentrao de clulas e a absorbncia da luz (Densidade tica, DO = log I 0 /I), vamos medir a turbidez de vrias diluies (Figura 3) de uma suspenso de uma cultura de E.coli e proceder a contagem em placa destas diluies. Material - Microrganismos: Escherichia coli (bactria) Saccharomyces cerevisiae (levedura) - Meios de cultura: Caldo lactosado Caldo glicosado - Equipamentos: Agitador magntico Espectrofotmetro - Diversos:

51 Tubos ou cubetas para o espectrofotmetro Pipetas de 5 ml esterilizadas Mtodos - Fazer a diluio das culturas, conforme mostra a figura 3. - Calibrar o espectrofotmetro, utilizando luz com comprimento de onda variando entre 500 e 600nm. Colocar no aparelho um tubo contendo 5ml de meio de caldo lactosado ou caldo glicosado estril. Com este tubo (branco) o espectrofotmetro ajustado para D.O. igual a zero, ou transmitncia igual a 100%; - retirar o branco do aparelho e colocar o tubo da cultura. Fazer a leitura da D.O. e anotar o resultado. Imediatamente proceder a contagem em placa, da cultura no tubo que foi feita a leitura no espectrofotmetro. - repetir o mesmo procedimento para os demais tubos da cultura diluda, ajustando sempre o espectrofotmetro contra o branco, a cada leitura, e agitando bastante o tubo com a cultura; - para a contagem em placa, dos tubos contendo a cultura de E.coli e S. cerevisiae fazer diluies at 1x10 - 7 e plaquear em duplicata 1 ml das diluies de 1x 10 - 4 a 1x10 - 7 .

FIGURA 3. Diluio da cultura para leitura no espectrofotmetro

Resultad os

52 Anotar na tabela, os resultados das leituras das densidades ticas e das correspondentes contagens em placas. Aps obter o nmero de clulas por contagem em placa, das diluies, relacionar num grfico, os valores da D.O. das diversas diluies na ordenada, contra os nmeros de microrganismos correspondentes que se determinou. Assim, obtemos uma curva de calibrao para o referido microrganismo nas condies do experimento. Diluies da cultura (ml) 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 Densid ade tica (D.O) Concentrao celular (clulas/ ml)

PRTICA N 10
OBJETIVOS: Obter a concentrao de clulas de leveduras pelo uso de cmara de contagem (cmara de Neubauer).

A contagem direta por microscpio a mais rpida, e levada a efeito com a contagem de organismos num volume conhecido da cultura. Esta enumerao feita com o auxlio de lminas espessas, conhecidas como cmaras de contagem. As mais comuns so as de Petroff-Hausser, Neubauer e as de Helber. Estas cmaras apresentam uma rea reticulada, com pequenos quadrados de superfcie conhecida. Fazendo parte do conjunto, existe uma lamnula que recobre os pequenos quadrados, de modo que a altura destes lamnula conhecida. No nosso experimento, as leveduras sero contadas numa cmara de Neubauer, que apresenta uma rea dividida em quadrados com 1/400 mm 2 ; a cmara coberta com uma lamnula, deixando uma altura de 1/10 mm, i.., de cada quadrado lamnula. Assim sendo o volume que fica acima de cada quadrado de 1/4000 mm 3 . Esta contagem inclui organismos denominada de contagem total de clulas. viveis e mortos, sendo

53 Este mtodo de contagem direta, tem a vantagem de fornecer um resultado quase imediato, no entanto tem a desvantagem de no se ter a distino entre clulas vivas e mortas. Material - Microrganismo: Cultura de Saccharomyces cervisiae - Reagentes: Soluo salina fisiolgica (0,85% NaCl) -Equipamentos: Microscpio tico comum Cmara de contagem de Neubauer Bico de Bunsen - Diversos: Pipeta Pasteur Mtodos -Adicionar com uma pipeta Pasteur ou similar, uma gota da suspenso da cultura de levedura sobre a rea reticulada da cmara; -colocar a lamnula sobre a gota. Alternativamente, pode-se colocar primeiro a lamnula, e deixar- se que a suspenso do microrganismo, que sai da pipeta, escorra por ao capilar sob a lamnula; - esperar cerca de dez minutos, at que o material sedimente; - usando a objetiva de 40-45X, contar as leveduras em cerca de 10 quadrados dispostos em X (ver figura 2). Resultad os - Calcular o nmero de leveduras/mL, contidas em uma suspenso utiliza- se a seguinte frmula. Concentrao Celular (leveduras/mL) = n x 25000 x diluio onde n= nmero de clulas dos quadrados

Exemplo: n = 232 diluio 1:100

54 Concentrao celular = 232 x 25000 x 100 = 5,8 x 10 8 clulas/mL

PRTICA 11 OBJETIVO: Determinar uma curva de calibrao para a determinao da concentrao da levedura Saccharomyces cerevisiae a partir do fermento prensado. INTRODUO: A partir do conhecimento do teor de matria seca em fermento prensado comercial possvel preparar uma suspenso padro de leveduras, de determinada concentrao, com bastante confiabilidade. Atravs de uma srie de diluies convenientes dessa suspenso padro so obtidas novas suspenses de concentraes conhecidas. Finalmente, a turbidez provocada no meio pelas diferentes suspenses de leveduras medida atravs de um instrumento adequado e os valores obtidos so relacionados com as respectivas concentraes por intermdio de uma expresso matemtica. As diluies adequadas so obtidas atravs de tentativas de forma a abranger um intervalo de concentraes que atenda as seguintes condies: 1 a .) Deve haver uma correlao linear entre a concentrao e o logaritmo da transmitncia e; 2 a ) Os valores das transmitncias obtidas devem estar situadas na regio de maior sensibilidade na escala do instrumento utilizado. TCNICA: 1. Em um copo de Bquer de 50 ml pesar, em balana semianaltica, 2g de fermento prensado, anotando o valor exato. Diluir em um pouco de gua e transferir, analiticamente, para um balo de 1000 ml. Completar o volume e homogeneizar; A partir da concentrao da suspenso padro escolher os valores para as concentraes, de forma a cobrir uma determinada faixa de concentraes; Realizar uma srie de diluies com um conjunto de pipetas e bales volumtricos adequados. Utilizar como sugesto os valores da tabela abaixo. Suspenso nmero Conc. da diluio, Fator de diluio Modo de preparo

2.

3.

55 X (g/l) 1 2 3 4 5 6 7 8 4. 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,8 1,2 20x 10x 6,67x 5x 4x 3,33x 2,5x 1,67x (ml da susp. padro) 25 at 500 25 at 250 15 at 100 20 at 100 50 at 200 15 at 50 20 at 50 15 at 25

Homogeneizar cada suspenso e transferir para um tubo de espectrofotmetro previamente ajustado ao comprimento de onda de 610 nm. Realizar, pelo menos, duas leituras do valor da absorbncia para cada concentrao. O espectrofotmetro calibrado antes de cada leitura, com um branco de gua destilada. Construir um grfico, colocando no eixo das ordenadas os valores da concentrao X (g/l) e no eixo da abscissa os valores da absorbncia (D.O). Fazer uma regresso linear com o auxlio de um programa de computador ou utilizando o mtodo dos mnimos quadrados. Calcular o coeficiente de correlao, r, e determinar o intervalo de concentraes, X 1 X 2 , no qual a expresso vlida.

5.

6.

7. 8.

Observao: A curva de calibrao obtida pelos pontos descritos vlida apenas para o fermento prensado utilizado na sua confeco.

PRTICA 12 OBJETIVOS: Avaliar o crescimento de um microrganismo em diferentes meios de cultivo; Confeccionar a curvas de crescimento celular, utilizando o mtodo turbidimtrico;

56 Calcular o tempo de gerao (G) e a velocidade especfica mxima de crescimento (m x ) e a produtividade celular (P) em cada meio de cultivo. INTRODUO: O crescimento microbiano pode ser definido em termos, tanto da massa, como tambm do nmero de clulas. Em condies de crescimento exponencial, massa celular e nmero de clulas permanecem proporcionais, embora a relao entre estes dois valores possa variar em determinadas condies de cultivo. O crescimento de um microrganismo em diferentes meios de cultivo, por exemplo, pode ser avaliado pela determinao da massa celular que, por sua vez, pode ser medida indiretamente pela turvao de uma suspenso. A evoluo do crescimento pode ser avaliada utilizando um cultivo em batelada em condies de incubao controladas. Com leituras da densidade ptica (absorbncia) de uma srie de amostras retiradas a intervalos de tempo regulares, e com auxlio da curva padro de calibrao, possvel confeccionar uma curva de crescimento relacionando a concentrao celular (ordenada) com o tempo de cultivo (abscissa). Nesta curva so, ento, identificadas as diferentes fases do crescimento microbiano. Durante a fase exponencial de crescimento pode-se ento determinar o tempo de gerao (G) e a velocidade especfica mxima de crescimento (M X . ). Pode-se ainda determinar a produtividade celular (P) que a relao entre a variao da concentrao celular pela variao do tempo de cultivo. Este valor dever ser determinado pela seguinte equao: P= (X f - X o )/(t f - t o ) ) Onde: X o = Concentrao celular inicial, (g/l) X f = concentrao celular final , (g/l) t f = tempo final, (h) t o = tempo inicial, (h) MATERIAL - Microrganismo Saccharomyces cerevisiae - Meios de cultura Caldo nutritivo suplementado com 1% de acar (glicose, frutose e sacarose) - Equipamentos: Espectrofotmetro Mesa agitadora (rumbeira) Balana semianaltica

57 - Diversos: Cubetas do espectrofotmetro Tubos de ensaio estreis 3 Erlenmeyers, 1000 ml Pipetas, 10 ml MTODOS 1. Preparar 1,5 litros de caldo nutritivo, distribuir 500 ml em 3 Erlenmeyers de 1000 ml de capacidade. Adicionar no primeiro 5g de glicose, no segundo 5 g de sacarose e no terceiro 5 g de frutose, homogeneizar e esterilizar a 121 o C por 15 minutos. Deixar esfriar; 2. Retirar uma amostra de 5-10 ml de cada meio para servir como um branco; 3. Colocar os Erlenmeyers na balana semi-analtica e inocular esterilmente cerca de 0,2 a 0,4 g do microrganismo Saccharomyces cerevisiae (fermento prensado ); 4. Retirar 3 ml de amostra com uma pipeta estril, imediatamente aps a inoculao, correspondente, portanto, ao tempo zero. Efetuar a leitura da Absorbncia (ou densidade ptica). Anotar o resultado; 5. Colocar os Erlenmeyers na mesa agitadora, tendo o cuidado de fixlos bem. Ligar a agitao a 9000 rpm. Deix-los sobre agitao durante todo o cultivo; 6. Retirar amostras de 3 ml a intervalos de 1 hora, at que se observe um mnimo de trs valores idnticos, ou muito prximos, de densidade ptica (DO). Anotar os resultados; 7. Construir um grfico para cada meio de cultivo, colocando no eixo das ordenadas os valores do tempo (h) e no eixo das abscissas concentrao X (g/l); 1. Calcular a velocidade especfica mxima de crescimento (m x ) o tempo de gerao (G) e a produtividade celular (X/t) em cada meio de cultivo;

1. Comparar os resultados obtidos e tirar concluses a respeito do meio mais adequado ao crescimento.

Modelo de registro tabular Meio de Cultivo: Tempo Densidade Concentrao (h) ptica X(g/l) (DO)

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