tica, Legal e Protege.

Leishmune. tica, Legal e Protege.

Introduo
A Fort Dodge tem como MISSO Trazer ao mundo produtos farmacuticos que melhorem vidas e que proporcionem valor excepcional aos nossos clientes. Ciente do significado deste enunciado, nossa empresa investe continuamente em Pesquisa e Desenvolvimento para oferecer comunidade produtos seguros e eficazes. Respeitamos incondicionalmente a classe veterinria, foco do nosso trabalho. Por isso, as informaes que transmitimos aos nossos clientes baseiam-se em trabalhos tcnicos, que sustentam a nossa argumentao. Leishmune TICA.

Sabemos que a escolha de uma vacina um ato de grande responsabilidade. Confiana na marca e avaliao criteriosa dos resultados de segurana, eficcia e proteo, apresentados pelo fabricante, tm grande importncia no processo de deciso. Porm, fundamental ter a convico de que o produto escolhido est devidamente regularizado junto aos rgos competentes. Leishmune foi registrada no Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento sob a licena n 8.627, em 11 de junho de 2003. Leishmune LEGAL.

E finalmente, lembramos que em 2009 a vacina Leishmune est completando 5 anos de mercado. Entre 2004 e 2008 mais de 70.000 ces foram vacinados em todo o Brasil e, segundo as informaes fornecidas pelos veterinrios responsveis pela vacinao, a proteo conferida superior a 97%. Este um resultado importante, que foi obtido a partir de levantamentos realizados a campo, ou seja, em ces residentes em reas endmicas e submetidos ao desafio natural. Leishmune PROTEGE.

Vacina de subunidade
Vacinas de subunidade utilizam antgenos vacinais obtidos a partir de uma frao especfica e purificada de determinado microorganismo, tecnologia de produo que resulta em uma

vacina altamente segura e eficaz. Desenvolvida pela Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), a Leishmune produzida com o complexo glicoproteico FML (fucose-mannose-ligand) como antgeno. O FML est presente em todas as leishmnias do complexo L. donovani (L. donovani, L. infantum / chagasi) e inibe a penetrao de formas promastigotas e amastigotas em macrfagos, evitando assim a infeco.
1,2

A escolha do adjuvante tambm uma importante etapa a ser cumprida durante o desenvolvimento de uma vacina. Adjuvantes so utilizados com a finalidade de potencializar a resposta imune quando administrados junto com o antgeno e no devem ser txicos nem causar efeitos colaterais graves.
3

O poder imunognico do antgeno FML potencializado pela saponina, adjuvante de imunidade utilizado na Leishmune . Nos estudos publicados, a combinao FML+saponina foi capaz de induzir alta resposta imune sem causar efeitos txicos locais ou sistmicos graves.
4,5,6

Importante salientar que a Leishmune no representa risco de infectividade para o co, por se tratar de uma vacina composta por antgeno purificado no-patognico (FML). Trabalhos cientficos demonstraram que o co vacinado, alm de no desenvolver a doena, no apresenta o parasita na pele e no sangue, mesmo sob desafio.
7,8

Leishmune FML

Subunidade FML

Outras subunidades

Leishmnia

Alta resposta imune celular

Na proteo contra a Leishmaniose Visceral Canina (LVC), a resposta imune celular a mais importante e so os macrfagos que desempenham o papel central no controle da doena.

Aps a infeco e posterior fagocitose das promastigotas metacclicas pelos macrfagos, poder ocorrer a destruio das leishmnias ou a sua multiplicao e posterior disseminao, dependendo das citocinas produzidas. Entre as citocinas responsveis pela resistncia, destacam-se a IL-2, IL-12, TNF (fator de necrose tumoral) e interferon , que so produzidas por linfcitos T especficos, a partir do estmulo direto sobre o CD4, resultando em uma resposta Th-1 protetora. Por outro lado, quando so produzidas outras interleucinas como IL-4, IL-5, IL-6, IL-13 e IL-10 (maioria dos ces no vacinados), a resposta imune celular no observada, resultando em uma resposta Th-2; consequentemente, a doena estar presente. Diversos estudos recentes demonstraram que a principal citocina responsvel pela susceptibilidade do hospedeiro doena a IL-10, pois alm de estimular a resposta Th-2, ela inibe e bloqueia a produo de interferon , citocina responsvel pela proteo. A Leishmune induz a resposta Th-1, estimulando a produo de interferon e citocinas ativadoras de macrfagos, responsveis pela resistncia infeco e destruio do parasita, resultando na proteo dos ces (Fig. 1). Em um estudo recente apresentado no Simpsio Internacional de Imunologia Veterinria (Ouro Preto - MG, 2007), foi demonstrada resposta linfoproliferativa, alta produo de interferon e ausncia de IL-10 em animais vacinados com Leishmune , quando comparados com um grupo controle, caracterizando forte proteo dos animais9. Tambm foi demonstrado que a vacina induz altos nveis de IgG2 (Th-1), imunoglobulinas que demonstram a resistncia natural doena.
10

Fagolisossomo

Resposta Th-1 protetora (ces protegidos)

IL4 IL5 IL6 IL10 IL13
CD8

Amastigota Promastigota

Resposta Th-2 (susceptibilidade doena)

Fig.1 - Resposta protetora em ces vacinados com Leishmune (fonte: Nogueira, FS 2007)

A resposta imune celular induzida pela Leishmune tambm foi comprovada pela intradermorreao (IDR) em animais vacinados e posteriormente desafiados (Fig. 2 e 3), tanto experimentalmente quanto a campo. A IDR positiva demonstra que h resposta imune celular e consequente proteo do animal.
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19

A Fort Dodge sempre comprovou a resposta celular em todos os trabalhos realizados, tanto em animais de laboratrio quanto em ces, e a grande maioria deles est disponvel em literatura internacional.

Fig.2

Ces vacinados inoculados com lisado de promastigotas, via intradrmica.

Fig.3

Medio do halo produzido pela hipersensibilidade local do teste de IDR, demonstrando que h resposta imune celular.

Proteo comprovada superior a 92%

Nos 2 trabalhos de eficcia realizados em ces, durante a fase de desenvolvimento da Leishmune , foi demonstrado proteo de 92 e 95% nos animais vacinados e acompanhados

durante 24 e 41 meses, respectivamente. Estes estudos foram realizados em uma regio endmica para a Leishmaniose Visceral (So Gonalo do Amaranto RN) e receberam apoio financeiro da FUNASA (Fundao Nacional de Sade).
20,21

Outra publicao, com 550 ces vacinados e acompanhados durante 2 anos, demonstrou 99% de proteo. Neste estudo todos os ces suspeitos foram submetidos PCR de sangue e linfonodo, sendo que outros testes tambm foram realizados, conforme solicitao do mdico veterinrio responsvel pelo co.22 Um levantamento realizado em 2008, com mdicos veterinrios usurios da Leishmune , mostrou que a proteo a campo , em mdia, 97,3%. Estes dados foram relatados por 89 clnicas, localizadas em reas de alto desafio, com uma amostragem de 8.393 ces vacinados entre Agosto 2004 e Agosto de 2008, comprovando que a vacina altamente eficaz campo.

Perfil sorolgico do co vacinado com a Leishmune

A partir do lanamento da Leishmune , em 2004, os laboratrios de diagnstico comearam a observar que

soros de ces vacinados apresentavam resultados NEGATIVOS no teste ELISA. Isto se explica pelo fato do kit ELISA utilizado pelos laboratrios particulares ter como antgeno uma protena recombinante (S7), que no reconhece os anticorpos anti-FML de ces vacinados.23 Recentemente, ficou evidenciado, atravs de estudos realizados com um kit de diagnstico desenvolvido no laboratrio de Imunoparasitologia da FCAV-UNESP de Jaboticabal, pela ps-graduanda Tricia Maria de Oliveira (dissertao de mestrado), sob orientao da Prof Dra. Rosangela Zacarias Machado, que os ces vacinados com a Leishmune apresentam resultado negativo neste kit, que utiliza protenas solveis semipurificadas de leishmnia como antgeno. O kit utilizado nos inquritos epidemiolgicos, do laboratrio Bio-Manguinhos, tambm utiliza antgenos solveis de leishmnia. Conclui-se, portanto, que os animais vacinados com a Leishmune apresentam resultado negativo nos kits ELISA atualmente licenciados pelo Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento - MAPA (kit Biogene e kit Bio-Manguinhos). Durante o desenvolvimento da Leishmune , o teste sorolgico ELISA realizado na UFRJ utilizava o FML como antgeno (mesma glicoprotena utilizada como antgeno na Leishmune ), mostrando resultados positivos. Este foi o motivo pelo qual a Fort Dodge divulgou que os animais seriam soropositivos aps a vacinao com a Leishmune , o que no ocorre quando so usados os kits ELISA do mercado, que utilizam outro antgeno. A regularizao dos kits de diagnstico registrados no MAPA s ocorreu aps o lanamento da Leishmune , em 2004. Alm disso, os kits ELISA do Bio-Manguinhos no esto disponveis comercialmente.

Descrio do mtodo ELISA

+ substrato

1. O antgeno diludo em soluo tampo, numa concentrao pr-estabelecida, incubado em placa de poliestireno (placa com alto poder de adsoro). 2. Aps perodo de incubao realizada a lavagem da placa, para eliminao dos antgenos no adsorvidos. 3. O anticorpo (soro) previamente diludo adicionado. 4. Ocorre a ligao do anticorpo ao antgeno aderido na placa, e uma nova lavagem realizada para retirada de anticorpos que no se ligaram. 5. Adiciona-se uma protena conjugada, ou seja, um anti-anticorpo marcado com uma enzima, que se liga ao complexo de antgenoanticorpo j aderido na placa. 6. A placa passa por nova lavagem. 7. adicionado um substrato revelador. 8. Este substrato revelador reage com a enzima da protena conjugada, produzindo uma cor (azul). 9. Ao final do teste adiciona-se um bloqueador de reao que acentua a colorao (amarelo). A leitura realizada em leitor de ELISA. A intensidade da colorao determina a quantidade de anticorpos presente na amostra.24

Testes ELISA realizados com soros de ces vacinados com Leishmune

Kit Bio-ManguinhosA
Controles positivos Controles negativos Sem soro Sem soro Controles negativos Controle positivo

Kit BiogeneB

Soros no reagentes

Soros no reagentes

ELISA FMLC
Controles positivos Controles negativos Sem soro

Soros reagentes
A - Kit Bio-Manguinhos kit utilizado somente nos inquritos epidemiolgicos. B - Kit Biogene nico kit licenciado no MAPA para uso em laboratrios particulares. C - ELISA FML ELISA desenvolvido na UFRJ, utilizado somente na referida universidade e no Controle de Qualidade da Fort Dodge.

Leishmune tica
A Fort Dodge uma empresa que preza pela qualidade e veracidade das informaes transmitidas classe veterinria, e tem como Misso proporcionar qualidade de vida excepcional aos seus pacientes atravs do desenvolvimento de produtos farmacuticos e biolgicos de alta qualidade. Neste sentido, a empresa sempre primou pelo apoio e parceria com Mdicos Veterinrios, trazendo informaes tcnicas de altssimo nvel e produtos especficos e exclusivos.

Leishmune Legal
A vacina Leishmune est registrada desde 11/06/2003, sob o n 8.627, no Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento (MAPA), nico rgo responsvel pela aprovao, registro e liberao de produtos veterinrios, sendo liberada para uso dos Mdicos Veterinrios de todo o Brasil como uma ferramenta legal (lcita) para o controle da Leishmaniose Visceral Canina.

Proprietrio e Fabricante: FORT DODGE Sade Animal Ltda. Rua Luiz Fernando Rodriguez,1701 CEP 13064-798 - Campinas - SP CNPJ 43.588.045/0001-31 Resp. Tc: Dr. Christopher Roger White CRMV-SP n 8473 SAC 0800-7019987 www.fortdodge.com.br Licenciado no Ministrio da Agricultura sob o n 8.627 em 11/06/03.

Leishmune Protege
Os estudos para o desenvolvimento da Leishmune iniciaram na dcada de 80, na Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), pela equipe da Dra. Clarisa Palatnik de Sousa. Desde 1980 at hoje, j foram publicados artigos cientficos referentes ao antgeno (FML), ao adjuvante de imunidade (saponina), segurana, imunogenicidade, eficcia e proteo da vacina em ces, alm de trabalhos que demonstraram que a Leishmune uma vacina bloqueadora da transmisso. Mais de 1.000 ces foram vacinados para a realizao destes estudos. Entre os mais importantes esto os que demonstraram:

1. EFICCIA: alm dos estudos de fase III, a eficcia foi confirmada em estudo que contemplou a
vacinao de 550 ces de reas endmicas e peri-endmicas. Os veterinrios responsveis pelo acompanhamento do estudo avaliaram clinicamente os animais e a resposta imune celular foi comprovada pela citometria de fluxo (mensurao de CD4, CD8 e CD21) e pela IDR.
22

2. SEGURANA: estudo que avaliou a possibilidade de reaes alrgicas, locais e sistmicas foi realizado com 600 ces adultos de diversas raas, com idade de at 13 anos26; outro estudo foi realizado em filhotes de raas pequenas, com a aplicao de 1 dose e o dobro da dose da vacina.
27

3. COMPATIBILIDADE: da vacina Leishmune para aplicao simultnea com a Duramune e com a Rai-Vac I. Ficou comprovada a possibilidade de aplicao das trs vacinas na mesma ocasio, sem qualquer tipo de reao ps-vacinal.
28

Alm dos estudos acima, dois trabalhos publicados demonstraram o potencial da Leishmune em bloquear a transmisso da Leishmaniose Visceral (LV), alm do estudo de xenodiagnstico realizado na Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG):

1. AUSNCIA DO PARASITO em pele, sangue e linfonodo de ces vacinados e expostos ao vetor. Neste trabalho, realizado em rea endmica para LV, 32 ces mostraram a ausncia de sinais clnicos, assim como resultados negativos para parasitas na pele (imunohistoqumica), sangue e linfonodos (PCR) 11 meses aps a vacinao com a Leishmune. Neste mesmo perodo, dos 40 animais no vacinados e alocados na mesma rea, 25% tornaram-se sintomticos; 56% apresentaram resultado positivo no PCR de linfonodo, 15,7% eram positivos no PCR de sangue, alm de 25% positivos na imunohistoqumica de pele.7 2. BLOQUEIO DA TRANSMISSO em insetos que se alimentaram de sangue infectado com leishmnias e soro de ces imunizados. Os resultados demonstraram que a Leishmune uma vacina bloqueadora de transmisso, pois preveniu o desenvolvimento de formas promastigotas da leishmnia no intestino do flebtomo, interrompendo o ciclo epidemiolgico.29 3. XENODIAGNSTICO realizado na UFMG, a fim de demonstrar a no infecciosidade do co vacinado para os flebotomneos. Os resultados preliminares do xenodiagnstico, utilizando a Lutzomyia longipalpis, mostraram que 2 dos nove ces naturalmente infectados foram infectantes para os flebotomneos (os dois ces eram sintomticos), enquanto que nenhum dos 19 ces vacinados com a Leishmune infectou os flebtomos, mesmo estando em constante desafio durante 3 anos aps a 1 dose de vacina (em publicao).

Ciclo de transmisso da Leishmaniose Visceral Canina

2
(1) O flebtomo faz seu repasto sanguneo e ingere clulas (macrfagos) parasitadas pelas formas amastigotas da leishmnia. Essas formas so liberadas no trato digestivo e tornam-se promastigotas, que se multiplicam intensamente, colonizando o esfago e a faringe do flebtomo e, na poro anterior do sistema digestivo, tornam-se promastigotas metacclicas, que so a forma infectante. (2) O inseto vetor infectado, ao picar o hospedeiro vertebrado (animal, homem), inocula a forma promastigota metacclica. Essas formas so fagocitadas na epiderme por clulas de defesa (macrfagos da pele) e, no seu interior, evoluem para amastigotas. A partir da ocorre uma multiplicao intensa intracelular e, quando conseguem vencer as resistncias oferecidas pelo organismo, se rompem liberando as formas amastigotas para todos os tecidos.

Finalmente, apesar do baixo ndice de ces vacinados, em Araatuba houve uma reduo de 27,45% e de 61% dos casos caninos e humanos, respectivamente. J em Belo Horizonte a incidncia em humanos declinou 36,14% em reas onde 83,3% dos ces foram vacinados e aumentou em 10,67% onde houve um pequeno nmero de ces vacinados. Mesmo com a pouca cobertura vacinal observou-se a reduo do percentual de ces infectados que seriam sacrificados.8,30

Referncias Bibliogrficas
1. PALATNIK de SOUSA, C.B. et al. Inhibition of Leishmania donovani promastigote internalization into murine macrophages by chemically defined parasite glycoconjugate. Infection and Immunity (1989) 754-763. 2. PALATNIK de SOUSA, C.B. et al. Leishmania donovani surface glycoconjugate GP36 is the major immunogen component of the Fucose-Mannose Ligand (FML). Acta Tropica 53 (1993) 59-72. 3. BOMFORD, R; In: Adjuvants for anti-parasite vaccines. Parasitol. Today. 1989. 5 (2): 41-46. 4. SANTOS, W.R. et al. Haemolytic activies of plant saponins and adjuvants. Effect of Periandra mediterranea saponin on the humoral response to the FML antigen of Leishmania Donovani. Vaccine 15 (9) (1997) 1024-1029. 5. SANTOS, W.R. et al. Saponins, IL12 and BCG adjuvant in the FML-vaccine formulation against murine visceral leishmaniasis. Vaccine 21 (2002) 30-43. 6. PALATNIK de SOUSA, C.B. et al. Protective vaccination against murine visceral leishmaniasis using aldehydecontaining Quilaja saponaria sapogenins. Vaccine 22 (2004) 2470-2479. 7. NOGUEIRA, F.S. et al. Leishmune vaccine blocks the transmission of canine visceral leishmaniasis. Absence of Leishmania parasites in blood, skin and lymph nodes of vaccinated exposed dogs. Vaccine 23 (2005) 4805-4810. 8. PALATNIK de SOUSA, C.B. et al. FML vaccine against canine visceral leishmaniasis: from second-generation to synthetic vaccine. Expert Rev. Vaccines 7 (6), (2008) 833-851. 9. LIMA, V.M.F. et al. In : Anais do 8 International Veterinary Immunology Symposium, Leishmune Vaccine-induced immune response in dogs from an endemic area of visceral leishmaniasis, 15 a 19 de agosto de 2007, Ouro Preto, Brasil, 115-116p. 10. MENDES, C.O. et al. IgG1/IgG2 antibody dichotomy in sera of vaccinated or naturally infected dogs with visceral leishmaniasis. Vaccine 21 (2003) 2589-2597. 11. ARAJO, M.S.S. et al. Despite Leishvaccine and Leishmune trigger distinct immune profiles, their ability to activate phagocytes and CD8+ T-cells support their highquality immunogenic potential against canine visceral leishmaniasis. Vaccine 26 (2008) 2211-2224. 12. GONALVES DA COSTA, S. et al. Immunotherapeutic effect of the FML-Saponin vaccine in one canine case of visceral leishmaniasis (So Gonalo, RJ). Revista Brasileira de Cincia Veterinria (2000), Niteri. V.7. 13. PARAGUAI DE SOUZA, E. et al. Vaccination of Balb/c mice against experimental visceral leishmaniasis with the GP36 glycoprotein antigen of Leishmania donovani. Vaccine 19 (2001) 3104-3115. 14. NOGUEIRA , F.S. et al. Immunotherapy against experimental canine visceral leishmaniasis with the saponin enriched-Leishmune vaccine. Vaccine 25 ( 2007) 6176-6190. 15. GAMBOA-LEN, R. et al. Immunotherapy against visceral leishmaniasis with the nucleoside hydrolase-DNA vaccine of Leishmania donovani. Vaccine 24 (2006) 4863-4873. 16. SILVA, B. P. et al. Pulcherrimasaponin, from the leaves of Calliandra pulcherrima, as adjuvant for immunization in the murine model of visceral leishmaniasis. Vaccine 23 (2005) 1061-1071. 17. BORJA-CABRERA, G. P. et al. Effective immunotherapy against canine visceral leishmaniasis with the FML-vaccine. Vaccine 22 (2004) 2234-2243. 18. SANTOS, W. R. et al. Immunotherapy against murine experimental visceral leishmaniasis with the FML-vaccine. Vaccine21(2003)4668-4676. 19. PALATNIK de SOUSA, C. B. et al. The FML vaccine (fucosemannose-ligand) protects hamsters from experimental Kalaazar.JournaloftheBrazilianAssociationofScience.Vol46(4).1994. 20. BORJA-CABRERA, G.P. et al. Long lasting protection against kala-azar using the FML-QuilA saponin vaccine in an endemic area of Brazil. Vaccine 20 (2002) 3277-3284. 21. SILVA, V.O. et al. A phase III trial of efficacy of the FMLvaccine against canine kala-azar in an endemic area of Brazil (So Gonalo do Amarante, RN). Vaccine 19 (2001) 1082-1092 . 22. BORJA-CABRERA, G.P. et al. Immunogenicity assay of the Leishmune vaccine against canine visceral leishmaniasis in Brazil. Vaccine 26 (2008) 4991-4997. 23. ANDRADE, P.P et al. Serologic discrimination between vaccinated and infected dogs in visceral leishmaniasis. Vaccine Congress (2007) Amsterdam, The Netherlands, p164. 24. ROITT, I.; BROSTOFF, J.; MALE, D. Imunologia. 5ed. So Paulo. Manole, 1999, 423p. 25. World Health Organization. UNDP/World Bank/WHO Special program for Research and Training in Tropical Diseases (TDR). Guidelines for the evaluation of Plasmodium falciparum vaccines in populations exposed to natural infection, 1997, 11-49p. 26. L.E. Parra et al. Safety trial using the Leishmune vaccine against canine visceral leishmaniasis in Brazil. Vaccine 25 (2007) 2180-2186. 27. Dados em arquivo: Leishmune safety on pure breed puppies, with 3 doses administered at 21 days interval (2003). 28. Dados em arquivo: Leishmune safety trial, with 2 saponin concentrations, injected simultaneously with Duramune and Rai-Vac I as a possible vaccination program for adult dogs. (2003) 29. Saraiva, E. M. et al. The FML vaccine (Leishmune) against canine visceral leishmaniasis: A transmission blocking vaccine. Vaccine 24 (2006) 2423-2431. 30. PALATNIK de Sousa, C. B. et al. Decrease of the incidence of human and canine visceral leishmaniasis after dog vaccination with Leishmune in Brazilian endemic areas. WorldLeish4 (2009) India, Lucknow, p. 276.

Pentgono 14682