Universidade Presbiteriana Mackenzie 23/03/2012

Extrao de DNA genmico bacteriano e analise eletrofortica do resultado

Felipe Tadeu Rocha 31004741

Julia Zaccarelli 41019318 Lorenzo De Mingo 41018435 Marianna Manes 41052129 Thaislaine Guerner 31118682 4 Etapa

Turma B12 Resumo Este trabalho tem como objetivo a visualizao de molculas de DNA da bactria E.coli atravs do mtodo de eletroforese. Para isso foi feita a extrao do DNA, o preparo do gel e a corrida eletrofortica. O resultado foi que as molculas de DNA bacteriano migraram muito pouco em direo ao plo positivo do gel. Isso aconteceu porque essas molculas so muito grandes e, consequentemente, no conseguem se deslocar muito. 1. Introduo O DNA formado por genes, que so a parte funcional do DNA genmico. Os genes contm as informaes do organismo e as que sero passadas de uma gerao para a outra. O Genoma o conjunto completo de fatores hereditrios contidos nos cromossomos. (COMCIENCIA, 2000). A molcula de DNA formada pela ligao de duas fitas, que so constitudas por nucleotdeos. Estes, por sua vez, so a juno de uma pentose com funo de Desoxirribose, fazendo uma ligao glicosdica com bases nitrogenadas (A,T,C,G) e uma ligao fosfodiester ao grupo fosfato (podem ser at trs grupos fosfato em um nucleotdeo) . Um nucleotdeo se liga ao outro na sequncia 53. Isso significa que o grupo OH do carbono 3 da pentose do nucleotdeo inicial da fita se liga ao grupo fosfato do carbono 5 de outro nucleotdeo. Desse modo, ao analisar uma fita de DNA, o nucleotdeo inicial da fita ter o seu carbono 5 ligado a um grupo fosfato e o ltimo nucleotdeo da fita sempre ter o seu grupo OH livre. Assim, sempre que um nucleotdeo deseja se ligar a fita, ele ser acoplado ao carbono 3 - por isso se diz que as fitas de DNA seguem a sequncia 53. Essa juno de nucleotdeos d origem ao RNA (quando apenas um fita) ou ao DNA (quando duas fitas se ligam atravs de pontes de hidrognio entre as bases nitrogenadas) (COMCIENCIA, 2000). O DNA do cromossomo bacteriano um filamento circular, constitudo por duas cadeias dispostas em hlice (JUNQUEIRA, 2005) e que fica solto no citoplasma da bactria numa regio chamada de nucleoide, que fica prxima a membrana plasmtica. Alm dos cromossomos do nucleoide, as bactrias podem apresentar outros pequenos fragmentos de cromossomos circulares,

denominados

plasmdeos

(JUNQUEIRA,

2005).

Os

plasmdeos

ficam

localizados no citosol fora do nucleoide. Por no ter uma separao espacial, o genoma fica exposto aos ribossomos e, por consequncia, a traduo e a transcrio nas bactrias ocorrem simultaneamente. Neste experimento foi utilizado DNA da bactria Escherichia coli. Essa bactria um bacilo gram negativo de tamanho moderado, pertencente famlia Enterobacteriaceae. Ela faz parte da flora intestinal do homem. Em condies especiais esta bactria pode causar infeces oportunistas, como a gastroenterite - causando diarria, disenteria, febre, clicas abdominais e fezes sanguinrias (MURRAY, 2010). Para a visualizao dos resultados foi utilizada a tcnica da eletroforese em gel de agarose. A eletroforese um mtodo de separao de molculas criado na dcada de 1930 pelo qumico sueco Arnie Tiseleus. Ele baseado na diferena de velocidades em que as molculas se locomovem quando submetidas a um campo eltrico de corrente contnua. Essa tcnica pode ser usada em vrios tipos de molculas, como vitaminas, carboidratos, protenas, cidos nuclicos e nucleotdeos (HOLLER, 2002). O mtodo se inicia colocando a amostra a ser estudada em um suporte poroso e plano, como, por exemplo, gel. Em seguida, colocada uma soluo tampo, capaz de estabelecer o pH da soluo, facilitando a separao das molculas (FERNANDEZ, 2001). Por ltimo, aplicada uma corrente eltrica por um par de eletrodos, sendo um em cada lado do suporte (HOLLER, 2002). Como resultado, h formao de zonas ou bandas, que so agrupamentos de molculas de acordo com os seus tamanhos, formas e cargas (FERNANDEZ, 2001). A velocidade de migrao depende da carga e do tamanho das molculas. Molculas menores tm uma velocidade maior e molculas com uma carga maior tambm tem uma velocidade maior (HOLLER, 2002). O perodo de tempo de migrao depende do tipo de molcula que esta sendo analisada (FERNANDEZ, 2001). 2. Objetivos Este trabalho tem como objetivo extrair o DNA genmico da bactria E.coli utilizando o reagente DNAzol e analisar o resultado utilizando a tcnica da eletroforese em gel de agarose.

3. Material e mtodos 3.1 Material biolgico 1 tubo de 3mL da bactria E.coli em meio LB, cultivada overnight com agitao 3.2 Reagentes DNAzol, etanol absoluto gelado, soluo tampo TAE ou TBA e TE (TRIS-EDTA) 3.3 Corantes Soluo bluegreen, soluo corante contendo 5% de glicerol, 0,1% de azul de bromofenol e 0,1% de xylene cyanol. 3.4 Extrao do DNA genmico Centrifugamos a cultura de E.coli a 5000rpm durante 3 minutos. Em seguida, descartamos o sebrenadante e adicionamos 250 L de DNAzol. Misturamos a soluo para que ficasse bem homognea. Na sequncia, transferimos para um microtubo para ser incubada a temperatura ambiente por 3 minutos. Ao trmino da incubao, centrifugamos a soluo a 10000 rpm por 5 minutos. Depois retiramos o sobrenadante e transferimos a soluo para um microtubo limpo. Adicionamos 125 L de etanol absoluto gelado ao contedo do microtubo e misturamos por inverso. Em seguida a soluo foi incubada no gelo por 3 minutos e depois centrifugada a 10000rpm. Aps a centrifugao, descartamos o sobrenadante. O DNA extrado da bactria ficou precipitado no fundo do tubo. Ressuspendemos o precipitado em 40 L de tampo TE. Ao trmino do experimento, estocamos a soluo final -20C. 3.5 Preparao do gel Pesamos 0,3 gramas de agarose, adicionamos 30mL de soluo tampo TAE ou TBA e fundimos essa mistura em forno de microondas. Deixamos resfriar at aproximadamente 50C. Colocamos depois o lquido no molde previamente vedado com fita crepe. Posicionamos o pente de acrlico sobre o molde e esperamos gelificar. 3.6 Preparao das amostras

Misturamos em um microtubo 8 L de DNA genmico de E.coli, 1 L de soluo bluegreen e 1 L de soluo corante. 3.7 Aplicao das amostras Transferimos o molde com o gel de agarose para a cuba eletrofortica e, em seguida, retiramos o pente e a fita crepe. Adicionamos soluo tampo TAE ou TBA na cuba, at ultrapassar o gel. Em dois buraquinhos do gel, o primeiro e o ltimo, colocamos a soluo padro (formada pela mistura de 8 L de DNA padro (lambda Hindll), 1 L de soluo corante e 1 L de soluo bluegreen). Nos outros buraquinhos colocamos 10 L de amostra. 3.8 Corrida eletrofortica Para que a corrida eletrofortica acontecesse, ligamos os eletrodos fonte, aplicando uma voltagem inferior a 5V/cm2. As molculas migraram do plo negativo para o positivo 3.9 Visualizao Ao trmino do experimento, desligamos a fonte de eletricidade e retiramos os fios dos eletrodos. Em seguida retiramos a lmina de acrlico com o gel. Ajustamos essa lmina num suporte de papel toalha. Depois colocamos o gel em um transiluminador de luz U.V. 4. Resultados As molculas de DNA genmico da bactria E.coli migraram pouco para o polo positivo do gel de agarose.

Figura 1: Eletroforese em gel de agarose. Colunas amostra padro. Colunas 1, 3 e 5 amostras de DNA genmico. Colunas 2, 4 e 6 amostras de DNA plasmidial.

5. Discusso e concluso O resultado desse experimento foi o esperado, pois o gel de agarose
muito poroso, o que faz com que molculas de grandes dimenses, tais como lipoprotenas e cidos nucleicos, tenham facilidade em fazer a migrao de um lado para o outro. Desse modo, as molculas de DNA genmico ficam aglomeradas

perto da cavidade em que foram colocadas para fazer a corrida eletrofortica. Apesar dos resultados serem os esperad os, o mtodo empregado para
fazer a extrao do DNA, utilizando DNAzol, no foi o mais adequado. Existem tcnicas mais precisas, como o tratamento com formol e clorofrmio, que permite

uma melhor precipitao do DNA. Outros mtodos utilizados so os kits de extrao, como, por exemplo, o Kit Qiagen TM e o Kit Invitrogen easyDNA, que so prprios para que a anlise seja feita por espectrofotometria, eletroforese em gel de agarose ou PCR.

7 H tambm outro fator a ser considerado. As pessoas que realizaram a

extrao do DNA no possuam nenhuma experincia na realizao desse procedimento. Esse fato pode ter acarretado numa m qualidade de visualizao
do resultado.

Foi possvel concluir que a corrida eletrofortica extremamente til na anlise de DNA genmico. Tambm foi possvel perceber que as molculas presentes no material so muito grandes e, por isso, migram uma distncia muito pequena em uma velocidade muito reduzida. 6. Referncias bibliogrficas COMCIENCIA. Projeto genoma: a cincia de ponta no Brasil. 06/07/2000. Disponvel em: <http://www.comciencia.br/reportagens/genoma/genoma10>. Acesso em: 17 mar 2012 Entrevista com Jos Fernando Perez, diretor cientfico da FAPESP FERNANDEZ, C.G., GARCIA, S.M.L. (2001) Captulo 1: Ferramentas metodologicas para o estudo de problemas de biologia do desenvolvimento. In: FERNANDEZ, C.G., GARCIA, S.M.L. Embriologia. 2 Ed, Editora Artmed, Porto Alegre, p.21-32 HOLLER, F.J., NIELMAN, T.A., SKOOG, D.A. (2002) Captulo 30: Eletroforese capilar e eletrocromatografia capilar. In: HOLLER, F.J., NIELMAN, T.A., SKOOG, D.A. Princpios de anlise instrumental. 5 Ed, Editora Bookman, Porto Alegre, p.687-702 JUNQUEIRA, L.C., CARNEIRO, J. (2005) Captulo 14: Clulas Procariontes. In: Biologia celular e molecular. 8 Edio, Editora Guanabara Koogan, So Paulo, p. 267-281 MURRAY, P.R., PFALLER, M.A., ROSENTHAL, K.S. (2010) Captulo 30: Enterobacteriaceae. In: MURRAY, P.R, PFALLER, M.A., ROSENTHAL, K.S. Microbiologia mdica. 6 Ed, Editora Elsevier, So Paulo, p.299-313

POMBEIRO, A.J.L.O. (2003) Captulo 19: Tcnicas eletroforticas. In: POMBEIRO, A.J.L.O., Tcnicas e operaes unitrias em qumica laboratorial. 4 Ed, Editora Fundao Calouste Gulbenkian, Lisboa, p.702-747