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Stratgie dexploration fonctionnelle et de suivi thrapeutique

La cytomtrie en ux applique lexploration des pathologies de la surface oculaire Flow cytometry applied to the exploration of ocular surface pathologies
F. Brignole-Baudouin
Laboratoire de toxicologie, facult des sciences pharmaceutiques et biologiques, universit Ren-Descartes Paris-V, France Reu le 1 juillet 2003 ; accept le 15 septembre 2003

Rsum Les applications de la cytouorimtrie en ux (CMF) ne cessent de crotre, dpassant les domaines de limmunologie et de lhmatologie et connaissant entre autres, un essor important en pharmacotoxicologie. Ltude de lapoptose, de la rsistance la chimiothrapie et du stress oxydant reprsentent quelques-unes des voies danalyse des actions des mdicaments et des phnomnes toxiques. Plus particulirement pour les pathologies de la surface oculaire en ophtalmologie, nous avons dvelopp une mthode non invasive danalyse en CMF des cellules de la conjonctive recueillies sur un papier ltre puis dissocies mcaniquement. Ainsi, dimportantes constatations ont t rapportes dans les domaines des syndromes de Sjgren, des allergies oculaires et des phnomnes iatrognes induits par lutilisation au long cours de mdicaments anti-glaucomateux, comme lexistence au niveau de la muqueuse oculaire dune activation immunologique et dune apoptose pithliale, mme en labsence de tout signe clinique vocateur dinammation. La surveillance de lefcacit des traitements immunosuppresseurs ou uidiants, et des effets nfastes des conservateurs contenus dans les collyres, est dsormais permise par la CMF qui a ainsi dj contribu dimportants dveloppements dans la pharmacologie et la thrapeutique oculaires. Ce procd danalyse biologique peut tre transpos tous types de muqueuses, ouvrant ainsi la voie une approche innovante et non invasive de lexploration physiologique et physiopathologique des muqueuses. 2003 ditions scientiques et mdicales Elsevier SAS. Tous droits rservs. Abstract Flow cytometry (FCM) is now widely used not only in immunology and hematology but also in many other domains and among these, especially pharmacotoxicology. Apoptosis, multi-drug resistance, oxidative stress are some ways for drug effects and toxicity assessment. In ophthalmology, where there was a real need for exploring the ocular surface directly on the patient eye with noninvasive tools, we have developed a new method to analyse conjunctival cells collected by impression cytology on a lter and mechanically dissociated before FCM processing. Important observations have been made concerning Sjgrens syndrome, ocular allergy and antiglaucoma eye drops toxicity like the ndings of cell activation and apoptotic patterns in a large number of patients, even without clinical signs. FCM now allows to monitor immunosuppressant drug efciency or lubricants as well as the toxicity of eye drops containing preservatives. Thus, FCM has already contributed to develop and improve pharmacology and ocular treatments. This new procedure could be applied to any other mucosae offering a noninvasive and original exploration of the mucosae physiopathology. 2003 ditions scientiques et mdicales Elsevier SAS. Tous droits rservs.
Mots cls : Cytouorimtrie en ux ; Empreinte conjonctivale ; Toxicit ; Conservateur ; Syndrome de Sjgren Keywords: Flow cytometry; Impression cytology; Toxicity; Preservative; Sjgrens syndrome

Adresse e-mail : fbaudouin@pharmacie.univ-paris5.fr (F. Brignole-Baudouin). 2003 ditions scientiques et mdicales Elsevier SAS. Tous droits rservs. doi:10.1016/j.immbio.2003.09.007

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1. Introduction Depuis les annes 1970, la cytomtrie en ux, qui a rvolutionn le domaine de la biologie cellulaire ne cesse dtendre ses applications, en dpit de lmergence de nouvelles autres techniques plus sophistiques de biologie cellulaire ou molculaire. Son principe repose sur lillumination individuelle de cellules en suspension dans un milieu liquide par une lumire monochromatique de forte nergie fournie par un rayon laser. Les cellules renvoient alors des signaux lumineux proportionnels leur taille (Forward scatter : FSC) pour ceux diffuss sous un faible angle en avant delles, ou proportionnels leur structure ou leur densit intracellulaire pour ceux diffuss sous un grand angle (Side scatter : SSC). Paralllement, dautres signaux colors peuvent tre mis soit parce que la cellule est spontanment uorescente soit parce que des anticorps conjugus un uorochrome lui auront t coupls. Ces signaux lumineux passent ensuite au travers de ltres dichroques et sont renvoys par des miroirs vers les dtecteurs appropris [22]. Pour les cytouorimtres les plus courants, aux dtecteurs de taille et de structure peuvent ainsi tre associs plus de trois cinq dtecteurs de couleur faisant ainsi jusqu sept paramtres analysables. Si la contrainte de la cytomtrie en ux rside dans lobligation que les cellules soient en suspension, elle prsente lavantage de permettre lanalyse individuelle de chaque cellule passant devant le rayon lumineux et de rvler des htrognits de populations l ou dautres techniques chouent comme la spectrouorimtrie. La cytouorimtrie en ux est loin de tomber en dsutude comme en tmoigne laugmentation du parc des cytouorimtres proposs par les fabricants (Tableau 1). De nouveaux cytouorimtres peuvent tre quips faon de sources lumineuses excitatrices dont les longueurs donde sont adaptes aux applications souhaites. Plus petits, plus performants, certains peuvent tre transportables dans des voitures ou des bateaux, dautres peuvent analyser des cellules contenues dans les puits dune micro-plaque. En outre, la puissance des logiciels assortis et les sensibilits de dtection nettement amliores permettent danalyser des concentrations cellulaires allant jusqu 100 500 cellules par millilitre selon les appareils et de dtecter des intensits de uorescence de plus en plus faibles. Outre la caractrisation des cellules, la cytouorimtrie en ux permet lexploration de leur fonction et de leur physiologie. Elle a dj largement dpass les cadres phares de lhmatologie et de limmunologie pour concerner de nombreux autres domaines comme la microbiologie ou la toxicologie. Au dpart, les cellules devant tre ncessairement en suspension proveTableau 1 Les diffrents fournisseurs de cytouorimtres en ux et les appareils proposs Fournisseurs BD Biosciences Beckman Coulter DakoCytomation Partec Cytouorimtre en ux FacsCalibur, FacsVantage, LSR XL, Elite, Cytomics FC500 CyAn-MLE, LX Cyow, PAS-III

naient de tissus relativement riches, sang, moelle, liquide de ponctions... Puis, des cellules adhrentes extraites de tissus ou cultives en ligne continues ont pu tre analyses et peu peu, cette technique sest tendue aux prlvements pauvres et aux cellules rares, comme les liquides bronchoalvolaires. Ainsi, pour notre part, nous nous intressons ltude de prlvements conjuguant les trois difcults : cellules adhrentes, prlvements pauvres et cellules rares : les prlvements de la muqueuse conjonctivale appels empreintes conjonctivales . La conjonctive est un tissu fondamental de la surface oculaire immunologiquement actif et vascularis, la diffrence de la corne contigu, tissu transparent avasculaire et pauvre en cellules immunitaires, dont lintgrit est essentielle la fonction visuelle. Corne et conjonctive subissent les mmes agressions de la part de lenvironnement et servent dinterface entre le milieu extrieur et les fragiles et prcieuses structures intra-oculaires. la diffrence de la corne, la conjonctive est hautement ractive. Ce tissu peut tre examin partir de biopsies agressives, souvent difciles proposer en clinique, ou surtout par la pratique de lempreinte conjonctivale, procd peu invasif de recueil des cellules les plus supercielles de la conjonctive. La technique de cytouorimtrie en ux applique aux empreintes conjonctivales existe depuis 1997, rclame par des ophtalmologistes soucieux dobtenir un outil dexploration sensible, prcis et able pour explorer, diagnostiquer et suivre les manifestations pathologiques de la surface oculaire de leurs patients [2]. Trois grandes pathologies sont davantage concernes par cette ncessit, lallergie, les syndromes secs et les pathologies iatrognes reprsentant toutes trois un nombre important de patients dont le pronostic visuel peut tre mis en danger lors de la prennisation du processus pathologique. Lallergie reprsente 15 % des consultations dophtalmologie et les syndromes secs concernent plus de 20 % des sujets gs de plus de 65 ans [20] ; quant aux pathologies induites par des collyres administrs pendant des annes, elles intressent au premier chef une population de plus de 700 000 patients glaucomateux pour lesquels une forte tension oculaire menace le nerf optique et chez lesquels des altrations de la surface oculaire peuvent compromettre terme lefcacit dune chirurgie devenue lultime recours. 2. Les techniques classiques dexploration de la surface oculaire : lempreinte conjonctivale Dveloppe la n des annes 1970, la technique de lempreinte conjonctivale constitue un moyen sr, peu agressif, pratiquement indolore, de collecter un tapis de cellules conjonctivales, pour des analyses biologiques, dans le cadre de nombreuses pathologies de la surface oculaire (Fig. 1). Lempreinte conjonctivale collecte la ou les couches les plus supercielles de lpithlium conjonctival, donc des cellules en voie ou en cours de desquamation. Lpithlium conjonctival se renouvelle en effet partir de ses couches basales et les cellules les plus supercielles atteignant un tat de diff-

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Fig. 1. Mode de prlvement de lempreinte conjonctivale laide dun demi ltre de polyther (sulfone) (Supor Gelman Siences).

renciation terminale sont vacues rgulirement dans le ux lacrymal. Cest cette couche de surface, comprenant les cellules ayant atteint leur dernier stade de diffrenciation, que lempreinte conjonctivale peut ainsi permettre danalyser. ce niveau, trois types de populations cellulaires sont prsentes sur les empreintes conjonctivales : les cellules pithliales de recouvrement, cellules considres jusqu prsent comme participant simplement au revtement de la muqueuse conjonctivale mais

en fait directement impliques dans de nombreuses ractions biologiques, souvent inammatoires ; les cellules mucus ou cellules caliciformes ou goblet cells en anglais ; et un contingent de cellules inammatoires. Celles-ci comprennent entre autres des cellules dendritiques, caractristiques par leur forme et leur capacit dimmunocomptence, et composes notamment par les cellules de Langerhans, mais on retrouve galement des populations lymphocytaires intra-pithliales rsidentes ou issues du chorion sous-pithlial sous-jacent. La cytologie classique de lempreinte conjonctivale permet de calculer la densit en cellules mucus, danalyser le degr de mtaplasie squameuse touchant, notamment en cas de syndrome sec, la surface oculaire, la prsence quoique plus difcile analyser de cellules inammatoires, lidentication de cellules pithliales contenant une chromatine en forme de serpent (snake-like chromatin), la prsence dinclusions intra-cellulaires ou de cellules atypiques dans les couches supercielles de la conjonctive comme des mastocytes ou des osinophiles. Lanalyse de toutes ces populations cellulaires, leur forme, leur nombre, leur densit respective, leurs modications pathologiques sont ainsi de prcieux indicateurs de ltat de la surface oculaire. Bien plus faciles obtenir et moins agressives que des prlvements cornens, les empreintes conjonctivales sont galement un reet indirect des pathologies conjonctivocornennes notamment dans le domaine des scheresses oculaires, au cours des inammations chroniques, ou ventuellement de certains phnomnes infectieux.

Fig. 2. Coloration au PAS (A) et immunomarquage de cellules dendritiques avec un anticorps anti-HLA DR (B), de cellules mucus avec un anti-MUC5AC (C) en uorescence contre coloration nuclaire liodure de propidium.

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Fig. 3. Immunomarquage des cellules mucus en microscopie confocale montrant leur rarfaction dans un cas de scheresse oculaire ( droite).

Les techniques classiques de cytologie conjonctivale sont bien rodes mais connaissent des limites importantes dans leur exploitation, ce qui a conduit dvelopper ces dernires annes de nouvelles procdures dimmunomarquage au prix toutefois damnagements techniques parfois complexes. Lapposition sur lame de verre dans un premier temps a permis malgr les risques de perte cellulaires notamment des cellules mucus, de raliser des immunomarquages impossibles sur la membrane de recueil, moins de raliser des techniques complexes en microscopie confocale (Figs. 2 et 3) [3,4,6]. Puis lextraction des cellules dans un milieu liquide tamponn a permis damliorer linterprtation de ceux-ci par la rapidit danalyse, lobjectivit et la puissance statistique quautorise la CMF. 3. La technique de prlvement pour la cytouorimtrie en ux sur empreinte conjonctivale La mthode consiste recueillir gnralement sans anesthsie ou avec une anesthsie locale en gouttes, laide dun ltre de polyther sulfone (Supor, Gelman Science), les cellules les plus supercielles de lpithlium conjonctival, celles ayant atteint un stade terminal de diffrenciation et destines tre limines (Fig. 1). Le prlvement est totalement exsangue, indolore et non invasif linverse dautres systmes plus agressifs comme le brossage ou la biopsie. Ces ltres de 13 mm de diamtre prsentant de pores de 0,20 microns sont habituellement utiliss en biochimie et doivent tre coups en deux. Ils permettent aux cellules conjonctivales en cours de desquamation dadhrer et dtre aisment collectes en formant un tapis cellulaire n et homogne. Dans le cadre dvaluations scientiques ou lorsque les examens seront rpts, lempreinte doit tre prleve toujours au mme endroit car il existe des disparits dans la rpartition des cellules notamment des cellules mucus. Il est prfrable de choisir la conjonctive bulbaire suprieure qui est protge par la paupire et en tout cas de toujours noter soigneusement le lieu de prlvement pour de futures explorations. Une fois les ltres prlevs, ils peuvent tre plongs dans une solution tamponne type PBS ou conservs dans une solution de paraformaldhyde 0,05 %. Achemines au laboratoire, les

cellules sont extraites mcaniquement laide dun cne mont sur une pipette ; le nombre de cellules recueillies varie selon lexprience du prleveur de 2 105 106 par ltre. Un immunomarquage est ensuite ralis suivi de la lecture au cytouorimtre dans un faible volume. 4. Analyse en cytouorimtrie en ux Le protocole danalyse en cytomtrie en ux des cellules conjonctivales comporte classiquement un histogramme biparamtrique reprsentant la taille cellulaire en fonction de la structure en mode linaire (Fig. 4) ou logarithmique. Une fentre dacquisition est trace autour de la population des cellules pithliales en excluant les dbris cellulaires (sur la gure, situs dans langle infrieur gauche) et les ventuels agrgats cellulaires (sur la gure, vers langle suprieur droit). Des histogrammes monoparamtriques conditionns sur cette population cellulaire en rapportent le nombre de cellules analyses en fonction des intensits de uorescence en mode logarithmique comme habituellement en CMF (Fig. 5). Lanalyse dautres populations cellulaires comme les lymphocytes, peut galement tre ralise grce un histogramme biparamtrique de la structure ou de la taille en fonction de lintensit dexpression dun antigne panleucocytaire comme le CD45 (Figs. 4 et 6) ou en fonction de tout autre marqueur dintrt CD4, HLA DR... La dtection des cellules lymphodes, amliore grce lutilisation du CD45 permet de classer par ordre dintensit, les lymphocytes, les monocytes/macrophages, les osinophiles, les basophiles, les polynuclaires. Applique ltude des prlvements conjonctivaux, cette faon de procder permet dvaluer les lymphocytes intra-pithliaux majoritairement CD8 positifs (Fig. 6), les cellules dendritiques, de dtecter des antignes prsents la surface et dans le cytoplasme des cellules. 5. La quantication de la uorescence Classiquement, en CMF, les rsultats sont exprims en pourcentage de cellules positives et en moyennes dintensits de uorescence (MIF). Pour afner les rsultats et les standar-

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Fig. 4. gauche, cytogramme de taille/structure en mode linaire reprsentant la population majoritaire de cellules pithliales et droite, cytogramme CD45/taille permettant de mieux individualiser les cellules non pithliales.

Fig. 5. Histogramme reprsentant lintensit de uorescence exprime par les cellules pithliales de la conjonctive aprs immunomarquage laide dun anticorps anti-HLA DR en fonction de leur nombre, chez un sujet normal gauche et chez un sujet porteur de syndrome de Sjgren droite.

Fig. 6. Phnotypage CD4 et CD8 des lymphocytes prsents la surface de lpithlium conjonctival.

diser dans le temps lors des tudes prospectives, nous avons converti les MIF en units arbitraires grce des billes qui uorescent dans des canaux prcis sur laxe logarithmique de uorescence. En effet, sur un diagramme sont reportes sur laxe y les valeurs fournies par le fabricant et sur laxe des x les MIF obtenues pour chaque type de billes ; ceci permet dtablir une droite de calibration sur laquelle seront reportes les MIF exprimes par les cellules de lchantillon analys. Ce systme permet galement, grce ces valeurs de rfrences, dassurer une standardisation de la uorescence au sein dun mme laboratoire ou entre laboratoires diff-

rents quelque soit le cytouorimtre utilis. Il existe de nombreux types de quantication de billes. Celles renfermant le uorochrome sont les plus stables : Immunobrite (Coulter) ou Dakouorosphres (Dako), Quantum Simply Cellular (Flow Cytometry Standards) [16] ; dautres sont recouvertes de uorochromes ou dautres encore recouvertes danticorps non marqu et devant tre contre-marques comme les cellules de lchantillon. Ainsi sont dnies des MEF (Molecular Equivalent of Fluorochrome), des MESF (Molecular Equivalent of Soluble Fluorochrome) ou des capacits lier lanticorps (ABC : antibody binding capacity, QIFIKIT, Dako).

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6. Applications aux pathologies de la surface oculaire Les altrations cellulaires de la surface oculaire se manifestent soit par une rarfaction des cellules mucus soit par des mtaplasies cellulaires avec exfoliation et desquamation progressives paralllement un accroissement du nombre de cellules inammatoires notamment les cellules dendritiques [3]. La CMF applique aux pathologies de la surface oculaire permet danalyser un grand nombre de cellules dans un faible volume. Ainsi, par membrane complte, peuvent tre analyses au moins mille cellules pithliales par paramtre et jusqu dix paramtres. Les techniques de dtection de lapoptose se prtent bien lexploration des processus toxiques agressant la surface oculaire : la diminution de la taille cellulaire, lexpression de marqueurs comme lannexine-V, lApo2.7, la mesure du pic sub-G1 sont quelques uns des paramtres couramment tudis sur ces cellules. Les phnomnes immuno-inammatoires se manifestent par lexpression de certains marqueurs comme lapparition dantignes de classe II du complexe majeur dhistocompatibilit ou lamplication de molcules tmoignant du degr dactivation cellulaire comme les molcules dadhsion, les molcules de la famille des rcepteurs au TNFa... De tous ces marqueurs, lexpression de HLA DR sest avre la plus intressante grce ses amplitudes importantes de variation (Fig. 5), reprsentant ainsi le meilleur standard dvaluation de linammation [1,2,7,8,9]. 7. Syndromes secs et inammation Le syndrome de Gougerot-Sjgren (SGS) est une maladie auto-immune concernant non seulement la glande lacrymale mais aussi toute la surface oculaire o elle sexprime par une inammation chronique accompagne la fois dinltrats lymphocytaires et dune apoptose des cellules pithliales oculaires. Il existe, paralllement ces syndromes secs autoimmuns, des syndromes secs de diffrentes origines, hormonales, toxiques (pollution, ventilation...), iatrognes qui saccompagnent aussi dune inammation conscutive la scheresse chronique et la dgnrescence des cellules pithliales. Lors dune activation cellulaire et en conditions inammatoires, HLA-DR est exprim par les cellules pithliales de la conjonctive qui ne lexpriment pas ltat normal. Lexpression de ce marqueur est proportionnelle au degr dinammation conjonctivale et est particulirement forte chez les patients porteurs de syndrome sec auto-immun. En effet, nous avons pu suivre lanalyse des empreintes conjonctivales de plus de 240 patients souffrant de scheresses oculaires, maladie de Gougerot-Sjgren ou syndrome sec non auto-immun, au cours dune tude multicentrique europenne portant sur lvaluation de leffet de la ciclosporine en application locale [8,9]. Nous avons pu ainsi observer cette expression de HLA DR, tmoin de linammation locale infra-clinique prsente dans ces cas de scheresses, indpendamment de la prsence de tout signe ophtalmologique inammatoire, avec toutefois une intensit signicative-

Fig. 7. A. Comparaison des expressions quanties en units arbitraires de uorescence des HLA-DR, CD40, Fas, Apo2.7 et CD40L par les cellules pithliales de la conjonctive de sujets normaux et de patients atteints de kratoconjonctivite sche (KCS). B. Comparaison en fonction de lorigine auto-immune (Sjren) ou non, des expressions de HLA DR, CD40 par les cellules pithliales de la conjonctive de patient atteints de KCS [8].

ment plus importante dans le groupe des sujets prsentant une maladie dorigine auto-immune (Fig. 7). Nous avons galement montr que dautres marqueurs dactivation cellulaire comme le CD95 (Apo-1 ou rcepteur Fas), le CD40, le CD40 ligand et le CD54, molcule dadhsion ICAM-1 ainsi que lApo2.7, marqueur dapoptose sont corrls positivement de manire signicative lexpression de HLA-DR. Ceci conrme que lil sec, quelle que soit son origine, est bien une maladie inammatoire, mme si son aspect clinique ne le laisse pas souponner. Paralllement, nous avons observ un effet signicatif de la ciclosporine sur la modulation de lexpression des marqueurs dinammation notamment sur celle de HLA-DR ds le troisime mois de traitement et dans toutes les situations de scheresses oculaires. Lexpression de HLA-DR nest pas une manifestation spcique dauto-immunit, elle est sous la dpendance de cytokines comme lIFNc et le TNFa. LIFNc induit de plus lhyperexpression de CD95-Fas et de CD40 et lapoptose des cellules pithliales de manire dose- et temps-dpendante [6,13]. Les maladies de la surface oculaire sont soumises laction de nombreuses cytokines inammatoires et il est logique de penser que lIFNc y participe [15,29]. Il reste dterminer si ces expressions saccompagnent dune acquisition des capacits de prsentation antignique par ces cellules comme cela a pu tre prouv pour les cellules cornennes et les cellules des acini lacrymaux [18,24]. Cette

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Fig. 8. Dcroissance sous leffet de la ciclosporine en collyre des expressions de HLA DR en units arbitraires des uorescences par les cellules conjonctivales de patients prsentant des syndromes secs oculaires. La ciclosporine a t administre 0,05 ou 0,1 % et lmulsion lipidique servant de vhicule la ciclosporine a servi de contrle [9].

expression des antignes de classe II la surface des cellules pithliales la suite dune stimulation par des cytokines inammatoires pourrait participer aux ractions de cytotoxicit et/ou au recrutement de cellules inammatoires [30]. Quoi quil en soit, la ciclosporine en collyre sest rvle efcace dans toutes les formes de syndromes secs, non seulement les syndromes de Sjgren dorigine auto-immune mais aussi les scheresses dorigines hormonale, iatrogne ou environnementale (Fig. 8) et il est important de signaler quaucun des effets indsirables rapports au cours des traitements immunosuppresseurs base de ciclosporine administre par voie orale na t observ. Elle agirait comme une drogue la fois anti-inammatoire, immunosuppressive et probablement modulatrice de lapoptose [15,29] et reprsente le premier traitement tiologique des syndromes secs.

tels que les lentilles de contact qui peuvent reprsenter des sites non ngligeables de rtention et daccumulation des conservateurs [27]. Les manifestations cliniques de ces effets toxiques sont nombreuses, le plus souvent non spciques et parfois graves : prurit, larmoiement, urticaire, dme des paupires, eczma, dermite, conjonctivite, rosions conjonctivales ou cornennes prdominant dans les zones de stagnation, kratite ponctue, ulcre, kratinisation, et mme atteinte rare mais grave de lendothlium cornen, obstruction lacrymale, brose sous-conjonctivale, novascularisation cornenne, aggravation dun syndrome sec pr-existant ou apparition dun syndrome sec de novo de type vaporatif [23,25]. Ce dernier risque impose par prcaution la rgle de supprimer tout collyre conserv devant des symptmes de scheresse oculaire. En outre, il est dsormais reconnu que le pourcentage de russite de la chirurgie du glaucome diminue avec laugmentation du nombre des collyres et la dure du traitement [10,11,19]. Or, cette chirurgie nest propose que dans les cas rsistant aux traitements mdicaux par collyres, donc, bien souvent aprs des annes de suivi et dessais de contrle mdical de la tension intra-oculaire. Le conservateur le plus frquemment utilis dans les collyres est le chlorure de benzalkonium (BAC) gnralement la concentration de 0,01 %. Nous avons montr que la dgradation de lADN rvle par ltude du pic sub-G1 augmente en fonction des concentrations mises en contact pendant 15 minutes avec des cellules conjonctivales en culture. De la mme manire, lexpression dun marqueur mitochondrial prcoce dapoptose, lApo2.7 samplie sous leffet de doses croissantes de BAC [12,14]. Si lon peut admettre la prsence de produit conservateur pour des collyres lors de traitements courts de lordre de 5 15 jours, il devient en revanche indispensable de savoir valuer les risques de lintroduction de produits toxiques mme faible dose dans une perspective thrapeutique long terme. Depuis quelques annes, les travaux sur la toxi-

8. Effets toxiques des collyres et des lentilles de contact Les collyres peuvent tre toxiques par leurs proprits physico-chimiques propres, de pH ou dosmolarit et entraner par lintermdiaire de chacun de leurs constituants, principe actif ou conservateur, des ractions dirritation, dallergie, ou mme de photosensibilisation. Les consquences de cette toxicit se manifestent rapidement au niveau cellulaire par une mtaplasie avec perte des microvillosits, ncrose, libration denzymes, production de cytokines proinammatoires, de drivs de lacide arachidonique et apparition de cellules inammatoires et de broblastes [17,21,31]. La rapidit de survenue et lintensit de cette raction inammatoire dpendent beaucoup de la dose du produit toxique accumule. Cest pourquoi il est important de diffrencier le principe actif, souvent fragile et labile, imposant des instillations pluri-quotidiennes, des conservateurs dont la rmanence locale est plus longue par incorporation dans les membranes cellulaires et qui prsentent un plus grand risque daccumulation [26]. Il faut tenir compte aussi de lincorporation des conservateurs dans les biomatriaux

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cit des conservateurs auxquels notre quipe a largement particip [12,14,45] ont permis de sensibiliser les industriels des laboratoires pharmaceutiques dvelopper une gamme de collyres sans conservateur, avec des systmes divers de distribution des gouttes (anti-reux, ltres...) pour les trois maladies chroniques de lil : le glaucome, lallergie et lil sec, et dont la gnralisation tend heureusement se rpandre.

10. Conclusion Lutilisation de la cytouorimtrie en ux dans le domaine de lophtalmologie a dj permis de renforcer les preuves concernant la toxicit des conservateurs contenus dans les collyres et a ainsi particip leur suppression progressive au prot de la fabrication de collyres unidose ou au dveloppement de systmes anti-reux ou de ltration liminant le conservateur ou vitant de contaminer le acon. Les prochains enjeux de la cytouorimtrie en ux pourront concerner le diagnostic parfois difcile des allergies grce la mise au point dun test discriminant les diffrentes orientations cytokiniques allergiques de type TH2 ou mdiation cellulaire de type TH1. Cette identication permettrait galement de proposer un traitement mieux adapt anti-inammatoire, immunosuppresseur ou anti-allergique spcique. La cytouorimtrie en ux sur empreintes conjonctivales continuera valuer le statut inammatoire de la surface oculaire lors du diagnostic et/ou au cours du suivi thrapeutique pour les besoins des ophtalmologistes cliniciens ou dans le cadre dessais cliniques. Cette mthode, vritable spcialit transversale, trouve dans son application ce tissu immunologiquement ractif et complexe quest la muqueuse conjonctivale, un encouragement de futurs dveloppements pour lexploration de toutes sortes de prlvements tissulaires ou muqueux. Rfrences
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9. Les autres applications Les autres applications en cours concernent en premier lieu le suivi de patients porteurs de syndromes secs oculaires traits avec de lanti-TNFa par voie gnrale, ou sous FK506 en collyre. Lvaluation toxicologique de traitements de la surface oculaire est galement permise grce ltude des phnomnes dapoptose ou la dtection dinterleukines inammatoires. Le phnotypage des lymphocytes prsents dans cette partie supercielle de la conjonctive et la dtection des systmes TH1/TH2 reprsentent enn deux axes majeurs de la comprhension des mcanismes physiopathologiques impliqus au cours des kratoconjonctivites dont le diagnostic peut parfois errer favorisant le passage un tat chronique. Concernant la balance TH1/TH2, nous avons montr au cours dune tude ralise partir dempreintes conjonctivales de patients prsentant une conjonctivite allergique et de patients sans signe dallergie une relative exclusion entre lexpression de HLA DR, reet du versant TH1, par les cellules conjonctivales et de la prsence dIgE dans les larmes, reet du versant TH2, conrmant lintrt de connatre cet quilibre dans le diagnostic des pathologies de la surface oculaire, notamment les formes compliques ou chroniques [4]. Enn, nous avons galement pu valuer par cytouorimtrie en ux, le stock de deux cytokines inammatoires, IL-6 et IL-8, chez des patients traits pour glaucome (Fig. 9) et, ainsi, mettre en vidence que cette rserve est, dune part, plus importante chez ces patients que chez les sujets normaux [5,28], et dautre part dautant plus leve que le traitement comporte un conservateur.

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[8] Fig. 9. Expressions de HLA-DR et des interleukines IL-6 et IL-8 dans le cytoplasme des cellules pithliales de la conjonctive de patients glaucomateux.

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