Aspectos bioqumicos de la fitohemaglutinina. Aplicaciones en teraputica mdica.

Introduccin. 1. Fitohemaglutinina. Propiedades biolgicas. Caractersticas estructurales. 2. Localizacin y funcin de la fitohemaglutinina en la planta. 3. Gentica y biosntesis de la fitohemaglutinina. 4. Bases estructurales del reconocimiento e interaccin de la fitohemaglutinina con los carbohidratos. 5. Aplicaciones prcticas de la fitohemaglutinina. 6. Potencialidades teraputicas de la fitohemaglutinina. 7. Efecto inmunomodulador de la fitohemaglutinina. 8. Posibles beneficios del uso de la fitohemaglutinina en algunas afecciones especficas. 9. Conclusiones 10. Referencias bibliogrficas INTRODUCCIN. Desde hace algn tiempo existe la certeza, al menos terica, de que algunos mitgenos derivados de plantas podran actuar sobre el sistema inmunolgico modulando su respuesta (Wimer, 1996, 1998). Estos mitgenos pertenecen a las lectinas, una clase de protenas bastante heterogneas en cuanto estructura cuaternaria, que poseen como rasgos comunes la capacidad para unirse especfica y reversiblemente a determinados carbohidratos y la posibilidad de aglutinar clulas. Algunas pueden ser agrupadas en familias sobre la base de determinadas caractersticas. As aparecen, por ejemplo, las lectinas de las legumbres o los cereales, estructuralmente bastante parecidas a las lectinas tipo C (Ca2+ dependientes) de los animales y que contienen dominios homlogos de reconocimiento a carbohidratos (Sharon, 1993). Dentro de las fitolectinas o lectinas de las legumbres o los cereales, que como familia muchas de ellas comparten tambin la propiedad de inducir mitosis en algunos tipos de clulas; se encuentra la lectina de la semilla del guisante, la lectina de la lenteja, la aglutinina del frijol de soya, la aglutinina del germen del trigo, el mitgeno de la hierba carmn, la aglutinina del man, la concanavalina A y la fitohemaglutinina (PHA, siglas en ingls), entre otras (Sharon, Lis & Lotan, 1974). De todas ellas una de las ms estudiadas y una de las que mayor inters despierta en investigaciones es la fitohemaglutinina por la amplia gama de aplicaciones que se le atribuyen. FITOHEMAGLUTININA. PROPIEDADES BIOLGICAS. CARACTERSTICAS ESTRUCTURALES. La PHA integra la fraccin proteica de las semillas del frijol colorado comn Phaseolus vulgaris, aglutina tanto hemates como leucocitos, se une a determinados oligosacridos y estimula la mitosis en diferentes estirpes celulares, dentro de ellas los linfocitos (Hamelryck et al, 1996). Es la lectina ms abundante en estas semillas, donde alcanza entre el 5 y el 10% del contenido proteico total (Staswick & Chrispeels, 1984) y comprende cinco glicoprotenas tetramricas (isolectinas) (PM=1150004130 D, por ultracentrifugacin), muy estables sobre todo en medio cido (Biswas & Kayastha, 2004) y formadas por dos polipptidos (L=leucocito y E=hemate) (Leavitt, Felsted & Bachur, 1977) en las combinaciones (L4, L3E1, L2E2, L1E3, E4) (Hamelryck et al, 1996). Las subunidades E (PM=31700600 D) son responsables de la eritroaglutinacin, pero muestran poca o ninguna actividad mitognica, mientras que las subunidades L (PM=29900200 D) confieren propiedades leucoaglutinantes a la protena nativa y tienen la mxima actividad estimulante de la mitosis (Felsted, Leavitt, Chen & Bachur, 1981; Monsigny, Jeune-Chung & Perrodon, 1978). Las dos subunidades difieren en la secuencia de aminocidos desde el residuo 1 al 7, pero son idnticas en las posiciones 8 a la 24. Los residuos 12 y 60 de cada subunidad son una asparagina

glicosilada con igual composicin en. Los ltimos tres residuos de las subunidades son tambin semejantes (Millar, Hsu, Heinrikson & Yachnin, 1975). Las isolectinas tienen una composicin aminoacdica muy semejante; slo difieren en los aminocidos treonina, lisina y arginina y carecen de aminocidos azufrados (Leavitt et al, 1977). Los oligosacridos presentes en la protena tienen un alto contenido de manosa (4 %) y N-acetil-Dglucosamina (2,2 %) (digestin con -manosidasa y endo--N-acetilglucosaminidasa H). Aparecen tambin otros carbohidratos como fucosa y xilosa (Staswick & Chrispeels, 1984; Vitale, Ceriotti, Bollini & Chrispeels, 1984). En todas las lectinas derivadas de plantas existen dos iones metlicos por monmero (un in Ca2+ y un in de un metal de transicin, fundamentalmente Mn2+) situados en la vecindad del sitio de unin a los carbohidratos. La PHA posee estos mismos iones y su presencia es esencial tanto para la unin a los carbohidratos como para la mitogenicidad de la protena. Los dos iones metlicos estn ligados por cuatro molculas de agua y seis residuos de aminocidos (una histidina, un glutmico, una asparagina, dos asprtico y un residuo hidrofbico) (Hamelryck et al, 1996). Adems del sitio de unin a los carbohidratos, un grupo de lectinas, dentro de ellas tambin la PHA, poseen sitios hidrofbicos de unin, que pueden ser divididos en tres grupos. El primero est adyacente al sitio de unin a los carbohidratos y es el responsable de la afinidad 10 veces mayor de estas lectinas por los monosacridos que contienen sustituyentes hidrofbicos, que por aquellos que no los poseen. El segundo, situado a una distancia aproximada de 30 del sitio de unin a los azcares, tiene una baja afinidad por los ligandos hidrofbicos. Y el tercero es un sitio de alta afinidad por la adenina y sus derivados N-6 (incluidas un nmero de hormonas derivadas de adenina, presentes en las plantas) (Hamelryck et al, 1996). LOCALIZACIN Y FUNCIN DE LA FITOHEMAGLUTININA EN LA PLANTA. La PHA se acumula, sobre todo, en las vacuolas de almacenamiento del parnquima de los cotiledones de las semillas, pero tambin se concentra en las races de la planta, especficamente en las vacuolas de los meristemas de las races primarias y en las paredes celulares de las races elongadas. Mediante PCR reversotranscriptasa se ha demostrado la existencia casi exclusiva de ARNm de la isoforma PHA-E en estos ltimos sitios (Chrispeels, 1995). Se presume que la PHA junto con la arcelina y el inhibidor de la amilasa participa en mecanismos de defensa en la planta. Estas ltimas dos protenas son consideradas formas truncadas de la PHA en las cuales se han perdido, una y dos de las vueltas o lazos necesarios para unirse a carbohidratos, respectivamente, aboliendo de ellas esta propiedad (Hamelryck et al, 1996; Mirkov et al, 1994). La PHA acta protegiendo las semillas contra virus, bacterias, hongos y herbvoros invertebrados, papel determinado en gran medida, por la capacidad de reconocer y unirse a glicanos extraos a la planta (Peumans & Damme, 1995; Rudiger, 1998). GENTICA Y BIOSNTESIS DE LA FITOHEMAGLUTININA. Las subunidades E y L son miembros de una familia de cuatro polipptidos codificados por igual nmero de genes estrechamente relacionados y a los que se hace referencia como familia de la PHA del frijol. Esta familia, adems de la PHA-E y la PHA-L, tambin contiene a la arcelina y al inhibidor de la amilasa (Hamelryck et al, 1996). Durante el desarrollo de las semillas, no todas las variedades de Phaseolus vulgaris, sintetizan PHA en la misma proporcin. Se han encontrado reducidos niveles de ARNm para PHA en aquellas plantas que producen la protena en menor medida (Staswick & Chrispeels, 1984). Se responsabiliza de este hecho a la presencia de codones de terminacin prematuros que desestabilizan el ARNm. Estos ARNms desestabilizados son reconocidos y rpidamente degradados como mecanismo que le evita a la planta la produccin de molculas de protena truncadas, hipo o afuncionales. La desestabilizacin es dependiente de la posicin de los codones sin sentido. Hay indicios de que los transcriptos con codones sin sentido situados en aproximadamente el 20, el 40 el 60 % de la secuencia a lo largo de la regin codificante normal, producen ARNms altamente inestables, mientras que un transcripto con un codn sin sentido al 80 % es tan estable como el tipo salvaje (van Hoof & Green, 1996).

En la biosntesis los glicopptidos sufren modificaciones tanto cotraduccionales como postraduccionales. Los polipptidos se sintetizan mediante polisomas unidos al retculo endoplsmico. La glicosilacin va sucediendo al mismo tiempo de la traduccin y en este proceso cada cadena polipeptdica adquiere las dos cadenas laterales de oligosacridos. La de la posicin asparagina 12 tiene un alto contenido de manosa, mientras que la de la asparagina 60 contiene mucho menos manosa pero adicionalmente posee fucosa y xilosa (Faye, Sturm, Bollini, Vitale & Chrispeels, 1986). El transporte de la protena hacia las vacuolas de almacenamiento es mediado por el aparato de Golgi, donde al menos una porcin de las cadenas de oligosacridos sufre modificaciones. Estas modificaciones producen un gradual acortamiento de las cadenas de carbohidratos hasta alcanzar el pequeo tamao que tienen cuando ya las glicoprotenas estn en las vacuolas (Vitale et al, 1984). Se ha llegado a la conclusin de que las dos cadenas de carbohidratos adicionadas a los residuos 12 y 60 tienen un alto contenido de manosa cuando son recin sintetizadas; pero la unida a la posicin 60 es la que sufre fundamentalmente las transformaciones, lo cual puede deberse a que las enzimas responsables de este proceso tienen un mayor acceso a esta cadena que a la de la posicin 12 (Faye et al, 1986). La importancia biolgica de este procesamiento no est muy clara, aunque s se conoce que no est relacionado con las seales que marcan a la molcula como una protena vacuolar, sino que tal informacin est contenida en el dominio polipeptdico de la protena (Voelker, Herman & Chrispeels, 1989), entre los residuos 14 y 23 de la PHA madura, ms especficamente cerca de la posicin 19. No se descarta la posibilidad de un segundo dominio que puede funcionar conjuntamente con el primero para un correcto marcaje de la protena (Tague, Dickinson & Chrispeels, 1990). BASES ESTRUCTURALES DEL RECONOCIMIENTO E INTERACCIN DE LA FITOHEMAGLUTININA CON LOS CARBOHIDRATOS. La gran mayora de las propiedades biolgicas de las lectinas estudiadas hasta el momento se basan en la capacidad para reconocer e interactuar con diferentes carbohidratos (Sharma & Surolia, 1997). La especificidad para estas molculas vara ampliamente entre las diferentes lectinas (Sharma & Surolia), condicionado por la variabilidad estructural de los sitios de unin (Sharon, 1993), donde las interacciones hidrofbicas, las modificaciones postraduccionales y la oligomerizacin juegan un papel esencial (Vijayan & Chandra, 1999). Los anlisis extensivos de las secuencias y estructuras de varias lectinas muestran que a pesar de la hipervariabilidad de sus regiones de combinacin ellas exhiben un significativo patrn de uniformidad (Sharma & Surolia) y la especificidad por los diferentes monosacridos parece depender de un ncleo conservado de residuos que forma puentes de hidrgeno con el azcar y una vuelta o lazo variable que determina la forma exacta del sitio de unin. La alta afinidad por oligosacridos y monosacridos particulares que contienen sustituyentes hidrofbicos resulta fundamentalmente de la existencia de distintos subsitios prximos al sitio de unin a los carbohidratos; subsitios que tienen un pequeo nmero de residuos y se encuentran tanto en sitios especficos para manosa como para galactosa (Loris, Hamelryck, Bouckert & Wyns, 1998). Especficamente para la PHA-L, el cambio de la asparagina de la posicin 128 por cido asprtico, elimina completamente la capacidad de unin a los carbohidratos y con ello las actividades leucoaglutinantes y mitognicas caractersticas. Esta mutacin, sin embargo, no impide que los polipptidos formen los tetrmeros normales y sean transportados hacia las vacuolas de almacenamiento de la clula (Mirkov & Chrispeels, 1993). El determinante estructural mnimo, altamente afn para la PHA-L es el pentasacrido Gal 14 GlcNAc 12 [Gal 14 GlcNAc 16] Man (Hamelryck et al, 1996). APLICACIONES PRCTICAS DE LA FITOHEMAGLUTININA. Dadas las propiedades de aglutinar clulas sanguneas, la PHA se utiliz inicialmente como medio para separarlas de la sangre total (Li & Osgood, 1949). Al demostrarse posteriormente el efecto mitognico, el espectro de aplicaciones se increment y actualmente se usa como factor estimulante de la proliferacin en cultivos de diferentes estirpes celulares, incluidos los linfocitos (Buhring et al, 1999; Fukao et al, 1999; Kenan et al, 1992); en los que tambin acta sobre los procesos

bioqumicos relacionados con la respuesta inmune (Kawashima, Kawasaki, Kitamura Tnojima & Morimoto, 1998; Kunikata et al, 1998; Ohbo et al, 1995; Ryan, Vadas & Shannon, 1994). Otras aplicaciones incluyen el estudio in vitro de los mecanismos bioqumicos de la apoptosis (Posmantur, Wang & Gilbertsen, 1998; Wakamatsu, Makino, Tei & Baba, 1999) y de la proliferacin celular en linfocitos (Emamghoreishi et al, 1997; Forcic & Mazuran, 1999; Jensen, Odum, Jorgensen, Christophersen & Olesen, 1999), su empleo como marcador histoqumico en estudios de neurofisiologa, neuroanatoma y en el proceso de envejecimiento del SNC (Lanciego, Mengual, Erro & Gimenez-Amaya, 1999; Wouterlood & Groenewegen, 1991), como marcador farmacolgico para el seguimiento de la respuesta al tratamiento y toxicidad de medicamentos (Stein Murray & Word, 1999) y en la produccin y mejora de medios diagnsticos y mtodos analticos (Delves, 2001; Hampel, Kottgen, Dudenhausen & Kottgen, 1999; Ijima, Kimura & Shiba, 1999). Todas estas aplicaciones se basan esencialmente en la propiedad de combinarse especficamente con determinados sacridos. POTENCIALIDADES TERAPUTICAS DE LA FITOHEMAGLUTININA. Los resultados in vitro avalan el posible uso teraputico de la PHA, sobre todo de la isoforma mitognica L4. Se reconoce en esta protena a un ideal modificador de la respuestas biolgicas a causa de su extensivo estudio, su disponibilidad en forma pura y estable, convenientemente administrable por mltiples vas, aparentemente no sensibilizante, poco txica, con mxima efectividad a dosis relativamente bajas, no inductora de estrs, no oncognica, no infecciosa, compatible con otras modalidades teraputicas, probablemente compatible con el embarazo y con una adecuada relacin costo-efectividad (Wimer, 1990). La inmunoterapia sera uno de los campos ms beneficiados con su uso debido a la capacidad de interaccin rpida e irreversible con los linfocitos, uno de los principales efectores de la respuesta inmune (Wimer, 1990). Su potencial teraputico tambin podra incluir reas como la oncologa, las infecciones crticas, los transplantes, las quemaduras extensivas, las aplasias medulares e incluso, ser utilizada como agente adyuvante en la produccin de vacunas, pues ha resultado ms efectiva de esta manera que como agente de induccin (Wimer, 1990, 2002). EFECTO INMUNOMODULADOR DE LA FITOHEMAGLUTININA. La evaluacin de las posibilidades de la PHA como modulador del sistema inmune ha estado comprometida debido al empleo de excesivas dosis de PHA eritroaglutinante, nocivas para el sistema circulatorio de los pequeos animales de laboratorio; mientras que en humanos el factor limitante ha sido la restringida disponibilidad del mitgeno en forma no aglutinante. Como consecuencia, la subestimacin de su eficacia ha conspirado contra la produccin industrial de las cantidades adecuadas para ensayos clnicos. No obstante, se han empleado los datos experimentales que existen para pronosticar a priori los efectos de la modulacin mitognica in vivo (Wimer, 1996). La transformacin linfoctica (blastognesis) fue descrita por vez primera por Nowell en 1960. Usando PHA para separar las fracciones sanguneas por aglutinacin de glbulos rojos y blancos, este autor observ que la PHA tambin estimulaba los linfocitos a una transformacin tipo blastocito y divisin celular. Esta observacin se aplic rpidamente al estudio de los cromosomas humanos y se us para medir el potencial de proliferacin de los linfocitos, propiedad esencial para la inmunidad mediada por clulas. Se considera que la estimulacin no especfica y no inmunolgica por la PHA, hace que del 65 al 90 % de los linfocitos presentes en el cultivo experimenten blastognesis y divisin celular despus de 2-3 das en cultivo (Cohen, 1983). La mayora de las observaciones apoyan la tesis de que la estimulacin ocurre fundamentalmente sobre los linfocitos T (Bohnlein et al, 1989; Cohen, Ichikawa, Lavastida, Gonzalez & Daniela, 1983; Hernandez & Leavitt, 1984; Wimer, 1997), otros plantean que las poblaciones de linfocitos B tambin son estimuladas a proliferar y diferenciarse, aunque en menor proporcin (Shankey, Daniele & Novell, 1981). Utsinger et al. (1977) encontraron incrementos en el contenido de ADN entre aproximadamente el 4 y el 8 % de las clulas B altamente purificadas, mientras que Knuutila y Kovanen (1987), hallaron una frecuencia de mitosis entre el 6 y el 20 % en estas clulas. No obstante, se considera que la proliferacin y diferenciacin de los linfocitos B necesita, en ltima

instancia, de la presencia de subpoblaciones de linfocitos T auxiliadores que seran inducidos por la PHA (Clement, Dagg, Lehmeyer & Kiyotaki, 1983). Otro aspecto relacionado con la accin inmunomoduladora de la PHA y que tendra un fuerte impacto en teraputica es la tambin sealada posibilidad de suprimir la capacidad de respuesta del sistema inmune. Aunque no est muy claro an el mecanismo por el cual se produce la inmunosupresin, ya desde los aos 70s se plantea como posibilidad el hecho de que la PHA fuese capaz de activar clulas supresoras que secundariamente podran inhibir la proliferacin linfocitaria (Kurnick, Bell & Grey, 1976). Tambin se seala como probable el hecho de que los linfocitos estimulados podran liberar productos solubles capaces de activar las clulas supresoras y de esta manera inducir la inmunosupresin (Larsson & Blomgren, 1978;Mawas, Charmot, Comoy & Sasportes, 1977). Sobre este tpico Wimer (1998) seala que adems del efecto supresor inherente, esta sustancia tambin potencia la supresin generada por los agentes convencionales, tanto a nivel de la respuesta inmune celular como de la humoral. Borrebaeck y Schon (1987) en su estudio con diferentes lneas de clulas T de leucemia linfoctica humana, encontraron inhibicin de la proliferacin y la sntesis de ADN. Estos autores emplearon PHA-L y PHA-E y observaron que el grado de inhibicin era dependiente de la dosis de la isolectina y que se necesitaban concentraciones considerablemente mayores (hasta 10 veces ms) de la isolectina E que la necesaria para inducir la misma respuesta con la PHA-L. POSIBLES BENEFICIOS DEL USO DE LA FITOHEMAGLUTININA EN ALGUNAS AFECCIONES ESPECFICAS. Wimer es uno de los autores que ms ha especulado sobre el posible uso de la PHA en teraputica, tomando como base, principalmente, los hallazgos experimentales de otros investigadores. Segn su parecer hay tres enfermedades que pueden recibir los supuestos beneficios de la PHA directamente: la anemia aplstica, el cncer y la infeccin por VIH (Wimer, 1990, 1997, 1998, 2000, 2002). En la anemia aplstica el mitgeno podra ser utilizado en tres formas diferentes: (1) En los tipos de anemias por citotoxicidad directa ms benignos, se podra aplicar un rgimen estimulante para incrementar la produccin de factores de crecimiento y de esta manera acelerar la recuperacin de la aplasia, (2) Donde es necesario un aloinjerto de clulas madres hematopoyticas para reemplazar la mdula sea severamente daada, se podra incluir el mitgeno en el rgimen preparatorio, (3) En las anemias aplsticas de causa inmunolgica en las que es necesario instaurar un protocolo de supresin, la PHA adicionada a un rgimen de drogas como la ciclosporina y la globulina antilinfocito, podra, no slo incrementar la supresin, sino tambin prevenir la reemergencia tarda del desorden clonal (Wimer, 1998). En el tratamiento del cncer, la PHA podra ser efectiva por la posibilidad de ayudar a la induccin de la remisin en ciertos tumores, por tener un efecto citotxico antitumoral directo, por mejorar el efecto antineoplsico de las radiaciones y la quimioterapia, por disminuir el riesgo de transformacin maligna, por promover la diferenciacin y restaurar la respuesta de crecimiento normal en las clulas malignas, por manifestar un riesgo mnimo de suprimir la actividad citotxica antitumoral, as como por amplificar la inmunogenicidad de las clulas tumorales (Wimer, 1990). En la infeccin por VIH, administrada sistemticamente, la PHA podra interferir con la invasin del virus a las clulas CD4+ al bloquear las molculas de la glicoprotena 120 en la cubierta viral necesarias para este proceso; al mismo tiempo que activara los linfocitos T como consecuencia de su unin a las protenas CD2 y al receptor de los linfocitos T para antgenos. La naturaleza no especfica de las clulas efectoras antivirales generadas por esta activacin, impedira las mutaciones a la vez que se recuperaran las clulas T depletadas, se estimulara la mielopoyesis y se reforzara la resistencia a las malignizaciones y las infecciones prevalentes en el estado de inmunodeficiencia. Estos efectos adecuadamente coordinados con una apropiada combinacin de inhibidores de la proteasa y la reversotranscriptasa, podran tericamente, acelerar la completa eliminacin del VIH, acortando as la duracin del tratamiento requerido y eliminando los perjudiciales efectos de las mutaciones del virus en estos pacientes (Wimer, 1998, 2000, 2002). CONCLUSIONES

Son evidentes las potencialidades de la PHA y su aplicacin en teraputica mdica, avaladas por sus bien documentadas propiedades biolgicas y una vasta utilizacin en estudios in vitro. Esto, unido a la posibilidad de su empleo en el tratamiento de enfermedades, hasta el momento incurables, como el SIDA y el cncer, justificara cualquier esfuerzo de la ciencia en investigaciones in vivo en este campo. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS 1. Biswas, S. & Kayastha, A. M. (2004). Spectroscopic characterization of Phaseolus vulgaris leucoagglutinin. Protein Pept Lett. Feb, 11, 1-7. 2. Bohnlein, E., Ballard, D. W., Bogerd, H., Peffer, N. J., Lowenthal, J.W. & Greene, W. C. (1989). Induction of interleukin-2 receptor-alpha gene expression is regulated by post-traslational activation of kappa B specific DNA binding proteins. J Biol Chem, 264, 8475-8. 3. Borrebaeck, C. A. & Schon, A. (1987). Antiproliferative response of human leukemic cells: lectin induced inhibition of DNA synthesis and cellular metabolism. Cancer Res, 47, 4345-50. 4. Buhring, H. J., Simons, P. J., Pudney, M., Muller, R., Jarrossay, D. & van Agthoven, A. (1999) The monoclonal antibody 97 A6 defines a novel surface antigen expressed on human basophils and their multipotent and unipotent progenitors. Blood, 94, 2343-56. 5. Chrispeels, M. J. (1995). Targeting and release of phytohemagglutinin from the roots of bean seedlings. Plant Physiol, 109, 603-10. 6. Clement, L. T., Dagg, M. K., Lehmeyer, J. E. & Kiyotaki, M. (1983). Two phenotypically distinct suppressor T cell subpopulations inhibit the induction of B cell differentiation by phytohemagglutinin. J Immunol, 131, 1214-7. 7. Cohen, F. (1983). Respuestas inmunolgicas mediadas por clulas. En: Sonnenwirth AC, Jarett L. Gradwohl. Mtodos y Diagnsticos del Laboratorio Clnico. (pp. 1136-47) Ciudad de La Habana:Cientfico-Tcnica. 8. Delves, P.J. (2001). New insights in glycoimmunology. Biotech News International, 2, 8-10. 9. Emamghoreishi, M., Schlichter, L., Li, P. P., Parikh, S., Sen, J. & Kamble, A. (1997). High intracellular calcium concentration in transformed lymphoblasts from subjects with bipolar I disorder. Am J Psychiatry, 154, 976-82. 10. Faye, L., Sturm, A., Bollini, R., Vitale, A. & Chrispeels, M. J. (1986). The position of the oligosaccharide side-chains of phytohemagglutinin and their accessibility subsequent processing in the Golgi. Eur J Biochem, 158, 655-61. 11. Felsted, R. L., Leavitt, R. D., Chen C., Bachur, N. R. & Dale, R. M. (1981). Phytohemagglutinin isolectin subunit composition. Biochem Biophys Acta, 668, 132-40. 12. Forcic, D. & Mazuran, R. (1999). Modulation of [Ca+2]i in freshly isolated mouse lymphocytes with in vivo priming. Immunol Lett, 67, 23-30. 13. Fukao, T., Kaneko, H., Berrell, G., Gatei, M., Tashita, H. & Yoshida, T. (1999). ATM is upregulated during the mitogenic response in peripheral blood mononuclear cells. Blood, 94, 1998-2006. 14. Hamelryck, T. W., Dao-Thi, M.H., Poormans, F., Chrispeels, M. J., Wyns, L. & Loris R. (1996). The crystallographic structure of phytohemagglutinin-L. J Biol Chem, 271, 20479-85. 15. Hampel, D. J., Kottgen, B., Dudenhausen, J. W. & Kottgen E. (1999). Fetal fibronectin as o marker for an imminent (preterm) delivery. A new technique using the glycoprotein lectin immunosorbent assay. J Immunol Methods, 224, 31-42. 16. Hernandez, D. E. & Leavitt, R. D. (1984). Mitogenic and mitogenically defective phytohemagglutinin isolectins stimulate T-cell growth factor (interleukin 2) production and response in fresh and cultured human T lymphocytes. Cell Immunol, 86, 101-8. 17. Ichikawa, Y., Lavastida, M. T., Gonzalez, E.B. & Daniels JC. (1983). Further characterization of mitogen-induced autorosette-forming cell: correlation with T-cell subsets and with lymphocyte proliferative responses to mitogens. Cell Immunol, 76, 351-60.

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