Utilizao do MS Excel para calcular

KM e Vmax a partir do grfico de

Lineweaver-Burke











Rodrigo Csar dos Santos Vida
2008


NDICE


1 INTRODUO..................................................................................................... 3

2 TPICOS EM CINTICA ENZIMTICA.............................................................. 4
2.1 SOBRE AS ENZIMAS........................................................................................... 4
2.2 A CONSTANTE DE MICHAELIS-MENTEN E VELOCIDADE MXIMA.............................. 5

3. FUNES LINEARES........................................................................................ 7
3.1 TERMOS DE UMA FUNO LINEAR....................................................................... 7
3.2 REPRESENTAO GRFICA DE UMA FUNO....................................................... 8
3.3 REGRESSO LINEAR ....................................................................................... 10

4 USANDO O MS EXCEL..................................................................................... 14
4.1 FRMULAS E CLCULOS.................................................................................. 15
4.1.1 Digitando uma frmula .......................................................................... 15
4.1.2 Utilizando o assistente de frmulas....................................................... 16
4.2 CALCULANDO Y EM FUNO DE X.................................................................... 18
4.3 CALCULANDO OS COEFICIENTES A E B DE UMA FUNO LINEAR ..................... 19
4.3.1 Calculando o coeficiente A.................................................................. 19
4.3.2 Calculando o coeficiente B.................................................................. 19
4.3.3 Calculando o coeficiente de correlao................................................. 19
4.4 CRIANDO GRFICOS DE REGRESSO LINEAR COM O MS EXCEL ........................ 20

5 ANALISANDO KM E VMAX.............................................................................. 22
5.1 O GRFICO DE LINEWEAVER-BURKE................................................................. 23

6. REFERNCIAS................................................................................................. 28
3
1 INTRODUO

O estudo da cintica enzimtica um importante tpico dentro do
contedo programtico da disciplina de bioqumica ou enzimologia. A regresso
linear um assunto importante e til em diversas reas de conhecimentos. Com
base nela podemos montar uma curva de calibrao e analisar se os dados so
ou no confiveis.
Para compreender as regresses lineares deve-se primeiro
compreender as funes lineares, suas caractersticas e suas resolues.
O Microsoft Excel (MS Excel) uma ferramenta simples que pode
ser facilmente operada para a resoluo de todos esses clculos e de uma
infinidade de outros. Dentre eles, a determinao da constante de Michaelis-
Menten e da velocidade mxima observadas em uma reao, uma alternativa
resoluo em papel milimetrado, mais confivel e rpida de fazer.
Esse trabalho tem por objetivo introduzir ao leitor as facilidades de se
utilizar o MS Excel para determinao dessas constantes. Inclui rpidas
explicaes sobre cintica enzimtica, explicaes sobre funes lineares e os
mtodos de resoluo de uma regresso linear manualmente e pelo MS Excel,
bem como os passos para se criar um grfico e, finalmente, como calcular as
constantes de Michaelis-Menten e velocidade mxima.
4
2 TPICOS EM CINTICA ENZIMTICA

A cintica enzimtica, por definio, estuda os processos catalisados
por enzimas, especialmente a velocidade da reao. As enzimas so
macromolculas proticas com capacidade cataltica capazes de catalisar (ou
seja, acelerar) reaes qumicas sobre outras molculas, denominadas substrato.
As enzimas possuem stio de ligao com o qual se ligam ao
substrato e catalisam a reao, convertendo o substrato (S) ao produto da catlise
(P). A enzima no sofre reao durante o processo, de modo que ao fim da reao
permanece inalterada.

E + S ES EP E + P


2.1 Sobre as enzimas

As enzimas possuem stios de ligao (centros catalticos) para com
o substrato, muitas delas mais de um. Dessa forma, podemos concluir que ao
aumentarmos a concentrao do substrato, aumenta-se tambm a velocidade da
reao. Isso verdadeiro at uma determinada concentrao do substrato,
quando apesar de aumentarmos a concentrao do substrato (mantendo a
concentrao da enzima), a velocidade da reao no se modifica. Chamamos
esse ponto de velocidade mxima (Vmax).
Os stios catalticos so extremamente sensveis ao substrato com o
qual so colocados. Assim h uma especificidade por parte das enzimas para com
determinados substratos. De fato, para certos substratos h apenas uma enzima
especfica capaz de catalisar uma reao com eficincia.
Algumas enzimas podem ser influenciadas por outros elementos
presentes no meio. Algumas enzimas possuem um stio de ligao especial onde
elementos moduladores podem se ligar influenciando na reao: moduladores
negativos diminuem a velocidade da enzima, enquanto os positivos aumentam-na.
As enzimas com tal propriedade so denominadas enzimas alostricas.
5
2.2 A constante de Michaelis-Menten e velocidade mxima

Como j vimos as enzimas so saturveis. Isso implica que um
grfico de velocidade enzimtica no ser linear, mas a partir de determinada
concentrao de substrato descrever uma curva.



A concentrao do substrato , portanto, fator determinante para
atingir a velocidade mxima, como mostrado no grfico acima. A constante de
Michaelis-Menten (KM) fornece a quantidade de substrato necessria para se
atingir a metade da velocidade mxima. A medida da velocidade mxima a
medida da quantidade de substrato convertida em produto em dado perodo de
tempo, e pode ter como unidade M.min
-1
. A unidade de KM a mesma para a
medida do substrato (mM, M...).
Um erro bastante comum acreditar que KM ser numericamente
igual a metade de Vmax. Observe que KM diz respeito a uma medida de
concentrao de substrato, enquanto Vmax a medida da velocidade de
transformao do substrato em produto. Podemos concluir que o quociente de KM
por Vmax no necessariamente ser igual a 2.
Conhecer as concentraes de KM e Vmax so importantes pois
garantem o uso racional das enzimas. Muitos catalisadores enzimticos so
sintetizados em pouca quantidade ou so comercialmente caros e, portanto,
6
devem ser usados com sapincia. Para calcular esses valores h diferentes
metodologias. Existem disponveis no mercado programas baseados em
regresso no linear, capazes de fornecer respostas precisas a partir do grfico da
curva da cintica enzimtica. No entanto, nem sempre temos acesso fcil a tais
programas sofisticados.
Outra forma de calcular KM e Vmax utilizando a plotagem dos
dados em papel milimetrado, onde a curva linearizada e as informaes so
obtidas atravs da regresso linear dos coeficientes da equao. Esse mtodo
pode ainda ser utilizado no programa MS Excel, mais simples e fcil de ser
encontrado em computadores domsticos, e que fornece dados bastaste precisos
e confiveis.
7
3. FUNES LINEARES

3.1 Termos de uma funo linear

Uma funo uma equao matemtica com pelo menos uma
incgnita, onde para cada valor atribudo haver valores referentes, ou em funo
deste. Trata-se de relaes matemticas especiais entre dois objetos.
No caso das equaes lineares (de primeiro grau) as funes
apresentam a seguinte formulao bsica:

( ) a bx x f + =


Onde X so os valores conhecidos (atribudos) e Y so os valores
determinados em funo da X segundo a equao. Matematicamente falando, X
corresponde ao conjunto domnio e Y, ao conjunto imagem da equao. Os
termos b e a so coeficientes da equao, onde b chamado de inclinao
da reta e a o termo independente.
Em uma funo linear, para cada valor X atribudo, possvel
calcular o valor de um e apenas um Y correspondente. Os valores atribudos
para X podem ser feitos de maneira aleatria. Observe a funo abaixo:

( ) 4 2 + = x x f


Para calcular esses valores correspondentes de Y, basta substituir os
valores atribudos para X na equao.

X Y f(x) = 2x + 4 y = 2x + 4
-3 -2 y = 2 * (-3) + 4 = -2
-2 0 y = 2 * (-2) + 4 = 0
-1 2 y = 2 * (-1) + 4 = 2
0 4 y = 2 * 0 + 4 = 4
1 6 y = 2 * 1 + 4 = 6
2 8 y = 2 * 2 + 4 = 8
3 10 y = 2 * 3 + 4 = 10
8

3.2 Representao grfica de uma funo

As funes possuem uma representao grfica baseada em
coordenadas (X,Y) em um plano cartesiano. A coordenada abcissa (horizontal)
corresponde aos valores definidos para X, e a coordenada ordenada (vertical)
corresponde aos valores encontrados para Y.
No caso do exemplo anterior, quando colocados no plano cartesiano,
os valores descrevero o seguinte grfico:

-4
-2
0
2
4
6
8
10
12
-4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4


Podemos observar que as funes do primeiro grau so ditas
lineares, pois sua representao grfica sempre tende linearizao. Um grfico
a representao visual de uma funo, e a partir dele podemos tirar importantes
concluses:

O ponto em que o grfico toca o eixo X (ou seja, onde Y = 0) corresponde
raiz da equao. A raiz de uma equao fornecida quando igualamos a
funo zero. Nas funes lineares, h apenas uma raiz, e ela sempre est
presente.
9
O termo independente A a coordenada onde o grfico toca o eixo Y (pois
ento X = 0) quando ambos os eixos possuem a mesma origem.

A inclinao da reta B define o ngulo de inclinao do grfico. Se o valor de
B positivo, diz-se ter um grfico crescente. Quando o valor de B
negativo, um grfico decrescente.

No caso de uma equao quadrtica (de segundo grau, onde h uma
incgnita X elevada ao quadrado). O grfico definido como uma parbola que
corta o eixo X em dois pontos, evidenciando duas razes distintas (o X e X da
frmula de Bhskara), apenas em um ponto, no caso de razes coincidentes
(quando A = 0) ou no tocar em ponto algum, no caso de no houver razes
(quando A < 0). No caso de uma equao do primeiro grau, todas as funes
possuem razes, mesmo que no estejam demonstradas no grfico.
10
3.3 Regresso linear

Nos modelos clssicos estudados temos a equao (funo) linear e
utilizamos valores de X para determinar Y, seguido da representao grfica. Mas
no caso de termos o grfico, ou os valores de X e Y, precisamos determinar a
equao que originou esses valores. Para isso utilizamos a regresso linear,
tambm chamada tcnica dos quadrados mltiplos.
Deve-se observar que a regresso caracterstica da funo
utilizada, sendo assim temos regresses logartmicas, potenciais, de mdia mvel
e polinomiais, onde a ordem define o expoente maior (quadrticas, de terceiro
grau, etc). Quando nos referimos a uma regresso de ordem um, ou seja, uma
funo de primeiro grau, estamos tratando de uma regresso linear.
Os termos de uma funo linear podem ser calculados atravs das
seguintes frmulas:

N
x
x
N
y x
xy
B
2
2
) (E
E
E E
E
=

x de mdia B y de mdia A =


Note a necessidade de primeiro se determinar o valor de B para
depois determinar o termo independente A.

N Nmero de termos da determinao, ou de pontos na reta.
Ex Somatria dos valores de X.
Ey Somatria dos valores de Y.
Exy Somatria dos produtos entre X e Y.
Ex Somatria dos valores dos quadrados de X.
(Ex) Somatria de X elevada ao quadrado.

As mdias de X e Y (Mx e My) so obtidas pela soma de X dividido
pelo nmero de termos (N), ou seja, a mdia aritmtica simples dos valores.

11
UM EXEMPLO...
O quadro abaixo demonstra os valores sugeridos para X e Y:

X Y
-3 -8
-2 -5
-1 -2
0 1

Pede-se a funo geratriz desses valores.

Para facilitar os clculos e evitar erros, sugerimos a utilizao de
uma tabela de resolues como a que exibimos a seguir. fortemente sugerido
sempre realizar todos os clculos antes de inseri-los na frmula.

x y xy x
-3 -8 24 9
-2 -5 10 4
-1 -2 2 1
0 1 0 0
Ex -6 Ey -14 Exy 36 Ex 14
(Ex) 36 My -3,5
Mx -1,5

Substituindo na frmula da regresso linear, obtemos:

3
4
36
14
4
14 6
36
=

= B

1 ) 5 , 1 3 ( ) 5 , 3 ( = = A


Assim podemos concluir que a equao linear de onde derivam os
resultados apresentados no incio do exemplo 3x+1, o que demonstra ser
verdadeiro, pois quando substitumos na expresso obtida os valores de X
sugeridos obtemos exatamente os resultados de Y sugeridos (a prova real).
12
Em alguns casos, quando realizamos a prova real, observamos que
mesmo colocando os resultados para X sugeridos no incio do exerccio os
resultados de Y so levemente diferentes daqueles sugeridos. Esse fenmeno
acontece principalmente quando os valores para A e B obtidos no so valores
inteiros. Isso se deve porque nem sempre os valores de X para a varivel Y
respondem perfeitamente a uma funo, como demonstrado no exemplo anterior.
Muitas experincias prticas que utilizam valores conhecidos para se
determinar outros (X determinando Y) so influenciados por diferentes variveis e
limitaes do prprio experimento. A regresso linear fornece os resultados mais
provveis dentro de um horizonte de eventos. possvel, no entanto, mensurar
essa confiabilidade atravs do clculo do coeficiente R, tambm chamado
coeficiente de Pearson ou coeficiente de correlao. R est compreendido entre 0
e 1, que respectivamente representam totalmente incorreto e totalmente confivel
(0% de acerto e 100% de acerto, ou accuracy). Dessa forma podemos condicionar
os resultados a nveis confiveis e, se necessrio, excluir os resultados que
sofreram muita variao por fatores alheios ao experimento, como problemas com
diluio ou tempo de leitura incompatvel com a tcnica.
R pode ser calculado com base na seguinte expresso:

| | | | ) ( ) (
) (
y y N x x N
y x xy N
R
E E E E
E E E
=


N Nmero de termos da determinao, ou de pontos na reta.
Ex Somatria dos valores de X.
Ey Somatria dos valores de Y.
Exy Somatria dos produtos entre X e Y.
Ex Somatria dos valores dos quadrados de X.
Ey Somatria dos valores dos quadrados de Y.
(Ex) Somatria de X elevado ao quadrado.
(Ey) Somatria de Y elevado ao quadrado.

Observe a necessidade de se elevar ao quadrado o resultado obtido
para R (apenas R corresponde ao coeficiente de correlao).
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No exemplo anterior, obteremos para R o seguinte clculo:

x y xy x Y
-3 -8 24 9 64
-2 -5 10 4 25
-1 -2 2 1 4
0 1 0 0 1
Ex -6 Ey -14 Exy 36 Ex 14 Ey 94
(Ex) 36 (Ey) 196

| | | |
1
196 94 4 36 14 4
) 14 6 ( 36 4
=


= R


O quadrado de 1 1, e portanto a confiabilidade na regresso obtida
de 100%. Prova disso que os valores sugeridos para X geram por essa
expresso, os valores sugeridos para Y sem a menor diferena.
Agora, observe os seguintes valores:

X Y
15 31
30 61
45 92,6
60 122,9
75 151,5
90 180
105 210

A expresso obtida atravs de regresso linear Y = 1,98X + 2,15.
Esses valores foram aproximados. R obteve 0,9997, o que significa que os
valores de X, quando substitudos nessa expresso, vo gerar valores de Y
diferentes. Essa diferena notoriamente pequena, mas mesmo pequenas
diferenas podem arruinar pesquisas ou denotar falhas nos procedimentos.
14
4 USANDO O MS EXCEL

O MS Excel, programa distribudo pela Microsoft Corporation, um
editor de planilhas matemticas carregado com funes que permitem clculos
simples e avanados. Baseado em suas funes, podemos calcular os valores de
Y em funo de X, bem como os coeficientes de uma equao, ou seja, regredir
funo geratriz a partir dos resultados obtidos, por exemplo, numa curva de
calibrao.
Esse captulo tem por objetivo explicar os conceitos mais simples de
utilizao de frmulas e grficos para que o leitor seja capaz de analisar um
grfico de cintica enzimtica e calcular os valores de KM e Vmax sem
complicaes. Mais informaes sobre as funes do MS Excel podem ser obtidas
gratuitamente em sites especializados (vide captulo 6 deste trabalho).
Esse pequeno tutorial foi feito baseando-se na verso 2003 do MS
Excel, mas por se tratar da base de insero de dados, como criao de tabelas e
digitao de frmulas, perfeitamente funcional em verses anteriores e
posteriores. A posio dos botes e cores exibidas pode variar conforme a verso,
mas no sua utilidade e funcionalidade.
15
4.1 Frmulas e clculos

4.1.1 Digitando uma frmula

O MS Excel baseia-se no uso de frmulas matemticas e na relao
entre as clulas que compe a planilha. Sempre que um dado digitado ele passa
a fazer parte de uma clula, e assim passa a ter uma coordenada de localizao.
As funes mais complexas possuem um ttulo, que deve ser
digitado entre o sinal de igual e antes dos parnteses. O sinal de igual (=) inicia
toda e qualquer frmula, e entre os parnteses devem ser colocados os nmeros
ou as coordenadas para que a frmula tenha o que calcular.
Os dados a serem calculados podem estar na forma de nmeros ou
na forma das coordenadas das clulas. Tecle Enter para exibir a resposta.
Observe abaixo:

=RAIZ(9) : calcula a raiz de 9.
=SOMA(C1;C3) : soma os valores contidos nas clulas C1 e C3.
=CONTAR.VAZIO(A1:A11) : conta o nmero de clulas vazias no intervalo.





Para mais informaes sobre como usar as funes avanadas (que
possuem um nome), consulte o assistente de frmulas. Uma breve descrio
desse assistente dada no captulo 4.3.1 desse trabalho.
As funes matemticas bsicas (adio, subtrao, multiplicao e
diviso) podem ser feitas a partir de smbolos simples e diretos (+, -, *, /
respectivamente). Esse mtodo poupa tempo, pois ao invs de digitarmos o nome
da funo, podemos digitar os dados diretamente. Alm disso, podemos mesclar
nmeros digitados diretamente na frmula e nmeros digitados em outras clulas,
atravs de suas coordenadas (C1, D2, H13...). Dessa forma podemos escrever:
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=(2+2) : soma 2 com 2.
=(5*3+1) : multiplica 5 e 3 e soma 1.
=((2/5)*(7/8)) : divide 2 por 5 e multiplica pelo resultado de 7 dividido por 8.
=(C1+C5) : soma os valores contidos nas clulas C1 e C5.
=(D1*5-3) : Multiplica D1 por 5 e subtrai 3 do resultado.





Observe que os parnteses so utilizados para se organizar as
aes. Assim =(2+4/2) igual a 4, enquanto =((2+4)/2) igual a 3. Os parnteses
so resolvidos primeiro, mas na ausncia deles empregada a regra de primeiro
efetuar as operaes de diviso e multiplicao e depois somar ou subtrair.


4.1.2 Utilizando o assistente de frmulas

Certifique-se de que todos os dados necessrios de X e Y j esto
digitados e que a clula onde o cursor se encontra a clula onde voc deseja
que a resposta seja inserida. Para abrir o assistente de frmulas, clique sobre a
pequena seta direita do boto de auto-soma, ento clique em Mais funes....
Voc pode optar por selecionar os dados antes ou depois de iniciar o assistente.


17
Na janela que abrir, digite um nome relativo frmula que deseja ser
efetuada, ou digite diretamente o nome dela, e tecle enter para procurar entre as
frmulas listadas. Selecionada a frmula requerida, tecle OK para selecionar os
argumentos da funo (os dados necessrios sua execuo):



Clique sobre o boto com uma seta vermelha localizado na extremidade
direita de cada caixa de texto para minimizar a janela.



Use o mouse para selecionar a clula ou o intervalo de dados com as
informaes necessrias execuo da frmula (uma pequena descrio do
tipo de informao necessria ao funcionamento correto da frmula
fornecida na parte de baixo da janela dos parmetros).

Clique novamente no boto vermelho para retornar janela dos argumentos.
Se houver outros argumentos, execute o item anterior at fornecer
informaes suficientes para a concluso da tarefa. Clique OK para finalizar.
18
4.2 Calculando Y em funo de X

Para calcular qualquer funo no MS Excel podemos usar as
frmulas descritas acima. Como as funes do primeiro grau so, na realidade,
multiplicaes de coeficientes com incgnitas somados ou subtrados por outro
coeficiente, podemos usar o mtodo rpido de insero de frmulas: usando os
sinais algbricos /, *, -, e +.
A funo a ser estudada f(x)=2x+1.
Primeiro digitamos os valores de X, que so definidos por ns
mesmos. Usaremos nesse exemplo o seguinte conjunto: {-2, -1, 0, 1, 2}. Esses
valores devero ser escritos na forma de coluna (fig.1).
Em seguida, selecione a clula imediatamente ao lado do primeiro
valor de X. Digite a frmula para a expresso que queremos utilizar. Para a
expresso 2x+1 a funo a ser digitada dever ser =(2*clula+1). No lugar de
clula deve ser inserida a coordenada do primeiro valor de X. No exemplo
mostrado na figura 2, o primeiro valor de X encontra-se na coordenada A3, ento
a frmula =(2*A3+1). (fig.2).
Posicione o cursor sobre a clula que contm o primeiro valor de Y.
Note que h um pequeno quadrado no canto inferior direito das clulas
selecionadas. Esse o comando autopreenchimento. Posicione o mouse sobre
esse pequeno quadrado ele tomar a forma de uma cruz , clique e arraste
expandindo o contedo para baixo at atingir a ltima clula que seja adjacente a
um valor de X (fig.3). Solte o mouse. A frmula =(2*clula+1) foi copiada e
aplicada s clulas abaixo automaticamente. Os valores de Y foram calculados.

FIG 1 FIG 2 FIG 3

19
4.3 Calculando os coeficientes A e B de uma funo linear

Para calcular os coeficientes da regresso linear, podemos digitar as
frmulas diretamente na clula de resposta, ou usar o assistente de frmulas para
obter os resultados, pesquisando pelos nomes das frmulas.
Quando digitamos uma frmula que trabalha com seqncia de
dados, temos que informar o intervalo de clulas. Esse intervalo informado com
o uso de dois pontos (:). Assim, digitar B1:B4 significa o intervalo B1, B2, B3 e B4.


4.3.1 Calculando o coeficiente A

Para obter o termo independente de uma funo linear, digite a
frmula =INTERCEPO(valores_de_Y;valores_de_X) na clula de resposta. Nos
campos de valores de Y e X devem ser informados os intervalos de clulas que
contm os dados para Y e X, respectivamente. Observe atentamente que se deve
primeiro informar o intervalo Y e depois o intervalo X.


4.3.2 Calculando o coeficiente B

Digite a frmula =INCLINAO(valores_de_y;valores_de_x) para
executar a frmula do termo de inclinao da reta.


4.3.3 Calculando o coeficiente de correlao

Digite a frmula =RQUAD(valores_de_y;valores_de_x) para obter o
resultado para o coeficiente de correlao R direto. Existe uma alternativa a essa
frmula: =PEARSON(matriz1;matriz2), que fornece como resultado apenas R,
sendo necessrio eleva-lo ao quadrado em seguida.
20
4.4 Criando grficos de regresso linear com o MS EXCEL

Antes de criar seu grfico, certifique-se de que os dados necessrios
de X e Y esto digitados na planilha.

- Selecione o intervalo de dados necessrios regresso linear (coluna com
os valores de X e coluna com os valores de Y).
- Clique sobre o boto assistente de grfico.
- Na janela que abrir, como tipo do grfico, selecione disperso(XY), e
como subtipo o modelo que apresenta pontos no conectados por linhas.
Clique em avanar.
- Passe a etapa dois clicando em avanar.
- Na etapa trs, digite o nome do grfico e dos eixos (opcional). Clique em
avanar.
- Na etapa quatro, selecione o local do grfico (se flutuando na planilha ou
como nova planilha). Clique em concluir.

O resultado obtido semelhante ao mostrado abaixo:



21
A regresso linear representada graficamente como uma linha
(uma funo do primeiro grau) que passa tocando ou mais proximamente
maioria dos pontos descritos originalmente pelos dados. No MS Excel, essa linha
denominada linha de tendncia.

- Clique sobre o grfico.
- Na barra de menus, clique em grfico e depois em adicionar linha de
tendncia.
- Selecione a opo linear, e depois clique na aba opes.
- Marque as caixas exibir equao no grfico e exibir valor de R-quadrado
no grfico.
- Clique em OK.

O resultado obtido dever ser similar a este mostrado abaixo:



Observe que atravs da opo grfico possvel obter a equao da
regresso linear e o R diretamente.
22
5 ANALISANDO KM E VMAX

Nos estudos envolvendo enzimas, de importante relevncia as
informaes conhecidas como Constante de Michaelis-Menten (KM) e Velocidade
Mxima (Vmax). A velocidade mxima a concentrao de substrato em que a
enzima apresenta sua velocidade mxima, e KM representa a concentrao de
substrato em que a enzima apresenta metade da velocidade mxima.
Por exemplo, na reao envolvendo glioxalato obtiveram-se os
seguintes resultados:

Glioxalato
(mM)
Velocidade de transformao
(M.min
-1
)
1,00 2,5
0,75 2,44
0,60 2,08
0,50 1,89
0,40 1,67
0,33 1,39
0,25 1,02

Nota-se pelo grfico que h pouca variao da velocidade mxima
acima de certa concentrao de substrato (a velocidade mxima):
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
SUBSTRATO
V
E
L
O
C
I
D
A
D
E


23
A partir do grfico mostrado anteriormente no possvel calcular
KM e Vmax sem o uso de programas baseados em regresso no-linear. No
entanto, linearizando a curva e obtendo os coeficientes da regresso, possvel
que analisemos essas constantes. O grfico linearizado conhecido como grfi
ode Lineweaver-Burke, ou grfico do duplo recproco.


5.1 O grfico de Lineweaver-Burke

Nesse modelo grfico, o ponto em que a reta intercepta os eixos X e
Y correspondem respectivamente ao inverso de KM e inverso da velocidade
mxima, conforme o modelo abaixo:

Para se obter esse grfico, primeiro, necessrio inverter todos os
valores da velocidade e da concentrao do substrato. Isso feito dividindo-se 1
pelo valor. No MS Excel efetue =(1/clula).

Glioxalato
(mM)
Velocidade de transformao
(M.min
-1
)
1 0,4
1,333333 0,409836
1,666667 0,480769
2 0,529101
2,5 0,598802
3,030303 0,719424
4 0,980392
24

O resultado disso um grfico que tende linearizao, como
exibido abaixo:

0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5
1/SUBSTRATO
1
/
V
E
L
O
C
I
D
A
D
E


O grfico de Lineweaver-Burke deve passar mais proximamente aos
pontos e portanto equivalem regresso linear, ou linha de tendncia:
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5
1/SUBSTRATO
1
/
V
E
L
O
C
I
D
A
D
E

Observe que a partir dos dados fornecidos o grfico de Lineweaver-
Burke no toca os eixos. Isso porque na prtica no existem concentraes
negativas para serem utilizadas. necessrio ento projetar a linha do grfico
25
sua esquerda, de forma a faz-lo tocar os eixos X e Y. importante manter o
ngulo de inclinao constante, no alterando assim os coeficientes da regresso.
Plotando os dados em papel milimetrado, os pontos sero contados
manualmente, e nesse caso uma diferena de fraes de milmetros poder
alterar substancialmente o clculo final. O seguinte mtodo de determinao dos
pontos mais exato, e sendo efetuado pelo MS Excel, poder ter dezenas de
casas decimais de preciso.
A partir dos dados fornecidos para a criao do grfico de
Lineweaver-Burke (1/X e 1/Y), devem-se obter os coeficientes da regresso linear.


158 , 0 194 , 0 ) ( + = x x f

97 , 0 = R


Com base nos dados obtidos da regresso, podemos considerar o
seguinte:

- O coeficiente A o ponto onde o grfico toca o eixo Y (onde X = 0).
- O ponto em que o grfico toca o eixo X a raiz da equao (onde a
equao est igualada a zero).

Sendo assim, podemos concluir que as coordenadas (X;0) e (0;Y)
sero (-0,814;0) e (0;0,158). Com esses dados podemos projetar o grfico sua
esquerda, fazendo com que toque os eixos nas coordenadas descritas:

26
-0,2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
-2 -1 0 1 2 3 4 5
1/SUBSTRATO
1
/
V
E
L
O
C
I
D
A
D
E

Agora podemos calcular a velocidade mxima e o KM usando as
coordenadas encontradas.

329 , 6
158 , 0
1 1
= = =
Y
VMAX

228 , 1
814 , 0
1 1
=

= =
X
KM


O quociente entre KM e Vmax equivale ao termo B da regresso:

194 , 0
329 , 6
228 , 1
= = =
VMAX
KM
B


Atravs da relao acima podemos definir o valor de KM sem a
necessidade de definir o ponto que intercepta o eixo X apenas tendo calculado
os termos da regresso e Vmax:

228 , 1 329 , 6 194 , 0
329 , 6
194 , 0 = = = KM
KM


Assim, podemos concluir que a velocidade mxima da reao
6,329 M.min
-1
e KM igual a 1,228 mM.

27
6. MAIS INFORMAES

- Mais informaes sobre a cintica enzimtica e bioqumica podem ser acessadas
nos seguintes endereos:
PT.WIKIPEDIA.ORG
EN.WIKIPEDIA.ORG
HTTP://XYZT.ATOMIC-HOSTING.COM/VI/ENZIMAS.HTM
HTTP://WWW.BIOQ.UNB.BR/INDEX_BR.PHP


- Mais informaes sobre o MS Excel podem ser obtidas nos seguintes endereos:
HTTP://WWW.USD.EDU/TRIO/TUT/EXCEL/
HTTP://WWW.BAYCONGROUP.COM/EL0.HTM
HTTP://WWW.APOSTILANDO.COM/DOWNLOAD.PHP?COD=165&CATEGORIA=OFFICE


- Departamento de Bioqumica da Universidade Estadual de Londrina (UEL)
HTTP://WWW2.UEL.BR/CCE/BIOQUIMICA/


- Contato com o autor
rodrigo84vida@hotmail.com
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7. REFERNCIAS

MURRAY, R. K.; GRANNER, D. K. et al. Harper: bioqumica. 6. Edio. Atheneu
Editora So Paulo. So Paulo. 1990.

LOROWITZ, W. Using Microsoft Excel to Plot and Analyze Kinetic Data.
Weber State University. <faculty.weber.edu/wlorowitz/3053/kineticsexcel.pdf> em
09/03/2008.





- As imagens dos grficos nas pginas 5 e 23 desse trabalho foram retiradas da
pgina de cintica enzimtica da Wikipdia brasileira, disponvel no endereo
http://pt.wikipedia.org/wiki/Cin%C3%A9tica_enzim%C3%A1tica, em 21/10/2008.

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Corpotration. Todos os direitos reservados Microsoft Corporation.