Curso de Atualizao - Micoses

Captulo 1 - Diagnstico laboratorial das micoses pulmonares*

Chapter 1 - Laboratory diagnosis of pulmonary mycoses

Melissa Orzechowski Xavier, Flvio de Mattos Oliveira, Luiz Carlos Severo

Resumo
Nesta era de imunossupresso e transplantes, imperativa a comunicao entre mdicos e laboratoristas devido ao fato de que o diagnstico de doenas fngicas, para esses pacientes, deve ser rpido, o que complicado e requer a cooperao e colaborao de vrios profissionais com distintas especializaes. Este artigo revisa as tcnicas laboratoriais utilizadas para o diagnstico de infeces fngicas pulmonares. Os tpicos abordados incluem: fatores relacionados ao hospedeiro, como resposta imunolgica e predisposies anatmicas; colheita, armazenamento, remessa e transporte das amostras; processamento laboratorial; exame microscpico direto; tcnicas de colorao, cultivo e identificao fngica; biossegurana em laboratrios; tropismo e reao teciduais; soromicologia; e deteco de antgenos. Descritores: Micologia; Laboratrios hospitalares; Tcnicas de diagnstico e procedimentos; Pneumopatias fngicas.

Abstract
In this era of immunosuppression and transplantation, it is imperative that laboratory scientists remain in close communication with physicians. In patients receiving immunosuppressive therapy, the diagnosis of mycoses must be rapid, which is complicated, requiring the cooperation and collaboration of a number of professionals from various fields of expertise. In this paper, the laboratory diagnosis of pulmonary fungal infection is reviewed. The following topics are included: host factors such as immunological response and predisposing anatomical features; collection, transport and storage of specimens; laboratory processing of samples; direct microscopy; staining techniques, culture and identification of fungi; laboratory biosafety; tissue tropism and reactions; serology; and antigen detection. Keywords: Mycology; Laboratories, hospital; Diagnostic techniques and procedures; Lung diseases, fungal.

Introduo
Nas ltimas dcadas, houve um importante aumento na incidncia das infeces fngicas em decorrncia de quatro fatores: uma medicina agressiva (drogas imunossupressoras e transplantes, assim como o uso e abuso de antibiticos); incidncia de leucemia, linfoma e AIDS; maior conhecimento da micologia clnica; e maior acurcia das tcnicas diagnsticas.(1-3) As micoses pulmonares podem ser causadas por fungos leveduriformes (Cryptococcus sp.), fungos dimrficos (Histoplasma sp.) ou fungos filamentosos (Aspergillus sp.) e podem ser divididas conforme o fator de risco que os pacientes

Blastomyces, Coccidioides, Cryptococcus, Histoplasma e Pneumocystis) ou neutropenia (gneros Aspergillus, Fusarium, Scedosporium, Trichosporon e zigomicetos). A histria clinicoepidemiolgica e exames de imagem levam a um diagnstico presuntivo que orienta o mdico para a colheita do espcime clnico. Esses dados indicam o processamento mais adequado para o esclarecimento etiolgico, incluindo a escolha da tcnica para o exame microscpico (visualizao do fungo em sua morfologia parasitria) e a escolha do meio de cultivo a ser utilizado,

apresentam: alterao de linfcitos T (gneros

* Trabalho realizado no Departamento de Medicina Interna da Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Rio Grande do Sul UFRGS e no Laboratrio de Micologia, Hospital Santa Rita, Santa Casa - Complexo Hospitalar, Porto Alegre, RS, Brasil. Endereo para correspondncia: L.C. Severo. Laboratrio de Micologia/Hospital Santa Rita, Santa Casa - Complexo Hospitalar, Rua Prof. Annes Dias, 285, CEP 90020-090, Porto Alegre, RS, Brasil. Tel 55 51 3214-8409. Fax 55 51 3214-8435. E-mail: severo@santacasa.tche.br; severo@pesquisador.cnpq.br Apoio financeiro: L.C. Severo pesquisador 1B do Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq; Processo 301624/79-8).

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assim como a temperatura e o tempo de incubao (isolamento do fungo para posterior identificao). Todos esses fatores encontram-se interligados, e a sua ausncia ou a escolha do procedimento incorreto em qualquer uma dessas etapas pode prejudicar a interpretao do resultado final. Assim, de extrema importncia que exista uma estreita cooperao entre clnicos e laboratoristas para assegurar que todas as etapas sejam corretamente realizadas, tornando o diagnstico mais acurado para o tratamento adequado. Mas, infelizmente, frequente que o clnico, o patologista e o microbiologista ainda trabalhem de forma independente no sentido de diagnosticar uma doena infecciosa. Essa falha na comunicao culmina com dados clnicos incompletos acompanhando o material submetido ao laboratrio, bem como com o retardo ou a no obteno do diagnstico, o que, consequentemente, prolonga a doena no paciente. O diagnstico laboratorial definitivo pode ser realizado de forma direta, atravs da pesquisa do microrganismo, ou indireta, atravs da busca de resposta especfica do hospedeiro ao fungo (Tabela 1). No entanto, cabe ressaltar que a interpretao dos achados laboratoriais deve ser feita luz da histria clnico-epidemiolgica. A triagem soromicolgica, a histopatologia (reao tecidual e documentao dos elementos fngicos nos tecidos) e o resultado do exame microscpico direto orientaro a correta interpretao dos achados laboratoriais e a deciso teraputica inicial. Os resultados dos cultivos corroboraro ou modificaro essa deciso.(4) Cabe ao microbiologista alertar o mdico se o resultado do teste suficiente ou no para embasar a ao teraputica. A combinao ideal para o diagnstico de uma infeco fngica pulmonar inclui: 1) evidncia clnica (febre, estertores, roncos e alterao radiolgica) 2) isolamento e identificao fngica compatvel 3) demonstrao de elementos fngicos invadindo o tecido 4) semelhana micromorfolgica do fungo isolado s caractersticas observadas no histopatolgico ou no exame direto 5) resposta imunolgica ao fungo identificado Sero abordadas todas as etapas do diagnstico laboratorial das micoses pulmonares, incluindo a fase inicial, referentes s amostras,
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e os mtodos laboratoriais, como os principais testes diagnsticos realizados rotineiramente nos laboratrios de micologia, e ainda alguns testes novos que tm demonstrado resultados promissores no diagnstico precoce de algumas dessas doenas.

Espcime clnico
Existem trs etapas de fundamental importncia para um diagnstico final definitivo. So elas: colheita, armazenamento e transporte.

Colheita
Deve ser realizada da forma mais assptica possvel, evitando contaminaes. Todas as amostras devem ser colhidas em frascos estreis devidamente identificados, cuja vedao seja suficiente para impedir vazamentos. As principais amostras para o diagnstico de micoses pulmonares so secrees e/ou fragmentos teciduais do trato respiratrio inferior, assim como amostras de locais de disseminao, sangue e outros fludos corpreos.(4)

Tabela 1 - Testes utilizados para o diagnstico direto e indireto de micoses pulmonares. Diagnstico direto pesquisa do agente Exame micolgico Exame direto Cultivo Deteco de antgenos Prova do ltex ELISA sanduche GM-D glucana Deteco de DNA fngico Reao em cadeia da polimerase Exame histopatolgico Grocott, Mucicarmin de Mayer, FontanaMasson Diagnstico indireto pesquisa da resposta do hospedeiro Exames de imagem Raio-X Tomografia computadorizada Pesquisa de anticorpos Testes intradrmicos* Imunodifuso ELISA Exame histopatolgcio H&E
*No tem valor diagnstico.

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Secrees respiratrias
O escarro de grande utilidade para o diagnstico das micoses sistmicas, especialmente paracoccidioidomicose. O material deve ser colhido pela manh, antes da primeira alimentao e aps higiene oral com gua, atravs de respirao profunda e tosse. Facilitam a expectorao a farta hidratao prvia, a nebulizao com soro hipertnico morno e a drenagem postural com punho-percusso. O lavado brnquico e/ou o lavado broncoalveolar (LBA) til no diagnstico de uma ampla gama de infeces pulmonares, especialmente no caso de infeces oportunsticas nos pacientes imunodeprimidos (pneumocistose).

Fragmento de tecido
A associao de exames micolgicos e histopatolgicos de grande vantagem, pois esses exames so complementares. Depois de colhido, o fragmento deve ser separado em alquotas no bloco cirrgico. Uma dessas alquotas deve ser acondicionada em frasco com soluo salina ou gua destilada estreis para o exame micolgico; outra, em frasco com formol para a histopatologia.

evitar a proliferao de outros microrganismos que podem vir a interferir no isolamento fngico, dificultando ou impedindo o desenvolvimento/reconhecimento do real agente de uma infeco pulmonar. Na impossibilidade do envio imediato, as amostras devem ser mantidas sob refrigerao a 4C. Amostras de lquor devem ser mantidas em temperatura ambiente, visto que sua refrigerao retarda o crescimento de Cryptococcus sp. Materiais que tiveram contato com mucosas so potencialmente contaminados com a microbiota local, como o caso do escarro, que deve ser processado em at 2 h. Caso no seja possvel, esse deve ser mantido sob refrigerao por um perodo mximo de 24 h, com a ressalva de que esse fato retarda o crescimento fngico.

Transporte
O material dever ter algumas informaes bsicas: nome do paciente, naturalidade, local onde reside/residiu, viagens realizadas (para incluir as micoses de importao no diagnstico), histria ocupacional/lazer [como criao de animais, como por exemplo, galinhas (histoplasmose) e pombos (criptococose)], tipo de material, data da colheita, hiptese diagnstica, condies predisponentes/associadas, histria teraputica, testes laboratoriais requeridos, mdico responsvel, servio de onde provm o material, telefone e/ou e-mail.(4) A amostra clnica deve ser devidamente acondicionada, conforme o meio de transporte, a natureza da amostra clnica e o material dos frascos, que devem estar devidamente fechados.
a b c

Bipsia aspirativa por agulha fina

O aspirado de linfonodo, de pulmo e de outros rgos permite o estudo da celularidade, o diagnstico microscpico e o cultivo. O material colhido, quando escasso, deve ser imediatamente disposto sobre uma lmina de microscopia e fixado para posterior colorao. Caso seja possvel a colheita de uma alquota maior ou de fragmentos tissulares, coloque-os em frascos estreis com soluo salina ou gua destilada para evitar a desidratao ou mantenha-os na prpria seringa.

Sangue
destinado para hemocultivo ou exames sorolgicos. Deve ser colhido assepticamente, atravs de puno venosa perifrica, em tubos de hemocultura ou em tubos sem EDTA (sistema vacutainer) para a separao do soro.

Armazenamento
Todos os espcimes clnicos devem ser enviados imediatamente ao laboratrio, para

Figura 1 - a) colorao de branco de calcoflor demonstrando elementos leveduriformes grandes multibrotantes caractersticos de Paracoccidioides brasiliensis; b) Colorao de nigrosina demonstrando levedura capsulada caracterstica de Cryptococcus sp.; c) Clarificao com hidrxido de potssio demonstrando conidiforo aspergilar.

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O transporte dever ocorrer o mais rpido possvel. Os espcimes clnicos so transportados de acordo com os procedimentos laboratoriais a que se destinam: o material a ser cultivado deve ser transportado em frasco esterilizado e sob refrigerao (caixa de isopor com gelo reciclvel); quando o exame solicitado a microscopia direta, lminas fixadas so suficientes.

tinta Parker (azul preto permanente), branco de calcoflor ou nigrosina (Figura 1). Esfregaos de pus, sangue, exsudatos, LBA e aspirado de rgos podem ser fixados e corados com Giemsa ou Grocott (Tabela 2).

Cultivo
Consiste em disponibilizar in vitro os nutrientes necessrios para que o fungo presente na amostra clnica possa se multiplicar, formar estruturas de reproduo e ser identificado. Esse exame deve ser executado mesmo quando o fungo, por ter morfologia peculiar, identificvel ao exame microscpico. Os demais fungos, necessariamente, devem ser isolados em cultivo e identificados para que se obtenha o diagnstico da micose. Os meios de cultivo mais utilizados nos laboratrios de micologia so gar Sabouraudglicose 2% (Figura 2a), podendo ser acrescido de cicloheximida (Figura 2b) e/ou cloranfenicol. A escolha do meio vai depender das informaes clnicas e/ou do resultado do exame microscpico.(5) O primeiro meio utilizado para o isolamento de fungos de crescimento rpido, enquanto que o segundo, contendo antifngico e antibacteriano, utilizado para o isolamento de fungos que necessitam de um perodo de incubao maior, como os fungos dimrficos (por exemplo, H. capsulatum). Nesses casos, os antimicrobianos acrescidos ao meio inibem fungos ditos contaminantes e bactrias que impedem o crescimento e o isolamento do agente etiolgico verdadeiro.(5) Outros meios de cultivo especficos podem ser utilizados em casos de suspeio clnica evidente, como, por exemplo, po esterilizado

Material imprprio para exame

Escarro com mais de 24 h, frascos no identificados ou contendo informaes discrepantes da ficha clnica do paciente, material colhido em swab e material encaminhado em frascos inadequados, com suspeita de contaminao, so imprprios para o exame. O microbiologista dever entrar em contato com o clnico solicitando uma nova amostra.(4)

Diagnstico laboratorial
Exame direto
O exame direto consiste em avaliar a amostra clnica microscopicamente, entre a lmina e a lamnula, utilizando reagentes e/ou corantes para a visualizao das estruturas fngicas. Embora o exame direto seja conclusivo para o diagnstico de algumas micoses pulmonares, como a pneumocistose, a paracoccidioidomicose (Figura 1a), a criptococose (Figura 1b) e a bola fngica aspergilar (Figura 1c), na maioria das vezes, esse exame no suficiente para a identificao do agente etiolgico. Fragmentos teciduais, escarro e LBA podem ser analisados atravs da adio de uma soluo de 20% de hidrxido de potssio, com ou sem

Tabela 2 - Reagentes e corantes para exame micolgico direto de distintas espcimes clnicas. Material Quantidade Reagentes/corantes Lavado broncoalveolar 10-20 mL Prata e calcoflor Escarro 5-10 mL N-acetilcistena ou hidrxido de sdio ou sputumlysin (Stat-Pack, Caldon Biotech, Carlsbad, CA, EUA), calcoflor Lquor 3-5 mL Nigrosina, calcoflor Pus e exsudatos 3-5 mL Hidrxido de potssio, prata, Kinyoun, Gram 10-20 mL (adulto); 1-5 mL (crianas) Prata, Giemsa, calcoflor Sanguea Tecido 1-5 mm Prata, hidrxido de potssiob Medula ssea 0,2 mL (esfregao); 1 mL (cultivo) Prata, hidrxido de potssiob Urina 10-20 mL Direto, calcoflor
a

devem estar heparinizados, bacrescido de tinta Parker.

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Figura 2 - a) Cultivo em gar Sabouraud-glicose 2% em diferentes temperaturas de incubao, demonstrando a inibio do crescimento bacteriano a partir de 40C, associado termotolerncia de Aspergillus fumigatus; b) Cultivo em gar Sabouraudglicose 2% acrescido de cicloheximida para isolamento de Histoplasma capsulatum de amostras no estreis; c) Cultivo em gar Staib evidenciando a produo de melanina por Cryptococcus sp., que o difere de outras leveduras (brancas).

para agentes de zigomicose e meios de cultura como o gar Staib (sementes de Guizotia abyssinica) para Cryptococcus sp. de espcimes obtidos da rvore brnquica (Figura 2c).(6) O tempo e a temperatura de incubao tambm dependem do agente etiolgico que se pretende isolar. Em geral, fungos leveduriformes e filamentosos possuem crescimento rpido, com isolamento em no mximo uma semana, enquanto fungos dimrficos necessitam de um perodo maior de incubao (duas/trs semanas para H. capsulatum e P. brasiliensis). Quanto temperatura, o ideal que o material seja incubado a 25C e 35C, possibilitando que todos os microrganismos possam ser isolados, alm de permitir que os fungos dimrficos trmicos possam ser rapidamente identificados.(7) Na Tabela 3 se resumem os meios de cultivo mais utilizados na micologia clnica. A identificao da maioria dos gneros de fungos filamentosos causadores de micoses pulmonares realizada a partir das caractersticas morfolgicas encontradas nos meios de cultivo utilizados na rotina. No entanto, para a identificao de algumas espcies, so necessrios meios especiais, como por exemplo, o meio de Czapeck-Dox para espcies de Aspergillus(8) e o meio canavanina-glicina-azul de bromotimol para diferenciar C. neoformans de C. gattii.(9) Outra tcnica de utilidade na identificao de fungos filamentosos o cultivo em lmina em meio de gar-batata-cenoura, que estimula a conidiognese e facilita a visualizao das estruturas completas de esporulao. Para a identificao de leveduras, provas bioqumicas

so necessrias, como assimilao e fermentao de carboidratos, prova da urease, prova do tubo germinativo e mtodo automatizado, como ATB Expression sistema ID 32C (bioMrieux, Marcy ltoile, Frana). Embora persista a idia equvoca de que o resultado de um exame micolgico demorado, a maioria dos fungos que causam doenas humanas pode ser isolada em at 7 dias (fungos leveduriformes e filamentosos), com exceo dos fungos dimrficos que, s vezes, necessitam de um tempo maior de incubao (duas/ trs semanas) para o aparecimento de estruturas caractersticas (Tabela 3).(7) Assim, no encaminhar o material para cultivo pode implicar em falta de reconhecimento diagnstico, falha teraputica e sofrimento para o paciente. importante salientar que muitos fungos causadores de micoses pulmonares so oportunistas, ou seja, microrganismos que antigamente eram somente considerados como contaminantes, sem importncia clnica. Esses emergiram como patgenos e possuem extrema relevncia como agentes etiolgicos em indivduos imunossuprimidos.(10,11) Fungos do gnero Aspergillus se enquadram nessa descrio, sendo fungos anemfilos e ubquos e, ao mesmo tempo, relacionados com altas taxas de mortalidade em alguns grupos de pacientes, como doentes hematolgicos e transplantados de medula ssea. Com isso, a interpretao do cultivo micolgico em casos de isolamento de fungos como Aspergillus sp., Fusarium sp. e zigomicetos, entre outros, deve ser realizada com cautela, sem se descartar a hiptese de haver uma contaminao da amostra, nem de ser o verdadeiro patgeno. Nesses casos, o diagnstico definitivo requer a associao de outros exames, como a histopatologia ou a sorologia. Cabe salientar que, na fase filamentosa, os fungos dimrficos Histoplasma sp. e Coccidioides sp. (endmicos no nordeste do Brasil) so muito virulentos, e a manipulao das colnias fngicas deve ser feita em capela de biossegurana; no caso do Coccidioides sp., prefervel trabalhar com colnias formolizadas.(12,13)

Sistemas de hemocultivo
Nas ltimas duas dcadas, houve um grande progresso nos sistemas de isolamento fngico a partir do sangue perifrico. O primeiro foi o meio bifsico. Atualmente, dispe-se da tcnica de
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Tabela 3 - Meios de cultivo recomendados para o isolamento fngico conforme o espcime clnico e o tempo de crescimento fngico. Micose Material Meios de cultivo Tempo de S SCl My BHI AN U CGB Po crescimento Histoplasmose Paracoccidioidomicose Criptococose Aspergilose Zigomicose Hialo-hifomicose: Estril No estril Estril No estril Estril No estril Estril No estril Estril No estril Estril No estril x x x x x x x x x x x x x 2-6 dias x x x x 1-3 dias x x x x x x x x x x 1-10 dias 3-5 dias x x 21-30 dias x 7-14 dias

Scedosporium/Fusarium

S: Sabouraud (25C); SCl: Sabouraud com cloranfenicol (25C); My: Sabouraud com cloranfenicol e cicloheximida (25C); BHI: Infuso de crebro e corao (35C); AN: gar Staib (25C); U: uria (25C); CGB: canavanina-glicina-azul de bromotimol (25C).

lise-centrifugao (Wampole Isolator; Wampole Laboratories, Cranbury, NJ, EUA) e sistemas automatizados, continuamente controlados, como BACTEC (Becton Dickinson, Sparks, MD, EUA) e BacT/ALERT (bioMrieux, Marcy ltoile, Frana). Quanto ao isolamento de leveduras (gneros Candida, Trichosporon e Cryptococcus), esses mtodos se equivalem; no entanto, a lisecentrifugao considerada o padro ouro para o isolamento de fungos dimrficos trmicos, especialmente H. capsulatum, de amostras de sangue.(4,14-18) Na tcnica de lise-centrifugao, o sangue obtido por puno venosa estril deve ser inoculado em um tubo especfico, que contm polianetol sulfonato de sdio, polipropilenoglicol e saponina, sendo posteriormente homogeneizado e centrifugado (5.100 rpm). O sedimento obtido ento utilizado para a semeadura em dois meios de cultivo, gar Sabouraud a 25C, e infuso crebro-corao a 35C, por at trs semanas.(19). O polianetol sulfonato de sdio funciona como anticoagulante e o polipropilenoglicol como substncia antiespumante. A saponina o componente mais importante dessa tcnica, pois promove a lise de glbulos brancos e hemcias, alm de inativar o complemento e outros antimicrobianos do plasma, permitindo a liberao intracelular dos fungos, o que aumenta a taxa de crescimento e abrevia o tempo de cultivo (2-10 dias), tanto para fungos leveduriformes, como para filamentosos. Essa
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tcnica tem sensibilidade superior a de outras tcnicas de hemocultivo.(20)

Exame histopatolgico
Fragmentos obtidos por bipsia ou por exrese cirrgica devem ser fixados em formol, includos em parafina e, aps os cortes histolgicos, corados para a avaliao histopatolgica. O exame histopatolgico pode ser classificado tanto como ferramenta para o diagnstico direto das micoses pulmonares, auxiliando na pesquisa do agente fngico pela colorao de Grocott, quanto como auxlio no diagnstico indireto, na pesquisa de resposta do hospedeiro, atravs da avaliao da reao tecidual pela colorao de H&E. A reao tecidual inespecfica, no sendo suficiente para diagnosticar etiologicamente as micoses pulmonares. Porm, a histopatologia com demonstrao do agente fngico nos tecidos fundamental para fechar o diagnstico de micoses oportunsticas, confirmando que o fungo isolado no cultivo no corresponde a um contaminante. A associao desses dois exames geralmente considerada o padro ouro de diagnstico nas micoses oportunsticas, como a aspergilose, zigomicoses, hialo-hifomicoses e feo-hifomicoses.(2,6,21,22) A histopatologia proporciona uma importante contribuio para o diagnstico micopatolgico, mas nunca se deve esquecer as limitaes dessa tcnica, baseada na micromorfologia e na reao tecidual. Em adio, mais de um microrganismo

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pode estar envolvido no processo infeccioso e, nesses casos, s mesmo a associao do cultivo micolgico poder esclarecer o diagnstico. Contudo, o estudo histolgico e a investigao micolgica nunca devem ser negligenciados, especialmente em se tratando de infeces oportunsticas. A integrao do patologista com o clnico, o cirurgio, o radiologista e o microbiologista extremamente benfica na busca do diagnstico das micoses pulmonares. Esse profissional, alm de demonstrar os elementos fngicos nos tecidos e de avaliar as consequncias estruturais da doena, pode auxiliar a elucidar a patogenia, prever alteraes funcionais e o prognstico. Nos cortes de tecido, a reao tecidual pode ser classificada em granulomatosa, necrtica ou purulenta, e o agente etiolgico inicialmente pode ser dividido em dois grupos, conforme os elementos fngicos observados: filamentosos e elementos fngicos arredondados (leveduras, esporngios, esfrulas, condios e esporos).(21-24) Alm da realizao da histopatologia em fragmentos de tecido obtidos in vivo, o estudo de autpsia, atravs de exames histopatolgicos e micolgicos, extremamente importante por

corroborar um diagnstico prvio da micose ou ento por revelar uma infeco no suspeitada em vida. Nesse ltimo caso, sua grande relevncia est baseada em elucidar aos profissionais a ocorrncia da micose, para que essa possa ser includa no diagnstico diferencial ainda in vivo, na tentativa de ser devidamente tratada, evitando novos casos fatais semelhantes.

Tcnicas de colorao
A colorao de H&E utilizada para a observao da reao tecidual. No diagnstico das micoses pulmonares, essa colorao no a ideal, porque as estruturas fngicas muitas vezes no so visualizadas ou se coram fracamente. A vantagem que permite distinguir as estruturas fngicas hialinas das demceas, diferenciando as hialo-hifomicoses das feohifomicoses e auxiliando na identificao do agente. Entre as coloraes especiais para a visualizao de elementos fngicos em tecidos e esfregaos, destaca-se a impregnao argntea (Grocott) como a mais utilizada, mais sensvel e mais especfica no diagnstico micolgico devido ao melhor contraste entre os elementos fngicos e o tecido circunjacente. Em situaes

Tabela 4 - Algumas caractersticas da reao recidual na infeco fngica. Micose Tropismo tecidual Reao Forma parasitria Aspergilose Pulmes, seios paranasais, Supurativa Hifas hialinas septadas com vasos sanguneos ramificao a 45 Paracoccidioidomicose Pulmo, suprarrenal, transio Mista piognica e Elemento leveduriforme mucocutnea, msculo granulomatosa; hiperplasia esfrico multibrontante estriado, tecido linfoide e pseudoepiteliomatosa; (15 a 30 m) zonas mais frias do corpo granuloma sarcoide Histoplasmose Pulmo, bao, linfonodos, Histioctica; granuloma com Elemento leveduriforme fgado, medula ssea e pele necrose caseosa; granuloma pequeno unibrotante sarcoide; granuloma com (2-5 m) calcificao Artrite trombtica; Hifas hialinas raramente Zigomicose Pulmes, seios paranasais, vasos sanguneos, granuloma sarcoide septadas, de 5 a 20 m de dimetro com ramificao tecido subcutneo, trato gastrointestinal de 90 Criptococose Sistema nervoso central, Sem reao; granuloma Levedura frequentemente pulmes sarcoide encapsulada (4-6 m) Pneumocistose Pulmes, espao alveolar Granuloma sem necrose Elementos fngicos caseosa com clulas apresentam-se como ascos gigantes dispersas; contendo ascsporos granuloma com calcificao central: exsudato alveolar espumoso; espessamento intersticial por edema e infiltrado mononuclear

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em que o material somente encaminhado para o patologista, utilizam-se coloraes especiais na tentativa de elucidar o agente etiolgico. Para micoses pulmonares causadas por Cryptococcus sp., existem coloraes que conseguem identific-lo com maior facilidade: mucicarmim de Mayer, que cora, em vermelho brilhante, a cpsula de mucopolissacardeo, e Fontana-Masson, que evidencia a melanina na parede fngica.(13)

Interpretao dos achados histopatolgicos

O sucesso no diagnstico histopatolgico das micoses depende no somente do conhecimento do patologista, mas tambm da qualidade da colorao, da apresentao e do nmero dos elementos fngicos no material clnico. Uma caracterstica das doenas infecciosas so os tropismos teciduais (Tabela 4) que apresentam os diferentes agentes etiolgicos. marcante essa tendncia da criptococose com o sistema nervoso central, da histoplasmose com o sistema monoctico/macrofgico (fgado, bao, gnglios e medula ssea) e da paracoccidioidomicose com a suprarrenal (Figura 3a). O angiotropismo observado na aspergilose, hialo-hifomicose e zigomicose, causando angete trombtica.(22,25,26) Embora a reao tecidual seja inespecfica para o diagnstico de infeces fngicas, variando conforme o indivduo, o local e o tempo da infeco, algumas reaes so mais comuns em determinados tipos de micose (Tabela 4). Uma reao piognica aguda ou crnica com infiltrado neutroflico (abscesso) ocorre com frequncia na aspergilose invasiva,

mas tambm o que se observa, como regra, na actinomicose, na nocardiose e na rodococose, surgindo a necessidade do diagnstico diferencial com estas bacterioses. Uma reao mista, piognica e granulomatosa, com hiperplasia pseudoepiteliomatosa frequente na paracoccidioidomicose. O granuloma histioctico com clulas gigantes de Langerhans e necrose central (granuloma tuberculoide com necrose caseosa) uma caracterstica da histoplasmose, especialmente na forma pulmonar aguda. O granuloma sarcoide pode ser visto na paracoccidioidomicose (Figura 3b), na criptococose e na histoplasmose, o que possui extrema importncia, sendo uma atitude de bom senso descartar todas essas doenas antes de confirmar o diagnstico de sarcoidose, que de excluso. O granuloma fibrocaseoso, frequentemente diagnosticado por tcnicas imagticas, como ndulo(s) na cortical pulmonar, pode ser observado na paracoccidioidomicose, na criptococose e na histoplasmose. Nessa ltima, o granuloma apresenta-se frequentemente calcificado.(21-23) Elementos fagocitados no interior de macrfagos podem se encontrados na presena de H. capsulatum e Cryptococcus sp. quando em formas pequenas desprovidas de cpsula. No interior de clulas gigantes so encontrados P. brasiliensis, Cryptococcus sp. e H. capsulatum.(21,23) De acordo com o tamanho e com os aspectos micromorfolgicos (brotamento, hifas, pseudo-hifas) e tintoriais dos elementos fngicos observados na histopatologia, o diagnstico presuntivo pode ser estabelecido em algumas micoses. P. brasiliensis se apresenta como elementos fngicos leveduriformes esf-

Figura 3 - a) Suprarrenal mostrando intensa necrose caseosa (doena de Addison) por paracoccidioidomicose; b) Granuloma sarcoide observado na paracoccidioidomicose; c) Presena de elementos leveduriformes esfricos e multibrontes de Paracoccidioides brasiliensis na colorao de H&E (seta).

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H. capsulatum caracterizado por elementos

fngicos leveduriformes pequenos (2-5 m) e unibrotantes; Cryptococcus sp. uma levedura geralmente encapsulada e unibrotante (4-6 m). A presena no tecido de hifas hialinas, ramificadas e regularmente septadas tanto pode indicar aspergilose, como scedosporiose ou outra hialo-hifomicose. Na aspergilose, em casos de colonizao de cavidade aerada (bola fngica), em que possvel observar o conidiforo de Aspergillus sp., o diagnstico definitivo, mas permite somente a identificao do gnero.(21,27) As feo-hifomicoses, zigomicoses e bola fngica so termos coletivos que designam grupos de micoses causadas por diferentes gneros fngicos, para as quais a histopatologia por si s no fornece o diagnstico etiolgico, necessitando ser associada ao isolamento e identificao fngica realizados atravs dos exames micolgicos. Na maioria dos casos, o exame histopatolgico serve como uma referncia, um auxlio para a identificao etiolgica, demonstrando estruturas caractersticas de um determinado agente. Porm, embora a deteco de elementos fngicos leveduriformes pequenos nos tecidos seja sugestiva de H. capsulatum, pode se tratar

ricos (15-30 m) e multibrotantes (Figura 3c);

de Cryptococcus sp. sem cpsula, Candida glabrata, Sporothrix schenckii e formas pequenas de P. brasiliensis. Nesses casos, se o agente no for isolado em cultivo, a nica maneira de se confirmar o diagnstico por imunofluorescncia direta, tcnica restrita a servios de referncia e apenas disponvel para a deteco de alguns fungos. Outras provas podem corroborar uma hiptese diagnstica, como a imunodifuso para pesquisa de anticorpos, a prova do ltex para deteco de antgeno capsular de Cryptococcus sp. e, mais recentemente, ELISA sanduche para a deteco do antgeno galactomanana de Aspergillus sp., a deteco de -glucana e o uso de tcnicas moleculares para a deteco de DNA fngico na amostra clnica.(28-34) Esses testes podem apresentar diferentes taxas de eficcia (sensibilidade, especificidade, valores preditivos positivo e negativo) conforme a amostra clnica e os indivduos testados. A probabilidade de se distinguir pacientes com e sem uma micose funo da sensibilidade e da especificidade do teste. Entretanto, o mais importante para o clnico o valor preditivo, isto , a probabilidade de que um paciente com teste positivo tenha realmente a doena e de que aquele com teste negativo esteja livre da doena. O valor preditivo depende, alm da sensibilidade e da especificidade do teste, da prevalncia da doena na populao avaliada.

Imunodifuso
Esta prova se baseia na formao de imunocomplexos que, devido ao seu alto peso molecular, precipitam, formando uma linha de precipitao visvel macroscopicamente. um teste relativamente rpido e de fcil execuo. O resultado pode ser dado em at uma semana, mas o resultado apenas qualitativo. O teste pode ser realizado em lminas ou em placas de Petri contendo gel de gar na concentrao de 1%, fundido em tampo fosfato ou tris. Cavidades so produzidas neste gel, com furadores especiais, para a disposio do antgeno no centro e dos soros a serem testados ao redor. Todos se difundem pelo gar e, ao se encontrarem, reagem e precipitam formando uma linha com aspecto leitoso que pode ser visualizada atravs de iluminao indireta e sob fundo escuro. Uma amostra de soro controle positivo (soro padro) deve ser utilizado juntamente na
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Figura 4 - a) Linhas de identidade observada em imunodifuso positiva para paracoccidioidomicose; b) Prova do ltex para criptococose demonstrando aglutinao nos orifcios superiores correspondentes aos soros positivos e, nos orifcios inferiores, aspecto leitoso nos soros negativos; c) Tcnica de ELISA sanduche utilizada para a deteco do antgeno galactomanana em pacientes com suspeita de aspergilose invasiva (da esquerda para direita: soro controle negativo, soro controle cutoff, soro controle positivo, e soros suspeitos).

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reao para facilitar a leitura e a interpretao final do teste. Uma amostra positiva aquela que forma uma linha de precipitao a qual possui sua extremidade unida com a linha do soro padro, conhecida como linha de identidade, que significa que ambos os soros possuem anticorpos para o reconhecimento do mesmo antgeno. Alm de soro, outras amostras clnicas, como lquor e urina, tambm podem ser utilizadas (Figura 4a). A imunodifuso para o diagnstico de histoplasmose resulta em duas linhas de precipitao conhecidas como bandas H e M. A banda H diagnstica de doena e detectada em 10-25% das amostras positivas, ao contrrio da banda M, que no distingue infeco prvia de infeco ativa e encontrada em mais de 75-85% das amostras positivas.(6) Esse teste rotineiramente utilizado para a pesquisa de anticorpos nas micoses pulmonares causadas por H. capsulatum, P. brasiliensis e Aspergillus sp. (forma alrgica e bola fngica).(2) Resultados falso-negativos frequentemente so observados em casos de pacientes imunossuprimidos.

aglutinao ocorra, fenmeno chamado de efeito pr-zona. Caso haja suspeio da ocorrncia desse fenmeno, os soros devem ser diludos e o teste repetido.

Deteco da galactomanana por ELISA sanduche

O diagnstico definitivo da aspergilose invasiva limitado por vrias razes.(33) Culturas de secrees respiratrias possuem sensibilidade diagnstica muito baixa: Aspergillus sp. recuperado em cultivo do escarro e do LBA em apenas 8-34% e 45-62% dos pacientes com aspergilose invasiva, respectivamente. A confirmao diagnstica usualmente requer a avaliao histopatolgica; no entanto, quadros graves de neutropenia ou de trombocitopenia comumente impedem a realizao de procedimentos cirrgicos invasivos nesses pacientes. Bipsias transbrnquicas so associadas a uma frequncia elevada de resultados falso-negativos. Cultivos de sangue, lquor e medula ssea raramente so positivos para Aspergillus sp.. A TCAR um recurso auxiliar de grande importncia no diagnstico precoce de aspergilose pulmonar invasiva em indivduos neutropnicos, particularmente na presena do chamado sinal do halo (halo de necrose envolvendo ndulo pulmonar).(10,11,36) Testes especficos tm sido desenvolvidos para auxiliar os mtodos convencionais frequentemente utilizados na rotina micolgica. Um desses testes recentemente liberado pela Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria no Brasil a tcnica de ELISA sanduche desenvolvida para a deteco da galactomanana, um polissacardeo hidrossolvel componente da parede celular de fungos do gnero Aspergillus, liberado na circulao sangunea durante o crescimento das hifas nos tecidos do hospedeiro (Figura 4c).(37,38) Essa tcnica capaz de detectar baixas concentraes de galactomanana (0,5 ng/mL) nas amostras clnicas e est disponvel comercialmente (Platelia Aspergillus EIA; Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). Fornece resultado rpido em aproximadamente 4 h; porm, seu uso como ferramenta diagnstica est aprovado somente para amostras de soro de pacientes neutropnicos (doentes hematolgicos ou transplantados de medula ssea). No entanto, sua eficcia em outros espcimes clnicos e em distintos grupos de risco para aspergilose invasiva est sendo pesquisada.(39,40)

Prova do ltex
A prova do ltex para a pesquisa de antgenos capsulares do Cryptococcus sp. altamente sensvel (95%) e especfica (98%).(2,12,35) um teste extremamente rpido e fcil de ser realizado, cujo resultado inicial qualitativo, atravs de uma reao de aglutinao passiva. No entanto, por meio de diluies seriadas da amostra clnica, o resultado final pode ser quantificado. Diversos espcimes, como soro, lquor, urina e LBA so teis para realizao desse teste. A prova consiste em homogeneizar a amostra clnica do paciente com uma partcula inerte (ltex) sensibilizada com anticorpo antiantgeno capsular de Cryptococcus sp. A leitura do resultado realizada visualmente, sendo negativas as amostras de aspecto leitoso e positivas as amostras que formarem grumos, correspondentes aglutinao de vrios antgenos ligados entre si atravs dos stios de ligao Fab dos anticorpos (Figura 4b). Resultados falso-negativos podem ocorrer em casos de criptococose causada por Cryptococcus sp. deficiente de cpsula ou em casos de excesso de antgeno na amostra, no permitindo que as pontes se formem e que a
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Quando monitorada de forma seriada, a deteco da galactomanana antecipa o diagnstico de aspergilose invasiva em um intervalo de 6 a 14 dias em indivduos neutropnicos. Devido provvel liberao intermitente do antgeno, o teste deve ser realizado duas vezes por semana, confirmando-se o diagnstico ao apresentar resultados positivos em pelo menos duas amostras consecutivas. A taxa de resultados falso-negativos oscila entre 8% e 10% e est relacionada a quadros de encapsulao da infeco, formao de imunocomplexos por anticorpos anti-Aspergillus (em pacientes com menor imunossupresso), ou exposio a agentes antifngicos (como profilaxia). A frequncia de resultados falso-positivos usualmente varia entre 8% e 14%, sendo as principais causas o uso de agentes quimioterpicos citotxicos (promovendo dano s mucosas intestinais), enfermidade do enxerto versus hospedeiro, anticorpos autorreativos, infeco por outros fungos como os do gnero Penicillium e Paecilomyces, transfuses, antibiticos de origem fngica (piperacilina-tazobactam; amoxicilina com cido clavulnico) e contaminao no laboratrio.(37,39,41-44) Recentemente, foi demonstrada tambm a reao cruzada no teste com Histoplasma sp., resultando em galactomanana positiva em pacientes com histoplasmose.(45) Apesar de ser um teste extremamente especfico, possui uma sensibilidade muito variada, com taxas entre 17% e 100%.(46) A maior razo para essa variabilidade est atribuda ao valor de corte utilizado no teste, o qual determina a positividade das amostras. Utilizando-se um valor de corte entre 1,0 e 1,5, a sensibilidade do galactomanana no LBA variou entre 85% e 100% na maioria dos estudos.(47-49) Outro fator de extrema importncia na eficcia dessa tcnica a prevalncia da doena em uma determinada populao, o que interfere no valor preditivo positivo encontrado. Consequentemente, o teste para a deteco de antgeno aspergilar deve ser reservado para pacientes com alto risco, nos quais o custo-benefcio compensador.(46)

Reao em cadeia da polimerase no diagnstico micolgico

A aplicao das tcnicas moleculares, como a PCR, escassa no diagnstico de micoses pulmonares. Realizadas somente em nvel de pesquisa, apresentam diversos contrapontos. Protocolos

no esto disponveis, os mtodos no esto padronizados, no havendo consenso entre as tcnicas de extrao e amplificao dos materiais nucleicos, nem tampouco kits comerciais disponveis. Assim, h dificuldade em comparar resultados intra e interlaboratrios.(33,35) A tcnica de PCR caracteriza-se pela amplificao enzimtica de regies curtas de DNA in vitro. O principal alvo o gene 18S ribossomal. Primers (oligonucleotdeos ou filamentos curtos de cidos nucleicos) so utilizados para reconhecer e hibridizar de modo especfico com sequncias-alvo de DNA. Depois de reconhecidas, as molculas de DNA-alvo so ento copiadas por uma enzima DNA polimerase termoestvel (Taq polymerase), na presena de concentraes timas de magnsio e de desoxinucleotdeos (bases A, C, T e G). Atravs de mltiplos ciclos de aquecimento e resfriamento, realizados em um termociclador (mquina de PCR), multiplica-se de modo exponencial o nmero de molculas de DNA na reao. Essa multiplicao ocorre a partir da separao das fitas de DNA (desnaturao) com posterior ligao dos primers molcula de DNA (anelamento) e ao da enzima DNA polimerase (extenso), que alonga a molcula em formao, utilizando-se os desoxinucleotdeos livres na reao. Ao trmino de cada ciclo, cada nova molcula de DNA sintetizada atua como um novo alvo para o prximo ciclo. Teoricamente, esse mtodo permite a gerao de bilhes de cpias de DNA-alvo a partir de uma nica cpia de DNA, com grande velocidade. O produto final da reao analisado por eletroforese em um gel de agarose atravs do qual, em comparao com marcadores de tamanho conhecido, determina-se o tamanho do fragmento de DNA obtido. Esse produto final pode ser tambm purificado e utilizado para outras aplicaes em biologia molecular, como no sequenciamento genmico (determinao da composio molecular do mesmo, ou da sequncia de nucleotdeos que o compe). Os pontos crticos esto relacionados com o mtodo de extrao do DNA, bem como com a escolha dos primers na reao, que devem amplificar, de modo especfico, DNA fngico ao invs de DNA humano. Resultados promissores a partir de amostras de soro e de LBA, com sensibilidade de 79-100% e especificidade de 81-100%, so descritos para a aspergilose invasiva.(10,41,42,50-52) No entanto, devido s dificuldades atuais na
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padronizao dos testes de PCR, esses no esto ainda formalmente includos como testes diagnsticos para micoses pulmonares.(32,34,43)

Laudo micolgico
Aps a realizao dos exames, emitido um laudo, o qual deve apresentar terminologia clara, notificar a existncia de material imprprio, referir todos os achados, incluir uma interpretao e esclarecer sobre microrganismos raros. Esse tipo de laudo s pode ser feito em vigncia de informaes clnicas adequadas.

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Sobre os autores
Melissa Orzechowski Xavier Flvio de Mattos Oliveira Luiz Carlos Severo
Professora Substituta de Micologia. Fundao Universidade Federal do Rio Grande FURG Rio Grande (RS) Brasil. Pesquisador. Laboratrio de Micologia, Hospital Santa Rita, Santa Casa - Complexo Hospitalar, Porto Alegre (RS) Brasil. Professor Associado (Nvel 2). Departamento de Medicina Interna, Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Rio Grande do Sul UFRGS Porto Alegre (RS) Brasil.

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