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HEMOGLOBINA GLICADA

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INDICAO MDICA DO EXAME A determinao da hemoglobina glicada em amostras de sangue til no controle do diabetes. PRINCPIO A resina de troca inica, carregada negativamente, exibe uma afinidade para molcula com carga positiva. Em fora inica e pH selecionados, a hemoglobina glicada (Hb-G) tem carga positiva menor que a hemoglobina A e se liga mais fracamente resina. A aplicao do tampo Hb-Rpida (n 1) promove a eluio da hemoglobina glicada, ficando as outras hemoglobinas retidas na resina. A medida espectrofotomtrica do eluato (Hb-G) e da hemoglobina total (Hg-total) permite o clculo da percentagem de Hb-G na amostra. AMOSTRA Preparo do paciente Recomenda-se jejum mnimo de 8 horas. Tipos de amostra Usar sangue total colhido com EDTA. Pode-se obter resultado falsamente elevado quando a amostra colhida em heparina. Armazenamento e estabilidade da amostra O analito estvel no sangue total por 5 dias entre 2 8 C. Volume mnimo (Definir o volume mnimo a ser encaminhado para anlise) Volume ideal (Definir o volume ideal a ser encaminhado para anlise) Fazer referncia ao manual ou POP de colheita, separao e distribuio de material. PRODUTO UTILIZADO Hemoglobina Glicada, Catlogo 17 Labtest Diagnstica Av. Paulo Ferreira da Costa, 600 Lagoa Santa, MG, 33400-000 ANVISA - 10009010016

Tampo Hb-Rpida: Armazenar entre 15 25 C. Contm tampo fosfato 36 mmol/L pH 6,7 e biocida no txico. Hemolisante: Armazenar entre 15 25 C. Contm ons borato e azida sdica 14,6 mmol/L. Colunas para cromatografia: Armazenar entre 15 25 C. Contm resina de troca inica equilibrada com tampo fosfato pH 6,7. Precaues e cuidados especiais 1. Os cuidados habituais de segurana devem ser aplicados na manipulao do reagente. Fazer referncia ao manual ou POP de segurana. 2. Os reagentes no abertos, quando armazenados nas condies indicadas so estveis at a data de expirao impressa no rtulo. Durante o manuseio, os reagentes esto sujeitos contaminao de natureza qumica e microbiana que podem provocar reduo da estabilidade. O laboratrio deve estabelecer a estabilidade em suas condies operacionais. 3. O hemolisante contm azida sdica, que txica. Deve-se tomar cuidado para evitar a ingesto e, no caso de contato com os olhos, lav-los imediatamente com grande quantidade de gua e procurar auxlio mdico. A azida pode formar compostos altamente explosivos com tubulaes de chumbo e cobre. Utilizar grandes volumes de gua para descartar o reagente. Fazer referncia ao manual ou POP de segurana. 4. No misturar reagentes de lotes diferentes. EQUIPAMENTOS 1. Fotmetro capaz de medir com exatido a absorbncia em 415 nm ou filtro azul (405 a 430). 2. Pipetas para medir amostras e reagentes. 3. Termmetro.

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CONTROLE DA QUALIDADE Materiais Identificar os materiais para controle interno e externo da qualidade (fabricante, nmero de catlogo), instrues de preparo e frequncia da utilizao dos mesmos. Limites de tolerncia Descrever o procedimento para definio dos limites de tolerncia, o sistema adotado para utilizao do mapa de Levey-Jennings e das regras de controle e as providncias a serem tomadas diante de valores que ultrapassem tais limites. Fazer referncia ao manual ou POP para utilizao dos materiais de controle. Verificao de novo lote de controles e/ou reagentes Descrever o procedimento de verificao de novos lotes de controles e de reagentes. Gerenciamento dos dados Definir como os dados relativos ao controle da qualidade so arquivados e gerenciados. Fazer referncia ao manual ou POP de garantia da qualidade. PROCEDIMENTO Minimizao da ao de interferentes Este procedimento deve ser aplicado somente quando a amostra estiver turva, lipmica ou ictrica. 1. Pipetar em um tubo 1,0 mL da amostra bem homogeneizada. Marcar o nvel de 1,0 mL no tubo. 2. Centrifugar a 2000 rpm por 5 minutos. Retirar o plasma sem ressuspender as hemcias. 3. Adicionar 3,0 mL de NaCl 150 mmol/L (0,85%). Centrifugar. Acertar o volume para a marca de 1,0 mL, retirando o excesso do sobrenadante. 4. Homogeneizar bem e utilizar para preparar o hemolisado. Preparo do hemolisado Em um tubo 12 x 75 adicionar 0,4 mL de hemolisante (n 2) e 0,1 mL da amostra. Agitar fortemente por 20 segundos e esperar 5 minutos. Se a hemlise for incompleta (o lquido no tubo se mostra turvo), centrifugar e usar o sobrenadante. Antes de iniciar a cromatografia, assegurar-se de que o hemolisado, o tampo e as colunas tenham a mesma temperatura ambiente. Nunca realizar a cromatografia se o hemolisado, tampo e coluna tiverem temperaturas diferentes do ambiente no qual se realizar a cromatografia. Preparo da coluna A presena de bolhas de ar no filtro ou na resina interfere na drenagem do tampo, aumentando o tempo de eluio da hemoglobina glicada. Retirar a tampa superior da coluna, introduzir o basto fazendo movimentos giratrios descendentes a ascendentes para ressuspender a resina. Remover imediatamente a tampa inferior, colocar a coluna em um tubo de ensaio e esperar que todo o lquido penetre na resina. A partir da, a coluna estar pronta para uso e a cromatografia dever ser iniciada imediatamente. Jamais iniciar a cromatografia em temperatura inferior a 16 C ou superior a 30 C. Medir a temperatura do lquido que drenou da coluna para correo do resultado. Cromatografia Adicionar 0,05 mL do hemolisado sobre a resina, de modo que no haja ressuspenso da mesma, evitando a formao de bolhas de ar. Esperar que o hemolisado penetre na resina. Transferir a coluna para um tubo de ensaio limpo e seco, marcado com o nmero 1 e adicionar lentamente, com a ponta da pipeta tocando a parede da coluna, 3,5 mL de Tampo Hb-Rpida (n 1). A eluio da Hb-G se completa quando todo o tampo penetra na resina. Desprezar a coluna. Colorimetria Homogeneizar o contedo do tubo nmero 1 (Hb-G) e us-lo para a colorimetria sem qualquer tratamento adicional. Para um tubo limpo e seco, marcado com o nmero 2 (Hb-total) pipetar 7,0 mL de gua destilada, adicionar 0,02 mL do hemolisado e misturar. Determinar as absorbncias dos tubos nmero 1 (Hb-G) e nmero 2 (Hb.total) em 415 nm ou filtro azul (405 a 430 nm) acertando o zero com gua destilada. A cor estvel por 4 horas. Precaues e cuidados especiais 1. Para manusear e descartar reagentes e material biolgico, aplicar as normas estabelecidas de segurana. Fazer referncia ao manual ou POP de segurana.

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A limpeza e secagem adequadas do material so fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obteno de resultados corretos. Fazer referncia ao manual ou POP de limpeza e verificao da qualidade da limpeza dos materiais. 2. A gua utilizada no laboratrio deve ter a qualidade adequada a cada aplicao. Assim, para preparar reagentes e usar nas medies, deve ter resistividade 1 megaohm ou condutividade 1 microsiemens e concentrao de silicatos < 0,1 mg/L (gua tipo II). Para o enxge da vidraria a gua pode ser do tipo III, com resistividade 0,1 megaohms ou condutividade 10 microsiemens. No enxge final utilizar gua tipo II. Quando a coluna deionizadora est com sua capacidade saturada ocorre a produo de gua alcalina com liberao de vrios ons, silicatos e substncias com grande poder de oxidao ou reduo que deterioram os reagentes em poucos dias ou mesmo horas, alterando os resultados de modo imprevisvel. Assim, fundamental estabelecer um programa de controle da qualidade da gua. Fazer referncia ao manual ou POP de gua reagente. CLCULOS Ver linearidade. A1 Hemoglobina Glicada (%) = 5 x A2 A1 = Absorbncia do tubo nmero 1 (Hb-G) A2 = Absorbncia do tubo nmero 2 (Hb-Total) Efeito da temperatura A cromatografia deve ser realizada a 22 C. Se for realizada em temperatura diferente, corrigir o resultado para a temperatura de 22 C, multiplicando-se o resultado encontrado pelo fator de correo correspondente temperatura de trabalho. Temperatura de trabalho (C) 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 RESULTADOS Unidade de medida % Valores de referncia Hemoglobina Glicada: 5,3 a 8,0% LIMITAES DO PROCEDIMENTO Linearidade O sistema linear at 30%. Valor superior a 30% no foi relatado na literatura. Interferncias 1- Em amostras lipmicas ou ictricas obtm-se resultados falsamente elevados. 2- A presena de hemoglobina F na amostra leva obteno de resultados falsamente elevados, enquanto a presena das hemoglobinas S e C produzem resultados falsamente diminudos. A anemia Fator de correo 1,16 1,13 1,10 1,08 1,05 1,03 1,00 0,98 0,95 0,93 0,90 0,88 0,86 0,84 0,82 x 100 ou A2 A1 x 20

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ferropriva produz resultados falsamente elevados. Em todas as condies onde a meia-vida das hemcias est modificada, podem ocorrer alteraes nos valores da hemoglobina glicada. SIGNIFICADO CLNICO Um nmero importante de trabalhos confirma a utilidade da determinao da Hb-G na avaliao do estado de controle da glicemia em pacientes diabticos e est definitivamente provado que a elevao da Hb-G influenciado somente por fatores ligados ao diabetes. Portanto, a Hb-G se eleva com a deteriorao da tolerncia glicose e com todos os fatores de risco como idade, obesidade, histria familiar e histria de recm nascido de grande peso. O grau de glicosilao diretamente proporcional ao valor da glicemia e sua durao varia tambm de paciente a paciente. Pequenas elevaes dos valores da glicose em reduzidos intervalos de tempo no so capazes de produzir modificaes significativas na Hb-G. Quando pacientes diabticos em estado de descontrole so submetidos ao tratamento e passam a apresentar valores da glicemia em nveis timos, observa-se reduo progressiva da Hb-G que atinge o ponto de equilbrio depois de 6 8 semanas. Assim, o conceito de que uma determinao de Hb-G reflete os nveis glicmicos da sexta ou oitava semana precedente ao teste est definitivamente comprovado. Um resultado de Hb-G prximo ao valor superior referente indica que o paciente diabtico tem estado sob controle metablico adequado por vrias semanas e exclui uma perda temporria do controle durante o perodo avaliado. Os estudos da cintica da glicosilao da hemoglobina tm demonstrado que quando h perda do controle glicmico os valores da Hb-G comeam a se elevar logo na primeira semana de descontrole e a velocidade do aumento muito maior que a velocidade de queda quando um paciente diabtico colocado em nveis desejveis de glicemia. Portanto, um resultado elevado de Hb-G pode ocorrer na presena de um controle metablico adequado quando a Hb-G ainda no atingiu o novo ponto de equilbrio. Estudos recentes do DCCT (Diabetes Control and Clinical Trial) demonstram que a morbidade ou mortalidade do diabetes esto diminudos quando ocorre um controle adequado da glicemia e que a dosagem de Hb-G muito importante para informar o estado de controle da glicemia. Existem muitas dvidas sobre os nveis de controle metablico adequado relacionados aos valores de HbG. bastante razovel admitir que os valores da Hb-G em diabticos bem controlados devem estar o mais prximo possvel dos valores de referncia. Entretanto, as tentativas de se obter estes valores esbarram em uma complicao bastante grave: a hipoglicemia. A tabela abaixo mostra um sumrio de alguns dos valores alvo recomendados. Os nveis metablicos alvo foram definidos como timos, aceitveis e comprometidos, e os valores da Hb-G so expressos em termos percentuais do limite superior de referncia do mtodo (LSR). Assim, em um mtodo com LSR igual a 8,0%, um diabtico com nveis timos de controle metablico ter resultados de Hb-G menores que 8,8%, enquanto um valor maior que 11,2% significa estado metablico comprometido. REFERNCIAS 1. Bunn HF et al. Biochem Biophys Res Commum 1975; 67: 103-109. 2. Daneman D. The Endocrinologist 1994; 4: 33-43. 3. Gabbay KH et al. J Cli Endocrinol Metab 1977; 44: 859-864. 4. Koenig RJ et al. Diabetes 1976; 25: 230-232. 5. Koenig RJ et al. New Engl J Med 1976; 295: 417-419. 6. Paulsen EP. Metabolism 1973; 22: 269-271. 7. Rahbar S. Clin Chem Acta 1968; 22: 296-298. 8. Schellekens APM et al. Clin Chem 1981; 27: 94-99. 9. Schnek AG and Schroeder WA. J Am Chem Soc 1961; 83: 1472-1478. 10. Trivelli LA, Ranney H, Lai HT. New Engl J Med 1971; 284: 353-357. 11. Westgard JO, Barry PL, Hunt MR. Clin Chem 1981; 27: 493-501. 12. Hemoglobina Glicada, Instrues de Uso, Labtest Diagnstica.

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