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FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

Unidad Temtica 5

Taxonoma bacteriana
(Gua de estudio) Benintende, S; Snchez, C., Sterren, M. Y Musante, C Objetivo El objetivo de la Taxonoma bacteriana es dar un ordenamiento de las unidades taxonmicas bsicas (especies). Especie bacteriana: Es un conjunto de poblaciones clonales que presentan un elevado grado de similitud fenotpica entre s y que a su vez difieren de otros conjuntos de poblaciones clonales. Caracterizacin Ideal: caracterizacin completa del genotipo (es decir de su constitucin gentica). Real: caracterizacin parcial del fenotipo (apariencia). Pero adems de utilizar propiedades estructurales, se debe recurrir a las propiedades bioqumicas y fisiolgicas para la caracterizacin de especies; es decir que las bacterias se clasifican no solo por su apariencia sino tambin por lo que pueden hacer. Denominacin: uso del sistema binomial de nomenclatura: formado por 2 palabras. Ejemplos: Bacillus subtilis Bradyrhizobium japonicum

Bacillus subtilis

La segunda palabra cita la

especie
La primer palabra indica el rango taxonmico inmediato superior, el

Gnero

Manual Bergey de Bacteriologa Volumen I Bacterias gram (-) de importancia mdica e industrial Volumen II Bacterias gram (+) de importancia mdica e industrial Volumen III Bacterias gram (-) restantes Volumen IV Actinomicetes y bacterias relacionadas

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Taxonoma clsica La taxonoma clsica est basada en la caracterizacin: morfolgica, fisiolgica y bioqumica. Entre los caracteres taxonmicos morfolgicos: Coloracin de gram Negativo: se observan bacilos aislados de Positivo: se observan cocos agrupados en color rosado (coloracin dada por la estafilos (estafilococos) de color violeta, safranina). tpico de una coloracin de Gram (+).

Agrupamientos

Estructuras especiales Esporas Cpsulas

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Entre los caracteres bioqumicos y fisiolgicos Pruebas de: Rojo de metilo, Voges Proskauer, Catalasa. Rojo de Metilo
Principio: fermentadores cido-mixtos que producen una descenso de pH por debajo de 4,3. Se agrega el indicador Rojo de Metilo al medio de cultivo, luego de la incubacin. Si ocurre un descenso de pH por debajo de 5, se produce un viraje al color rojo y la prueba se considera (+). Resultados (-) se observan por lo general de color amarillo. Se utiliza para diferenciar Escherichia sp. (+) de Enterobacter sp. o Klebsiella sp. (-)

Voges-Proskauer
Principio: produccin de 2 3 butanodiol (fermentadores butanodilicos). Reactivo: -naftol. Resultados: reaccin color rojo (+) reaccin color amarillo (-) Se utiliza: para separar bacterias de los gneros Klebsiella y Enterobacter (+) de Escherichia (-).

Catalasa
Principio: propiedad de la enzima catalasa de descomponer el perxido de hidrgeno (H2O2). Se aade al cultivo unas gotas de H2O2 para observar la formacin de burbujas. La observacin de burbujas (tubo +) indica la presencia de la catalasa. Se utiliza para diferenciar los gneros Bacillus (+) de Clostridium (-), Stresptococcus (-) de Staphylococcus (+)

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Existen sistemas comerciales que permiten la rpida identificacin de una bacteria en base a la capacidad de utilizacin de determinados sustratos, presencia de determinadas enzimas, etc.

Tcnicas

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Tcnicas serolgicas Utilizacin in vitro de las reacciones antgeno-anticuerpo para la identificacin de un microorganismo (virus, bacterias, hongos).

Testigo Antgeno
(cepas de rizobio)

Placas de inmunodifusin

Agar

Antgeno
( cepas de rizobio)

Testigo Antisuero

Enzima

Test de ELISA

Anticuerpo

Microorganismo

Sustrato

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Antgeno

Clula bacteriana Anticuerpo antibacteriano marcado fluorescentemente

Anticuerpos fluorescentes

Aplicaciones de la biologa molecular a la identificacin bacteriana 1.- Composicin de bases del ADN: Determinado por la cantidad de G+C respecto del total de bases. 2.- Tcnicas basadas - en la hibridacin del ADN-ADN y ADN-ARN: Permite evaluar el grado de homologa gentica entre bacterias - en la amplificacin de sectores del ADN (por ejemplo PCR): Permite ver si existe o no homologa entre sectores del genforo bacteriano aumentando del nmero de copias de un determinado sector de ADN.

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Amplificacin de sector de ADN (PCR) (Ver movie pcwin en material complementario)

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Complemento Terico Prctico Identificacin de Bacterias El trabajo en microbiologa se basa en el estudio de poblaciones microbianas debido a la dificultad en la manipulacin y la limitada informacin que se puede obtener a partir de los individuos microbianos. Los pasos que se siguen para determinar la identidad de un microorganismo es la IDENTIFICACIN. Un microorganismo se identifica adecuadamente cuando se encuentra que la descripcin de una especie es idntica a las caractersticas observadas en dicho microorganismo. La unidad taxonmica de clasificacin que comnmente se utiliza es la especie. Esta categora sistemtica se define como el conjunto de poblaciones clonales1 de elevada similitud fenotpica2 que a su vez difieren de otras poblaciones clonales. Una caracterstica de los microorganismos es que en un corto perodo de tiempo ocurren considerables aumentos de las poblaciones, lo que determina que se puedan establecer cambios genticos que adquieren continuidad. Ello hace problemtico diferenciar especies sobre la base de un pequeo nmero de caracteres. La esencia de la identificacin la integran dos clases de operaciones: Aislamiento, que es el tipo de siembra que permite la separacin de microorganismos a partir de una poblacin mixta (constituida por ms de una clase de microorganismos) Cultivo, que es el crecimiento de la poblacin microbiana en ambientes artificiales (medios de cultivo), bajo condiciones de laboratorio. Estas operaciones son las mismas independientemente de los microorganismos con los que se trabaje. Para comenzar la identificacin se parte de un cultivo puro3, lo que previamente ha implicado el aislamiento del microorganismo a partir de una poblacin microbiana natural mixta (leche, suelo, etc.). Para obtener un cultivo puro se utilizan tcnicas como el enriquecimiento selectivo y la siembra en placas. El aislamiento para la obtencin de un cultivo puro por mtodos de siembra en placa implica la separacin e inmovilizacin de las clulas individuales sobre un medio nutritivo solidificado con agar. Cada viable da origen, al crecer, a una colonia cuya transferencia puede hacerse fcilmente con ansa. La siembra en estra para la purificacin de cultivos es el mtodo empleado. El inculo4 tomado con el ansa se va agotando progresivamente con cada sucesiva estra. As las estras iniciales proporcionan un crecimiento confluente y a lo largo de las ltimas estras se van desarrollando colonias aisladas. Pero, si toma material de una de estas colonias y se transfiere a un medio apropiado a esto no se le puede denominar un cultivo puro, ya que por cada colonia visible en la primera placa puede haber clulas de otros microorganismos que quedaron depositadas en el agar y no lograron dar un crecimiento macroscpico a pesar que son viables. Por lo tanto nunca se debe tomar la colonia de la primera placa para preparar un cultivo puro, sino que a partir de esta se hace una segunda siembra denominada purificacin. Si todas las colonias de esta
1

Un clon es una poblacin de clulas bacterianas derivadas del crecimiento de una sola clula parental convenientemente aislada.
2

Fenotipo es el conjunto de caracteres hereditarios que se expresan, mientras que se conoce como genotipo a toda la informacin contenida en el genoma de los individuos de una determinada especie, y que no necesariamente siempre se expresa.
3

Cultivo que contiene una sola clase de microorganismos Material microbiano utilizado para sembrar 8

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segunda placa resultan idnticas, una colonia bien aislada puede utilizarse para establecer un cultivo puro. Es necesario que una vez que se logr el aislamiento se mantenga al microorganismo y a su descendencia en un ambiente artificial que impida el acceso de otros microorganismos. Este ambiente se puede crear en la caja de petri o en el tubo de ensayo. Obtenido el cultivo puro es posible hacer la identificacin del microorganismo utilizando los caracteres morfolgicos y bioqumicos y fisiolgicos. Lo ideal sera una descripcin completa de su fenotipo (expresin de los caracteres), o mejor an por su genotipo (informacin gentica). Como metodologa habitual se utilizan criterios de fcil determinacin como los morfolgicos, por su practicidad. Algunos de ellos son forma, tamao, movilidad, reproduccin, tincin a colorantes especiales como la de Gram, presencia o ausencia de estructuras como esporas, cpsulas y flagelos, crecimiento en medios geleficados en los que se puede observar forma, tamao, color y aspecto de las colonias producidas. Sin embargo este criterio ofrece elementos de juicio insuficientes para la caracterizacin definitiva y por lo tanto se tienen en cuenta otros criterios como son los mecanismos fisiolgicos y bioqumicos, entre los cuales se incluyen informacin sobre crecimiento, muerte y supervivencia en diferentes condiciones de cultivo (temperatura de crecimiento, pH, concentracin de sales, etc.), ausencia o presencia de enzimas (catalasa, amilasa, etc.), como toman, utilizan y /o almacenan la energa. Prueba diagnstica Crecimiento a diferentes temperaturas Crecimiento anaerbico Produccin de cidos a partir de carbohidratos Reduccin de nitrato a nitrito Hidrlisis de almidn Utilizacin de citrato Principio Detectar la habilidad para crecer a distintas temperaturas determinando la ptima para el crecimiento. Tambin permite verificar la plasticidad para crecer a diferentes temperaturas Intenta comprobar los requerimientos de oxgeno de los microorganismos Se fundamenta en la produccin de cido durante el crecimiento por la fermentacin de azcares o alcoholes azucarados del medio de cultivo Se fundamente en que algunas bacterias utilizan el NO3- como aceptor alterno de electrones, reducindolo a NO2- o N2 Detecta la presencia de la enzima amilasa, por la formacin de un complejo azul en el medio de cultivo al combinarse el yodo con el almidn Se basa en la capacidad de las bacterias para utilizar el citrato como nica fuente de carbono, pudiendo adems utilizar el N de la sal de amonio del medio, con la produccin de amonaco. Este ltimo compuesto se convierte OHNH4 que alcaliniza el medio por arriba de pH 6.7 virando el indicador de medio de verde a azul