Introduccin

1.1. La preservacin de alimentos mediante la utilizacin de productos naturales. Los consumidores actuales demandan cada vez ms, alimentos sin sustancias conservantes o antimicrobianas sintetizadas qumicamente y asocian alimentos sanos y seguros con alimentos frescos o mnimamente procesados. Esto ha llevado a la bsqueda de nuevas formas de preservacin y al anlisis de sus efectos sobre la estabilidad microbiolgica de los alimentos (Buchanan & Phillips, 1990; Leistner 1992; 1995). La estabilidad microbiolgica y por lo tanto la inocuidad de la mayora de los alimentos procesados (tradicionales y nuevos), est basada en la combinacin de diversos factores (composicin qumica bruta, pH, actividad de agua, temperatura de conservacin, tratamiento tecnolgico, etc). Estos factores controlan el desarrollo microbiano previnindolo, retardndolo y/o incluso inactivando a los microorganismos (Leistner, 1995). La tecnologa de manipulacin de factores implica exponer a los microorganismos a un ambiente adverso y de esta manera inhibir su crecimiento al interferir, mediante la combinacin de los factores, con su homeostasis (Gould, 1988). La homeostasis es la tendencia de los microorganismos a estabilizar su ambiente interno en respuesta a factores externos. Si el equilibrio interno es modificado por los factores de preservacin (actividad de agua, pH, temperatura, aditivos) utilizados en la formulacin del alimento, entonces los microorganismos dejarn de multiplicarse o reducirn su velocidad de reproduccin, canalizando su energa a reestablecer el equilibrio, cuando esto no ocurre puede producirse la muerte del microorganismo. Los diversos factores de preservacin tienen diferentes mecanismos de accin sobre los microorganismos (Leistner, 1995). Uno de los ms tilizados para prolongar la vida til de los alimentos (lapso de aptitud) es el agregado de sustancias que retardan o inhiben la proliferacin microbiana. El conocimiento de la influencia de las sustancias utilizadas as como los efectos de la combinacin de las mismas, puede permitir el desarrollo de procesos mnimos pero ms efectivos para asegurar la estabilidad microbiolgica de los alimentos. Ohlsson (1994) seala que los hbitos alimenticios de los consumidores de esta dcada estn cambiando e identifica aspectos como dieta y salud, conveniencia, seguridad e ingredientes naturales como nuevas tendencias en el mercado de alimentos procesados. En muchos pases se est consolidando el desarrollo y consumo de alimentos ms naturales,
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minimamente procesado, libres de aditivos o al menos con cantidades reducidas de stos (Giese, 1994), por lo que existe un peligro potencial en la seguridad de los alimentos al reducir parte de los factores utilizados habitualmente para su preservacin (Russel & Gould, 1991). Giese (1994) y Davidson (1996) mencionan que la seguridad de los alimentos mejora significativamente con la incorporacin de compuestos antimicrobianos, ya que estas sustancias se aaden a los alimentos para prevenir la descomposicin de los mismos, por la actividad metablica microbiana. Davidson (1996) define a los antimicrobianos como compuestos qumicos presentes o aadidos en los alimentos, que retardan el crecimiento microbiano o inactivan a los microorganismos y por lo tanto, detienen el deterioro de la calidad y brindan seguridad al alimento en el cual se encuentran. El aspecto ms importante de la prdida de la calidad de los alimentos es el asociado con el deterioro microbiano y en particular con la presencia y/o desarrollo de microorganismos patgenos. Esto ha llevado a investigar el uso y modo de accin de conservadores disponibles a fin de emplearlos de manera eficiente y a estudiar su aplicacin al combinarlos con otras formas tradicionales y noveles de preservacin. Los principales antimicrobianos utilizados en alimentos actan principalmente inhibiendo y/o disminuyendo el crecimiento de los microorganismos, aunque algunos pueden tambin desactivarlos (Russell & Gould, 1991; Gould, 1996). Las sustancias empleadas como conservadores se usan esencialmente para prevenir el deterioro de los alimentos durante su almacenamiento y distribucin, asegurando de esta manera, la inocuidad del producto durante el lapso de aptitud establecido. Por lo tanto, el principal objetivo de ataque de estas sustancias sern aquellos microorganismos que puedan desarrollarse y deteriorar los alimentos. Adems, dichas sustancias, se convertiran en un impedimento para el crecimiento de los microorganismos patgenos y productores de toxinas (Gould & Russell, 1991; Davidson, 1996). Numerosos investigadores concuerdan con el hecho de que la evaluacin de aditivos para alimentos debe basarse en un balance entre riesgos y beneficios. Por lo tanto, es fundamental que para cada aditivo, dichos riesgos y beneficios, estn identificados y definidos adecuadamente. Particularmente, en el futuro, sern aptos como aditivos aquellos que tengan o cumplan con varias funciones en los alimentos a los cuales se incorporan (Davidson & Branen, 1993). La bsqueda de nuevos compuestos qumicos que puedan ayudar a la conservacin de alimentos se ha visto restringida por ciertos aspectos,
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principalmente econmicos. En estos trminos, desarrollar un nuevo compuesto y lograr que ste sea aprobado tiene un costo significativamente elevado, sin contar adems, el tiempo considerablemente extenso que demanda el proceso de aprobacin. Para asegurar que el aditivo desarrollado no tiene ningn efecto negativo sobre la salud, se deben realizar una serie de pruebas que incluyen: genotoxicidad, fertilidad, teratogenicidad, toxicidad subcrnica, y toxicidad crnica, incluyendo carcinognesis. Una prueba con resultado positivo descalifica al compuesto para que ste pueda ser utilizado en los alimentos (Lck & Jager 1997). Estos obstculos han conducido a la bsqueda de nuevos conservadores por otras vas. Una de las alternativas, es examinar compuestos que en la actualidad son utilizados en la industria de alimentos con distintos propsitos, los cuales poseen comprobado potencial como antimicrobianos, estn aprobados y son seguros en los niveles utilizados. Dentro de estos compuestos se encuentran los llamados antimicrobianos naturales (o productos naturales) presentes en plantas (Nychas, 1995, Davidson, 1996).

1.2. Compuestos con actividad antimicrobiana presentes en plantas La bsqueda de nuevas alternativas para extender el lapso de aptitud de muchos productos alimenticios ha reorientado la investigacin hacia los productos naturales. Dentro de stos existe un gran inters en el uso de los llamados antimicrobianos naturales como posibles susbtitutos de los tradicionalmente utilizados (Nychas, 1995) y existen varios reportes en la bibliografa acerca de la actividad antimicrobiana de especies, hierbas y plantas o sus extractos (Hitokoto et al., 1980; Shelef, 1983; Jay & Rivers, 1984; Karapinar, 1985; Thompson, 1986; Graham & Graham, 1987; Beuchat & Golden, 1989). Las defensas qumicas cuya funcin principal es proteger a la planta contra los herbvoros o las enfermedades son agrupadas bajo el trmino metabolitos secundarios. En la tabla 1 se pueden observar algunos ejemplos de compuestos con actividad antimicrobiana producidos por plantas y descriptos por Duke (1985). Si bien se ha estimado que las plantas sintetizan cientos de miles de diferentes compuestos metablicos secundarios y que todos los das son reportados otros nuevos, se los ha agrupado en cinco clases de acuerdo a la estructura qumica o segn la forma en que la planta los produce. Los grupos ms comunes son:

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Alcaloides: compuestos cclicos que contienen nitrgeno. Estn distribuidos extensamente entre muchas familias de plantas superiores, donde a menudo son producidos en las races (figura 1a). Su actividad en animales es diversa, pero muchos intervienen como neurotransmisores. Numerosos alcaloides son adictivos (Kutchan,
1995).

Glucsidos cianogenticos: Son substancias orgnicas, tambien conocidas como hetersidos cianogenticos, principios activos de diferentes familias botnicas (Rosaceae, Linaceae, Fabaceae, Euphorbiaceae, etc.). Qumicamente, corresponden a estructuras heterosdicas: su genina, que biogenticamente deriva de aminocidos como fenilalanina, tirosina, leucina, isoleucina y valina, suele ser un aldehdo o una cetona, generalmente el benzaldehdo o la acetona, unidos al cido cianhdrico en forma de hidroxinitrilo. La molcula de azcar reductor se fija por la funcin hidroxlica para formar el hetersido. Ciertas plantas y animales tienen enzimas que hidrolizan y separan el azcar liberando el cianuro, ste acta directamente sobre las mitocondrias inhibiendo la produccin de energa. Glucosinolatos: Comprenden un pequeo grupo de compuestos tambin llamados hetersidos sulfocianogenticos o hetersidos azufrados, son glucsidos que contienen tanto N2 como azufre y se biosintetizan a partir de diversos aminocidos, lo que da lugar a diferentes estructuras qumicas (figura 1c). Su distribucin es limitada, se encuentran principalmente en la familia de las crucferas (Brassicaceae), a las que proporcionan el olor y sabor caracterstico. Compuestos fenlicos: Definidos qumicamente como anillos bencnicos con uno o ms grupos hidroxilo, existen ms de veinticinco mil estructuras llamadas fenlicas, muchas de las cuales son usados frecuentemente como conservantes por su accin antioxidante. En las plantas previenen la oxidacin de las membranas y otros tipos de daos oxidativos. Como defensas, son de sabor desagradable, txicos e inhiben la digestin (figura 1b). Los colores azules y rojos de la mayora de las flores son proporcionados por flavonoides, los robles y el t son ricos en polmeros fenlicos llamados taninos, el olor de la gaulteria es debido a un cido fenlico (metilsalicilato). Ha sido demostrado que estos compuestos tienen efecto antimicrobiano (Toda et al., 1989) sobre un amplia gama de microorganismos, al parecer por su capacidad de acomplejar protenas extracelulares y de la pared celular bacteriana.
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Terpenos: Es el segundo grupo ms importante de compuestos secundarios. Son muy diversos en estructura y actividad, aunque todos surgen del isopreno. La mayora son voltiles e imparten el olor tpico a conferas, mentas y muchas otras especies herbceas y arbustivas. Los triterpenoides, un subgrupo, incluyen muchos compuestos extremadamente amargos, como la curcibitacina de las calabazas y pepinos. Tabla 1: Principales tipos de compuestos antimicrobianos provenientes de plantas
Nombre vulgar Aceite de oliva Ajo Cscara sagrada Cebolla Chamomilla Clavo Eucaliptus Ginseng Henna Liquoriza Quinina Te verde Tomillos Valeriana aNombre cientfico
Olea europaea Allium sativum Rhamnus prusiana Allium cepa Matricaria chamomilla Syzygium aromaticum Eucalyptus globulus Panax notoginseng Lawsonia inermes Glycyrrhiza glabra Cinchona sp. Camellia sinensis Thymus vulgaris Valeriana officinalis cido glico Glabrol .Quinina Catequinas
cido cafeico, timol, taninos

Compuesto
Hexanal Allicina , ajoeno Taninos Allicina cido antmico Eugenol Taninos

Clase
Aldehdo Sulfxido Polifenoles Antraquinonas Sulfoxido cido fenlico Terpeno Polifenoles Saponinas cido fenlico Alcohol fenlico Alkaloide Flavonoides Terpenos, alcoholes fenlico, polifenoles Terpenos

Actividada
General General Virus, bacterias, hongos Bacteria, Candida S. aureus Helmintos General Bacterias, virus E. coli, Sporothrix, Staphylococcus, Trichophyton S. aureus S. aureus, M. tuberculosis Plasmodium spp. General Virus, bacterias, hongos General

Toxicidad relativab ? ? 1.0 ? 2.3 1.7 1.5 2.7 1.5 2.0 2.0 2.0 2.5 2.7

Aceite esencial

Cowan, 1999. General hace referencia a actividad sobre una multiplicidad de microorganismos: bacterias, hongos y protozoarios. b- 0 altamente seguro, 3 altamente txico.

El potencial y ms extendido uso de muchos de estos antimicrobianos naturales parece promisorio dada la demanda de los consumidores. Sin embargo, el reto es aislar, purificar, estabilizar e incorporar estos compuestos a los alimentos sin afectar adversamente la calidad sensorial y las caractersticas de seguridad de los productos (Beuchat y Golden, 1989). Adems, la bioactividad de estos compuestos puede variar dependiendo de la especie o hierba, tipo de microorganismo presente y alimento involucrado (Giese, 1994). La actividad antimicrobiana de las especies y plantas se atribuye generalmente a compuestos fenlicos presentes en los extractos o aceites esenciales de las mismas (Nychas, 1995; Shelef, 1983) y se reconoce que factores como contenido de grasa, potenas, sales, el pH y la temperatura afectan la bioactividad de los compuestos fenlicos (Nychas, 1995; Tassou & Nychas, 1994). Entre los productos naturales ms estudiados se
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encuentran los presentes en plantas, hierbas y especias y dentro de stos los AEs de plantas aromticas.
a)

Coniina Alcaloide piperidinico Conium maculatum

Morfina Alcaloide isoquinolico Papaver somniferum

Atropina Alcaloide tropano Hyoscyamus nger Atropa belladona

b)

cido cafeico cido fenlico Coffea canephora

Hipericina Quinonas Hypericum perforatum

Apigenina Flavones Matricaria chamomilla

c)

Estructura bsica de los glucosinolatos

Glucobrasicina Desulfoglucosinolatos Brassica olerucea

Figura 1: Estructura qumica de algunos compuestos con actividad antimicrobiana: a) Compuestos del grupo de los alcaloides, b) diferentes compuestos del grupo de los flavonoides y c) compuestos del grupo de los glucosinolatos

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1.3. Composicin de los AEs Qumicamente los AEs consisten en gran medida en mezclas de compuestos sencillos llamados terpenos. La palabra terpeno deriva del nombre alemn de la esencia de trementina: terpentin. Existe una gran diversidad de AEs como las plantas que los producen; en la tabla 2 se muestran algunas de los ms conocidos, el lugar de origen de la planta y el mtodo de extraccin ms frecuente (Hili et al., 1997). Se han llegado a identificar en un AE hasta 300 componentes. Las plantas producen mayor cantidad de terpenoides que los animales y los microbios. La produccin, acumulacin, emisin y/o secrecin de grandes cantidades de ellos depende de la presencia de estructuras anatmicas altamente especializadas (Croteau et al., 2000). Katayama y Nagai (1960) reconocieron a los compuestos activos de algunos aceites esenciales como eugenol, carvacrol, timol y vainillina. Se ha reportado que algunos de estos compuestos fenlicos tienen un amplio espectro de efectividad contra los microorganismos, como el timol extrado del tomillo y del organo, el aldehido cinmico extrado de la canela y el eugenol extrado del clavo de olor. Tabla 2: Fuentes botnicas y geogrficas de los AEs
Aceite Anis Basil Bergamota Cardamomo Cilantro Geranio Jazmn Lavanda Pasto limn Mejorana Patchouli Menta Sndalo Tagettes rbol de te Especie
Illicium verum Ocimun basilicum Citrus bergamia Elettaria cardamomum Couianrum sativum Pelargonium graveolens Jasminiun oficinales Lavendula hybrida Cymbopogon citratus Thymus mastichina Pogostemon patchouli Mentha piperita Santalum album Tagettes glandulfera Malaleuca tenifolia

Parte de la planta
Fruto Hierba Cscara Fruto Fruto Hierba Flores Flores Hierba Hierba Hojas Hierba Madera Hierba Hojas

Pas de origen China India Costa de Ivory Guatemala Rusia Egipto Marruecos Francia Nepal Espaa EUA India India Nepal Australia

Mtodo de extraccin
Arrastre de vapor Arrastre de vapor Prensado Arrastre de vapor Arrastre de vapor Arrastre de vapor Extraccin con solvente Arrastre de vapor Arrastre de vapor Arrastre de vapor Arrastre de vapor Arrastre de vapor Arrastre de vapor Arrastre de vapor Arrastre de vapor

Hili et al., 1997

En la figura 2a se observa el hemiterpeno isopreno que contiene cinco carbones (una unidad de isopreno C5H8), es un gas emitido en la atmsfera por muchas especies de plantas, donde juega un importante papel en la qumica del ozono. En el caso de los monoterpenos, stos se subdividen a su vez en tres grupos: acclicos, monocclicos y bicclicos. Un ejemplo de monoterpenos aclicos es el
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hidrocarburo mirceno que se encuentra en las esencias de las verbenceas. El timol es el caso de un compuesto cclico fenlico y su ismero el carvacrol son los componentes principales de los tomillos y los organos.Otros ejemplos de monoterpenos cclicos son el terpineol presente en el cedrn y el mentol (figura 2b) que es caracterstico de algunas mentas (Zygadlo et al., 1994, 1995a; IPGRI, 1996). Los terpenos bicclicos se pueden dividir a su vez en tres clases, segn el tamao del segundo anillo, siendo el primero siempre de seis carbonos. La -tujona es el caso de 6 + 3, los pinenos presentes en las esencia de trementina tienen la conformacin 6 + 4, mientras que el alcanfor se caracteriza por un anillo de 6 + 5 (figura 2c).

a)

Isopreno (monoterpeno)

citronelol

-mirceno b)

Timol

Carvacrol

-terpineol

Mentol

c)

tujona

Pineno

Alcanfor

Figura 2: Estructuras qumicas de diferentes terpenos de acuerdo al nmero de carbonos y a su conformacin espacial. a) unidad isopreno y el monoterpeno citronelol, b) monoterpenos acclicos y cclicos. c) terpenos bicclicos. 9

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1.4. Las micotoxinas: Hongos productores, y su incidencia en alimentos. Las micotoxinas son un grupo de sustancias con estructuras qumicas muy diversas, formadas durante el metabolismo de hongos toxicognicos. La biosntesis de estos compuestos ocurre fundamentalmente cuando el desarrollo del micelio se ha detenido durante la fase estacionaria de crecimiento, y existe limitacin de algunos nutrientes, en presencia de un exceso de fuentes carbonadas disponibles (Sorenson, 1993). Estas toxinas son clasificadas como metabolitos secundarios, debido a que carecen en su mayora de funciones conocidas para la fisiologa del hongo que las produce. Actualmente se cree que estos compuestos podran tener diferentes funciones en la supervivencia de los hongos que les dio origen, inhibiendo el crecimiento de otros microorganismos, participando como agentes que favorecen la simbiosis con plantas, o actuando como hormonas sexuales o factores inductores de diferenciacin (Demain & Fang, 2000). Recientemente se han identificado relaciones genticas entre la esporulacin y la produccin de micotoxinas (Calvo et al., 2002; Shim & Woloshuk, 2001). Algunos metabolitos secundarios, incluyendo los antibiticos, estimulan la formacin de esporas, las protegen en el medio ambiente y pueden favorecer o inhibir su germinacin (Demain & Fang, 2000). Esta observacin hace pensar en la posible relacin beneficiosa para el hongo, entre la esporulacin y el metabolismo secundario. Este ltimo podra favorecer la diseminacin y supervivencia del micelio, proporcionando un mecanismo mediante el cual se reprima la germinacin de esporas, cuando no existen condiciones ambientales favorables para su desarrollo. Aproximadamente cuatrocientas micotoxinas han sido aisladas y caracterizadas qumicamente hasta el presente, producidas fundamentalmente por especies de cuatro gneros fngicos: Aspergillus, Fusarium, Penicillium, y Alternaria (Etzel, 2002). A pesar de esto, no todas las especies includas dentro de estos gneros tienen la capacidad para sintetizarlas y, por otro lado, dentro de un gnero y especie fngica productora de micotoxinas, puede haber cepas que presenten diferente capacidad toxicognica (Magnoli et al., 1998; Magnoli et al., 1999). Estos hongos filamentosos son clasificados como ambientales, y algunos de ellos pueden comportarse como endofitos, e infectar tempranamente a los cereales durante su cultivo en el campo. Debido a su diversidad qumica, las micotoxinas pueden disolverse en las fases lipdicas (fundamentalmente) o acuosas de los alimentos, y difundir al interior de ellos (Hussein & Brasel, 2001; Pitt, 2000). En consecuencia, estas toxinas pueden ser encontradas principalmente en cereales,
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semillas, frutas, y alimentos elaborados en base a estas materias primas; an cuando en ellos no se encuentren elementos fngicos. El maz (Zea mays L.) es uno de los cereales que durante su cultivo puede ser afectado por un grupo considerable de enfermedades producidas por hongos, virus o bacterias, presentndose cada ao con diferente severidad, dependiendo de las condiciones ambientales y del cultivar considerado (Len, 1984). Si se tienen en cuenta solamente las enfermedades producidas por hongos, el vuelco por podredumbres de la raz, tallo, y espiga; pueden afectar la calidad del grano por la acumulacin de micotoxinas (aflatoxinas, fumonisinas, tricotecenos, zearalenona, etc). Los principales hongos responsables de estas afecciones son: Diplodia maydis, D. macrospora, Fusarium avenaceum, F. verticillioides, Gibberella spp., Phytium aphanidermatum, y Macrophomina phaseolina (United States Department of Agriculture, 1980). Adems, las podredumbres del almacenamiento pueden desarrollarse en la espiga o en el maz poscosecha, y fundamentalmente son producidas por especies de Aspergillus niger, A. flavus, A. parasiticus, y A. ochraceus; y por algunas especies de Penicillium, las que se presentan solas o en combinacin con otras especies, principalmente del gnero Fusarium spp. La infeccin por estos hongos se puede producir en el campo durante las ltimas etapas del cultivo, o durante el almacenamiento (Len, 1984; Resnik et al., 1995; United States Department of Agriculture, 1980). Una vez recolectado y acondicionado, el grano de maz puede ser utilizado con diferentes fines. Una parte de la produccin se destina a satisfacer la demanda del mercado internacional, y el remanente se consume en el mercado interno. Durante los ltimos aos, nuestro pas present una tendencia a adquirir el perfil de exportador, debido al notable crecimiento de la produccin, y del escaso incremento del consumo interno, generndose una disponibilidad de mayores saldos exportables. En la ltima dcada Argentina export prcticamente el 50% del volumen total del maz producido (Garca & Della Valle, 2003). Segn datos proporcionados por el Instituto Nacional de Estadstica y Censos, la produccin total de cereales en nuestro pas creci en los ltimos aos un 57,5%; con respecto a datos de la campaa 1995-1996, cosechndose en el 2001 un total de 34.852.000 toneladas, y constituyendo el maz un 45% del total de cereales producidos (INDEC, 2004). El incremento en la produccin de cereales en Argentina se evidencia, adems, al analizar la participacin de nuestro pas en el mercado mundial de cereales, pasando de un 2% a
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comienzos de la dcada del noventa, a un 12,3% del total comercializado mundialmente durante la campaa 1997-1998. Por otra parte, el maz destinado al mercado interno puede ser utilizado para los diferentes tipos de molienda, como simiente, para el consumo humano o animal, todos bajo la forma de grano; y para la constitucin de reservas forrajeras, es decir silaje (Garca & Della Valle, 2003). La poblacin o el consumidor es cada da ms exigente respecto de la calidad de los alimentos elaborados, y en el orden internacional los pases importadores interponen nuevas barreras al ingreso de mercaderas, reduciendo los ndices de tolerancia de sustancias que contaminan el grano y los subproductos de su industrializacin, tales como las micotoxinas, insectos y agroqumicos. Las concentraciones de toxinas fngicas en los cereales estn ntimamente relacionadas con las fluctuaciones de precios en los mercados interno y externo. La especulacin sobre la cotizacin de cereales, y del maz en particular, est normalmente asociada a largos tiempos de almacenamiento de los mismos, utilizando generalmente infraestructura inadecuada. En consecuencia, el maz puede sufrir infecciones adicionales con hongos ambientales micotoxicognicos, aumentando de manera importante sus niveles de micotoxinas, con respecto a las concentraciones existentes inmediatamente despus de la cosecha (Munkvold, 2003). En Argentina existe escasa reglamentacin actualizada sobre los lmites mximos permitidos de micotoxinas en alimentos para el consumo humano o de animales. Actualmente algunas disposiciones internacionales regulan estrictamente los niveles permitidos de estos contaminantes, afectando directamente el comercio internacional y, por lo tanto, a productores y proveedores (Jukes, 2004; Resnik et al., 1995). Desde el punto de vista toxicolgico, la infecciones del maz por Aspergillus spp. y Fusarium spp., adquieren la mayor importancia en la salud humana y animal (Peraica et al., 1999). 1.5. Los gneros Aspergillus y Fusarium: Micotoxinas sintetizadas por estos hongos. El gnero Aspergillus fue descripto por primera vez hace aproximadamente 300 aos. Es extremadamente comn en productos almacenados en regiones tropicales y subtropicales, principalmente granos, nueces y especias; como agente que participa en su descomposicin (Hocking, 1997).
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Aspergillus flavus est ampliamente distribuido en la naturaleza, puede sintetizar aflatoxina B1 (AFB1) (figura 3a), aflatoxina B2 (AFB2), y cido ciclopiaznico; pero solamente una proporcin de 30-40% de las cepas aisladas, son toxicognicas (Abarca et al., 2000). A. parasiticus sintetiza AFB1, AFB2, aflatoxina G1 (AFG1) y aflatoxina G2 (AFG2). Su distribucin a nivel mundial est ms limitada, aunque el porcentaje de aislamientos de A. parasiticus aflatoxicognicos es muy elevado (Hocking, 1997). De acuerdo a Nelson et al. (1983), el gnero Fusarium se agrupa en 12 secciones. Las especies toxicognicas ms comunmente encontradas en alimentos estn includas en las secciones Liseola (F. verticillioides, F. proliferatum, F. nygamai y F. subglutinans), Sporotrichiella (F. sporotrichioides y F. poae), Gibbosum (F. equiseti), y Discolor (F. graminearum y F. culmorum) (Bullerman, 1997). Gibberella fujikuroi (Sawada) es el teleomorfo de muchas de las especies de anamorfos conidiales en el gnero Fusarium seccin Liseola, incluyendo F. verticillioides (Sacc.) Niremberg (ex F. moniliforme Sheldon), F. subglutinans (Wollenweber y Reinking) Nelson, Toussoun y Marasas; y F. proliferatum (Matsushima) Niremberg (Nelson et al., 1983). Segn el concepto de especies biolgicas, F. verticillioides y F. proliferatum pertenecen a las poblaciones de apareamiento A y D, respectivamente. Aunque F. verticillioides y F. proliferatum son los principales productores de fumonisinas, existen especies dentro de Liseola u otras secciones que tambin pueden sintetizarlas, pero en menor grado. Hasta la actualidad se han descripto por lo menos 14 fumonisinas, las que han sido clasificadas en grupos A, B, C, P y H (JECFA, 2001), siendo la fumonisina B1 (FB1) (figura 3b) la ms importante por su incidencia en alimentos, y por los efectos txicos producidos en animales y humanos.

a)

b)

Figura 3: Estructuras qumicas de AFB1 (a) y de FB1 (b).

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Teniendo en cuenta las diferentes infecciones fngicas que puede sufrir el maz durante su cultivo y almacenamiento, la coinfeccin por Aspergillus spp. y Fusarium spp. y, consecuentemente, la existencia simultnea de AFB1 y FB1, puede ser una situacin comn en el maz destinado al consumo humano y animal.

1.6. Las micotoxicosis. Las micotoxinas presentan un amplio rango de toxicidad, relacionado principalmente con la actividad que tienen estos compuestos por s mismos, la va de administracin, el tiempo de exposicin, el sexo, la cepa y la edad de la especie animal afectada (Hengstler et al., 1999). Cuando estas toxinas ingresan al organismo de los animales y humanos se inducen micotoxicosis agudas, subcrnicas, o crnicas; segn la dosis y el tiempo de exposicin a estos compuestos. Las primeras se producen cuando altas dosis de micotoxinas ingresan al organismo en un lapso de unas pocas horas, pudiendo causar la muerte del individuo. En la actualidad raramente se registran casos de micotoxicosis agudas en humanos por el consumo de alimentos contaminados con niveles altos de micotoxinas, encontrndose casos fundamentalmente en algunos pases en desarrollo. Por el contrario, frecuentemente se observan sntomas de intoxicacin aguda luego de la administracin teraputica de alcaloides del ergot (Etzel, 2002). Los otros tipos de intoxicacin, en los que ingresan al organismo cantidades menores de toxinas durante unos pocos meses (subcrnicas) o por varios meses o aos (crnicas), representan el mayor problema para la salud humana y animal en el mundo. Es posible que las micotoxinas presentes en los alimentos, sean responsables de ms muertes humanas que los microorganismos transmitidos a travs de estos (Pitt, 2000). Entre los primeros datos de intoxicacin humana por micotoxinas se encuentran los brotes agudos de ergotismo causados por alcaloides ergticos del hongo Claviceps purpurea, que alcanzaron proporciones de epidemia, conocida como el fuego de San Antonio, mutilando y causando la muerte a miles de personas en Europa, durante la Edad Media. Las vctimas estaban expuestas a la dietilamida del cido lisrgico (LSD), sustancia alucingena que se produca durante el horneado del pan elaborado con trigo contaminado por el cornezuelo del centeno (Peraica et al., 1999). La accin letal de algunos de estos metabolitos secundarios hizo que sean utilizados con fines de bioterrorismo. Uno de los primeros usos de las micotoxinas como armas biolgicas se registr en el siglo VI aC,
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donde los Asirios envenenaban a sus enemigos con centeno contaminado con ergot (Etzel, 2002). En lo que respecta a salud y produccin animal, el inters general por las micotoxinas aument en 1960, cuando se declar en animales de granja en Inglaterra una micotoxicosis aguda transmitida por el pienso, denominada enfermedad X de los pavos, comprobndose posteriormente que era causada por las aflatoxinas (Peraica et al., 1999). Conjuntamente con el consumo de tabaco, la dieta es probablemente uno de los factores ms importantes en la etiologa del cncer humano (Ferguson, 2002), siendo vehculo de una amplia variedad de carcingenos qumicos genotxicos o epigenticos. Estos carcingenos qumicos pueden tener accin directa, ejerciendo el efecto txico sin sufrir previamente biotransformaciones, o comportarse como pro-carcingenos, los cuales son bioactivados en el organismo mediante reacciones "detoxificantes". En el caso de procarcingenos que ingresan por va oral, la bioactivacin ocurre fundamentalmente en hgado, siendo ste el principal rgano blanco de accin (deBethizy & Hayes, 2001). El cncer, segunda causa de muerte en la actualidad en los pases desarrollados, es un grupo de enfermedades de origen multignico y multifactorial; resultado de dos procesos sucesivos: el aumento descontrolado de la proliferacin de un grupo de clulas que da lugar a un tumor o neoplasia; y la posterior adquisicin de capacidad invasiva, que les permite la diseminacin en el organismo y la formacin de metstasis (Lodish et al., 2001).

1.7. Mecanismos de accin txica de fumonisina B1 en humanos y animales. Las fumonisinas, descriptas por primera vez en 1988 (Bezuidenhout et al., 1988), son un grupo de al menos 14 amino-polialcoholes formados esencialmente por una cadena aliftica de 20 carbonos con dos cadenas laterales hidroflicas unidas mediante enlaces tipo ster. En maz, la biosntesis ocurre luego de la infeccin del grano por cepas toxicognicas, principalmente en la fase tarda de madurez en el campo, cuando los granos todava tienen altas actividades de agua. Con menor importancia, las fumonisinas pueden encontrarse en otros alimentos como sorgo, esprragos y arroz. Si existen condiciones desfavorables de almacenamiento, luego de la cosecha pueden incrementarse considerablemente los niveles de estas micotoxinas (JECFA, 2001). Las fumonisinas estn ampliamente distribuidas en la naturaleza, siendo la FB1 considerada como la ms
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abundante y la ms txica de las fumonisinas (Thiel et al., 1992). Las concentraciones de esta toxina en maz pueden variar desde unas pocas ppb, hasta niveles alrededor de 160 ppm (Chu & Li, 1994; Shephard et al., 1996). La estabilidad de FB1 durante el procesamiento de los alimentos es afectada por varios factores, incluyendo la humedad del producto, la concentracin y localizacin de la toxina, la presencia de aditivos, y el tipo de matriz del alimento (Jackson & Bullerman, 1999). Las fumonisinas son muy estables al calor, ocurriendo destruccin significativa de estas toxinas cuando se alcanzan temperaturas superiores a 150 C, aunque la eficiencia del proceso disminuye a medida que se utilizan mayores tiempos de calentamiento (JECFA, 2001). Los estudios realizados hasta el presente sugieren que FB1 no es genotxica, pero tiene una importante accin promotora de cncer heptico, segn se ha demostrado por la induccin de focos -glutamil transpeptidasa y GST positivos en hgado de ratas (Voss et al., 2002). En 1993 la Agencia Internacional para la Investigacin en Cncer ha clasificado a las fumonisinas como compuestos probablemente carcinognicos para humanos (Grupo 2B) (IARC, 1993b). En ratas y en otros animales utilizados en investigacin, cuando FB1 ingresa por va oral, aproximadamente un 4% de la dosis administrada es absorbida en intestino. Luego se distribuye a la mayora de los tejidos desapareciendo rpidamente del plasma, y eliminndose del organismo de acuerdo a un modelo bi o tricompartamental (MartinezLarranaga et al., 1999). La proporcin del gasto cardaco que recibe cada rgano tiene una importancia fundamental cuando se pretende entender por qu hgado y rin son los principales blancos de accin de FB1. Estos dos rganos retienen la mayora de la toxina absorbida (Martinez-Larranaga et al., 1999), siendo en algunos casos ms importante la retencin en hgado, y en otras situaciones se acumula principalmente en rin. No existen evidencias, tanto en estudios in vitro como in vivo, de que FB1 sea metabolizada. La micotoxina absorbida es posteriormente excretada por bilis. Cuando llega a intestino es hidrolizada posiblemente por enzimas microbianas, perdiendo uno o ambos cidos tricarboxlicos laterales; encontrndose en materia fecal la toxina y los productos de la hidrlisis. Mientras que no existen evidencias de que FB1 sea metabolizada por el complejo citocromos p, algunos estudios in vivo e in vitro han demostrado que esta micotoxina puede modificar la actividad de este complejo enzimtico (Spotti et al., 2000).
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Para explicar los efectos txicos de FB1 en animales se han propuesto varios mecanismos, dos de los cuales cuentan con mayor respaldo de evidencia experimental, y es posible que estn estrechamente relacionados. En uno de ellos, la FB1 produce la inhibicin de la ceramida sintetasa, una enzima clave en el metabolismo de los esfingolpidos. En el otro mecanismo, una variacin en las proporciones de cidos grasos y fosfolpidos celulares inducira cambios en la sntesis de eicosanoides, prostaglandinas, leucotrienos y otros derivados oxigenados. La disrupcin del metabolismo de esfingolpidos produce desbalances en el contenido de fosfoglicerolpidos, cidos grasos y colesterol. Segn estas hiptesis FB1 causa directa o indirectamente, un espectro amplio de cambios en el metabolismo lipdico y en las vas bioqumicas de las clulas. Ambas situaciones tienen como consecuencia alteraciones en la sealizacin mediada por lpidos, y en reacciones metablicas importantes para el crecimiento, diferenciacin y muerte celular. (Mobio et al., 2000; Pinelli et al., 1999). Fumonisina B1 posee similitud estructural con algunos sustratos de ceramida sintetasa, produciendo inhibicin competitiva de la enzima. La esfinganina (Sa), una base esfingoide formada durante la sntesis de novo de esfingolpidos, y la esfingosina (So) producida durante el reciclaje fisiolgico de esfingolpidos celulares; son los sustratos naturales de la enzima ceramida sintetasa (JECFA, 2001). Tanto en estudios in vivo como in vitro, se observ que la inhibicin de esta actividad enzimtica por accin de FB1 tiene como consecuencia un incremento rpido de las concentraciones intracelulares de Sa y, en menor grado, de So (IPCS, 2000). Este aumento en los niveles de Sa produce una inversin en la relacin Sa/So intracelular, que puede ser detectada en sangre perifrica y orina, debido a que Sa puede difundir libremente a travs de la membrana plasmtica. En este sentido, se ha estado evaluando la posibilidad de utilizar la relacin Sa/So presente en diferentes muestras biolgicas como biomarcador de exposicin a fumonisinas (Qiu & Liu, 2001). La respuesta a la exposicin a FB1 depende del tipo celular afectado, persistiendo por ms tiempo el desbalance lipdico en hepatocitos y en clulas renales (IPCS, 2000). Wang et al. (1999) realizaron un aporte muy importante para la micotoxicologa de las fumonisinas. En un modelo experimental en ratas observaron que, luego de inducirse el desbalance de lpidos celulares con una dosis de FB1, niveles diez veces inferiores fueron suficientes para sostener este efecto en el tiempo. En otras palabras, los efectos txicos que
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puede tener un alimento que contiene bajas concentraciones de FB1, pueden ser subestimados si quienes los consumen han estado previamente expuestos a mayores cantidades de esta micotoxina. Aunque existen reas geogrficas donde la exposicin humana a fumonisinas es muy elevada, no hay constancia confirmada de una toxicidad aguda por estas toxinas en seres humanos (JECFA, 2001), y no se ha podido determinar su dosis letal en animales de experimentacin. Las fumonisinas han sido descubiertas por los efectos crnicos inducidos en animales de granja. Las primeras publicaciones referidas a FB1 fueron realizadas por investigadores sudafricanos en 1988, que aislaron y caracterizaron la toxina a partir de F. verticillioides MRC 826 (Bezuidenhout et al., 1988; Gelderblom et al., 1988). Durante los aos siguientes se pudo confirmar que estas micotoxinas eran las responsables de la leucoencefalomalacia equina (Marasas et al., 1988), que ya haba sido descripta por Butler en 1902, y del Sndrome de edema pulmonar que produjo la muerte de miles de cerdos en EE.UU. en 1989. Adems, en modelos experimentales en animales, la intoxicacin con FB1 indujo alteraciones en los parmetros nutricionales de cerdos y de ratas (Casado et al., 2001; Dilkin et al., 2003). Sydenham et al. (1990) observaron una relacin directa entre la exposicin a altos niveles de FB1 y una mayor incidencia de cncer de esfago en la poblacin de Transkei, Sudfrica. Observaciones similares fueron realizadas por Chu y Li (1994) en China, y por Doko y Visconti (1994) en Italia. Los resultados epidemiolgicos en los ltimos aos parecen reforzar este concepto, pero en la actualidad no se conoce exactamente de qu manera FB1 participa en la instalacin de los procesos neoplsicos.

1.8. Bioactividad de compuestos de origen vegetal sobre la toxicognesis de algunas cepas fngicas. Ms de 1340 plantas son conocidas por ser fuente potencial de compuestos antimicrobianos, pero pocas han sido estudiadas cientficamente (Wilkins & Board, 1989). Algunos autores han examinado los efectos de los compuestos aislados de AEs de plantas aromticas sobre cultivos fngicos para encontrar fungicidas naturales. Un nmero importante de los constituyentes de estos AEs ha demostrado tener capacidad inhibitoria sobre el desarrollo de las cepas fngicas (Chao & Young, 2000). Aparentemente existira una relacin directa entre la estructura qumica del componente ms abundante en el AE y
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sus efectos antifngicos. Generalmente la capacidad inhibitoria del AE podra ser atribuda a la presencia de un ncleo aromtico, conteniendo un grupo polar funcional (Farag et al., 1989). Alrededor de 30.000 compuestos aislados de AEs de plantas aromticas contienen grupos fenlicos y stos compuestos son los ms utilizados por la industria de los alimentos (Meeker & Linke, 1988). De los AEs mencionados anteriormente, un nmero significativo de publicaciones ha documentado la actividad antimicrobiana del AE de pasto limn, palo rosa, canela, clavo de olor y organo sobre diferentes especies microbianas. Mishra & Dubey (1994) informaron que el AE de pasto limn (Cimbopogon citratus) actu como un fungisttico efectivo sobre 47 cepas de hongos filamentosos, adems estos autores describen que los efectos de este AE sobre Aspergillus flavus son, en algunos casos superiores a fungicidas de sntesis comerciales como el Agrosan, oxicloruro cprico etc. Tambin en A. flavus, se demostr el efecto inhibitorio sobre el crecimiento y la produccin de aflatoxinas de los AE de clavo (Syzygium aromaticum) y la canela (Cinnamomum zeylanicum) (Bullerman et al., 1977; Montes-Belmont & Carvajal, 1998; Sinha et al., 1993). La actividad inhibitoria del AE de organo (Origanum vulgare) sobre el crecimiento de A. flavus, A. ochraceus y A. niger ha sido evaluada previamente por Paster et al (1995) demostrando resultados significativo sobre el crecimiento y la toxicognesis. Soliman & Badea (2002) reportaron la actividad antifncia y antitoxicognica del AE de tomillo (40% de timol) sobre A. flavus, A. parasiticus, A. ochraceus y F. verticillioides. En general varios autores concuerdan en que las concentraciones utilizadas para detener el desarrollo fngico en un sustrato como las semillas almacenadas, son relativamente altas y que deberan desarrollarse experimentos con el objetivo de encontrar la dosis ptima para las especies fngicas que contaminan una especie de cereal en particular. Tambin existe coincidencia en que los componentes minoritarios de los AEs juegan un rol importante en la bioactividad sobre los microorganismos y sobre la estabilidad de los AEs.

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