QUIMERISMO

FUNDAMENTOS BSICOS
Se define como quimerismo a la coexistencia en un mismo organismo de poblaciones celulares originadas en individuos genticamente distintos. En el TPH (Transplante de progenitores hematopoyticos) alognico se induce en el receptor un estado de inmunodepresin que permite la supervivencia de las clulas del donante. Segn la presencia o ausencia de las clulas hematopoyticas del paciente tras el TPH se distinguen dos situaciones: Quimerismo completo, situacin en la que todas las clulas hematopoyticas proceden del donante. Quimerismo mixto, coexistencia de clulas hematopoyticas del donante y el receptor.

Pueden usarse determinados marcadores especficos de injerto que permiten valorar el grado del quimerismo. Las tcnicas ms empleadas son: El estudio del fenotipo eritrocitario o linfocitario (poco sensible) Estudios citogenticos o de FISH (utiles sobre todo cuando existen diferencias de sexo entre el donante y el receptor Estudios de los polimorfimos del DNA (generalmente estudio de microsatelites por PCR)

La tcnica de pintado cromosmico (PC) es una FISH, en la que se utilizan sondas formadas por fragmentos de ADN que corresponden a todas las secuencias nicas de un cromosoma (librera cromosmica). Permite visualizar el cromosoma entero, y por lo tanto detectar monosomas, trisomias, delecciones que afectan a una parte importante del cromosoma y translocaciones.

MTODO
Cultivo celular Bandas G Hibridacin in situ fluorescente (Pintado cromosmico)

MATERIALES
Material comn de laboratorio Centrifuga Falcons Bao Caja metlica Microscopios Solucin hipotnica: KCl 0.075M Zaira Armas Gonzlez, 2 CFL, 01/02/2011

Carnoy: 3 partes de metanol y una de acido actico Colorante Wright Buffer Srensen 20xSSC: 87.75g de NaCl y 44.1g de citrato de sodio dihidratado en agua tridestilada en 500ml, para obtener la 2xSSC se diluye al 1/10 RNAsa solucin madre: 25mg de RNAsa en 2.5ml de 2xSSC se calienta a 100C durante 10min Pepsina solucin madre: diluye 2g de pepsina en 100ml, se aade 500l de HCl 0.01N 10xPBS: 4g de KH2PO4 ,23g de NaH2PO4 y 80g de NaCl en agua tridestilada hasta 1l. Para obtener el 1xBPS se diluye al 1/10 Formamida al 70% en 2xSSC Solucin madre Stop mix DNA humano genmico total DNA de esperma de salmn Ioduro de propidio(IP): solucin madre de 1mg de IP en 1 ml de agua tridestilada

MUESTRAS
Mdula sea Sangre perifrica

PROCEDIMIENTO
1. Cultivo celular: 1.1. Centrifugar muestra a 1200rpm durante 12min (Ver imagen n1) 1.2. Con una jeringuilla de 1 ml se recoge la capa blanquecina 1.3. Colocamos una gota en un eppendorff (para realizar el contaje) 1.4. Se reparten 10x106 millones de clulas en un Falcon que contiene 5ml de medio de cultivo (Ver imagen n2) 1.5. Se cierra el Falcon dejando el tapn algo abierto 1.6. Se coloca en el incubador de CO2 a 37C durante 24h 2. Extraccin del cultivo: 2.1. Se aaden 50l de antibitico colcemid 2.2. Pasado 30 min se pasa el contenido del Falcon a un tubo cnico de centrifuga 2.3. Se centrifuga a 1600rpm durante 12min 2.4. Se elimina el sobrenadante con cuidado de no mover el botn celular 2.5. Se resuspende el botn y se le aade la solucin hipotnica lentamente hasta enrasar el tubo (evitar que queden grumos) 2.6. Se incuba el tubo a 37 durante 30min 2.7. Se hace una prefijacin aadiendo unas cuantas gotas de Carnoy, resuspendiendo bien el contenido del tubo Zaira Armas Gonzlez, 2 CFL, 01/02/2011

2.8. Se centrifuga a 1600rpm durante 12min 2.9. Se elimina el sobrenadante con cuidado de no mover el botn celular 2.10. Se realiza la fijacin de la muestra, se aade lentamente el Carnoy hasta enrasar el tubo 2.11. Se vuelve a centrifugar a 1600rpm durante 12min y se elimina el sobrenadante 2.12. Se vuelve a resuspender el botn con Carnoy y centrifugar hasta que se obtenga un botn celular blanco. 2.13. Tras el ltimo lavado se vuelve a resuspender el botn celular con Carnoy recin preparado (3:1 o 4:1) 2.14. Y se realizan las extensiones: 2.14.1. Se deja caer la gota sobre el portaobjetos desde la mxima altura posible 2.14.2. Se coloca sobre una placa calefactora a 55-60C 2.14.3. Se dejan sobre la plancha hasta que se sequen 2.15. El material sobrante se distribuye en eppendorff para su conservacin a -20C 3. Bandas G (para el estudio del cariotipo)(Ver imagen n3)(Ver anexo n1) 3.1. Se deja envejecer la preparacin durante toda una noche a 65C 3.2. Se incuba las preparaciones en 2xSSC a 65C durante 20 o 30 segundos 3.3. Se tie con el colorante de Wright disuelto en tampn Srense (1:3) durante 2min 3.4. Se lava con agua y se deja secar 4. Tcnica de hibridacin in situ fluorescente (FISH) (pintado cromosmico) 4.1. Se pueden utilizar sondas marcadas comercialmente (anexo n2 marcaje de la sonda) 4.2. Se deja envejecer la muestra 24h 4.3. Con un lpiz de diamante se delimita el rea que se va a hibridar (zona limpia y con abundante metafase) 4.4. Pre-tratamiento: 4.4.1. Se coloca sobre el portaobjetos 150l de la solucin madre de RNAsa 4.4.2. Se cubre con un cubreobjetos de 24x40 4.4.3. Se coloca en una caja metlica y se deja incubar durante 1h a 37C 4.4.4. Se sumerge la preparacin en un bao de 2xSSC hasta que se desprende el cubreobjetos 4.4.5. Se realizan 2 lavados ms en 2xSSC a temperatura ambiente durante 5min 4.4.6. Se incuba la preparacin en un bao de solucin madre de pepsina a 37C durante 5 min 4.4.7. Se realiza un lavado en 1xPBS a temperatura ambiente durante 5 min 4.4.8. Se realiza la post-fijacin en una solucin de formaldehido al 37% a temperatura ambiente durante 10 min 4.4.9. Se vuelve a realizar el lavado durante 5 min 4.5. Se realiza la deshidratacin de la muestra: 4.5.1. Se sumerge la preparacin en una serie de baos de etanol al 70%, 80% y 100% durante 3 minutos cada uno 4.5.2. Se deja secar a temperatura ambiente 4.6. Desnaturalizacin del ADN (tanto de la sonda como de la muestra problema): 4.6.1. La preparacin se sumerge en un bao de formamida al 70% a 72C durante 2min Zaira Armas Gonzlez, 2 CFL, 01/02/2011

4.6.2. Rpidamente se detiene la desnaturalizacin sumergiendo la preparacin en una serie de baos de etanol fros (-20C) al 70%, 80% y 100% durante 3min en cada uno 4.6.3. La sonda: 4.6.3.1. Ponemos 10l de sonda en un porta 4.6.3.2. Se incuba a 70C durante 10min 4.6.3.3. Se mantiene a 37C entre 15min y 2h (hasta momento de hibridar) 4.7. Hibridacin: 4.7.1. Se debe de mantener el rea de hibridacin sellada hermticamente y en condiciones de alta humedad, para ello: 4.7.1.1. Se coloca sobre el rea de la preparacin los 10l de sonda 4.7.1.2. Se cubre con un cubreobjetos de 20x20 4.7.1.3. Se sellan bien los bordes con goma de sellar 4.7.1.4. Se coloca la preparacin en una caja metlica que contiene papel mojado 4.7.1.5. Se deja incubar a 42C durante toda la noche 4.8. Deteccin: 4.8.1. Se retira la cola de los bordes del cubreobjetos con cuidado de no moverlos 4.8.2. Se sumerge la preparacin en un bao de 2xSSC a temperatura ambiente, hasta que se desprenda el cubreobjetos 4.8.3. Se realizan 3 lavados en una solucin de post-hibridacin de formamida al 50% a 45C durante 5min cada uno. 4.8.4. Se lava la preparacin en 3 baos de 0.1xSSC a 45C durante 5min cada uno 4.8.5. Finalmente se realizan 3 lavados en una solucin de Tween20 al 2% en 4xSSC a 45C durante 5min en cada uno 4.9. En algunos casos antes de los 3 ltimos lavados se ha realizado la amplificacin de la seal 4.10. Contra-tincin: 4.10.1. Este es diferente segn el marcaje de la sonda 4.10.2. En sondas marcadas con biotina y detectada con avidina-FITC la seal que se obtiene es de color verde por lo que la contra-tincin utilizada es el propidiun iodide que tie el reto de la preparacin de color naranja, para ello: 4.10.2.1. Se coloca en el portaobjetos 500l de la solucin de propidium iodide y se deja en la oscuridad a temperatura ambiente durante 5min 4.10.2.2. Se lava bien la preparacin con abundante agua del grifo y se deja secar en la oscuridad a temperatura ambiente 4.10.2.3. Se colocan 9l de antifade Vectashield sobre el rea de hibridada 4.10.2.4. Se observa al microscopio de fluorescencia 4.11. Visualizacin de la seal (imagen n4): 4.11.1. La visualizacin al microscopio permite observar en metafase, dos seales de color verde correspondientes al cromosoma que estamos hibridando, si la metafase es normal 4.11.2. Una seal verde o tres seales verdes del cromosoma en cuestin, si el caso presenta monosoma o trisoma. Zaira Armas Gonzlez, 2 CFL, 01/02/2011

4.11.3. Tres seales verdes de diferentes tamaos si presenta traslocacin donde est implicado el cromosoma pintado

ANEXO N1
(Estudio del cariotipo) El cariotipo es un esquema, foto o dibujo de los cromosomas de una clula metafsica ordenados de acuerdo a su morfologa y tamao, que estn caracterizados y representan a todos los individuos de una especie. El cariotipo es caracterstico de cada especie, al igual que el nmero de cromosomas; el ser humano tiene 46 cromosomas (23 pares porque somos diploides o 2n) en el ncleo de cada clula,1 organizados en 22 pares autosmicos y 1 par sexual (hombre XY y mujer XX).Cada brazo ha sido dividido en zonas y cada zona, a su vez, en bandas e incluso las bandas en subbandas, gracias a las tcnicas de marcado.

ANEXO N2
Marcaje de la sonda, mtodo de translation En un tubo de eppendorf para 1g de sonda se aade 5l de 10x dNTP conteniendo Biotin-14-dATP y 5l de una mezcla de enzimas 10x que contiene DNA polimerasa I y DNA polimerasa I/DNAsa I, y 45l de agua destilada Se incuba la mezcla a 16C durante 60min Se aade a la mezcla 50l de stop mix (para parar el marcaje de la sonda) Para eliminar los nucletidos no incorporados a la sonda de DNA se realiza una cromatografa de exclusin por filtracin en columnas de Sephadex, equilibrando las columnas haciendo tres lavados con 100l de TE y centrifugando a 1200rpm durante 5min Se pasa a travs de la columna la mezcla con la sonda marcada y los nucletidos no unidos, y se recoge en otro eppendorf la sonda marcada Al eppendorf con la sonda marcada se aade 2l de la solucin de DNA humano genmico total, 1l de la solucin de DNA de salmn, 10l de acetato de sodio 2M y 250l de etanol al 100% Se deja un mnimo de 30min a -20C y se centrifuga a 12000g durante 15min Se elimina el etanol y se aade 250l de etanol fro (-20C) Se vuelve a centrifugar 15min a 12000g Se elimina el etanol y se deja secar el botn Se aaden 10l de formamida y se resuspende bien Se deja a 37C durante 30min La sonda marcada se puede guardar durante un ao a -20C Zaira Armas Gonzlez, 2 CFL, 01/02/2011

BIBLIOGRAFA

http://es.wikipedia.org/wiki/Cariotipo
http://www.tdr.cesca.es/TESIS_UAB/AVAILABLE/TDX-0514101-122704/obm1de2.pdf http://www.tdr.cesca.es/TESIS_UAB/AVAILABLE/TDX-0514101-122704//obm2de2.pdf Hematologa clnica. Autores: J.Sans-Sabrafen, C.Besses Raebel, J.L. Vives Corrons

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ESQUEMA
Metodologa utilizada en el procesamiento y anlisis de la muestra

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IMGENES

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