Sunteți pe pagina 1din 127

AgO = lant O din LPZ Ag R = miez PZ din LPZ Ag K = capsula Ag H = flagel Ag F = pili 1. Microbiologia. Obiectul de studiu.

Disciplinile microbiologice si obiectele de studiu. Etapele istorice de dezvoltare a microbiologiei. Rolul savantilor A. Leeuwenhoek, L. Pasteur, R. Koch, I.Mecinicov in dezvoltarea microbiologiei. Obiectul de studiu: 1. mi/o si activitatea lor vitala (forma, structura, metabolism, crestere si multiplicare) identificare 2. relatiile mi/o cu mediul ambiant si cu organismul-gazda Scopurile studierii mi/o: 1) patogene, oportuniste = prevenire maladii infectioase 2) utile, inofensive = productie AB, medicamente prin ADNrec (streptokinaza, insulina), alimente (unt, brinza) 3) insecticide biologice 4) fabricare plastic biodegradabil ??? 5) decompunere deseuri, metan Disciplini microbiologice: particularitati biologice mi/o bacteriologie virologie protozoologie micologie, etc habitat mi/o microbiologia solului ... marina ... cosmica implicatii in activitatea umana microbiologia medicala ... veterinara ... alimentara, etc Genetica microbiana Ecologia microbiana Microbiologia medicala studiaza: a) relatia mi/o-gazda umana b) capacitatile patogene mi/o c) capacitatile antiinfectioase organism uman d) metode de diagnostic etiologic al bolilor infectioase e) metode de terapie/profilaxie antimicrobiana Etape istorice in dezvoltarea microbiologiei: I. empirica (pina in sec. 15) II. morfologica (sec. 16-18) A. von Leewenhoek: 1673 prima observare si descriere a mi/o III. fiziologica (sec. 19) L. Pasteur: prepararea vaccinurilor contra antraxului, turbarii, holerei; sustine necesitatea sterilizarii instrumentelor, bandajelor R. Koch: introducerea mediilor de cultura solide; izolare agent antrax, tbc; elaborare teorie despre rolul etiologic al mi/o in bolile infectioase (postulatele lui Koch) I. Mecinicov: argumentare rolul florei intestinale (antagonism); descoperire fagocitoza si rolul antimicrobian al inflamatiei 2. Tipurile de laboratoare microbiologice si sarcinile lor. Regimul si regulile de lucru in laboratorul microbiologic. Clasificarea laboratoarelor in functie de exigenta sigurantei antiinfectioase.

Notiune de microorganisme. Categoriile taxonomice, tipuri acelulare si celulare. Deosebirile dintre microorganismele procariote si eucariote. Mi/o = organisme microscopice (micro-nano- metri) + alge, protozoare, virusuri, agenti subvirali (prioni), cipuerci microscopice (fungi, micete) Clasificari mi/o: fenotipica (prima tentativa Carl von Linne) genotipica filogenetica (bazata pe studiul fosilelor sau al HLA) Grupe taxonomice: domeniu regn increngatura clasa ordin familie gen specie Taxoni infraspecifici din cadrul speciei, care prezinta anumite diferente: biovar (activitate biochimica/fiziologica) serovar (structura Ag) patovar (grad de patogenitate) lizovar (sensibilitate la bacteriofagi) antibiovar (sensibilitate la AB) Rolul taxonilor infraspecifici: markeri epidemiologici! Clasificare mi/o: forme acelulare (virusuri, viroizi, prioni) forme celulare: bacteria = procariote, eubct 1) G2) G+ 3) micoplasme (lipsite de PC) archaea = procariote, PC fara peptidoglican, habitat in conditii extremale eucarya = eucariote (fungi, protozoare) 4. Metodele microbiologice de diagnostic si esenta lor. Metoda microscopica in diagnosticul bolilor infectioase. Tipurile de microscoape, utilizarea practica, particularitatile si rolul uleiului de emersie. Metode microbiologice de diagnostic: diagnostic direct (detectare agent patogen sau a produselor lui) 1. microscopic (orientativ) prezenta bct, nr, forma, structura 2. bacteriologic izolare culturi pure de bct, identificare si testare la AB 3. biologic (experimental) inoculare produs patologic la animale de laborator, provocare maladie tipica 4. depistare Ag mi/o in lichide biologice 5. identificare AN mi/o prin tehnici de biologie moleculara diagnostic indirect (imunologic) 1. serodiagnostic detectare si titrare Ac specifici in serul bolnavului 2. intradermoreactie introducere alergen microbian epidermal/intradermal; reactie pozitiva = aparitie eritem hipersensibilitate specifica (intilnire repetata cu Ag) 5. Morfologia bacteriilor. Grupurile morfologice de bacterii. De desenat. Caracterele tinctoriale ale bacteriilor. Colorantii de baza utilizati in microbiologie. Metodele de colorare. Aplicarea practica. Bct = mi/o, unicelular, procariot, autonom Grupe morfologice de bct: coci: 1. micro 2. diplo (neisseria=bob de cafea, pneumococi=lanceolati) 3. tetra 4. strepto (lant) + enterococcus, lactococcus 5. stafilo (gramezi) 6. sarcine (pachete 8-16-32 coci) bastonase 1. bacterium capete rotunjite, nu formeaza spori (ex. E. coli) 2. bacillus capete retezate, formeaza spori ce nu depasesc diametrul celulei (ex. B. anthracis); posibilitate formare lanturi = streptobacili 2

3.

3. clostridium capete rotunjite, formeaza spori ce depasesc diametrul celulei (ex. C. perfringens) spiralate/incurbate 1. vibrio (ex. V. cholarae) 2. campylo-/helico- bacter = 2 apire. aspect de pasare in zbor (ex. C. jejuni) 3. spirillum = cel. spiralate rigide 4. spirochaeta = cel. spiralate flexibile, 5-25 spire (ex. Treponema, Leptospira, Borrelia) polimorfe (Actinomyces, Rickettsia, Chlamydia, Mycoplasma) 6. Etapele si tehnica de pregatire a frotiurilor din culturile bacteriene crescute pe medii lichide. Tehnica de pregatire a frotiurilor din biosubstrate: sputa si frotiuri amprente. Metodele de fixare. Pregatirea frotiurilor examen microscopic Etape in pregatirea frotiului: 1) etalare material microbian 2) uscare 3) fixare oamoara bct, mareste afinitatea pt colorant 4) colorare asigura contrast intre mi/o si fundal 5) examinare (microscop optic cu imersie) Caracter tinctorial = capacitatea mi/o de a fixa colorantul 7. Etapele si tehnica de pregatire a frotiurilor din culturile bacteriene crescute pe medii solide. Tehnica de pregatire a frotiurilor din biosubstrate: singe, puroi. Metodele de fixare. 8. Structura celulei bacteriene. Enumerati elementele permanente (obligatorii) si nepermanente (neobligatorii) de structura. Membrana citoplasmatica si citoplasma. Structura, compozitia chimica si functiile biologice. Metodele de evidentiere. Elemente permanente: 1. PC 2. MCt 3. Ct 4. nucleoid 5. ribosomi 6. mezosomi G+ (E, citocromi) Elemente nepermanente: 1. capsula 2. spor 3. flageli 4. fimbrii 5. plasmide 6. incluziuni celulare MCt: mozeic fluid Singer lipsa colesterol, contin sterol-like molecules hopanoizi mai bogata in prot. decit eucariotele fctii multiple (la eucariote indeplinite de organite) PBP catalizare transpeptidare si sinteza PC permeaze transport prot. sist. de secretie receptori E lant respirator Rol MCt: 1. Bariera semipermeabila, selectiva difuziune simpla, facilitata 2. Permeaze transport activ 3. E activitate metabolica 4. Metabolism energetic 3

5. Participa la diviziunea celulara 6. Sinteza PG si fosfolipidelor 7. Chemotaxis (R specifici) Mezozomi: cresc S MCt cresc activitatea metabolica, energetica Ct: Lipsesc organitele Prezenta: ribozomi, nucleoid, inclusiuni, plasmide pH acid Rol Ct: sediul proceselor metabolice 9. Peretele celular bacterian, functiile. Particularitatile de structura ale peretelui celular al bacteriilor gram pozitive. Coloratia Gram. Tehnica si mecanismul de colorare. Importanta practica. Exemple de bacterii gram pozitive. PC = invelis rigid ceinconjoara protoplastul; e constituit din PG. PG = mureina = heteropolimer macromolecular, format din 2 parti: Partea glicanica (PZ) = catene liniare paralele: NAG + NAM Partea peptidica = peptide 4*aa (izoforme D si L) legate de NAM protectie de proteaze G-: tetrapeptidele unite direct (bidimensional) G+: tetrapeptidele unite prin punti interpeptidice 5*Gly (tridimensional) Structuri prezente doar la procariote: 1. ac. diaminopimelic (tetrapeptid, la G+) 2. izoforma D aa 3. NAM Fragmente solubile de mureina (PG) interactiune cu toll-likeR/CD14R de pe macrofage secretie citokine soc septic! Rol PC: 1. Protectie de liza osmotica 2. Forma 3. Factor de patogenitate (soc septic) 4. Protectie contra subst. toxice (AgO, E din spatiul periplasmatic) 5. Tinta de atac a unor substante: Lizozim scindare legaturi din catena glicanica (intre NAG si NAM) AB inhibitie proces de transpeptidare PC G+: Componente: PG (tridimensional) 40-80% ac. teichoici (fixati de NAG), ac. lipoteichoici (fixati de MCt) = polimeri de ribitol, glicerol-fosfat; o sarcina electrica negativa o transfer de ioni o fctie Ag o activare complement pe cale alternativa o stimulare secretie citokine o adeziune intercelulara prot. asociate PC o Streptococcus pyogenes = prot. M o Staphylococcus aureus = prot. A (clumping factor), prot. fixatoare de fibronectina Uniform Grosime 80 nm 10. Peretele celular bacterian, functiile. Particularitatile de structura ale peretelui celular al bacteriilor gram negative. Coloratia Gram. Tehnica si mecanismul de colorare. Importanta practica. Exemple de bacterii gram negative. PC G-: Componente: 4

PG (bidimensional) 1-10% MEx: existenta situsuri de comuniune intre MEx si MCt rol in transport o Prot. majore: porine, receptori (pili, fagi) o Prot. minore: E de captare si transport a subst. LP Braun = uneste Mex si PG stabilizare MEx LPZ (cel mai neobisnuit component) stabilizare MEx o Lipid A localizat in MEx; endotoxina (stimuleaza secretia citokinelor) o Miex PZ transport unele subst.; AgR specificitate de gen o Lant O (OZ) sarcina negativa, impiedica fagocitoza; AgO specificitate de specie N.B. Bct au capacitatea de a modifica structura AgO capacitate de a amagi apararea imuna Neomogen Grosime 12 nm Spatiul periplasmatic: E si prot. fixate de MCt Rol e: hidroliza, sinteza PC, detoxifiere (ex. Beta-lactamaze) Coloratia GRAM 1. Violet de gentiana Ct violeta 2. Spalare cu apa, tratare cu sol. Lugol (iodin) formare complex insolubil violet-iodin fixare colorant in celule 3. Tratare cu alcool 95% o eliminare colorant din bct G- pori mai mari in PG, continut mai mare de lipide (solubile in alcool), pH slab acid o mentinere colorant in bct G+ pori mai mici, continut scazut de lipide alcoolul dehisrateaza peretele si reduce diametrul porilor 4. Recolorare cu fuxina apoasa Rezultat: G-: rosu G+: violet Utilizarea coloratiei Gram: a. Diagnostic b. Sensibilitate la AB Forme particulare, osmotic sensibile: Protoplast = G+, fara PG Sferoplast = G-, MCt+MEx, partial fara PG Forme L = bct lipside de PC, din cauza AB, (i)reversibile Mycoplasma lipsite de PC, osmotic rezistente rezistenta marita MCt; forma pleiomorfa 11. Particularitatile de structura si compozitia chimica a peretelui celular al bacteriilor acidorezistente. Coloratia Ziehl-Neelsen. Componentele, tehnica si mecanismul de colorare. Exemple de bacterii acidorezistente. Coloratia Ziehl-Neelsen: 1. Colorare cu fuxina fenicata + incalzire lama pina la aparitia vaporilor 2. Spalare cu apa, tratare cu sol. ac. sulfuric 5% 3. Spalare cu apa, recolorare cu albastru de metilen Rezultat: Acidorezistente: rosu Acidonerezistente: albastru 12. Aparatul nuclear al bacteriilor. Compozitia chimica si functiile biologice. Metodele de evidentiere. Plasmidele bacteriene, tipurile si functiile lor. Aparatul nuclear = nucleoid, ADN bicatenar circular 1 crs N.B. date recente ca V. cholerae contine > 1 crs ADN: pliat n bucle, stabilizat prin ARN i proteine (diferite de histone). Fiecare bucl hiperspiralizat sub aciunea ADN-girazei i topoizomerazei IV (se ntlnesc doar la bacterii). Pe ADN sunt fixate enzime de sintez (ADN - , ARN polimeraze). 5

Metode speciale de colorare (Feulgen): HCl.aldehida.react. Shiff.culoare rosie ??? colorare Plasmide: elemente genetice (ADN) extracromozomiale, capabile de replicare autonom. Confer bacteriei caractere suplimentare. Se transmit celulelor-fiice la diviziunea bacteriei. Plasmidele conjugative F se transmit prin conjugare. Episom - plasmida integrat n cromosom integrat Tipuri de plasmide: F factor de fertilitate, conjugative (sinteza pililor F) R rezisten la antibiotice Ent producerea enterotoxinei Hly producerea hemolizinei Col producerea de bacteriocine Utilizarea practic: n tehnologii de ADN-recombinant 13.Sporii bacterieni. Compozitia chimica si functiile biologice. Etapele sporogenezei. Amplasarea sporului in celula. Exemple de specii patogene sporulate, de desenat. Metodele de evidentiere a sporilor. Bacterii sporogene, G+: Bacillus, Clostridium. sporogene, F. vegetativa = activa metabolic Spor: Inactiv metabolic Coninut sczut de ap liber Coninut mare (pn la 10%) n dipicolinat de calciu Rezistent la temperaturi i pH extreme, desicare, radiaii, ageni chimici i fizici n condiii favorabile sporul germineaz, dezvoltndu-se forma vegetativ. Forma sporului (sferic, oval) i poziia n celul (central, subterminal, terminal) sunt caractere utile n identificarea bacteriilor. Pozitia sporului in celula: central subterminal terminal terminal, cu deformarea celulei Structura sporului: exospor tunica externa = straturi proteice rezistenta la subst. chimice (ex. apa oxigenata) tunica interna ??? cortex = PG inlaturare osmotica a apei dehidratare PC sporal protoplast = nucleoid + ribosomi + E de reparare ADN 15% masa uscata spor = dipicolinat de Ca, localizat in protoplast stabilizare ADN ADN asociat la DNA binding proteins protectie contra temperaturii inalte, radiatiilor, desicatiei Stadiile sporogenezei (durata 36-72 ore); stimul carenta alimetara Stadiul I se formeaz filamentul axial, compus din ADN Stadiul II divizarea asimetric a citoplasmei printr-un sept, formarea presporului, care presporului, conine un filament de ADN. MCt nglobeaz presporul. Stadiul III nglobarea complet a presporului, care este limitat de 2 membrane Stadiul IV formarea cortexului de PG ntre cele 2 membrane Stadiile V-VI formarea tunicii proteice la exterior i maturarea sporului. Uneori se formeaz un nveli extern suplimentar - exosporiu Stadiul VII sporul matur este eliberat iar celula-mam se dezintegreaz Germinarea sporului I. activare (reversibil) II. germinatie III. crestere Evidenierea sporilor: colorarea dup AUJESZKY sporilor: 6

14. Capsula bacteriilor. Compozitita chimica si functiile biologice. Metodele pozitive si negative de colorare a capsulei. Exemple de bacterii capsulate, de desenat. Capsula formata din polimeri organici sintetizati in mediul natural de existenta al bct. Se disting: Capsula adevrat (peste 0,2m), vizibil la microscopul optic Capsula 0,2 Microcapsula, detectat la microscopul electronic Microcapsula, Capsula flexibil (slime, glicocalix), o reea lax de fibre polizaharidice, care difuzeaz n mediu. Nu se evideniaz microscopic. Asigur formarea biofilmelor bacteriene ansamblu Asigur structurat de celule bacteriene nglobate ntro matrice de polimeri de origine bacterian, care poate adera la suprafee inerte (ex.: cateter, stimulator cardiac, endoproteze, sonde de intubare, etc) sau esuturi vii. Compoziia chimic: ap i substane organice (polizaharide, mucopolizaharide, peptide) : Bacillus anthracis acid glutamic Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae PZ Streptococcus pyogenes acid hialuronic Funciile capsulei: 1. Impiedic desicarea bacteriei ([apa] marita) 2. Barier de permeabilitate pentru substane toxice (antibiotice, ioni metalici) antibiotice, 3. Barier protectoare faa de factori antiinfecioi (complement, fagocite), bacteriofagi, protozoare 4. Rezerv nutritiv 5. Aderarea bacteriei la substrat esuturi sau suporturi inerte substrat 6. Specificitate Ag de specie sau tip (Ag K) (Ag K) S. pneumonia: patogenitate marita in prezenta capsulei Evidenierea capsulei Coloraia Burri-Hinss coloratie negativ Coloraia Pe lam se amestec suspensia bacterian cu tu de China, se etaleaz, se usuc Frotiul se fixeaz cu alcool Se coloreaz frotiul cu fucsin apoas apoas Rezultatul: capsula apare ca un halou incolor pe fondul negru. Citoplasma bacteriilor se Rezultatul: coloreaz n rou. Coloraia Romanovski Giemsa (capsula se coloreaz n roz) coloraie pozitiv 15. Flagelii. Structura si compozitia chimica. Clasificarea bacteriilor dupa amplasarea si numarul flagelilor. Metodele directe de studiere si evidentiere a flagelilor. Coloratia Loeffler. Pilii bacterieni, tipurile. Flageli = structuri filamentoase proteice. Rol: 1. mobilitate 2. Ag H Tipurile de bacterii dup dispoziia flagelilor monotriche (Pseudomonas) lofotriche = un mnunchi de flageli la o extremitate (Spirillum) amfitriche = cte un flagel sau un mnunchi de flageli la fiecare extremitate peritriche = flageli pe toat suprafaa celulei (Proteus vulgaris) La spirochete flagelii se plaseaz n spaiul periplasmic flageli interni, periplasmatici. Structura flagel 1. filament = helicoidal, alcatuit din flagelina 2. cirlig de articulatie 3. corp bazal G+ inel intern (MCt) inel extern (PG) G7

disc M (Mct) disc S (spatiu periplasmatic) disc P (PG) disc LPZ (MEx) Sinteza flagel = proprietate de autoasamblare Rotire flagel E. coli = 270/s Motilitatea e determinate de chemotaxis. Bct nu allege directia de miscare, cid oar determina daca trebuie sau nu sa continuie miscarea in aceeasi directie. Evidentierea flagelilor: microscopie electronic coloratie Loeffler (mordansarea cu tanin, sruri de aluminiu, fer, apoi colorarea cu fucsin sau albastru de metilen) Pilii comuni (fimbriile) elemente proteice fine, rigide, scurte, pe bct G-. Structura: prot. pilina, fixate de MEx. Numrul fimbriilor per celul: sute. : Rol pili: 1. adeziunea bacteriilor la suprafee inerte, la celule sau alte bacterii 2. Ag F Pili conjugativi structuri capiliforme de natur proteic, prezeni n numr de 1-10 per celul Pili (codificati de plasmide conjugative F). Rol pili conjugativi: 1. transferul de ADN prin conjugare transferul 2. R pentru unii bacteriofagi Evidenierea pililor: microscopia electronic 16.Metodele indirecte de studiere a mobilitatii bacteriilor. Pregatirea preparatelor native. Metodele de examinare. Principiul microscopiei cu fond negru si contrast de faza. Studierea preparatelor native pictur suspendat sau ntre lam i lamel (microscopia cu contrast de faz sau pe fond negru). nsmnarea culturii bacteriene n medii semisolide (se observ turbiditate) . (se observ Creterea culturii n vl pe suprafaa mediului solid. 17.Granulatiile de volutina. Compozitia chimica si functiile biologice. Metodele de evidentiere. Coloratia Loeffler si Neisser. Mecanismul si tehnica de colorare. Exemple de bacterii cu granulatii de volutina. Importanta practica. Tipuri de incluziuni Ct: glicogen sau PHB (poli-beta-hidroxibutirat) vacuole de gaz plutire (ex. cianobacterii) magnetosomi = incluziuni de Fe sub forma de magnetit --. orientare in cimpul magnetic al pamintului granule de volutina (polimetafosfat) = granule metacromatice La tratarea cu unii colorani bazici granulele de volutin se coloreaz n alt culoare, de ex. n rou-violet la colorarea cu albastru de metilen fenomenul metacromaziei. Rol granule de volutina: 1. rezerva energetic 2. sursa de fosfati sinteza AN 3. scadere presiune osmotic Interesul medical: la agentul difteriei, Corynebacterium diphtheriae, granulele de volutin se medical: agentul localizeaz la extremitile celulei, iar la corynebacterii nepatogene sunt repartizate neuniform n citoplasm. Evidenierea: metoda Loeffler, metoda Neisser 18. Morfologia si ultrastructura spirochetelor. Clasificarea. Metodele de studiere. Speciile patogene si diferenierea lor. 19. Morfologia si ultrastructura micoplasmelor si chlamidiilor. Metodele de studiere. Speciile patogene. 8

20. Notiuni de sterilizare, obiect steril si nesteril. Sterilizarea cu vapori fluizi si sub presiune. Obiectele si regimurile sterilizarii. Controlul eficienei sterilizrii. 21. Notiuni de sterilizare, obiect steril si nesteril. Sterilizarea cu aer fierbinte. Obiectele si regimurile sterilizarii. Controlul eficienei sterilizrii. 22.Notiuni de sterilizare, aseptica si antiseptica. Metoda mecanic de sterilizare. Aplicarea practica. Tipurile de filtre. Conservantii. 23.Metabolismul microbian. Particularitile. Enzimele bacteriene. Clasificarea, rolul in fiziologia microbian. Aplicarea practic in microbiologie. Metabolismul bacterian = ansamblu de reacii biochimice care au loc n celula vie, format din cata- si ana- bolism. Particularitile metabolismului bacterian: 1. metabolism unicelular, necompartimentat (toate procesele metabolice intr-o singur celul) 2. foarte flexibil, diverse ci metabolice (adaptare rapida la condiiile mediului) 3. foarte intens (viteza reaciilor este mare) 4. produsele intermediare din procesele catabolice pot fi utilizate direct n calitate de precursori pentru reaciile anabolice (amfibolism) 5. prezenta catalizatori proteici specifici enzime Caracter special al E bct: active n limite largi de temperaturi (0-65C) i de pH (2-9) Clasificare E: Constitutive, permanente Inductive, adaptive, se sintetizeaz n prezena substratului (ex.: lactaza) Represive, sinteza lor este inhibat de acumularea n exces a produsului reaciei catalizate Dup locul de aciune (exoenzime, endoenzime) Dup tipul reaciei catalizate (oxido-reductaze, hidrolaze, transferaze, liaze, izomeraze, ligaze) Dup impactul asupra ma/o Enzime metabolice Enzime de patogenitate (hialuronidaza, colagenaza, plasmocoagulaza, hemolizina, fibrinolizina, lecitinaza) Importana practic a studierii enzimelor 1. Identificarea i clasificarea bacteriilor (enzimele determin activitatea biochimic specific a bacteriilor) 2. Substrat pt unele AB 3. Determinarea mecanismelor patogenezei infeciilor (unele enzime sunt responsabile de producerea leziunilor n esutul gazdei) 4. Aplicarea industrial a enzimelor 24. Nutriia bacteriilor. Tipul nutriiei si mecanismele transportului nutrienilor in celula bacterian. Clasificarea m/o dupa sursele de carbon. Notiune de m/o saprofite si parazite. Nutriia modalitile prin care bacteriile asimileaz din mediu substanele necesare pentru metabolism. Modul (tipul) de nutriie = absorbtiv. Nutritii se obtin prin solvire (sruri minerale, CO2, O2) sau dup o digestie prealabil (proteine, polizaharide, lipide). Digestia: G+ extracelular G- n spaiul periplasmic Transportul transmembranar 1. Difuzie simpl: O2, CO2, AG, nutrieni liposolubili 2. Difuzie facilitat (permeaze): molecule mari 9

3. Transport activ (proteine de transport specifice = ABCtransportori) 4. Translocaie substratul este modificat (ex.: fosforilat) n timpul transportului membranar; necesit energie. ex. PEP + glucid piruvat + glucid-P 5. transport Fe = secretie siderofori N.B. G-: necesitate traversare prealabila a MEx MEx contine prot. de transport specfice (OmpE, prot. speciale pt vit. B12) Excreia metaboliilor difuzie, proteine de transport, liza bacteriei Necesitile nutritive ale bacteriilor Necesiti elementare, de baz: C, H, O, N n cantiti importante, S, P, Fe, Ca, Mg, K n cantiti mici i urme de Co, Cu, Zn, Mo Necesiti specifice: bct prototrofe = capabile a-i realiza integral sinteza metaboliilor eseniali bct auxotrofe - solicit suplimentar compui organici preformai (factori de cretere), care nu pot fi sintetizai de bacterie (ex.: AA, baze purinice, pirimidinice, vitamine). Prezena lor n mediul de cultur este indispensabil creterii acestor bacterii. Clasificarea bacteriilor dup sursa de carbon Bacterii autotrofe utilizeaz CO2 ca unic surs de carbon (nepatogene) Bacterii heterotrofe utilizeaz carbonul din compuii organici (glucide, acizi grai, alcooli, etc) Bacteriile care utilizeaz materia organic moart sunt saprofite (reciclarea materiei organice) Bacteriile parazite (obligate, facultative) triesc pe contul organismelor vii, aducndu-le prejudicii Bacteriile patogene reprezint parazite care afecteaz grav gazda, provocnd maladie sau moarte. Surse de azot AA sau acizi nucleici Sruri de amoniu, nitrii, azot atmosferic Surse de substane minerale: S - din AA, sulfuri, sulfai; P - din fosfai; K, Mg, Ca, Na - din sruri minerale; Zn, Cu, Mn, Mo din ap 25. Clasificarea m/o dupa sursele de energie. Mecanismele de obtinere a energiei la bacteriile chemoorganotrofe. Clasificarea m/o dupa tipul de respiratie. Exemple. Clasificarea bacteriilor dup sursa de energie fototrofe utilizeaz energia solar (fotosint) chemotrofe folosesc energia degajat din reaciile chimice de oxido-reducere. Ele necesit un substrat donor de hidrogen (e- i H+) i un substrat acceptor de hidrogen. chemolitotrofe donorul de H = substan anorganic chemoorganotrofe donorul de H = substan organic (glucoza, lipide...) Bacteriile patogene sunt chemoorganotrofe Mecanismele de obinere a energiei la chemoorganotrofe n funcie de acceptorul final de H : Respiraie aerob. Acceptorul final este oxigenul gazos. Implic lanul respirator de transport al electronilor asociat MCt. Produs final H2O sau H2O2 . Respiraie anaerob. Acceptori finali compui anorganici (nitrat, sulfat, S). Transportul de electroni prin lanul respirator. Produse finale nitritul, amoniacul, sulfura (n prezena O H2O2). Fermentaie. Substratul organic este metabolizat fr intervenia unui agent oxidant extern. Const n procese de ox-red care realizeaz numai o oxidare parial a substratului, donorul i acceptorul de H+ fiind substane organice. Astfel se ajunge de la un substrat mai redus la o molecul mai oxidat (ex.: fermentare lactic, 10

fermentare alcoolic, acid mixt, acetoinic, etc). Fermentaia se poate desfura n prezena O2, dar fr intervenia acestuia. Clasificarea bacteriilor dup sursele de energie i carbon: Bacterii fotoautotrofe (energie solar, CO2) Bacterii fotoheterotrofe (en. sol., subst.org) Bacterii chemoautotrofe Bacterii chemoheterotrofe (chemolitoheterotrofe, chemoorganoheterotrofe) 26. Cresterea si multiplicarea bacteriilor. Fazele multiplicarii culturilor periodice (discontinue) de bacterii. Cultivarea bacteriilor si conditiile (principiile) necesare pentru cultivare. Creterea mrirea coordonat a masei i volumului structurilor bacteriene ca rezultat al proceselor de sintez. Multiplicarea creterea numrului de celule pe o unitate de suprafa sau de volum. Diviziune binar nmugurire (levuri, ciuperci levuriforme) Autoreproducere (virusuri) Spori (micete) Fragmentare (actinomicete) Ciclul celular procesele care au loc de la formarea celulei pna la urmtoarea diviziune. Faza C replicarea ADN Faza G de laten, segregarea cromozomilor Faza D de diviziune, formarea septului Replicarea ADN depinde de masa critic a celulei, iar separarea cromozomilor i diviziunea intervin n momentul cnd celula atinge o lungime limit. Perioada dintre 2 diviziuni reprezint timpul (perioada) de generaie (TG). Durata TG depinde de specie i de condiiile de cretere (condiii optime vitez maxim). Creterea bacteriilor n laborator cultivare izolare Rolul izolarii bct: 1. Identificarea mi/o (scop de diagnostic) 2. Testatea sensibilitii lor fa de AB 3. Obinere produi de biosintez (AB, aa), bioconversie (hormoni steroizi), fermentare (alcooli, acizi organici, etc), producerea vaccinurilor, probioticelor... Pentru cretere bacteriile au nevoie de nutrieni i condiii fizico-chimice adecvate. Condiiile (principiile) de cultivare: 1. Surs nutritiv adecvat 2. Surs de energie 3. Ap 4. Temperatura potrivit 5. pH adecvat 6. Concentraie optim a oxigenului i a CO2 7. Presiune osmotic adecvat Temperatura de cretere Exist temperaturi minime, maxime i optime de dezvoltare a bacteriilor. n raport cu temperatura optim deosebim: psichrofile t optim 10-20 C. Cresc i la 0 C. mezofile optimum 30-37 C (limite 15-45 C) termofile optimum 50-60 C (pn la 95 C) hipertermofile (cresc la 70110 C) pH neutrofile (majoritatea, inclusiv cele patogene) pH 6-7,5 acidofile pH 2-6 (Lactobacillus) alcalofile pH >8 (Pseudomonas, Vibrio) Presiunea osmotic 11

halotolerante (osmotolerante) cresc n concentraii reduse de NaCl (mediu izotonic cu mediul intern al gazdei) mi/o patogene halofile prefer concentraii mari de NaCl (1-30%) stafilococi, vibrioni (Vibrio parahaemolyticus)

Oxigenul strict aerobe cresc doar n prezena O2. Obin energia prin respiraie aerob microaerofile necesit concentraii reduse de O2 i 2-10% CO2. Obin energia prin respiraie sau fermentaie. Neisseria, Brucella, Campylobacter strict anaerobe cresc doar n absena O2. Obin energia prin fermentaie sau uneori respiraie anaerob. Absena catalazei, superoxid dismutazei, peroxidazei. Clostridium, Bacteroides anaerobe aerotolerante pot crete n prezena O2, obin energia prin fermentaie, posed peroxidaz Lactobacillus, streptococi facultativ anaerobe cresc n orice condiii, obin energia prin respiraie sau fermentaie 27.Mediile de cultura. Principiile de clasificare. Mediile uzuale. Componenta. Destinatia lor. Manifestarea cresterii bacteriilor in medii lichide si solide. MC = soluii/substrate solide, asigur nutrienii i condiiile fizico-chimice pt cultivarea bct. Pot fi utilizate pt: 1. cultivarea (izolarea) bacteriilor 2. testarea sensibilitii la AB 3. stocarea sau transportul culturilor bacreiene. Cerinele fa de MC: a. necesitile nutritive i energetice bct b. umiditate optimal c. pH optimal (7,2-7,4) i constant (caracter de tampon) d. potenial de oxido-reducere optimal (anaerobi - rH2<5, aerobi rH2>10) e. izotonic (0,5% NaCl) f. steril i transparent Clasificarea MC: Dup provenien Empirice, naturale. Au la baz produse de origine animal sau vegetal (snge, ser, lapte, ou, cartof, extracte din carne, cord, creier, ficat, pete, levuri, etc). Compoziia chimic precis nu poate fi controlat. Sintetice includ ingrediente chimice pure, compoziia chimic este cunoscut cu exactitate Semisintetice Dup consisten Lichide (bulion) utilizate pentru obinerea biomasei bacteriene i a produselor lor (AB, E, toxine) Solide conin 10-15% gelatin sau 2-3% agar-agar (polizaharid extras din alge roii, t topire 80-100C, solidificare 42C). Placa de geloz n cutii Petri izolarea culturilor pure; geloza nclinat (n pant) acumularea culturilor pure. Semisolide 0,2 0,5 % agar-agar. Se utilizeaz pentru studierea activitii biochimice sau a mobilitii bacteriilor. Dup compoziia chimic (complexitate) i destinaie Medii uzuale (universale, simple) Ap peptonat (ap+1% pepton+0,5% NaCl) Bulion peptonat BP (extract apos din carne + 1% pepton+0,5% NaCl) Geloza nutritiv (BP + 2-3% agar-agar) Gelatina nutritiv (BP + 10-15% gelatin) Sunt utilizate pentru creterea bacteriilor nepretenioase la cultivare Sterilizarea prin autoclavare: 120C, 20 min Medii complexe: 12

elective selective: pe mediu solid pe mediu lichid = mediu de imbogatire diferential-diagnostice (DD) izolare cultura pura multitest, pt acumulare cultura pura si identificare preliminara identificare finala speciale de transport Medii elective formate din medii simple cu adaos de componente care permit creterea mi/o exigente nutritiv (bulion-ser, bulion glucozat, geloz-snge streptococi, neisserii; ser coagulat corinebacterii, etc) Medii selective medii solide cu adaos de componente sau cu condiii fizico-chimice particulare care stimuleaz creterea unor specii i inhib creterea altor specii (geloza salin stafilococi, geloza alcalin - vibrioni, mediul Ploskirev - Salmonella, Shigella, etc) Mediile de mbogire reprezint medii selective lichide, utilizate pentru mbogirea florei patogene i inhibarea florei de asociaie dintr-un prelevat plurimicrobian (ex: materii fecale) a. Mediul Muller (BP+Lugol+CaCO3+hiposulfit) b. Mediul Kauffmann (mediul Muller+bil+verde de briliant) Salmonella c. Bulion cu selenit Shigella, Salmonella d. Ap peptonat alcalin (pH=8) Vibrio cholerae e. Kitt-Tarrozzi (BP+0,5% glucoz+buci de ficat) pentru anaerobi Medii diferenial-diagnostice (DD) permit diferenierea speciilor bacteriene n baza activitii lor biochimice (zaharolitice, proteolitice, lipolitice, de oxido-reducere) Sunt construite dup urmtoarea schem: Baz nutritiv+substrat+indicator (la necesitate) Medii DD pentru izolarea culturii pure Studierea proprietilor zaharolitice Endo (geloz+lactoz+fucsin+hiposulfit de Na) Levin (geloz+lactoz+eozin+albastru metilen) Ploskirev (geloz+lactoz+rou neutru+sruri de acizi biliari+verde de briliant) Coloniile lactozo-pozitive vor fi colorate (roii pe Endo, Ploskirev, albastru-violete pe Levin) Studierea proprietilor de oxido-reducere Mediul cu sulfit de Bi pentru Salmonella (colonii negre reducerea sulfitului n sulfura de Bi) Mediul Klauberg (geloz-snge cu telurit de K) pentru Corynebacterium diphtheriae Studierea proprietilor lipolitice Geloza cu glbenu de ou bacteriile cu lecitinaz formeaz un halou opac n jurul coloniei Studierea proprietilor hemolitice Geloza-snge (geloza+5-15% snge defibrinat) in cazul hemolizei n jurul coloniilor apare o zon clar Medii DD multitest pentru acumularea culturii pure i identificare preliminar Russel geloz+1% lactoz, 0,1% glucoz, indicator Kligler identic Russel+sulfat de Fe (detectarea H2S) Olkeniki identic Kligler+1% zaharoz+uree Indicatorul Andrede fucsin+NaOH Scindarea glucidelor (acid - A, acid i gaz - AG) duce la modificarea pH i virajul culorii mediului din rou n galben. n pant se apreciaz lactoza/zaharoza (oxidare), n coloan-glucoza (fermentare). Producerea H2S nnegrirea mediului Medii DD pentru identificarea final irul pestri Hiss (lichid sau semisolid): tuburi ce conin soluii 0,5% de diferite glucide i indicator. Aprecierea dup modificarea culorii (acid - A) i apariia bulelor de gaz (acid i gaz AG) Medii cu AA (lizin, arginin, ornitin) i indicatori Medii speciale pentru izolarea unor anumite bacterii (Finn, Popescu, Lowenstein-Jensen pentru agenii tuberculozei, Sabouraud fungi) 13

Medii de transport transportare/stocare material (prelevat). Menine n via bacteriile, fr a favoriza multiplicarea lor. Mediul cu glicerin 30% Soluie tampon-fosfat Soluie NaCl 3% Mediul Cary-Blair Mediul Stuart (NaCl, 0,5% agar, tioglicolat de Na, albastru de metilen) pentru anaerobi, neisserii, etc Pentru cultivarea bacteriilor o cantitate mic de material ce conine bacterii (inoculum) se ntroduce ntr-un mediu de cultur (nsmnare, inoculare), care ulterior va fi incubat n termostat (pentru asigurarea temperaturii optime). n timpul incubrii (18-24-48 ore..) bacteriile cresc i se divid, formnd o cultur bacterian (totalitatea bacteriilor acumulate prin multiplicare intr-un mediu). M.tuberculosis 3-5 sptmni V.cholerae 6-12 ore Cultur pur format din bacterii de aceeai specie (indispensabil identificrii) Cultur mixt compus din bacterii de specii diferite Tulpin populaie microbian constituit din descendenii unei singure izolri n cultur pur, care va fi studiat ulterior. Clon populaie care rezult din multiplicarea unei singure celule Manifestarea creterii i multiplicrii bacteriilor n mediu lichid Turbiditate uniform Formarea unei pelicule la suprafaa mediului (vibrioni, yersinia - agentul pestei) Formarea unui sediment la fundul tubului sau pe perei (streptococi, Bacillus anthracis) n mediu solid formarea coloniilor Colonie o aglomerare de bacterii care se dezvolt dintr-o singur celul sau un grup de celule (UFC - unitate formatoare de colonii) pe suprafaa unui mediu solid. Fiecare specie bacterian formeaz colonii specifice (caracter util n identificare). Caracteristica coloniilor a. Dimensiuni colonii mici (0,1-1mm), medii (1-2mm), mari (2-3mm) b. Contur (margini) neted, ondulat, zimat, lobat, etc c. Suprafa plat, bombat, convex, ombilicat, etc d. Form punctiform, circular, filamentoas, neregulat e. Culoare (pigmentaie) alb, galben, aurie, etc f. Densitate opac, transparent, etc g. Consisten cremoas, untoas, uscat, mucoid Tipurile de colonii Colonii S (smouth) rotunde, netede, umede, lucioase Colonii R (rough) margini neregulate, suprafaa uscat, rugoas Caracterele de cultur ale bacteriilor = exigenele nutritive (medii, temperatur, pH, aerare, etc), viteza i manifestarea creterii pe medii lichide i solide Dinamica multiplicrii bacteriilor n culturi n funcie de modul de dezvoltare a culturilor bacteriene se disting: Culturi discontinue Culturi continue Culturi sincrone Culturile discontinue se obin la cultivarea bacteriilor n volum limitat de mediu. Astfel de culturi sunt obinute i utilizate n laboratorul microbiologic Fazele dezvoltrii unei culturi discontinue

14

I. Faza de lag faza de adaptare la condiiile mediului, bacteriile sunt active metabolic, cresc n dimensiuni, dar nu se divid. Durata este variabil (2-4 ore); depinde de starea bacteriei, condiiile mediului, etc II. Faza logaritmic bacteriile cresc i se divid cu vitez maximal constant, curba evolueaz exponenial. Bacteriile sunt foarte sensibile la ageni antimicrobieni (culturi utile pentru testarea sensibilitii la antibiotice). Durata 8-10 ore. III. Faza staionar rata celulelor care se multiplic scade treptat, numrul celulelor vii rmne constant mai multe ore. Cauza consumarea nutrienilor, acumularea metaboliilor toxici. Morfologia bacteriilor este tipic speciei, apar incluziuni, spori (culturi utile pentru identificare). Sensibilitatea la agenii antimicrobieni scade. Durata 10-12 ore. IV. Faza de declin (letalitate) bacteriile mor progresiv. Cultura continu se realizeaz cnd mediul de cultur este continuu rennoit i mbogit cu oxigen cu evacuarea unei cantiti de cultur. Se realizeaz n chemostate sau turbidostate, cultura aflndu-se permanent n faza exponenial. Se utilizeaz n microbiologia industrial. n intestin culturi continue. Culturi sincrone culturi n care bacteriile se divid n acelai timp. ??? 28.Metoda bacteriologic in diagnosticul bolilor infecioase. Scopul. Prelevate de la pacieni si din mediul ambiant. Principiile de recoltare, ambalare si transportare in laborator. Pregatirea probelor pentru investigatiile de laborator. 29.Examenul bacteriologic. Etapele de izolare a culturilor pure de bacterii aerobe. Volumul de lucru la fiecare etapa. Principiile de identificare a culturii pure. Examenul bacteriologic = inocularea prelevatel pe MC izolare cultura pura identificare, testare sensibilitate la AB, eventual conservare. Etape examen bacteriologic: 1. Faza pre-analitic (responsabilitatea medicului) Prescrierea investigaiei (n funcie de datele examenului clinic i paraclinic). n ordonan se fixeaz identitatea medicului, a pacientului, scopul analizei, manifestrile patologice, locul, data apariiei, alte date: imunosupresie, tratament cu antibiotice, graviditate, etc. 2. Prelevarea probelor Alegerea prelevatului (de la poarta de intrare, locul multiplicrii sau/i din cile de eliminare a agentului patogen) Modul de prelevare (recoltare) : n recipiente sterile Respectnd regulile de autoprotecie La debutul bolii Pn la administrarea antibioticelor 3. Transportarea Imediat sau utiliznd medii de transport, cu respectarea condiiilor speciale dup necesitate n ambalaj special (cutii metalice, pungi din plastic...) n fia de nsoire s fie indicat identitatea pacientului, vrsta, sexul, natura prelevatului, data, ora prelevrii, scopul investigaiei) Materiale de examinat (prelevate) de la pacieni: Secreii rino-faringiene Sput Puroi Exudate Snge LCR Urin Mase fecale Bioptate Material cadaveric 15

Materiale de examinat din mediul extern: Ap Alimente Sol Aer Lavaje Vectori, etc EXAMENUL BACTERIOLOGIC PENTRU CULTURILE AEROBE Prelevatul este supus examenului macroscopic (modificarea aspectului, a mirosului, etc) orientare n diagnostic Dup necesitate, probele sunt supuse pregtirii pentru investigaie (diluare, omogenizare, centrifugare, etc) Examinarea microscopic (preparate native, Gram, Ziehl-Neelsen, Burri-Hinss...) prezena mi/o, forma, cantitatea, G+/-. I etap IZOLAREA CULTURILOR PURE Scopul izolrii - de a obine o cultur pur dintr-un melanj de celule bacteriene sau dintr-un produs patologic. Tehnici utilizate: o Prin epuizarea inoculului pe suprafaa gelozei din cutia Petri (nsmnare n striuri paralele, nsmnare n cadrane, etalarea consecutiv pe trei cutii). o Metoda diluiilor logaritmice a inoculului n geloz topit i rcit la 50 C (10-1, 10-2,...), apoi turnate n cutii Petri sau eprubete. Incubare n termostat la 37 C, 18-24 h (n funcie de TG). Metode speciale de izolare n culturi pure: bct sporulate: nclzirea prealabil a prelevatului 80 C 20 min bct acido-rezistente: tratarea prealabil cu acid a prelevatului i neutralizarea ulterioar cu o baz bct din asociaii cu numr minim de mi/o patogene: mbogirea prealabil a florei patogene utiliznd medii de mbogire bct cu virulen nalt i pretenioase la cultivare: inocularea la animalele de laborator sensibile II etap ACUMULAREA CULTURII PURE Examinarea macroscopic a coloniilor crescute (form, culoare, dimensiuni, etc) Examinarea microscopic (frotiu Gram) a coloniilor suspecte confirmarea puritii culturii Repicarea coloniilor suspecte pe geloz n pant acumularea culturii pure Termostat, 37 C, 18-24 ore III etap IDENTIFICAREA CULTURII PURE Verificarea puritii culturii (frotiu Gram) Identificarea culturii pure const n evidenierea unor caractere specifice ale acestei culturi pentru a o include ntr-o familie, gen, specie, variant Se studiaz caracterele: 1. Morfologice 2. Tinctoriale 3. De cultur 4. Biochimice 5. Antigenice (seroidentificarea) 6. De patogenitate 7. Sensibilitatea la bacteriofagi (fago-identificarea) 8. Sensibilitatea la AB IV etap EVALUAREA REZULTATELOR, FORMULAREA SI ELIBERAREA RSPUNSULUI Compararea rezultatelor obinute cu caracterele speciilor bacteriene cunoscute pentru a gsi asemnri. Exemplu de rspuns: Din proba examinat a fost izolat tulpina de Corynebacterium diphtheriae, biovar gravis, tox+, sensibil la ...., rezistent la ..... STUDIEREA ACTIVITII BIOCHIMICE A BACTERIILOR Activitatea zaharolitic (irul Hiss, coagularea laptelui, etc) 16

Activitatea proteolitic Degradarea proteinelor native (lichefierea gelatinei sau a serului coagulat, peptonizarea laptelui, etc) Evidenierea enzimelor specifice (ureaz, decarboxilaze, dezaminaze, etc) prin detectarea produsele finale ale reaciilor: H2S, NH3, indol o Depistarea producerii H2S: formarea sulfurii de fer de culoare neagr n mediile multitest Kligler, Olkeniki, etc; plasarea unei benzi de hrtie de filtru mbibat cu acetat de Pb deasupra BP n care crete cultura studiat (formarea sulfurii de Pb nnegrete hrtia) o Depistarea indolului (produs al metabolizrii triptofanului) benzi de hrtie mbibate cu acid oxalic. n prezena indolului indicatorul vireaz n roz. o Depistarea amoniacului (ureaza) hrtia de turnesol se coloreaz n albastru. o Depistarea catalazei (H2O2 .... H2O + O2): cultura se amestec cu o pictur de ap oxigenat apariia bulelor de gaz o Depistarea oxidazei (detectarea prezenei citocromoxidazei din lanul respirator) Reactiv di (tetra)metil-parafenilen-diamin (benzi sau rondele de hrtie mbibate cu reactiv, creioane, etc) Oxidarea reactivului culoare violet-neagr Oxidazo+ : Neisseria, Vibrio, Pseudomonas Oxidazo- : Enterobacteriaceae o Depistarea lecitinazei mediu cu glbenu de ou 10% - formarea unui halou opac n jurul coloniilor o Depistarea lipazei mediu cu Twin 80 1% halou opac n jurul coloniilor (precipitarea acizilor grai) o Depistarea hemolizinei geloz-snge 5-10% - zon clar n jurul coloniei o Depistarea ADNazei, fosfatazei, etc Probele sunt incubate la 37 C, 18-24 h Identificarea rapid Utilizarea galeriilor miniaturizate standarde (economie de timp, spaiu, material) Sistemul API o galerie din plastic format din numeroase alveole care conin fiecare un mediu deshidratat diferit (glucide, AA, etc). Alveolele sunt inoculate cu o suspensie bacterian testat i incubate. Ulterior la necesitate se adaug reactive pentru detectarea metaboliilor particulari. Lectura conform unui cod de cifre sau computerizat 30.Metodele de creare a condiiilor de anaerobioz pentru cultivarea anaerobilor. Izolarea culturilor pure prin metoda Zeissler. Volumul de lucru la fiecare etapa. Particularitatile de identificare a culturilor pure. EXAMENUL BACTERIOLOGIC PENTRU CULTURI ANAEROBE (clostridiene, neclostridiene) Condiia principal cultivare n absena oxigenului Utilizarea mediilor anaerobe (Kitt-Tarrozzi regenerat - 100 C, 20 min, rcit, acoperit cu vazelin; nsmnarea n geloz n coloan) Crearea condiiilor de anaerobioz Metoda fizic utilizarea anaerostatului Metoda chimic n exicator se ntroduc substane ce fixeaz oxigenul (pirogalol+baz); utilizarea gas-pachetelor Metoda biologic Fortner cultivarea concomitent a aerobilor i anaerobilor Recoltarea cu precauie, evitnd contactul cu aerul (n seringi, utiliznd medii speciale) I etap MBOGIREA ANAEROBILOR nsmnarea prelevatului n 2 eprubete cu mediul Kitt-Tarrozzi regenerat nclzirea unui tub la 80 C, 20 min distrugerea florei nesporogene Incubarea la 37 C, 24-48 h (va avea loc nmulirea anaerobilor) II etap - IZOLAREA CULTURII PURE DE ANAEROBI Studierea caracterelor de cultur tulburarea mediului, descompunerea bucilor de ficat, etc

17

Izolarea culturii pure de anaerobi prin metoda Zeissler (nsmnarea a 0,1 ml din mediul KT pe 3 cutii cu geloz-snge glucozat consecutiv). Incubarea n anaerostat/exicator/gaspack, 24-48 h Metoda Weinberg diluii succesive a culturii n geloz glucozat lichefiat i aspirarea n tuburi lungi i nguste, nchise ermetic. Incubarea n termostat, 24 h III etap - ACUMULAREA CULTURII PURE Studierea macroscopic a coloniilor Examinarea microscopic (frotiu Gram) a coloniilor suspecte Repicarea n mediul K-T regenerat pentru acumularea culturii pure Incubarea n termostat, 24 h IV etap - IDENTIFICAREA CULTURII PURE DE ANAEROBI Verificarea puritii culturii pure (frotiu Gram) Studierea caracterelor culturii pure izolate (cu respectarea condiiilor de anaerobioz) V etap - EVALUAREA REZULTATELOR, FORMULAREA I ELIBERAREA RSPUNSULUI 31. Antagonismul microbian. Tipurile. Mecanismele. Metodele de studiere. Aplicarea practica. Eubioticele. Exemple. BIOTOP spaiu cu condiii de via particulare (conjunctiva, mucoasa intestinal, orofaringe, vagin, tegument, etc), populat i transformat de asociaii de fiine vii. MICROBIOCENOZ (comunitate microbian) asociaii microbiene ce populeaz un biotop. Microorganismele prezente ntr-un biotop particular constituie microflora acestui habitat (m/f cutanat, intestinal, etc). Aceasta joac un rol important n protejarea gazdei fa de o invazie microbian ulterioar, actionnd prin urmtoarele mecanisme: 1. competiia pentru aceiai nutrieni; 2. competiia pentru aceiai R de pe celulele gazdei; 3. producia de bacteriocine; vitamine; 4. producerea de acizi grai volatili sau ali metabolii; 5. stimularea continu a sistemului imun; 6. stimularea producerii unor factori imuni de protecie (anticorpii naturali). ntre microorganismele unui biotop se pot stabili relaii: Indiferente (neutralism) Favorabile (comensalism/satelitism, simbioz/mutualism, sinergism) Defavorabile (parazitism, antagonism) Antagonism o specie inhib sau omoar alt specie prin mecanisme specifice sau nespecifice Mi/o care manifest activitate inhibitoare antagonist (A), mi/o care sufer concurent (C). Antagonism nespecific: Antagonistul este mai activ, utiliznd nutrienii, oxigenul. Antagonistul produce metabolii toxici (acizi, indol, H2S, amoniac, peroxid, etc). Antagonism specific antagonistul produce substane cu aciune specific asupra unui sau mai multor concureni (AB, bacteriocine). Efectul aciunii unui antagonist asupra concurentului poate fi bacteriostatic sau bactericid (uneori bacteriolitic). Utilizarea practic a antagonismului microbian: 1. depistarea mi/o produceni de antibiotice (micete, actinomicete, bacterii) 2. obinerea produselor biologice curative de origine microbian (probiotice, eubiotice/sinbiotice): Lactobacterina, Colibacterina, Bifidumbacterina, Bificol, etc 3. crearea biocenozelor favorabile organismului METODELE DE STUDIU AL ANTAGONISMULUI n mediu solid (metoda traneei) antagonistul se nsmneaz n centrul cutiei, concurenii perpendicular. Termostat 24h. Aprecierea dup dimensiunea zonei de inhibiie a creterii culturii concurentului. n mediu semisolid I strat antagonistul, II strat concurentul. Termostat 24h. Aprecierea zon clar ntre straturi. nsmnarea n mediu lichid (BP) a unui numr egal de A i C. Dup 24 h de incubaie se rensmneaz 0,1 ml pe placa cu geloz. Se compar numrul coloniilor de A i C.

18

32.Antibioticele. Notiune. Clasificarea dupa producent, spectrul si efectul de actiune asupra celulei bacteriene. Mecanismele de actiune a antibioticelor. Exemple. ANTIBIOTICE (AB) produse de origine natural (microbian, animal sau vegetal), derivai (AB) semi-sintetici sau produse sintetice care inhib sau omoar selectiv unele mi/o sau/i celule tumorale, fr a exercita ca regul efecte toxice asupra macroorganismului. tumorale, Clasificarea AB Dup efectul asupra celulei Bacteriostatic (tetraciclina, cloramfenicol) cloramfenicol Bactericid (streptomicina, polimixina) Bacteriolitic (peniciline, cefalosporine) Dup spectrul de activitate spectru restrns (ngust) de aciune (AB anti-G+, anti-G-, anti-tuberculoase, antimicotice, anti-tumorale) spectru larg de aciune (G+ i G-) Dup producent (origine) fungic (peniciline, cefalosporine,...) actinomiceta (aminoglicozide, macrolide, cloramfenicol, etc) microbian (bacitracina din Bacillus subtilis, gramicidina din Bacillus brevis, polimixina subtilis, brevis, din Bacillus polimyxa) polimyxa) vegetal fitoncidele (alicina, rafanin, imanin) animal (lizozimul din albu de ou, ecmolina din oase de pete, eritrina din mas eritrocitar, splenocitina din splin) Dup compoziia chimic (beta-lactamice, macrolide, aminoglicozide, fenicoli, polipeptide, compozi poliene, sulfamide, chinolone i fluorochinolone, nitrofurani, etc) Mecanismul de aciune al AB o AB cu aciune asupra sintezei peretelui celular (dereglarea sintezei peptidoglicanului) Beta-lactamice (peniciline, cefalosporine). Deregleaz procesul de sintez a PG, inhibnd transpeptidazele (inta - PFP) Vancomicina, teicoplanina (blocheaz transferul pentapeptidului din MCP spre peretele celular) Bacitracina (blocheaz reciclarea moleculelor de transport transmembranar - bactoprenol) Fosfomicina (blocheaz piruviltransferaza, implicat n sinteza acidului N-acetil muramic) Efectul acestor AB este bactericid/litic, doar celulele metabolic active sunt omorte. Nu afecteaz celulele eucariote (lipsa PG). afecteaz o AB cu aciune asupra MEx i a MCt AB polipeptidice (polimixina, colistina). Se fixeaz pe membrane bacteriene (n special pe lipidul A (ME la bacterii G-), provocnd dezorganizarea lor. Efect bactericid. AB polienice (nistatina, levorina, amfotericina B, etc). Se fixeaz pe sterolii MCP ale micetelor, perturbnd respiraia i dezorganiznd MCP (permeabilitate excesiv i moartea celulei). Aceste AB acioneaz i asupra celulelor n repaos. Relativ toxice, n special nefro. o AB cu aciune asupra ribozomilor 30S (aminoside: streptomicina, kanamicina, gentamicina, tobramicina, amikacina; tetracicline) 50S (cloramfenicol, triamfenicol; macrolide: eritromicina, oleandomicina; lincosamide: clindamicina, lincomicina). Se leag pe receptori specifici de pe subunitile 30S sau 50S, perturbnd sinteza proteic (inhibiia transpeptidazei, a translocaiei peptidelor, etc). Rezult inhibiia sintezei proteice sau sinteza proteinelor nefuncionale. Efectul este bacteriostatic (aminosidele bactericid), doar asupra celulelor active metabolic. o AB cu aciune asupra acizilor nucleici Rifampicina inhib ARN-polimeraza ADN-dependent. Rezult stoparea sintezei ARNm Novobiocina , Chinolonele (acidul nalidixic, ciprofloxacina, ofloxacina) blocheaz activitatea Novobiocina topo-izomerazelor, intervenind n conformaia ADN-ului. Efect bactericid. Sulfamidele i trimetoprimul perturb sinteza acidului folic i folailor (cofactori n sinteza AN). Activitate bacteriostatic. Producerea AB 19

Metoda biologic Metoda sintetic Metoda semi-sintetic Etapele metodei biologice: 1. Cultivarea tulpinilor-producente (ex.: Penicillium notatum, Actinomyces griseum, etc) n etc) mediu lichid adecvat 2. Extragerea AB 3. Purificarea i concentrarea AB 4. Controlul toxicitii 5. Determinarea activitii AB Activitatea AB se msoar n uniti de mas (g, mg, g) sau de aciune (UA). 1 UA cantitatea minimal de AB care inhib creterea unei tulpini de referin n condiii standarde. Penicilina 1UA = 0,6 g de substan pur Cerinele fa de AB: 1. Toxicitate selectiv 2. Efect terapeutic cu doze minime 3. Activitate de lung durat 4. Spectru restrns de aciune 5. S fie solubile i absorbite uor 6. S nu provoace efecte secundare 7. S nu se dezvolte rezistena contra AB 8. S fie ieftine 33. Rezistena microbilor la antibiotice, tipurile. Mecanismele rezistenei dobindite si manifestatea ei. Combaterea rezistenei. Cauzele: Factori genetici, proprii bacteriilor Factori ce favorizeaz selecia i difuzarea tulpinilor bacteriene rezistente Tipurile de rezisten: o Natural, ereditar, de specie, prezent la toi membrii unei specii sau gen lipsa intei ex.: micoplasme, micete; imposibilitatea de a atinge inta ex.: Mycobacterium (cerurile, lipidele mpiedic ptrunderea AB n citoplasm); bacteriile nu efectueaz procesul inhibat de AB ex.: acidul folic este preluat din mediu rezisten la sulfamide o Achiziionat, dobndit, afecteaz tulpinile unei specii sensibile. Depinde de aciunea de selecie exercitat de AB utilizate n tratament, urmat de rspndirea ei (ntre bacterii, interuman, transmisie de origine animal). interuman, Diminuarea permeabilitii membranare Modificarea intei moleculare Eliminarea excesiv a AB Inactivarea enzimatic a AB, care poate fi hidrolizat (penicilinaz, cefalosporinaz) sau modificat structural (acetilaze, adenilaze, fosforilaze), etc. Rezistena dobndit se poate manifesta fenotipic (bacteriile n faza de repaos, formele L de bacterii) sau genetic (genotipic) (genotipic) Rezistena genetic poate fi: Cromozomial, determinat de mutaii (10%) Cromozomial, Mecanisme: modificarea intei moleculare, diminuarea permeabilitii membranare Mecanisme: Plasmidic, epidemic, realizat prin transfer de gene prin intermediul plasmidelor R (poate fi Plasmidic, rezisten multipl). Mecanisme: inactivarea enzimatic, modificarea intei, substituia/supraproducia intei, excreie excesiv a AB. Prevenirea rezistenei 1. Supravegherea epidemiologic a tulpinilor rezistente 2. Politic strict de prescriere a AB 20

Respectarea dozelor terapeutice corecte i a timpului de tratament necesar Asocierea AB cu mecanisme de aciune diferite Prescrierea AB care nu sunt sensibile la beta-lactamaze, utiliznd inhibitori (acidul clavulanic, sulbactamul, tazobactamul). Ex.: augmentina amoxicilina+acid clavulanic 6. Reciclarea AB 7. Producerea AB noi Efectele negative ale antibioticoterapiei 1. Efect toxic (streptomicina surditate, cloramfenicolul toxic pentru mduva osoas, polipeptidele nefrotoxice, etc) 2. Efect teratogen 3. Aciune sensibilizant (penicilina, etc) 4. Disbacterioz 5. Dereglarea imunogenezei 6. Selecia suelor rezistente Bacteriocinele substane proteice bactericide produse de numeroase specii bacteriene i active asupra altor tulpini ale aceeai specii sau asupra speciilor nrudite. Producerea bacteriocinelor este determinat plasmidic (plasmide Col). Tipuri de bacteriocine: colicine (secretate de Escherichia coli), corinecine (Corynebacterium), coli), vibriocine (Vibrio), piocine (Pseudomonas), etc. Studiul sensibilitii unei tulpini la bacteriocine (bacteriocinotipia) se utilizeaz n scopuri bacteriocinotipia) epidemiologice. Notiuni de tulpini bacteriene sensibile, intermediare si rezistente la antibiotice. Metodele de determinare a sensibilittii microbilor la antibiotice: difuzimetrica (rondelelor), diluiilor succesive. Noiune de concentraie minim de inhibiie (CMI) si concentraie minim bactericid (CMB). Sensibilitatea microbilor la AB n funcie de rezultatele clinice, bacteriile se divizeaz n 3 clase: sensibile la AB (S), rezistente (R) i intermediare (I, moderat sensibile). Tulpinile S efectul terapeutic este obinut cu doze terapeutice uzuale Tulpinile R efectul terapeutic nu poate fi obinut cu doze terapeutice Tulpinile I succesul terapeutic este imprevizibil. Ar fi posibil cu doze mari sau la administarea local a AB. Fiecare tulpin izolat manifest sensibilitate particular. Ea poate fi studiat n laborator pentru determinarea profilului de sensibiliti al acestei tulpini, ceea ce constituie o antibiogram. antibiogram. Testarea sensibilitii bacteriilor la AB o Metoda difuzimetric (rondelelor). Utilizat uzual n infecii banale. Condiii: mediu standard, concentraie standard de mi/o (105/ml), rondele/discuri (comprimate) cu % standarde de AB, condiii standarde. Mediul este inoculat cu suspensia bacterian. Dup uscare n termostat se aplic rondelele 24h, 37C. 37 Lectura diametrul zonei de inhibiie a creterii culturii bacteriene este comparat cu diametrele standarde pentru fiecare AB. Valori sub acest diametru tulpina este R, dac este depit S. o Metoda diluiilor ntr-un ir de tuburi cu 1 ml BP se efectueaz diluia AB (256 UA, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0,5, etc). Se adaug n fiecare tub (cu excepia celui martor) 0,1 ml de suspensie bacterian 105/ml. Termostat - 24h. Lectura cea mai mic doz de AB care inhib creterea culturii dup 24h de incubare (mediu clar) constituie Concentraia Minim de Inhibiie (CMI) a AB pentru tulpina testat. CMI msoar efectul bacteriostatic. Concentraia Minim Bactericid (CMB) cantitatea minim de AB care omoar 99,9% din inoculum dup 18h de incubare. Determinarea CMB din ultimele tuburi fr cretere se repic 21 34.

3. 4. 5.

0,1 ml de mediu pe placa cu geloz. Dup 24h se compar numrul celulelor ce au supravieuit cu nr iniial de bacterii (105/ml). Corelaia dintre studii in vitro i rezultate in vivo n studii in vitro parametrii (densitatea suspensiei bacteriene, concentraia AB, etc) nu se modific n timp. In vivo, la pacieni, concentraia AB variaz n timp i n funcie de esut. vivo, Pentru a stabili dac tulpina izolat este sensibil sau rezistent la un AB se cere cunoaterea Concentraiei Terapeutice (CT) (cantitatea de AB prezent n focarul infecios n cursul CT) tratamentului cu doze terapeutice) a fiecrui AB testat. Tulpini Sensibile CMI/CT <1, ex.: 2/8, 2/16 - efect terapeutic posibil cu doze uzuale Tulpini Tulpini Rezistente CMI/CT>1, ex.: 8/2, efect terapeutic imposibil CMI/CT> Tulpini Intermediare CMI/CT=1, efect terapeutic imprevizibil. Pot fi utilizate doze maxime de AB sau administrarea lor local Testarea CMI / CMB este indicat n tratamentul infeciilor grave : meningite, septicemii, endocardite, infecii cronice sau la persoane cu imunosupresie. Monitorizatea (supravegherea) tratamentului cu AB. Verificarea eficacitii antibioterapiei. antibioterapiei. 1. Determinarea concentraiilor umorale sau tisulare ale AB Indicaii: Utilizarea unui AB toxic n caz cnd bolnavul sufer de deficiene metabolice sau excretoare (renale, hepatice) Se compar concentraiile obinute cu CMI a antibioticului testat (sau cu CT). 2. Studiul activitii inhibitorii a lichidelor biologice (NEI) Indicaii: infecii grave care nu rspund rapid la tratament. Efectuarea: la diluii duble (1/2, ...) ale lichidului examinat (ser, LCR, urin) se adaug suspensia bacterian (din tulpina izolat de la bolnav). Lectura: dup 24h de incubaie la 37 C se apreciaz diluia maxim cu efect bacteriostatic/cid. NEI 1:8 reflect eficiena antibioticoterapiei 35.Bacteriofagul. Natura. Caracterele morfobiologice. Profagul. Lizogenia. Aplicarea practica a bacteriofagului. Bacteriofagi = virusuri ce infecteaz bacteriile. Parazii intracelulari obligatorii ai bct. acteriof agi virusuri infecteaz ile. Paraz ii intracelulari obligatorii bct. Toate bacteriile pot fi infectate de ctre bacteriofagi. bacteriile po infectate c bacteriof agi In majoritatea cazurilor, un fag anume infecteaz doar celulele unui singur gen, unei anumite cazurilor, infecteaz celulele unui singur nei specii sau a unei tulpini - specificitatea fagului prezena R pt acest fag la suprafaa bctspecii unei specificitate agului prez ena cest sup faa bctgazd . . Structura bacteriofagului Structura Structura fagilor corespunde regulilor generale ce se refer la structura virusurilor. tructura regulilor refer structura virusurilor. 1. Acid nucleic (ADN sau ARN, mai frecvent dublucatenar). nucleic ARN, dublu atenar). 2. Inveli proteic = capsid protecie a materialului genetic. Poseda R la suprafa Inveli proteic protec materia genetic infecia gazdei. Capsida este constituit din subuniti proteice, capsomere, aranjate gazdei. este constituit sub uniti proteice, capsomere, aranjate simetric ntr-o ordine distinct, conferind forma fagului. distinct fagului. 3. Unii fagi pot conine i enzime (ex.: lizozim, neuraminidaza). agi enzi neuraminidaza). Exist 3 forme morfologice principale de fagi: ologic agi Fag icosaedric: form sferic, 20 fee triungiulare, 30 muchii i 12 vrfuri (simetrie cubic a icosaedric eric e triu ngi ulare, v capsidei). Fag cilindric: bastonae proteice formate din capsomere, asamblate ntr-o structur cilindric: bastona proteic formate capsomere, asa mblate ntr-o tubular (simetrie helicoidal a capsidei). Fag complex: constituit din cap icosaedric ataat la o coad helicoidal. Coada este complex: constituit din icosaedric ataat . este format din doua tuburi concentrice, un tub intern rigid - canalul axial, care este inconjurat doua tuburi concentric canalul axial, este de teaca cozii, un manon contractil. Gulerul cozii (colul) se afl la jonciunea capului cu cozii, man afl jonc coada. La partea distal a cozii se afl o plac hexagonal, placa bazal, la fiecare apex La partea afl plac placa baz al, fiind ancorate cte un croet i o fibr. Ele reprezent sistemul de fixare a fagului pe i fibr. reprez stemul fixare agului bacteria receptoare i contribuie la injecia materialului genetic n celul. bacteria receptoare i contribui materia genetic n Nu toi fagii au o astfel de morfologie. Unii au coad lunga i non-contractila, alii - coada to morf nga i non- contractila al scurt, sau far coad . Exist i fagi filamentoi. . agi filamento Interaciunea dintre bacteriofag i celula-gazd 22

Bacteriofagii exist n stare de virioni extracelulari, iar la infectarea unei bacterii ei pot duce la Bacteriofagii virioni extracelulari iar infectarea unei bacterii doua tipuri de infecii: ti de Infecie litic fagii viruleni. La finele ciclului de multiplicare bacteria infectat este li tic agii viruleni finele ci clului multiplicare bacteria infectat lizat elibernd fagii nou-formati. libernd agii nou-formati. Infectie nelitica sau lizogen fagii temperai (moderai). Ei infecteaz bacteriile nfectie lizogen agii tempera (modera i). infecteaz ile fr a le distruge. istrug INFECTIA LITIC (ciclul biologic al fagului virulent) INFECTIA LI TIC clul biologic agului Adsorbia. ciocnire intmpltoare fagul se fixeaz prin intermediul plcii bazale (la inceput Adsorb ia. int mpl agul fixeaz intermediul plcii baz (la prin fibrele sale, apoi prin croete) de un R specific de pe PC bacterian (uneori flageli sau pili). fibrele sale, apoi cro ete) de specific bacteria pili). Penetrarea. fixare ireversibil a fagului pe PC aciune E (ex. lizozim) perforare PC Penetrarea. ireversibil fagului (ex. lizozi contracie manon apropiere cap de placa bazal canalul axial penetreaz MCt ADN man apropiere placa baz canalul penetreaz fagic este injectat in bacterie. agic este injectat Expresia genomului viral (biosinteza componentelor fagice, maturizarea). penetrare Expresia genomului maturizarea). penetrare ADN viral n bacterie (fag vegetativ) timp de aproximativ 12 minute virionul nu este n vegetativ) virionul depistat n bacteria infectat = faza de eclips. Ea coincide cu sinteza enzimelor virale care vor bacteria infectat de eclips. coincide si nteza enzi melor asigura ulterior: ulterior: replicarea ADN fagic; replicarea agic sinteza proteinelor fagice; nteza proteinelor agice; asamblarea acestor elemente. mblar elemente Asamblarea fagilor. sinteza compui capsida i AN n cantiti suficiente asamblarea Asa mblar agilor. compu cantiti spontan a particulelor noi de fagi, prin incorporarea acidului nucleic n capsid . spontan nucleic n . Eliberarea. Majoritatea fagilor, dup maturizare, sunt eliberai n urma lizei peretelui bacterian Eliberarea. fagi zare, su libera n lize pe bacteria cu enzime ale bacteriofagului Timpul dintre infectie i eliberare (ciclul de reproducere) este de 20-60 minute la 37C, fagii Timpul dintre infectie i liberare este de agii sunt eliberai n valuri de 50-1000 fagi per celul. libera n val agi pe INFECTIA NON LITIC SAU LIZOGEN : FAGII TEMPERAI INFECTIA LI TIC LIZOGEN AGII TEMPERA Fagii temperai (moderai) atunci cand infecteaz o bacterie pot: agii tempera infecteaz po 1. sau induce un ciclu complet de multiplicare, ce duce la liza bacteriei, ci clu multiplicare, bacteriei 2. sau, mai frecvent, dup injectarea ADN-ului, s integreze acest ADN n cromozomul DN-ului, integreze acest n cromoz omul bacterian prin recombinare specific, formnd un profag (lizogenizare) bacteria specific, formnd prof 3. sau sa ramn n Ct sub form de plasmid. ram sub plasmid. In ultimele dou cazuri bacteria nu moare i, multiplicndu-se, replic genomul viral dou bacteria nu moar multiplic ndu-se, replic concomitent cu propriul su genom: bacteria (cultura) este numit lizogen. Ea posed i propriul s bacteria este izogen. transmite descendenilor capacitatea de a produce fagi n absena infeciei. transmi descende nilor produc fag absena ei. Proprietile culturilor lizogene Proprietile lizogene Inducia ciclului litic. Profagul pstreaz virulena potenial. Meninerea strii de lizogenie Induc litic. p streaz virulen poten ial Men st lizogenie implic sinteza unui represor proteic, codificat de fag. Dispariia lui duce la inducia ciclului litic. implic ciclului li tic. Inducia se poate declana spontan la un numar limitat de celule sau poate fi provocat la oat declan poat provocat majoritatea celulelor, de ex., la aciunea unor mutageni, ca razele ultraviolete sau mitomicina majoritatea celulelor, ex. ac mutageni, ca razele ultraviolete mitomi cina C. Sistemul SOS activat prot. RecA scindeaza represorul proteic al fagului expresia ciclului stemul activat represo proteic agului expresia ci clului litic. Pentru aceasta profagul trebuie sa fie excizat - operaie invers integrrii. Excizia este tic aceasta prof agul excizat rii. xciz este efectuat de ctre proteina xis, codificat de fag. Urmeaz replicarea genomului, sinteza efectuat proteina xis, codificat Urmeaz genomului, componentelor fagului i fagii asamblai sunt eliberai prin liza celulei (profagul - gen potenial ent ului i agii asa mbla su a prin liza celulei (pr compon ag liber letal !). ! n timpul replicrii fagului moderat fragmente de ADN bacterian pot fi ntroduse din eroare n particulele virale. Aceti fagi pot n continuare ntroduce n cromosomul altor bacterii ADN continuare bacterian capturat = proces de transfer genetic = transducie. Natura genelor bacteriene transferate poate fi diferit: gene din apropierea locului de inserie a fagului (transducie specific) sau fragmente de ADN bacterian ntroduse din ntmplare n capsida fagului (transducie generalizat) Imunitate contra suprainfectiei. Bacteriile lizogene sunt imune la fagul virulent omolog munitate contra suprainfectiei. Bacteriile lizogene su agul profagului gzduit. Acest fag se adsoarbe, injecteaza ADNul, dar fr a se replica sau provoca g zduit. Ace se soa injecteaza DNul, liza. liza. Conversie fagic (modificarea fenotipului celulei cauzat de genele profagului). 23

Bacteriile infectate cu un fag pot prezenta unele caractere absente la celulele neinfectate. acteriile infectate po prez enta celulele ne infectate. Conversie fagic cauzat de: onversie agic cauzat 1. expresia unor gene ale fagului de ctre celule expresia agului c 2. inactivarea unor gene cromozomale la integrarea profagului. inactivarea cromoz omale integrarea pro agului. De ex., tulpinile de Corynebacterium diphtheriae care provoac difteria sunt lizogenizate de un ex. provoac teria su lizogenizate anumit tip de fagi care codeaza i exprim o toxin puternic; toxina eritrogen a ti agi codeaza i Streptococcus pyogenes, etc pyogenes, Cultura i titrarea bacteriofagilor. Efectul fagilor viruleni asupra culturilor ultura i titrarea bacteriofagilor. fec agilor viruleni sup culturilor bacteriene Bacteriofagii sunt cultivai n laborator n mediu de cultur lichid sau solid n prezena bacteriilor cultiva cultur omologe. omologe. Cultivarea n mediu lichid: mediu Bacteriile sensibile i fagii se ntroduc ntr-un bulion nutritiv (nr fagi < nr bct). Amestecul este (nr bct). incubat pentru a permite bacteriilor s se multiplice i de a fi infectate de ctre fagi numrul s c num fagilor crete mai rapid dect cel al bacteriilor pn la un punct critic cnd numrul fagilor cre dec p c num prezeni este suficient pentru a infecta toate bacteriile culturii. Toate celulele bacteriene sunt prezen lizate n acelai timp, ce duce la dispariia complet a turbiditii culturii (clarificarea mediului). acela dispari complet turbiditii Cultivarea fagilor n mediu solid: Amestecul bacterii-fagi poate fi adugat la geloza topit i Amestecul ad rcit la 45 C i apoi turnat n cutia Petri. Bacteriile cresc, se multiplic, formnd o pelicul cresc, fin, iar fagii continu s infecteze provocnd liza confluent a culturii bacteriene. Aceste continu s provoc confluent colonii de fagi se manifest sub forma unor pete sterile (plaje). Numrul plajelor indic numrul fagilor infecioi n prelevat (fiecare colonie se formeaz pe contul multiplicrii unui virion fagic). Bacteriofagii pot fi intlnii n diferite prelevate umane sau din mediul extern. Fagii indic Bacteriofagii prezena bacteriilor sensibile. IZOLAREA BACTERIOFAGILOR Prelevate: ap, sol, materii fecale, puroi, etc Izolarea direct filtrarea prelevatelor prin filtre bacteriene, ultracentrifugare. Izolare prin metoda de mbogire fr nsmnare materialul de examinat se inoculeaz ntr-un mediu nutritiv lichid (pentru multiplicare bacteriile omologe fagului cutat). Peste 10 ore de incubare la 37 C bulionul este supus filtrrii. In filtrat s-au acumulat fagii care 37 s-au inmulit pe contul bacteriilor omologe din prelevat. Izolare prin metoda de mbogire cu nsmnare inocularea prelevatului ntr-o suspensie bacterian omolog fagului cutat. Cultura bacterian asigur mbogirea fagilor. Peste 10 ore de incubare la 37 C bulionul este supus filtrrii. 37 INDICAREA BACTERIOFAGILOR Metoda OTTO. Pe placa de geloz din cutia Petri se nsmneaz n gazon suspensia de OTTO. bacterii omologe fagului. n continuare se aplic o pictur de filtrat care conine fag (cutia poate fi nclinat ca pictura s se preling). Cutia se incubeaz la 37 C timp de 24 ore. Aprecierea: dac n filtrat se aflau fagi omologi culturii bacteriene, n locul aplicrii filtratului se Aprecierea: observ o zon de liz (colonie negativ de fag). Metoda FURT. Filtratul ce conine fagi se amestec cu geloz topit i se toarn n cutia Petri. FURT. Suprafaa cutiei se mparte n 4 sectoare. n fiecare sector se nsmneaz n striuri culturi cunoscute de diferite bacterii. Incubare la 37C 24 ore. 37 Aprecierea: lipsa creterii bacteriilor ntr-un sector indic prezena fagului omolog. Aprecierea: Metoda FISHER Similar cu metoda Furt, doar c suprafaa cutiei se mparte n 10 cadrane, astfel pot fi nsmnate 10 culturi bacteriene i pot fi indicai concomitent mai muli fagi. TITRAREA BACTERIOFAGILOR Este utilizat pentru determinarea numrului de fagi viruleni n prelevat sau cultur. Metodele de titrare a bacteriofagului Titrarea bacteriofagului n mediu lichid (metoda Appelman) Titrarea bacteriofagului n mediu solid (metoda Gratia) 24

APPELMAN la diluii logaritmice a culturii de fag (10-1.....10-10) n bulion peptonat se adaug suspensie bacterian omolog fagului examinat. Dup 24 ore de incubare la 37 C se apreciaz titrul fagului: diluia maxim a fagului care nc mai provoac liza bacteriilor (mediu clar). fagului: dilu GRATIA. Dup diluia logaritmic a fagului i adugarea culturii bacteriene, coninutul fiecrui tub se amestec cu geloz topit i amestecul se toarn n cutii Petri. Dup 24 ore de incubare la 37C se numr plajele formate (coloniile negative de fagi). Numrul plajelor corespunde cu 37 nr de fagi viruleni din materialul de examinat. APLICAREA PRACTIC A FAGILOR n domeniul terapeutic Tratamentul i profilaxia maladiilor infecioase n domeniul diagnostic Fago-identificarea identificarea tulpinilor bacteriene necunoscute cu ajutorul fagilor omologi (metoda Otto, Furt, etc) Lizotipizarea (fagotipajul). Permite diferenierea unor tulpini din cadrul aceleeai specii (subdivizarea speciei n lizotipuri/fagovaruri). Este utilizat pentru tulpini de Staphylococcus aureus, Salmonella Typhi, .a. Lizotipul reprezint un marker epidemiologic. Fagii reprezint un model de studiu pentru geneticieni, fagii temperai se utilizeaz n ingineria genetic (ei pot asigura transferul de material genetic prin transducie). 36. Virusurile. Natura. Particularitile biologice. Principiile de clasificare. Forma si dimensiunile virusurilor. Metodele de studiu. Virusuri = gene vagabonde = particule infectioase autonome, caracterizate prin : 1. structura speciala : proteine + AN 2. lipsa sist. metabolice 3. myxovirusuri : AN + capsida = nucleocapsida reovirusuri : ARN dublu catenar Particularitile virusurilor Reprezint structuri acelulare cu potenial infecios Sunt lipsite de metabolism propriu, fiind parazii obligai intracelulari Nu cresc pe medii artificiale, numai pe celule vii Genomul viral este constituit dintr-un singur tip de AN (ADN sau ARN) Nu cresc i nu se divid, ci se reproduc n celule vii Dimensiuni de rangul nm (20-400 nm) Rezisten natural la antibiotice Rol capsida : 1. adsorbtie (exceptie virusuri cu supercapsida) 2. antigenitate virala specifica ??? Virusurile cu supercapsida realizeaza absorbtia prin intermediul ei utilizarea detergentilor pt inlaturararea supercapsidei inlaturare virulenta. CLASIFICAREA VIRUSURILOR Dup tipul AN (cu genom ARN/ADN) Dup dimensiuni (mici 20-50 nm, medii 50-150 nm, mari peste 150 nm) Dup tipul de simetrie a capsidei (helicoidal, cubic, mixt) Dup gazd (om, animal, insect, bacterie) Dup sensibilitatea n mediul extern, etc Virusuri ADN : Parvoviridae, Hepadnaviridae, Adenoviridae, Herpesviridae, Poxviridae Virusuri ARN+: Picornaviridae, Caliciviridae, Togaviridae, Flaviviridae, Coronaviridae, Retroviridae Virusuri ARN- : Rhabdoviridae, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae, Filoviridae Virusuri ARNd.c. : Reoviridae Virion unitate structural infecioas a virusului Viroid ARNm.c., circular, asociat cu boli la plante 25

Prion protein termostabil infecioas, cauzeaz la om boala Kuru, Creutzfeldt-Jacob, sindromul Gerstmann-Straussler, scrapie la oi COMPOZIIA CHIMIC I STRUCTURA VIRIONULUI Virusurile simple AN i nveli proteic capsida (nucleocapsid) Virusurile complexe nucleocapsid i un nveli extern, lipoglicoproteic (supercapsid, peplos) AN ADN sau ARN, mono- sau bicatenar, linear, circular sau fragmentat. ARN monocatenar : ARN+ (caten cu sens, ARNm) sau ARN- (caten fr sens) Funcia AN asigurarea replicrii i expresia genomului pentru sinteza proteic Capsida format din uniti proteice, capsomere, aranjate simetric. Simetrie helicoidal capsomerele se fixeaz pe catena de AN, form de bastona Simetrie cubic (icosaedric) capsomerele se aranjeaz n jurul AN, formnd un icosaedru (poliedru regulat cu 20 fee triungiulare i 12 vrfuri), eikos=20 Simetrie mixt (bacteriofagii, poxvirusurile) Funcia protecia AN, rol antigenic, adeziune Supercapsida structur glucido-lipido-proteic, derivat din membrana celulei gazd (lipidele din membrana celular, glicoproteinele proprii) Funcie protecie, antigene de suprafa, adeziune Unele virusuri conin enzime polimeraze, transcriptaze, etc. Aciunea factorilor fizici, chimici Virusurile sunt foarte sensibile la cldur, desicare, UV. Detergenii i solvenii inactiveaz virusurile cu supercapsid. Pot fi conservate prin liofilizare sau la -80 C REPRODUCEREA VIRUSURILOR I ADSORBIA virusului la celula-gazd prin intermediul receptorilor specifici (tropism) II PENETRAREA virusului n celul Pinocitoz (viropexis) Fuziunea membranelor Translocare Injectarea AN n citoplasm III DECAPSIDAREA (enzime celulare) IV BIOSINTEZA (sinteza proteinelor i replicarea AN) Are loc n citoplasm (virusuri cu ARN) sau nucleul celulei (virusuri cu ADN) Biosinteza virusurilor ADN ADNdc transcrierea ARNm translaia (precoce, tardiv), replicarea sinteza proteic Biosinteza virusurilor ARN ARN+ translaie, replicare sinteza proteic ARNtranscriere ARNm translaie, replicare sinteza proteic Retrovirusuri (ARN+) transcriere ADNADNdc transcriere ARNm replicare, translaie, sinteza pr. (sau integrare n cromosom) V. MORFOGENEZA (asamblarea) virionilor Proteinele capsidale particip la formarea nucleocapsidei (nucleu,citoplasm), glicoproteinele sunt inserate n MCP, substituind proteinele celulare. Contribuie la apariia incluziunilor sau a corpusculilor elementari. VI. ELIBERAREA virionilor (liza celulei, nmugurire, exocitoz) Interferena viral fenomen n care, consecutiv infeciei unei celule cu 2 virusuri, multiplicarea unuia este inhibat (virus interferat / virus interferent) 37. Virusurile simple si complexe. Structura virionului. Etapele de interactiune a virionului cu celula gazda. RELAII VIRUS-CELULA GAZD Infecie viral productiv, citocid Virusul este infecios iar celula permisiv. La nivelul ma/o corespunde infeciilor acute, aparente sau inaparente (grip, rujeol) Infecii virale persistente Celulele infectate supravieuiesc cu producerea permanent sau intermitent a virusului. 26

Infecii abortive cu virioni defectivi infecia nu se exprim, are loc transformarea celulelor prin proteine virale. Ele devin int pentru efectorii imunitii (macrofage, T-limfocite) n cursul unor infecii cronice (PESS post-rujeolic) Infecii integrate (virusuri ADN sau copii ADN ale Retrovirusurilor) Transformarea malign a celulei gazd Manifestarea infeciei dup o perioad de incubaie ndelungat cu expresia integral a genomului viral (HIV-SIDA) infecii lente Reactivri ocazionale, repetate ale infeciei cu exprimarea integral a informaiei genetice virale (infecia herpetic) infecii latente Infecii cronice perioade de remisie i acutizare, virusul este prezent permanent, chiar n absena simptomelor (hepatita viral B) TERAPIA ANTIVIRAL Dificulti: Toxicitate (imposibil de a distruge virusul fr afectarea celulei!) Apariia mutantelor rezistente Activitate asupra virusului n faz de multiplicare Costul avansat al tratamentului Primele preparate antivirale anticanceroase. Preparatele antivirale contemporane: Nu manifest activitate virucid, doar inhib reproducerea viral Sunt dirijate contra etapelor reproducerii virale Adeziunea virusului la celul Mecanismul blocarea receptorilor celulari (HIV-oligopeptidul T, care reproduce gp120; CD4 solubili) Dificulti: afinitate redus, degradare rapid Fuziunea, penetrarea Reprezint peptide sintetice (pentafuzida-T20, T1249) blocheaz fuziunea virusului HIV cu membrana celular (dificultate injecii s/c zilnice) Decapsidarea Amantadina, rimantadina inhib decapsidarea virusului gripal A Utilizare limitat dezvoltarea rezistenei Replicarea Mecanismul blocheaz activitatea enzimelor virale de reproducere (transcriptaze, polimeraze, replicaze) Avantaj nu influeneaz componentele celulei-gazd Analogi nucleozidici Se disting de nucleozidele naturale prin modificarea componentului glucidic sau a bazei purinice sau pirimidinice. Blocheaz elongarea catenei de ADN n curs de formare. Antiherpetice (aciclovir, ganciclovir, penciclovir, idoxuridin) Anti-HIV (zidovudin, didanozin, zalcitabin, stavudin, lamivudin, etc) Anti-HBV (entecavir, LdT, LdC faz de cercetare) Analogi nucleotidici Cidofovir-CMV, HSV adefovir- HIV, HBV, HSV, CMV tenofovir HIV, HBV Analog al pirofosfatului Foscarnet HSV, CMV (HIV, HBV -?) Inhibitori nenucleozidici ai RT HIV (nevirapin, delavirin, efavirenz) Blocarea activitii polimerazelor virale se realizeaz prin: Competiie cu substratul natural al enzimei ngrmdirea steric a centrului activ al enzimei Incorporarea n catena de ADN n curs de sintez Blocarea procesului de elongare a catenei de ADN prin incapacitatea de a fixa un alt nucleozid pe analogul su artificial Asamblarea, eliberarea 27

Inhibitori ai proteazei HIV (sanquinavir, ritonavir, indinavir, amprenavir, lopinavir, nelfinavir, etc) toxicitate, rezisten Inhibitori ai neuraminidazei virusurilor gripale (zanamivir, oseltamivir). Activ contra gripei A i B (efect preventiv, curativ, rezisten rar) INTERFERONII (IFN) IFN ansamblu de proteine capabile s confere celulelor o stare de rezisten la o infecie viral. IFN tip 1 (clasic, antiviral): IFN-alfa (leucocitar) IFN-beta (fibroblastic) Inductori: virusuri, LPS, ARN bicatenar IFN-gama, tip 2, imun, produs de LT activate, NK. Manifest activitate imunomodulatoare IFN acioneaz asupra ciclului de replicare viral prin intermediul celulei: interaciunea IFNalfa cu receptorul su induce sau stimuleaz expresia unor gene celulare, rezultnd o activitate antiviral (blocarea translaiei ARNm viral, degradarea ARNm viral). Este posibil i blocarea asamblrii i nmuguririi virusului (HIV) IFN mresc expresia moleculelor clasa I a CMH, iar IFN-gama i a celor de clasa II IFN mresc activitatea intrinsec i extrinsec a macrofagelor i manifest activitate antiproliferativ IFN-gama activeaz celulele NK Utilizarea terapeutic a IFNhepatite B i C cronice, infecii herpetice, sarcomul Kaposi, limfome, leucemii Alte citokine (TNF-a, IL-2, IL-4, IL-10, IL-12) sunt la etapa de testare in vitro. TERAPIA CELULAR (CMV, EBV) Fondat pe administrarea CTL (limfocite Tc) autologe. Prelevarea sngelui de la bolnav Izolarea CTL specifice Clonarea i proliferarea CTL in vitro Reinjectarea la pacient VIITOR: fototerapia, imunizarea intracelular (introducerea unei gene ce codific un anticorp antiviral) 38.Culturile celulare. Tipurile. Izolarea virusurilor pe culturi de celule. Metodele de indicare si identificare a virusului izolat. CULTIVAREA VIRUSURILOR Virusurile sunt cultivate pentru: Stabilirea diagnosticului etiologic Testarea infeciozitii virusurilor Testarea preparatelor antivirale Producerea vaccinurilor SISTEME DE CULTIVARE Culturi de celule Ou embrionat de gin Animale de laborator Animalele de laborator se utilizeaz limitat (receptivitate selectiv, preexistena infeciilor, cost avansat). Se recurge numai cnd nu exist alte posibiliti (VHB, HIV, Coxsackie, etc). Constituie modele de cercetare sau de control al vaccinurilor. Animalele utilizate curent oriceii albi nou-nscui, dar pot fi utilizai obolani, cobai, maimue, etc. Regulile de lucru cu animalele de laborator (selectare, inoculare, examinare) sunt identice cu cele din infeciile bacteriene. Oul embrionat de gin (5-13 zile) reprezint un mediu de celule nedifereniate, cu multiplicare activ, steril i lipsit de mijloace de aprare antiinfecioas. Se utilizeaz n prepararea unor vaccinuri virale (ex.: gripal) Iniial se verific viabilitatea embrionului la ovoscop n camera obscur. Prelevatul se inoculeaz steril cu seringa n cavitatea amniotic sau alantoidean, sau pe membrana chorioalantoidean (utiliznd metoda deschis sau nchis). 28

Orificiul se parafineaz i se incubeaz la 35-37 C timp de 48-72 ore Culturile de celule (1949 - Enders, Weller, Robbins). Celulele provenite din esuturi adulte sau embrionare, normale sau tumorale, plasate ntr-un mediu adecvat (nutrieni, pH, t) rmn viabile i se multiplic. Pentru cultivarea virusurilor se utilizeaz culturile n monostrat celular. Tipurile de culturi de celule: Culturi primare (primar tripsinizate). Sunt obinute din esuturi adulte sau embrionare de origine animal sau uman. Suport 4-6 pasaje (subcultivri) Culturi diploide. Obinute din esut embrionar (MRS5, fibroblaste umane). Pot fi subcultivate 40-50 generaii Linii continui de celule. Obinute din esut tumoral. Pot fi subcultivate nelimitat. HeLa carcinom de col uterin KB tumoare a rinofaringelui Hep-2 tumoare canceroas a laringelui Obinera culturilor de celule primar tripsinizate: Prelevarea esutului (ex.: rinichi de maimu) Fragmentarea i splarea cu sol fiziologic Dezagregarea tisular cu enzime proteolitice Separarea celulelor prin centrifugare Dozarea suspensiei 105 106 celule/ml ntroducerea celulelor n mediu nutritiv i repartizarea n recipiente sterile Incubarea pn la formarea monostratului celular (inhibiie de contact) Monostratul poate fi infectat cu virus sau servete drept surs de celule pentru o nou cultivare (pasaj) Mediile de cultur pentru culturi de celule conin AA, Vit, factori de cretere, sruri minerale (Eagle, Hanks, 199, hidrolizat de lactalbumin, etc), rou fenol pentru monitorizarea pH (vireaz n galben n mediu acid) Mediile de cretere sunt mbogite cu ser sangvin (uman, animal) pentru cultivarea CC Mediile de ntreinere se utilizeaz pentru meninerea monostratului n procesul reproducerii virale. Nu conin ser. CC reprezint sistemul virus-gazd predilect n virologia clinic i cercetare. Inocularea CC Se aleg tuburi cu monostrat bine format Se nltur mediul de cretere, se spal cu sol. Hanks Se inoculeaz 0,1 0,2 ml de prelevat Peste 30-60 min n tuburi se toarn cte 1 ml mediu de ntreinere Se ntroduc n termostat la t adecvat 3-4 zile 39.Izolarea virusurilor in ou embrionar de gaina. Metodele de infectare. Indicarea si identificarea virusului izolat. 40.Metoda virusologica in diagnosticul virozelor. Materiale de examinat (prelevate) de la bolnav. Regulile de recoltare, ambalare si conditiile de transportare in laborator. Pregatirea pobelor pentru examinare in metoda virusologica. Etapele si esenta lor. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL VIROZELOR Indicaii: Boli cu msuri terapeutice sau profilactice speciale (SIDA, hepatite, rubeola, etc) Elucidarea etiologiei virale a unor izbucniri epidemice (meningite, gastro-enterite, pneumonii, etc) Supravegherea epidemiologic Prelevate: LCR, snge, exsudate, secreii nazale, rino-faringiene, mase fecale, urin, vezicule i ulceraii cutaneo-mucoase, bioptate, etc. 29

Eficacitatea diagnosticului este condiionat de: Alegerea corect a prelevatelor, calitatea lor i transportarea n laborator Examinarea precoce (la debutul bolii) Transportarea rapid a probelor sau utilizarea mediului de transport Respectarea regulilor de autoprotecie i de protecie a anturajului la recoltare, transportare i examinarea probelor METODELE DE DIAGNOSTIC AL VIROZELOR METODE DIRECTE Examenul virusoscopic (evidenierea direct a virionului sau a componentelor lui n prelevate) Examenul virusologic (izolarea i identificarea virusului) Detectarea Ag virale n prelevat Identificarea genomului viral (hibridizarea AN, amplificarea genic PCR) METODE INDIRECTE Serodiagnosticul (creterea de cel puin 4 ori a titrului Ac n dinamic) EXAMENUL VIRUSOSCOPIC Microscopia optic depistarea n prelevat a incluziunilor virale specifice (corpusculii Guarnieri n variol, Babe-Negri n rabie) sau nespecifice, citoplasmatice sau nucleare. Se prepar frotiuri sau frotiuri-amprente colorate Romanovschi-Giemsa sau cu fluorocrom Microscopia electronic Imunoelectronomicroscopia mai sensibil, mai specific. Se examineaz complexele imune virus Ac Imunofluorescena (direct i indirect) utilizat n diagnosticul rapid al virozelor EXAMENUL VIRUSOLOGIC Prelucrarea prealabil a prelevatelor: Omogenizarea (dup necesitate) nlturarea elementelor celulare, inclusiv bacteriene (centrifugare, ultrafiltrare) Tratarea cu antibiotice pentru prevenirea creterii bacteriilor i fungilor contaminani (penicilin - 500 UA/ml, streptomicin 500 UA/ml, nistatin - 20 UA/ml) Etapele diagnosticului virusologic Izolarea virusului Evidenierea (indicarea) reproducerii virale Identificarea virusului Izolarea virusului se realizeaz prin inocularea cu material de examinat a animalelor de laborator, embrionilor de gin sau a culturilor de celule. Alegerea sistemului de cultivare se efectueaz n funcie de particularitile biologice ale agentului etiologic probabil i posibilitile laboratorului. INDICAREA VIRUSULUI n culturi de celule ECP modificri degenerative i distrugere celular, rezultat al multiplicrii virale (rotunjire sau retracie celular, citoliz, apariia vacuolelor sau granulelor n citoplasm, picnoza nucleului, fuziunea membranelor, etc). ECP poate fi studiat la microscopul optic pe celule necolorate sau colorate cu hematoxilin-eozin, Giemsa, fluorocrom. Incluziuni virale Reprezint acumulri paracristaline de virioni sau de componente virale n aria de replicare i asamblare a virusurilor (citoplasm, nucleu). Coloraia Giemsa, hem-eozin, fluorocrom. Localizarea, forma i afinitatea tinctorial (bazofile, acidofile) sunt particulariti diagnostice pentru unele viroze. Interferena Ex.: V.rubeolic nu produce ECP, dar determin fenomenul de interferen. Pentru detectarea V.rubeolei se infecteaz CC cu virus citopatogen. Lipsa multiplicrii acestui virus confirm prezena V.rubeolei. Hemadsorbia (RHAd) pentru virusuri cu HA Unele virusuri posed n componena capsidei, n special supercapsidei, glicoproteine care pot adera la suprafaa hematiilor HA. n timpul eliberrii din celul prin nmugurire a acestor virusuri, HA lor se afl deja nserate n MCP la nivelul mugurelui. Dac la aceasta etap n recipientul cu monostrat celular se 30

adaug suspensie de hematii i se menine 15-20 min la t caracteristic fiecrui virus, la microscop pot fi urmrite hematiile fixate la suprafaa celulelor infectate (RHAd). Hemaglutinarea (RHA) Pentru virusurile cu HA acumulate n mediul de ntreinere. n acest caz mediul de ntreinere aglutineaz eritrocitele unor specii de mamifere sau psri. Formarea plajelor Reprezint focare de celule alterate n monostratul celular acoperit cu agar. Numrarea plajelor permite cuantificarea virusului infectant. Proba culorii Metabolismul celular neafectat virajul culorii mediului din rou n galben (pH acid) Metabolismul celular inhibat culoarea mediului nu se modific

Indicarea virusului n oul embrionat de gin Oule se rcesc 18 ore la +4 grade C pentru o vazoconstricie maxim, apoi aseptic se taie coaja, se recolteaz lichidul alantoic sau amniotic, iar MCA i embrionul se ntroduc n cutii Petri sterile. Se observ: Moartea embrionului Apariia modificrilor (hemoragii, pustule) pe MCA Acumularea de HA n lichide Indicarea virusului pe animale de laborator Boala manifest a animalului, deces Urmrirea virusului n organele-int: Hemaglutinare Infeciozitatea omogenatelor Examene histopatologice (leziuni inflamatorii, degenerare, incluzii virale specifice: corp. Babe-Negri n neuronii infectai cu V.rabic, etc) Identificarea virusurilor Determinarea genului, speciei i serotipului de virus prin stabilirea structurii antigenice. Se efectueaz cu ajutorul serurilor imune specifice antivirale n diferite reacii serologice: RN RIHA/RIHAd RFC RIF RIE (ELISA) ARI, etc DETECTAREA AG VIRALE N PRELEVATE Avantaje: simplitatea i rapiditatea examenului, nu necesit meninerea infeciozitii virusului Dezavantaje: sensibilitate direct proporional cu cantitatea virusului din prelevat Se utilizeaz Ac policlonali de origine uman (seruri imune) sau Ac monoclonali (de origine murin) Reacii: RHAI, RLA, RIF, RIE, Western-blot, ARI, etc. IDENTIFICAREA GENOMULUI VIRAL (punerea n eviden a AN virali din prelevate n cursul infeciilor virale acute sau cronice i monitorizarea tratamentului). Pot fi examinate toate esuturile i lichidele biologice. Hibridizarea acizilor nucleici fr amplificare Hibridizarea dup amplificare (PCR i variantele ei) DIAGNOSTICUL SEROLOGIC Esena: depistarea Ac sintetizai de gazd n rspuns la o infecie viral. Dup o primo-infecie are loc inducerea formrii Ac, iar dup o reinfecie sau reactivare titrul Ac crete n dinamic. n serodiagnosticul virozelor este obligator de a examina 2 probe de ser de la bolnav : prima prelevat la debutul bolii, al doilea prelevat peste 15 zile. Ac sunt depistai n ser, uneori n LCR, exsudate, lichid articular, etc. 31

Pentru depistarea Ac se utilizeaz Ag virale de referin (suspensie viral inactivat, proteine virale native sau recombinante, oligopeptide sintetice). Tehnici utilizate: RFC, RIHA, RHAI, RN, RIFI, ARI, AIE (ELISA), etc. Semnificaie diagnostic prezint trecerea titrului de Ac de la 0 la pozitiv (seroconversie, primo-infecie) sau creterea titrului Ac de cel puin 4 ori n cursul infeciei. Ambele seruri vor fi testate n aceeai zi, prin tehnici identice i n acelai laborator. 41. Rolul microorganismului in procesul infectios. Notiune de mi/o patogene. Patogenitatea si virulenta mi/o. Unitatile de virulenta. Utilizarea practica a atenuarii dirijate a virulentei. INFECIA totalitatea proceselor biologice care se produc n ma/o n urma penetrrii mi/o patogene sau potenial patogene (PP). poten (PP). PROCESUL INFECIOS interaciunea dintre mi/o i ma/o n diverse condiii ale mediului ambiant. Manifestarea lui poate fi inaparent / asimptomatic (stare de portaj sntos, eliminarea rapid a mi/o) sau simptomatic. simptomatic. MALADIA INFECIOAS manifestarea suprem a procesului infecios diferite simptome efectele metaboliilor microbieni (toxine, enzime, etc) sau de reacia imun a gazdei la etc) prezena bacteriei. Particularitile bolii infecioase 1. provocata de ageni patogeni provocata 2. Contagiozitate (capacitatea de a se transmite de la o surs la o persoan receptiv) 3. Specificitate (un agent provoac o infecie, ex.: Clostridium tetani este agentul tetanosului, etc.) 4. Evoluie clinic stadial 5. Imunitate la reinfecie (durat variabil) 6. Apariia maladiei depinde de multipli factori, n special de capacitatea agentului cauzal de a provoca maladia i de gradul de rezisten al gazdei la aceast invazie ROLUL MICROORGANISMULUI N PROCESUL INFECIOS. PATOGENITATEA I VIRULENA Relaiile dintre mi/o i ma/o gazd: Comensalism (flora bucal, intestinal, etc) Parazitism (prezena mi/o este nociv pentru ma/o) Orice mi/o parazit capabil s provoace o infecie (n condiii adecvate) este considerat p a t o g e n. Exist 2 tipuri de mi/o patogene: Obligat (cert) patogene, care infecteaz persoane imunocompetente cu doze mici patogene, Potenial patogene (oportuniste), care pot cauza infecie numai cu doze mari sau la persoane imunocompromise (deseori fac parte din flora normal a organismului) Mi/o patogene pot fi gzduite uneori fr a provoca maladia, astfel de persoane sunt numite purttori sntoi de germeni. Microorganismele patogene se caracterizeaz prin: Patogenitate capacitatea unei bacterii de a declana infecia. Este un caracter de specie determinat genetic (cromozom, plasmide, bacteriofagi). n cadrul unei specii patogene pot exista tulpini cu manifestare variat a patogenitii de la absena total pn la foarte nalt. Virulen gradul de patogenitate al unei tulpini (msur cantitativ a patogenitii). Se al apreciaz prin infectarea animalelor de laborator cu cantiti diferite de mi/o. Unitile de virulen: DLM numrul de bacterii necesar pentru a ucide 80% din animalele infectate animalele DL50 50% letalitate DCL 100% letalitate DI50/DI provoac boala la 50% / 80% animale Modificarea virulenei: Amplificarea prin transfer i recombinare genetic, condiii optime pentru cretere 32

Reducerea (atenuarea) prin meninerea bacteriilor n condiii nefavorabile (t, factori chimici, etc), muta ii etc), ii 42. Caracteristica mi/o patogene. Factorii de patogenitate. Clasificarea. Rolul factorilor de patogenitate de structura si al enzimelor de patogenitate in evolutia infectiei. Bacteria patogen trebuie: 1. S fie capabil de a se transmite ntre gazde 2. S penetreze n organismul-gazd 3. S se rspndeasc prin organism 4. S se multiplice i s persiste (evitnd sau distrugnd sistemul imun al gazdei) 5. S produc leziuni Aceste capaciti sunt asigurate de factorii de patogenitate. Factorii de patogenitate ai bacteriilor Factori structurali (somatici) Adezine - fimbriile, glicocalixul, proteine de adeziune ale peretelui celular. Asigur aderarea bacteriilor la receptorii de pe suprafaa celulelor-int sau la proteine matriciale extracelulare (colagen, fibronectin, laminin, elastin, etc) Proteine ale sistemelor de secreie (tipuri I-IV) Capsula antifagocitar, anti-complement Ag K Antigenul O - antifagocitar Peptidoglicanul (adeziune, agresie tisular) Acizii teichoici/lipoteichoici (adeziune, toxicitate) Proteina A la stafilococi (aciune antifagocitar prin fixarea Fc a IgG) Proteina M la streptococi (adeziune, antifagocitar) Enzime de patogenitate (responsabile de persisten, diseminare i producerea leziunilor) Plasmocoagulaza (formarea trombilor septici-efect antifagocitar, propagare n organism) (formarea septici-efect Fibrinolizina (eliberarea bacteriilor din trombi) Hialuronidaza (diseminare, leziuni tisulare) (diseminare, tisulare Colagenaza (identic) Neuraminidaza (lichefierea mucusului) Proteaze (ex.: distrugerea Ig A secretorii) Dezaminaze Decarboxilaze Fosfataze, etc Toxine bacteriene (responsabile de leziuni) Exotoxine (proteice, secretate n mediul extracelular) Endotoxine (LPZ, legate de celula bacterian) Moduline i invazine Injectate la suprafaa sau direct n interiorul celulei-int Induc penetrarea (internalizarea) i propagarea bacterian Se ntlnesc la Yersinia, Shigella, Salmonella, Escherichia Ali factori ce asigur persistena mi/o: Variaii antigenice Mimicria antigenic 43. Toxinele microbiene. Tipurile de toxine si caracteristica lor. Rolul in patogeneza infectiei. Caracteristica exotoxinelor: Proteine produse de bacterii G+/GPot fi secretate n mediul extern, eliberate n spaiul periplasmic sau fixate pe suprafaa celulei Termolabile (excepie enterotoxina stafilococic i TS (toxina termostabil) a E. coli) coli) Hidrosolubile i acioneaz la distan Efectul se instaleaz dup o perioad de incubaie 33

Manifest tropism (specificitate de aciune) Toxicitate nalt (DLM de ordinul ng/kg) Exotoxinele sunt imunogene (induc sinteza anticorpilor - antitoxine) antic Antitoxinele neutralizeaz activitatea exotoxinei (faza de fixare pe receptorii celulari) Exotoxinele tratate cu formol 0,4% i meninute la 39-40C timp de 3-4 sptmni se transform n anatoxine. Ele sunt lipsite de toxicitate dar pstreaz imunogenitatea (utilizate n calitate de vaccin). Suportul genetic al exotoxinelor: cromozom (dizenteric), plasmide (toxina antraxului, toxina tetanic), profagi (toxina difteric, botulinic). Tipurile de exotoxine: Toxine citolitice Deregleaz membranele celulare prin aciune enzimatic (fosfolipaza /lecitinaza, sfingomielinaza) sau prin formarea porilor (streptolizina O, -toxina/hemolizina S.aureus, (streptolizina S.aureus, leucocidina) Toxine citotoxice, de tip A-B (acioneaz n interiorul celulei). Ex.: toxina difteric, botulinic, citotoxice, tetanic, holeric, etc Au structur bipartit: fracia polipeptidic B (cell binding) este responsabil de legarea de binding) receptorii specifici din membrana celulei-int, fracia polipeptidic A (active) ptrunde n (active) celul (prin endocitoz sau translocare) i determin activitatea toxic. Fiecare citotoxin acioneaz strict specific: citotoxin specific: toxina difteric inhib sinteza proteinelor, toxina toxina botulinic i tetanic neurotoxine, inhib eliberarea neurotransmitorilor, toxina toxina holeric i pertusic activeaz adenilat-ciclaza membranar, etc toxina Obinerea exotoxinelor bacteriene Cultivarea tulpinii toxigene n mediu lichid lichid Filtrarea culturii pentru separarea toxinei Purificarea toxinei Concentrarea toxinei Determinarea activitii toxinei (se msoar in uniti de floculare Lf ) m soar uniti Caracteristica endotoxinelor: Complexe LPZ din peretele celular G- (cel mai toxic component este lipidul A). Este eliberat n urma lizei bacteriilor (sub influena sistemului imun al gazdei sau a unor AB). Termostabil Ne-imunogen Nu poate fi transformat n anatoxin DLM de ordinul mg/kg Efectul se manifest imediat Determin efecte generale, indiferent de provenien Mecanismul de aciune al endotoxinei : LPZ induce secreia unor substane biologic active (citokine pro-inflamatoare: IL-1, IL-6, IL-8, IL12, TNF-a) de ctre macrofage i alte celule. Iniial LPZ se leag de o protein seric (LPS-binding protein) acest complex interacioneaz cu CD 14 de pe membrana macrofagului. Exist i molecule solubile de CD 14, astfel endotoxina poate s acioneze asupra altor celule, de ex.: celulele epiteliale. Un alt receptor macrofagic poate interaciona cu LPZ receptorul toll-like (TLR4). n doze mari citokinele pot provoca ocul endotoxinic (septic), comun pentru toate bacteriile G-: Febr (eliberarea pirogenilor IL-1, TNF de ctre celulele care au captat endotoxina) Leucopenie, urmat de leucocitoz Tulburri de coagulare (activarea factorului XII formarea fibrinei i obstrucia capilarelor sanguine coagulare intravenoas diseminat) Hemoragii (consumarea factorilor de coagulare) n diverse organe (rinichi, suprarenale, plmni, creier) Vazodilatare, urmat de colaps vascular (sechestrarea periferic a sngelui, hipovolemie, acidoz metabolic, scderea brusc a presiunii sanguine) 34

n consecin au loc leziuni hemoragice i necroz n diverse organe (rinichi, suprarenale, plmni, creier...). Pronosticul este foarte sever. 44. Rezistenta nespecifica a macroorganismului. Notiune. Factorii care asigura rezistenta nespecifica. Rolul factorilor tisulari (de bariera) si umorali in prevenirea infectiei. P A T O G E N E Z A BOLII INFECIOASE Sursa de infecie: omul bolnav, reconvalescent, purttor sntos (infecii antroponoze) sau animalele (infecii zooantroponoze). Mecanismele de transmitere Prin contact (direct, indirect) Fecal-oral (alimentar, hidric, etc) Aerogen (aer-praf, aer-picturi) Transmisiv (prin intermediul vectorilor) Transmisiv (prin vectorilor) Vertical (transplacentar) Microbii penetreaz prin tegument, mucoase sau direct n snge (pori de intrare). Un microb poate avea una sau mai multe pori de intrare. Doza critic ex.: dizenterie 102 mi/o, febr tifoid 105 , holer 109 . La poarta de intrare bacteria ader la celule (adeziunea) i se multiplic local (colonizarea), adeziunea) colonizarea), formnd focarul primar de infecie. Infecia poate rmne localizat sau poate s se rspndeasc (invazia) pe cale limfatic, sanguin, pe calea nervilor sau prin continuitate (din , aproape n aproape). n esutul afectat mi/o se multiplic i provoac leziuni direct prin intermediul enzimelor sau toxinelor sau indirect, via mecanisme imune. Mi/o se elimin cu diferite secrete sau excrete ale ma/o, prin care are loc contaminarea altor gazde sau obiecte. Dinamica evoluiei bolii infecioase 1. Perioada de incubaie (de la penetrarea mi/o pn la apariia primelor simptome). Durata variabil (ore ani). Microbul se adapteaz, se multiplic, produce toxine, enzime, etc. 2. Perioada de invazie (prodromal, de debut). Apar primele semne clinice, nespecifice (febr, frison, inapeten, astenie, etc). Durata 2-3 zile. 3. Perioada de stare (a manifestrilor clinice specifice). Durata variabil. 4. Perioada terminal (convalescen i vindecare, sau cronicizare, sau stare de portaj, sau deces) Criteriile de apreciere a rolului etiologic al agentului cauzal n survenirea infeciilor specifice (postulatele lui Koch) Bacteria trebuie s fie prezent la toate persoanele bolnave. Bacteria trebuie s fie izolat de la bolnav i meninut n cultur pur. Cultura pur inoculat la un voluntar sau la un animal experimental trebuie s reproduc simptomele bolii. Aceeai bacterie trebuie s fie reizolat de la voluntarul sau animalul infectat. Actualmente se insist pe genomul bacterian (prezena genelor de patogenitate). Rolul mediului ambiant i social n infecie (condiiile economice, condiiile de via, catastrofe ecologice sau naturale, progresul n igiena public, etc). Maladii sociale: tuberculoza, pediculoza (tifosul exantematic), sifilisul, etc. Rolul macroorganismului n procesul infecios. Rezistena nespecific a ma/o. Pentru meninerea coerenei celulelor i esuturilor i pstrarea integritii sale ma/o pune n joc 2 categorii de procese aprute succesiv n cursul evoluiei: Rezistena nespecific, nnscut dezvoltat filogenetic, asigurat de factori constituionali. Rspuns maxim imediat, nespecific, antigen-independent. Imunitatea (rezistena specific) s-a dezvoltat ontogenetic, Ag-dependent i Ag-specific, rspuns maxim peste cteva zile de la agresie, se caracterizeaz prin memorie imunologic. Rezistena nespecific Rezistena nespecific este asigurat de factori tisulari (de barier), factori celulari i umorali. Factori tisulari (de barier) 35

1. Tegumentul (barier mecanic - integritatea, descuamarea stratului cornos; barier (barier biologic -flora normal, chimic - pH acid al tegumentului) 2. Mucoasele (barier mecanic - integritatea, micarea cililor, scurgerea secretelor; (barier chimic -secreiile digestive, pH acid al urinei; biologic -flora normal; barier enzimatic enzimele din secreiile mucoaselor, ex.: lizozimul, lactoferina) Dac barierele au fost depite, atunci organismul dispune de ali factori de rezisten nespecific: factori celulari i umorali. Factori umorali de rezisten nespecific Reactivi de faz acut organismul supus unei agresiuni reacioneaz prin sinteza i secreia crescut a unor proteine plasmatice: inhibitori de proteaze proteine ale sistemului complement i ale coagulrii sistemului proteina C reactiv protrombina, fibrinogenul, etc. Acestea mresc rezistena gazdei, limiteaz leziunile tisulare si favorizeaz vindecarea. 1. Complementul reprezint un sistem complex de proteine termolabile solubile i membranare. Se ntlnesc n plasma sangvin, limf i exsudate. Nu se detecteaz n saliv, lacrimi, urin, transsudate. Exist peste 30 de fracii ale C. C1-C9 sunt solubile, celelalte au rol de receptori membranari. Fraciile C1-C9 circul n ser sub form inactiv, care n procesul activrii capt proprieti enzimatice. Activitatea biologic a complementului: Opsonizarea bacteriilor Aciune citolitic Activitate anafilactic stimulare chimiotaxis activare neutrofilele, degranularea mastocitelor,bazofilelor Activarea limfocitelor B 2. Properdina proteine serice care particip la activarea complementului pe cale alternativ. 3. -lizinele proteine serice termostabile (63 grade) cu activitate antimicrobian asupra bacteriilor G+ n special 4. X lizina, protein seric termostabil (70-100 grade), produce liza bacteriilor G lizina, 5. Lizozimul prezent n lacrimi, saliv, ser sanguin, favorizeaz liza bacteriilor 6. Anticorpii normali 7. Interferonii (glicoproteine cu aciune antiviral, antiproliferativ i imunomodulatoare) 45. Rezistenta nespecifica a macroorganismului. Notiune. Factorii celulari de rezistenta nespecifica. Fagocitoza: celulele fagocitare, etapele fagocitozei. Notiune de opsonine si opsonizare. Rolul fagocitozei in initierea raspunsului imun. Factori celulari de rezisten nespecific Reacia inflamatoare. mpiedic multiplicarea i rspndirea microbilor i asigur distrugerea lor. Fagocitoza (component al reaciei inflamatoare). Asigur captarea i distrugerea substanelor strine, inclusiv a mi/o, celulelor infectate, celulelor tumorale. Celulele fagocitare (fagocitele) 1. Leucocitele PMN 2. Macrofagele (monocite n snge, macrofage fixe cel. Kupffer, macrofage alveolare, (monocite osteoclaste, microglia, macrofage din splin i ganglioni limfatici). Pentru a interveni, fagocitele trebuie s recunoasc bacteriile ca particule strine. Exist molecule solubile i membranare care pot recunoate componente bacteriene: Solubile lectinele care se pot lega de manoza din PC; proteine plasmatice ce leag LPZ bacterian Membranare pe macrofage exist receptori de manoz, receptorul CD 14 pentru LPZ, receptori Toll-like (TLR). TLR pot recunoate diferite molecule bacteriene: LPZ, PG, lipoproteine, acizi lipoteichoici, flagelina. Ali receptori: receptori pentru Fc al IgG, pentru complement (CR1, CR3, CR4), pentru interferon, limfokine, lectine, fibronectin, .a. 36

FAZELE FAGOCITOZEI 1. Chemotaxisul (atractani proteine bacteriene, fragmente de PC, capsule, LPZ, chemokine, etc) 2. Adeziunea mi/o la fagocit (fagocitul recunoate molecule strine de pe suprafaa recunoate bacteriilor monomeri de PG, acizi teichoici, LPZ, acid micolic, ADN bacterian, ARNd.c. micolic, ADN bacterian, viral, manoza, glicani din fungi, etc ) viral, Inhibitori capsula, Ag O, prot. M, prot. A, plasmo-coagulaza, etc. Bacteriile patogene care nu plasmo-coagulaza, etc. pot fi fagocitate se numesc extracelulare. Stimulatori cationi de Ca2+, prot. C - reactiv, opsonine (fracii de complement (C3b), fibronectina, unii Ac). Datorit receptorilor opsoninele acoper suprafaa bacteriilor (opsonizare). Fagocitele de asemenea posed receptori pentru opsonine i astfel faciliteaz adeziunea i ingestia mi/o. 3. Ingestia (nglobarea) i formarea fagosomei. 4. Distrugerea (digestia) intracitoplasmatic. Fagosoma fuzioneaz cu Lz fagolizosom intracitoplasmatic. mi/o va fi omort sub aciunea E, anionilor superoxizi, H2O2, pH acid, apoi digerat de E hidrolitice. 5. Produsele degradate pot fi eliminate din celul (PMN, macrofagele) sau dup o selecie i pregtire prealabil (processing) unele peptide vor fi expuse pe membrana macrofagelor n asociaie cu molecule ale CMH. Ele vor contribui la stimularea imunitii prin interaciunea cu receptorul pentru Ag de pe limfocitele T. Aceasta este fagocitoza complet. complet. Fagocitoza incomplet agentul persist i se multiplic n fagocit (micobacterii, gonococi). Cauze: inhibiia formrii fagolizosomei, eliminarea bacteriei din fagosom nainte de fuziunea cu lizosoma, etc). Acetia sunt patogeni facultativ intracelulari. Aprecierea strii funcionale a fagocitelor Procentul fagocitelor active (N - 30-60%) ponderea fagocitelor care au nglobat cel puin un fagocitelor active mi/o Numrul fagocitar (N - 4 - 24) nr de mi/o nglobate n mediu de un fagocit Alte celule cu activitate nespecific: celulele K i NK 46. Notiune de antigen. Proprietatile de baza ale antigenelor (imunogenitatea si antigenitatea). Antigenele complete si incomplete (haptenele), caracteristica lor. Antigenele T-dependente si T-independente. Determinantele antigenice (epitopii), tipurile. Valenta antigenului. ANTIGENELE substane strine (non-self) de natur endo-/exo-gen capabile s declaneze un rspuns imun (umoral, celular, toleran imunologic, memorie imunologic, paralizie imunologic). Proprietile de baz ale Ag: Imunogenitatea capacitatea Ag de a fi recunoscut ca strin i de a induce rspuns imun str specific Antigenitatea (specificitatea) capacitatea Ag de a interaciona specific cu Ac sau cu receptorul pentru Ag complementar al limfocitelor sensibilizate Antigenele care posed ambele caractere sunt Ag complete. complete. Cerinele fa de Ag complete: S fie substane strine S fie formate din gruparea carrier (purttor) i epitopi (determinante antigenice) S aib o greutate molecular de peste 10 kDa S aib structur chimic complex (proteine, PZ, LPZ, etc) PZ, S aib o conformaie spaial stabil Antigenele incomplete (haptenele) posed antigenitate dar sunt lipsite de imunogenitate. Cerinte fata de Ag incomplete (haptenele): Au mas molecular mic 37

Pot deveni imunogene combinndu-se cu macromolecule purttoare (proteine sau polizaharide) Exemple de haptene: sruri ale metalelor grele (Cr, Ni), substane de origine vegetal, haptene: medicamente, colorani, oligonucleotide. SuperAg molecule proteice particulare (enterotoxinele stafilococice, toxina ocului toxic SuperAg stafilococic, toxina exfoliativ a stafilococilor, nucleocapsida virusului rabic), capabile s stafilococic, stimuleze un numr mare de limfocite T (10-40%). N 0.01%. SuperAg provoac reacii imunopatologice. Se disting arbitrar: Ag solubile: proteine plasmatice, toxine, enzime, hormoni, etc solubile: Ag figurate (celulare, corpusculare): celule, bacterii, parazii, etc. n funcie de provenien se deosebesc: Ag heterofile Ag comune mai multor specii animale. Ex.: Ag polizaharidice Forssman, prezente n hematiile de cal, cine, oaie, cobai; sistemul Rh al eritrocitelor Forssman, prezente se ntlnete la om i maimuele Macaccus rhesus, etc Ag heterologe (xeno-Ag, hetero-Ag) Ag provenite din organismul altei specii Izo-Ag (alo-Ag) Ag de grup n cadrul unei specii (sistemul ABO i Rh, clasele de Ig) Rh, Idioantigene antigenele specifice unui individ. Corespund moleculelor CMH Autoantigene Ag proprii unui organism, devenite imunogene n anumite condiii (spermatozoizii, tiroglobulina, insulina, cristalinul, esutul nervos, etc) Exoantigene (provenite din compartimentul extracelular - bacterii, fungi, protozoare (provenite fagocitate) fagocitate) Endoantigene (provenite din citoplasma celulelor, reprezint proteine proprii modificate (provenite sau proteine virale sintetizate de celulele macroorganismului) Structura antigenic a celulei bacteriene Ag structurale (Ag O/R somatice, LPZ, termostabile; Ag H flagelar, proteic, termolabil; Ag K termolabil; capsular, termovariabil; Ag F fimbrial) termovariabil; Ag solubile (enzime de patogenitate, exotoxine) Antigene virale: proteine/GP de invelis, nucleoproteine, enzime invelis, Determinantele antigenice (epitopii) Determinantele antigenice Imunogenitatea este o caracteristic a ntregii macromolecule Ag. Antigenitatea (specificitatea) este determinat de anumite secvene ale Ag. Suprafee limitate din macromolecula Ag apte s se combine cu Ac specifici sau cu receptorii de pe limfocitele sensibilizate se numesc determinante antigenice sau epitopi. sensibilizate determinante antigenice La glucide epitopul este format din 4-6 monozaharide. Polizaharidele sunt formate dintr-un epitop repetat sau dintr-un numr redus de epitopi diferii. diferi Polizaharidele sunt Ag T-independente, pot induce sinteza Ac fr intervenia TL. Epitopul proteic este constituit din civa aminoacizi (AA). (AA) Epitopii liniari (secveniali) sunt determinai de structura primar a AA (8-30 AA) lini Epitopii conformaionali sunt determinai de structura secundar sau teriar a moleculei proteice (juxtapoziia n spaiu a AA situai la distan). Se modific la denaturarea proteinei. Fiecare molecul proteic reprezint un mozaic de epitopi, fie diferii, fie identici. Proteinele sunt Ag T-dependente, deoarece ele induc sinteza Ac doar prin cooperarea dintre T i sinteza B limfocite. Numrul de epitopi de pe o molecul imunogen reprezint valena Ag. 47. Sistemul imun, functiile. Organele sistemului imun. Rolul organelor centrale si periferice ale sistemului imun. Celulele sistemului imun si functiile lor. IMUNITATE nereceptivitatea organismului la orice ageni strini din punct de vedere genetic, inclusiv la mi/o i toxinele lor. IMUNITATE capacitatea de aprare specific a organismului fa de agresori externi (virusuri, bacterii, fungi, protozoare, toxine) ct i fa de propriile molecule i unele celule degradate sau protozoare, toxine) modificate. 38

Sarcina fundamental a imunitii distincia dintre moleculele i celulele proprii (self) i cele self) strine (non-self) non-self) TIPURILE DE IMUNITATE Ereditar (natural, de specie). Poate fi absolut (lipsa intei) sau relativ. Dobndit (achizitionata, adaptativa) Activ Natural (postinfecioas) Artificial (n urma vaccin rii) rii) Pasiv Pasiv Natural (transplacentar, prin laptele matern) matern) Artificial (administrarea Ac / seruri imune sau a limfocitelor) Imunitatea dobndit se caracterizeaz prin: 1. Dezvoltare lenta si manifestare tardiva (cteva zile, sptmni dupa contactul cu un Ag) 2. Specificitate fa de Ag (capacitatea de a recunoaste si raspunde specific la numeroase substante straine, inclusiv agenti infectiosi) 3. Memorie imunologic (capacitatea de a elabora raspuns mai rapid, mai intens si eficace la intalniri repetate cu un Ag) Imunitatea dobndit poate fi: Imunitate antibacterian, antiviral, antimicotic, antitoxic, antitumoral, etc. n funcie de mecanismele reaciilor imune: Imunitate umoral, exercitat prin intermediul unor proteine numite anticorpi (Ac, Ig) umoral, exercitat limf. B. Fiind secretate in sange si lichide biologice neutralizeaza si elimina microbii B. extracelulari si toxinele lor. Imunitate celular, eficienta in eliminarea parazitilor intracelulari sau a celulelor tumorale. celular, Este exercitat prin intermediul limf. T (citotoxicitate directa, activarea macrofagelor, exercitat celulelor NK, secreia citokinelor). secre n dependen de persistena mi/o: Imunitate steril se manifest dup eliminarea agenilor patogeni din organism (ex.: eliminarea rujeol) Imunitate nesteril nereceptivitatea se pstreaz doar n perioada aflrii mi/o n organism (tbc, sifilis). Sistemul Imun reprezinta un ansamblu de celule, molecule i tesuturi (organe) distribuite n celule, (organe) tot organismul, care participa la instaurarea imunitatii. organismul, imunitatii. Functiile Sistemului Imun: 1. Aparare contra infectiilor 2. Recunoasterea tesuturilor si proteinelor straine si raspunsul la ele 3. Protectie contra tumorilor TESUTURILE SISTEMULUI IMUN Organele centrale (primare) ale SI mduva osoas i timusul la vertebrate (ficatul n perioada embrionar), bursa Fabricius la psri. Apar primele n timpul vieii embrionare. Rolul sursa celulelor-stem, instruirea, maturizarea i selectia celulelor imunocompetente (limfocitele T i B). n mduva osoas se afl celulele-stem, precursori ai T i B-limfocitelor. Pre-T limfocitele migreaz ulterior n timus, unde va avea loc instruirea i maturizarea lor, devenind celule imunocompetente, capabile s recunoasc specific un singur Ag (prin achiziionarea unor receptori specifici). Instruirea si maturizarea B-limfocitelor are loc n mduva osoas. Aceste procese sunt independente de orice stimulare antigenic a organismului. Dup prsirea organelor centrale limfocitele nu mai revin aici, ele se stabilesc n organele limfoide secundare, recirculnd prin snge, limf. recirculnd Organele periferice (secundare) ale SI (secundare) n ele se realizeaz contactul dintre Ag, celulele prezentatoare de antigen ( CPA) i celulele imuno-competente, cu inducerea unui raspuns imun. cu imun. Ganglionii limfatici (raspuns imun contra Ag transportate cu limfa) Splina (raspuns imun contra Ag transportate cu sangele) 39

Formaiunile limfoide ale mucoaselor digestive i respiratorii (amigdale, plci Peyer, apendice), esutul limfoid asociat tegumentului (raspuns imun contra Ag ce penetreaza prin epitelii) esutul

Ariile timo-dependente (populate de limfocite T) sunt: zona paracorticala a ganglionilor limfatici (paracortex), manonul limfoid periarteriolar al pulpei albe a splinei i zonele interfoliculare ale plcilor Peyer. 48. Celulele imunocompetente. Dezvoltarea limfocitelor T si B, receptorii de suprafata. Diferentierea limfocitelor T si B naive la un stimul antigenic. Functiile celulelor efectoare. Limfocitele (celule imunocompetente, recunoasterea Ag) Celulele efectoare (eliminarea microbilor) Celulele prezentatoare de Ag (CPA) (captarea si prezentarea Ag microbiene ) LIMFOCITELE Toate limfocitele provin din celule-stem ale maduvei osoase, cu o etapa ulterioara de maturizare si selectie. Limfocitele T si B sunt unicele celule ce poarta receptori specifici de Ag (celule imunocompetente), fiind mediatorii principali ai imunitatii adaptative competente) Maturizarea limf. B are loc n mduva osoas prin intermediul interaciunii directe cu celulele stromei, iar n stadiile tardive sub aciunea citokinelor secretate de celulele stromale (n special IL-7). Limf. B sunt supuse unei selectii pozitive in favoarea expresiei de receptori intacti si unei selectii negative contra recunoasterii puternice a antigenelor proprii. In organelor limfoide secundare limf. B se localizeaza in foliculii cortexului extern din ganglionii limfatici, foliculii din plcile Peyer i foliculii zonei periferice din pulpa alb a splinei (arii timoindependente). Limf. B mature se caracterizeaz prin prezena urmtorilor receptori de suprafa: 1. Receptorul pentru Ag (BCR). Este reprezentat de molecule de Ig monomeri de Ig M i Ig D. Interacioneaz cu molecule antigenice din soluii sau fixate pe membrane celulare (macromolecule native proteine, glucide, AN, etc) 2. Receptorul pentru fragmentul Fc al IgG 3. Receptor pentru fraciunea C3b a complementului 4. Receptori pentru interleukine (IL) 5. Proteine ale Complexului Major de Histocompatibilitate - CMH 6. Alte proteine specifice CD79, CD19 asociate BCR Organismul contine 107-109 clone diferite de limf.B, fiecare cu BCR unic. BCR recunoate antigenele dup configuraia lor. Limf. B stimulate de Ag se multiplic i se difereniaz n celule efectoare - plasmocite secretoare de Ig (Ac) i n celule B-memorie. Precursorii limf. T migreaz n timus, unde sub influena celulelor stromale i a corpusculilor Hassal se difereniaz n limf. T mature. Migraia limf. T din cortex spre medulara timic este nsoit de achiziia unor proteine de suprafa specifice (receptori: TCR, CD3, CD4, CD8, etc). etc). La o etapa precoce de selectie doar limfocitele cu TCR functional vor supravietui. Dezvoltarea ulterioara a limf. T este caracterizat printr-o selecie pozitiv (supravieuiesc TL care recunosc moleculele CMH propriu). Aceste molecule sunt prezente pe suprafata celulelor dendritice si a macrofagelor din timus. Limfocitele T care au trecut selecia pozitiv, dar care sunt capabile s recunoasc cu afinitate selec pozitiv s recunoasc inalta peptide proprii asociate cu CMH suport o selecie negativ (moarte programat prin apoptoz). Selecia const n eliminarea clonelor de limfocite potenial autoreactive (potenial reactive fa de moleculele proprii). Timusul selecioneaz utilul, ignor inutilul i distruge nocivul. ( Von Boehmer ). ). La etapa finala limf. T care sunt capabile sa recunoasca peptide in asociatie cu moleculele CMH I pierd receptorul CD4 (devenind celule TCD8), iar cele ce recunosc complexe peptid-CMH II pierd receptorul CD8 (devenind celule TCD4) Receptorii TL: 40

1. TCR, receptorul pentru Ag - format din 2 catene polipeptidice i (90%) sau i . TCR TCR, poate recunoate doar peptide antigenice asociate cu molecule ale CMH, localizate pe suprafaa unei CPA. Nu interacioneaz cu Ag solubile. 2. CD3 (Cluster Differentiation 3) asociat TCR, ajut la transmiterea n celul a semnalului TCR de recunoatere a Ag si de activare a limfocitului. limfocitului. 3. CD2 prezent la toate limf. T, fixeaz hematii, poate fi depistat prin testul de formare a stat rozetelor. Unii markeri (receptori) de suprafa definesc 2 variet i principale de LT: limf. T CD4+ i (rece i TCD8+ CD4 exprimat pe 60% din TL. Recunosc Ag peptidice legate cu moleculele CMH II (exprimate TL. pe celulele dendritice, macrofage i limf. B). Limfocitele TCD4 (T4) au funcia de coordonator central al rspunsului imun i la activare se difereniaz n subpopulaia de Thelper (Th). Th Th). acioneaz prin producerea citokinelor. n funcie de profilul de citokine elaborate se disting 2 grupe de Th: Th1 i Th2. Diferenierea n Th1 este favorizat de IL-12 produs de macrofage. Citokinele secretate de macrofage. Th1 (IL-2, TNF i IFN-) favorizeaz rspunsul imun celular i hipersensibilitatea tardiv IFN- (activarea macrofagelor pentru distrugerea mi/o intracelulare, proliferarea i diferenierea limf. T citotoxice (Tc)). (Tc) Th2 recunosc Ag prezentate n special de limf. B. Secret IL-4, IL-5, IL-10 i IL-13, responsabile B. de imunitatea umoral. Favorizeaz proliferarea si diferentierea limf. B i producerea anticorpilor (Ac, Ig). (Ac, Ig) Exist o competiie ntre cele dou tipuri de Th: IFN- inhib diferenierea i proliferarea Th2, iar IL-4 inhib activitatea Th1. CD8 exprimat pe 40% LT. Recunosc Ag peptidice asociate cu moleculele CMH I (exprimate pe LT. toate celulele nucleate). Pot produce citokine, dar n special manifest activitate citotoxica. La citotoxica activare se difereniaz n limf. T citotoxice (Tc) i T- supresoare (Ts). Tc) TTs). ( ( Tc distrug celulele infectate cu virus, cu bacterii intracelulare sau celulele canceroase, intervin n respingerea grefelor (imunitatea celular). Ts suprim rspunsul imun fiind responsabile de tolerana imunologic. T-memorie asigur memoria imunologic. Raportul limfocitelor CD4/CD8 este de 1,5 Limfocitele B i T naive sunt celulele care inca nu s-au ntlnit cu un Ag. Dup interaciunea ntlnit cu Ag urmeaza activarea lor, proliferarea i diferenierea n celule efectoare (LB n plasmocite, LT n Th, Tc), care vor elimina microbii sau neutraliza toxinele lor prin diferite Tc), mecanisme. LBreprezint 10-15% din populaia limfocitar, cu o durat de via scurt, de 3-5 zile, iar LT constituie 70% cu o durat de via lung (luni, ani). Alte celule limfocitare (nule, neimuno-competente) 15% limfocitare Celule NK, capabile s distrug spontan celule canceroase i celule infectate cu virus. NK, Celule K, posed pe membrana lor receptori pentru fragmentul Fc al Ig. Distrug celulele-int K, acoperite cu Ac (Ig) fenomen de citotoxicitate Ac-dependent. 49. Recunoasterea antigenului de catre T si B limfocite. Celulele prezentatoare de antigen, functiile lor. Complexul major de histocompatibilitate. Clasele moleculelor CMH si implicarea lor in raspunsul imun umoral si celular. CELULELE PREZENTATOARE DE ANTIGEN (CPA) CELULELE BL recunosc direct prin intermediul BCR epitopi antigenici conformaionali solubili sau fixai pe membrane celulare. TL pot recunoate numai epitopi proteici liniari asociai cu molecule ale CMH expui pe lini suprafaa unor celule specializate CPA (restricie CMH). CPA profesioniste includ celulele dendritice foliculare i tisulare, monocitele / tisulare, macrofagele i limfocitele B ele le macrofag limfocite Funciile CPA Func 41

1. Captarea, fragmentarea (processing-ul) Ag proteice, selectia i expunerea pe suprafaa sa Captarea, fragmentarea (processing-ul) expunerea a peptidelor antigenice (epitopi liniari) asociate cu moleculele CMH. peptidelor 2. Transportarea acestor complexe spre tesutul limfoid periferic, unde complexul CMH-peptid complexe va fi prezentat LT naiv cu TCR specific, declanand activarea lui. declanand lui. 3. CPA care exprima peptide asociate cu CMH I vor interactiona cu limfocite TCD8, iar CPA care exprima peptide in asocoatie cu CMH II cu TCD4. 4. Producerea semnalelor secundare de activare a LT (secreia unor citokine). (secre COMPLEXUL MAJOR DE HISTOCOMPATIBILITATE Moleculele CMH reprezint un ansamblu unic de glicoproteine exprimate pe suprafaa celulelor organismului, care sunt veritabili markeri/Ag de identitate ai fiecrui individ. markeri/Ag ai Rolul moleculelor CMH: 1. Particip la prezentarea Ag peptidice TL. 2. Responsabilitate n respingerea grefelor. grefelor. CMH este transmis genetic. Genele CMH sunt situate pe cromozomul 6 la om, locus numit HLA (Human Leukocyte Antigen). Moleculele CMH sunt formate din 2 catene polipeptidice, Antigen). constituite din domenii extracelulare, un fragment transmembranar i o regiune intracitoplasmatic. Structura tridimensional a moleculei duce la formarea unei caviti, la fundul creia se afl R care vor interaciona cu peptide antigenice proprii sau strine. Al i i receptori ai CMH interacioneaz cu moleculele CD4 sau CD8 de pe TL. Se disting molecule (antigene) CMH de clasa I i de clasa II. Moleculele CMH I sunt exprimate pe toate celulele nucleate ale organismului. CMH I recunoaste si interacioneaz cu receptorul CD8 de pe TL. CMH I particip la prezentarea peptidelor antigenice scurte (9 AA) obinute n cursul degradrii particip in citoplasma (de ctre proteasome) a Ag endogene (molecule proprii sau proteine virale sintetizate de CPA). CPA) Complexul peptid/CMH I de pe suprafaa CPA (macrofage, celule dendritice) poate fi recunoscut de complexul TCR/CD8 complementar de pe TCD8 naive activarea limfocitelor, diferenierea lor n limf. Tc - iniierea rspunsului imun celular) Complexul peptid /CMH I de pe suprafaa celulelor infectate sau a celulelor tumorale poate fi recunoscut de complexul TCR/CD8 complementar de pe limfocitele efectoare Tc distrugerea celulelor ce conin Ag endogen. distrugerea Moleculele CMH de clasa II sunt exprimate pe celulele specializate n prezentarea Ag pt TCD4: CD4 limf. B, celule dendritice, monocite, macrofage. Ele pot prezenta peptide din 12-30 AA derivate 12-30 din degradarea n fagolizosome a Ag exogene (bacterii, protozoare, fungi, virioni liberi). n (bacterii, fungi, Complexul peptid/CMH II de pe celulele prezentatoare de Ag interacioneaz cu complexul TCR/CD4 de pe limfocitele CD4 naive sau efectoare (Th1, Th2). CD4 Astfel moleculele CMH II sunt implicate n ambele tipuri de imunitate: umoral i celular. Prezentarea Ag limfocitelor T. Ag este prezentat receptorului TCR sub form de peptide asociate moleculelor CMH de clasa I sau II de pe CPA. CPA. Limf. TCD8 recunosc n special Ag endogene, provenite din proteine citoplasmatice (molecule TCD8 endogene, proprii modificate sau proteine virale) degradate de ctre proteasome. Aceste peptide din 9 AA sunt prezentate n asociaie cu moleculele CMH de clasa I de pe macrofage, celule dendritice, dar i de pe suprafaa tuturor celulelor nucleate ale organismului. dendritice, Limf. TCD4 recunosc Ag exogene (provenite din bacterii, protozoare, virusuri libere). TCD4 (provenite protozoare, libere) Prezentarea este asigurat de ctre celule dendritice tisulare, celule Langerhans din epiderm, limf. B, monocite/macrofage (celule fagocitare). fagocitare). Dup captarea Ag i fragmentarea lor (n fagolizosome) peptidele antigenice selectate (15Dup 30 AA) sunt ataate de moleculele CMH II i expuse pe suprafaa CPA pentru a fi prezentate ata suprafa limf. TCD4 naive activarea i diferenierea lor n celule efectori Th1 sau Th2 Prezentarea Ag limfocitelor B poate fi realizata prin intermediul celulelor dendritice celulelor foliculare din splin i ganglioni limfatici. Aceste celule nefagocitare fixeaz prin intermediul receptorilor membranari Ag polizaharidice sau proteice prezentndu-le ulterior limfocitelor B.

42

50. Imunoglobulinele (Ig) si anticorpii. Structura monomerului de Ig. Valenta Ig, anticorpii completi si necompleti. Clasele de Ig si proprietatile lor. IMUNOGLOBULINELE (ANTICORPII) = glicoproteine din fracia -globulinelor. Se disting Ig membranare (BCR) i Ig solubile (secretate) Ac ca atare. (secretate) Ac = molecule glicoproteice produse de plasmocitele derivate din limf. B activate de Ag. Ac circul n snge i ptrund n esuturi. Sunt eficieni contra bacteriilor, toxinelor microbiene i virusurilor n poziie extracelular. STRUCTURA I PROPRIETILE Ig UNITATEA DE STRUCTUR a Ig (monomerul) este constituit din 2 lanuri glicoproteice (catene) identice uoare L (Light) i 2 catene grele H (Heavy), legate ntre ele prin puni disulfidice. (Light) (Heavy), Exist 2 tipuri de catene L i , identice ntr-o molecul de Ig. Se disting 5 clase de lanuri H: , , , , , ce corespund celor 5 clase (izotipuri) de Ig: Ig G, Ig A, Ig M, Ig D, Ig E. n componena lanurilor se disting regiuni variabile (aminoterminale) i regiuni constante (carboxilterminale). Regiunile variabile ale catenelor L i H formeaz o cavitate tridimensional - centrul activ (paratopul) al moleculei de Ig, care va reaciona specific cu determinanta antigenic (epitopul) Ag corespunztor, constituit din 5-7 AA sau 3-4 reziduuri glucidice. Regiunea variabil constituie fragmentul Fab (antigen binding) al moleculei de Ig. (a inding) Regiunea constant corespunde fragmentului Fc (constant, cristalizabil). Este purttor de receptori i responsabil de activitatea biologic a Ig: 1. Transportul transplacentar al unor Ig (Ig G) 2. Fixarea pe diferite celule (mastocite, bazofile, fagocite, limfocite, etc.) ixarea etc.) 3. Capacitatea de a fixa complementul 4. Capacitatea de fixare a prot. A a stafilococilor 5. Definete clasele i subclasele de Ig (specificitatea antigenic a catenei H) Monomerul de Ig este constituit din 2 fragmente Fab i unul Fc. ntre ele se afl zona balama, balama, responsabil de flexibilitatea moleculei de Ig. Numrul paratopilor determin valena Ig. Ac cu 2 sau mai muli paratopi se numesc Ac complei, cei cu un singur paratop Ac incomplei. Ig G, Ig D i Ig E sunt monomeri, Ig A din ser monomeri, din secretele mucoaselor dimeri, Ig M sunt pentameri. Proprietile claselor de Ig Ig G (4 subclase IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) 75% din ansamblul Ig serice. CS = 7S, GM = 150kDa. Sunt unicele Ig capabile s traverseze bariera placentar. Fc al IgG are centre de fixare a al are complementului (activarea C pe cale clasic), a macrofagelor i neutrofilelor (rol n opsonizare), a prot. A a stafilococilor. Perioada de semi-via 21 zile. Manifest activitate opsonizant, antibacterian, antitoxic, antiviral. . Ig M 5-6% din totalul Ig. Pentamer. CS = 19S, GM = 900kDa. Se distrug sub aciunea mercapto-etanolului sau cisteinei. Semi-viaa 5 zile. Fixeaz si activeaz complementul pe cale clasic. Nu traverseaz placenta, prezena Ig M la nou-nscut denot infecie intrauterin. Sunt primele care apar dup un stimul antigenic primar i indic un proces infecios acut. Monomeri de IgM constituie BCR pe B-limfocite. Ig A 15% din totalul Ig. CS = 7S, GM = 160 kDa. Bogate n glucide. Se disting 2 subclase: IgA1 (93%) i IgA2 (7%). Semiviaa 6 zile, nu traverseaz placenta, nu activeaz complementul pe cale clasic. clasic. Ig A serice (monomeri) 6% din totalul Ig serice. Agregate de IgA pot activa complementul pe cale alternativ. Ig A secretoare (sIg A) saliv, lacrimi, colostrum, lapte, secreii gastro-intestinale, nazale, bronhice. Dimer. Asigur protecia mucoaselor, blocnd ataarea bacteriilor i virusurilor de receptorii mucoaselor. Ig D 0,2% din totalul Ig. CS 6,5S, GM 170 kDa. Semi-viaa 3 zile. Rolul receptor pentru Ag (BCR) pe LB; posibil particip la eliminarea limfocitelor B care produc autoAc (Ac autoreactivi). Ig E 0,002 - 0,01%, CS 7,9S, GM 185 kDa. Semiviaa 2-3 zile. Nu traverseaz placenta, nu fixeaz complementul. Termolabile (inactivate la 56C n 30 min). Se pot fixa pe suprafaa mastocitelor i bazofilelor, determinnd degranularea lor cu eliberarea unor amine vazo-active 43

(oc anafilactic, dereglri alergice). Eficiente n afeciuni parazitare (opsonizarea helminilor i artropodelor) . 51. Raspunsul imun, consecintele. Etapele raspunsului imun. Notiuni de imunitate umorala si celulara. Functiile si efectorii. RI = proces complex, indus de ptrunderea unui Ag. Are loc n organele limfoide secundare i prevede implicarea mai multor celule (CPA, limfocite T, B, .a.) i substane solubile (citokine). Consecinele unui rspuns imun: Imunitate (umoral, celular) Hipersensibilitate (imediat, tardiv) Memorie imunologic Toleran imunologic Paralizie imunologic Ac sunt efectorii principali ai imunitii umorale, iar limfocitele Tc i macrofagele activate ale imunitii celulare. Imunitatea umoral este eficace contra bacteriilor non-invazive (extracelulare), virusurilor libere i contra toxinelor. Imunitatea celular intervine n special contra paraziilor intracelulari (bacterii, virusuri) i celulelor proprii modificate (tumorale) Etapele unui rspuns imun 1. ntlnirea Ag cu CPA, T-, B-limfocite. Are loc n organele limfoide secundare. secundare. 2. Recunoaterea specific a Ag, asigurat de limfocitele B i T nave prin receptorii pentru Ag (BCR, TCR). BL pot recunoate epitopi superficiali conformationali ale moleculelor de Ag native. TL recunosc doar epitopi lineari din Ag proteice prezentate de CPA in asociatie asociatie cu moleculele CMH. moleculele 3. Activarea, proliferarea i diferenierea T sau B limfocitelor n celule efectoare i celule B sau T-memorie. Coordonarea acestor procese este asigurat de contacte celulare directe T-memorie. i de citokine, eliberate de diverse celule. 4. Realizarea efectului (neutralizare, opsonizare, liz, etc). 52. Raspunsul imun umoral (RIU). Destinatia. Factorii implicati in declansarea si dezvoltarea RIU. Fazele RIU. RIU primar si secundar. RIU = form a imunitii achiziionate asigurat de Ac. Are funcia de a neutraliza i elimina microbii extracelulari i toxinele microbiene. In acest proces particip Ag, CPA, limf T4, limf B. particip Fazele rspunsului imun umoral: 1. Intalnirea Ag cu limfocitele B. Are loc in organele limfoide secundare. Ag patrunde direct n snge intlnirea are loc n splin . n s int . Ag penetreaz prin tractul respirator amigdale i esutul limfoid asociat bronhilor i penetreaz mucoaselor Ag penetreaz n tractul intestinal plcile Peyer, foliculii solitari penetreaz pl Ag patrunde prin tegument esutul limfoid asociat tegumentului. patrunde 2. Recunoaterea epitopilor unui Ag de ctre receptorul specific (BCR) de pe suprafaa B Recunoa c receptorul (B suprafa limfocitelor naive (selecia clonala) i activarea lor. (selec Limf B nave recunosc epitopii prin intermediul moleculelor de Ig M i Ig D (BCR) de pe suprafata lor, capabile s lege epitopi omologi cu forma complementara. s Antigenele T-independente (polizaharide, LPZ) la fixarea lor pe BCR activeaza direct limf B. La interactiunea BCR/Ag T-dependent (proteine), limf B naiv se comporta ca o CPA (inglobarea Ag, degradarea lui, selectarea peptidelor antigenice si prezentarea pe suprafata celulara a complexului peptid/CMH II pentru a fi recunoscute de limf TCD4). Primul semnal activator reprezinta interactiunea BCR cu epitopul Ag corespunzator. Semnale secundare intervin ulterior (ex.:fixarea pe limf B a fraciei C3d a complementului). Astfel limf B frac naiv este activat, fiind capabil sa produc cantitati mari de molecule CMH II, molecule coproduc stimulatoare i receptori pentru citokinele produse de limf Th. 3. Proliferarea limfocitelor B activate si diferentierea lor Dup activarea LB de un Ag T-independent urmeaza proliferarea lui intr-o clona de celule identice (expansiunea clonala) i diferenierea n plasmocite, care vor sintetiza si secreta Ac din clasa (izotipul) Ig M, memoria imunologica lipseste. 44

Dac LB a fost activat de un Ag T-dependent, stimularea proliferrii se va produce numai prin T-dependent, interaciunea dintre LB activat si limfocitul Th activat de acelai Ag. LB i LT au aceeai limfocitul Ag. specificitate antigenic, doar ca LB recunoate epitopi nativi (conformationali), iar L Th recunoate fragmente peptidice ale acestui Ag. Producerea limf Th are loc de asemenea n organele limfoide secundare (zonele timodependente), unde limfocitele TCD4 naive interacioneaz cu peptidul antigenic de pe CPA, dependente), urmnd proliferarea i diferenierea lor n limf efectoare (Th1, Th2), productoare de citokine. Th2 migreaz spre foliculii limfoizi, unde are loc ntlnirea lor cu limf B activat. Complexul TCR/CD4 de pe limf Th recunoate complexul peptid/CMH II de pe limf B activat. Ulterior se formeaza alte legaturi co-stimulatoare. Astfel limf Th devin capabile sa secrete citokine: IL- 4, 5, 10, 13, care vor actiona asupra LB activat . Aceste citokine induc proliferarea LB activate, stimuleaza diferentierea lor in plasmocite secretoare de Ac Ig M cu paratopul (centrul activ) identic cu BCR de pe LB (2000 Ac/sec sintetizate de un plasmocit). Sub influena plasmocit). citokinelor produse de limf Th unele LB pot s se diferenieze n plasmocite secretoare de Ig din alte clase (IFN IgG2; IL-4 Ig G4, IgE; TGF beta- IgA). IgG2; Ig IgE; Plasmocitele rmn n organele limfoide periferice, iar Ac secretai ptrund n circulaia sangvin. Unele plasmocite migreaz spre mduva osoas, continund s produc Ac mult timp (luni, ani), chiar dup eliminarea Ag. In caz de infectie a mucoaselor, plasmocitele se vor afla la nivelul mucoaselor (n Lamina propria), producand Ac (sIg A) care vor fi transportati la suprafata propria), mucoaselor. O parte din LB activate se transform n celule memorie. Limf B memorie nu secret Ac, ele circul prin snge i supravieuiesc mai multe luni sau ani fiind gata sa reacioneze la o ptrundere repetat a Ag. 4. Efectul interaciunii dintre Ag i Ac in vivo depinde de natura Ag i de tipul de Ac i se interac poate manifesta prin: Opsonizarea bacteriilor i intensificarea fagocitozei Activarea complementului pe cale clasic citoliz (inclusiv bacterioliz) Neutralizarea toxinelor, enzimelor Inhibiia adeziunii bacteriilor, virusurilor (IgA) Neutralizarea virusurilor extracelulare Imobilizarea bacteriilor si protozoarelor Citotoxicitatea mediat celular Ac-dependent (celulele acoperite de Ac sunt distruse de celulele K) Rspunsul umoral primar la primul contact cu Ag I faz de laten dureaz 4-7 zile, pn la apariia primilor Ac. In acest timp are loc are recunoaterea, degradarea Ag, diferenierea T,B limfocitelor. II faz logaritmic Titrul Ac crete, atingnd max n a 10-15 zi. Iniial are loc producerea Ig M, peste 4-5 zile - IgG sau alte izotipuri de Ig (prin comutatie de clasa sub influenta citokinelor produse de Th). Th). III faz de producere maxim a Ac Durata variaz n funcie de Ag. IV faz de diminuare a titrului de Ac (declin) n cazul Ag proteice dureaza sptmni, Ag diminuare (declin) polizaharidice luni, Ag virale ani). Rspunsul umoral secundar (la un contact repetat cu acelai Ag). Este asigurat de LB-memorie Perioad de laten scurt (ore) Ascensiune rapid a titrului Ac Titru maxim de Ac meninut o durat mai mare Afinitate crescut a Ac fa de Ag Producerea anticorpilor Ig G Serul sangvin obinut de la un organism imunizat cu un Ag conine o mare varietate de molecule de Ac, produi de diferite clone de LB. Acetia sunt Ac policlonali. diferite Aceti policlonali. Ac monoclonali sunt absolut identici. Se obin prin fuzionarea LB cu o celul tumoral. Hibridomul obinut se multiplic ca o celul tumoral i secret Ac omogeni, identici cu BCR. Servesc la detectarea receptorilor de pe suprafaa celulelor, tratament etc. etc. 53. Raspunsul imun celular (RIC). Destinatia. Factorii implicati in declansarea si dezvoltarea RIC. Fazele RIC. 45

Rolul RIC = a elimina microbii care pot supravieui n vacuole fagocitare sau n citoplasma celulelor infectate. Acest tip de imunitate este asigurat de limfocitele T. Acest T. Principalii efectori ai RIC sunt limfocitele Tcitotoxice (Tc) derivate din limf TCD8 (T8), care (T8), au capacitatea de a distruge celulele infectate cu virus sau tumorale i de a liza macrofagele liz macrofagele infectate cu bacterii facultativ intracelulare. Ambele tipuri de limfocite (TCD8 naive si Tc) infectate poseda TCR si molecule CD8. Macrofagele activate reprezint ali efectori ai RIC. Ele sunt atrase n focarul infecios, apoi Macrofagele activate atrase activate, devenind capabile s distrug bacteriile intracelulare. te, e activa capabil Celulele K i NK particip de asemenea la realizarea citotoxicitii (nu sunt angajate imun). imun). Limfocitele TCD4+ participa indirect la dezvoltarea raspunsului imun celular, deoarece n urma celular, recunoaterii Ag vor produce un numr mare de citokine care vor aciona asupra diferitor celule: monocite, limfocite TCD8, TCD4, celule NK, etc. celule: Dezvoltarea rspunsului imun celular I etapa Prezentarea Ag LT nave. Procesul are loc n organele limfoide periferice (OLP). nave. CPA profesioniste (macrofage, celule dendritice) capteaza Ag (ex.: celule infectate cu virus sau dendritice) celule tumorale) fagocitoza unele proteine virale pot fi transferate din fagosome in Ct ele vor fi fragmentate de catre proteasome asamblarea cu moleculele CMH I complexul peptid/CMH I este scos la suprafata CPA (peste 250.000 complexe per celula) CPA cu limfa sunt transportate in ganglionii limfatici, unde ele vor fi capabile sa prezinte Ag limfocitelor TCD8 nave. II etapa Recunoasterea epitopilor Ag de catre TCR unui LT CD8 naiv si activarea lui. Limf T8 nave vor recunoaste peptide asociate cu CMH I de pe suprafata CPA care au captat celule infectate cu virus. Epitopul trebuie sa corespunda cu TCR de pe limfocitul T8, iar CMH I va recunoaste situsuri de pe CD8. Aceaste interactiuni, precum si alte legaturi moleculare intre CPA si limf T8, participa la activarea limf T8 nave (costimulare). Citokinele eliberate de CPA se implica de asemenea. III etapa Proliferarea limfocitelor T8 (expansiunea clonala) si diferentierea lor. Dupa (expansiunea lor. activare, sub influenta unor citokine eliberate de limf Th1 (in special IL-2), are loc proliferarea limf T8 si diferentierea lor in celule efectoare Tc, capabile sa lupte cu infectia intracelulara Tc, sau celulele tumorale. Proliferarea incepe la 2 zile de la activarea limfocitelor i se produce rapid (peste o sptmn dup infectare pn la 10-20% din toate limf din OLP pot fi specifice pentru un Ag. N 1:106 ). Diferentierea in celule Tc are loc in paralel cu proliferarea. Celulele efectoare Tc prsesc OLP i migreaz spre tesutul infectat, unde, recunoscnd Ag, vor efectoare infectat, elimina infecia. Unele limfocite T se difereniaz n limfocite T memorie, durat de via lung, memorie, inactive funcional, dar sunt gata s reacioneze rapid la o nou expoziie la acelasi microb (rspuns celular secundar). IV etapa Realizarea efectului IC. Citotoxicitatea este rezultatul contactului specific direct dintre clona de Tc i inta lor (celule infectate cu virus sau bacterii intracelulare, celule tumorale). Celulele infectate prezint pe suprafaa sa peptide antigenice asociate cu moleculele CMH I, fiind recunoscute de ctre TCR i CD8 de pe limf Tc. CD8 Reacia citotoxic: contact membranar dintre Tc i celula-int limfocitele Tc elibereaz : perforine care se insereaz n membrana celulei-int formare pori. Paralel, limf Tc secret enzime (granzime) care penetreaz n Ct celulei prin pori apoptoza ei. IFN produs si secretat de Th1 este un activator puternic al macrofagelor, stimuland capacitatea lor de a distruge patogeni intracelulari. De asemenea, citokinele mentionate activeaza limf Tc si celulele NK, promoveaza proliferarea limf T4, stimuleaza producerea opsoninelor (intensificarea fagocitozei), activeaza neutrofilele, stimuleaza cresterea productiei de monocite in maduva osoasa, etc. Memorie imunologica Capacitatea sistemului imun de a elabora raspuns mai rapid, mai intens si mai eficace la intalniri repetate cu acelasi Ag. Toleranta absenta raspunsului imun la antigene proprii (self). Este determinata de inactivarea si eliminarea limfocitelor autoreactive in procesul de maturizare a limfocitelor T si B. CITOKINELE 46

Citokinele sunt molecule care permit diferitor celule s comunice ntre ele n producerea unei reacii. Citokinele reunesc un grup heterogen de molecule: interleukine (IL), limfokine, monokine, interferoni (IFN), factori de stimulare a coloniilor (CSF), factori de necroz a tumorilor (TNF), etc. Citokinele permit celulelor Sistemului Imun s se multiplice i s se diferenieze (ex.: IL-2 este un factor de cretere al TL, iar IL-4 stimuleaz BL i diferenierea lor n plasmocite productoare de Ig E) Citokinele sunt glicoproteine care acioneaz asupra celulelor prin intermediul receptorilor membranari, care nu sunt ntotdeauna activi. Expresia lor poate fi indus de o alt citokin (ex.: IL-1 induce receptorul pentru IL-2 pe T i BL) . Receptorii citokinelor sunt prezente i pe alte celule ale organismului. Astfel ele ar putea servi la comunicarea ntre Sistemul Imun i alte sisteme ale organismului, ca SNC i sistemul endocrin. 54. Reactiile de hipersensibilitate (RHS). Definitie. Particularitatile RHS. Clasificarea RHS in functie de mecanismele imunologice efectuate. Hipersensibilitate raspunsuri imune excesive sau anormale, capabile sa provoace leziuni provoace tisulare si maladii. Aceste reacii se pot dezvolta n cadrul mecanismelor de aprare fa de un microb patogen. n acelai timp, reacii similare pot fi dirijate contra substanelor de origine neinfectioasa. infectioasa. Particularitile RHS: RHS sunt specifice de Ag/alergen. specifice RHS sunt induse de un contact primar cu Ag/alergenul care provoac rspunsul imun specific (umoral, celular). RHS sunt declanate la contacte ulterioare repetate cu acelai Ag/alergen. Clasificarea RHS dup mecanismele imunologice efectuate (Gell, Coombs) Hipersensibilitatea de tipul I (reacii imediate, anafilactice) Hipersensibilitatea de tipul II (citolitic-citotoxic) Hipersensibilitatea de tipul III (prin complexe imune) Hipersensibilitatea de tipul IV (tardiv) Hipersensibilitatea de tipul V (prin autoAc) 55. Reactiile de hipersensibilitate de tip I (imediate, anafilactice). Factorii implicati, alergenii. Anafilaxia locala si generala, mecanismul reactiilor. Depistarea RHS de tipul I. Combaterea reactiilor anafilactice. RHS imediate mai sunt numite alergie sau atopie. Persoanele predispuse la astfel de reactii sunt numite atopice. Antigenele care declanseaza o hipersensibilitate imediata sunt calificate atopice. ca alergeni. Manifestrile patologice survin timp de 15-30 min dup rentroducerea alergenului n organismul sensibilizat. n reaciile anafilactice particip Ig E. la persoanele predispuse la alergii intalnirea cu unele Ag determina activarea limf Th2 si producerea Ac Ig E. Fiind sintetizate n timpul primului contact cu alergenul, IgE se fixeaz pe receptori ai mastocitelor (n special din esutul conjunctiv sau din mucoase), persistnd mai multe luni. La ptrunderea repetat (percutan, prin mucoase, intravenos) antigenul omolog leag ncruciat fragmentele Fab ale Ig E vecine de pe mastocite. Aceasta duce la eliberarea din mastocite. celule a unor mediatori, substane biologic active (histamin, serotonin, Factorul de Necroz al Tumorilor, prostaglandine, leucotriene). Ele se fixeaz pe receptorii terminaiilor nervoase inducnd contracia musculaturii netede (bronice, intestinale, uterine), (bronice, uterine) vasodilataie, creterea permeabilitii vasculare cu edem, reacie urticarian n tegument i hipersecreie de mucus la nivelul bronic. Aceste reactii survin la cateva minute de la reintroducerea Ag. Alti mediatori ai mastocitelor citokinele recruteaza, pe parcursul al catorva ore, neutrofile si eozinofile la nivelul localizarii reactiei. Acest proces inflamator al RHS imediate reprezinta faza tardiva a reactiei. Este responsabila de leziunile tisulare provocate de catre atacurile repetate de hipersensibilitate imediata. Anafilaxia general (ocul anafilactic)

47

Este cea mai brutal i grav reacie declanat de un Ag/alergen. Se manifest n cteva secunde dup administrarea parenteral a dozelor mari de Ag/alergen cu semne clinice sistemice: urticarie, asfixie, colaps circulator i oc. Poate duce la deces subit. Ag responsabile de ocul anafilactic: medicamente (analgezice, anestetice, AB, seruri sangvine de animale, enzime), venin de viespi, de albine, alimente. Anafilaxia local (alergenul administrat n doz foarte mic sau depus pe o mucoas) La nivelul mucoaselor: conjunctivita alergic, rinita, astmul i traheita spasmodic (alergeni: polenuri, dejecte de acarieni din praful de cas) Forme cutanate: dermatita atopic i urticaria cutanate: Alergia alimentar: manifestri extradigestive (urticarie, edem Quincke, astm, anafilaxie) i alimentar: digestive (diaree, vome) Depistarea RHS tipul I: Teste cutanate prin aplicarea cutanat sau administrarea intradermic a alergenilor. Reacie pozitiv peste 15 min local apare o reacie eritemo-papuloas. Teste de provocare se efectueaz la astmatici, prin administrarea alergenului n aerozol (pe cale nazal, ocular, oral) i msurnd modificrile imediate i tardive a volumului expirat maxim. Dozarea imunoenzimatic sau radioimun a Ig E Principii de tratament Evitarea alergenului Desensibilizarea prin administrarea repetata a dozelor mici de Ag, care induce sinteza Ac Ig Ag, G Tratament simptomatic (inhibitori ai degranulrii mastocitelor, anti-histaminice, etc) 56. Reactiile de hipersensibilitate de tip II (citolitic-citotoxice). Factorii implicati, consecintele. Diagnosticul si combaterea RHS de tipul II. RHS de tipul II (citolitic-citotoxice) Implic Ac (Ig G sau Ig M) dirijai contra unui Ag natural sau exogen fixat pe suprafaa unei celule sau a unui esut. Se dezvolt n cteva minute sau ore. Afecteaz n special celulele sngelui, provocnd citoliza prin activarea complementului sau prin opsonizare i fagocitoz de ctre macrofage. Celulele K de asemenea pot distruge celulele opsonizate. Aceste mecanisme cauzeaz citopenie. Reacii transfuzionale (prezena Ac anti-hematii n timpul unei transfuzii sanguine poate induce hemoliz intravascular prin activarea C pe cale clasic). Maladia hemolitic perinatal prin incompatibilitate Rhesus. Mama Rh- se imunizeaz n cursul primei graviditi contra ftului Rh+ la trecerea hematiilor fetale n sngele matern (la natere, n timpul unui avort). La o graviditate ulterioar, mama pre-imunizat contra factorului Rh+ poate sintetiza Ig G anti-Rh+, dac ftul este iari Rh+. Aceti Ac pot traversa bariera placentar i liza hematiile ftului la finele graviditii, provocnd o hemoliz grav. Prevenirea: administrarea Ac anti-Rh+ tuturor femeilor Rh- n primele 48 ore de la naterea Prevenirea: unui copil Rh+ sau a unui avort. Aceti Ac opsonizeaz hematiile fetale din sngele matern i provoac eliminarea lor rapid. 3. Hemoliza imun de origine medicamentoas (medicamentul se depune pe membrana eritrocitar i Ac anti-medicament distrug eritrocitele acoperite de acest medicament). 4. Trombocitopenii i granulocitopenii. Diagnostic: Diagnostic: Depistarea Ac contra celulelor (esuturilor) implicare Prezena Ac i C n leziuni, depistai prin RIF 57. Reactiile de hipersensibilitate de tip III (mediate de complexe imune solubile). Factorii implicati. Mecanismul, manifestarile patologice. Depistarea RHS de tipul III. RHS de tipul III (mediate de complexe imune Ag-Ac solubile) n mod normal CI sunt eliminate repede din organism. n unele circumstane CI persist perioade ndelungate. Cauze: Infecii cronice: angine streptococice, endocardite bacteriene, hepatite virale, parazitoze, etc esuturi proprii devenite auto-reactive n urma unor procese distructive (ex.: colagenoze) esuturi Introducerea albuminei serice n cantiti mari (tratament cu seruri imune) 48

Mecanismul: Complexele Ag-Ac solubile activeaz C i determin leziuni n locul formrii sau depunerii lor n esuturi sau pe endoteliul vascular. Fenomene patologice locale: reacia Arthus, glomerulonefrita, artrit, poliatrerite. Se produc locale: n exces de Ac dup 3-10 ore de la contactul cu Ag. Fenomene patologice generale: boala serului (n exces de Ag). generale: Depistarea RHS de tipul III: Evidenierea CI n biopsii tisulare. Se efectueaz utiliznd RIF, RIE sau ARI Titrarea Complementului seric (diminuarea titrului) 58. Reactiile de hipersensibilitate de tip IV (mediate celular, tardive). Tipurile. Factorii implicati, alergenii. Depistarea RHS de tipul IV. RHS de tipul IV (mediate celular, tardive, ntrziate) Sunt determinate de limfocite T CD8 (Tc) sau TCD4 (Th1) activate la contactul secundar cu Ag sensibilizant. Sunt cunoscute 3 modele de hipersensibilitate tardiv: Hipersensibilitatea tuberculinic Reacia granulomatoas Dermatitele de contact Hipersensibilitatea tuberculinic este indus de infecii bacteriene, virale, fungice sau parazitare, prin vaccinare cu vaccinuri vii atenuate sau cu proteine fixate pe un adjuvant complet. Ptrunderea repetat a Ag activeaz limdocitele Th1 specifice de acest Ag, ducnd la activarea Tc i eliberarea unor citokine, responsabile de acumularea local a celulelor mononucleate cu apariia eritemului i formarea unui infiltrat, n unele cazuri chiar i necroz. Leziunea apare peste 48 ore i dispare n 3-5 zile. Hipersensibilitatea granulomatoas apare n cursul sensibilizrii cu substane insolubile sau greu digerabile (constituienii unor parazii, compui lipoidici ai micobacteriilor, brucelelor, etc). n aceste cazuri RHS se prelungete i se manifest prin formarea, n cteva sptmni sau luni, a unui granulom. n componena granulomului se disting 3 zone: central, din celule epitelioide, intermediar din limfocite i fibroblaste i periferic din leucocite PMN, limfocite B i plasmocite. Granulomul poate fi supus fibrozei i calcifierii, persistnd mai muli ani. Hipersensibilitatea de contact este determinat de haptene (metale grele - Ni, Cr, substane chimice cauciuc, clei, pesticide, vopsele, produse cosmetice, medicamente). Aplicate percutan se combin cu proteinele membranare, n special ale celulelor Langerhans din epiderm. Aceasta duce la expansiunea clonal a limfocitelor TCD8+. La contacte repetate cu aceeai hapten, citokinele eliberate de limfocitele activate determin infiltrarea celular a glandelor sudoripare, sebacee, a foliculilor piloi, a epidermei. Peste 48-72 ore local se observ eritem, edem i formarea veziculelor. Explorarea hipersensibilitii tardive T e s t e c u t a n a t e (in vivo) Dermatitele de contact se depisteaz prin aplicarea cutanat a haptenelor i examinarea eritemului, infiltratului cutanat i a veziculelor aprute peste 48 ore. Hipersensibilitatea tuberculinic se exploreaz prin introducerea intradermic a alergenilor microbieni: tuberculina (derivat proteic al unei culturi de Mycobacterium tuberculosis), tuberculosis), brucelina, tularina, antraxina, dizenterina, etc. Peste 48 ore se msoar diametrul eritemului i induraiei. Reacia pozitiv denot c organismul a fost n contact cu alergenul (infecie anterioar sau actual, vaccinare) i c acesta persist n macrofagele organismului. Pentru confirmarea maladiei sunt necesare investigaii suplimentare. Teste in vitro Testul de transformare limfoblastic (limfocitele unei persoane cu hipersensibilitate tardiv cultivate in vitro n prezena Ag /alergenului suport o transformare blastic cu proliferare ulterioar). 49

Testul de inhibiie a migrrii leucocitelor (activarea limfocitelor T de ctre Ag specifice duce la secreia citokinelor care inhib migrarea leucocitelor) 59. Imunizarea artificiala activa. Vaccinurile. Caracteristica imunitatii postvaccinale. Vaccinarea primara si de rapel. Cerintele fata de vaccinuri. Notiuni de vaccinoterapie si vaccinoprofilaxie. 60. Vaccinurile vii atenuate. Obtinerea, avantajele si dezavantajele vaccinurilor vii. Exemple. 61. Vaccinurile inactivate (omorate). Obtinerea, avantajele vaccinurilor inactivate. Exemple. Autovaccinul, utilizarea practica. si dezavantajele

62. Vaccinurile subunitare (fragmentate, chimice) si anatoxinele. Obtinerea, avantajele si dezavantajele vaccinurilor subunitare. Notiune de adjuvant. Vaccinurile adsorbite. 63. Imunizarea artificiala pasiva, caracteristica. Preparatele biologice cu anticorpi, tipurile, cerintele fata de ele. 64. Clasificarea serurilor imune curative dupa provenienta si modul de actiune. Caracteristica lor, avantajele si dezavantajele serurilor omoloage si heteroloage. 65. Utilizarea practica a preparatelor biologice cu anticorpi. Modul de administrare, reactiile adverse si prevenirea lor. 66. Rectiile antigen (Ag) anticorp (Ac) in vitro. Caracteristica legaturii Ag-Ac. Fazele interactiunii Ag-Ac. Aplicarea practica a reactiilor serologice. Serurile imune diagnostice, diagnosticurile: obtinerea, aplicarea practica. Studiul i aprecierea imunitii poate fi efectuat prin intermediul diferitor teste realizate in vitro sau in vivo (reacii imunologice). Pentru aprecierea rspunsului imun umoral se studiaz interaciunea dintre Ag i Ac, iar pentru aprecierea imunitii celulare se determin numrul total de limfocite, subclasele limfocitelor T, se evalueaz citokinele, etc. REACIILE ANTIGEN-ANTICORP in vitro (REACIILE SEROLOGICE) REAC (REAC SEROLOGIC Reacia Ag-Ac este determinat de interaciunea specific dintre epitopii Antigenului i eac este determinat interac specific epitopii Antig paratopii Anticorpilor. n acest proces intervin patru tipuri de legturi: legturi de hidrogen, ii Anticorpilor. i eg paratop t l leg hi legturi electrostatice, forele Van der Waals i legturi hidrofobe. electrostatic for leg hi drof Legtura Ag-Ac are trei caracteristici: este exotermic, specific i reversibil. are tre caracteristici: este exotermic, specific reversibi Afinitatea unui Ac pentru un Ag specific caracterizeaz intensitatea forelor de legtur a finitate unui pentru specific caracteriz intensitate for leg complexului Ag-Ac. Ea depinde de complementaritatea steric dintre paratop i epitop. complexului Ea complementaritate steric dintre epitop. Aviditatea unui Ac pentru un Ag specific reprezint rapiditatea apariiei manifestrii reaciei ate entru c reprezint rapiditate apari vidit p specifi reac Ag-Ac (precipitare, aglutinare, etc.). Ea depinde de constanta de asociere, de valen a Ac, de precipitare, aglutinare, etc.). Ea depi nde constanta de asociere, a de numrul de epitopi, de temperatur, de pH, de for a ionic a mediului. de epitopi temperatur de a ionic mediului. Un paratop se poate combina cu un singur epitop, numit specific. Astfel, dac este specific Astfel, cunoscut unul din elementele reaciei - Ag sau Ac, poate fi identificat cellalt unul din elementele reac poat identificat Reaciile Ac-Ac (reaciile serologice) au dou direcii de aplicare practic: Seroidentificare: Detectarea i dozarea Ag (element necunoscut - tulpini microbiene eroidentificare: etectarea doz tulpini izolate din diferite prelevate) cu ajutorul Ac specifici cunoscui. specifici Pot fi utilizate dou surse de Ac: Ac monoclonali, absolut omogeni, dar care recunosc doar Pot utilizate dou surs monoclonali, omogeni, recu un singur epitop i Ac policlonali, ce se con in n seruri imune (antiseruri), care permit i clonali, antiseruri) pol in ( permi legturi de aviditate nalt cu Ag. aviditate Serurile imune se obin prin injectarea la un animal de laborator a antigenelor cunoscute. injectarea antigenelor cunoscu te. Dup o perioad de timp, serul animalului va conine anticorpi contra acestor antigene. Dar ti serul animalului con anticorpi contra aces natura exact a Ac din acest ser nu poate fi cunoscut cu exactitate (Ac policlonali). Specificitatea serului trebuie s fie permanent controlat i Ac nedorii trebuie s fie pecificitate serului eliminai prin adsorbie. elimina prin adsorbi 50

Serodiagnostic: Detectarea i titrarea Ac din serul bolnavilor (component necunoscut) erodiagnostic: etectarea titrar fa de un Ag specific cunoscut (coninut n diagnosticuri). specific cuno (con Unele reacii Ag-Ac se manifest direct i pot fi observate de experimentator: de exemplu reac manifest observate experimentato exemplu precipitarea sau aglutinarea complexelor Ag-Ac, liza unor celule purttoare de Ag pe precipitarea sau aglutinarea complexelor Ag-Ac, membrana lor (hemoliz, bacterioliz, etc). (hemoliz, bacterioliz, Alte reacii Ag-Ac nu se vizualizeaz spontan in vitro. n acest caz se va recurge la nite reac nu viz ualiz recurge artificii experimentale, cum ar fi utilizarea Ac marcai: artificii experimentale, marca Ac marcai cu un fluorocrom: imunofluorescen a. marca a Ac marcai cu un izotop radioactiv: analiza radio-imun. marca iz radio-imun Ac marcai cu o enzim: analiza imunoenzimatic. marca enzi imunoenzi matic. INTERACIUNEA ANTIGEN-ANTICORP UNEA Faza specific: are loc interaciunea dintre Ag i Ac specific corespunztor. Este un specific: fenomen rapid, invizibil, comun pentru toate reaciile Ag-Ac. Decurge la temperatura de 37 inviz ibi toate reac C, n prezena unui electrolit (sol. fiziologic). Faza nespecific, vizibil a uniunii Ag-Ac, se manifest prin precipitare, aglutinare, liz, etc nespecific, viz ibi precipitare aglutinare, - fenomene determinate de anumite condiii (valena Ac, dimensiunile Ag, etc). 67. Reactia de aglutinare (RA). Componentele, mecanismul. Reactiile de aglutinare directa (pe lama, in tuburi). Lectura si aprecierea rezultatelor reactiilor. Aplicarea practica. REACIA DE AGLUTINARE Din latin agglutinatio - ncleiere Reacia Ag-Ac se poate manifesta prin aglutinare atunci cnd determinantele antigenice sunt purtate de particule figurate (Ag insolubile, corpusculare), iar Ac specifici sunt complei (cel puin bivaleni). Aglutinarea este determinat de formarea unei reele ntre Ag i Ac, ce permite apropierea unui numr suficient de particule figurate pentru a constitui aglutinate vizibile cu ochiul liber. Ac IgM cu 10 epitopi poteniali aglutineaz mai activ dect Ac IgG. Clasificarea reaciilor de aglutinare Aglutinare activ sau direct, n care particula figurat (Ag corpuscular) este el nsui activ direct, purttor de determinante antigenice specifice (hematii, leucocite, trombocite, spermatozoizi, bacterii) Aglutinare pasiv sau indirect, n care particula servete doar de suport pentru un pasiv indirect, determinant antigenic solubil fixat artificial pe suprafaa sa. Frecvent sunt utilizate ca suport hematii formolate, particule de latex sau microcristale de colesterol. Reactii de aglutinare activa (directa) Reactii de aglutinare activa (directa Aspect calitativ alitativ Reactia poate fi efectuata pe lama de sticla sau in tuburi. a poate efectuata eacti lama in tuburi. Reactia pe lama eactia lama Se amesteca o picatura de ser si o picatura de suspensie bacteriana (Ag). Lectura se face la de suspensie (Ag). ectura face microscop sau cu ochiul liber. In caz de reactie pozitiva apar conglomerate, iar lichidul se sau liber. caz reactie poz itiva clarifica; clarifica; in caz de reactie negativa, caz reactie negativa lichidul ramane tulbure. ramane tulbure. Reactia in tuburi eactia tuburi In eprubeta se amesteca serul si Ag figurate (hematii, bacterii). serul figurate (hematii bacterii Reactia pozitiva se manifesta prin formarea unui sediment cu aspect de umbrela inversata a poz itiva in formarea unui eacti pr inversata la fundul tuburilor (peste 20-24 ore) i clarificarea lichidului. Aprecierea intensitaii reaciei fu ndul tuburilor se efectueaza dupa sistema de 4 plusuri (++++). Celulele neaglutinate se sedimenteaza la fundul tuburilor sub forma de buton sau inel elulele ne aglutinate sedimenteaza fu ndul tuburilor sub forma sau (reactie negativa). Lectura se face cu ochiul liber sau folosind oglinda concava a (reactie negativa ectura face concava microscopului. Aspect cantitativ antitativ Metoda dilutiilor succesive etoda dilutiilor Initial se efectueaza dilutii succesive ale serului (1/50, 1/100, 1/200, etc) in care se introduc ulterior cantitati egale de Ag. Termostat 2 ore, apoi la t camerei 18-20 ore. cantitati ore. Aprecierea: cea mai mare dilutie a serului in care se manifesta aglutinare de cel putin 3 : Aprecierea + (+++) se numeste titrul anticorpilor aglutinanti (titrul serului aglutinant). aglutinant). 51

Aglutinarea directa este utilizata pentru determinarea grupelor sangvine sau in diagnosticul glutinarea directa este utilizata pentr determina grupelor sangv ine sau diagnosticul unor maladii infectioase (seroidentificarea Ag sau depistarea i titrarea Ac din serul maladii infectioase bolnavilor) . Reactile de aglutinare pasiva (indirecta) Reactile de aglutinare pasiva (indirecta Aglutinarea pasiva consta in fixarea unui Ag solubil (sau al unui Ac) pe un suport corpuscular glutinarea pasiva consta fixa unui solubi (sau inert, care nu intervine in reactia Ag-Ac. In calitate de suport inert pot servi hematiile, inert, intervi reactia particule de latex, cristale de colesterol. Suspensia de particule sensibilizate cu Ag sau Ac ristale uspensia este pusa in contact cu serul imun (respectiv cu Ag), ca si in cazul aglutinarii directe. e l respectiv est seru ( Avantajele reactiilor indirecte: facilitatea lecturii si sensibilitatea inalta. reactiilor indirecte: facilitate lecturii sensibilitate inalta. Reactia de hemaglutinare indirecta (pasiva) RHAI / RHAP eactia de hemaglutinare indirecta pasiva Unele antigene de origine polizaharidica se fixeaza practic spontan, dupa o scurta incubatie, fixeaza prac tic spontan, curta incubatie pe suprafata hematiilor. Antigenele proteice se fixeaza doar dupa o pregatire prealabila a hematiilor. Antigenele proteice fixeaza pregatire prealabi hematiilor (de ex.: tratarea cu tanina, formol). hematiilor (de tanina, RHAI se efectueaz in godeurile unei placi din polistiren. Reactia pozitiva se manifesta prin unei placi polistiren. eactia poz itiva prin aglutinarea eritrocitelor sensibilizate (umbrela inversata de culoare bruna la fundul aglutinarea godeurilor). godeurilor) n reacia de latex-aglutinare Ac sau Ag sunt fixai pe particule de latex. Reacia se efectueaz pe lama de sticl. Reacia de latex-aglutinare este utilizata in identificarea factorului reumatoid la bolnavi facto ului re suspecti de poliartrita reumatoida, in bacteriologie pentru identificarea rapid a mi/o sau Ag suspecti poli artrita re umatoida pentru lor n prelevate, sau identificarea tulpinilor izolate, de asemenea pentru serodiagnosticul unor infecii. Reacia de Co-aglutinare. La baza acestei reacii se afl proprietatea unei bacterii Staphylococcus aureus (tulpina Cowan) - ce are n componena peretelui celular proteina A - s fixeze Ig G prin intermediul Cowan) fragmentului Fc. Astfel se formeaz diagnosticuri cu Ac, cu ajutorul carora pot fi identificare Ag respective necunoscute. Reacia se efectueaz pe lam. REACIA COOMBS Unii Ac (monovaleni) nu sunt aglutinani n condiii normale, fiind monovalenti (ex.: anticorpii anti-Rh, responsabili de incompatibilitatea materno-fetal n sistemul Rh). Ei pot fi depistai graie testelor Coombs. Sunt posibile 2 tehnici, n funcie de prelevat: snge de la nou-nscut sau de la femeia gravid. Tehnica Coombs direct. La un nou-nscut se caut prezena Ac materni anti-Rh fixai pe hematii, dac mama este Rh-. La aceste hematii suspecte se adaug un ser anti-Ig uman. Acest ser nu aglutineaz hematiile normale, din contra, el provoac aglutinarea hematiilor pe care sunt fixai Ac anti-Rh. Tehnica Coombs indirect. La o femeie gravid Rh- Ac anti-Rh sunt prezeni n ser. Iniial la acest ser se agaug hematii Rh+ (pentru formarea complexului Ag-Ac), apoi se aplic agau serul anti-Ig. 68. Reactia de hemaglutinare indirecta (RHAI) cu scop de seroidentificare. Componentele, mecanismul. Lectura si aprecierea rezultatelor RHAI. Aplicarea practica. 69. Reactia de hemaglutinare indirecta (RHAI) cu scop de seroidiagnostic. Componentele, mecanismul. Lectura si aprecierea rezultatelor RHAI. Aplicarea practica. 70. Reactiile de aglutinare pasiva (indirecta). Reactiile de latexaglutinare si de coaglutinare. Componentele, mecanismul. Lectura si aprecierea rezultatelor reactiilor. Aplicarea practica. 71. Reactia Coombs. Componentele, mecanismul. Lectura si aprecierea rezultatelor reactiilor. Aplicarea practica. 52

72. Reactiile de precipitare. Mecanismul. Conditiile formarii retelei de precipitare. Reactia de precipitere inelara. Componentele. Lectura si aprecierea rezultatelor reactiilor. Aplicarea practica. 73. Reactiile de precipitare in gel. Clasificarea. Reactia de imunodifuzie dubla (tehnicile Elek, Ouchterlony). Componentele, mecanismul. Lectura si aprecierea rezultatelor reactiilor. Aplicarea practica. REACTIILE DE PRECIPITARE Imunoprecipitarea se manifesta doar atunci cand Ag solubil este amestecat cu Ac corespunzator. Ea poate fi observata sau in mediu lichid, sau solid, fiind sau calitativa, sau cantitativa. Acestea sunt reactii specifice dar putin sensibile, ce necesita cantitati importante de anticorpi. Precipitarea complexelor moleculare rezultate din uniunea Ag-Ac este determinata de rez formarea unei retele tridimensionale de Ag reunite prin Ac. Condiiile de formare a reelei de precipitare: Condi re Ac sa fie cel putin bivalent (Ac completi) Ag sa fie multivalent (haptenele nu pot fi precipitate) Precipitarea maxima corespunde cu zona de echivalen, unde Ac si Ag sunt in raport echivalen, optimal de concentraie, ce permite precipitarea tuturor moleculelor de Ac cu Ag concentra corespunzator. n exces de Ag sau de Ac precipitatul nu se formeaz. Utilizare: n medicina legala (determinarea apartenenei de specie a diferitor proteine: apartenen proteine: snge, sperm, etc), n igiena alimentar (depistarea falsificrii alimentelor), n diagnosticul alimentar (depistarea falsific maladiilor infectioase, etc PRECIPITAREA IN MEDIU LICHID Reactia de precipitare inelara Intr-un tub cu diametrul de cinci millimetri se introduce serul imun; pipeta se inclina si pe imun; peretii ei se lasa sa se prelinga incet solutia de Ag, ca sa nu se amestece cu serul. Daca Ac din ser corespund cu Ag, in zona de separare a celor doua lichide Ag, se formeaza un inel alb, ceea ce semnifica precipitarea complexului Ag-Ac. Avantajul metodei rapiditatea si simplicitatea. Utilizarea practica: identificarea practica: petelor de sange, depistarea falsificarilor produselor alimentare, depistarea antigenului polizaharidic al agentului antraxului in omogenat de organe (reactia Ascoli). Reacia de floculare (tehnica Ramon) Se efectueaz diluia succesiv a serului imun (Ac) la care se adauga cantiti egale de Ag. Se ntroduc probele n termostat i periodic se examineaz pentru depistarea tubului n care apare precipitatul iniial (zona de echivalen). Utilizare: pentru determinarea cantitii de toxin, antitoxin sau anatoxin. PRECIPITAREA N MEDIU SOLID (N GEL) n aceste reacii Ag i Ac difuzeaz unul spre altul prin geloz i n zona de concentraie optim a acestor dou reactive se produce precipitarea sub form de linii albe-cenuii. Dac exist mai multe sisteme Ag-Ac, se vor forma linii de precipitare distincte. Poate fi utilizat n analiza calitativ a unui amestec de Ag ntr-o soluie. Imunodifuzia simpl radial (tehnica Mancini) Se efectueaz pe o plac acoperit cu geloz, n care sunt ncorporai Ac specifici. Ag este depus n godeurile din stratul de geloz. Ag difuzeaz radial n geloz pe parcursul a 48 ore. Dac Ag corespunde Ac, atunci are loc formarea de discuri de precipitare, cu suprafaa proporional concentraiei Ag din godeu. Se utilizez pentru depistarea i cuantificarea Ig, hormonilor, enzimelor, etc. Imunodifuzie dubl (tehnicile Ouchterlony i Elek) Se acoper cu geloz o plac de sticl sau se toarn geloza n cutia Petri. 53

n tehnica Ouchterlony Ag i Ac difuzeaz din godeurile situate la o distan de 15 mm unul de altul. n tehnica Elek cele 2 reactive difuzeaz din benzile de hrtie plasate pe suprafaa gelozei. Moleculele difuzeaz n gel n funcie de greutatea lor i formeaz linii de precipitare pentru fiecare sistem Ag-Ac ce corespund n zona lor de echivalen. Dac dou Ag sunt identice, liniile lor se unesc, dac sunt diferite se intersecteaz. Utilizarea determinarea toxinelor (toxigeneza), antitoxinelor, Ag proteice Contraimunoelectroforeza (CIEF) Este util la examinarea amestecurilor antigenice complexe. Lectura este posibila peste 90 minute. Geloza este turnat pe o plac de sticl, Ag i Ac sunt dispui n rezervoare circulare de 2 mm diametru, la o distan de 10 mm. n timpul electroforezei Ag, ncrcat negativ, migreaz spre polul pozitiv, ntlnind Ac care migreaz spre catod. La interaciunea Ag i Ac omologi are loc formarea liniei de precipitare. CIEF servete la examinarea componentelor Ag din lichide biologice: LCR, urin, lichid pleural, ascit, etc. 74. Reactia de fixare a complementului (RFC) cu scop de seroidiagnostic. Componentele, mecanismul. Lectura si aprecierea rezultatelor reactiei. Aplicarea practica. 75. Reactia de fixare a complementului (RFC) cu scop de seroidentificare. Componentele, mecanismul. Lectura si aprecierea rezultatelor reactiei. Aplicarea practica. 76. Reactia de imunofluorescenta (RIF, reactia Coons) directa. Componentele, mecanismul. Lectura si aprecierea rezultatelor reactiei. Aplicarea practica. REACII DE CITOLIZ IMUN (cu participarea complementului) Activarea fraciilor complementului (C) duce la liza particulei purttoare de Ag (hematii, bacterii, diverse celule...) Activarea complementului Calea clasic Calea alternativ Calea lectinic Activarea C pe cale clasic Activatorul l constituie complexe Ag-Ac (IgG, IgM) l Consecutivitatea activrii C: Ag-Ac fixeaz fracia C1qrs, care capt ulterior activitate esterazic (n prezena obligatorie a Ca++) C1 activeaz C4, cu formarea complexului AgAcC1C4b. Este apoi activat C2 (AgAcC1C4bC2a), complexul C4bC2a devenind convertaz ce acioneaz asupra C3 Urmeaz clivarea C3 n C3a (anafilotoxin) i C3b, care se unete de complex (AgAcC1C4bC2aC3b), formnd C5-convertaza, care cliveaz C5 n C5a i C5b (AgAcC1C4bC2aC3b), C5b se leag de membrana celulei-int. Urmeaz fixarea simultan a C,6,7. La final se fixeaz C8, apoi C9, formnd complexul de atac membranar. Fixarea lor produce leziuni ireversibile liza celulei. Calea alternativ de activare a C Activatori: endotoxine, celule infectate cu virus, levuri, parazii, venin de cobr, agregate de IgA sau IgE. C1,4 i 2 nu intervin i reacia ncepe cu C3. Properdina, factorul B i ionii de IgE. Mg++ sunt obligatorii n procesul de activare pe cale alternativ. Calea lectinic de activare a C este determinat de legarea unor lectine pe unele grupri de manoz, carbohidrat prezent n componena multor mi/o i absent la ma/o. Lectina este echivalent fraciei C1q. Alte 2 molecule se asociaz, formnd o enzim similar C1, ceea ce duce la formarea complexului C4bC2a (C3-convertaza) Componentele reaciilor de liz: 54

Ag (celule bacteriene, hematii, etc) Ac (lizine - IgG i IgM) Complement ser proaspt de cobai sau ser de cobai liofilizat Reacia de bacterioliz (RBL) Ag suspensie de bacterii vii (vibrioni, leptospire...) suspensie Ac serul imun sau serul bolnavului Complement RBL in vitro Se efectueaz diluia succesiv a serului Se adaog suspensie microbian vie Se adaog complement (martor: Ag+ser fiziologic+C) Incubare 2 h la 37C 37 Rensmnare pe cutii cu geloz cte 0,1 ml din fiecare diluie (24h 37 C) Lectura se compar nr coloniilor crescute din martor i probele studiate Titrul cea mai mare diluie a serului n care au fost lizate cel puin 50% din celule RBL in vivo vivo Amestecul dintre Ag i Ac se inoculeaz intra-peritoneal la animale de laborator (ex.: oareci albi) Peste fiecare 10 min, timp de o or, se extrage lichidul peritoneal, se pregtete un preparat nativ i se examineaz pe fond negru sau cu contrast de faz. Rezultat pozitiv numrul bacteriilor scade treptat pn la dispariie. Utilizarea RBL diagnosticul holerei (RVL), leptospirozelor (RALL) Reacia de hemoliz (RHL) Ag hematii de berbec, suspensie de 3% Ac ser imun de iepure anti-hematii de berbec (serul hemolitic) Complement Principiul reaciei: complexele Ag-Ac formate fixeaz C i-l activeaz pe cale clasic, provocnd hemoliza. Intensitatea hemolizei se apreciaz vizual (++++) sau prin msurarea densitii optice a hemoglobinei eliberate. Utilizarea practic a RHL: pentru dozarea C, precum i n montarea reaciei de fixare a complementului. REACIA DE FIXARE A COMPLEMENTULUI (RFC) Este o reacie complex, constituit din 2 sisteme Ag-Ac i cu participarea C. n RFC particip Ig capabile s fixeze C IgM i IgG. RFC se utilizeaz n diagnosticul virozelor, infeciilor bacteriene, etc Toate componentele RFC sunt utilizate n acelai volum fiind titrate n prealabil pentru aprecierea dozelor de lucru. Reacia este nsoit de martori ai tuturor componenilor Reacia se efectueaz n 2 etape utiliznd 2 sisteme. I etap Sistemul de baz este constituit din Ag1 (diagnosticuri sau Ag necunoscute), Ac1 (serul bolnavului sau serul imun) i complement n doza de lucru. Amestecul este incubat 1h la 37 C sau meninut 16-18 ore la 4 C. Dac Ac se combin cu Ag omolog va avea loc i 37 fixarea C (efect frecvent invizibil). II etap la sistemul de baz se adaog sistemul indicator (hemolitic), constituit din hematii de berbec (Ag2) combinate cu Ac specifici (Ac2). Peste 1h incubare la 37 C reacia 37 este terminat. Evaluarea rezultatelor dac complementul a fost fixat de primul sistem Ag-Ac hemoliza nu se observ (rezultat pozitiv). Dac Ag1 nu corespunde cu Ac1, complementul rmne disponibil pentru fixare pe sistemul indicator Ag2-Ac2, provocnd hemoliza (rezultat negativ) Complement Fixation Tehnici serologice cu utilizarea Ac marcai n unele cazuri este imposibil de a detecta o reacie Ag-Ac: unii Ac nu precipiteaz, alii nici nu precipiteaz, nici nu aglutineaz, exist complexe Ag-Ac care nu fixeaz C. n aceste cazuri pot fi utilizai Ac marcai pentru a vizualiza Ag respectiv. Conjugarea Ac cu marcani nu afecteaz proprietile lor imunologice. Aceste reacii se monteaz pe suport solid (lam, plci din plastic) 55

Marcanii utilizai uzual: Fluorocromi (rodamina, fluoresceina), care emit respectiv o lumin rou-oranj sau verdegalben la tratarea lor cu raze UV (Reacia de Imuno-Fluorescen) Enzime (fosfataza alcalin, peroxidaza), capabile s modifice culoarea unui substrat (Reacia Imuno-enzimatic) Radio-izotopi (125J sau 3H), care emit respectiv raze gamma i beta (Analiza Radio-Imun) Reacia de imunofluorescen (RIF, reacia COONS) Metoda direct (numai n scop de seroidentificare). Din materialul ce conine Ag (material nativ, cultur pur, biopsie tisular) se prepar un frotiu, peste care se aplic serul imun specific cu Ac marcai cu fluorocrom. Peste 20 min de incubare ntr-o camer umed preparatul este studiat la microscopul luminiscent. n caz de reacie pozitiv se observ luminiscen local. Inconvenient necesitatea de a avea seruri imune marcate specifice pentru fiecare Ag. Metoda indirect. Poate fi utilizat pentru sero-identificare i sero-diagnostic. indirect. Pe frotiul ce conine Ag se aplic Ac corespunztori nemarcai. Peste 20 min se spal minuios preparatul, apoi se adaog anti-Ig fluorescent, care se va combina cu Ac din complex. Acest reactiv poate fi utilizat n numeroase reacii. Anti-Ig se obine prin imunizarea iepurilor (sau altor animale) cu Ig. Tehnica fondat pe fixarea C: Markerul fluorescent este un ser anti-complement care se va lega de complementul fixat pe complexul Ag-Ac. RIF se utilizeaz pentru identificarea rapid a Ag din biosubstrate sau pentru serodiagnostic. Reacia Imuno-Enzimatic (RIE, ELISA -Enzyme Linked Immunosorbent Assays). -Enzyme ssays). RIE direct (metoda sandwich). Utilizat doar n sero-identificarea Ag. n godeurile din placa de polistiren n care sunt fixai Ac cunoscui se toarn soluia de Ag necunoscut. Se incubeaz 1h. Dup o splare minuioas a godeurilor se adaog Ac marcai cu enzime, care se fixeaz pe epitopii liberi ai Ag polivalent. Dup incubare de 30 min-1h se spal iari godeurile. Prezena complexului Ac-Ag-Ac-marcat se depisteaz cu ajutorul substratului cromogen (substan iniial incolor, dar care se coloreaz sub aciunea enzimei, ex. apa oxigenata si orthofenilendiamina). RIE indirect. Utilizat n serodiagnostic. Ag cunoscut este fixat la fundul godeurilor. Ac (serul testat) se ntroduce n godeu, dup 1h se spal totul i se adaog ligandul marcat cu enzim (anti-Ig sau proteina A cuplate cu enzim). Acest ligand se fixeaz pe Ac testai. Se adaog apoi substratul cromogen. Cantitatea de Ac se msoar dup densitatea optic a lichidului din godeuri.

Tehnica imunoblot (western blot) permite identificarea Ag dintr-un amestec. amestec. I etap electroforeza n gel a probei de Ag II etap transferul electric al Ag pe membrana de nitroceluloz III etap pe membran sunt aplicai succesiv Ac dirijai contra Ag, apoi conjugatul marcat cu enzim, care permite depistarea Ac fixai. Dup o splare se adaog substratul cromogen. Fiecare complex Ag-Ac formeaz zone colorate distincte. Utilizare: depistarea Ac Utilizare: anti-HIV, caracterizarea Ac monoclonali... Proteinele sunt separate electroforetic n gel poliacrilamid. Sub aciunea cmpului electric are loc difuzia proteinelor conform greutii moleculare, aranjndu-se n zone liniare subiri diferite: mai aproape de start se aranjeaz proteinele cu mas molecular mare (120-150 kDa), la final se aranjeaz proteinele cu mas molecular mic (5-10kDa). Apoi lamela de gel este transferat pe o foaie de nitroceluloz amplasat ntre electrozii unei surse de curent continuu. Sub aciunea cmpului electric are loc trecerea proteinelor din gel pe nitroceluloz, unde se fixeaz foarte bine pe hrtie. Proteinele fixate sunt marcate cu o enzim (e.g. alkaline phosphatase sau peroxidase) incolor. Procedura ulterioar de montare a reaciei este similar tehnicii ELISA.

56

Analiza radioimun (ARI) Principiul este identic cu cel al RIE Ag se fixeaz la fundul godeurilor din placa de plastic. Se adaog Ac testai care se vor combina cu Ag omolog. Dup splarea godeurilor, se adaug un ligand radiomarcat (anti-Ig). Dup eliminarea excesului de izotopi prin splare, se msoar radio-activitatea: ea este proporional cu concentraia Ac dozai. Reacia de neutralizare (RN): formarea complexelor Ag-Ac duce la neutralizarea efectului biologic al Ag (neutralizarea toxinelor, enzimelor, virusurilor). Reacia de imobilizare Unii anticorpi anti-bacterieni pot provoca imobilizarea bacteriilor mobile (vibrioni, spirochete) 77. Reactia de imunofluorescenta (RIF, reactia Coons) indirecta. Componentele, mecanismul. Lectura si aprecierea rezultatelor reactiei. Aplicarea practica. 78. Reactia imunoenzimatica (RIE, ELISA) directa (tehnica sandwich). Componentele, mecanismul. Lectura si aprecierea rezultatelor reactiei. Aplicarea practica. 79. Reactia imunoenzimatica (RIE, ELISA) indirecta. Componentele, mecanismul. Lectura si aprecierea rezultatelor reactiei. Aplicarea practica. 80. Reactiile de hemaglutinare (RHA) si de inhibare a hemaglutinarii (RIHA). Componentele, mecanismul. Lectura si aprecierea rezultatelor reactiilor. Aplicarea practica.

81.Infectiile stafilococice. Clasificarea stafilococilor (familie, gen, sp.). Factorii de patogenitate. Habitatul, infectiile cauzate. Diagnosticul microbiologic. Prelevatele. Metoda microscopica, izolarea si identificarea culturii pure. Markerii epidemiologici. Profilaxia si tratamentul specific al infectiilor stafilococice. CARACTERISTICA GENERAL A GRUPULUI COCILOR PIOGENI Familia Staphylococcaceae Genuri: Staphylococcus Gamella Macrococcus Salinicoccus Familia Streptococcaceae Genuri: Streptococcus Lactococcus Familia Neisseriaceae Genul: Neisseria Caracter comun capacitatea de a condiiona procese supurative-distructive. 57

Morfologic reprezint coci (sferici, lanceolai, riniformi), imobili, nesporogeni, unele specii formeaz capsule. n funcie de caracterele tinctoriale se disting: Coci G+ (Staphylococcaceae, Streptococcaceae) Coci G- (Neisseriaceae) Cocii piogeni se deosebesc prin: a. Caractere de cultur (exigene nutritive, tipul de respiraie, etc) b. Caractere biochimice c. Factori de patogenitate Rolul n patologia uman: Infecii nespecifice Infecii specifice (gonoreea, scarlatina, etc) GENUL STAPHYLOCOCCUS Se disting 2 grupuri (varieti): Stafilococi coagulazo-pozitivi - SCP foarte viruleni (S.aureus, S.intermedius) Stafilococi coagulazo-negativi SCN potenial-patogeni (aproximativ 30 specii: S.epidermidis, S. saprophyticus, S. capitis, S.haemolyticus, S.hominis, etc) Habitat: 20-70% din populaie sunt purttori: S.aureus - cavitatea nazal, intestin, S.epidermidis narine, tegument, S.saprophyticus - tegument. Staphylococcus aureus Caracterele morfobiologice Caractere morfo-tinctoriale: coci gram+, n frotiu se aranjeaz n grmezi neregulate (greac: staphylos-ciorchine, kokkos grunte), n perechi sau izolat . Imobili, nesporogeni, necapsulai (uneori microcapsule) Caractere de cultur: facultativ anaerobi, nepretenioi la cultivare, cresc pe medii uzuale. Temperatura optima 37C, pH-7,07,5. n BP turbiditate uniform Geloza salin cu glbenu de ou-GGO (3 % NaCl) Mediul Chapman (7,5 % NaCl, manitol) Geloz-snge Colonii S, opace, pigmentate (auriu, citric, alb), pe geloz-snge cauzeaz hemoliz. Pe GGO coloniile sunt nconjurate cu un halou opac (aciunea lecitinazei). Caractere biochimice: catalazo-pozitivi, fermenteaz manitolul Factori de patogenitate I. Factori structurali: peptidoglicanul (induce secreia citokinelor de ctre celulele limfocitare, responsabile de starea de oc) acizii lipoteichoici (induc o hipersensibilitate tardiv) proteina A (asigur fixarea Fc al IgG, mpiedic opsonizarea i fagocitoza) adezine, care permit fixarea S.aureus pe diverse molecule plasmatice ale gazdei: Fibronectin i laminin. Fibronectina este prezent pe suprafee epiteliale i endoteliale, precum i n chiaguri sanguine. Fibrinogen. Fixarea de fibrinogen asigur aderarea la chiaguri i esuturi lezate. Colagen. Tulpinile ce posed astfel de adezine cauzeaz osteomielite i artrite septice Microcapsula, rol antifagocitar II. Toxine 1. Alfa-toxina (alfa-hemolizina). Efect citolitic fa de trombocite, monocite, hematii, cu eliminarea citokinelor, care pot fi cauza ocului septic stafilococic. 2. Beta-toxina (sfingomielinaza). Prezent la tulpinile izolate de la bovine cu mastit. 3. Gamma i delta-toxine. Efect leuco- i hemolitic. 4. Leucocidina, efect litic fa de leucocite i macrofage, factor important n procese dermonecrotice 5. Exfoliatine (epidermolizine) A i B. Manifest tropism cutanat. 58

6. Mecanism: se fixeaz de unele proteine cutanate (profilagrin i filagrin), inducnd desprinderea intra-epidermic dintre stratum granulosum i stratum spinosum, cu formarea leziunilor buloase (impetigo bulos, sindromul pielii oprite). 7. Enterotoxine: A, B, C1, C2, C3, D, E, G. Termostabile, rezistente la aciunea enzimelor proteolitice ale tubului digestiv. Determin intoxicaii alimentare (enterotoxina B poate cauza oc toxic). 8. Toxina sindromului toxic stafilococic (TSST-1). Determin stare de oc stafilococic. Toate toxinele sunt imunogene. Enterotoxinele, TSST-1 reprezint superantigene, activnd 20% de limfocite T (particip la declanarea strii de oc) III. Coagulazele Coagulaza liber - protein extracelular care se leag de protrombina gazdei cu formarea unui complex. Astfel activat, trombina determin conversia fibrinogenului n fibrin cu coagularea plasmei. Reprezint cauza tromboflebitelor septice i protejeaz cocii de fagocitoz. Coagulaza legat (clumping factor) este un determinant superficial al S.aureus fixator de fibrinogen. Antifagocitar. Provoac fenomenul de aglutinare a stafilococilor n prezena fibrinogenului. IV. Stafilokinaza (fibrinolizina) activator al plasminogenului (asociat cu bacteriofagi lizogeni). Complexul stafilokinaz-plasminogen manifest activitate proteolitic, cauznd dizolvarea trombilor (responsabil de localizri septice secundare). V. Enzime de patogenitate: Hialuronidaza faciliteaz diseminarea bacteriilor Alte enzime: proteaze, lipaze (inclusiv lecitinaza), ADN-aze, fosfataze, etc. Rol n diseminarea infeciei i producerea leziunilor. Se disting multiple serotipuri de S.aureus, iar receptorii pentru bacteriofagi permit clasificarea n lizotipuri (fago-variante). Epidemiologia infeciilor stafilococice Sursa de infecie: omul bolnav sau purttori sntoi de germeni. Rareori bovinele bolnave de mastit. Mecanismele i cile de transmitere: Contact direct sau diseminare manuportat Contact indirect (alimente, praf, mbrcminte, etc) Factori favorizani: diabet, tratament imunosupresiv, arsuri, plgi, etc Formele clinice ale infeciilor cu S.aureus Infecii supurative Infecii cutanate: foliculite, furuncule, carbuncule, abcese, panariiu, infecie de plag (frecvent de origine nosocomial). Exfoliatina determin sindromul pielii oprite (sindromul Lyel) la copii, pemfigus epidemic la nou-nscui (boala Ritter) i impetigo bulos la maturi. Infecii ale mucoaselor: mastoidite, sinusite, otite, angine... Infecii ale seroaselor: artrite, pleurezie, peritonit, meningit... Infecii osoase: osteomielit, spondilodiscit, infecie de protez Infecii viscerale: abces pulmonar, cerebral, flegmon perirenal, pielonefrite, etc Septicemii i endocardite. Cauzate i ntreinute de un focar infecios primar complicat de tromboflebit. n mediu spitalicesc au caracter nosocomial (catetere intravasculare, proteze valvulare cardiace, articulare, stimulatoare cardiace...) Manifestri digestive Intoxicaii alimentare (doza toxic - 1g la 100 g aliment). Vome, diaree, deshidratare, absena febrei Enterocolite consecutive unei antibioterapii Sindromul ocului toxic stafilococic: febr, hipotensiune arterial, erupie cutanat scarlatiniform, stare de oc, leziuni viscerale (cerebrale, renale, hepatice, musculare). Descris n 1978 n SUA la femei care utilizau tampoane periodice i sufereau de vaginit cu S. aureus. Tulpini responsabile de acest sindrom pot fi izolate din diverse leziuni stafilococice. Infecii cauzate de SCN 59

S.epidermidis determin infecii asociate cu proteze i catetere, frecvent de origine nosocomial (endocardite, endoftalmii, peritonite la pacieni cu dializ peritoneal, bacteriemii). S.epidermidis produce un polizaharid de adeziune, care-l fixeaz pe implante din plastic. S.saprophyticus i S.haemolyticus pot cauza infecii ale tractului urinar S.lugdunensis infecii de plag, endocardite Imunitatea antistafilococic este mixt: celular i umoral Diagnostic de laborator Materiale de examinat n funcie de forma clinic Diagnostic direct Examen microscopic direct (Gram, RIF) Examen bacteriologic. La interpretare se ine cont de datele clinice. n caz de infecii nosocomiale sau otrvire alimentar se identific markerii epidemiologici (lizotip, serotip, antibiotip). Determinarea antibiogramei este obligatorie (tulpini multirezistente). Identificarea acizilor nucleici prin tehnici de biologie molecular n cazuri particulare se caut prezena toxinelor (reacia de latex-aglutinare, ELISA) Diagnostic indirect (serologic) Se examineaz seruri sanguine pentru depistarea anticorpilor anti-stafilolizine-alfa (titru> 2 UI/ml) n caz de infecii profunde sau cronice, sau anti-acizi teichoici (titru> 1:16) n caz de endocardite sau focare inaccesibile. Tratamentul specific al infeciilor stafilococice: autovaccinuri, vaccinuri inactivate, seruri imune (n infecii cronice) Antibiotice: peniciline semi-sintetice (oxacilin), augmentin, imipenem, aminoside, macrolide, fluorochinolone, glicopeptide (vancomicin, teicoplanin) cotrimoxazol, fosfomicin, rifampicin, acidul fuzidic, etc Profilaxia specific: plasm antistafilococic, Ig anti-stafilococic, ser hiperimun, anatoxin stafilococic 82.Infectiile streptococice. Clasificarea streptococilor (familie, gen, sp.). Clasificarea dupa aspectul hemolizei si structurii antigenice. Factorii de patogenitate (structurali,exotoxinele, enzimele de patogenitate). Infectiile cauzate de S.pyogenes. Diagnosticul microbiologic. Prelevate patologice. Metoda microscopica, izolarea culturii pure, identificarea. Serodiagnosticul scarlatinei si reumatismului. FAMILIA STREPTOCOCCACEAE Genul Streptococcus (fragili i exigeni la cultivare) Genul Lactococcus (anterior streptococi din grupul N) Genul Streptococcus Reunete specii facultativ anaerobe caracterizate prin morfologie tipic (coci gram+ n lanuri, imobili, nesporogeni, capsulai), metabolism fermentativ i lipsa catalazei. Clasificarea streptococilor Dup aspectul hemolizei pe geloz-snge Streptococi beta-hemolitici (hemoliz complet, zon clar n jurul coloniilor) Streptococi alfa-hemolitici (hemoliz incomplet, zon verzuie n jurul coloniilor) Streptococi nehemolitici (gamma-hemoliz) 2. Clasificarea imunologic Lancefield Dup antigenul polizaharidic C din peretele celular se disting 20 grupe serologice (A H, K W). Streptococii care nu posed acest Ag nu se ncadreaz n clasificarea Lancefield (ex.: S.pneumoniae). Ei se identific dup caractere de cultur i biochimice. 3.Dup habitat i patogenitate Streptococi piogeni, viruleni, beta-hemolitici (aparin grupurilor A,B,C,G) Streptococi orali, comensali, nehemolitici sau alfa-hemolitici, negrupabili dup Lancefield Streptococi fecali, specii comensale sau condiionat patogene ale tractului digestiv uman i animal Streptococi lactici, reprezint flora laptelui i produselor lactate 60

Diferenierea streptococilor patogeni de cei saprofii se efectueaz de asemenea n baza criteriilor Cherman: Creterea la 10 i 45 C Creterea n bulion cu 6,5% NaCl Creterea n mediu cu pH 9,6 Hidroliza esculinei pe mediu cu 40% bil Liza culturii n bulion biliat Sensibilitatea la bacitracin i optochin Hidroliza hipuratului de sodiu Streptococcus pyogenes (gr. A) Bacterie strict uman, posibil portaj oro- i nasofaringean (20%). Caractere morfologice: lanuri scurte sau perechi de coci sferici gram+, imobili, capsulai, nesporogeni. Caractere de cultur: facultativ-anaerobi, cultiv pe medii elective. Pe geloz-snge, dup 18-24 ore incubare la 37 C colonii S mici, cu zon de -hemoliz. n bulion glucozat, bulion-ser formeaz depozit la fundul i pe pereii tubului. S.pyogenes este sensibil la bacitracin. Structura antigenic a S.pyogenes (Lancefield-Griffith): Polizaharidul C din peretele celular, specific pentru grupul A (dup Lancefield). Poate fi identificat n RP, latexaglutinare, co-aglutinare. Proteinele de suprafa: M (fimbriale), R i T (uneori asociate cu acizii lipo-teicoici), care permit diferenierea n 90 serotipuri (dup Griffith). Proteina M manifest reactivitate imunologic ncruciat (mimicrie antigenic) cu constitueni normali ai organismului (miozin, sarcolem, sinoviale), determinnd procese imunopatologice (manifestri post-streptococice). Ag proteice de tip se identific prin RP (Ag M) i RA (Ag T). 3. n MCP exist Ag comun cu membrana bazal a glomerulilor renali Factori de patogenitate Factori de structur Capsula din acid hialuronic, neimunogen. Efect antifagocitar Proteina M, adeziune, antifagocitar Acizii lipoteichoici, adeziune la celule epiteliale Proteina F, receptor de fibronectin 2. Toxine Streptolizinele O (oxigen-labil) i S (oxigen-stabil). Sunt toxine citolitice. SLO manifest efect cardiotoxic, hemolitic. Inhib chimiotactismul PMN i reduce activitatea celulelor imunocompetente. Induce formarea Ac neutralizani antistreptolizine (ASLO). SLS nu este imunogen. Manifest activitate citolitic i leucotoxic. Toxinele eritrogene (pirogene) A, B i C sunt determinate de fagi moderai. Au activitate de superantigen, producnd inflamaie asociat cu stare de oc. Mitogene i imunosupresive. Tulpinile lizogene determin scarlatina. 3. Enzime de patogenitate: hialuronidaza, streptodornaza B (ADNaza), lipoproteinaza, streptokinaza (fibrinolizina) Epidemiologia infeciilor provocate de S.pyogenes Sursa de infecie: bolnavii i purttorii sntoi (faringe i amigdale, mai rar anus, vagin, tegument). Mecanismele i cile de transmitere: Aerogen (picturi Pflugge) Contact direct (leziuni cutanate) Patogenia i formele clinice ale infeciilor provocate de S.pyogenes Infecii ale mucoaselor Sfera ORL: rinite, faringite, angine eritematoase (risc de reumatism articular acut), abcese periamigdaliene, adenite cervicale, sinusite, otite, mastoidite. Scarlatina (angin streptococic nsoit de erupie cutanat). Infecii cutanate i subcutanate: erizipel, impetigo, celulit, fasciit necrozant, mionecroz (sindromul Meleney), eritemul nodos, infecii ale plgilor i arsurilor 61

Septicemii Sindromul ocului toxic streptococic, secundar unei infecii locale, n special subcutanat Alte infecii: endometrite, pneumonii Infecii post-streptococice RAA (reumatismul articular acut), mai frecvent la copii de vrst colar. Apare dup infecii faringiene i este determinat de aciunea direct a streptolizinei, depozite de complexe imune (RHS III), precum i prin interaciunea autoAc i al Ac anti-streptococici cu autoantigene din miofibrile, valvule cardice i sinoviale (RHS II). Glomerulonefrita acut (GNA) Maladie a copilului de vrst precolar. Survine dup 10-20 zile de la o infecie cutanat, mai rar faringean. Se caracterizeaz prin perturbarea funciei renale, edem i hipertensiune arterial. Patogenie: efect toxic direct, reacii autoimune, bazate pe asemnarea unor Ag streptococice din MCP i membrana bazal glomerular (RHS II i III), persistena formelor L. Imunitatea antistreptococic este specific de tip, asigurat de Ac anti-proteina M. Ac anti-eritrotoxin protejeaz de eritemul scarlatinos. Streptococcus agalactiae (gr. B) Alfa-hemolitic. Streptococ piogen animal (bovidee), ocazional gzduit de om n orofaringe, vagin i intestin. Rol n patologie: La gravide: infecie urinar, infecie de plag, amniotite, endometrite, avort sau natere prematur La nou-nscut: infecie precoce (septicemie, pneumopatie n primele 10 zile de via) sau tardiv (meningit) La adult: infecie de plag, osteo-artrite, infecii uro-genitale, septicemii, endocardite, meningite. Streptococi din grupul C (S.equisimilis, S.equi) i din grupul G Beta-hemolitici cu rezervor animal i uman (tegument, mucoase). Responsabili de infecii cutanate, faringite, septicemii post-partum, infecii osteoarticulare, meningite, pneumopatii. Rareori urmate de GNA. Excepional pot cauza scarlatin. Streptococii din grupul D (S.bovis, S.equinus) Fac parte din flora comensal a tubului digestiv al omului i animalelor. Rolul n patologia uman: endocardite, infecii neonatale, cholecistite, peritonite, infecii urinare, septicemii. 83.Infectiile pneumococice. Clasificarea agentului (familie, gen, sp.). Factorii de patogenitate. Infectiile cauzate. Diagnosticul microbiologic. Prelevatele. Microscopia directa, izolarea si identificarea culturii pure, diferentierea de S.pyogenes. Profilaxia specifica a infectiilor pneumococice. Streptococii negrupabili (lipsii de antigene de perete) Streptococcus pneumoniae (prezent pe mucoasele omului i ale unor mamifere, n special n nasofaringe) Ali streptococi negrupabili (S.mitis, S.mutans, S.oralis, S.sanguis). Prezeni n cavitatea bucal, joac rol n geneza cariei dentare, n infecii materno-fetale, bacteriemii i endocardite Streptococcus pneumoniae Caractere morfo-tinctoriale: diplococi ovoizi sau lanceolai, gram+, imobili, nesporogeni, capsulai. Caractere de cultur: cultiv pe medii elective (geloz-snge, geloz-ser, bulion-ser), pH optimal 7,8. Pe geloz-snge, peste 18-24 ore de incubare la 35-37 C n atmosfer cu 5-10% CO2, formeaz colonii S mici, cu o zon de hemoliz alfa (verzuie). Din cauza autolizei pneumococilor centrul coloniilor se deprim. Tulpinile necapsulate formeaz colonii R. Structura antigenic Antigene capsulare, de origine polizaharidic. Permit clasificarea pneumococilor n 90 serotipuri. Antigenul proteic R, mascat de Ag capsulare Antigenul proteic M, specific de tip 62

Factori de patogenitate: Capsula (rol antifagocitar) Adezine sIgA - proteaz Acidul lipoteichoic (implicat n reacii inflamatoare cu semne generale i leziuni tisulare, posibil oc) Autolizinele (eliberarea unor factori bacterieni cu rol n virulen) Pneumolizina (hemolizina). Efect citotoxic asupra celulelor epiteliale i endoteliale. Reduce activitatea bactericid a PMN. Hialuronidaza Neuraminidaza S.pneumoniae se difereniaz de ali streptococi prin: Sensibilitatea la optochin Liza culturii de pneumococi n prezena srurilor biliare (activarea autolizinelor) testul de solubilitate n bil Patogenitatea pneumococilor pentru oarece Prezena capsulei Hidroliza inulinei Epidemiologia infeciilor cu pneumococi Sursa de infecie purttorii sntoi (naso-faringe) sau bolnavii Calea de transmitere aerogen Infeciile cauzate de S.pneumoniae Infecii respiratorii: pneumonia franc lobar acut, broncho-pneumonii, bronite, otite, sinusite, mastoidite. Meningite (n special la copii) Bacteriemii cu artrite, peritonit, pericardit, endocardit. Imunitatea antipneumococic este specific de tip, prin Ac anti-capsulari. Diagnosticul de laborator al infeciilor streptococice Prelevate n funcie de forma clinic (tampon faringean sau cutanat, puncie a esutului subcutanat, LCR, puroi, snge, etc) Metodele de diagnostic Diagnosticul direct Examenul microscopic (frotiu Gram orientativ, RIF) Examenul bacteriologic (de baz) Detectarea serologic a Ag specifice Identificarea ADN prin tehnici de biologie molecular Diagnosticul indirect (util n infecii post-streptococice) Evidenierea Ac ASLO n cazul RAA (titru diagnostic > 200 UA/ml) Ac antistreptodornaz B (titru diagnostic > 240 UA/ml) + ASLO n cazul GNA Dozarea Ac anti-hialuronidaz (titru diagnostic > 350 UA/ml) i anti-streptokinaz (titru diagnostic > 160 UA/ml) Diagnosticul scarlatinei Pentru identificarea eritemului scarlatinos se utilizeaz reacia Schultz-Charlton (antieritrotoxina inoculat n erupie determin dispariia exantemului) Reacia Dick pentru depistarea Ac anti-eritrotoxin (determinarea receptivitii la scarlatin). I/dermic se inoculeaz 0,1 ml eritrotoxin. Rezultat pozitiv: peste 24 ore eritem local peste 10 mm (lipsa anti-eritrotoxinei, receptivitate) Rezultat negativ: absena eritemului (anticorpi prezeni, persoan imun la scarlatin) Profilaxia specific a infeciilor streptococice Vaccin contra S.pyogenes nu exist (variabilitatea proteinei M, Ag comune cu esuturile umane) Femeile purttoare de S.agalactiae sunt imunizate cu vaccin din polizaharide capsulare Exist un vaccin anti-pneumococic, constituit din antigene capsulare mai frecvent ntlnite n regiune 63

Tratamentul infeciilor streptococice S.pyogenes este sensibil la penicilina G i macrolide. Tratamentul anginelor previne complicaiile post-streptococice. S.pneumoniae este sensibil la peniciline i cefalosporine. Exist tulpini rezistente la tetraciclin, eritromicin, macrolide. Familia Enterococcaceae Genul Enterococcus Specii: E.faecalis, E.faecium, E.durans, etc Caractere morfo-biologice: coci ovoizi, gram+, dispui n perechi sau lanuri scurte. Anaerobi facultativi. Diferenierea de genul Streptococcus: cresc la 10 i 45 grade C, se multiplic n prezena a 6,5% NaCl, hidrolizeaz esculina n mediu cu 40% bil i produc piridonil arilamidaz. Habitat: comensali ai intestinului omului i animalelor, uneori se ntlnesc pe mucoasa genital, n orofaringe i pe tegument. Reprezint markeri microbiologici de poluare fecal a mediului. Rezisteni n mediul extern i la antibiotice. Rolul n patologia uman: endocardite, infecii urinare, meningite, infecii neonatale. Frecvent infecii cu caracter nosocomial (infecie de plag). 84.Infectiile meningococice. Clasificarea meningococilor (familie, gen, sp.). Factorii de patogenitate. Infectiile cauzate. Diagnosticul microbiologic. Prelevatele. Metoda microscopica. Izolarea si identificarea culturii pure. Depistarea antigenelor meningococice in LCR. Profilaxia specifica. Clasificarea (Bergey's 2001) : Familia Neisseriaceae Genurile - Neisseria, Kingella, Chromobacterium, Aquaspirillum Genul Neisseria include dou specii patogene umane importante N. gonorrhoeae i N.meningitidis (neisserii pretenioase). Specii comensale, gzduite pe mucoasele tractului respirator i digestiv, conjunctiv, vagin, uretra distal (neisserii nepretenioase): Neisseria flava; Neisseria flavescens; Neisseria subflava; Neisseria perflava; Neisseria lactamica; Neisseria mucosa; Neisseria pharyngis; Neisseria polysaccharea; Neisseria sicca; Neisseria sp. In unele condiii se pot comporta ca patogeni oportuniti. Caractere generale ale genului Neisseria Coci gramnegativi, asociai n diplococi, uneori tetrade, imobili Bacterii carboxifile, cu metabolism respirator Catalazo- i oxidazo-pozitive Sunt gzduite pe mucoasele omului i animalelor Speciile patogene sunt exigente la cultivare Neisseria meningitidis 1884 - Marchiafava si Celli observ diplococi gramnegativi n LCR al unui pacient cu meningit 1887 - Weichselbaum izoleaz bacteria din LCR i demonstreaz rolul ei etiologic Bacterie strict uman care colonizeaz rinofaringele la un numar mare de purttori sntoi (5-30%). Portajul poate avea o durat de la cteva zile la cteva luni. In unele cazuri i cu frecven redus este capabil s provoace septicemie i/sau o meningit cerebrospinal. Caractere morfobiologice N.meningitidis se prezint sub form de coci imobili, gram-, in frotiu se aranjeaz in diplococi cu suprafeele adiacente aplatizate sau puin concave (aspect riniform, de boabe de cafea). Posed capsul i fimbrii. Structura antigenic a N.meningitidis Ag polizaharidice capsulare permit caracterizarea a 13 serogrupe: A, B, C, D, X, Y, Z, 29E, W135, H, I, K et L. Mai frecvent intlnite sunt serogrupele A, B, C, Y i W135. Ag proteice din membrana extern (cinci proteine majore) permit distincia tipurilor serologice Ag lipo-oligozaharidice (serotipuri) 64

Aceste antigene servesc n calitate de markeri epidemiologici. Caractere de cultur N.meningitidis este un mi/o carboxifil, foarte exigent la cultivare. Se cultiv doar pe medii mbogite cu snge sau ser: geloz-ser, geloz-snge, geloz-ciocolat, mediul MuellerHinton i prenclzite n termostat. Coloniile S, mici (1-2 mm), cu marginile netede, bombate, translucide apar peste 24-48 ore de incubare la 37 C n atmosfer umed mbogit cu 5-10% CO2. Activitate biochimic N.meningitidis posed catalaz i oxidaz, scindeaza glucoza i maltoza fr a produce gaz. Rezistena n mediul extern: N.meningitidis este o bacterie deosebit de fragil, sensibil n special la desicare, radiaii solare, variaii de pH i refrigerare; temperaturi sub 37 C determin autoliza bacteriilor. Factorii de patogenitate Adezine (fimbriile i proteine ale ME) Capsula rol antifagocitar sIg A-proteaza descompune sIg A de pe mucoase Endotoxina declaneaza secreia diferitor citokine Receptori i captatori de Fe (receptori membranari pentru transferin i lactoferin, care permit captarea directa a Fe din aceste substane, precum i extragerea lui direct din hemoglobin) Epidemiologia infectiilor meningococice Sursa de infecie bolnavii cu meningit sau rinofaringit meningococic sau purttorii de germeni Transmiterea aerogen, prin picturi Pflugge, prin obiecte contaminate (jucrii) exceptional Patogeneza infectiilor meningococice Meningococul ader la epiteliul rinofaringelui, provocnd sau o infecie local (rinofaringita), sau o infectie inaparent. In caz de diminuare a rezistenei organismului, bacteria trece n submucoas i apoi n circulaia sanguin general (meningococcemia). Aceast translocaie este favorizat de inflamaii rinofaringiene, n special virale. In circulaia general, graie capsulei, bacteria este protejat de mijloacele de rezisten a organismului. Prin tropism pentru celulele plexului choroid, meningococul ader la acest nivel i, prin translocaie, trece n spaiul meningean, inducnd meningita cerebrospinal. Odat cu dispariia anticorpilor materni, N. meningitidis devine principala bacterie responsabil de meningite la nou-nscui. Ulterior, imunitatea antimeningococic se instaleaz progresiv i frecvena meningitelor meningococice diminueaz. Formele clinice de infectii meningococice Rinofaringita (forma clinic cea mai frecvent, deseori asimptomatic) Septicemia (meningococcemia). Reprezint etapa a doua a maladiei. Complicaii: meningococcemie fulminant (sindromul Waterhouse-Friderichsen) n 10 - 20 % de cazuri (oc endotoxinic, purpur extensiv indus de coagulopatie de consumare (coagulare intravascular diseminat)). Meningita cerebrospinal epidemic. Este precedat de o faringit i nsoit de bacteriemie. Este caracterizat prin febr nalt, cefalee, vom, fotofobie, hiperestezie cutanat. Poate fi prezent poziia caracteristic n "coco de puc" dat de sindromul de contractur. Frecvent se ntlnete herpesul labial, peteii cutanate sau artralgii. Afectarea sistemului nervos se face n grade variabile, cu delir, agitaie psihomotorie, somnolen, uneori com, pareze i paralizii, convulsii. Evoluia n absena tratamentului se face spre deces n 80-90% din cazuri, restul prezentnd sechele grave. Alte forme: infecii bronhopulmonare, endocardite, pericardite, osteomielite, artrite (determinate de formarea de complexe imune), conjunctivite, angine. Diagnosticul de laborator al infectiilor meningococice Prelevate: in funcie de forma clinic se prelev exsudatul nasofaringean, snge pentru hemocultur, LCR, lichidul articular, etc. 65

Probele se prelev nainte de a se administra antibiotice i se transport rapid la laborator, ferite de variaii de temperatur i lumin. La necesitate se utilizeaz mediul de transport Stuart Diagnosticul direct Examenul LCR este primordial pentru diagnosticul meningitei. Prelevat n condiii aseptice prin puncie lombar, n volum de 4-6 ml n 2 eprubete de centrifug. LCR este tulbure, conine mii sau zeci de mii de elemente celulare, cu predominana de 95100% a neutrofilelor. Aceast reacie celular este insoit de hipoglicorahie, de hiperalbuminorahie i pH acid prin acumularea de acid piruvic i lactic. Examenul microscopic al sedimentului LCR Frotiuri colorate cu albastru de metilen sau Gram: diplococi Gram-negativi riniformi n pozitie intra i extracelular, dar densitatea bacterian este sczut, i examenul este negativ n 1/3 cazuri. Prezena leucocitelor n numr mare pledeaz pentru un prognostic favorabil. b) RIF Examenul bacteriologic Sedimentul din LCR se nsemneaz pe medii de cultur mbogite, cum sunt gelozasnge, geloza-ciocolat, mediul Mueller-Hinton prenclzite la 37 C. Exsudatul nazofaringean se nsemneaz imediat dup recoltare pe medii cu adaos de antibiotice (lincomicin, vancomicin, ristomicin) pentru inhibarea altor specii microbiene existente n exsudat. Sngele pentru hemocultur se nsemneaz direct pe medii de cultur lichide (bulion glucozat 2% respectnd proporia de 5 % snge). Examinrile se fac zilnic timp de 5-7 zile prin subculturi. Identificarea i diferenierea de neisseriile comensale se bazeaz pe aspectul morfologic pe frotiuri colorate Gram, prin testul oxidazei care este pozitiv, scindarea numai a glucozei i maltozei, identificarea serologic prin RA cu seruri imune specifice de grup. Decelarea direct n snge i LCR a antigenelor polizaharidice capsulare, utiliznd reaciile de contraimunoelectroforez, ELISA, latex i coaglutinare cu antiseruri specifice de grup. Detectarea acizilor nucleici Diagnosticul indirect Diagnosticul serologic. Pot fi titrai Ac antimeningococici utiliznd RA sau RHAI. Are valoare diagnostic redus Tratamentul trebuie instituit extrem de urgent, imediat dup internare i efectuarea punciei lombare. Tratamentul etiotrop const n administrarea de antibiotice timp de 7-10 zile: Penicilin, Ampicilin, Cloramfenicol, Cefalosporine. Profilaxia specific: imunizare activ cu vaccin polizaharidic antimeningococic monovalent sau polivalent (A, C, Y, W), care se poate administra intradermic sau subcutanat, dup vrsta de 3 luni (pentru grupul A), oferind protecie de 95-100% pentru o durat de 2-3 ani; polizaharidul capsular de grup B este un homopolimer al acidului sialic i nu este imunogen pentru oameni. Contacii vor fi supravegheai clinic timp de 10 zile. Chimioprofilaxia cu Penicilin V, timp de 7 zile, sau cu Rifampicin, 3 zile, se aplic n familii sau n colectiviti de precolari Purttorii, depistai n focar, vor fi tratai timp de 7-10 zile cu Penicilin V. Cazurile de meningit sau meningococcemie vor fi declarate n 24 de ore de la depistare 85. Infectia gonococic. Clasificarea gonococilor (familie, gen, sp.). Factorii de patogenitate. Infectiile gonococice acute si cronice. Diagnosticul microbiologic. Prelevate. Microscopia directa, izolarea si identificarea culturii pure. Particularitatile de recoltare a prelevatelor si de diagnostic a gonoreei cronice. MICROBIOLOGIA I DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL GONOREEI Gonoreea este o uretrit specific, cu eliminare masiv de puroi, mai aparent la barbati dect la femei. Termenul "gonoreea", a fost utilizat prima data de Galen n secolul II i nseamn scurgerea seminei". Multe secole gonoreea i sifilisul erau confundate. Paracelsus (1530) credea ca gonoreea este un simptom precoce al sifilisului. Aceasta confuzie a fost ntrit de 66

medicul englez John Hunter, n 1767. Hunter intenionat i-a inoculat puroi de la un bolnav cu simptome de gonoree, mbolnavindu-se de sifilis! Agentul cauzal al gonoreei, Neisseria gonorrhoeae, a fost descris pentru prima oar de A. Neisser n 1879 n puroi de la un bolnav de gonoree. Mi/o a fost izolat n cultur pur n 1882 de ctre Loeffler pe ser coagulat i rolul su etiologic a fost stabilit ulterior pe voluntari umani (conform postulatelor lui Koch). Neisseria gonorrhoeae Caractere morfobiologice Neisseria gonorrhoeae este un coc gram-negativ, cu diametrul de 0.6 - 1.0 m, uzual observat n perechi cu suprafeele concave alturate. In prelevate patologice (puroi, exsudate) se localizeaz frecvent intracelular n leucocite polimorfonucleare (neutrofile). Imobil, posed fimbrii cu lungimea de civa micrometri. n funcie de prezena fimbriilor se cunosc patru tipuri de N. gonorrhoeae : T1, T2, T3, T4 Caractere de cultura Gonococul este exigent la cultivare. Pentru izolarea lui se utilizeaz medii mbogite cu ser sangvin, extract de drojdii, lichid ascitic, etc (mediul HYL, Thayer-Martin, geloz-ciocolat). Culturile cresc la 35-36 C n atmosfer umed cu 5-10 % CO2. Peste 24-48 ore apar colonii mici (0,5-1mm), netede, translucide. Dup aspectul coloniilor pot fi descrise 4 tipuri: Colonii de tipul I i II apar la izolare, corespund tulpinilor virulente, purttoare de pili (fimbrii), Colonii de tipul III i IV, apar la repicare, mai mari, corespund tulpinilor fr pili Structura antigenic 3 proteine majore din ME (Por / PI, Opa/PII, PIII) definesc multiple serotipuri (variante). Opa prezint o mare variabilitate antigenic, chiar n interiorul unei tulpini. Lipopolizaharidul din ME Proteina fimbriilor, cu o mare diversitate antigenic Caractere biochimice: gonococii sunt oxidazo-pozitivi, scindeaza doar glucoza pna la acid, nu atac maltoza Factorii de patogenitate Adezinele (fimbriile, unele proteine din membrana extern Opa). Opa de asemenea induce transcitoza gonococilor n celulele epiteliale. sIgA-proteaze, cu rol in colonizarea mucoaselor Proteine ale ME (Por), care inhib formarea fagolizosomei (supravieuirea i multiplicarea gonococilor n fagocite) Endotoxina (rezisten la complement, secreia citokinelor) Sisteme de captare a Fe (receptori membranari pentru transferin i lactoferin) Variaia antigenic rapid a fimbriilor de adeziune i a proteinei Opa (conversie, hipermutaie, transformare) Rezistena n mediul extern N. gonorrhoeae este un mi/o fragil, sensibil la variaii de temperatur, desicare, raze UV i alte condiii ale mediului extern. Gonococul este inhibat de bumbacul din tampoane (hipoclorit...). Pentru prelevri sunt indicate tampoane cu alginat de Ca sau din dacron. Epidemiologia infeciei gonococice Sursa de infecie unica surs este bolnavul cu gonoree, n special cu infecie inaparent Transmiterea la maturi exclusiv prin contact sexual; la nou-nscut la trecerea prin canalul de natere al mamei bolnave Patogeneza infeciilor cauzate de N.gonorrhoeae Infecia gonococic este n general limitat la mucoasele cu epiteliu columnar. Mai frecvent implicat este uretra, cervixul, rectul, faringele i conjunctiva. Epiteliul scuamos al vaginului nu este sensibil la infecia cu N. gonorrhoeae. Totui, la fetie gonococul poate provoca vulvovaginite. Infeciile mucoaselor sunt caracterizate uzual prin secreii purulente. Patogeneza gonoreei Prin intermediul fimbriilor i a unor proteine din ME (Opa) gonococii ader la vilozitile celulelor epiteliale columnare neciliate. 67

Urmeaz penetrarea lor n celul (prin endocitoz), apoi vacuola este transportat la baza celulei, unde bacteria este eliberat prin exocitoz n esutul subepitelial. Pe parcursul infeciei, lipopolizaharidul bacterian (LPZ/LOZ) i peptidoglicanul sunt eliberate prin autoliza celulelor. Ambele substane activeaz complementul pe calea alternativ, LPZ de asemenea stimuleaz producia factorului de necroz a tumorilor (TNF), care provoac distugerea celulelor. Neutrofilele sunt imediat atrase n focar i inglobeaza bacteriile. Muli gonococi sunt capabili s supravieuieasca n interiorul fagocitelor pn la moartea lor, cu eliberarea bacteriilor ingerate. Particularitaile gonoreei la brbai In majoritatea cazurilor decurge acut (85-95%), fiind manifestat clinic: Uretrita (secreie uretral alb galbuie, durere i usturime la mictiune, dizurie) Prostatita Orhita Epididimita Particularitile gonoreei la femei In majoritatea cazurilor infecia decurge asimptomatic (80% de cazuri), cu evoluie spre cronicizare. Formele clinice: Cervicita (cu sau fr leucoree) forma cea mai frecvent Uretrita Bartolinita Salpingita (pericol de sterilitate, graviditate extrauterin) Ovarita Endometrita Peritonita Alte forme clinice: Faringita i proctita gonococic Diseminarea infeciei gonococice (1-3%) determin artrite, leziuni cutanate, septicemii, endocardite, meningite. Tulpinile de N. gonorrhoeae care cauzeaza infecii diseminate sunt uzual rezistente la complement i la reacia bactericid a serului. La nou-nscut conjunctivita purulent cu extinderea rapid a infeciei la globul ocular (ophtalmia neonatorum) poate fi urmare a contaminrii la trecerea prin canalul de natere Diagnosticul de laborator al gonoreei Prelevate: La brbai - secreiile uretrale La femei - secreiile uretrale, vaginale, din endocol sau orificiile glandelor vulvare Pot fi examinate coninutul leziunilor cutanate, exsudat articular, nasofaringean, snge, puroi din conjunctiv, LCR, tampon rectal. Pentru recoltarea acestor secreii se foloseste un tampon de alginat de Ca (sau ansa bacteriologic), care este apoi trimis imediat n laborator pentru testare (dupa necesitate se foloseste mediul de transport Stuart cu tioglicolat i crbune activat). Daca eliminrile sunt srace, se procede la stimularea secreiei (reactivare, provocare): Alimentar (cu bauturi alcoolice bere) Chimic (instilaii cu nitrat de Ag sol. 1% in uretr, 10% n colul uterin) Biologic (inocularea gonovaccinului, recoltarea secreiilor imediat dupa menstre la femei) Mecanic (masaj al prostatei) Termic (diatermie sau inductotermie) Metodele de diagnostic Examenul microscopic (elocvent doar n cazul uretritelor acute la brbai). In frotiuri din puroiul uretral colorate Gram sau cu albastru de metilen se observ diplococi gram- situai intra- sau extracelular. RIF Examenul bacteriologic (este obligator n forme asimptomatice sau cronice) 68

Gonococul fiind o bacterie foarte fragil, este obligator de a nsmna imediat prelevatele sau de a utiliza un mediu de transport adaptat. Pentru izolare se folosesc medii mbogatite (ex.: mediul Thayer-Martin, care este bogat n factori de cretere i conine antibiotice (vancomicina, colistina, amfotericina) care inhib alte bacterii din prelevat, geloza-ciocolata). Coloniile apar peste 18 - 24 h de incubare in atmosfer cu CO2. Identificarea N.gonorrhoeae se efectueaz n baza caracterelor morfotinctoriale, aspectul coloniilor crescute pe medii selective, oxidaza +, scindarea doar a glucozei pn la acid. Seroidentificarea cu Ac monoclonali n reacia de Co-aglutinare Depistarea direct a N. gonorrhoeae n prelevate poate fi realizat prin tehnici ELISA sau RIF Detectarea acizilor nucleici prin hibridare sau amplificare genic Examenul serologic (serodiagnosticul) RFC Tratamentul gonoreei Antibiograma este indispensabil unui tratament eficient! Peniciline Cefalosporine de generaia III Fluorochinolone Cotrimoxazol Profilaxia gonoreei Nespecifica (individual sau general) Prevenirea oftalmiei gonococice se efectueaza prin instilarea intraconjunctival la nounscui a soluiei 1% de nitrat de Ag 86.Bruceloza. Clasificarea agentilor (familie, gen, sp.). Patogeneza brucelozei. Diagnosticul microbiologic. Prelevate. Metoda microscopica, izolarea si identificarea speciilor de brucele. Diagnosticul imunologic (reactiile Huddelson, Wright), intradermoreactia Burnet. Profilaxia specifica a brucelozei. 87.Tularemia. Clasificarea agentului patogen (familie, gen, sp.). Patogeneza, formele clinice ale infectiei. Diagnosticul microbiologic. Prelevate. Metoda microscopica, metoda biologica, izolarea si identificarea agentului. Metodele alergica si serologica. Profilaxia specifica a tularemiei. Zooantroponozele = maladii ale animalelor care pot fi transmise oamenilor n rezultatul unui contact direct sau indirect cu populaii animale infectate. Unele dintre aceste infecii - antraxul, tularemia, pesta, bruceloza fac parte din categoria infeciilor extrem de periculoase. Sunt foarte contagioase (transmitere aerogen, alimentar, prin contact direct, receptivitate general). Se manifest nu doar ca epidemii, ci i ca pandemii. Reprezint infecii cu evoluie foarte grav. Agenii cauzali sunt rezisteni n mediul extern. Clasificarea Familia Francisellaceae Genul Francisella Specii: F.tularensis (agentul cauzal al tularemiei) F.philomiragia (infectii sistemice) Se cunosc 4 biovaruri (subspecii) de F.tularensis, care difer dupa activitatea biochimic, virulen i rspndire geografic: 1. F.tularensis tularensis (nearctica) (tip A; foarte virulent, raspndit n America de Nord) 2. F. tularensis holarctica (palearctica) (tip B; mai puin virulent, cu raspndire n Europa) 3. F. tularensis mediasiatica: virulen similar cu F. tularensis holarctica 4. F. tularensis novicida: virulen redus, cauzeaza infecie numai la gazde imunocompromise. Izolat n SUA. Prima descriere a tularemiei a fost realizat n Japonia n 1837. Denumirea agentului provine de la regiunea Tulare, California, unde, n 1911, n timpul unei epizootii printre veveriele de pmnt, a fost izolat tulpina bacterian. 69

Dr Edward Francis, n 1928, studiaz i descrie agentul cauzal i patogeneza maladiei prin experien personal n peste 800 cazuri. F. tularensis are rspdire ubicvitar, parazitnd peste 100 de specii de animale slbatice (n special roztoare), psri i insecte i persist n apa din zonele unde se ntlnesc aceste animale. Toate mamiferele fac o septicemie cu prezena bacteriilor n toate tesuturile. Caracterele morfobiologice ale F.tularensis Morfologia: F.tularensis reprezint o cocobacterie foarte mic (0.2-0.5 m x 0.7-1.0 m), gram-negativ, uneori se coloreaz mai intens la poli, pleomorf, imobil, asporogen, tulpinile virulente posed capsul. Caractere de cultur: bacteria nu poate fi cultivat pe medii uzuale. Pentru izolare se utilizeaz medii mbogite: 1. mediul Francis (geloz + snge de iepure + cistein + glucoz) 2. mediul McCoy (cu glbenu de ou) 3. geloz-ciocolat Cultiv la 35 - 37 grade, n aerobioz. Peste 2-4 zile apar colonii S, mici (1 - 2 mm n diametru), albe-cenuii, mucoide, cu marginile regulate i suprafaa lucioas. Caractere biochimice: F.tularensis este catalazo+ i oxidazo-, nu descompune ureea, produce H2S, unele biovaruri fermenteaz glicerolul. Rezistena n mediul extern: Mi/organismele pot supravieui perioade ndelungate de timp n ap, nmol, cadavre de animale (mediu umed). F.tularensis este distrus la 56 grade n 10 minute, dar congelarea permite conservarea bacteriei. Factorii de patogenitate : 1. Capacitatea de a penetra n macrofage, supravieuind i multiplicndu-se n interiorul celulelor pn la moartea lor (parazitism facultativ intracelular) 2. Capsula (rol protector) 3. Endotoxina (LPZ) Epidemiologia i patogeneza tularemiei Sursa de infecie animale bolnave sau cadavre de animale, transmiterea de la om la om nu are loc. Rezervorul principal mamifere mici i medii (iepuri, veverie, obolani, oareci, roztoare acvatice, lemingi). Omul, pisicile, cinii, anumite specii de psri, peti i amfibii pot fi gazde accidentale Vectori insecte (tuni, nari, cpue ) Pori de intrare tegumentul (chiar intact), mucoasele, conjunctiva Transmiterea: 1. Contact cu animale infectate, cadavre sau cu apa contaminat (lacuri, bazine, etc) 2. Aerogen prin inhalare (vntori...) 3. Alimentar, prin consum de ap sau alimente infectate 4. neptura artropodelor hematofage Francisella tularensis este una dintre cele mai virulente bacterii. Cteva zeci de mi/o (10-50) pot provoca suferine grave. Patogeneza i formele clinice de tularemie Francisella tularensis este o bacterie facultativ intracelular. Iniial infecteaz macrofagele, cu diseminarea mi/o i afectarea diferitor organe, inclusiv plmnii, ficatul, splina, ganglionii limfatici. Un rol important n patogeneza leziunilor l joac hipersensibilitatea tardiv. Formele clinice de tularemie sunt n relaie cu calea de ptrundere: 1. Forma ulceroganglionar (70-85% de cazuri), penetrarea agentului patogen prin tegument sau mucoase. Mi/o se multiplic local i determin apariia, peste 3-5 zile de la expoziie, a unei papule la locul de inoculare. Peste cteva zile se transform n pustul, care se ulcereaz rapid. Ulcerul are 2 - 4 cm n diametru i marginile neregulate. Uneori 70

2. 3.

4.

5. 6.

ulcerul poate fi acoperit cu o crust neagr (asemntoare cu escara n antrax). Bacteriile se rspndesc spre ganglionii limfatici regionali, unde cauzeaz limfadenite necrotice, nconjurate de infiltrate granulomatoase (bubonul tularemic). Ganglionii limfatici afectai devin fluctuani, uneori crend canale de drenare n tegument. Mi/o pot disemina hematogen infectnd multiple organe, cu dezvoltarea septicemiei. Forma ganglionar se manifest prin afectarea ganglionilor limfatici regionali, leziunea de la poarta de intrare lipsete. Forma oculoganglionar apare la ptrunderea agentului cauzal prin conjunctiv. Se dezvolt necroza i ulceraia conjunctivei, cu infiltraie limfocitar. Din conjunctiv bacteriile trec n ganglionii limfatici preauriculari, submandibulari sau cervicali, provocnd leziuni similare cu cele din tularemia ulceroganglionar. Forma orofaringean (angino-ganglionar). Mi/o intr prin mucoasa orofaringelui n urma ingestiei sau inhalrii lor. Uzual se dezvolt faringite sau tonzilite exsudative, cu ulceraie ulterioar. Ptrunderea n ganglionii limfatici cervicali determin necroz i supuraie. Forma tifoidic (abdominal), cu afeciuni generalizate. Mi/o ptrund n snge prin tegument sau mucoase i afecteaz plmnii i organele reticulo-endoteliale. Determin frecvent septicemie i oc Forma pneumonic, foarte grav. Mi/o ptrund n plmni aerogen sau hematogen.

Diagnosticul de laborator al tularemiei Se realizeaz doar n laboratoare specializate. Prelevate: n funcie de forma clinic: serozitate din leziunea cutanat sau conjunctiv, exsudat faringean, punctat din ganglionul limfatic afectat, sput, snge. Diagnosticul direct Examenul microscopic direct este foarte dificil, aproape imposibil. RIF are o sensibilitate mai mare Examenul bacteriologic. Izolarea F.tularensis direct din prelevate este practic imposibil. Uzual se utilizeaz inocularea prelevatelor la animale experimentale sensibile (oareci, cobai). La necropsii se studiaz frotiuri-amprente din organele afectate (Giemsa, RIF), se fac nsmnri pe medii speciale (Francis, Mc Coy). Tulpinile izolate sunt identificate morfologic, cultural, biochimic, antigenic (RA cu seruri anti-F.tularensis). Diagnosticul indirect Serodiagnosticul. Detectarea Ac este un element esenial n diagnosticul tularemiei. Ac apar dup ziua a 7 de boal, ating titrul maxim peste 1-2 luni (1:1000 sau mai mult) i persist mai muli ani. RA cu suspensie de bacterii omorte este cea mai utilizat. Titrul diagnostic 1:80, cu creterea lui n dinamic de cel puin 4 ori. ELISA este posibil. Intradermoreacia cu tularin. Hipersensibilitatea poate fi testat peste 5 zile de la debutul bolii. Tratamentul tularemiei Antibiotice: aminozide (streptomicin, gentamicin), tetracicline, cloramfenicol, fluorochinolone, eritromicin (exist i tulpini rezistente). Profilaxia tularemiei Informarea persoanelor expuse contaminrii Supraveghere sanitar Vaccinarea contingentelor de risc cu vaccin viu atenuat asigur imunitatea pe o durat de 57 ani 88.Antraxul. Clasificarea agentului patogen (familie, gen, sp.). Factorii de patogenitate. Formele clinice de antrax. Diagnosticul microbiologic. Prelevate. Metoda microscopica. Izolarea si diferentierea de antracoizi. Metoda biologica, metodele rapide (reactia Ascoli), proba alergica. Profilaxia si tratamentul specific al antraxului. Clasificarea: Familia Bacillaceae Genul: Bacillus 71

Specii: Bacillus anthracis (patogen, agentul antraxului) Bacillus cereus (intoxicaii alimentare), Bacillus polymyxa (genul Paenibacillus), Bacillus brevis (genul Brevibacillus), Bacillus subtilis bacili antracoizi, produceni de AB Bacillus anthracis a fost prima bacterie la care a fost demonstrat rolul ei n patogenia unei infecii. n 1877, Robert Koch a izolat microorganismul n cultur pur, demonstrnd capacitatea lui de a forma endospori i a produs antraxul experimental inoculndu-l la animale. Caracterele morfobiologice ale B.anthracis Bacil mare (5-6 m x 1 m), cu extremitile drepte (tiate), gram-pozitiv, imobil (antracoizii sunt mobili), n produse patologice se prezint sub form de lanuri scurte, iar n cultur lanuri lungi (tulpin de bambus). Tulpinile virulente formeaz capsul polipeptidic (acidul D-glutamic). Sporul este ovoid, n poziie central, nu deformeaz celula. Sporogeneza are loc n cultur, n sol i n esuturi i exsudate din animale moarte (n prezena oxigenului), dar nu n snge sau esuturi de animale vii. Caractere de cultur B.anthracis nu este exigent nutritiv, cultiv pe medii uzuale. Facultativ-anaerob, t optim 3537 grade, pH 7-7,4. Peste 24 ore de incubare formeaz colonii R, mari, cu contur neregulat, opace, plate, uscate, rugoase (coam de leu, cap de meduz). Nehemolitice pe geloz-snge (antracoizii sunt hemolitici). Pe geloz-ser, n exces de CO2, formeaz colonii S (producerea capsulei). Pe mediu cu 0,5-1 UI de penicilin B.anthracis formeaz lanuri din forme globulare - colier de perle (proprietate absent la antracoizi). n bulion peptonat formeaz flocoane la fundul eprubetei, cu supernatantul clar. B.anthracis este sensibil la fagul gamma. Caractere biochimice Activitate proteolitic lichefiaz gelatina n form de brad inversat, peptonizeaz laptele, diger serul coagulat, nu produce H2S. Activitate zaharolitic fermenteaz unele glucide: glucoza, maltoza, zaharoza, tregaloza, etc. Nu fermenteaz lactoza i arabinoza. Rezistena n mediul extern: formele vegetative sunt slab rezistente, sporii rmn viabili n sol decenii, se distrug la fierbere n 30-40 min. Factori de patogenitate Capsula polipeptidic, codifict de plasmida pX02. Inhib fagocitoza i puterea bactericid a sngelui. Capsula joac un rol important n etapele iniiale ale infeciei. Formarea capsulei are loc in vivo i in vitro, pe medii cu ser i n atmosfer cu 5 % CO2. Exotoxina antraxului, codificat plasmidic (pX01). Este constituit din 3 componente: 1. Factorul I, edematogen (EF), care este o adenilat-ciclaz. Acumularea de cAMP duce la modificarea permeabilitii membranare cu producerea edemului. inta celulele endoteliale (efect - oc hipovolemic, oc septic). 2. Factorul III, letal (LF), responsabil de efectele letale ale toxinei anthrax. Este o proteaz Zn++ dependent care induce producerea citokinelor de ctre macrofage i limfocite (efect recie inflamatoare, oc septic). 3. Factorul II, antigen protector (PA), induce sinteza Ac antitoxici protectori. PA este responsabil de fixarea toxinei pe receptorii celulelor sensibile. Aparte, aceti factori exercit activitate biologic nesemnificativ la animal. Din contra, combinaii din doi sau trei factori toxici determin urmtoarele consecine la animale experimentale: PA+LF = activitate letal PA+EF = produce edem PA+LF+EF = edem i necroz cu efect letal EF+LF = inactiv Acest experiment sugereaz c toxina antraxului are structur clasic de citotoxin bacterian de tip A-B cu PA n calitate de B-fragment (de fixare pe receptori celulari) i cu factorii EF i LF cu funcie de fragment A (activ), care acioneaz n interiorul celulei. 72

Structura antigenic a B.anthracis a. Ag polipeptidic capsular (induce Ac neprotectori) b. Ag polizaharidice somatice termostabile (depistate n reacia de precipitare Ascoli) c. Toxina (componentul PA), induce formarea Ac protectori, neutralizani Epidemiologia i patogeneza antraxului Sursa de infecie animalele erbivore bolnave de antrax (ovine, caprine, bovine, suine). Solul contaminat cu spori este un rezervor de germeni important i permanent (decenii). Transmiterea: prin contact direct cu animalele bolnave sau produse contaminate (carne, piei, ln, blan, etc), puni i nutreuri contaminate, cu ptrunderea agentului prin tegumentul lezat aerogen, prin inhalarea sporilor de B.anthracis pe cale alimentar (consum de carne de la animale bolnave de antrax insuficient prelucrate termic) n majoritatea cazurilor antraxul se manifest ca boal profesional a ngrijitorilor de animale, personalului de la abatoare, ntreprinderi de prelucrare a produselor animaliere, veterinarilor, zootehnicienilor, mcelarilor, tbcarilor, etc. Formele clinice de antrax Antraxul cutanat , pustula malign (forma cea mai frecvent). Sporii intr printr-o leziune a tegumentului, germineaz i prolifereaz la poarta de intrare, cu dezvoltarea unui edem gelatinos local caracteristic. La poarta de intrare, peste 12-36 ore de la penetrare, apare o papul, care evolueaz rapid ntro vezicul, apoi n pustul cu coninut sanguinolent. La spargerea pustulei se formeaz o leziune necrotic, prezentnd n centru o escar neagr nconjurat de vezicule satelite. Leziunea se localizeaz mai frecvent pe mini, fa, ceaf, etc. Ptrunderea n snge determin diseminarea sistemic a bacteriei. Antraxul pulmonar apare la inhalarea sporilor de B. anthracis , care sunt nglobai de macrofagele alveolare unde ei germineaz i se multiplic, determinnd o pneumonie foarte grav cu edem. Urmeaz infectarea ganglionilor limfatici mediastinali cu dezvoltarea unei necroze hemoragice. Pacientul manifest febr, stare de ru, mialgie, tuse ne-productiv. Din ganglionii limfatici infecia poate trece n snge. Decesul poate surveni n 24 h. Antraxul digestiv apare n urma consumului de carne infectat. n mucoasa intestinal se dezvolt procese identice cu cele din antraxul cutanat (enterocolit ulceroas). Clinic: vom i diaree, cu snge n masele fecale. Poate urma invazia ganglionilor limfatici mezenterici i a sngelui, asociat cu prostraie profund, oc i moarte. Meningita poate apare (foarte rar) ca urmare a oricrei forme de antrax. Diagnosticul de laborator al antraxului Se efectueaz numai n laboratoare specializate cu respectarea unor reguli stricte de securitate. Prelevate (n funcie de forma clinic): exsudat din leziunea cutanat, sput, snge, LCR, materii fecale, bioptate din ganglioni limfatici, probe necroptice, probe de la animalul suspect i elemente din mediul extern Examenul microscopic: direct, RIF n frotiuri pregtite din prelevate i colorate Gram sau cu albastru de metilen se observ bacili mari cu morfologia caracteristic, izolai sau n lanuri scurte. Sporii sunt rareori prezeni. Examenul bacteriologic Prelevatele monomicrobiene se nsmneaz pe geloz i geloz-snge, iar cele polimicrobiene se nclzesc n prealabil 10 min la 75 grade C. Incubarea la 37 C timp de 24 ore. Sngele n bulion glucozat, repicri zilnice timp de 7 zile pe geloz-snge. Examinarea coloniilor crescute, selecia celor suspecte i acumularea lor. Identificarea culturii pure acumulate i diferenierea de antracoizi. Examenul biologic 73

Se inoculeaz prelevatele la cobai sau oareci, care sunt foarte sensibili la infecie. Dup moartea lor (36-48h) bacilii sunt depistai n frotiuri din snge i organe. Depistarea Ag polizaharidice termostabile n prelevate (reacia de precipitare inelar Ascoli) Diagnosticul serologic. Ac anti-antrax pot fi depistai la convalesceni n RP sau RFC Diagnosticul imunologic (proba cutanat alergic). Se pune n eviden starea de hipersensibilizare prin inocularea intradermic a 0,1 ml de antraxin (extract din tulpina vaccinant de B.anthracis). Reacie pozitiv edem i hiperemie cu diametrul de peste 8 mm. Tratamentul antraxului Antibiotice (peniciline, cefalosporine, fluorochinolone) Imunoglobulina antiantrax Profilaxia specific a antraxului a. Depistarea i izolarea animalelor bolnave, incinerarea animalelor moarte sau ngroparea adnc a cadavrelor i acoperirea cu var nestins. b. Vaccinarea animalelor. c. Imunizarea personalului expus cu vaccin viu atenuat , vaccin acelular (elaborat din tulpini acapsulate avirulente, coninnd proteina PA). n curs de elaborare vaccin cu PA i antigen capsular. 89.Pesta. Clasificarea agentului patogen (familie, gen, sp.). Factorii de patogenitate. Formele clinice de pesta. Diagnosticul microbiologic. Prelevate. Regulile de recoltare, transportare si examinare a prelevatelor. Metodele microscopica, bacteriologica si serologica. Profilaxia specifica a pestei. Pesta (din latin pestis, maladie contagioas) este o maladie cu multiple faete mortale pentru om. Ea este cauzat de Yersinia pestis, descoperit de Alexandre Yersin de la Institutul Pasteur n 1894. Clasificare Familia Enterobacteriaceae Genul Yersinia Specia Yersinia pestis Se disting 3 varieti de tulpini - oriental, medieval i antic. Caractere morfotinctoriale yersiniile reprezint bastonae drepte, uneori coco-bacterii Gram negative, uneori colorate bipolar, acapsulate, asporulate, imobile la 37 C. Caractere de cultur yersiniile sunt mi/o anaerobe facultative, cultiv pe medii uzuale la 2528 C. n BP cultura se manifest printr-un voal la suprafa i un aspect floconos n interior. Pe geloz peste 48h apar colonii R mari, cu margini neregulate Activitate biochimic catalaza+, oxidaza-, fermenteaz glucoza, reduce nitraii n nitrii. Rezistenta: Yersiniile sunt rezistente n mediul extern i n cadavre de animale. Aspecte epidemiologice Roztoarele slbatice constituie rezervorul natural al maladiei. Yersinia este n principal vehiculat de un obolan, Rattus rattus, care o transmite la om prin intermediul puricilor infectai (Xenopsylla cheopsis, Nosopsyllus fasciatus). Foarte rar omul se infecteaz prin muctura obolanului infectat sau consumndu-l. Iepurii i carnivorele pot infecta omul prin contact direct sau muctura animalului infectat. n epidemii transmiterea se poate efectua interuman pe cale aerogen. Dup neptura unui purice infectat, germenul se multiplic la locul de inoculare cu formarea unei vezicule-pustule apoi ptrund n sistemul limfatic i colonizeaz ganglionii regionali n care se multiplic. Peste 2-5 zile apar semne de limfadenit hemoragic (bubonul pestos). Pesta bubonic 90% din cazurile de pest. Diseminarea hematogen permite bacteriilor s ating ansamblul organelor cu apariia semnelor clinice de septicemie. Afectarea plmnilor duce la pesta pulmonar secundar, cu expectoraii sanguinolente bogate n germeni, foarte contagioase. Contactul cu aceti pacieni duce, prin contact direct, la apariia pestei pulmonare primare care prezint o mortalitate de 90-100% n lips de tratament. 74

Diagnosticul de laborator al pestei Se realizeaz n laboratoare specializate cu regim special strict. Prelevate: punctat din bubon, sput, snge. Toate prelevatele de la o persoan infectat sunt foarte contagioase i manipularea lor cere msuri special de precauie. Examenul direct Examenul microscopic al punctatului din bubon colorat Gram sau Giemsa poate fi evocator (bacterii Gram-, ovoide, cu coloraie bipolar). RIF nu este destul de semnificativ, deoarece exist recii ncruciate cu alte yesinii. Examenul bacteriologic (izolarea culturii pure cu identificarea ei ulterioar) este o investigaie de baz. n pesta pulmonar, diagnosticul este confirmat prin izolarea culturii din sput sau din aspirat bronic. Hemocultura (izolarea culturii din snge) reprezint examenul-cheie n forma septicemic. Pot fi examinate i probe necroptice, deoarece germenul este foarte rezistent n cadavre n curs de putrefacie Depistarea rapid a antigenelor F1. Tratamentul pestei Antibiotice (streptomicin, gentamicin, doxiciclin, cloramfenicol) Profilaxia pestei Izolarea bolnavilor Persoanele de contact carantin 6 zile 90.Gangrena gazoasa. Clasificarea agentilor etiologici (familie, gen, sp.). Factorii de patogenitate (exotoxine, enzime). Manifestarile clinice in dependenta de specia microbiana. Diagnosticul microbiologic. Prelevate. Metoda microscopica, izolarea si identificarea culturii pure. Diagnosticul rapid. Profilaxia si tratamentul specific al gangrenei gazoase. Particulariti ale bacteriilor anaerobe: Oxigenul este toxic (lipsa superoxid dismutazei/catalazei, peroxidazei) Cresc n lipsa oxigenului/potenial redox sczut Energia este obinut prin fermentare CIRCUMSTANE CE FAVORIZEAZ INFECIILE CU ANAEROBI Hipoxii tisulare (ateroscleroz, necroz, tumoare malign, corp strin...) Tratament prelungit cu aminozide Stri de imunosupresie sau imunodepresie CLASIFICAREA ANAEROBILOR Bacterii telurice (sporogene). Prezente n sol, supravieuesc graie sporilor termorezisteni. Familia Bacillaceae Genul Clostridium C. perfringens, C.septicum, C.novyi (oedematiens), C.histolyticum agenii gangrenei gazoase C.tetani agentul tetanosului C.botulinum agentul botulismului C.difficile agentul colitei pseudomembranoase Patogene, provoac infecii specifice necontagioase Bacterii anaerobe nesporogene (flora Veillon). Reprezint flora comensal i saprofit a omului (flor endogen). Coci gram+ (Peptococcus, Peptostreptococcus) Coci gram- (Veillonella) Bastonae gram+ (Eubacterium, Actinomyces, Bifidobacterium, Propionibacterium, Lactobacillus) Bastonae gram- (Fusobacterium, Bacteroides) Spirochete Condiionat patogene, pot cauza infecii supurative, septicemii la persoane cu rezistena sczut sau n asociaii cu alte mi/organisme CLOSTRIDIILE GANGRENEI GAZOASE 75

Agenii cauzali: C.perfringens (serotipuri A, B, C, D, E) C.novyi (oedematiens) C.septicum C.histolyticum CARACTERE MORFOTINCTORIALE C. perfringens - bastona gram+ imobil, capsulat, sporogen (sporul oval sau rotund, central sau subterminal, deformeaz celula bacterian). Alte clostridii mobile, necapsulate CARACTERE DE CULTUR I ENZIMATICE Medii de cultur: Kitt-Tarrozzi regenerat, geloz-snge glucozat, geloz cu glbenu de ou i lactoz, mediul Wilson-Blair Colonii C.perfringens lenticulare, hemolitice, clostridiile mobile colonii R, pufoase Manifest activitate proteolitic (digestia cazeinei, producerea H2S, gelatinaza) i zaharolitic cu producere abundent de gaz. FACTORI DE PATOGENITATE TOXINE 1. Toxina alfa (lecitinaza) mionecroz, hemoliz, trombocitoliz, dereglri de coagulare, creterea permeabilitii vasculare, inactivarea ATPazei musculare, hipotensiune, bradicardie, oc 2. Toxina teta necrozant, hemolitic 3. Toxina beta necroza epiteliului intestinal 4. Enterotoxina perturb transportul apei, ionilor i a glucozei prin membrana enterocitelor ENZIME DE PATOGENITATE colagenaza (toxina kappa), proteinaza (toxina lambda), elastaza, hialuronidaza (toxina Mu), ADN-aza (toxina Nu), etc. CAPSULA rol antifagocitar HABITAT Mediul extern sol, ap, aer, praf Intestin, vagin, tract respirator superior (om i animale) FORME CLINICE Gangrena gazoas (post-traumatic, post-operatorie) Mionecroze Celulite, fasciite Septicemii Toxiinfecii alimentare Enterita necrozant PATOGENIA GANGRENEI GAZOASE Pori de intrare tegumentul sau mucoasele lezate. Omul se contamineaz: Exogen - bacteria sau sporul ptrunde n plaga contaminat cu sol, ap, praf (accidente rutiere, de munc, etc.) gangrena gazoas post-traumatic; gangrena gazoas uterin (urmare a avortului septic). Endogen flora intern a bolnavului contamineaz plaga (chirurgie septic visceral, chirurgia ortopedic, etc) - gangrena gazoas post-operatorie. Gangrena spontan in cancer intestinal. Condiii suplimentare pentru apariia infeciei: 1. Traumatisme cu necroz tisular, hematom, corpuri strine 2. Penetrare profund a germenului 3. Potenial rH2 sczut (- 0,5 V) 4. Multiplicarea bacteriilor aerobe asociate (enterobacterii, enterococi, stafilococi) 5. Imunitate deficitar (radioterapie, imunosupresori, antibioticoterapie neadecvat, etc) 6. Injecia substanelor vasoconstrictive

76

Multiplicndu-se bacteriile degradeaz esuturile, distrugndu-le din aproape n aproape, fiind responsabile de extensia infeciei i de toxemie. Produsele gazoase formate produc disecia esuturilor. Clinic: durere local, edem, mionecroz, crepitaie la palpare, scurgeri sero-hemoragice, stare general grav (febr, hipotensiune, bradicardie, perturbri de coagulare, oc, posibil deces) Alte forme clinice cauzate de C. perfringens celulite, fasciite, enterit necrozant, toxiinfecii alimentare DIAGNOSTICUL GANGRENEI GAZOASE Clinic crepitaie, miros fetid, scurgeri hemoragice din plag Confirmare prin diagnostic microbiologic Prelevate: puroi, snge, lichid seros, bioptate Precauii la prelevare: excluderea contactului cu aerul, transportare imediat sau utilizarea mediilor de transport lipsite de oxigen. DIAGNOSTIC DE LABORATOR Examenul microscopic bastonae gram+, n cantiti mari, asociate cu reacie leucocitar slab Intervenie chirurgical imediat !!!!! Examenul bacteriologic condiii anaerobe (anaerostat, gaz-pachete, medii anaerobe), metode clasice (Zeissler, Weinberg) Important: bacterii aerobe sau facultative asociate Tehnici de amplificare genic Diagnostic rapid Mediul Kitt-Tarrozzi, mediul cu lapte, mediul Wilson-Blair TRATAMENT I PROFILAXIE Tratament: Chirurgical (debridarea plgilor, eliminarea maselor necrotizate i a corpurilor strine, drenarea) Administrarea serului antitoxic polivalent (anti-C.perfringens, C.novyi, C.septicum) Antibioterapia cu asociaii de antibiotice (beta-lactamine, aminozide, metronidazol) Oxigenoterapia hiperbar incizii cutanate Profilaxia: prelucrarea minuioas a plgilor, eliminarea corpurilor strine i a esuturilor necrotice, seroterapie preventiv, anatoxina, antibioterapie, supravegherea bolnavilor 91.Tetanosul. Clasificarea agentului (familie, gen, sp.), factorii de patogenitate. Patogeneza tetanosului, evolutia simptomelor clinice. Diagnosticul microbiologic. Prelevate. Metoda microscopica, izolarea si identificarea culturii pure. Profilaxia si tratamentul specific al tetanosului. Agentul cauzal C.tetani Caractere morfotinctoriale bastona mobil, cu flageli peritrichi, sporogen. Sporul rotund este plasat terminal (bastona de tob). Gram+. Inert biochimic. Rezistena forma vegetativ este sensibil, sporul supravieuiete n sol decenii. FACTORI DE PATOGENITATE Toxina tetanic Tetanolizina hemoliz; Tetanospasmina contracturi ai muchilor striai. Compus din 2 fragmente proteice: fragmentul A (toxic, neimunogen) i fragmentul B (atoxic, imunogen). PATOGENIA TETANOSULUI Habitat sol, intestinul omului, animalelor Pori de intrare tegumentul, mucoasele lezate (plgi, arsuri, mucoasa uterin post-partum, intervenii chirurgicale, ulcere varicoase, focare dentare, droguri intravenoase, etc.), cordonul ombilical la nou-nscui. C. tetani este o bacterie ne-invaziv, multiplicndu-se la poarta de intrare i elabornd toxina, care difuzeaz n organism. Mecanismul de aciune al toxinei: la nivelul plcii motrice neuro-musculare toxina complet penetreaz ntr-o vezicul de endocitoz, fiind transportat pe calea retro-axonal pn la prima sinaps a mduvei spinrii. 77

Aici toxina traverseaz spaiul intersinaptic i urmeaz calea spre SNC. Locul de atac al toxinei l constituie sinapsa dintre motoneuron i neuronii cilor de inhibiie. Tetanospasmina blocheaz eliberarea glicinei (inhibitor al motoneuronului) de ctre interneuron i permite contracia simultan a perechilor de muchi protagonist-antagonist, producnd paralizie spastic (rigid) CLINICA TETANOSULUI Incubaia 6-15 zile (3 zile-3 sptmni) Semne clinice trismus (contractur dureroas a muchilor masticatori), facies sardonicus (contracii ale muchilor feei), anxietate, contracturi generalizate cu paroxisme spontane sau declanate de stimuli externi (zgomot, lumin, etc), poziia corpului n form de arc (opistotonus), dereglri de vorbire. Febra lipsete. Moarte prin asfixie (spasm laringean) sau stop cardiac. DIAGNOSTICUL TETANOSULUI Diagnostic clinic Diagnostic de laborator Prelevate: secreii din plag, material de pansament, medicamente, etc. Examenul microscopic (de orientare) Examenul bacteriologic (tardiv, de confirmare) Examenul biologic (depistarea toxinei prin infectarea oriceilor cu apariia semnelor clinice ale maladiei peste 24-48 ore), identificarea toxinei prin RN cu anti-seruri Examenul serologic dozarea antitoxinelor pentru studierea imunitii populaiei (RP, RLA, RHAI, ELISA) TRATAMENTUL I PROFILAXIA TETANOSULUI Tratament: Ser imun antitetanic (gama-globulin specific) intramuscular, intravenos Anatoxin tetanic Tratament simptomatic (sedative, miorelaxante, antibioterapie, respiraie asistat, etc) Profilaxie: Imunizarea activ cu anatoxin tetanic (conform calendarului vaccinrii ADTP, ADT, AT) n caz de plag: prelucrarea corect, anatoxin, ser imun antitoxic 92.Botulismul. Clasificarea agentului cauzal (familie, gen, sp.), factorii de patogenitate. Patogeneza botulismului, principalele simptome clinice ale intoxicatiei botulinice. Diagnosticul microbiologic. Materiale de examinat. Depistarea si identificarea toxinelor botulinice. Izolarea si identificarea C.botulinum. Profilaxia si tratamentul specific al botulismului. Agentul cauzal C.botulinum Caractere morfotinctoriale bastona mobil, sporogen, gram+. Sporul este ovoid, subterminal (aspect de rachet de tenis), termorezistent, distrus la 120 grade 15 minute (autoclavare). Scindeaz proteinele i glucidele cu formare de gaze i acizi (acetic, butiric, lactic, etc). Factori de patogenitate toxina botulinic serotipuri A,B,C,D,E,F,G. Este de natur proteic, antigenic, specific de tip, transformabil n anatoxin. Doza letal pentru om 1-2 g. Stabil n mediu acid i la aciunea enzimelor digestive. Poate fi distrus prin nclzire 15 min la 80 grade sau 10 min la 100 grade. PATOGENEZA BOTULISMULUI Habitat mixt sol, ape i flora comensal a omului i animalelor Transmiterea: Alimentar (alimente conservate n cas: crnai, unc, jambon, pete srat sau afumat, conserve de fructe i legume) Condiii favorabile toxigenezei: -Salinitate insuficient (mai mic de 10 %) 78

-Temperatura peste 16 grade -Anaerobioz (alimente compacte sau ambalaje ermetice) -Prezena glucidelor (conserve de fructe, legume) -Timp suficient pentru producerea toxinei (cel puin 8 zile) Botulismul infantil apare la sugari sub 6 luni (germinarea n intestin a sporilor vehiculai prin alimente) Perioada de incubaie 18-96 ore Toxina ingerat este absorbit n sistemul limfatic intestinal, apoi n snge. Acioneaz la nivelul periferic asupra sinapselor cu acetilcolina ca mediator (jonciunile neuro-musculare). Mecanismul aciunii botulotoxinei: inhib eliberarea acetilcolinei din veziculele sinaptice rezultnd blocarea stimulrii nervoase a muchiului (paralizii flasce). SEMNE CLINICE 1. Paralizii n sfera nervilor cranieni: diplopie, ptoz palpebral, midriaz, disfagie, disartrie, senzaie de sete 2. Paralizii descendente 3. Dereglri digestive: nausee, vom, constipaie 4. Lipsa febrei i a dereglrilor cardiace Cauza decesului: paralizie flasc a muchilor respiratori sau stop cardiac DIAGNOSTIC Diagnostic clinic Diagnostic microbiologic Prelevate: ser sangvin, extract din alimente, mase vomitive, mase fecale Depistarea toxinei (RN pe oareci, RP, RHAI, RCoA, RLA, ELISA) Tehnici de biologie molecular Examenul bacteriologic este suplimentar! TRATAMENTUL I PROFILAXIA BOTULISMULUI Tratament specific: seroterapie precoce (ser polivalent, apoi monovalent) asociat cu anatoxinoterapie Profilaxie: nespecific INFECII CAUZATE DE BACTERII ANAEROBE NESPOROGENE Parte component a microbiocenozelor rino-faringiene, digestive i genitale Condiii ce favorizeaz multiplicarea: Leziuni necrotice Diminuarea potenialului redox Reducerea rezistenei organismului Disbioze FORME CLINICE Septicemii Procese supurative Supuraii abdominale (peritonite apendiculare, supuraii determinate de cancer digestiv, supuraii post-operatorii, abcese) Supuraii ale micului bazin (abces perirectal, piosalpinx, supuraii urinare) Supuraii pleuro-pulmonare, bucale, ORL (otite) Abces al creierului i meningite purulente 93.Difteria. Clasificarea agentului patogen (familie, gen, sp.). Factorii de patogenitate. Patogeneza difteriei si formele clinice. Diagnosticul microbiologic. Prelevate patologice. Microscopia directa, izolarea si identificarea culturii pure (proba Pizu, Zacs, determinarea toxigenezei, diferentierea biovariantelor). Profilaxia si tratamentul specific al difteriei. DIFTERIA toxiinfecie acut, caracterizat printr-o angin pseudo-membranoas cu efecte toxice la distan (miocardul, SNC i rinichii). Este provocat de mi/o din genul Corynebacterium. Genul Corynebacterium se caracterizeaz prin prezena in componena peretelui celular: 79

o Acidului mezo-diaminopimelic o Acizilor micolici cu caten scurt (22-38 atomi de C) o Coninutul GC ntre 46-74 %. Prezint asemnri cu mi/o din genurile Mycobacterium i Nocardia. Clasificarea genului Corynebacterium Corinebacterii fitopatogene Corinebacterii patogene pentru animale, care afecteaz accidental omul: C.pseudotuberculosis, C.ulcerans Corinebacterii cu tropism uman: Specie patogen: C.diphtheriae (biovaruri gravis, mitis, intermedius) intermedius) Specii comensale (specii pseudodifterice, difteroizi): C.xerosis, C.pseudodiphthericum, C.jeikeium, etc C.jeikeium, Caractere morfotinctoriale ale C.diphtheriae Bacterii (bastonae) drepte sau puin ncurbate, cu extremitile rotunjite sau ngroate (aspect de halter sau de mciuc). n frotiuri se aranjeaz ungiular, n palisade sau sub forma caracterelor chinezeti, cifre romane sau litere majuscule: Y, M, N, V... Imobile, asporogene, necapsulate. necapsulate. Se coloreaz G+, pentru evidenierea granulaiilor de volutin - Loeffler, Neisser. G+, Caractere de cultur i biochimice C.diphtheriae este o specie facultativ anaerob, posed catalaz, citocromi a,b,c, oxidazo-. Temperatura optim de cultivare 37C, pH 7,4. Medii de cultur elective: Mediul Loeffler (ser bovin coagulat): colonii S, mici, netede, opace, albe-cenuii, apar peste 1624 ore de cultivare Geloz-snge Medii de cultur selective difereniale Mediul Clauberg (geloz-snge cu telurit de potasiu). C.diphtheriae gravis: colonii R, mari, negre, crenelate, aspect de floare de margaret, nehemolitice; mitis: colonii S, mijlocii, negre, mitis: bombate, cu zon de hemoliz Mediul Tinsdale (geloz-ser-cistin-telurit de potasiu-tiosulfat) - colonii negre cu halou brun Mediul Bucin (geloz-snge cu hinozol) colonii albastre Medii de transport geloz-ser semilichid cu telurit de K Mediul OCST (ou-cistin-ser-telurit) Activitatea biochimic a C.diphtheriae: Proteolitic: Ureaza- (testul Zaks), cistinaza+ (testul Pizu), indol-. Zaharolitic: Gravis: glucoza+, amidon+, zaharozaGravis: Mitis: glucoza+, amidon-, zaharozaMitis: Se disting 22 lizotipuri de C.diphtheriae i multiple serogrupuri (antigen O polizaharidic) i serovaruri (antigen K proteic). Factori de patogenitate 1. Toxina difteric - origine proteic, secretat de tulpinile lizogene (profagi Tox+), n prezena unor cantiti reduse de Fe. Exotoxin tipic (fragmente polipeptidice A i B). Mecanismul de aciune - stoparea sintezei proteice prin inactivarea factorului de elongare EF-2 (activitate de ADP-riboziltransferaz). Conduce la moartea celulei afectate. Toxina difuzeaz n organism perturbnd funcionarea diferitor organe (SNC, cord, rinichi). Poate fi transformat n anatoxin, utilizat n vaccinare. 2. Enzime de patogenitate: hialuronidaza, neuraminidaza Patogeneza i formele clinice de difterie Sursa de infecie: bolnavul cu difterie i purttorii sntoi de germeni (colonizeaz rinofaringele, rareori tegumentul sau conjunctiva). Mecanismele i cile de transmitere: Direct pe cale aerogen (picturi) sau contact cu plgi contaminate. 80

Indirect prin obiecte (jucrii, cri), praf sau alimente contaminate (lactate). La poarta de intrare bacteriile se multiplic i provoac un focar inflamator local, determinat de aciunea toxinei, care fiind ulterior difuzat pe cale limfo- i hematogen provoac starea de intoxicaie general. Focarul inflamator se localizeaz n faringe (angina difteric), mai rar n laringe (crupul difteric), nas, urechi, conjunctiv, mucoasa organelor genitale, plgi cutanate. Leziunile locale se caracterizeaz prin inflamaie fibrinoas. Exotoxina cauzeaz necroz, dilatarea vaselor i creterea permeabilitii, eliminarea fibrinogenului, care coaguleaz cu formarea unei pseudomembrane fibrinoase. Ea conine bacterii, hematii, PMN i celule necrozate. Se detaeaz dificil, nu se dizolv n ap, este reproductibil in situ n cteva ore. Membrana are tendin s se extind. n forma malign difteria este nsoit de edem al gtului, semne toxice i paralizia vlului palatin. Intoxicaia general afecteaz SN (disfagie, paralizii), sistemul cardio-vascular (miocardite), suprarenalele (insuficien a suprarenalelor), rinichii (nefroz). Tulpini de C.ulcerans pot produce toxin identic cu cea difteric. Diagnosticul de laborator al difteriei Este URGENT!!! Prelevate n funcie de forma clinic, respectnd strict regulile de prelevare i transport. Metode de diagnostic 1. Examenul microscopic (Gram, Loeffler, Neisser), microscopia imunofluorescent Neisser), microscopia 2. Examenul bacteriologic (izolarea, identificarea culturii pure). Studierea toxigenezei obligator. Se efectueaz prin RN cu ser antitoxic in vivo (cobai), in vitro (RP Elek), sau depistarea genei Tox n prelevat sau n cultura pur prin PCR. 3. Examenul serologic retrospectiv, RA cu seruri perechi (I sptmn i a IIIa) i cultur de C.diphtheriae. Titru semnificativ 1:100 C.diphtheriae. semnificativ sau creterea titrului de Ac. Evaluarea titrului de antitoxine n serul bolnavului. La debutul bolii el este absent sau nu depete 0,5 UI/ml Receptivitatea la difterie poate fi determinat prin: Testul Schick (in vivo) (in vivo) RN in vitro RHAI ELISA Titru antitoxinelor > 0,1 UI/ml protector Titru inferior 0,01 UI/ml lipsa proteciei UI/ml Tratamentul difteriei Seroterapie precoce (ser antitoxic antidifteric, Ig). Neutralizeaz activitatea toxinei, blocnd fixarea ei pe receptorii celulari. Antibioticoterapie (macrolide, tetracicline, cloramfenicol, aminozide, beta-lactamine). Asigur eradicarea germenilor. Tratament simptomatic Profilaxia specific a difteriei Vaccinarea obligatorie a copiilor conform calendarului de vaccinri cu anatoxin difteric. Exist vaccinuri asociate: ADT, ADTP. Vaccinarea primara cu ADTP la 4-5-6 luni, revaccinarea la 22-24 luni cu ADTP, la 6-7, apoi la 14-15 ani cu ADT. Recent a fost obinut un vaccin sintetic antidifteric. Reprezint un polipeptid situat la jonciunea fragmentelor A i B a toxinei difterice, o molecul peptidic purttoare i un adjuvant sintetic. 94.Tusea convulsiva. Clasificarea agentului cauzal (familie, gen, sp.). Factorii de patogenitate. Patogeneza tusei convulsive, stadiile bolii. Diagnosticul microbiologic. Prelevate. Izolarea (metode de insamintare) si identificarea culturii pure, metoda serologica. Profilaxia si tratamentul specific al tusei convulsive. Familia Halobacteriaceae Genul Bordetella Specii: 81

Bordetella pertussis (agentul tusei convulsive) Bordetella parapertussis (agentul parapertusei) Bordetella bronhiseptica (pneumonii, bacteriemii) Bordetella avium Bordetella holmensii (izolat din hemoculturi) Bordetella hinzii (izolat din prelevate respiratorii) Bordetella trematum (infecii cutanate i auriculare) Caractere morfobiologice B. pertussis Cocobacterii G-, asporogene, imobile, formeaz microcapsul, n frotiu se dispun separat, n G-, perechi sau lanuri scurte. Reprezint mi/o strict aerobe, foarte pretenioase la cultivare. Medii speciale de izolare: mediul Bordet-Gengou (geloz-snge cu amidon i glicerin) geloz-cazein-snge-crbune activat Mediul de transport Kuzneov (soluie tampon fosfat, 0,5% agar-agar, 0,2% crbune activat) Peste 3-5 zile de incubare n atmosfer umed la 37 C apar colonii S mici, bombate, lucioase, cu aspect de picturi de mercur, hemolitice (corespund bacteriilor virulente faza I), forme R avirulente, faza IV. Coloniile de B.parapertussis apar n 48 ore, B.bronchiseptica n 24 ore B.pertussis manifest activitate biochimic redus: oxidaza+, nu fermenteaz glucidele, ureaza-, nitrat-reductaza- . Structura antigenic a B.pertussis este complex: Ag capsulare polizaharidice Ag proteice Ag fimbrial (hemaglutinina) Ag lipopolizaharidic. Factorii de patogenitate 1. Adezine: Hemaglutinina filamentoas (purtat de pili). Permite ataarea bacteriei la mucoasa tractului respirator, de asemenea se fixeaz pe macrofagi i limfocite. Aglutinogene. Proteine de suprafa situate pe fimbrii. Particip la ataarea B.pertussis la Aglutinogene. celulele epiteliale. Pertactina. Protein a membranei externe, permite fixarea pe membrana celulelor eucariote Pertactina. Subunitatea B a toxinei pertusice. Se fixeaz pe leucocite i mpiedic migrarea lor spre pertusice. focarul inflamator. 2. Toxine Toxina pertussis (citotoxin de tip A-B). Acioneaz asupra diferitor celule eucariote, mrind concentraia intracelular de AMP ciclic (n special n celulele epiteliale ale TR). Provoac hiperlimfocitoz, sensibilizare la histamin, hipersecreie de insulin. Adenilat-ciclaza-hemolizin. Hemolizina provoac moartea macrofagelor i monocitelor, Adenilat-ciclaza-hemolizin. adenilat-ciclaza perturb activitatea bactericid a PMN, monocitelor i macrofagelor i stimuleaz secreia sero-mucoas a cilor respiratorii. Toxina dermonecrotic. Se elibereaz n urma lizei bacteriene. dermonecrotic. Toxina citotraheal. Glicopeptid care inhib sinteza ADN, provocnd distrugerea celulelor citotraheal. ciliate Endotoxina Patogeneza tusei convulsive Sursa de infecie omul bolnav, n special n perioada de debut al bolii. Mecanismul de transmitere aerogen, prin picturi B.pertussis manifest tropism pentru mucoasa cilor respiratorii: faringe, trahee, bronii, bronhiole, chiar alveole. Alterarea epitelilului ciliat mpiedic eliminarea mucusului, el fiind eliminat doar prin tuse. Tusea survine din cauza iritaiei mucoasei de ctre endotoxina bacterian. Excitaia de lung durat a receptorilor terminali ai nervului pneumogastric determin un flux continuu de impulsuri n bulbul rahidian, ce duce la formarea unui focat de excitaie dominant. El atrage excitaii nespecifice de la ali receptori, fapt ce determin accesele de tuse, care devin tot mai grave i mai frecvente. 82

Un stimul puternic poate stinge dominanta, cu atenuarea tusei. Focarul este foarte stabil, persist i dup dispariia bacteriei din organism. n evoluia tusei convulsive se disting 4 stadii (perioade): Perioada de incubaie (3-15 zile) Perioada cataral, foarte contagioas. Caracterizat prin tuse seac, rinoree (3-14 zile) cataral, Perioada convulsiv (paroxistic). Accese de tuse spasmodic, epuizant, asociat cu cianoz, vom, convulsii. (2-4 sptmni) Perioada de convalescen (2-4 sptmni) Complicaii grave sunt posibile la copiii sugari: bronho-pneumonii, encefalite. Imunitatea este durabil, umoral. Rol protector au Ac anti-toxin pertussis i antihemaglutinin filamentoas. Diagnosticul de laborator al tusei convulsive Prelevate: mucoziti nasofaringiene sau bronice, recoltate ct mai precoce. Prelevate: Metode de diagnostic RIF Examenul bacteriologic (nsmnare cu tamponul sau prin tehnic plcilor tuite) Tehnnici de biologie molecular (PCR) Examenul serologic (RA, RFC, ELISA). Reaciile se pozitiveaz din sptmna a II a perioadei convulsive. Se examineaz seruri perechi prelevate la interval de 14-21 zile. Semnificativ este o cretere de cel puin 4 ori a titrului Ac. Tratamentul tusei convulsive Eritromicin sau cloramfenicol cel puin 10 zile (pn la apariia Ac) Imunoglobulin uman antipertussis Profilaxia specific 1. Imunizarea artificial obligatorie cu vaccin ADTP. Componentul antipertusic este reprezentat de o suspensie de bordetele de faza I, adsorbite pe adjuvant. 2. Vaccinul acelular conine unele componente bacteriene (anatoxina pertussis, hemaglutinina filamentoas). Este mai bine tolerat, dar mai puin eficace. 3. Imunoglobulin uman antipertussis 95.Tuberculoza. Clasificarea agentilor cauzali (familie, gen, sp.). Factorii de patogenitate. Primoinfectia tuberculoasa - granulomul tuberculos, complexul primar. Evolutia procesului infectios la indivizii cu rezistenta necompromisa. Diagnosticul microbiologic. Metoda alergica (proprietatile tuberculinei), metodele rapide. Profilaxia specifica a tuberculozei. Familia Mycobacteriaceae Genul Mycobacterium Specii: o Responsabile de tuberculoza uman: M.tuberculosis, M.bovis, M.africanum (complex tuberculosis) o Agentul leprei: M.leprae (strict uman) o Micobacterii atipice, condiionat patogene: M.avium, M.ulcerans, M.fortuitum, M.fortuitum, M.kansasii, M.marinum, etc. Cauzeaz micobacterioze la persoane imunocompromise. o Micobacterii nepatogene: M.smegmatis, M.gastri, M.phley Caracteristica general a micobacteriilor: bastonae G+ drepte sau uor ncurbate, necapsulate, asporogene, imobile, acido-alcoolorezistente prin tehnica de colorare Ziehl-Neelsen. M.tuberculosis este o bacterie patogen strict uman, responsabil de tuberculoz. Este sensibil la cldur, lumin solar direct, raze UV sau X. Rezistent la frig sau desicare. Este puin sensibil la acizi, baze (se utilizeaz n decontaminarea prelevatelor) sau detergeni i foarte sensibil la soluia de alcool de 70. Caractere morfotinctoriale M.tbc este un bastona fin sau uor ncurbat, n frotiu se observ izolat, n grmezi sau corzi. Se coloreaz in rou prin tehnica Ziehl-Neelsen. 83

Caractere de cultur M.tbc este o bacterie strict aerob, foarte exigent la cultivare. Toate mediile de izolare au la baz ou coagulat. Mediul de referin Lowenstein-Jensen (ou, glicerin, asparagin). Alte medii solide Popescu (acid glutamic in locul asparaginei), Finn (glutamat de Na). asparaginei), Mediul lichid Sauton. Contine saruri minerale, asparagina, glicerina. M.tbc creste in 8-10 zile Sauton. sub forma de voal. Micobacteriile patogene cresc lent (perioada de generaie 20 ore), la 37C, pH 6,8-7,0. Coloniile de M.tbc apar peste 2-4 sptmni, sunt colonii R, rugoase, friabile, conopidiforme, opace, de culoare crem-bej. M.bovis i M.africanum formeaz colonii S, mici, netede, nepigmentate, vizibile peste 4-8 sptmni. Activitatea biochimic a micobacteriilor patogene Toate micobacteriile patogene produc o catalaz termolabil, distrus la 68C timp de 20 min. Celelalte micobacterii posed catalaz termostabil. M.tbs i M.bovis hidrolizeaz ureea. M.tbc produce acid nicotinic (niacin), reduce nitraii n nitrii. M.bovis nu manifest astfel de activitate. Compoziia chimic i factorii de patogenitate ai micobacteriilor Lipidele constituie 20-45% din masa celulei. Sunt reprezentate de acizi micolici i ceruri (condiioneaz transformarea macrofagelor n celule epitelioide i celule gigante Langhans). Cord-factorul (sulfo-lipid) perturba respiraia n mitocondrii, induce cultivarea n corzi (cosie) a M.tbc. M.tbc. Polizaharidele joac un rol important n formarea Ac serici, conferind specificitatea imunologic. Proteinele reprezint suportul imunitii celulare i a hipersensibilitii tardive. Patogeneza i formele clinice de tuberculoz Sursa de infecie omul bolnav cu TBC cu leziuni pulmonare cavitare deschise n bronsii (M.tbc, M.africanum) sau bovinele bolnave (M.bovis). M.africanum) (M.bovis). Transmiterea se efectueaz pe cale aerian (picturi, praf). Rareori este posibil contaminarea prin obiecte, alimente (lapte nepasteurizat) sau mini contaminate. Receptivitatea este influenat de vrst i factorii de mediu: carene nutritive, alcoolism, tratament imunosupresiv, etc Primoinfecia tuberculoas. Reprezinta un ansamblu de manifestari clinice, umorale si anatomice care se desfasoara in organism in urma primului contact cu agentul TBC. Dup contaminare (mai frecvent in copilarie), la poarta de intrare (90% - tractul respirator), copilarie), bacteriile sunt captate de macrofage n care se multiplic (bacterii facultativ intracelulare, mpiedic formarea fagolizosomei). Apare o leziune inflamatoare nespecific. Peste cteva sptmni (4-12) se dezvolt o imunitate celular i leziunea exsudativ evolueaz n leziune granulomatoas. Sub aciunea unor citokine macrofagii activai se difereniaz n celule epitelioide i celule multinucleate gigante. Ele sunt nconjurate de limfocite i fibroblaste. Acesta este granulomul tuberculos, semn caracteristic primo-infeciei. Infecia se extinde pe cale limfatic, cu afectarea ganglionilor regionali. Primoinfecia inaparent. La cca 85% leziunile se vindec i se pot autosteriliza. Nici o expresie . clinic sau radiologic. Tuberculoza primar subclinic. Dac multiplicarea bacteriilor este masiv, n leziunile . tuberculoase se realizeaz o necroz cazeoas (tuberculom). Frecvent are loc calcifierea tuberculomului (leziunea este vizibil radiologic), cu autosterilizarea spontan sau cu persistena unor bacterii n leziune. Consecinele primoinfeciei inaparente sau subclinice: dezvoltarea imunitii antituberculoase i a sensibilizrii tuberculinice. Tuberculoza primar manifest necomplicat. Pacienii au febr, astenie, pierdere n greutate, etc. Etapa ganglionar poate fi depit cu diseminri hematogene i afectarea pleurei, meningelui, mduvei osoase, parenhimei organelor. Leziunile pot evolua fie spre agravare, fie spre cicatrizare. Primoinfecia cu complicaii. Rareori (10% cazuri), evoluia este defavorabil: masele necrotice sunt evacuate n bronii, vase sanguine, pleur sau pericard cu formarea unei caverne, unde 84

bacteriile se multiplic intens. Fistulizarea ntr-un vas sangvin disemineaz infecia sistemic (tuberculoza miliar). Starea general este alterat, apare febr, tuse, uneori hemoptizie. Bolnavul este contagios, eliminnd bacterii cu sputa. Tuberculoza secundar. Se manifest n condiii de scdere a reactivitii imune, reinfecii secundar. masive sau reactivarea unor focare latente. Focarele noi apar n ritm lent i evolueaz cronic fr tendin de vindecare spontan. Alte forme clinice de tuberculoz: ganglionar, meningean, osteo-articular, uro-genital. tuberculoz: Imunitatea antituberculoas este celular, nesteril. Hipersensibilitatea tardiv nsoete imunitatea celular. Ac circulani nu au rol protector. 96.Tuberculoza. Clasificarea agentilor patogeni, factorii de patogenitate. Evolutia procesului infectios in tuberculoza pulmonara la gazda inalt receptiva. Diagnosticul microbiologic. Prelevatele: recoltarea, omogenizarea, decontaminarea. Concentrarea micobacteriilor din sputa. Microscopia directa, izolarea si identificarea micobacteriilor. Determinarea spectrului de sensibilitate la antibiotice si chimioterapice. Tratamentul specific al tuberculozei. Strategia DOTS. Diagnosticul de laborator al tuberculozei Prelevate: n funcie de forma clinic Prelevate: n caz de necesitate se efectueaz omogenizarea (decontaminarea) i concentrarea prelevatelor. Metode de diagnostic Examenul microscopic frotiuri colorate Ziehl-Neelsen (bastonae purpurii izolate) sau cu auramin (bastonase galbene pe fondul negru). negru). Examenul bacteriologic izolarea culturii pure pe mediile speciale, identificarea ei, testarea sensibilitii la chimioterapice (prin metoda diluiilor n mediu solid) PCR pentru detectarea rapid a micobacteriilor direct n prelevate Intradermoreacia la tuberculin (reacia Mantoux). Se cerceteaz starea de hipersensibilitate cutanat la tuberculin. Tuberculina reprezint un filtrat dintr-o cultur bulionic autoclavat de M.tuberculosis. Pe faa anterioar a antebraului se injecteaz i/dermic 2, 5 sau 10 UI de tuberculin n volum de 0,1 ml. Lectura peste 72 ore. Reacia pozitiv se manifest printr-o induraie i congestie cu diametrul superior sau egal cu 5 mm. Interpretarea se efectueaz n funcie de contextul clinic Reacia + indic c subiectul a fost infectat cu micobacterii (primoinfecie), a fost vaccinat cu BCG sau este bolnav de tuberculoz (n acest caz diametrul depete 10 mm). Reacia negativ exclude diagnosticul de tuberculoz. Tratamentul tuberculozei Antibiotice cu spectru larg: rifampicin, streptomicin, kanamicin Fluorochinolone Chimioterapice care inhib sinteza acizilor micolici (Izoniazida, Pirazinamida, Etambutolul, Etionamida) Exigenele terapiei antituberculoase: a mpiedica selecia mutanilor rezisteni i a steriliza definitiv focarul. n acest scop se utilizeaz asocierea a 3-4 droguri pe o perioad de 6-12 luni. Profilaxia specific Vaccinarea obligatorie cu vaccinul BCG. El reprezint o tulpin vie avirulent de M.bovis. A fost M.bovis. obinut de Calmette i Guerin n 1921 dup multiple repicri (230 pasaje) pe mediu cu cartof, bil i glicerin. Vaccinul se administreaz i/dermic la vrsta de 4-5 zile de la natere. Revaccinarea la 7 ani, apoi peste fiecare 5 ani (persoanele cu reactia Mantoux negativa). Revaccinarea se efectueaz la 7 ani persoanelor cu proba Mantoux negativ. 97.Sifilisul. Clasificarea agentului cauzal (familie, gen, sp.), factorii de patogenitate. Patogeneza si stadiile infectiei. Sifilisul congenital. Diagnosticul microbiologic al sifilisului. Prelevatele in dependenta de stadiile bolii. Metoda microscopica. Metoda serologica. CLASIFICAREA SPIROCHETELOR Spirochetele bacterii helicoidale, flexibile i mobile (fibrile interne), rspndite n natur, unele comensale ale mucoaselor umane. 85

Familia: Spirochaetaceae Genuri: Treponema, Borrelia, Spirochaeta, Cristispira

Familia: Leptospiraceae Genul: Leptospira

MICROBIOLOGIA I DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL SIFILISULUI Genul Treponema Specii : T.pallidum (patogen) subspecii (variante): o T.pallidum pallidum (agentul sifilisului) o T.pallidum endemicum (agentul bejelului, sifilis endemic nevenerian leziuni cutanate) o T. palidum pertenue (agentul pianului, maladie cutanat, nevenerian, zone tropicale i subtropicale) o T. carateum (agentul pintei/carate, nevenerian, America Central i de Sud) Treponeme comensale: Orale (T.denticola, T.orale, etc) Genitale (T.phagedenis, T.refringens, etc) CARACTERE MORFOLOGICE I TINCTORIALE T.pallidum bacterie fin, helicoidal, cu 8-14 spire regulate i capetele ascuite, mobil cu micri de flexie, nurubare i translaie. G Evidenierea: 1. preparate native (microscopul cu fond negru, contrast de faz) 2. nu se coloreaz dup Gram 3. Romanovsky-Giemsa roz-pal 4. impregnaie cu sruri de argint (filamente negre-brune pe fondul galben) 5. frotiuri Burri necolorate pe fondul negru CARACTERE DE CULTUR Cultivarea T.pallidum in vitro imposibil Pasaje succesive n testicule de iepure (tulpina Nichols de T.pallidum). Suspensii de astfel de treponeme supravieuiesc 72 ore n mediul Mayer-Nelson (la 25 grade n anaerobioz). STRUCTURA ANTIGENIC Haptene lipidice (antigen cardiolipidic / cardiolipin, Ag nespecific) fosfolipid din MCP, prezent la treponeme patogene i esuturi ale mamiferelor (extras din cord bovin) Antigen proteic (flagelar), de grup, comun treponemelor patogene i nepatogene (obinut din tulpina Reiter a T.phagedenis) Antigen lipoproteic din membrana extern, specifice T.pallidum (obinute din tulpina Nichols a T.pallidum) FACTORI DE PATOGENITATE 1. Factori de adeziune 2. Factori de invazie (hialuronidaza) 3. Factori de sensibilizare 4. Endotoxina Supresia rspunsului imun celular n stadiile iniiale ale bolii PATOGENEZA SIFILISULUI Sursa de infecie omul bolnav Cile de transmitere: 1. Sexual 2. Contact indirect (srut, obiecte, instrumente chirurgicale recent contaminate, transfuzii de snge, etc.) 3. Transplacentar (vertical) Poarta de intrare tegumentul lezat, mucoasa genital, anal, bucal Perioada de incubaie 2-6 sptmni (3) Evoluia sifilisului Sifilisul primar (4-6 sptmni) La poarta de intrare apare ancrul sifilitic: ulceraie cu baza indurat, nedureros, bogat n treponeme (99% localizare genital i anal, 1% - bucal). Adenopatie satelit. 86

Vindecare spontan a ancrului este posibila (imunitatea local). Sifilisul secundar (urmare a diseminrii sangvine) dup 6-8 spt. de evoluie Manifestri cutanate (rozeole, sifilide erozive,etc), foarte contagioase Manifestri la nivelul mucoaselor (plci mucoase) Poliadenopatie Leziuni ale organelor interne (hepatite, nefrite, periostite, meningite, etc) Rspunsul imun poate duce la dispariia leziunilor n 1-3 luni Sifilisul latent (persoanele la care treponemele persist n ganglioni limfatici i splin) Lipsa semnelor clinice Necontagios Durata nedeterminata Sifilisul teriar (dup 4-30 ani de la contaminare) Afeciuni cardio-vasculare (aortite, anevrisme) Afeciuni neurologice (tabes, paralizie general) Afeciuni osoase i cutanate (gome) Deces posibil Sifilisul congenital n timpul graviditii moartea ftului prin afeciuni poliviscerale La finele graviditii sau la natere leziuni tardive (dentare, osoase, oculare) Imunitatea (nesteril) o Umoral o Celular (protectoare, deprimat n sifilisul primar i secundar) DIAGNOSTICUL DE LABORATOR Prelevate: serozitatea din leziunile primare sau secundare, puncii din ganglioni limfatici, serul sangvin, LCR Metode de diagnostic Examenul microscopic (sifilis primar, secundar) Microscopia pe fond negru, contrast faz RIF Impregnare argentic, coloraia Giemsa Examenul serologic (sifilis secundar, teriar) I. Reacii nespecifice (cu Ag cardiolipidice) Reacia VDRL (Veneral Disease Research Laboratory) RP (RF) Ieftin, facil, specificitate redus Reacii fals pozitive: viroze, colagenoze, paludism, ciroze, reumatism, graviditate, etc. RFC (Wassermann) II. Reacii specifice (cu Ag treponemice) RFC Wassermann sau Kolmer RHAI (Ag lizat din tulpina Nichols fixat pe hematii) RIFI (Ag suspensie de T.pallidum fixat pe lam) RIT (testul Nelson) (Ag tulpina Nichols a T.pallidum) RIE (ELISA) PCR (detectarea ADN) n LCR, lichidul amniotic, esut EVOLUIA TITRURILOR DE AC RIFI se pozitiveaz la apariia ancrului (o lun dup infectare) VDRL dup 6 sptmni RHAI RIT n stadiul secundar, 2 luni dup infectare Dup tratamentul sifilisului: VDRL se negativeaz prima. Alte reacii rmn pozitive. TERAPIA I PROFILAXIA SIFILISULUI ANTIBIOTERAPIA beta-lactamine, tetracicline, macrolide (rezisten la aminoside) 87

Reacia Herxheimer este posibil (efectul endotoxinei). PROFILAXIA depistarea sistematic activ i tratarea bolnavilor. 98.Borreliozele. Clasificarea agentilor cauzali ai febrei (tifosului) recurente epidemice si endemice (familie, gen, sp.). Factorii de patogenitate. Patogeneza febrei recurente, manifestarile clinice. Diagnosticul microbiologic al febrei recurente. Prelevate. Examenul microscopic. Metoda biologica. CLASIFICARE: Familia Spirochaetaceae Genul Borrelia Specii: B.recurrentis (transmis prin pduchi) B.duttoni, B.hispanica, B.persica, B.burgdorferi, etc (transmise prin cpue) CARACTERE MORFOBIOLOGICE Morfologia: filamente spiralate cu 5-8 spire neregulate, flexibile i mobile, cu micri de flexie i nurubare. G-, colorate n albastru-violet dup Giemsa. Caractere de cultur: bacterii anaerobe, cultiv in vitro pe medii complexe i in vivo (ou embrionat, artropode, animale de laborator). Structura antigenic: variabilitate pronunat! Habitat: Omul bolnav n snge i esuturi infectate Roztoare Vectori (pduchi, cpue) n hemolimf, saliv, intestin FEBRA RECURENT Febra recurent epidemic Agentul cauzal - B.recurrentis Sursa de infecie omul bolnav Vector - Pediculus humanus Contaminare prin hemolimfa eliberat la zdrobirea pduchilor Poarta de intrare tegumentul lezat, conjunctiva Febra recurent endemic Agenii cauzali - B.hispanica, B.persica, B.duttoni, etc Sursa de infecie roztoarele slbatice sau peridomestice Vectoricpue din genul Ornithodoros Contaminare prin neptur, prin intermediul lichidului coxal, prin dejecii anale PATOGENEZA FEBREI RECURENTE Perioada de incubaie 3-14 zile (borreliile se multiplic n viscere ficat, splin, creier, etc.) Perioada febril debut brutal, cu febr 40-41 grade i frison (endotoxina eliberat n snge la distrugerea borreliilor). Algii difuze, stare de tifos, semne meningeale, hepato-splenomegalie, icter. Criza febril dureaz 7 zile. Urmeaz o perioad afebril de o sptmn, succedat de alt criz termic cu durat mai scurt. Accesele se repet (2-4-10 recurene). Mecanismul recurenelor Borreliile care ptrund n organism prezint variaii antigenice succesive. Sub aciunea anticorpilor bactericizi formai la sfritul acceselor febrile se selecteaz varianta antigenic responsabil de urmtorul acces. Febra recurent endemic are o evoluie mai benign, cu recurene mai frecvente. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL FEBREI RECURENTE Prelevate: snge, LCR Metode de diagnostic: Examenul microscopic (n perioada febril): o preparate native (fond negru, contrast de faz) o frotiuri colorate Giemsa 88

o RIF Examenul biologic (infectarea cobailor, obolanilor) TRATAMENTUL I PROFILAXIA FEBREI RECURENTE Tratament: peniciline, tetracicline, cloramfenicol Profilaxie: lupta contra vectorilor i protecia individual 99.Borreliozele. Clasificarea agentului cauzal al bolii Lyme (familie, gen, sp.). Patogeneza bolii Lyme, manifestarile clinice. Diagnosticul microbiologic al bolii Lyme. Prelevate. Examenul microscopic. Izolarea si identificarea B.burgdorferi. Diagnosticul serologic. BOALA LYME Agentul cauzal Borrelia burgdorferi (B.burgdorferi sensu stricto, B.afzelii, B.garinii) Caractere morfoculturale bacterie helicoidal, mobil, efectueaz micri de flexie i rotaie. Nu se coloreaz prin metoda Gram. Se cultiv lent (cteva sptmni) numai pe medii speciale. HABITAT I CONTAMINARE Rezervor de infecie: roztoare, animale domestice (cini, cai, etc), psri. Vectori: cpue din genurile Ixodes i Amblyomma, nari, tuni Contaminare: prin neptura vectorului infectat EVOLUIA BOLII LYME Incubaie 2-4 sptmni Faza primar (leziune cutanat eritemul cronic migrator, febr, cefalee, astenie). Durata 3-4 spt. Faza secundar durata 2-6 sptmni manifestri neurologice, cardiace, cutanate, osteoarticulare. Faza teriar dureaz luni, ani afeciuni cronice cutanate (acrodermatit cronic atrofiant), articulare (artrite cronice), neurologice (encefalomielite). DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL BOLII LYME Prelevate: biopsii cutanate, snge, LCR, lichid articular Metode de diagnostic: Examenul microscopic (preparate native, coloraia special a biopsiilor, impregnare argentic) Examenul bacteriologic Diagnosticul serologic (RIFI, ELISA, Western-blot) PCR Tratament peniciline, tetracicline Profilaxie informarea populaiei, extragerea cpuelor 100. Leptospirozele. Clasificarea agentilor patogeni (familie, gen, sp., s/v). Factorii de patogenitate ai leptospirelor. Patogeneza infectiei. Diagnosticul microbiologic. Prelevate, examenul microscopic, izolarea si identificarea culturii pure. Metoda biologica, diagnosticul serologic ( RHAI, RFC, RAL). Profilaxia si tratamentul specific al leptospirozelor. Leptospirele sunt bacterii care pot infecta numeroase specii de animale (n special vertebrate) i accidental omul. Clasificare Familia Leptospiraceae Genul Leptospira Spp. L.interrogans (patogen pentru om i animale) L.biflexa (saprofit, ape de suprafa) L.parva (saprofit, apa de conduct) CARACTERE MORFOBIOLOGICE Caractere morfologice bacterii fine i spiralate, cu 10-30 spire strnse i regulate, cu capetele ndoite n crlig (aspect de S, C, ?). Realizeaz micri de nurubare, flexie i translaie. Pot fi examinate la microscopul cu fond negru sau cu contrast de faz. Coloraia Giemsa roz-pal 89

CARACTERE MORFOBIOLOGICE Caractere de cultur Medii lichide cu sruri anorganice tamponate cu fosfai i mbogite cu ser de iepure (mediile Korthof, Stuart, Wervort-Volf), medii semisintetice Aerobioz 28-30 grade C Leptospirele se multiplic n 3-10 zile (pn la o lun) fr a tulbura mediul Structura antigenic a L.interrogans Antigene cu specificitate de gen, LPZ Antigene majore de grup (peste 20 serogrupuri) Ex.: L.icterohaemorrhagia, grippotyphosa, hebdomadis, canicola, pomona, autumnalis, etc. Antigene proteice minore de tip (peste 200 serotipuri/variante) - proteice PATOGENEZA LEPTOSPIROZELOR Sursa de infecie: roztoarele slbatice, accidental-roztoarele peridomestice sau animalele domestice (porci, cini, cai, bovine) leptospirele sunt gazduite in tubii contori proximali renali. Poarta de intrare: tegument i mucoase Cile de transmitere: 1. Alimentar (alimente i apa contaminat) 2. Contact direct cu animalele infectate 3. Contact indirect (cu apa contaminat) Leptospirele sunt antrenate n circulaia sangvin fr leziuni la poarta de intrare. Incubaia 1-2 sptmni (10 zile) Evoluia leptospirozelor: Faza septicemic (generalizat) 7 zile febr, frison, sindrom meningeal Faza afebril (1-3 zile) Faza organic (febr, sindrom meningeal, sindrom hepato-renal, sindrom cardio-vascularhemoragic, icter) Imunitatea: umoral, specific de tip, durabil DIAGNOSTICUL DE LABORATOR Prelevate: snge, LCR (prima sptmn), urin (din sptmna II de boal), probe necroptice (seciuni histologice renale, hepatice) Metode de diagnostic Examenul microscopic (fond negru, contrast de faz, coloraia Giemsa sau impregnaia argentic a seciunilor histologice), RIF Examenul bacteriologic Probele sunt nsmnate n cte 3-5 tuburi cu mediu de cultur, incubate n aerobioz la 28 grade pn la 1-3 luni. Identificarea n baza caracterelor: Microscopice De cultur De patogenitate Serologice (RFC, RAL) Examenul biologic (inocularea intraperitoneal a cobailor). Peste 1-3 zile leptospirele pot fi depistate n exsudatul din cavitatea abdominal. Tehnici PCR (detectarea ADN) Diagnocticul serologic (din spt. II) Reacii cu specificitate de gen (RFC, RHAI, RIFI, ELISA) Reacii cu specificitate de tip (de referin)-RAL (Reacia de Aglutinare-Liz) Titrul diagnostic - 1/400 sau creterea n dinamic de 4 ori TRATAMENT I PROFILAXIE Tratament: penicilin, tetraciclin, gama-globulina antileptospiroas 90

Profilaxie: deratizarea, igiena i protecia muncii, supravegherea bazinelor de ap, vaccinarea selectiv (vaccin inactivat, durata imunitii-1 an) 101. Escherichiozele. Clasificarea E.coli dupa structura antigenica. Habitatul, rolul in fiziologia omului. Factorii de patogenitate. Fenotipurile diareigene, bacteriemice, uropatogene. Infectiile intestinale cauzate de categoriile fenotipurilor diareigene. Infectiile extraintestinale cauzate de E.coli. Diagnosticul microbiologic al colienteritelor la copii. Prelevate. Izolarea, acumularea, identificarea culturii pure (biochimica, serologica), diagnosticul serologic. FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE Peste 30 genuri cu 130 specii Habitat: intestinul omului, animalelor Martor al contaminrii fecale a mediului Majoritatea constituie flora normal (comensal) intestinal CLASIFICAREA N FUNCIE DE PATOGENITATE: Enterobacterii patogene: genurile Shigella, Salmonella, Yersinia, unele variante ale speciei Escherichia coli; Enterobacterii condiionat patogene: genurile Citrobacter, Enterobacter, Hafnia, Klebsiella, Morganella, Proteus, Providencia, Serratia, Edwardsiella, etc. TESTE-CHEIE ALE FAMILIEI 1. Bacterii (bastonae) gramnegative 2. Nesporogene 3. Mobile-peritriche/imobile 4. Facultativ-anaerobe 5. Fermenteaz glucoza (A, AG) 6. Catalaza-pozitive 7. Oxidaza-negative 8. Reduc nitraii n nitrii TESTE PRIMARE (identificarea genurilor) 1. Utilizarea citratului de Na (mediul Simmons) 2. Utilizarea malonatului de Na 3. Hidroliza ureei (testul Preus) 4. Decarboxilarea lizinei (LDC) 5. Dezaminarea fenilalaninei (FAD) 6. Producere de H2S n mediul multitest (ex.: Kligler) 7. Fermentarea glucozei pn la acizi (testul MR) 8. Fermentarea glucozei pn la acetoin (testul VP) 9. Mobilitatea (n geloz semilichid) TESTE SECUNDARE (identificarea speciilor/variantelor) 1. Teste biochimice (fermentarea glucidelor, decarboxilarea aminoacizilor (arginin, ornitin), producerea indolului, etc) 2. Fagoidentificarea i lizotipia 3. Colicinogenotipia 4. Seroidentificarea 5. Antibiograma CARACTERE MORFOBIOLOGICE Caractere morfologice: bastonae G-, 1 - 6 m x 0,3 - 1 m, mobile peritriche (Klebsiella, Yersinia pestis, Shigella imobile), nesporogene, formeaz microcapsule (Klebsiella capsulat), posed fimbrii. Caractere de cultur: Anaerobe facultativ Temperatura optim 37 grade C (limite 18 45 grade) Nepretenioase nutritiv 91

Colonii S, apar dup 18-24 h de incubare, 2 - 3 mm (dup repicri pot apare colonii R), Klebsiella mucoide, Proteus invadeaz suprafaa mediului MEDII DE CULTUR De transport: glicerin 30%, soluie salin 3%, soluie tampon-fosfat De mbogire a bacteriilor patogene: Kauffmann, Muller, bulion selenit, etc Diferenial-diagnostice: I. De izolare ENDO, LEVIN, PLOSKIREV Componena: baz nutritiv, lactoz, indicator Coloniile L+ : colorate Coloniile L- : incolore (frecvent flora patogen) Mediul Wilson-Blair cu sulfit de Bi (Salmonella reduce sulfitul n sulfur de Bi colonii negre pe mediul verde) II. De acumulare i identificare preliminar (medii multitest) Russel, Kligler (glucoz, lactoz, sruri de Fe) Olkeniki (glucoz, lactoz, zaharoz, uree, sruri de Fe) III. De identificare final (medii cu citrat, malonat, irul Hiss, medii cu aminoacizi, gelatina, etc) CARACTERE ANTIGENICE Ag O (R), de perete, LPZ, termostabil i rezistent la alcool, sensibil la formol, specificitate de gen, specie, grup Ag H, flagelar, proteic, termolabil i inactivat de alcool, rezistent la formol, specificitate de tip (variant) Ag K, superficial, capsular, termovariabil, specificitate de specie, tip (mascheaz Ag O, inaglutinabilitate cu seruri anti-O). Variante L, A, B la E.coli, Vi la Salmonella i Citrobacter Ag F, fimbrial, termolabil, nespecific ECA antigen comun fam. Enterobacteriaceae (interes taxonomic) Ag Kunin GENUL ESCHERICHIA Genul Escherichia Spp.: E.coli, E.blattae, E.fergusonii, E.vulneris, E.hermanii Habitat: intestinul omului i animalelor (80% din flora aerob intestinal), 107-109 bacterii/gram fecale. Contamineaz solul i apele de suprafa. Prezena E.coli - indicator de contaminare fecal. Rolul E.coli n fiziologia uman 1. Manifest activitate antagonist fa de alte bacterii, inclusiv cele patogene. 2. Stimuleaz dezvoltarea esutului limfoid prin intermediul Ag sale 3. Particip la procesele de digestie, inclusiv n metabolismul colesterolului i acizilor biliari 4. Asigur organismul cu vitamine, sintetiznd vitamine B, K, acid nicotinic, acid folic, etc. CARACTERE MORFOBIOLOGICE E.coli enterobacterie tipic, mobil, lactoza+, fermenteaz glucidele cu formare de AG (teste primare: MR +, mobilitate +, celelalte sunt negative) Structura antigenic Ag O 180 tipuri (O1, O2, O3......O180) Ag H 60 tipuri (H1, H2, etc) Ag K 100 tipuri Din combinaii rezult serovariante: ex. O55:H2:K1 Factori de patogenitate 1. Capsula (antifagocitar, Ag K1 camuflaj imunologic datorit epitopilor comuni cu polisialozilglicopeptide cerebrale la nou-nscui) 2. Proteine din ME i LPZ (anti-complement, protecie de factorii bactericizi ai sngelui, adeziune, invazie) 3. Fimbrii (adeziune) 4. Toxine (endotoxina, enterotoxine termostabile - ST i termolabile - LT, citotoxine Shigalike toxine (SLT-1, SLT-2) 5. Hemolizina 6. Siderofori (sisteme de captare a Fe) ROLUL E. COLI N PATOLOGIA UMAN 92

FENOTIPURI DIAREIGENE Tulpini enteropatogene: EPEC (O26, O55, O111, O125, O142, etc). Responsabile de gastroenterite infantile (infecii salmoneliforme). Ader la mucoasa intestinului subire printr-o protein din membrana extern fr a penetra intracelular. Tulpini enteroinvazive: EIEC (O28, O124, O143, etc). Responsabile de sindrom dizenteric cu invazia mucoasei colonului, penetrare intracelular, ulceraii. Factori de patogenitate: adezine, citotoxine. Tulpini enterotoxigene: ETEC (O6, O8, O20, O25, O115, etc). Responsabile de diareea cltorului, sindrom holeriform. Adeziunea la enterocitele intestinului subire este asigurat de pili (CFA colonization factor antigen sau CS coli surface factors). Elaboreaz toxine enterotoxine ST i/sau LT. Activeaz adenilat- respectiv guanilat ciclaza enterocitelor, provocnd o secreie sporit a ionilor de Cl- i inhibiia absorbiei ionilor de Na+, antrennd o pierdere hidric important. Tulpini enterohemoragice: EHEC (O157:H7; O26, O111). Responsabile de colite hemoragice cu sindrom uremic-hemolitic (anemie hemolitic+trombocitopenie+insuficien renal). Posed factori de adeziune i produc citotoxine capabile de difuzie n organism (Shiga-like toxine SLT 1 i SLT 2). Produc frecvent hemolizin. Tulpini enteroagregative: EAggEC (O111:H12). Posed adezine, hemolizine i SLT. Provoac diaree persistent (peste 14 zile) la copii. Ader agregativ la suprafaa culturilor de celule. Tulpini enteroadezive: EAEC. Ader difuz la celulele intestinale i culturile de celule. Provoac sindroame diareice. FENOTIPURI UROPATOGENE (O1, O2,O4,O6). Posed afinitate pentru mucoasa urogenital (fimbrii tipul P sau 1, Ag O i K specifice, hemolizine, etc). FENOTIPURI BACTERIEMICE Alte forme clinice provocate de E.coli: oc endotoxinic Meningite la nou-nscui (preponderent tulpini cu Ag K1) Infecii ale plgilor (frecvent de origine nozocomial) Colecistite, peritonite, salpingite, etc. Toxiinfecii alimentare DIAGNOSTIC DE LABORATOR Prelevate n funcie de forma clinic: materii fecale, urin, snge, LCR, puroi, etc Metode de diagnostic Examenul microscopic de orientare (frotiu Gram n infecii extra-intestinale, RIF) Examenul bacteriologic (de baz, cantitativ) Examenul serologic (retrospectiv, de confirmare) RA cu autotulpini (titru diagnostic 1:200) Tratamentul escherichiozelor Antibiotice (conform antibiogramei) Eubiotice (colibacterin, lactobacterin, bifidumbacterin, bificol, etc) Profilaxia escherichiozelor - nespecific 102. Dizenteria. Clasificarea agentilor patogeni (familie, gen, spp.). Factorii de patogenitate ai shigelelor. Patogeneza dizenteriei, simptomele clinice. Diagnosticul microbiologic. Prelevatele. Microscopia (RIF), izolarea, acumularea, identificarea culturii pure (biochimica, serologica), serodiagnosticul. Profilaxia si tratamentul specific al dizenteriei. GENUL SHIGELLA. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL DIZENTERIEI Shigelele strict umane. Cauzeaz infecii intestinale - igeloze, cea mai grav formdizenteria bacterian. Clasificarea genului Shigella (biochimic i antigenic): A Shigella dysenteriae (12 s/v, 12 b/v) Manitol B Shigella flexneri (6 s/v, 14 ss/v, 23 b/v) C Shigella boydii (18 s/v) D Shigella sonnei (1 s/v, 7 b/v) Subgrupele B, C, D manitol + 93

CARACTERE MORFOBIOLOGICE Enterobacteriaceea tipice, imobile, lactozo-negative, scindeaz glucoza pana la acizi (testul MR+), celelalte teste primare sunt negative. Factori de patogenitate: 1. Factori de adeziune la mucoasa colonului (fimbrii, LPZ) 2. Microcapsula (antifagocitar) 3. Factori de penetrare i multiplicare intracelular 4. Toxine: Shigatoxina - neurotoxic, enterotoxic, citotoxic elaborat de S.dysenteriae 1 Enterotoxine (Shiga-like toxine (SLT), verotoxine) Endotoxina Structura antigenic: Ag O i K cu specificitate de gen, specie, subspecie, variant Rezistena n mediul extern: S.dysenteriae - foarte sensibil (1-2 ore) S.flexneri persist 1-3 sptmni n ap, 2 luni n lactate S.sonnei persist i se multiplic n lactate PATOGENEZA DIZENTERIEI BACTERIENE Sursa de infecie: bolnav, reconvalescent, purttor Transmiterea fecal-oral: Contact direct (mini murdare) Alimentar (alimente, ap) Doza infectant: 10-102 bacterii Bacteriile se multiplic n intestin, colonizeaz epiteliul colonului i macrofagele din foliculii limfoizi, penetreaz intracelular (prin macropinocitoz dirijat). Bacteriile se propag intra- i entercelular graie polimerizrii actinei la un pol al celulei (caracter determinat plasmidic). Urmeaz multiplicarea local intracelular cu invazia celulelor vecine provocnd moartea lor. Aceasta duce la inflamaie fibrinoas intens a colonului, micro-abcese i ulceraii, cu apariia mucusului, puroiului i sngelui n materiile fecale. Perioada de incubaie 2 - 4 zile Semne clinice febr, dureri abdominale, tenesme (spasme rectale), scaune lichide mucosanguinolente frecvente. Vindecarea n 2-5 zile (clinic, apoi microbiologic). Forme cronice sau portaj sunt posibile. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL DIZENTERIEI Prelevate: probe de scaun (elementele muco-sanguinolente), apa, alimente, lavaje de pe suprafee Metode de diagnostic 1. Examenul microscopic RIF 2. Examenul bacteriologic: Izolarea culturii pure pe medii DD (Endo, Levin, Ploskirev) sau mbogirea ighelelor n bulion selenit Coloniile L- sunt repicate pe mediile Olkeniki, Kligler pentru acumularea culturii pure i identificare preliminar (lactoza/zaharoza -, glucoza A, ureea -, H2S -) Identificarea definitiv a culturii pure o Caractere morfotinctoriale o Caractere de cultur o Caractere biochimice (teste primare, secundare) o Caractere antigenice (seroidentificarea prin RA pe lam cu seruri imune anti-Shigella polii monovalente) o Fagoidentificarea o Virulena (testul Sereny la cobai) o Antibiograma Analiza rezultatelor i formularea rspunsului 3. Diagnosticul serologic (din a 5-7 zi de boal) 94

RA, RHAI (aduli 1:400 (S.flexneri); 1:200 (S.sonnei); copii 1:100; coproanticorpi (Ig A 1:80) ELISA RIFI Imunitate: specific de tip, 1-2 ani, umoral (IgA) Profilaxie: vaccinuri ribosomale, inactivate, atenuate (imunitate de scurt durat) Tratament: antibiotice (trimetoprim, sulfamide, tetraciclin, ampicilina, etc), eubiotice, bacteriofagi, vaccin inactivat (dizenteria cronic) 103. Salmonelozele. Clasificarea salmonelelor (familie, gen, specii, subspecii). Clasificarea Kauffmann-White dupa structura antigenica. Samonelele tifoparatifoidice. Dinamica titrului de anticorpi in febrele tifoparatifoidice, la purtatori sanatosi si ai anticorpilor anamnestici. Diagnosticul serologic. Reactia de aglutinare Widal. Tehnica efectuarii, citirea si interpretarea rezultatelor. Aplicarea practica a reactiilor RHAI, Vi-RHAI. CLASIFICARE Genul: Salmonella (Daniel Elmer Salmon, veterinar american, care a descoperit bacteria n 1885) Specii: Salmonella enterica, Salmonella bongori Subspecii ale speciei S.enterica: enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houtenae, indica Se cunosc peste 2500 Serovariante, majoritatea tulpinilor izolate din patologii umane (99,5%) aparin ss. S.enterica enterica: S. London, S. Enteritidis, S. Typhi, S. Paratyphi A, S. Paratyphi B, S.Choleraesuis, etc Salmonella enterica subspecia enterica serovar Typhi = Salmonella Typhi CLASIFICAREA KAUFFMANN-WHITE (conform structurii antigenice) Ag O 67 varieti antigenice (O1, O2, O3, ... O65, etc), permite repartizarea salmonelelor in serogrupe (A, B, C, D, E,...Z, O51,...) Fracii antigenice majore desemneaz grupa: O2 A; O4 B, O6 C, O9 D, etc Fracii antigenice minore comune O1, O12, Ag H definete serovariante n cadrul grupei. Structura flagelinei este determinat de 2 gene cromozomiale diferite, care se exprim alternativ (variaie de faz, frecvena 10-4). Ag H faza 1 (specific) Ha; Hb; Hc; Hd; Hg,m Ag H faza 2 (nespecific) H1,2; H1,5; H1,7; Serovar monofazic: O1,2,12:Ha (S.Paratyphi A) Serovar difazic: O1,4,12:HbH1,2 (S.Paratyphi B) Ag Vi (K), termolabil, prezent la S.Typhi, S.Paratyphi C, S.Dublin. Este concentrat la polii bacteriei. S. Typhi O9,12:HdVi+ / O9,12:HdViConform patogenitii pentru gazd se disting: Salmonele monopatogene (umane) (S.Typhi, S.Paratyphi A) Salmonele bipatogene (patogene pentru om i animale, ubicvitare) majoritatea 104. Salmonelozele. Salmonelele tifoparatifoide, clasificarea (familie, gen, specie, subspecii), structura antigenica, factorii de patogenitate. Patogeneza febrelor tifoparatifoide. Prelevatele si metodele de diagnostic in dependenta de perioada de boala. Izolarea, acumularea, identificarea hemoculturii si coproculturii (biochimica, serologica, fagoidentificarea). Profilaxia si tratamentul specific. Caractere de cultur Medii de mbogire : Muller, Kauffmann (medii cu bil, tetrationat), bulion cu selenit de Na Medii DD de izolare a culturii pure: Endo, Levin , Ploskirev (colonii S, lactozo-); mediul cu sulfit de bismut Wilson-Blair (colonii negre) Medii DD de acumulare i difereniere: Olkeniki, Kligler (glucoza AG, lactoza-, H2S+, ureaza-) 95

Teste primare: utilizeaz citratul de Na, produc H2S, MR+, LDC+, mobilitate+, celelalte teste negative. Teste secundare: scindeaz glucidele AG, indol-, ornitindecarboxilaza+, etc EXCEPIE: S.Typhi citrat-, H2S-, scindeaz glucoza pn la acid; S.Paratyphi A H2S+/-, LDCFACTORI DE PATOGENITATE 1. Fimbrii (adeziune) 2. Capacitatea de a penetra n celule i de multiplicare intracelular (Macrofage, celule epitel) 3. Endotoxina 4. Citotoxine (SLT) inhib sinteza proteic (necroz) 5. Enterotoxine (LT, ST) activeaz adenilat/guanilatciclazele membranare (diaree) 6. Siderofori (captarea Fe) 7. Ag Vi (antifagocitar, inhib activarea C, rezisten la activitatea bactericid a serului) Majoritatea salmonelelor (98%) sunt sensibile la bacteriofagul O1. Exist bacteriofagi cu specificitate de specie i variant. Habitat: intestinul omului, animalelor, psrilor. Rezistena n mediul extern: salmonelele rezist la 70C 30 min., rezistente la concentraii mari de sare. Se nmulesc n produse alimentare la temperatura camerei. ROLUL SALMONELELOR N PATOLOGIA UMAN SALMONELOZE: Febre tifo-paratifoide (S.Typhi, S.Paratyphi A, B, C) Salmoneloze digestive (toxi-infecii alimentare, gastro-enterite) Manifestri extra-digestive: bacteriemii nontifoidice infecii pleuro-pulmonare afeciuni osteo-articulare (osteite, osteomielite, artrite septice, etc) infecii cardio-vasculare (pericardite, arterite) infecii urinare infecii abdominale (colecistite, abces al ficatului, splinei) infecii ale SNC (meningite, abces al creierului, abces epidural, etc) FEBRELE TIFO-PARATIFOIDE Agenii cauzali S.Typhi, S.Paratyphi A, B, (C) Sursa de infecie omul bolnav, purttorul Contaminarea fecal-oral (ap, alimente), contact direct Doza infectant 105 bacterii PATOGENEZA a. Traversarea epiteliului intestinal intact b. Invazia i multiplicarea intracelular la nivelul plcilor Peyer i esutului limfoid al tubului digestiv (perioada de incubaie) c. Ptrunderea n ganglionii limfatici mezenterici cu multiplicarea salmonelelor (perioada prodromal) I sptmn de boal (bacteriemie). Invadarea fluxului sangvin, via sistemul limfatic (diseminarea germenilor cu eliberarea endotoxinei). Endotoxina pe cale sangvin parvine la centrii neurovegetativi ai ventriculului 3, determinnd febr, stare de tifos, colaps cardio-vascular, leziuni intestinale. II sptmn de boal (difuzie parenchimatoas) Bacteriile sunt fixate n organele SRE i se multiplic n ficat, splin, mduv osoas, esut limfoid, etc III-IV sptmn de boal (faza alergic). Din ficat salmonelele ptrund n cile biliare, apoi iari n intestin. La nivelul plcilor Peyer se dezvolt o reacie de hipersensibilitate tip 4 - necroz, ulceraii. Din aceast perioad ncepe eliminarea salmonelelor cu saliva, materiile fecale, urina, bila, etc. Manifestri clinice 96

Perioada de incubaie - 1-3 sptmni Perioada prodromal (de invazie) 1-3 zile Perioada de stare. Debut brutal, cu frison, febr 39-41 grade, cefalee, stupoare, somnolen, delir, com. Erupii cutanate (rozeole) apar pe abdomen, torace, spate n ziua a 8-9 de boal (embolii limfatice cu bacterii). Diaree, constipaie, tulburri cardiovasculare. Durata 7-10 zile Complicaii: hemoragii intestinale, perforarea intestinului, peritonit, miocardit, meningit, psihoz etc. Perioada de reconvalescen (1-3-6 luni) Imunitatea celular, umoral 5-10% convalesceni purttori pn la 3 luni (cu depistarea salmonelelor n bil sau/i urin) 3-5% convalesceni (cu litiaz biliar) purttori cronici (1-10 ani toat viaa) Recidive sunt posibile (descrcri bacteriemice din focare profunde, forme L), se caracterizeaz prin simptome atenuate i evoluie de scurt durat DIAGNOSTICUL DE LABORATOR PRELEVATE: snge (perioada febril, n special I sptmn de boal), urin (ncepnd cu a II sptmn), materii fecale (II-III sptmn de boal), exudat din rozeole, ser sangvin (din ziua a 7-ea), bil, mduv osoas METODE DE DIAGNOSTIC Examenul microscopic RIF Identificarea final n baza studiului caracterelor morfotinctoriale, de cultur, biochimice, antigenice (RA pe lam cu seruri imune polivalente ABCDE, seruri monovalente anti-O de grup (O2, O4, O6, O9, etc) , seruri monospecifice anti-H (de variant), seruri anti-Vi, sensibilitatea la bacteriofagi). Rezultatul definitiv negativ n ziua a 11. Rozeolocultura (exudatul din rozeole se ntroduce n 3-5 ml bulion biliat). Mielocultura (0,5 ml mduva osoas din stern n 3-5 ml bulion biliat). Bilicultura (dup 3-6 luni de la vindecare, 5-10 ml bil se ntroduc n BP). Se examineaz ca i hemocultura. Coprocultura (din spt. 2) 3-5 g materii fecale se nsmneaz direct pe medii DD i pe medii de mbogire. Urocultura (10 ml urin se centrifugheaz, sedimentul se examineaz ulterior ca i coprocultura). Serodiagnostic (din II sptmn) RA Widal (la diluii ale serului bolnavului se adaog diagnosticuri OH din S.Typhi, ParatyphiA i B). Titrul diagnostic 1/200 sau creterea n dinamic a titrului RA modificarea Felix (utilizarea separat a diagnosticurilor O i H). Anticorpii anti-O (Ig M) apar primii (ncepnd cu ziua 7-8) i dispar dup 2-3 luni (maximum spt. II-III). Anticorpii anti-H (Ig M, apoi Ig G) apar mai trziu (10-12 zi) i persist o durat mai lung. n debut de reconvalescen (sptmna a IV) titrul Ac anti-O i anti-H se egaleaz. RHAI (cu diagnosticuri eritrocitare O). INVESTIGAREA PURTTORILOR Coproculturi repetate Urocultura Bilicultura Serodiagnostic Reacia de Vi-aglutinare (eritrocite sensibilizate cu Ag Vi). Titrul diagnostic - 1/40 Reacia de latex-aglutinare Determinarea claselor de imunoglobuline Ig M sau Ig G Tratament: Fluorochinolone Cefalosporine de generaia III 97

Cloramfenicol Ampicilin Cotrimoxazol Profilaxia specific: vaccinarea selectiv (zone endemice, militari, personal medical, etc) Vaccinul chimic TABTe Vaccinul atenuat Ty2 (administrare oral, imunitate local sIg A), contraindicat gravidelor, copiilor, imunodeprimailor vaccinul subunitar din Ag Vi (areactogen, imunitate 3-5 ani) 105. Salmonelozele. Salmonelele nontifoidice (bipatogene). Clasificarea (familie, gen, specii, subspecii). Structura antigenica, clasificarea KauffmannWhite. Serovariante mai frecvent izolate. Factorii de patogenitate. Patogeneza salmonelozelor, formele clinice. Diagnosticul microbiologic. Prelevate, izolarea, acumularea, identificarea culturii pure (biochimica, serologica). Diagnosticul serologic. SALMONELOZE DIGESTIVE (gastro-enterite, toxi-infecii alimentare) Consecutive consumului de alimente contaminate cu salmonele (ou, maionez, patiserie cu crem, carne, etc). Agenii cauzali: salmonele bipatogene Gr. B (S. Typhimurium, S. Paratyphi B, S. Heidelberg, S. Derbi) Gr. C (S. Choleraesuis, S. Newport, S. Paratyphi C) Gr. D (S. Enteritidis, S. Dublin) Gr. E (S. Anatum) PATOGENEZA GASTROENTERITELOR Sursa de infecie: animalele domestice i psrile (bolnave sau purttori cronici) Transmiterea pe cale alimentar (alimente contaminate direct de la surs sau pe parcursul procesului tehnologic), prin ap sau contact direct. Doza infectant 106-108 salmonele Salmonelele colonizeaz mucoasa intestinului subire, fiind entero-invazive provoac distrugerea epiteliului (SLT) i o reacie inflamatoare intens (gastroenterit, gastroenterocolit acut). Enterotoxina provoac diaree (activeaz adenilatciclaza sau guanilatciclaza enterocitelor), endotoxina absorbit acioneaz asupra SNC semne de intoxicaie. Gastroenteritele pot fi urmate de bacteriemii. Manifestri clinice: Perioada de incubaie 8 - 48 ore Debut brusc i evoluie acut (1-3 zile) cu diaree, vom, febr, cefalee, stare de ru. Evoluie sever la sugari, btrni, imunodeprimai (n special cu SIDA). TOXIINFECII ALIMENTARE Survin ca urmare a ingestiei unui aliment n care s-au acumulat cantiti mari de mi/o (105 107). Nimerind n intestin, bacteriile ptrund n snge, se distrug, iar endotoxina eliberat provoac semnele clinice de intoxicare. Alte forme de salmoneloze (septicemii, meningite, infecii urinare, etc) se dezvolt la persoane cu rezistena sczut. Diagnosticul de laborator al salmonelozelor Prelevate: mase fecale, mase vomitive, snge, splturi gastrice, urin, resturi de alimente suspecte. Metode de diagnostic: Examenul bacteriologic de baz (coprocultur, hemocultur, urocultur...) RIF pentru diagnostic rapid Serodiagnostic - RHAI Profilaxia salmonelozelor nespecific Tratamentul simptomatic, antibioterapie la necesitate 106. Holera. Clasificarea vibrionilor (familie, gen, sp.). Criteriile de clasificare a V.cholerae n serogrupe, biovariante, serovariante. Factorii de patogenitate ai V.cholerae. Patogeneza holerei. Diagnosticul microbiologic. Prelevate. 98

Principiile metodelor rapide, citirea, interpretarea rezultatelor. Importanta metodei serologice de diagnostic a holerei. Familia: Vibrionaceae Genuri: Vibrio Aeromonas (inf de plag, diaree, septicemii) Plesiomonas (gastroenterite, septicemii, meningite) Photobacterium (saprofit) Enhydrobacter (saprofit) Caractere generale (cheie): bastonae G-, drepte sau ncurbate, mobile (mono sau lophotrichi), reduc nitraii n nitrii, fermenteaz glucidele, oxidaza+, catalaza+ GENUL VIBRIO Bastonae G-, ncurbate, nesporogene, necapsulate, mobile monotriche Clasificarea: Vibrioni halotoleranti - Vibrio cholerae (agenii holerei i diareelor holeriforme) Vibrioni halofili V.parahaemolyticus, V.alginolyticus, V.anguillarum, V.vulnificus, V.metschnikovii (oportunisti, cauzeaz toxiinfecii alimentare, septicemii, meningite, supuraii) Vibrioni free life (saprofii) VIBRIO CHOLERAE Clasificare : Serogrupuri: Vibrio cholerae O1, O2, ... O155 V.cholerae O1 i V.cholerae O139 Bengal (descris in 1992, mutant al Ag O, biovarul El Tor) agenii cauzali ai holerei Biovariante ale V.cholerae O1 : V.cholerae cholerae (clasic) descoperit in 1817 de catre R. Koch, 6 pandemii V.cholerae El Tor izolat in 1905 in Lazaret din El Tor, in 1961 determina pandemia a VII Serovariante ale V.cholerae O1 - Ogawa, Inaba, Hikojima V.cholerae non O1/non O139 (O2, O3,... etc, vibrioni NAG) responsabili de sindrom holeriform, diaree, toxiinfecii alimentare HOLERA Agenii cauzali: V.cholerae O1 (b/v Clasic i El Tor; s/v Ogawa, Inaba, Hikojima), V.cholerae O139 Bengal Caractere de cultur Anaerobi facultativi, temperatura optim de cultivare -- 37 grade. Cresc pe medii simple, dar prefer pH alcalin (8-9) i concentraii de 3% NaCl. Sensibili la pH acid Mediu de mbogire Apa peptonat alcalin 1% (AP) Medii de izolare a culturii pure Geloza alcalin (mediu electiv-selectiv) - GA Mediul TCBS (tiosulfat-citrat-bil-zaharoz) DD i selectiv Manifestarea creterii AP peste 6 ore de incubare vl fin la suprafaa mediului GA peste 12 ore colonii S (R atipice), transparente, cu nuan albstruie TCBS peste 12 ore colonii S, opace, galbene (fermentarea zaharozei) Caractere biochimice: V.cholerae este catalaza+ i oxidaza+, reduce nitraii n nitrii, produce indol, posed gelatinaz i LCD, fermenteaz glucoza pn la acid. Conform activitii glicolitice V.cholerae aparine grupului I Heiberg (fermenteaz zaharoza i manoza, nu fermenteaz arabinoza) Se disting 2 biotipuri (variante) de V.cholerae: clasic (V.cholerae cholerae) i El Tor (V.cholerae El Tor), identice morfologic i antigenic. Diferenierea biovariantelor STRUCTURA ANTIGENIC A VIBRIO CHOLERAE Ag O somatic, LPZ, termostabil (peste 155 serogrupe - O1, O2....O155) Ag O1 este constituit din 3 fracii - A,B,C 3 serovariante V.cholerae: Ogawa (A,B), Inaba (A, C), Hikojima (A; B; C) Ag H, proteic, termolabil, comun pentru V.cholerae 99

FACTORI DE PATOGENITATE Factori de adeziune (pili, Ag O1, glicocalixul) Enzime de patogenitate (mucinaza, neuraminidaza, LDC, lecitinaza) Enterotoxina (toxina holeric, holeragen), constituit dintr-o subunitate A (A1, A2) i 5 subuniti B. Mecanismul de aciune: Subunitile B servesc la fixarea de receptorul gangliozidic GM1 de pe membrana enterocitului, A2 asigur ptrunderea intracelular a fragmentului A1. Acesta activeaz adenilatciclaza membranar, ce duce la creterea concentraiei de AMPc intracelular cu inhibitia absorbtiei bicarbonatului i secreia exagerat a cloridului. Apa i electroliii (Na+ i K+) se acumuleaz n lumenul intestinal. Rezult deshidratare extracelular intens cu hemoconcentraie, oc hipovolemic i acidoz metabolic. PATOGENEZA HOLEREI I MANIFESTRILE CLINICE HOLERA toxiinfecie intestinal acut, strict uman. Agentul cauzal V.cholerae O1/O139 Sursa de infecie bolnav, convalescent, purttor sntos (crustacee acvatice?) Mecanismul de transmitere: 1. fecal-oral 2. contact direct (manual) 3. alimentar (apa, alimente) Doza infectant 109 UFC (104 pentru persoane cu hipoaciditate gastric) Vibrionii care au supravieuit nimeresc n intestinul subire. Local mucinaza descompune mucusul, ce permite adeziunea la enterocit i multiplicarea vibrionilor (colonizarea) cu secreia toxinei. Evoluia clinic a holerei: I - perioada de incubaie (2-5 zile) II enterita holeric (scaune frecvente, abundente, apoase, aspect zeam de orez) III gastro-enterita (scaune frecvente 20 ori pe zi vome abundente. Consecine deshidratare, carene de sruri, acidoz, hipoxie tisular, hipotensiune, contracii (crampe) musculare. IV - Algida holeric (stare extrem de grav, hipotermie, asfixie, colaps, com, deces) Imunitatea umoral (sIgA, IgG), antibacterian i antitoxic, de scurt durat (2 ani), reinfecii sunt posibile 107. Holera. Criteriile de clasificare a V.cholerae (serogrupe, biovariante, serovariante), factorii de patogenitate. Diagnosticul microbiologic. Prelevatele, recoltarea, conservarea. Metoda microscopica. Metoda bacteriologica: mbogairea, izolarea, acumularea, identificarea culturii pure (teste biochimice, biologice, serologice). Etapele, durata examenului bacteriologic. Profilaxia specifica a holerei. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HOLEREI Prelevate: mase vomitive, materii fecale, bil (purttori), de la cadavru 3 fragmente din intestinul subire i vezica biliar, prelevate din mediul extern (apa, alimente) Metode de diagnostic 1. Diagnosticul rapid Studierea mobilitii (preparate native bacterii mobile, ncurbate, grupate n bancuri de peti sau pescrui n zbor Frotiu Gram (bacterii G-, ncurbate) Imobilizarea vibrionilor cu serul anti-O1 Imobilizarea vibrionilor cu bacteriofagi C i ET RIF 2. Examenul bacteriologic (de baz) Prelevatele se nsmneaz n AP I (mbogire) i GA I (TCBS) (izolarea culturii pure) termostat 100

Peste 6 ore se examineaz cultura din AP (vl la suprafa), utilizat pentru diagnosticul rapid, apoi se rensmneaz pe AP II i GA II. Peste 12 ore se examineaz coloniile de pe GA I sau TCBS. Coloniile suspecte (plate i transparente cu nuan albstrie pe GA, galbene pe TCBS) sunt expuse diagnosticului rapid (5 teste), apoi repicate pe mediul cu lactoz i zaharoz pentru acumularea culturii pure i difereniere primar. AP II poate fi utilizat pentru efectuarea testelor rapide si nsmnare pe GA III. Culturile lactoza-/zaharoza+ sunt identificate morfologic, cultural, biochimic, serologic (cu ser O1 polivalent, apoi cu seruri monospecifice Ogawa i Inaba), diferenierea biovariantelor. 3. Depistarea toxinei In vivo (ansa ligaturata la iepure, culturi de celule) In vitro (ELISA, cu utilizarea gangliozidului GM1) Tehnici de biologie moleculara (PCR, etc) 4. Serodiagnostic (retrospectiv) Anticorpii (aglutinine, vibriocine) apar dup 10-15 zile de boal. RA (serul bolnavului + diagnostic din V.cholerae O1 (titrul diagnostic 1/80) RHAI (serul bolnavului + diagnostic eritrocitar) Dozarea antitoxinelor (ELISA, RHAI) Reacia de vibrioliz (serul bolnavului + cultur de vibrioni + complement). Titrul diagnostic 10-4 TRATAMENTUL I PROFILAXIA HOLEREI Tratament Antibiotice (tetraciclin, sulfanilamide, doxiciclina) Rehidratare Tratament simptomatic Profilaxie Igiena individual i colectiv Vaccinarea (vaccin inactivat, vaccin subunitar, holeragen-anatoxin) Imunitatea pn la 6 luni Vaccinul viu este in proces de studiu. VIBRIONII HALOFILI V. parahaemolyticus toxiinfecii alimentare, consecutive utilizrii fructelor de mare, gastroenterite V. vulnificus, V. alginolyticus procese supurative (otite, conjunctivite, infecii de plag, etc) CAMPYLOBACTER CARACTERE MORFOBIOLOGICE Reprezentantii genului Campylobacter sunt bastonase Gram -, incurbate in virgula, in S sau pescarus in zbor, mobili monotrichi. Trei specii de Campylobacter sunt patogene pentru om : C. fetus, C. jejuni, C.coli . Campylobacter au metabolism respirator microaerofil. Pot fi izolate pe medii selective imbogatite cu singe continand numeroase antibiotice (bacitracin[, novobiocina, vancomicina, polimixina, etc) Temperatura optima 37 grade C. Colonii S, plate, cenusii, translucide, 1-2 mm diametru, apar peste 2-4 zile de cultivare. HABITAT Campylobacter se intalnesc in tubul digestiv al animalelor, in special pasari, ovine, porci. Contaminarea omului are loc pe cale digestiva (apa, lapte, carne). PATOGENIE SI FORME CLINICE C. jejuni/coli au o putere enteropatogena importanta, fiind responsabile de enterite. Afecteaza toate varstele, dar mai frecvent copiii, in conditii de igiena precara. Maladia evolueaza benign cu vindecare spontana in cateva zile. C. fetus determina septicemii la persoane fragilizate: cirotici, diabetici, cardiaci, gravide... SENSIBILITATE LA AB Erithromycina este antibioticul de electie in tratamentul campilobacteriozelor digestive. Alte antibiotice: tetraccclina, aminoside, cloramfenicol, ampicilina 101

108. Rickettsiozele. Tifosul exantematic. Agentii cauzali (familie, gen, sp.). Patogeneza infectiei. Diagnosticul microbiologic. Prelevate. Metodele microscopica, biologica. Diagnosticul serologic si diferentierea tifosului exantematic epidemic, endemic, bolii Brill-Zinsser. Profilaxia specifica. CARACTERISTICA GENERAL A RICKETTSIILOR Rickettsiile = bacterii intracelulare obligatorii. Ciclul lor de dezvoltare necesit o gazd vertebrat (om, cine, obolan) i un vector (pduche, purice, cpu, acarian). Reprezint mi/o G- de dimensiuni mici, comparabile cu virusurile mari (500 nm). Totui, reprezint bacterii, deoarece se multiplic prin diviziune binar, posed ADN i ARN, sunt sensibile la antibiotice. CLASIFICARE Familia Rickettsiaceae Genuri: Rickettsia (care include 2 grupuri) Grupul tifos, constituit din R.prowazekii (responsabil de tifosul exantematic epidemic, vector pduchele) i R. typhi (responsabil de tifosul exantematic endemic, murin, vector puricele) Grupul febrelor ptate, transmise prin cpue (R.rickettsii, R.conorii, R.australis, R.akari, R.sibirica, etc) Genul Orientia, cu unica specie O.tsutsugamushi, agentul febrei de lstri Genul Coxiella, unica specie C.burnetii, responsabil de febra Q N.B. Genurile Ehrlichia i Bartonella nu mai aparin familiei Rickettsiaceae. RICKETTSIA Caractere morfotinctoriale: bacterii G-, polimorfe (coco-bacterii, bastonae, forme filamentoase, etc), imobile, asporogene, posed microcapsul. Prin tehnica de colorare Macchiavello-Gimenez (fucsin+verde de malahit) rickettsiile apar colorate n rou pe fondul verde palid al citoplasmei. Coloraia Giemsa roii n citoplasma albastr. Caractere de cultur: fiind parazii intracelulari (nu pot fosforila glucoza i folosesc metabolii intermediari din gazd), rickettsiile nu cresc pe medii artificiale. Ele pot fi cultivate doar pe animale de laborator, vectori, ou embrionat de gin sau culturi de celule. Rickettsiile se multiplic prin diviziune binar n interiorul celulei-gazd. Imediat dup diviziune, n condiii nutritive bune, rickettsiile sunt antrenate n micri rapide i parcurg citoplasma celulei-gazd n toate direciile. Aceste deplasri sunt determinate de polimerizarea filamentelor de actin. Atunci cnd mediul este srac diviziunea se oprete, bacteriile se alungesc, cu apariia formelor filamentoase. Strategii de multiplicare intracelular: Reprezentanii genului Rickettsia vieuiesc liber n citoplasm, graie capacitii de a prsi rapid vacuola de fagocitoz. Coxiella burnetii se multiplica n fagolizosomi cu pH acid. Structura antigenic a rickettsiilor: Ag corpuscular cu specificitate de specie Ag solubil cu specificitate de grup Fracii Ag comune cu tulpina Proteus OX o OX 19 pentru grupul tifos exantematic o OX 2 i OX 19 pentru grupul febrelor ptate o OX K pentru grupul tifos de lstri Factori de patogenitate: Exotoxina Hialuronidaza Hemolizina TIFOSUL EXANTEMATIC 1909 Ch. Nicolle la institutul Pasteur din Tunis descrie transmiterea tifosului epidemic prin intermediul pduchelui (premiul Nobel). 1910 Brill descoper tifosul de recdere, descris dup 20 de ani de Zinsser, de unde denumirea maladiei Brill-Zinsser.

102

1916 Rocha-Lima descoper bacterii fine n corpul unui pduche de la un bolnav de tifos. Aceste mi/o au fost denumite Rickettsia prowazekii (n cinstea lui Von Prowazek i Ricketts, care au murit de tifos studiind maladia). 1928 Mooser separ tifosul murin de tifosul epidemic. Agenii cauzali ai tifosului exantematic: R.prowazekii provoac tifosul exantematic epidemic. R.typhi provoac tifosul endemic, murin. Patogeneza tifosului exantematic epidemic: Sursa de infecie omul bolnav de tifos exantematic sau de boala Brill-Zinsser Vectorul pduchele uman Pduchele se infecteaz de la bolnav n ultimele 2 zile de incubaie, pe parcursul perioadei febrile i 2-3 zile dup normalizarea temperaturi. Rickettsiile se multiplic n celulele epiteliale intestinale ale pduchelui fiind eliminate cu dejectele. Astfel, omul se contamineaz nu prin neptura pduchelui, ci prin leziunile cutanate sau mucoase n care au nimerit dejectele insectei. Infectarea este posibil i prin inhalarea prafului n care se conin rickettsii uscate sau la nimerirea acestui praf pe conjunctiva ochiului. n SUA de la veverie zburtoare prin intermediul ectoparaziilor acestora. Dup inoculare rickettsiile trec n snge, penetreaz n celulele endoteliale ale vaselor sangvine mici, se nmulesc i le distrug. Rickettsiile secret factori procoagulani care determin tromboz cu inflamaie periadventiial a vaselor mici (nodulii Popov-Frankel). Leziunile sunt mai numeroase n tegument, SNC, miocard. Perioada de incubaie 6-23 zile (10-12 zile) Debutul este brusc, cu febr 40-41 grade C, cefalee, insomnie, slbiciuni, excitaie, hiperactivitate nervoas i psihic. Se observ hiperemia feei i faringelui, sclerele sunt injectate. n ziua a 4-6 a maladiei apare o erupie cutanat rozeolo-peteial (pe trunchi, apoi pe membre), nsoit de splenomegalie. Febra dispare peste 2 sptmni. Convalescena este lung i astenia durabil. Dup vindecare nu rmn sechele. Imunitatea anti-rickettsian este mediat celular, anticorpii neutralizeaz efectul toxic al rickettsiilor. ns imunitatea nu elimin obligatoriu toate rickettsiile prezente n organismul convalescentului. Aceste bacterii latente se manifest la persoane n vrst n absena pediculozei, atunci cnd imunitatea scade (boala Brill-Zinsser, tifosul de recdere, tifosul fr pduche). Procesul infecios poate fi reactivat sub influena unor maladii intercurente, a stresului, etc. n timpul maladiei B-Z rickettsiemia este de 10 ori mai rar dect n forma epidemic a tifosului exantematic i dureaz cel mult 5-8 zile. Evoluia este benign, erupia este mai abundent, roz, intoxicaia este redus. La btrni pot surveni complicaii vasculare. Tifosul exantematic endemic: agentul cauzal este R.typhi, sursa de infecie obolanul, iar vectorul puricele. Clinica se aseamn cu cea a tifosului epidemic, dar gravitatea este redus simptome mai puin severe, erupia mai srac. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL TIFOSULUI EXANTEMATIC Diagnosticul direct (examenul microscopic, bacteriologic) se efectueaz n laboratoare specializate. Prelevate: snge, bioptate din esuturile infectate, vectori Examenul microscopic: se examineaz celulele endoteliale circulante n snge sau frotiuriamprente din esutul infectat. Frotiurile se coloreaz Giemsa sau Macchiavello. Rickettsiile apar roii pe fondul albastru (respectiv verde) al citoplasmei celulei-gazd. Poate fi montat RIF. Examenul bacteriologic: prelevatele sunt inoculate la cobai sau oarece, n cavitatea vitelin a oului embrionat de gin sau pe culturi celulare. Tulpina izolat astfel va fi identificat prin RIF, RFC, RAR. Examenul serologic: este bazat pe depistarea Ac din serul bolnavului cu ajutorul Ag din Proteus OX i Ag rickettsiene (de grup sau de specie). Reacii nespecifice: Reacia de aglutinare Weil-Felix, folosete ca Ag suspensii de Proteus OX 19. Se pozitiveaz la sfritul primei sptmni de boal. Titrul aglutininelor atinge valoarea 103

maxim la nceputul convalescenei i scade la valori nesemnificative peste cteva luni dup boal. Valoare diagnostic are creterea titrurilor de cel puin 4 ori pe parcursul bolii. Reacii cu antigene rickettsiene (specifice): 1. RFC, cu Ag rickettsian total. Devine pozitiv la finele primei sptmni de boal, maxim n sptmna 3 sau 4 i persist mai muli ani dup vindecare. Sunt semnificative titruri peste 1:16, cu creterea de cel puin 4 ori n evoluia bolii. 2. RAR (reacia de aglutinare a rickettsiilor). Este foarte sensibil i specific, cu utilizarea Ag corpusculare purificate. Curba aglutininelor evolueaz paralel cu cea a Ac fixatori de complement. Titrul diagnostic - 1:160 i mai mult. 3. RHAI. Hemaglutininele pot fi detectate din ziua a 4 de boal n titruri 1:20 1:40 care cresc n sptmna a 2 atingnd cifrele 1:160-1:320. Titrul diagnostic este de 1:160. Peste 3 luni de la debutul bolii titrul acestor Ac scade pn la valori nesemnificative. 4. RIFI 5. RN a toxinei rickettsiene. Se efectueaz pe oricei. In calitate de toxin se utilizeaz o suspensie de rickettsii vii, care va fi neutralizat cu ser imun n diferite diluii. Identificarea ADNului rickettsian prin PCR Diferenierea dintre tifosul exantematic i boala Brill-Zinsser Pentru boala Brill-Zinsser este caracteristic: 1. Tifos exantematic n anamnez 2. Absena pediculozei 3. Evoluie benign 4. Reacia Weil-Felix negativ 5. Titrul Ac n RFC nu crete n dinamic 6. Ac din clasa Ig G Diferenierea tifosului exantematic epidemic de cel endemic Evoluie benign n tifos endemic Dup titrul Ac n reaciile cu Ag specifice Inocularea intraperitoneal la cobai masculi: R.prowazekii provoac febr, iar R.typhi inflamaie scrotal Tratamentul tifosului exantematic Antibiotice care penetreaz intracelular: Tetracicline (doxiciclina, minociclina) Cloramfenicol Rifampicina, eritromicina, ciprofloxacina Profilaxia tifosului exantematic Msuri antiparazitare: despduchere, deratizare, respectarea igienei Profilaxia specific: exist vaccinuri inactivate (corpusculare i subunitare) preparate din cultur rickettsian izolat n oul embrionat, n pduchi sau n plmnii oriceilor albi. Aceste vaccinuri confer imunitate de scurt durat. Vaccinul viu, preparat din tulpina E de R.prowazekii este mai imunogen, dar are proprieti alergizante. Genul Coxiella reunete bacterii intracelulare G- (coco-bacterii), care se disting de reprezentanii genului Rickettsia prin rezistena la ageni fizici (formeaz spori) i prin structura lor antigenic diferit. Se caracterizeaz prin variaie antigenic (de faz). Faza I este virulent, faza II este atenuat. Specia-tip este C.burnetii, cu repartiie mondial. Provoac febra Q (Query fever). Rezervorul de germeni i sursa de infecie l constituie animalele (roztoare, ovine, caprine, bovine). Cile de transmitere la om: Aerogen (picturi, praf) Alimentar (lapte contaminat) Prin vectori-artropode foarte rar Profesiile expuse riscului: agricultori, veterinari, muncitori la abatoare, mcelari 104

Dup o incubaie de 2-3 sptmni boala debuteaz brutal cu febr iniial n platou, apoi ondulant, cefalee, transpiraii, astenie, semne de bronho-pneumonie, pneumopatie atipic i/sau hepatit. Complicaii endocardita subacut sau cronic cu hemoculturi negative. Diagnosticul de laborator al febrei Q Izolarea bacteriilor din bioptate (ficat, tegument, valve) sau din snge. Se efectueaz inocularea cobailor, a oului embrionat de gin sau a culturilor de celule. Tulpina izolat se identific n RIF Depistarea rapid a C.burnetti n prelevate prin RIF Detectarea genomului cu ajutorul PCR Diagnosticul serologic: 1. RFC cu Ag de faza I i II (existena Ac anti-faza I este utill n diagnosticul endocarditelor); 2. RIFI (permite separarea IgG, IgM i IgA); creterea titrului Ac IgA este specific n endocardite; 3. ELISA. 109. Caracterele morfobiologice ale virusurilor gripale (clasificarea in serogrupuri si serotipuri, morfologia, structura virionului, structura antigenica, variabilitatea genetica). Patogeneza gripei. Diagnosticul de laborator al gripei. Prelevatele, metodele de diagnostic (virusoscopica, virusologica, serologica). Profilaxia si terapia specifica a gripei. FAMILIILE ORTHO- I PARAMYXOVIRIDAE Mixovirusurile reunesc virusuri ARN- cu afinitate pentru mucoproteine (myxo mucus) repartizate n 2 familii: Orthomyxoviridae Paramyxoviridae FAMILIA DIMENSIUNE NUCLEOCAPSIDA Simetrie Diametru GENOMUL SUPERCAPSIDA Spiculi H i N Spiculi F REPLICAREA GENOMULUI Orthomyxoviridae 100 nm Helicoidal 8 nm ARN-, transcriptaz asociat, 8 segmente Separai abseni n nucleu Paramyxoviridae 200 nm Helicoidal 16 nm ARN-, transcriptaz asociat, nesegmentat Asociai prezeni n citoplasm

FAMILIA ORTHOMYXOVIRIDAE Genuri: Influenzavirus A (virusul gripal A) Influenzavirus B (virusul gripal B) Influenzavirus C (virusul gripal C) Thogotovirus (virusurile Dhori i Thogoto) Agenii cauzali ai gripei infecie respiratorie acut cu simptome sistemice importante. Tipul A provoac pandemii periodice (1918 20 mln decesuri, 1957, 1968, 1977) Tipurile A i B epidemii regionale i locale. Anual 3-5 mln cazuri grave, 300 500 mii decesuri 1933 prima cultur de virus gripal uman (Smith, Andrewes i Laidlaw). MORFOLOGIA, COMPOZIIA CHIMIC A VIRUSULUI GRIPAL tipul A Particule rotunde, 80-120 nm, sau filamentoase, constituite din: 1. Genom = 8 segmente de ARN 105

2. Capsida (NC) tubular, de simetrie helicoidal, separat pentru fiecare segment 3. Supercapsida: Dublu strat lipidic extern (origine celular) Strat intern proteic (matrice, prot. virale M1, M2) asigur legtura dintre GP de suprafa i NC; M2-canal ionic 2 tipuri de GP nserate n membran: hemaglutinina - HA (H) i neuraminidaza -NA (N), distincte morfologic i biologic (virusul gripal C doar HA) Hemaglutinina (HA, H) H1 H16 Trimer compus din 2 polipeptide HA1 i HA2 HA1 fixarea specific a virionilor la receptori glicopeptidici membranari (inclusiv de pe hematii), ce conin acid N-acetilneuraminic/acid sialic HA2 fuziunea supercapsidei cu membrana celulei-gazd Anticorpii anti-HA: Inhib fixarea virusului de celula-int Inhib hemaglutinarea Neuraminidaza (NA) N1 N9 Tetramer, polipeptid unic Funcii : Cliveaz legtura dintre acidul sialic i glucidul alturat (tratarea celulelor cu neuraminidaz impiedic infecia celulei cu virus) Asigur detaarea virionilor nmugurii prin eliminarea acidului neuraminic/sialic din receptorii celulari Anticorpii anti-NA limiteaz diseminarea virionilor STRUCTURA ANTIGENIC Ag interne NP i M, specifice de tip A,B,C Ag externe HA i NA, specifice de subtip i de variant 16 variante de HA (H1-H16) i 9 de NA (N1-N9), asociaiile lor formeaz subtipuri de virus A. La om N1, N2 i H1, H2, H3 (H1N1; H2N2; H3N2) VARIAII ANTIGENICE ALE HA I NA Variaii Ag minore drift (mutaii punctiforme, modific civa AA din HA sau/i NA cu aparitia unor varieti de serotipuri, caracteristic pentru tipurile A i B) provoac epidemii fiecare 3-4 ani. Variaii Ag majore shift (recombinaii genetice, schimbarea complet a unui sau ctorva segmente genomice HA, NA, P, M, etc. Determina mutaii importante, aparitia serotipurilor noi) - provoac pandemii. Cultivarea virusului gripal 1. Ou embrionat de gin (cavitatea amniotic i alantoic) 2. Culturi de celule (fibroblati de pui, culturi primare de rinichi de maimu, etc) 3. Reproducerea infeciei la maimue, dihori MULTIPLICAREA VIRUSULUI ATAAREA (adsorbia) HA1+acid neuraminic PENETRAREA endocitoz DECAPSIDAREA fuziunea supercapsidei i membranei vacuolei de endocitoz, NC penetreaz n nucleu prin porii membranei nucleare BIOSINTEZA (eclipsa) Transcrierea ARNm (transcriptaze P1, P2, P3) Translaia ARNm i sinteza proteinelor virale (Ct) Replicarea genomului (ARNv....ARNc....ARNv) ASAMBLAREA n citoplasm: HA i NA se inser n MCt, iar M1 i M2 o cptuesc din interior n nucleu: NP se asociaz cu ARN-, formnd NC, apoi migreaz spre zonele modificate ale MCt (via AG) ELIBERAREA nmugurire NA ajut la desprinderea virionilor de MCt i evit formarea agregatelor. Celula rmne aparent viabil, dar epuizat i moare. Citoliza este determinat de rspunsul imun citotoxic (NK, LTC). 106

PATOGENEZA GRIPEI Virusul gripal A se ntlnete la om i animale: porc, cal, psri, foci, balene, etc. Virusul gripal B om (foci) Virusul gripal C om (cine, porc) Sursa de infecie omul bolnav (animale? Cazuri sporadice de grip aviar la om (H7N1, H9N2, H5N1) 2003/04 n Vietnam, 1997 Hong Kong). Virusul este prezent n rinofaringe n primele 2 zile de la debutul bolii Mecanismul de transmitere aerogen, prin picturi Flugge (tuse, strnut). Virusul se propag n cile respiratorii superioare i inferioare, inducnd o inflamaie a mucoasei i edem al laringelui, traheii i bronhilor. Celulele epiteliale ciliate sunt distruse (fr a afecta celulele bazale). Procesul regenerativ ncepe cu ziua a 5 i repararea complet a epiteliului are loc n 1 lun. Contingent de risc - persoane n vrst, copii, imunodeprimai, bolnavi cu maladii cronice cardiovasculare, respiratorii, insuficien renal, diabet. Forme clinice o Gripa inaparent, asimptomatic o Gripa comun (benign, durata 4-7 zile). Incubaia cteva ore - 2 zile. Debut brutal, cu frison, febr, cefalee, rinoree, tuse, mialgii, artralgii, anorexie, astenie (IFN?). Complicaii (infecii secundare bacteriene): otite, sinusite, bronite, bronhopneumonii, etc. Complicaii rare: sindromul Reye (encefalit acut cu degenerescena ficatului); sindromul Guillain-Barre (poliradiculonevrit). o Gripa malign (pneumonie viral primitiv cu edem pulmonar i IRA) DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL GRIPEI Prelevate: lavaje/aspiraii nazale, traheale, expectoraii bronice (n primele 48 ore) Examenul virusoscopic microscopia electronica, RIF Examenul virusologic 1. Izolarea n oul embrionat de gin de 10-11 zile sau culturi de celule (MDCK). 2. Indicarea virusului activitate hemaglutinant fa de eritrocite de cobai, gin, curcan a lichidului amniotic i alantoic, hemadsorbia lor pe cultura de celule. 3. Identificarea RIF, RIHA, RIHAds, RN Detectarea Ag virale n sedimentul celular (RIF, ELISA) Detectarea genomului viral Serodiagnosticul gripei Retrospectiv, de confirmare. Se examineaz seruri perechi. Se determin creterea titrului de Ac de 4 ori, sau prezena Ac Ig M. Reacii: RFC cu Ag NP (determinarea tipului) RIHA cu sua viral circulant ELISA RN Imunitatea: celular (LTC, NK), umoral (Ig G, Ig A), specific de subtip. TRATAMENTUL GRIPEI Amantadin, rimantadin. mpiedic ptrunderea NC n citoplasma celulei infectate cu virus A. Posibilitate rezistenta tulpini. Zanamivir, oseltamivir. Au structura similar acidului neuraminic. Inhib activitatea NA, mpiedicnd eliberarea virusurilor A i B i diseminarea lor prin mucus, determin agregarea virionilor. Interferon, unguent oxolinic. Tratament simptomatic (antipiretice, antibiotice, etc) PROFILAXIA SPECIFIC A GRIPEI 1. Vaccinuri inactivate: conin 2 tulpini de virus A (H1N1 i H3N2) i o tulpin B, cultivate in ovo i inactivate cu beta-propiolacton. Inoculare i/m, s/c; Ig G persist 5-6 luni. 2. Vaccinuri vii atenuate: tulpinile sunt cultivate in ovo la 25 C, atenuate prin pasaje multiple. Administrare intranazal prin aerozol, imunitate local (Ig A). 107

3. Vaccinuri subunitare: constituite din HA i NA 4. n curs de cercetare vaccinuri vii/subunitare recombinante, vaccinuri polinucleotidice. Situaia curent a infeciei prin virusul gripal nou A(H1N1) La 18 octombrie OMS raporteaz 414 945 de cazuri confirmate de grip de tip nou A(H1N1) i 4999 de decese. Evenimentele derulate prin apariia brusc, rspndirea rapid i transmiterea de la om la om a gripei noi A(H1N1), au impus OMS s ridice faza pandemic la nivelul 6. S-a stabilit c virusul gripal nou A(H1N1) conine gene ale virusului gripal de origine porcin (tulpini americane i euro-asiatice), gene de origine aviar i uman. Oamenii de tiin l-au mai numit reasortant cvadruplu. Sub aspect antigenic virusul gripal de tip nou A(H1N1) mult difer de acel gripal sezonier uman A(H1N1), de aceea vaccinurile antigripale umane sezoniere nu pot acorda protecie contra gripei de tip nou A(H1N1). Epidemiologie Virusul nou A(H1N1) se transmite de la om la om prin aceleai mecanisme ca i virusurile gripale sezoniere. Ele n mod obinuit se transmit de la om la om prin tuse i strnut de la persoanele bolnave cu grip. Uneori oamenii se pot mbolnvi indirect prin atingerea suprafeelor, obiectelor infectate cu virusuri gripale i ulterior atingnd mucoasele oculare, bucale i nazale. Oamenii pot fi contagioi cu o zi naintea apariiei simptomelor gripale i 7 zile de la debutul maladiei. Copiii, n special cei mici, pot fi contagioi mai multe zile. Particularitile tabloului clinic Gripa cu virusul nou A(H1N1), spre deosibire de cea sezonier, se manifest clinic preponderent la persoane tinere, anterior sntoase. Manifestrile clinice sunt asemntoare cu cele din gripa sezonier. Pacienii prezint semne clinice caracteristice, ce includ cel puin dou din urmtoarele simptome: febr, tuse, dureri n faringe, mialgii generale, cefalee (mai des frontal), frisoane, posibil diaree i vom. Frecvena atestrii sindromului dispeptic (11-38%) este mai mare dect n gripa sezonier. Durata bolii n majoritatea cazurilor este de 4-6 zile, cu o maxim de 13 zile. Este posibil dezvoltarea pneumoniilor, care pot evolua cu sfrit letal. Pe lng semnele gripale clasice, frecvent nregistrate, se numr i angina. Totodat, mai muli pacieni, care n-au necesitat spitalizare, n-au avut febr. n cazurile soldate cu deces tabloul clinic s-a prezentat prin febr, slbiciune pronunat, tahicardie, tahipnee, scderea nivelului de saturaie pulmonar cu oxigen, hipotensiune i cianoz tegumentar. n Mexic evoluia clinic s-a remarcat prin pneumonii severe, cu multiple infiltrate i mai rar - cu opaciti bazilare la examinarea radiografic, dup care a urmat sindromul destresei respiratorii acute (SDRA), nsoit de insuficien renal. Miocardita acut a fost suspectat la civa bolnavi. Muli pacieni au fcut stop cardiac peste puin timp dup spitalizare. Durata median ntre apariia primelor semne clinice i deces a fost de 10 zile (ntre 2 i 33 zile). FAMILIA PARAMYXOVIRIDAE SUBFAMILII : PARAMYXOVIRINAE (genurile Paramyxovirus, Rubulavirus, Morbillivirus) PNEUMOVIRINAE (genurile Pneumovirus, Metapneumovirus) CARACTERISTICA GENERAL A PARAMYXOVIRUSURILOR Virusuri nvelite, sferice, uneori filamentoase, 150-400 nm. Genomul ARN- nesegmentat (transcriptaza asociat) Capsida de simetrie helicoidal, constituit din proteina NP. n asociaie cu ARN formeaz NC tubular de 18 nm diametru Supercapsida dublu strat lipidic, proteina intern matrice M, spiculi glicoproteici nserai n membran: HN adeziunea la celula-int F fuziunea supercapsidei cu membrana celular n timpul penetrrii virusului n celul formare de sinciii n culturi de celule Reproducerea are loc n Ct 110. Familia Picornaviridae. Genul Enterovirus. Caracterele morfobiologice ale virusurilor poliomielitice (morfologia, structura virionului, structura antigenica). Patogeneza poliomielitei. Diagnosticul de laborator. Prelevatele 108

(recoltarea, prelucrarea prealabila), metodele de diagnostic (virusologica, serologica). Profilaxia specifica a poliomielitei. FAM. PICORNAVIRIDAE agenti patogeni ai unor imbolnaviri digestive, respiratorii, uneori nervoase, +/- exantem la om si animale (bovine, porcine, simiene) Clasificare: Genul Enterovirus - boli la om Genul Rhinovirus - boli la om Genul Cardiovirus Genul Aphtovirus Genul Enterovirus Clasificare: 68 serotipuri (antigenicitate, imbolnaviri): v. Poliomielitice 1, 2, 3 v. Coxsackie: grup A (23 serotipuri), grup B (6 serotipuri) v. Echo: 32 serotipuri Enterov. (Ev): 68- 71 v. Hepatitei A (Ev 72) Caractere comune Morfologie virioni sferic , 27-30nm, neinveliti capsid : cubica (icosaedric, 60 subunitati (organizate in 12 pentamere); subunitatea are 4 proteine capsidale (VP1, VP2, VP3 in exterior si VP4 in interior) genom: ARN m.c., sens +, are atasat o VPg cu rol de initiere replicare Structura antigenica depinde de epitopii exteriori VP1, VP2 si VP3 induc Ac SN, v.polio VP1 rol in SN Diferente Ag prin: RSN, imunodifuzie - in gel, RFC Reactii incrucisate : v.polio 1 si 2 Actiunea agentilor fizici si chimici: rezista zile la +220C si n sapt. la +40C distruse la +500C; ionii Mg++ rol protector (Mg Cl2 stabilizator vaccin ) conservare indelungata : - 700C UV, deshidratarea: inactivare rapida Incorporarea de coloranti (rosu neutru, acridin orange) le sensibilizeaza la lumina. lipsa invelis: rezistenta la solventi lipidici (eter, cloroform) detergenti rezistente la: lizol, fenol, derivati de amoniu cuaternar sensibile la: formol (0,3%), clor, guanidina Multiplicare: 1. adsorbtia pe receptori dep. de: pH si electroliti; la om: gena de pe cromozom 19 codifica receptor pentru v. polio 2. patrundere: viropexie 3. decapsidare, pierdere VP4 : 4. eliberare ARNv care devine ARNm, tradus la ribozomi 5. sinteza poliproteina gigant, scindare in P1 apoi clivare in VPO, VP3, VP1 si P1 si P3 (clivare in replicaze si proteaze = VPg care initiaza sint. ARN si ARN polimeraza) 6. prod. de ARN progen sens + se face cu ARN polimeraza care sintetiz. catene complementare sens- apoi de sens + , concomitent cu sint. proteine virale 7. asamblarea in reticulul endoplasmatic ciclu infectant: 5-10 ore (particule/celula = 10 5) V. POLIOMIELITIC Poliovirus Clasificare serotipuri: tip 1: Brunhilde 109

tip 2: Lansing tip 3: Leon Relatii virus celula gazda cultivare: culturi primare rinichi maimuta, amnios uman, linii continue: KB, HeLa, Hep2 efect citopatic: rotunjire, crestere refringentei, picnoza, degenerare, desprindere det. plaje circulare, clare, margini nete folosite la clonarea tulpini atenuate animale: cimpanzei, maimute Rhesus, Cinomoglus: inoculare i. medulara, i. cerebrala sau orala: viremie, eliminare v. fecale, paralizii flasce si r.i. umoral Patogeneza clinica manifestare infectie: asimptomatica/imbolnavire minora majoritara afectare sistem nervos, meningita aseptica si/sau poliomielita paralitica severa evolutie: patrundere: orofaringe, transport tesut limfoid (rinof., placi Peyer), multiplicare, diseminare limfatica, viremie tranzitorie cu manifestari clinice minore (respiratorii, digestive). Uneori multiplicare masiva tesut r.e. cu viremie persistenta si invazia sistemului nervos; virus prezent sange inainte debut clinic (+/- paralizii); infectare sanguina a sistemului nervos, diseminare pe axoni, clinic: febra, cefalee, redoarea cefei, paralizii flasce (leziuni neuroni motori coarne ant. maduva = poliomielita paralitica acuta). Posibila invazie a creier, talamus, hipotalamus, nuclei cerebelosi, trunchi cerebral, cortex motor = poliomielita bulbara/encefalita poliomielitica cu evolutii extrem de grave. Lezare nervi cranieni: paralizia faringe, paralizia corzi vocale (perechea X), paralizii oculare (perechea V) leziuni neuronale/extraneuronale: cromatoliza, distructie masiva, neuronofagie; edem, proliferare cel., infiltrat perivacular limfocitar (ggl ., placi Peyer, miocard) factori predispozanti: traume, efort fizic, sarcina, injectii, amigdalectomie incubatie 7-14 zile Imunitate : dupa boala sau vaccinare: rezistenta indelungata de tip RIU: Ac neutralizanti fata de VP1 si VP2 apar inainte debut (multiplicare intestinala si tesut limfoid) Ac circulanti previn diseminarea, nivel maxim 2-6 sapt., persista toata viata Ac FC apar mai tirziu si dureaza mai putin Ac SN si FC trec pasiv la copil = rezistenta 0-6 luni imunodeficienti: fac boala atipica cu afectare s.n. imunitatea locala: IgA impiedica reinfectia la intestin amigdalectomia scade rezistenta locala Epidemiologie: raspindire globala fosta endemica zone calde si epidemica zone remperate eradicare: 2000 sursa de v.: om cu infectie inaparenta transmisie: fecal-orala (direct/indirect: apa, alimente infectate, secretii faringiene); v. prezent in orofaringe n. zile inainte debut eliminare fecale: 3-6 sapt dupa imbolnavire susceptibilitate: generala Profilaxie: vaccin inactivat (Salk): preparat culturi rinichi maimuta, inactivat formol 1. confera imunitate umorala (blocheaza v. la orof) 2. elimina posib de mutante si revertanti 3. utilizabil in zone tropicale 4. utilizare imunodepresati 110

5. necesita rapeluri numeroase vaccin viu atenuat (Sabin): preparat pe diploide umane sau culturi simiene 1. induce i. locala si umorala persistenta (toata viata) 2. blocheaza multiplicarea intestinala 3. administrare orala 4. posiblie reversii si mutante virulente 5. transmitere v. vaccinale la neimunizati 6. paralizii post vaccinale (1 caz/1milion vaccinari) vaccin ADN recombinant (de viitor din polipeptide virale VP1 sau genom viral 111. Familia Picornaviridae. Genul Enterovirus. Caracterele morfobiologice ale virusurilor Coxsackie (morfologia, structura virionului). Clasificarea dupa structura antigenica. Rolul in patologia umana. Diagnosticul de laborator al infectiilor cauzate de virusurile Coxsackie. Prelevatele (recoltarea, prelucrarea prealabila), metodele de diagnostic. Coxsackie virus Relatii virus celula gazda cultivare: culturi de celule: V. Coxsackie B: culturi primare rinichi maimuta, rinichi embrionar, amnios uman V. gr. A: linie continua RD ECP: rotunjire, desprindere animale: V.C grup A inoc. soarece n.n. (i. cerebral, subcutanat, i. peritoneal) polimiozita, edem/necroza musculaturii striate, paralizii flasce; VC grup B: meningoencefalita (encefalomalacie), pancreatita, miocardita, hepatita si necroza tesut adipos Patogeneza clinica patrundere: respiratorie si digestiva, diseminare sanguina cu localizari diverse: herpangina: debut brusc, febra, disfagie (vezicule, papule, zone rosii pe pilieri, palat, amigdale). Evolutie benigna (4-6 zile). Afectare copii. Boala gurii, mainilor si picioarelor: herpangina, exantem maculopapular si veziculos bulos (maini, picioare, fese). Vindecare 7-14 zile Pleurodinia, mialgia epidemica (boala Bornholm): febra, stare generala alterata, durere retrosternala (diafragm), +/- pericardita Miocardita: la nou-nascut (transmitere perinatala), frecvent fatala; adult benigna Menigite aseptice, pancreatite, nefrite, malformatii congenitale (gravide) Imunitate: specifica de serotip: evid. prin RSN, IF, ELISA Ac SN apar la 7 zile, max. 3 saptamini, persista indelungat. Epidemiologie: raspindire globala endemo- epidemic (vara toamna); focare epidemice colectivitati (scoli,crese) sursa: om transmisie: fecal orala; aerosoli susceptibilitate: generala DIAGNOSTIC LABORATOR produse patologice: materii fecale, exsudat faringian, l.c.r., cheag sanguin, lichide veziculare, exsudat conjunctival, probe necroptice (maduva spinarii, perete continut intestinal, muschi toracici, formatiuni nervoase) izolare identificare izolare culturi celulare v Coxsackie B, V.polio, V.Echo : culturi primare rinichi maimuta, diploide umane V.Coxsackie A: lina celulara RD animale: V.Coxsackie A si B: soarece nou-nascut identificare : culturi celulare : SN cu seruri specifice de tip (Polio, Coxsackie B si Echo) animale : SN la v Coxsackie A 111

diagnostic serologic: Det. Ac pe probe duble (0-2/3 sapt) prin: SN, RFC, HAI, ELISA, precipitare in gel, reducerea plajelor diagnostic de certitudine: virus izolat si r.i. serc (crestere de 4 ori a Ac) tablou clinic caracteristic (paralizii) context epidemiologic pentru enteroviroze 112. Familia Picornaviridae. Genul Enterovirus. Caracterele morfobiologice ale virusurilor ECHO (morfologia, structura virionului, structura antigenica). Rolul in patologia umana. Diagnosticul de laborator al infectiilor cauzate de virusurile ECHO. Prelevatele (recoltarea, prelucrarea prealabila), metodele de diagnostic. 113. Virusurile hepatitice. Virusurile hepatitelor A si E. Clasificarea (familie, gen, sp.). Caracterele morfobiologice. Markerii serologici. Patogeneza hepatitelor A si E. Diagnosticul de laborator al hepatitelor A si E. Prelevatele, metodele de diagnostic. Profilaxia specifica. HEPATITE leziuni inflamatoare ale ficatului ORIGINE infecioas, medicamentoas, toxic, autoimun, etc Hepatitele virale leziuni determinate de aciunea citopatic direct a virusului n cauz, sau, mai frecvent, de reacia imun contra celulelor hepatice infectate. VIRUSURILE HEPATITICE Virusuri dominant hepatotrope 1. Virusul hepatitei A HAV- (fam. Picornaviridae) 2. Virusul hepatitei B HBV- (fam. Hepadnaviridae) 3. Virusul hepatitei C HCV- (fam. Flaviviridae) 4. Virusul hepatitei D HDV - (neclasificat) 5. Virusul hepatitei E HEV - (fam. Hepeviridae) 6. Virusul hepatitei G HGV? 7. Virusurile TT (Circovirus ?) 8. Virusuri ce afecteaz ficatul ocazional: Coxsackie, virusul citomegalic (CMV), virusul Epstein-Barr (EBV), virusul herpes simplex (HSV), .a. MANIFESTRI CLINICO-BIOLOGICE ALE HEPATITELOR Incubaia variabil (15 zile 6 luni) Gravitatea hepatitele A i E au evoluie benign, hepatitele B, C, D acute i cronice, complicaii grave Forma clinic clasic febr, artralgii, astenie, erupii, dereglri digestive, urmate de icter (3 sptmni), asociat cu anorexie, oligurie, decolorarea maselor fecale, bilirubinurie. Forme anicterice, asimptomatice (80-90% cazuri) Hepatita fulminant foarte grav Hepatita cronic persistent i cronic activ (cu citoliz) Complicaii ciroz, cancer primitiv al ficatului Manifestri extrahepatice, determinate de complexe imune circulante periarterit nodoas, poliartrit, glomerulonefrit, poliradiculonevrite, etc. RM - ar endemic prin hepatitele B i C. Indicele de prevalen a HBV este de peste 8%, iar al HCV de 5%. VIRUSUL HEPATITEI A Familia Picornaviridae Genul Hepatovirus Specie Virusul hepatitei A (HAV) Dimensiuni 28-30 nm Genom ARN+, liniar Capsid icosaedric, 60 capsomeri, compui fiecare din 4 polipeptide VP1, VP2, VP3, VP4 Rezisten: total la 600C 1 or, parial - 12 ore, rezist la % de clor uzuale. Inactivat de formol, beta-propiolacton, UV, hipoclorit de sodiu. HAV a fost depistat n 1973 prin IME 112

Primul vaccin 1992 Se cunosc 7 genotipuri (om, maimue) Cultivarea : Marmozete, cimpanzei Celule de hepatocarcinom uman Celule diploide umane Celule din rinichi de maimu Receptorul celular mucina (GP membranar) ECP nu provoac PATOGENEZA HEPATITEI A Surs i rezervor de infecie omul bolnav Mecanismul de transmitere fecal-oral (mini murdare, alimentele, apa contaminate); cazuistic transfuzional HAV se multiplic n esutul limfoid intestinal i citoplasma hepatocitelor. Se elimin cu masele fecale dup 2 sptmni de la infectare, diminueaz odat cu apariia semnelor clinice. Viremia 1-2 sptmni. Hepatocitoliza este determinat de LT CD8, NK. Incubaia 30 zile (15 50 zile) Forme clinice forme asimptomatice (90%), forme benigne (1-2 spt.), rareori forme grave, fulminante. Lipsa cronicizrii! Markerii virali n cursul maladiei: HAV (Ag viral) (mase fecale, snge) n ultimele 2 sptmni de incubaie i cteva zile de la apariia icterului IgM anti-HAV depistate de la debutul fazei icterice, titru maxim peste o sptmn i dispar dup 8-12 sptmni. IgG anti-HAV persist toat viaa. ARN viral (n mase fecale, snge, hepatocite). VIRUSUL HEPATITEI VIRALE E (HEV) HEV depistat n 1983 prin ME Familia Hepeviridae Genul - Hepevirus Structura HEV Dimensiuni 27 30 nm Genom ARN+ (descris n 1990) Capsid icosaedric (protein unic glicozilat) HEV se repartizeaz n 3 grupe genomice: I asiatic, II mexican, III nord-american (include i tulpini porcine) Patogeneza Sursa de infecie omul bolnav Mecanismul de transmitere fecal-oral (ap, alimente), posibil parenteral (la hemofili, persoane cu transfuzii, hemodializ) Perioada de incubaie 30 zile Clinica hepatit acut, asemntoare cu hepatita A. Forme grave la femei gravide, n special n trimestrul III al sarcinii (20-40% mortal). Risc de avort i natere prematur (12 30% cazuri) Markerii HEV: Virusul (Ag viral) prezent n mase fecale n faza acut (ME) IgM (3 luni de la debut) i IgG anti-HEV Genomul viral n mase fecale, hepatocite 114. Virusurile hepatitice. Virusul hepatitei B. Clasificarea (familie, gen, sp.). Caracterele morfobiologice. Markerii serologici. Patogeneza hepatitei B, consecintele. Diagnosticul de laborator al hepatitei B. Prelevatele, metodele de diagnostic. Profilaxia specifica. 113

VIRUSUL HEPATITEI VIRALE B (HBV) Ag Australia a fost detectat n 1964 de Blumberg, actualmente numit Ag HBs HBV virus ADN, ciclul de replicare comport o etap de transcripie invers Extrem de contagios i prezent n titruri mari n lichide biologice. Provoac hepatite acute, chiar fulminante, hepatite cronice, ciroz, hepatocarcinom. Peste 350 mln persoane infectate n lume. Peste 1,5 mln decesuri anual. Clasificare Familia Hepadnaviridae Genul Orthohepadnavirus Specia Virusul hepatitei B (HBV) Morfologia Particule sferice de 42 nm (particulele Dane), infecioase virionul complet (109 part/ml) Particule sferice, lipsite de acid nucleic, de 22 nm, neinfectioase Structuri tubulare, 200-700 nm lungime, neinfectioase Structura HBV (particula Dane) Genomul: ADN circular bicatenar parial (2/3). Posed catena lung L(-) i catena scurt S(+). Se disting 8 genotipuri (A H). Nucleocapsida (NC, core) icosaedric, comport Ag HBc, asociat cu Ag HBe (solubil). n NC se afl i ADN-polimeraza i timidin kinaza. Supercapsida dublu strat lipidic asociat cu proteine virale (Ag HBs). Un receptor pentru albumin din supercapsid intervine la etapa de penetrare a virusului. Rezistena : HBV este rezistent la aciunea eterului, la desicare i cldur. HBV i pstreaz infeciozitatea mai muli ani la -20 grade, cteva luni la +30 grade, cteva ore la +60 grade. Este distrus la fierbere i cu hipoclorit de sodiu. Animale experimentale maimue cimpanzei. Structura antigenic a HBV (markeri epidemiologici) Ag HBs, de suprafa. Posed determinani de grup (a) i de tip (d/y i w/r). Serotipuri ale Ag HBs : ayw, ayr, adw, adr, etc. Anticorpii anti-HBs au rol protector. Ag HBc, din NC, nu este detectabil n ser, doar n nucleul hepatocitelor infectate. Ag HBe, solubil, component al NC. Prezent n ser i martor de infeciozitate (replicare viral). ADN polimeraza Timidin kinaza Ag suscit sinteza Ac anti-HBs, anti-HBc, anti-HBe, anti-ADN polimeraz. Multiplicarea HBV Virusul penetreaz n hepatocit debarasat de supercapsid datorit receptorului su pentru albumin. Dup decapsidare ADN este completat de polimeraza viral, devenind bicatenar. ADN-ul viral ptrunde n nucleul celulei. ARN polimeraza gazdei transcrie catena ADN L(-) n ARN-pregenomic (+) i ARNm. n citoplasm are loc translarea ARNm i sinteza proteinelor virale. ARN-pregenomic (+) este ncorporat n capsid i ADN polimeraza viral sintetizeaz catena L (-) activitate de reverstranscriptaz. Pe matricea catenei L (-) este sintetizat catena S (+). Polimeraza manifest activitate de RNaz H i degradeaz ARN-pregenomic. NC capt supercapsida la nivelul MCt i virionul nou format este eliberat prin nmugurire (particulele Dane, infecioase). Proteinele externe (HBs) sunt produse n exces i se asambleaz n ser n particule sferice sau tubulare, neinfecioase. HBV nu este citolitic. Hepatocitoliza este determinat de rspunsul imun al gazdei. Hepatocitele infectate prezint pe suprafaa lor antigene virale, ce stimuleaz un rspuns imun. Limfocitele T CD8 i celulele NK atac i distrug celulele bolnave, iar anticorpii specifici neutralizeaz virusul circulant. 114

DE REINUT !!! 1. ADN viral dublu catenar este extrem de stabil, poate persista sub form de plasmid n hepatocit, fiind la originea portajului cronic i fenomenelor de reactivare. 2. ADN viral se poate integra n cromozomul hepatocitelor (aciune oncogen posibil). 3. Implicarea transcriptazei inverse se afl la originea unei rate de mutaii crescute (rezisten la chimioterapice, eec n cursul seroterapiei sau vaccinare, mutante fr Ag HBe). Patogeneza hepatitei virale B Sursa de infecie omul. HBV este prezent n sngele bolnavului, secreii genitale i sperm, saliv, lapte, urin, lacrimi. Cile de transmitere a HBV: 1. Parenteral prin snge i derivate (transfuzii, tratament cu produse sangvine, activitate profesional, injecii cu seringi contaminate -toxicomani, tatuaj, piercing, acupunctur). 2. Sexual (homo-/hetero-). 3. Vertical de la mam la copil (la natere sau n perioada neonatal). 4. Transmiterea direct (contact, srut) nu este exclus. 5. Riscul infeciei prin injecie 20-30% 6. Contagiozitate sangvin extrem de 10 ori superioar infeciei cu HCV i de 100 ori HIV. Perioada de incubaie - 30180 zile (10 sptm) Perioada de stare simptomatic la 20-30% pacieni (forme anicterice 70-80%) Vindecare 90% Hepatita viral B poate evolua spre cronicizare (10% la persoane imunocompetente). Hepatita fulminant 0,1 - 1% Ciroza hepatic sau cancer 20% CINETICA MARKERILOR Hepatita acut o Ag HBs este primul marker depistat n ser dup 1-3 luni de la contagiu, persist 1-2 luni i dispare peste cteva sptmni dup normalizarea transaminazelor. Persist la purttorii cronici. o Ag HBe apare imediat dup HBs, marker de replicare viral, dispare naintea Ag HBs. o Ac anti-HBc (IgM) apar peste 2-4 spt dup Ag HBs. o Ac anti-HBe apar dup ncetarea replicrii virale, odata cu dispariia Ag HBe. Marker de pronostic favorabil. o Ac anti-HBs apar peste 2-3 sptmni dup dispariia Ag HBs (fereastr imunologic). Neutralizani. Markeri ai vindecrii. Lipsesc la purttorii cronici. Evoluie favorabil: dispariia Ag HBs i Ag HBe, apariia succesiv a Ac anti-HBc, anti-HBe i anti-HBs. Hepatita fulminant prezena constant a IgM anti-HBc n titru nalt. Hepatite cronice (evoluie peste 6 luni). Hepatit cronic activ (persistena Ag HBs, Ag HBe i Ac anti-HBc - IgG). Hepatit cronic persistent (Ag HBs, Ac anti-HBe, anti-HBc) - purttor cronic de Ag HBs. (Reactivri sunt posibile, supraveghere necesar). 115. Virusurile hepatitice. Virusul hepatitei C. Clasificarea (familie, gen, sp.). Caracterele morfobiologice. Markerii serologici. Patogeneza hepatitei C, consecintele. Diagnosticul de laborator al hepatitei C. Prelevatele, metodele de diagnostic. Profilaxia specifica. VIRUSUL HEPATITEI C Identificat n 1989. n prezent 180-200 mln infectai. Familia Flaviviridae Genul Hepacivirus Dimensiuni 55-65 nm Genom ARN+, liniar. Heterogenitate genetic - se disting 6 (11 ?) genotipuri i numeroase subgenotipuri. HCV circul sub forma de un amestec complex i instabil de populaii virale 115

genetic distincte. n Europa predomin genotipul 1, care este mai puin sensibil la tratamentul cu IFN. Capsida icosaedric, protein unic. Supercapsida derivat din membrana reticulului endoplasmatic, cu 2 glicoproteine virale E1 i E2. Replicarea HCV are loc in citoplasma hepatocitelor i a celulelor mononucleate din snge Markeri epidemiologici Ag HCV, Ac anti-HCV, ARN viral Transmitere: 1. Prin transfuzii, transplant de esut i organe 2. Droguri administrate i/v 3. Nozocomial (n mediu medico-chirurgical, stomatologie, piercing, tatuaj, acupunctur) 4. Vertical 5. Sexual 6. Intrafamilial (foarfece, peptene, aparat de ras, etc) Incubaia 4 12 sptmni Hepatita C acut: 70-90% - asimptomatic, activitatea seric a transaminazelor (n special ALAT) este moderat crescut i tranzitorie, uneori oscilant. Se poate vindeca spontan n 20 % cazuri, fr a conferi imunitate complet. Hepatita C fulminant co-infecie cu HBV sau HAV. Hepatita C cronic (80% cazuri) persistena HCV peste 6 luni de la infecia acut. Cretere cronic a activitii ALAT, care este moderat i fluctuant. Co-infecia cu HIV factor stimulator. Complicaii ciroz (20% cazuri), cancer. 116. Virusurile hepatitice. Virusul hepatitei D. Clasificarea (familie, gen, sp.). Caracterele morfobiologice. Markerii serologici. Patogeneza hepatitei D, superinfectie si coinfectie. Diagnosticul de laborator al hepatitei D. Prelevatele, metodele de diagnostic. Profilaxia specifica. VIRUSUL HEPATITEI D Agent viral defectiv, satelit al HBV, 36-37 nm. Descoperit n 1977. Genul Deltavirus Genom ARN-, circular (3 genotipuri) Capsida sferic, 2 proteine, Ag Delta Supercapsid derivat din HBV, cu 3 forme de Ag HBs Se replic n nucleu, independent de HBV, dar care i asigur supercapsida cu Ag HBs. Manifest efect citopatic direct sau via rspunsul imun celular. Markerii HDV Ag HDV, Ac anti-HDV, ARN viral (asociai cu markeri ai HBV). Patogeneza hepatitei D Mecanismele i cile de transmitere identice cu HBV. Infecia Delta se poate manifesta n acelai timp cu hepatita B (co-infecie, evoluie acut, risc de forme fulminante) sau survine la un purttor cronic (suprainfecie, risc de hepatit cronic activ cu evoluie rapid n ciroz, forme fulminante sunt posibile). Virusul hepatitei virale G (HGV, GBV-C) Descoperit concomitent de ctre 2 echipe de cercettori, manifest analogie genomic cu HCV. Transmiterea parenteral este predominant. Exist portaj cronic (2 30 %) fr anomalie hepatic. Formele acute sunt rare, asociate cu alte hepatite virale. Clinic se aseamn cu hepatita viral C. Virusul TT (TTV) Virus ADN simplu, apropiat de Circovirus. Se transmite prin snge, fecal-oral i vertical. Este foarte rspndit n rndul populaiei 2-12% din donatori sunt purttori de virus (20-60 % la hemofili, toxicomani, hemodializai). Se identific la 40-50 % de bolnavi cu hepatit nonA-nonG. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE Diagnostic paraclinic: dozarea transaminazelor, bilirubinei, raportul albumine/globuline. 116

Trombopenie, leucocitoz, diminuarea protrombinei factori de alert. Diagnostic etiologic Detectarea virionilor (ME, IME) sau Ag virale (ELISA, RIF) n bioptate hepatice sau snge. Detectarea AN virali ntrahepatic sau n snge (hibridare, PCR). Evidenierea anticorpilor antivirali n serul sangvin prin tehnici ELISA, ARI, imunoblot, RIFI Diagnosticul hepatitei A Evidenierea Ig M anti-HAV (Ig G imunitate) Diagnosticul hepatitei B Depistarea Ag HBs, Ag HBe, Ac anti-HBc, anti-HBs, anti-HBe, anti-polimeraz n ser; Ag HBc n hepatocit) Diagnosticul hepatitei C Depistarea Ac anti-HCV (80% peste 15 spt de la expoziie, 95% - 5 luni, 97% - 6 luni ) Diagnosticul hepatitei D Evidenierea Ac anti-HDV PROFILAXIA HEPATITELOR VIRALE 1. Control eficace al donatorilor de snge, esuturi, organe, sperm, prevenirea MST i nozocomiale, utilizarea materialelor de uzaj unic, ameliorarea condiiilor sanitare, etc. 2. Imunizarea activ Anti-hepatita A vaccin inactivat (10-20 ani). Anti-hepatita B (vaccin recombinant Ag HBs). Vaccin anti-hepatita D i E n curs de studiu. 3. Imunizarea pasiv Imunoglobuline specifice anti- HAV, anti-HBV, anti-HEV. Tratament specific al hepatitelor A i E nu exist. Tratamentul specific al hepatitei B Interferon alfa Vidarabin, lamivudin, entecavir, telbivudin, adefovir (!!! Selecia tulpinilor rezistente) Imunoterapie Tratamentul specific al hepatitei C Interferon alfa Ribavirin Imunoterapie 117. Infectia HIV-SIDA. Virusul HIV. Clasificarea (familie, gen, variante). Structura virionului. Markerii serologici. Celulele tinta si rezervorul celular. Patogeneza infectiei HIV. SIDA. Diagnosticul de laborator al infectiei HIV-SIDA (reste directe si indirecte de depistare, teste de confirmare, diagnosticul serologic). Terapia specifica. FAMILIA RETROVIRIDAE. VIRUSUL HIV I INFECIA HIV/SIDA Prima descriere clinic a SIDA 1981 1983HIV a fost identificat la Paris, ins. Pasteur 1986 - propus denumirea HIV (Human Immunodeficiency Virus) 1986 a fost izolat HIV-2, Africa de Vest n prezent 40 mln persoane infectate cu HIV Zilnic se infecteaz 5-6 mii persoane Retroviridae familie numeroas de virusuri ARN dotate cu o enzim numit reverstranscriptaz: ARN ADNd.c CLASIFICAREA FAM. RETROVIRIDAE Subfamilia Orthoretrovirinae Genurile: Alpharetrovirus, Betaretrovirus, Gammaretrovirus, Deltaretrovirus, Epsilonretrovirus (induc tumori i leucemii), Lentivirus (virusul HIV) Subfamilia Spumaretrovirinae Genul: Spumavirus (nepatogeni) CARACTERE MORFOSTRUCTURALE GENERALE ALE FAMILIEI RETROVIRIDAE Dimensiuni 80-130 nm 117

Form sferic Genom dou molecule de ARN+, capacitate de integrare n nucleu sub form de ADN proviral Enzima reverstranscriptaza Capsid icosaedric Supercapsid derivat din MCP, lipidic cu GP virale nserate Ciclul replicativ este identic. VIRUSUL HIV. STRUCTURA I ORGANIZAREA GENOMULUI HIV-1 i HIV-2 responsabili de Sindromului Imuno-Deficienei Achiziionate (SIDA) HIV-1 repartiie mondial HIV-2 limitat la Africa de Vest Structura virusului HIV-1 / HIV-2 Genomul: diploid 2 molecule de ARN+ identice, nu sunt utilizate n calitate de ARNm Enzime: reverstranscriptaza (RT), integraza, proteaza Capsida: n form de trunchi de con, constituit din 2 proteine p24/26 CA (intern, major) i p7,9 NC (a nucleocapsidei, asociat ARN) Supercapsida: dublu strat lipidic de origine celular n care sunt nserate 2 GP virale Gp120/125, de suprafa, asigur fixarea virusului la receptorul celular CD4. Regiunea V3 este responsabil de ataare i induce anticorpi neutralizani specifici Gp41/36, transmembranar, legat de gp120, responsabil de fuziunea supercapsidei cu membrana celular Proteina p17/16, matrice, cptuete stratul intern al SC, asociat cu proteaza Genomul, proteinele interne (p24, p7, p17) i enzimele constituie nucleoidul (core) viral. Structura genomului (apr. 10 mii nucleotide) Gena gag (group antisens) prot. structurale interne (p24 i p17) Gena pol (polimerase) 3 enzime: RT (p66), integraza (p31), proteaza (p9) Gena env (enveloppe) o prot. precursor gp160, clivat ulterior n gp41 i gp120 Gene regulatoare tat, rev, nef, vif, vpr i vpu (HIV-1) sau vpx (HIV-2) Omologia dintre HIV-1 i HIV-2 este de 42%, mai nalt la nivelul genelor gag i pol (peste 50%) i redus la nivelul genelor env (39%). Se disting 3 grupe genomice ale HIV-1: M, O i N. Grupul M (major) comport 10 subtipuri (A-H, J i K), repartizate geografic neuniform (majoritatea n Africa, B Europa occidental si America de Nord, F Romnia, G Rusia, etc). Structura antigenic toate proteinele i glicoproteinele virale sunt imunogene. Rezistena HIV HIV este sensibil la solveni lipidici i detergeni, la 56 grade C este inactivat n 30 min, n 5 minute - 0,2 % hipoclorit de Na, 70% etanol, 0,2% glutaraldehid. Labil la pH-uri extreme, radiaii UV i RX Cultivarea o Celule mononucleate de la persoane sntoase o Linii celulare din LT MT2 o Animale sensibile maimuele cimpanzei (HIV-1), Rhesus (HIV-2) CICLUL DE REPLICARE Ataarea HIV la celula-gazd prin legarea gp120 la receptorul celular CD4. Rezult o modificare conformaional a gp120, ce permite buclei V3 a acestei gp s se fixeze de coreceptori de pe suprafaa celulei: CCR5 i CXCR4, CCR3, CCR2b .a. Penetrarea NC prin fuziunea supercapsidei (gp41) cu MCt. Decapsidarea i eliberarea ARN viral asociat cu RT. Retrotranscrierea ARN+ n ADN- (RT). RT degradeaz ARN+, apoi transcrie ADN- n ADNd.c., care va fi circularizat, apoi integrat (integraza) n cromozomul celular, constituind provirusul. Transcrierea ADNv n ARNm prin intermediul ARN-polimerazei II celulare. Sinteza proteinelor virale sub controlul factorilor celulari i proteinelor reglatoare. Poliproteina gag/pol 160 kd (p17 MA, p24 CA, p7 NC, p10 (proteaza), p66 (RT), p31 (integraza) Poliproteina env 160 kd (gp41 i gp120) Transcrierea ARN viral (ARN+) 118

Asamblarea NC Eliberarea prin nmugurire la nivelul MCt modificat prin inserarea gp virale: 10 mlrd de virioni/zi/o persoan infectat. Variabilitatea HIV este determinat de erorile comise de RT (o eroare la fiecare 10 mii baze). Mutaiile survin n special la nivelul genei env (bucla V3 din gp120, care intervine n fixarea HIV de coreceptori, reprezint epitopul major de neutralizare). Nu exist 2 sue virale identice. La bolnav este prezent o populaie viral polimorf, cu genomuri diferite. Consecine: dificultatea de a obine vaccin eficient selecia mutantelor rezistente la antiretrovirale CELULELE-INT I REZERVORUL CELULAR Limfocite TCD4+ (Th) (99% de replicare, ECP-sinciii) CPA: monocite/macrofage tisulare (replicare slab, ECP minim), celulele dendritice (prezente n timus, tegument, mucoase, organe limfoide, SNC i snge perif.). Ele au rol de vector i rezervor de virus (adsorb HIV la suprafaa lor i il transport n organele limfoide, unde el se replic n celulele CD4+). Se disting sue cu tropism macrofagic (M, sau R5), utilizeaz coreceptorul CCR5, i sue cu tropism limfocitar (T, sau X4), coreceptorul CXCR4. Limfocitele T pot fi infectate cu ambele sue (prezint ambii receptori). n primo-infecie sue R5, n stadiu de SIDA sue X4. Mecanismele de distrugere a limfocitelor T CD4: 1. Liza direct a celulelor infectate (ECP). 2. Limfocitele T CD8 pot distruge limfocitele T CD4 infectate. 3. Apoptoz n urma stimulrii antigenice a celulelor care au fost n contact cu Ag HIV. 4. Limfocitele infectate, acoperite cu gp120 pot provoca fixarea, fuziunea i moartea limfocitelor neinfectate. 5. Hiperstimulare celular cu dezvoltarea anergiei celulare. PATOGENEZA I CLINICA INFECIEI CU HIV Transmiterea: Cale sexual (hetero-/homo-). Cale sangvin (toxicomani, hemofili, transfuzii de snge sau transplante de organe, manopere medicale penetrante-injecii, acupunctur, tatuaj, pearcing). Cale vertical (in utero n ultimele sptmni de sarcin, n timpul naterii sau n timpul alptrii). EVOLUIA MALADIEI Primo-infecia (peste 20 zile dup contaminare). Durata 2-4 sptmni. Are loc: 1. multiplicarea intens i diseminarea virusului, 2. scderea numrului de limfocite T CD4, 3. creterea numrului limfocitelor CD8. Diminuarea arjei virale este determinat de rspunsul imun specific celular i umoral (Ac antigp120, gp41, p24). Evoluia poate fi asimptomatic sau simptomatic (50%): adenopatie cervical, febr, faringit, oboseal, mialgii, erupii cutanate. Faza asimptomatic, de laten clinic (durata aproximativ 10 ani). Virusul se replic n organele limfoide, numrul LT CD4 diminueaz lent sau rmne stabil. Apar variante noi de virus care se multiplic, SI le recunoate i reacioneaz specific, ciclul se repet de multiple ori. Aceasta duce la diminuarea progresiv a LT CD4 i epuizarea SI, urmat de multiplicarea necontrolat a HIV i dispariia complet a limf. T CD4. Faza clinic (SIDA) incubaia 8-10 ani Numrul LT CD4 500-200 celule/ml. Se manifest clinic prin febr cronic, pierdere n greutate, diaree, afeciuni ale tuturor organelor i sistemelor, infecii oportuniste, tumori (sarcomul Kaposi, limfome). Parazii: Toxoplasma, Histoplasma, Leishmania Bacterii: Mycobacterium, Salmonella, etc Fungi: Pneumocystis carinii, Cryptococcus neoformans, Cryptosporidium, Candida, etc Virusuri: HSV, HZV, CMV. 5-10% de infectai sunt asimptomatici de lung durat. arj viral redus. 119

Numrul LT CD4 stabil (peste 500/ml). Rspuns imun celular i umoral constant. Absena semnelor clinice. Rspunsul imun: Umoral Ac anti-gp120 mpiedic fixarea HIV. Celular LT CD8 recunosc i distrug celulele infectate (n special LT CD4, Th). DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECIEI HIV/SIDA Teste indirecte de depistare Teste ELISA de depistare a Ac (dup 22 zile de la contagiu) Teste combinate Ag - Ac (detectarea Ag p24 i Ac anti-p24 prin tehnici ELISA) Teste rapide (RA cu particule de gelatin sensibilizate) Teste de confirmare (n caz de reacie pozitiv). Tehnica de referin Western-blot (separarea el-for. a proteinelor virale, transferarea lor pe o band de nitroceluloz, tratarea cu serul cercetat, apoi efectuarea RIE). Pot fi detectai Ac contra tuturor Ag. Criterii de apreciere: un ser este considerat pozitiv dac sunt prezeni Ac contra cel puin 2 Ag de suprafa (gp160, gp120, gp41), asociai cu Ac contra cel puin o protein intern (p24, p17 sau a enzimelor) Teste directe Detectarea Ag p24 (marker direct al infeciei HIV) prin tehnici ELISA. Poate fi detectat n primoinfecie pn la seroconversie, apoi dispare i reapare n momentul evoluiei spre SIDA. Detectarea ARN-lui plasmatic sau ADNv prin teste de amplificare genic. Prezena ARNv n ser denot replicarea constant a virusului. Determinarea arjei virale este utilizat pentru monitorizarea unui pacient infectat. Izolarea HIV n cultur Se realizeaz prin inocularea cu plasm sau celule mononucleate de la bolnav a unei culturi de celule mononucleate de la donatori sntoi. Replicarea este detectat prin evidenierea Ag p24, RT sau a ARNv. Diagnosticul primo-infeciei (markerii virali) 1. ARNv plasmatic (apare dup 8-17 zile de la contagiu) 2. Ag p24 n ser (pn la apariia Ac anti-p24) 3. Ac anti-HIV (dup 3 sptmni de la contagiu) 4. Monitorizarea virologic a seropozitivilor 5. Parametrii imuno-hematologici (formula sangvin, determinarea subpopulaiilor de LT (valori absolute, raport T CD4/T CD8), dozarea Ig, microglobulinei beta2) 6. Markerii virali (arja viral plasmatic (ARNv), Ag p24, Ac anti-p24) CHIMIOTERAPIA ANTIRETROVIRAL Dup mecanismul de aciune: Inhibitori nucleozidici i nucleotidici ai RT (Abacavir, Didanosin, Lamivudin, Stavudin, Zalcitabin, Zidovudin, Tenofovir) Inhibitori nenucleozidici ai RT (Delavirdin, Efavirenz, Nevirapin) Inhibitori ai proteazelor (Amprenavir, Indinavir, Lopinavir, Nelfinavir, Ritonavir, Sanquinavir Inhibitorii adeziunii i penetrrii n curs de evaluare (CD4, T20) Inhibitor al asamblrii i eliberrii - Interferonul alfa Tratamentul este indicat tuturor bolnavilor de SIDA i persoanelor cu numrul LT CD4+ mai mic de 350/ml. Este indicat asocierea a 3 chimioterapice: 2 INRT + 1 IP; 2 INRT + 1 INNRT, 3 INRT, 1 INRT+1 INNRT+IP Dificulti: 1. Durata i costul tratamentului 2. Toxicitatea preparatelor 3. Dezvoltarea rezistenei Monitorizarea terapiei antiretrovirale: Msurarea arjei virale (copii ARNv n plasm) Determinarea numeric a LT CD4+ PROFILAXIA INFECIEI HIV/SIDA 120

Msuri nespecifice: prevenirea transmiterii HIV. Profilaxia specific dificil!!! Existena a 2 virusuri HIV-1 i HIV-2 cu numeroase subtipuri genetice i antigenice. Infecia natural nu este stopat de rspunsul imun, iar memoria imunologic este mediocr. Nu este definitiv clar rolul LT CD8+ (Tc). Lipsa unui model animal satisfctor. VIRUSURILE HTLV (Human T-cell Lymphotropic Virus) Genul Deltaretrovirus Specii HTLV-1 i HTLV-2 Structura comun retrovirusurilor Transmiterea contact sexual, vertical, prin snge (cu limfocite). Puterea oncogen determinat de gena transactivatoare tax. Manifestri clinice 1-5% din persoanele infectate dezvolt peste 20-30 ani leucemie acut cu celule T. Diagnostic depistarea virusului prin ELISA i confirmarea W-B, PCR. Tratament antiretrovirale, IFN. ONCOGENEZA VIRAL Cancerul este consecina dereglrii procesului normal de proliferare celular. Cile de apariie a cancerului: Hiperactivitatea genelor de stimulare a creterii Blocarea genelor care inhib creterea Virusuri cu potenial oncogen: Virusuri cu genom ADN (Papovaviridae, Adenoviridae, Herpesviridae, Hepadnaviridae) Virusuri cu genom ARN (Retroviridae) Caracter comun capacitatea genomului viral de a se integra n cromosomul celulei-gazd transformarea ei. Transformarea celular modificri ale funciilor biologice ale celulei, ce duc la multiplicarea necontrolat a celulelor i capacitatea de invazie a esuturilor. Virusurile oncogene conin gene care pot induce tumori v-onc Toate celulele conin gene omologe: proto-oncogene/c-onc (induc o protein care controleaz replicarea ADN i multiplicatea celular). V-onc i c-onc nu sunt identice!!! C-onc pot induce tumori numai n urma unor mutaii. Mecanismele oncogenezei: 1. Virusul aduce n celul o oncogen. 2. Virusul activeaz proto-oncogenele celulare. 118. Familia Herpesviridae. Clasificarea (subfamilii, genuri, spp.). Caracterele morfobiologice ale virusurilor herpetice. Virusurile HSV 1 si HSV 2. Patogeneza infectiilor cauzate (infectia primara, latenta, reactivarile). Particularitatile de evolutie la persoane imunocompromise. Diagnosticul de laborator al infectiilor cauzate de HSV. Prelevatele. Metodele de diagnostic. Profilaxia si terapia specifica. FAMILIA HERPESVIRIDAE Virusurile herpetice - ageni patogeni ai omului, primatelor i altor mamifere (porci, cai, vite), ai psrilor (gini, curcani, etc), petilor i broatelor, reunind peste 100 de virusuri. Clasificarea virusurilor herpetice de interes medical: Subfamilia Alphaherpesvirinae genul Simplexvirus (HSV-1, HSV-2) genul Varicellovirus (VZV) Subfamilia Betaherpesvirinae genul Cytomegalovirus (CMV ) genul Roseolovirus (HHV-6/7) Subfamilia Gammaherpesvirinae genul Lymphocryptovirus (EBV) genul Rhadinovirus (HHV-8) 121

CARACTERE GENERALE ALE HERPESVIRUSURILOR Structura virionului Virion sferic, 150-200 nm diametru, constituit din: centru dens, de forma unui mosor (bobin), de natur proteic, pe care este nfurat acidul nucleic; genomul viral ADNd.c., constituit din 80-100 gene capsida de simetrie icosaedric, format din 162 capsomere; tegument structur proteic fibrilar, situat ntre capsid i supercapsid; peplos (supercapsida), dublu strat lipidic, pe suprafaa creia proiemin spiculi scuri, constitui din 5-8 glicoproteine, responsabile de adeziune i fuziune. Enzime (ADN-polimeraza ADN-dependent, timidin-kinaza, ribonucleotid-reductaza, serinproteaza). Caractere biologice virusuri dermo, limfo i neurotrope determin infecii latente, recurente majoritatea prezint potenial oncogen posed numeroase enzime ce intervin n multiplicarea viral prezint un spectru foarte larg de gazde i o gam divers de forme clinice sunt virusuri fragile i se transmit numai prin contact direct Rezistena la ageni fizici i chimici n stare liofilizat, la 4 grade, virusurile herpetice se menin ani de zile. Relativ instabile la temperaturi ambientale (+ 22 grade C), inactivate de solveni lipidici, detergeni, dezinfectani uzuali, pH extreme. Prezint sensibilitate la aciunea inhibitorilor sintezei ADN (acyclovir, etc). Multiplicarea viral Adsorbia virionului la suprafaa celulei-int. Penetrarea NC prin fuziunea supercapsidei virale cu membrana celular. Degradarea partiala a capsidei de enzime celulare i ptrunderea ADN viral n nucleul celulei. Sinteza proteinelor celulare se oprete. Biosinteza: n 3 runde consecutive are loc transcrierea ARNm viral cu sinteza ulterioar a 3 tipuri de proteine: foarte precoce (alpha, immediate early), precoce (beta, early), care sunt n majoritate enzime i proteine tardive (gamma, late), care sunt proteine de structur. Replicarea ADN Asamblarea NC are loc n nucleu. Prsindu-l prin inmugurire, NC se nvelesc cu membrana nuclear intern, n care sunt nserate GP virale imature, pe care o dezbrac n procesul de nmugurire prin membrana nuclear extern. n citoplasm NC capt proteinele tegumentului i sunt ulterior re-nvelite n supercapsid ntr-o vezicul de exocitoz, n membrana creia se conin GP virale mature. Virionii sunt eliberai prin exocitoz . Celula infectat este alterat ireversibil prin: Inhibarea rapid a metabolismului celular. Fragmentarea cromozomului i apariia incluziilor intranucleare corpusculii Cowdry. Apariia de sinciii i celule gigante. SUBFAMILIA ALPHAHERPESVIRINAE GENUL Simplexvirus Specii: Herpes simplex virus tip 1 (HSV-1) Herpes simplex virus tip 2 (HSV-2) Cultivare: Culturi celulare primare umane sau din rinichi de iepure, fibroblaste de embrion de gin, linii celulare HeLa Ou embrionate de gin (pe membrana chorioalantoic produc pustule pocks-uri) Animale de laborator oarece nou-nscut (letal) Iepure (keratoconjunctivit dup scarificarea corneei) 122

Cobai infectat intraplantar (erupie vezicular local) Patogeneza infeciilor cu HSV Sursa de virus omul (90% au Ac anti-HSV1 i 20% anti-HSV2) Transmiterea virusului: 1. Contact direct: prin saliv sau lichidul vezicular, mai rar prin obiecte contaminate recent cu saliv (preponderent HSV-1) 2. Contact sexual (preponderent HSV 2) 3. n timpul naterii (herpes neonatal, HSV 2) 4. Transplacentar (herpes congenital, HSV 2)) 5. Prin intermediul transplantelor de organe infectate 6. Autoinocularea Infecia cu HSV -1 Primo-infecia este precoce, la 1-3 ani, n 90% cazuri asimptomatic. Manifestri clinice: herpesul labial gingivostomatit (erupie vezicular i ulceroas, adenopatie cervical, febr) kerato-conjunctivit (prezint riscul ulceraiei corneei i orbirii) eczema herpeticum (survine la pacieni cu eczeme cronice, se manifest ca o dermatit vezicular generalizat) panariiu herpetic (la personalul medical, la copii autoinoculare) meningite, menindo-encefalite, consecutiv infeciei pe calea nervilor trigemen sau olfactiv (letalitate 70%). Dup infecie (clinic sau asimptomatic) virusul se localizeaz n ganglionul trigemen, determinnd o infecie latent. Genomul viral persist sub form de episom. Replicarea ADN nu are loc, exprimndu-se doar cteva gene de laten. Reactivarea infeciei (herpesul recurent) are loc consecutiv scderii rezistenei organismului: stress, radiaii, frig, infecii, perturbri hormonale, etc. Virusul se propag centrifug pe cale nervoas, determinnd o infecie local (frecvent la jonciunea cutaneo-mucoas): herpes labial, nazal, keratita herpetic (buchet de vezicule, se acoper cu cruste n cteva zile, vindecarea survine n 10 zile). Infecia cu HSV -2 Determin preponderent infecii genitale. Primo-infecia are loc la persoane de 15-25 ani (primele contacte sexuale) sau la nou-nscui (herpes congenital, neonatal). 75% cazuri primo-infecia este inaparent. Manifestri clinice: herpesul genital (leziuni veziculo-ulcerative ale penisului, vulvei, vaginului, colului uterin, perineului, feselor, proctita herpetic. Dup infecia primar virusul rmne latent n ganglionii lombari i sacrali, determinnd recurene, cu aceeai localizare, care sunt mai puin severe. herpesul neonatal. Contractat de nou-nscut la natere sau de la personalul medical cu herpes oral sau panariiu herpetic. Se manifest prin septicemie sau conjunctivit. Netratat progreseaz cu diseminare visceral i deces (65%). Infecia poate fi asimptomatic. infecie congenital. Transmiterea transplacentar determin malformaii congenitale, vicii. cancer de col uterin i vulvar. La gazde imunocompromise infecia cu HSV evolueaz grav, cu diseminare masiv i afectarea organelor interne. Recurenele sunt mai frecvente, cu ulcerare, necroz, extindere. Rspuns imun: umoral i celular, se instaleaz dup 1-3 sptmni de la infecie. Ig M apar i n reactivri i sunt martor de multiplicare viral. Ig nu sunt protectoare, reactivrile au loc n prezena Ac. Imunitatea celular joac rolul principal n controlul infectiei cu HSV. Diagnosticul de laborator al infeciei cu HSV Prelevate: lichid din vezicule, ulceraii, cruste, fragmente bioptice sau necroptice. Diagnosticul direct 123

Examenul microscopic ME Microscopia optic pe frotiuri colorate cu hem-eozin se observ celule mari, cu incluzii intranucleare eozinofile (Cowdry) Detectarea Ag virale: RIF cu Ac monoclonali Examenul virusologic Izolarea virusului pe animale sensibile, ou embrionat de gin sau culturi celulare Indicarea virusului: manifestri clinice la animal, apariia veziculelor pe membrana chorioalantoica a oului embrionat, ECP specific pe culturile de celule (celule gigante sincitiale cu incluzii intranucleare) Identificarea virusului cu ajutorul serurilor imune specifice (RN, RIF, ELISA) Detectarea genomului viral prin tehnici de biologie molecular (hibridare in situ, PCR) Diagnosticul indirect Serodiagnostic. Examinarea serurilor perechi (precoce i tardiv) cu evidenierea creterii titrului de Ac de cel puin 4 ori. Reacii utilizate: RFC, RN, RIFI, ELISA. Tratamentul specific al infeciei cu HSV o Vidarabin (adenin-arabinosid). Analog nucleozidic al guaninei. Inhibitor competitiv al ADN polimerazei virale o Acyclovir, Valacyclovir, Zovirax (acycloguanosid), Penciclovir, famciclovir. Analogi nucleozidici ai guaninei. Inhibitori ai ADN polimerazei virale, manifest activitate numai asupra virusului n curs de replicare. o Foscarnet (phosphonoformat). Dezechilibreaz reacia de polimerizare a ADN. 119. Familia Herpesviridae. Genul Varicellovirus. Caracterele morfobiologice ale VZV. Patogeneza varicelei si zonei-zoster. Particularitatile de evolutie la persoane imunocompromise. Diagnosticul de laborator al infectiilor cauzate de HZV. Prelevatele. Metodele de diagnostic. Profilaxia specifica. GENUL Varicellovirus Specia virusul Varicella-Zoster (VZV), agentul etiologic al varicelei n primo-infecie i al zonei-zoster prin reactivare. Cultivarea numai pe culturi celulare (celule primare de origine uman, simian, din rinichi de iepure, linii celulare) Patogeneza infeciei cu VZV Infecia primar varicela Sursa de virus omul Transmiterea aerogen, prin secreii rinofaringiene sau prin contact cu lichidul vezicular sau obiecte recent contaminate cu lichid vezicular. Varicela se manifest n special la copii de 2-6 ani, evolund epidemic iarna i primvara. Contagiozitate maxim cu 1-2 zile naintea erupiei i o sptmn dup ultimul puseu eruptiv. Perioada de incubaie 14 zile Dup ptrundere virusul se multiplic local n cile respiratorii (mai rar conjunctiv) i ganglionii limfatici locali. Urmeaz faza de viremie primar, cu durata de 10-11 zile i cu afectarea sistemului reticulo-endotelial. Peste 5 zile urmeaz viremia secundar cu rspndirea i multiplicarea virusului n tegument, conjunctiv, tractul respirator (esuturilor de origine ectodermic). Apare febra i succesiunea unor valuri de erupie pruriginoas care evolueaz independent (macul papul vezicule cu lichid clar, apoi cruste) i ating tot corpul. Dispar fr cicatrice. Odat cu apariia Ac (2-3 sptmni) simptomele dispar. Evoluia este benign. La persoane cu deficiene imunitare leziuni hemoragice, suprainfecie bacterian, encefalite, pneumonii, varicela diseminat, letal. La gravide n primele 20 sptmni de sarcin varicela poate determina o embriofetopatie. Reactivarea (Zona-Zoster) n cursul primoinfeciei, prin nervii senzitivi sau hematogen, VZV disemineaz spre ganglionii spinali sau ai nervilor cranieni, unde persist latent. n caz de reactivare virusul se multiplic i se deplaseaz pe cale nervoas centrifug spre sectorul cutanat corespunztor, determinnd 124

Zona-Zoster. Infecia debuteaz cu neuralgie sever, hiperestezie i erupie vezicular localizat unilateral n dermatomul nervului afectat. Poate fi asociat cu meningit sau paralizii. Forme clinice: zoster oftalmic, zoster motor, encefalomielita. Erupiile persist pn la apariia rspunsului imun (umoral, celular). Tratament acyclovir, valacyclovir, famciclovir. Tratament simptomatic (analgezice, antipruriginoase). Profilaxie vaccin viu atenuat, tulpina Oka (n special la imunodeprimai). Pentru prevenirea evoluiei grave la contaci (nou-nscui, copii pn la 15 ani, gravide neimunizate, persoane cu imunodeficiene) se administreaz Ig uman hiperimun specific sau gammaglobuline de convalesceni de zona. SUBFAMILIA GAMMAHERPESVIRINAE GENUL Lymphocryptovirus Specia virusul Epstein-Barr (EBV) EBV este agentul cauzal al mononucleozei infecioase, implicat n etiologia unor tumori: limfomul Burkitt, carcinomul nasofaringean, leucoplakia proas a limbii. Este limfo i epiteliotrop. Structura antigenic a EBV: 1. antigen precoce (early antigen) EA enzime implicate n replicare 2. antigen de membran MA 3. antigen nuclear EBNA 4. antigen al capsidei virale VCA Cultivare: Culturi din limfocite B, provenite din snge din cordonul ombilical. Infectate cu EBV sufer transformare prin proliferare continu - imortalizarea limfocitelor. Inocularea de celule limfoblastoide la obolani nou-nscui, hamsteri, oareci induce tumori secretoare de IgM sau IgG. Celulele-int pentru EBV exprim pe suprafaa membranei celulare moleculele CR2 (CD21) receptor pentru fracia C3b a complementului, de care se ataeaz virusul limfocitele B i celulele epiteliale ale oro- i rinofaringelui. Infecia celulelor epiteliale este litic, cu moartea celulei i producere de virus. Celulele infectate astfel exprim pe membran Ag EA i VCA. n contrast, EBV induce infecie latent a limfocitelor B in vivo i transform limfocitele B normale in vitro cu proliferarea lor continua - linii limfoblastoide imortalizate. Limfocitele infectate latent exprim Ag EBNA i MA. Patogeneza mononucleozei infeciose Afecteaz n special copiii i adolescenii. Sursa de infecie omul. Transmiterea se efectueaz prin intermediul salivei (boala srutului), obiecte contaminate recent, rareori transfuzii. Poarta de intrare orofaringele. EBV afecteaz limf B direct sau dup traversarea esutului epitelial amigdalian prin transcitoz. Aceste limfocite B prolifereaz i produc virus, care infecteaz alte celule, astfel afectnd toate esuturile limfoide din organism. Incubaia 30-50 zile Semne clinice angin, astenie, febr, adenopatie generalizat, splenomegalie i hepatit Complicaii: anemie hemolitic, purpur trombocitopenic, meningit. n snge limfocite B atipice, care prezint Ag EBNA i MA. Vindecarea survine peste cteva zile sau sptmni (rspunsul imun). Reactivarea endogen a EBV conduce la sindromul de mononucleoz cronic, cu febr, astenie i producere anormal de Ig. Imunitate: o umoral = prezena Ac (IgM antiVCA sunt markeri de infecie recent, IgG antiVCA si antiEBNA semnal de infecie persistent). o celular = supresat, numrul de Ts fiind majorat pentru o perioad de 8 sptmni. Pe suprafaa limfocitelor B apar neoantigene (antigene Paul-Bunnell), ce induc Ac heterofili (Ac fa de hematii de oaie). Diagnosticul de laborator 125

Prelevate: spltur faringian, snge (limfocite), bioptate (ganglioni limfatici, splin) Examenul microscopic: pe frotiuri din snge limfocite B mari, anormale, cu citoplasma bazofil i nucleu fragmentat Detectarea Ag EBNA n RIF cu Ac monoclonali Examenul virusologic: izolarea virusului pe cultur de limfocite B i observarea transformrii maligne cu apariia unei linii continui Diagnosticul serologic: In infecia primar se evideniaz Ac heterofili (testul Paul-Bunnell). Teste pentru detectarea Ac specifici fa de Ag virale pe probe duble de ser: infecii primare IgM i Ig G (peste 2 spt) anti VCA (persista titru mic toat viaa), n convalescen anti EBNA infecia reactivat i n neoplazii reapar Ig G anti EA n titru mare i sunt prezeni Ac antiEBNA 120. Familia Herpesviridae. Genul Cytomegalovirus. Caracterele morfobiologice ale virusului citomegalic. Patogeneza infectiilor cauzate de CMV , manifestarile clinice (infectie primare, reactivarile). Diagnosticul de laborator al infectiilor cauzate de CMV. Prelevatele. Metodele de diagnostic. Profilaxia specifica. SUBFAMILIA BETAHERPESVIRINAE GENUL Cytomegalovirus Specia Virusul cytomegalic (CMV) Cultivarea numai pe culturi de celule primare din fibroblaste umane sau culturi de miometru. Celulele int: macrofagele, celulele endoteliale, limfocitele T i B, celulele-su din mduva osoas, celulele epiteliale ale canalelor glandulare. Patogeneza infeciei cu CMV Sursa de infecie omul Transmiterea: 1. Prin contact direct cu secrete i excrete ale bolnavilor (saliv, lacrimi, lapte, urin, secreii ale colului uterin, vaginale, sperm, mase fecale, snge). 2. Congenital (vertical). 3. Neonatal (n timpul naterii, prin lapte). 4. Transfuzii de snge sau transplante de organe. Primoinfecia este n general asimptomatic (80-90%). n caz de viremie este urmat de persistena latent a virusului n glandele salivare i limfocite B. Manifestri clinice: Infecia congenital moarte in utero cu avort; natere prematur, cu dezvoltarea bolii cu incluzii citomegalice (microcefalie, hepatosplenomegalie, purpur trombocitopenic, pneumonie interstiial, defecte neurologice). Patomorfologic - celulele infectate devin gigante (citomegalie), cu incluzii intranucleare specifice n ochi de bufni. Infecia postnatal (infectarea n timpul naterii sau cu laptele matern). Copiii elimin virusul prin urin i saliv. Decurge inaparent n majoritatea cazurilor. La prematuri pneumonie interstiial, sechele neurologice i retardare psihomotorie. Infecia primar a copilului sau a adolescentului. Dup o incubaie de 30 de zile diseminarea viral se manifest prin febr, hepatosplenomegalie, adenopatii asociate cu sindrom mononucleozic (neutropenie, limfocitoz, bazofilie). Evoluie benign. Infecia adultului (doar la imunodeprimai, persoane cu transfuzii sau transplante). Se aseamn cu mononucleoza infecioas (cu febr i splenomegalie, dar fr angin, fr adenit i fr Ac heterofili ) Dup primoinfecie virusul persist latent n limfocite. Reactivrile se traduc prin apariia unei viremii tranzitorii i excreia virusului. La imunodeprimai pneumonie, hepatit, infecie generalizat.

126

Imunitate umoral (Ac neutralizani, fixatori de complement) i celular prin intermediul limfocitelor Tc i celulelor NK. CMV are efect imunosupresor, ducnd la creterea nr limfocitelor Ts i diminuarea limfocitelor Th. Diagnosticul de laborator al infeciilor citomegalice Prelevate: fracia leucocitar a sngelui, urin, spltur rinofaringean, secreii cervicale, probe bioptice sau necroptice. Diagnosticul microscopic. Prezena celulelor mari, cu incluzii intranucleare n ochi de bufni pe frotiuri din leucocite, plasm, sediment urinar sau seciuni tisulare Detectarea Ag virale cu Ac monoclonali (RIF, ELISA) Examenul virusologic dificil. Cultivarea pe culturi de celule este lent (2-8 sptmni). ECPcelule mari, incluziuni eozinofile intranucleare i bazofile intracitoplasmatice Detectarea genomului viral (PCR) Serodiagnostic. Cercetarea serurilor perechi n RFC, RHAI, RIFI, ELISA Infecie congenital izolarea virusului n primele 2 sptmni de via, depistarea Ig M. Infecie recurent: reapariia excreiei virale la pacieni seropozitivi. Tratament: gancyclovir, valgancyclovir, foscarnet, cidofovir Profilaxie: vaccin viu atenuat sau/i plasm sau globulin hiperimun se administreaz gravidelor seronegative, recipienilor de transplant HHV 6 ntlnit la aduli n 90%. Agent implicat n etiologia unei afeciuni cutanate - exanthum subitum. La persoane cu imunosupresie pneumonii, encefalite, retinite, etc. HHV 7 izolat de la aduli sntoi (aprox. 75%), care excret virusul prin saliv. Sediul latenei epiteliul glandelor salivare, limfocite T CD4. Omologie de 50% cu CMV. HHV 8 asociat cu sarcomul Kaposi.

127