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UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PLATA FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLOGICAS CATEDRA DE ANALISIS CLINICOS I (HEMATOLOGIA)

METODOS DEL LABORATORIO HEMATOLOGICO


SEGUNDA PARTE

Docentes

Dra. Nilda E. Fink Dra. Mara Elena Chiesa Dra. Alejandra Fernndez Alberti Bioq. Fernando Ventimiglia Bioq. Mariana Gonzlez Bioq. Jos Luis Casali

La Plata, 2005

CONTENIDO
Pgina Recuento de leucocitos Determinacin de la frmula leucocitaria: recuento diferencial de leucocitos Electroforesis de las protenas sricas en acetato de celulosa Clulas LE Diagnstico de mononucleosis infecciosa Citoqumica 1. Reaccin de Pas (hidratos de carbono) 2. Peroxidasas 3. Sudan Black B (lpidos) Hemostasia 1. Recuento de plaquetas (mtodo manual) 2. Tiempo de sangra 3. Tiempo de coagulacin 4. Retraccin del cogulo Determinacin del tiempo de tromboplastina parcial activada Determinacin del tiempo de protrombina o tiempo de Quick en una etapa Determinacin de fibringeno 3 5 8 12 14 16 16 17 18 19 19 20 22 23 25 27 30

RECUENTO DE LEUCOCITOS

Mtodo manual 1) Agregar 20 l de sangre a un tubo de Kahn conteniendo 0,38 ml de solucin de Trk. Esta solucin contiene acido actico al 1 % en agua destilada y el agregado de una punta de esptula de azul de metileno. 2) Homogeneizar la mezcla. 3) Cargar las cmaras de recuento, procediendo tal como se realiz para el caso del recuento de hemates. 4) Ubicar el reticulado de la cmara con bajo aumento, constatar la ausencia de burbujas y que la distribucin sea regular. 5) Aplicando mayor aumento se procede al recuento de los elementos presentes en los cuadrados angulares grandes (4) de la cmara. Las cuentas de los cuatro cuadrados no deben diferir entre s en ms del 20%. En caso contrario debe cargarse nuevamente la cmara.

Recuadro central

Si el valor obtenido (leucocitos/mm3 de sangre) es menor de 2500, se practica nuevamente el recuento empleando una dilucin 1:10. Si por el contrario el nmero resulta notablemente elevado se emplean diluciones 1:100 o 1:200.

6) Clculo: m x 10 x d = N de leucocitos/ mm n Donde: m=nmero de leucocitos contados en n (4) cuadrados de 1 mm de superficie y d=dilucin utilizada Valores de referencia Adultos Recin nacidos Nios de 1 ao Nios de 4 a 7 aos Nios de 8 a 12 aos 4.000 - 11.000 / mm3 10.000 - 25.000 / mm3 6.000 - 18.000 / mm3 6.000 - 15.000 / mm3 4.500 - 13.000 / mm3

DETERMINACIN DE LA FRMULA LEUCOCITARIA: RECUENTO DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS

1) OBTENCIN DEL FROTIS DE SANGRE Sobre un portaobjetos perfectamente limpio, se coloca en un extremo una gota pequea de sangre (1-2 mm) recin obtenida, ya se trate de puncin digital, o del taln (en pediatra) o de la ltima gota de sangre extrada con la jeringa y que se encuentra en la luz de la aguja. Evitar usar sangre con anticoagulantes porque altera la morfologa de las clulas. Por medio de otro portaobjetos de borde pulido y al cual se le ha quitado los ngulos (extensor), se realiza la extensin de la gota de sangre: conservando un ngulo menor de 45 respecto al portaobjetos horizontal, el extensor se apoya delante de la gota de sangre y retrocediendo hasta tocarla, una vez que la misma se extiende a lo largo del borde de contacto por capilaridad, se avanza con firmeza y no muy rpidamente. As se obtiene una fina pelcula de sangre que representa integralmente a la gota de sangre que se extiende. Secar rpidamente el extendido al aire para evitar el deterioro de las clulas. Un extendido as obtenido poseer tres reas de diferente espesor y con distribucin tambin distinta de leucocitos: 1. Zona excesivamente gruesa: Se encuentra en la regin inmediata al punto de partida de la extensin (cabeza). En ella hay siempre un aumento del nmero de linfocitos. 2. Zona excesivamente fina: Corresponde al final de la extensin (cola) y en sta se observa un exceso de granulocitos y monocitos. 3. Zona ideal: Regin central (cuerpo), en ella hay un reparto equilibrado de las clulas.

2) COLORACIN DEL FROTIS DE SANGRE La coloracin se realiza por el mtodo de May Grnwald-Giemsa.

Fundamento Prcticamente todos los mtodos empleados para teir las clulas de la sangre se basan en el empleo de una mezcla de eosina y azul de metileno. Estos colorantes son muy sensibles a las variaciones de pH de las diferentes estructuras celulares, de modo que las que tienen carcter bsico fijan en mayor medida la eosina (colorante cido), mientras que las que poseen propiedades cidas fijan principalmente el azul de metileno (colorante bsico). Esto explica que ciertas estructuras basfilas presentes en el ncleo (nuclolo) o en el citoplasma (ribosomas) se coloreen de azul, mientras que otros componentes acidfilos como la hemoglobina adquieren color rosado. De esta manera, la diferente afinidad de ciertas granulaciones citoplasmticas por dichos colorantes permite clasificar los leucocitos polimorfonucleares en: neutrfilos, en los que la granulacin especfica posee compuestos neutros que fijan ambos colorantes simultneamente, resultando en un color pardo; eosinfilos, en los que la granulacin especfica contiene sustancias de intenso carcter bsico que fijan fundamentalmente los colorantes cidos, dando un color rojo-naranja; y los basfilos, cuya granulacin especfica posee sustancias de carcter cido, que fijan colorantes bsicos dando un color azul oscuro. Reactivos Solucin May Grnwald : eosinato de azul de metileno en metanol. Solucin Giemsa: azul de metileno (clorhidrato de tetrametiltionina), su derivado oxidado en medio alcalino: el azur II, y eosina (tetrabromofluorescena).

Mtodo Cubrir el frotis de sangre seco con solucin May Grnwald. Dejar 3 minutos. A continuacin, agregar buffer fosfato pH 6.8 en proporcin igual a la de colorante. Homogeneizar soplando suavemente con una pipeta o moviendo el portaobjetos con un movimiento de vaivn. Dejar 5 minutos. Volcar y cubrir el preparado con una solucin de Giemsa, obtenida a razn de dos gotas del colorante por ml de agua. Dejar 10 minutos. Lavar con agua , limpiar la cara inferior del portaobjeto con un algodn y secar al aire. 3) REALIZACIN DE LA FRMULA LEUCOCITARIA RELATIVA Sobre el frotis coloreado se coloca una gota de aceite de inmersin y se observa al microscopio. Puede utilizarse un aumento de 100X. La clasificacin de las clulas se puede realizar analizando las que se encuentran en una trayectoria que se hace comenzando en uno de los bordes, desplazando 4 a 5 campos microscpicos siguiendo de forma paralela al borde, iniciando a continuacin una recorrida transversal hasta llegar al otro borde. All se comienza de nuevo: 4 a 5 campos microscpicos y otra incursin hasta el borde opuesto. Se clasifican como mnimo 100 leucocitos.

Frmula leucocitaria normal de un adulto Cayados Neutrfilos Eosinfilos Basfilos Linfocitos Monocitos 0-1% 55-70% 1-4% 0-1% 20-40% 4-8%

No hay variacin de la frmula segn el sexo, pero s segn la edad. Nacimiento: 70% de neutrfilos. Primera semana: 50% de neutrofilos y 50% de linfocitos. Segunda semana: 65% de linfocitos y 25% de neutrfilos3-4 aos: 50% de linfocitos y 50% de neutrfilos. 10-12 aos: valores de referencia del adulto. Descripcin de cada uno de los elementos que componen una frmula normal 1. Neutrfilo: Ncleo lobulado ( 2-5 lbulos). Los lbulos estn unidos entre s por filamentos cromatnicos muy delgados. La cromatina es condensada. Es una clula terminal. Mide aproximadamente 12 m. El citoplasma es abundante y rosado, cubierto por una granulacin fina especfica de color pardo rojiza. 2. Neutrfilos en cayado: Slo se diferencia del anterior por su ncleo no lobulado en forma de C y, a veces de S . No hay una zona muy delgada de material nuclear que permita diferenciar dos lbulos. 3. Eosinfilo: Mide aproximadamente 13 m. El ncleo es segmentado, con predominio del bisegmentado en forma de anteojo. El citoplasma es abundante y est cubierto de granulaciones esfricas de mayor tamao que las del neutrfilo y que se colorean de anaranjado. 4. Basfilos: Mide aproximadamente 10 m. El ncleo est irregularmente lobulado. La cromatina es densa. La masa nuclear es voluminosa con relacin al citoplasma. Las granulaciones son groseras y muy irregulares en forma y tamao pudiendo quedar superpuestas al ncleo, cubrindolo parcialmente. 5. Linfocitos: Es una clula generalmente pequea (7 m), pero puede llegar hasta 12 m. La forma ms pequea posee slo un escaso anillo de citoplasma color celeste. Alrededor de un 10% de los linfocitos circulantes son clulas ms grandes y con citoplasma ms abundante. El ncleo por lo general es redondo, pero puede tener una escotadura. La cromatina es densa. 6. Monocito: Es el leucocito normal de mayor tamao (18-24 m). El ncleo presenta forma irregular y variada, la cromatina se esponjosa. La proporcin ncleo-citoplasma es aproximadamente semejante. El citoplasma se tie de celeste plomizo y no presenta granulaciones.

ELECTROFORESIS DE LAS PROTENAS SERICAS EN ACETATO DE CELULOSA

El suero humano contiene numerosas protenas que cumplen diferentes funciones. La electroforesis es una tcnica simple para separarlas en fracciones (Fig. 1).

1Ac 1Ag 1At Lp

Alb AT3 Lp C1q, C1r, C1s, C3, C4, C5 C1Inh

Alfa1-antiquimotripsina Alfa1-glicoprotena cida Alfa1-antitripsina Alfalipoprotena Albmina Antitrombina III Betalipoprotena Componente del complemento C1q ... C5 Inhibidor de C1

Cer CRP FB Fibr Hpt Hpx IgA, IgD, IgE, IgG, IgM Pl PreA

Ceruloplasmina Protena C reactiva Factor B Fibringeno Haptoglobina Hemopexina Inmunoglobulinas A ... M Plasmingeno Prealbmina

Figura 1. Electroforesis de protenas plasmticas en acetato de celulosa: se observan cinco fracciones cada una compuesta por muchas protenas individuales. Las ms importantes se muestran en la figura. Se utiliza la electroforesis de zona en la cual se emplea un soporte inerte: acetato de celulosa o agarosa; las protenas que son anfteras adquieren una carga neta negativa en el buffer de pH 8,6 (barbital) que se usa en la corrida, por lo tanto migran hacia el nodo. El buffer empleado no desnaturaliza ni precipita a las protenas y su fuerza inica est entre 0,05 y 1,5 mol/l. A medida que aumenta la fuerza inica la migracin se hace ms lenta. El soporte que utilizamos en el trabajo prctico separa las molculas por su carga molecular neta y se obtiene un patrn de 5 bandas para un suero normal.

La proporcin de las distintas fracciones proteicas vara en algunas enfermedades y adems se puede observar la aparicin de bandas diferentes de las normales como en el mieloma. CONSERVACIN DE LAS TIRAS Las tiras de acetato de celulosa se conservan en un recipiente tapado en metanol 40%. Es importante no permitir que las tiras se sequen porque pierden las dimensiones y caractersticas del gel. RECONOCIMIENTO DE LA SUPERFICIE PENETRABLE POR LAS PROTENAS Slo una cara es penetrable por las protenas y se reconoce fcilmente por que es ms opaca, despus de secarse entre dos hojas de papel de filtro. Las tiras tienen un ngulo achaflanado. La superficie penetrable puede reconocerse. Por ejemplo, poniendo la tira con el ngulo achaflanado abajo y a la derecha.

BUFFERS N 1 Veronal sdico 0,04M (dietilbarbiturato de sodio 8,24 g/litro) pH=8,6. N 2 Veronal sdico 5,15 g + EDTA sal tetrasdica 2,60 g/litro. pH=8,6. SOLUCIN COLORANTE Ponceau S: 0,5 g en 100 ml de cido tricloroactico 5% (dosis para 20 tiras). DESHIDRATANTE Metanol puro. SOLUCIN TRANSPARENTIZADORA 85 ml de metanol + 14 ml de cido actico + 1 ml de glicerol

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SOLUCIN DISOLVENTE PARA CUANTIFICAR LAS FRACCIONES PROTEICAS Acido actico 80%. PROCEDIMIENTO PARA LA ELECTROFORESIS 1. Sumergir las tiras en el tampn por lo menos 10 minutos (como mximo una noche). 2. Eliminar el exceso de lquido entre dos hojas de papel de filtro. 3. Extender las tiras sobre el puente de la cmara electrofortica. La superficie penetrable tiene que estar dirigida hacia arriba; adems las tiras deben quedar bien planas. Conviene hacerlo rpidamente para evitar la evaporacin. 4. Condiciones de migracin: semimicroelectoforesis. sobre puente de 8,5 cm para micro o

5. Voltaje fijo: 200 V tampn n 1 o n 2. Microelectroforesis Microaplicacin de 0,5 l/5mm a 3 cm del borde catdico. Tiempo: 20 minutos (longitud de la migracin 25 mm) (error admitido sobre tiempo: -1+5 minutos)

Semimicroelectroforesis Semimicroaplicacin 1,5 l/9 mm a 2cm del borde catdico. Tiempo: 30 minutos (longitud de la migracin 35 mm) error admitido sobre tiempo: -1+8 min).

1. Coloracin: 5 minutos. 2. Decoloracin: con solucin decolorante cambiar 3- 4 veces hasta que el fondo de la tira est blanco con agitacin. 3. Determinacin cuantitativa: A) Disolucin. Cortar las fracciones coloreadas e introducirlas en tubos de ensayo preparados en serie de 5. Agregar la solucin disolvente y agitar (para las fracciones obtenidas de tiras 2,5 x 17 cm usar 3 ml de solucin). Leer el colormetro a 520 nm para el colorante Ponceau S. B) Transparentizado de las tiras de acetato de celulosa. Se sumergen las tiras decoloradas en metanol puro anhidro durante 30 segundos como mnimo, en cubeta seca, y a continuacin en la solucin transparentizadora durante 1 minuto como mnimo. Luego se colocan sobre una placa de vidrio, eliminando las burbujas de aire y se calienta preferentemente debajo de lmpara infrarroja o 11

sobre un bao seco a 60C durante unos minutos, a unos 5-10 cm de distancia, hasta transparencia completa. Conviene hacerlo rpidamente para evitar que las tiras transparentizadas se sequen al aire Luego se invierte la placa de vidrio sobre papel de filtro, dejando enfriar durante 20 minutos como mnimo. Se puede separar la tira de acetato de celulosa de la placa de vidrio conservndola en sobre de plstico o entre papeles pudindose efectuar despus la lectura en el densitmetro. Los perfiles que se obtienen en la densitometra son los siguientes:

Figura 2. Electroforesis de protenas sricas: correlacin clinicopatolgica. VALORES DE REFERENCIA Protenas Valores relativos (%)* Albmina 52-65 1 2,5-5 2 7,0-13,0 8,0-14,0 12,0-22,0 * % del total de protenas Valores absolutos (g/dl) 3,2-5,6 0,1-0,4 0,4-1,2 0,5-1,1 0,5-1,6

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CELULAS LE

INTRODUCCIN El lupus eritematoso sistmico es una enfermedad de base autoinmune, en la que estn afectados numerosos tejidos y rganos como articulaciones, piel, sistema nervioso, rin, corazn, pulmn, sangre, hgado, bazo y ojos. PRINCIPIO Las clulas LE son polimorfonucleares que han fagocitado material nuclear alterado proveniente de la destruccin del ncleo de otros leucocitos por el llamado factor LE (factor nuclear). Este factor (IgG anti-ADN) se fija a la superficie del ncleo y determina alteraciones de la cromatina. El material nuclear alterado recubierto de anticuerpos y complemento es fagocitado por los polimorfonucleares neutrfilos.

Figura 3. MTODO 4. Extraer 10 ml de sangre y dejarla coagular en un tubo de ensayo durante 2 horas a 37C. 5. Centrifugar 10 minutos a 3500 rpm. 6. Eliminar el suero y depositar el cogulo sobre un tamiz de malla fina (gasa). 7. Aplastar el cogulo contra el tamiz, recogiendo el producto resultante en un tubo de ensayo. 8. Llenar mediante una pipeta de Pasteur un tubo de Wintrobe, con el material obtenido de la destruccin del cogulo. 9. Centrifugar durante 20 minutos a 5000 rpm. 10. Eliminar el sobrenadante y recoger con una pipeta Pasteur los leucocitos situados en la interfase suero/hemates. 11. Efectuar dos frotis con este material. 12. Teir con el mtodo de May Grunwald-Giemsa y observar mediante el objetivo de inmersin.

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INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS La prueba es positiva cuando se observan leucocitos en cuyo citoplasma se hallan ncleos fagocitados de otras clulas con aspecto desestructurado y parcial o totalmente hialinizados. Esta prueba es especfica, pero no tiene gran sensibilidad por cuanto es negativa en el 30% de los pacientes de lupus. La corticoterapia, que a menudo se aplica prontamente a estos enfermos, inhibe la formacin de las clulas LE. Por lo tanto en la actualidad no tiene tanto valor diagnstico y es necesario utilizar otras pruebas. Tambin se puede observar la formacin de clulas LE en otras enfermedades autoinmunes y muchas veces difciles de distinguir clnicamente del lupus, como en colagenopatas y artritis reumatoidea. Por ello en la actualidad la determinacin clsica de las clulas LE ha sido desplazada por otras pruebas cada vez mas sensibles y especficas, entre las que se destacan los anticuerpos antinucleres.

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DIAGNOSTICO DE MONONUCLEOSIS INFECCIOSA

Monoslide
Prueba de aglutinacin en placa, con neutralizacin segn

Davidsohn, para el diagnstico de mononucleosis infecciosa SIGNIFICACION CLINICA


La mononucleosis infecciosa es una enfermedad benigna producida por el virus de Epstein-Barr (EBV) que se caracteriza en su aspecto clnico por la aparicin de fiebre irregular durante una o dos semanas, dolor e hinchazn de los ganglios cervicales e irritacin farngea; con un cuadro hematolgico bastante caracterstico debido a la gran proliferacin de clulas linfoides atpicas. Paul y Bunnell observaron que el suero de estos pacientes generalmente contiene un alto ttulo de anticuerpos heterfilos, capaces de aglutinar glbulos rojos de carnero o de caballo. Estos anticuerpos no son privativos de la mononucleosis, ya que en el suero de individuos sanos pueden existir aglutininas anti-carnero con ttulos de 1/28 y hasta 1/56, observndose ttulos de 1/112 o ms en diversas infecciones y luego de estimulaciones antignicas como transfusiones sanguneas. Tales hechos indican que la evidencia de altos ttulos de anticuerpos heterfilos slo tiene valor presuntivo en el diagnstico de esta enfermedad. Davidsohn introdujo la adsorcin diferencial con extracto de rin de cobayo (capaz de adsorber los anticuerpos heterfilos nomononucleosis infecciosa o anticuerpos de Forssman), aumentando as la sensibilidad y especificidad de la prueba y permitiendo confirmar los resultados de la Paul-Bunnell, que por su rapidez y practicidad sigui emplendose como prueba de screening o seleccin. No obstante, existe cierto porcentaje de pacientes (aproximadamente el 10%) con mononucleosis infecciosa que poseen bajos ttulos de anticuerpos heterfilos, razn por la cual los resultados de estas pruebas nicamente son considerados significativos, desde el punto de vista diagnstico, cuando se relacionan con los datos hematolgicos y las manifestaciones clnicas del paciente. FUNDAMENTOS DEL METODO Los anticuerpos heterfilos asociados a la mononucleosis infecciosa se detectan por su capacidad de aglutinar los eritrocitos de caballo, neutralizndose simultneamente los anticuerpos no asociados a mononucleosis (anticuerpos Forssman) con extracto de rin de cobayo. La aglutinacin se visualiza macroscpicamente. REACTIVOS PROVISTOS Reactivo: suspensin de eritrocitos de caballo y extracto de rin de cobayo. Control Positivo: dilucin de suero positivo, inactivado. Equivalente a 2-3 (+). Control Negativo: dilucin de suero negativo, inactivado. REACTIVO NO PROVISTO Solucin fisiolgica. INSTRUCCIONES PARA SU USO Reactivo: vaciar la pipeta del gotero y agitar vigorosamente antes de usar, verificando que no queden eritrocitos adheridos al fondo del frasco. Control Positivo: listo para usar. Control Negativo: listo para usar. PRECAUCIONES Los reactivos son para uso "in vitro". Los controles han sido examinados para HIV y HBV encontrndose no reactivos. No obstante, deben ser empleados como si se tratara de material infectivo. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Reactivo y Controles provistos: estables en refrigerador (2-10C) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. MUESTRA Suero a) Recoleccin: obtener suero de la manera usual. b) Aditivos: no se requieren. c) Sustancias interferentes conocidas: se ha descripto un inhibidor termolbil de la reaccin que produce resultados falsos negativos. Para eliminar esta interferencia es necesario inactivar el suero. Adems, la hemlisis tambin interfiere. Inactivacin: colocar el suero a 56C durante 15 minutos, inmediatamente antes de usar. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: el suero debe ser preferentemente fresco. En caso de no procesarse en el momento puede conservarse en refrigerador (2-10C) hasta 48 horas o en congelador durante 3 meses, a partir del momento de su recoleccin. MATERIAL REQUERIDO 1- Provisto - Placa de vidrio 2- No provisto - Palillo o varilla de vidrio - Cronmetro - Material volumtrico adecuado para efectuar mediciones y diluciones de las muestras

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- Lmpara o fuente de luz horizontal PROCEDIMIENTO Llevar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente antes de usar. I) PRUEBA CUALITATIVA Colocar una gota (50 ul) de Muestra inactivada en uno de los crculos de la placa limpia y seca. Agregar una gota (50 ul) de reactivo homogeneizado. Mezclar con palillo de madera hasta obtener una suspensin uniforme en toda la superficie del crculo. Inmediatamente, disparar un cronmetro y observar microscpicamente el resultado dentro de los dos minutos. Para una correcta visualizacin de los resultados, debe mantenerse la placa sobre un fondo negro y ligeramente por encima de un haz luminoso horizontal (ej.: lmpara de microscopa). II) PRUEBA CUANTITATIVA Los sueros positivos, segn la prueba anterior, pueden titularse efectuando diluciones seriadas: 1) Colocar en una serie de tubos 200 ul de solucin fisiolgica. 2) Agregar al primer tubo 200 ul de la Muestra inactivada y mezclar. Transferir 200 ul de esta dilucin al segundo tubo y mezclar, continuando de esta forma las diluciones hasta el ltimo tubo. Las diluciones as obtenidas equivalen a 1:2; 1:4; 1:8; 1:16, etc. 3) Tomar una gota de cada dilucin y ensayar segn I). INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS Negativo: suspensin homognea. Positivo: aglutinacin que aparece dentro de los dos minutos. Se califica de 1 a 4 (+). Un resultado positivo indica la presencia de anticuerpos heterfilos asociados a la mononucleosis infecciosa. Ttulo: se expresa como la inversa de la mxima dilucin a la que se produce aglutinacin visible macroscpicamente. METODO DE CONTROL DE CALIDAD Como punto de referencia de las reacciones positivas y negativas de Monoslide, es conveniente procesar simultneamente el Control Positivo y Control Negativo provistos, que se utilizan de la misma manera que la muestra. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. PERFORMANCE Sensibilidad: en la tcnica original de Davidsohn se emplean eritrocitos frescos (nativos) que dan lugar a reacciones inespecficas, por lo que la hemaglutinacin slo se considera como reaccin positiva para mononucleosis infecciosa en diluciones mayores de 1/14. La sensibilidad de los eritrocitos estabilizados que provee Monoslide ha sido regulada para proporcionar igual reactividad con suero inactivado sin diluir. PRESENTACION Equipo para 100 determinaciones (Cd. 1593151). BIBLIOGRAFIA - Wintrobe, M. M. - "Hematologa Clnica" - Pg. 924 (Ed. 1969) - Intermdica. - Lee, C. L.; Davidsohn, I.; Slaby, R. - Am. J. Clin. Path. 49/1:3 (1968). - Lee, C. L.; Davidsohn, I.; Panczyszyn, O. - Am. J. Clin. Path. 49/1:12 (1968). - Sinay, H. S.; Schoen, I.; Miyahira, T. - Am. J. Clin. Path. 50/1:75 (1968). - Hoagland. R. J. - "Infectious mononucleosis" - Ed. 1967 - Grune-Stratton. - Marletta, J.; Cravero, J.; Fay, O.; Rey. J. - Paran (1977).

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2000 Rosario - Argentina
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CITOQUIMICA

La citoqumica constituye, en la prctica hematolgica, un complemento indispensable del estudio de la morfologa mediante la microscopa ptica convencional. Su finalidad es estudiar la presencia de ciertos componentes bioqumicos (enzimas o sustancias diversas) en el interior de las clulas sanguneas tanto del pool medular como de clulas circulantes en sangre perifrica. 1) REACCION DE PAS ( HIDRATOS DE CARBONO) Fundamento La oxidacin por cido perydico rompe la unin 1:2 glicol de la glucosa o de un derivado amino o alquilo sustituto. Por este mecanismo da origen a funciones aldehido revelables por el reactivo de Schiff. Reactivos 1. Solucin fijadora: Metanol 2. Solucin de cido perydico ( conservar en la heladera): Acido perydico H2O 1g 100 ml

3. Reactivo de Schiff ( conservar en heladera y oscuridad) Fucsina bsica Metabisulfito de Na HCl 1 N H2O destilada 1g 1,9 g 4 ml 100 ml

Calentar el agua destilada, agregar la fucsina. Calentar, sin hervir, agitar. Enfriar a 50 C, agregar todas las drogas y agitar. Dejar 24 hs. en heladera, en frasco color caramelo. Decolorar con carbn activado y filtrar. Es conveniente preparalo 3 o 4 das antes de usarlo. 4. Contracoloracin Azul de Metileno H2O destilada Procedimiento 1. Fijar con metanol 10 min. 2. Lavar con H2O de la canilla. 3. Agregar el cido peryodico (oxidante) 30 min. 4. Lavar con H2O de la canilla. 17 1g 100 ml

5. Cubrir con reactivo de Schiff, durante 60 min. 6. Lavar con H2O de la canilla, tres veces. 7. Contracolorear con azul de metileno, durante 5 min. 8. Lava con H2O de la canilla y dejar secar. Resultado Positivo: ncleos verdes, citoplasma rojo brillante. 2. PEROXIDASAS Fundamento Mtodo de Washburn: frente al agregado de agua oxigenada, aquellas organelas que poseen la enzima desprenden oxgeno naciente del agua oxigenada y este oxida la bencidina a un xido intermedio color azul oscuro al principio que luego vira al negro. Reactivos 1. Colorante (conservar en heladera y oscuridad) Bencidina Solucin saturada de nitroprusiato de Na Alcohol etlico absoluto 2. H2O2 H2O2 (30 vol.) H2O destilada Preparar en el momento. Procedimiento 1. Cubrir con el colorante durante 5 minutos (en esta etapa se fija y se impregna con bencidina). 2. Sin volcar, se agregan 10 gotas de la solucin de H2O2 . Dejar 5 min. 3. Lavar con H2O de la canilla. 4. Contracolorear con Giemsa 1/10, durante 20 minutos. Resultados Positivo: citoplasma cubierto de color negro en aquellas clulas que poseen la enzima. 2 gotas 10 ml 300 mg 1 ml 99 ml

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3. SUDAN BLACK B (LPIDOS) Fundamento Schaeffer y Fisher, autores del procedimiento, diagnosticaron que el Sudan agota parcialmente su efecto colorante en la peroxidasa del rbano que acta en forma competitiva respecto de la leucocitaria. Este hecho demostrara que mientras la tincin de grasas comunes obedece simplemente al fenmeno fsico de difusin en un mejor solvente, para las grasas leucocitarias se necesitara el blanco de las peroxidasas sobre el que actuara el Sudan Black por mecanismo qumico. Reactivos 1. Fijador: formol al 37 %. 2. Solucin de Sudan Black B Sudan Black B Etanol absoluto 3. Buffer 16 g de fenol en 30 ml de etanol 300 mg de Na2PO4H.12H2O en 100 ml de agua destilada. El buffer se obtiene agregando la solucin a) sobre la b). 300 mg 100 ml

4. Solucin de trabajo (conservar en fro en frasco oscuro): Agregar 4 partes de buffer a 6 partes de solucin de Sudan Balck B. Filtrar antes de usar. Procedimiento 1. Fijar los preparados con vapores de formol durante 5 a 10 minutos (en ambiente cerrado por ejemplo caja de Petri). 2. Lava bien con H2O de la canilla. 3. Sumergir (cubrir ) durante 1 hora en la solucin de trabajo. 4. Lavar con etanol 70% ( 2 lavados ) durantes 5 minutos en total. 5. Contracolorear con Hematoxilina o Giemsa (1/10) 10 minutos. 6. Enjuagar con H2O. Resultado Positivo: citoplasma cubierto de grnulos color negro.

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HEMOSTASIA

1. RECUENTO DE PLAQUETAS (METODO MANUAL) Fundamento El recuento de plaquetas se efecta en sangre obtenida de puncin venosa anticoagulada con EDTA, y sometida a hemlisis por accin de una solucin hipotnica de oxalato de amonio en agua destilada. Materiales y reactivos Tubos plsticos. Cpsula de Petri. Algodn. Anticoagulante EDTA (0,342 mol/L). Diluyente: Oxalato de amonio 1% en agua destilada.

Procedimiento 1. Se obtiene sangre por puncin venosa en anticoagulante EDTA (0,342 mol/L), en tubos plsticos. 2. Se homogeiniza bien la muestra y se toman 100 l que se colocan en otro tubo plstico que contenga 1,9 ml de oxalato de amonio 1%. 3. Incubar 10-15 min. para provocar la hemlisis. 4. Cargar la cmara de Neubauer con el hemolizado y dejar que sedimenten las plaquetas en ambiente hmedo: se recomienda colocar la cmara dentro de una cpsula de Petri conteniendo un trozo de algodn humedecido. 5. Incubar 10-15 min en atmsfera hmeda. 6. Efectuar el recuento en microscopio en el reticulado central de la cmara (dividido en 400 cuadrados pequeos comprendidos en 1 mm2). El recuento de plaquetas se realiza en el cuadrado central (al igual que el recuento de hemates), se eligen 5 de los cuadrados que se encuentran subdivididos en 16 cuadraditos, como se muestra a continuacin (Fig. 4).

Figura 4. Recuadro central

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La superficie de este cuadrado central es de 1 mm2 y la cmara tiene una profundidad de 0,1 mm. 7. Contar los 4 cuadrados de los extremos y el cuadrado central (por ende, sern 5 cuadrados con 16 cuadraditos c/u, o sea 80 cuadraditos). 8. Clculo: sumar las plaquetas contadas en los 5 cuadrados y multiplicar por 1000 para obtener el nmero de plaquetas por mm3. El factor 1000 surge del producto: 20 x 400 = 1000/mm3 80 x 0,1 mm3 Donde 20 es el factor de dilucin, 400 son los cuadraditos totales y 80 los cuadraditos contados. El volumen total del cuadrante es de 0,1 mm3. Observaciones Actualmente, en muchos laboratorios, los recuentos de plaquetas se realizan en forma automatizada en contadores hematolgicos o en contadores especficos, habindose logrado un alto nivel de precisin (incluso en trombocitopenias). El recuento manual suele efectuarse para la comprobacin de la cifra de plaquetas en trombocitopenias muy graves y en el caso de plaquetas gigantes en las que el recuento automtico no es fiable. 2. TIEMPO DE SANGRIA 2.1 METODO DE IVY Fundamento Esta prueba valora la capacidad hemosttica global in vivo y consiste en medir el tiempo transcurrido desde la realizacin de una pequea incisin cutnea hasta que cesa la hemorragia. La prueba mide el tiempo necesario para obtener un tapn hemosttico eficaz y, por ende, representa una valoracin global y simultnea de la funcin plaquetaria (nmero, adhesin, agregacin y degranulacin plaquetaria) y de la funcin vascular. Respecto al factor vascular, la prueba depende de la integridad de la pared vascular y de su capacidad constrictora. El mtodo original del corte en el lbulo de la oreja, introducido por Duke en 1910, es poco sensible y menos reproducible, por lo que no es aconsejable continuar utilizndolo hoy en da. En 1935, Ivy introdujo la aplicacin de un manguito de presin en el brazo y la prctica de la incisin en la cara anterior del antebrazo. Este mtodo, con la modificacin introducida por Borchgrevink, que sustituye la puncin con lanceta por un corte realizado con hoja de bistur, ha demostrado una alta sensibilidad. Por ltimo, la introduccin de plantillas o dispositivos automticos para la realizacin de la incisin ha venido a uniformar y aumentar la reproducibilidad. Materiales y reactivos Dispositivos automticos para la realizacin de la incisin: Simplate y Simplate II (Organon Teknika) y Surgicutt (Ortho Diagnostics). Cronmetro. 21

Procedimiento 1. Es aconsejable colocar un esfigmomanmetro en el brazo del paciente y se regula a 40 mm de Hg, mantenindolo a esta presin a lo largo de toda la prueba. 2. Se extrae el dispositivo automtico de su reservorio estril y se sita en la parte superior de la cara anterior del antebrazo (previamente desinfectada), en una zona sin vello y alejada de las venas superficiales, a unos 3 cm por debajo del pliegue del codo y paralelo al mismo. 3. Se presiona el disparador del dispositivo y al mismo tiempo se pone en marcha el cronmetro (el corte tendr un largo y profundidad predeterminados: 1 cm x 1 mm). 4. La sangre que brota espontneamente se va secando cada 30 segundos, sin tocar la incisin, anotndose el tiempo que tarda en cesar la hemorragia, que ser el resultado de la prueba. Cuando el tiempo se alarga ms de 20 minutos puede detenerse la prueba aplicando una compresa con material hemosttico. Valores de referencia Hasta 6-8 minutos. Los tiempos superiores a 10 minutos son claramente patolgicos. 2.2 METODO DE DUKE Fundamento El mtodo original de Duke es, como dijimos antes, poco sensible y menos reproducible, pero se continua aplicando. Procedimiento 1. Se practica una incisin de 2 mm de longitud en el lbulo de la oreja utilizando una lanceta con tope, descartable. 2. La sangre que brota espontneamente se va secando cada 30 segundos, sin tocar la incisin, anotndose el tiempo que tarda en cesar la hemorragia, que ser el resultado de la prueba. Valores de referencia Inferior a 5 minutos. Interpretacin de resultados La prueba se prolonga por reduccin del nmero de plaquetas o por alteraciones funcionales plaquetarias o plasmticas (enfermedad de von Willebrand) relacionadas con los procesos de adhesin, agregacin o degranulacin plaquetarias. Est alterado en trombocitopenias, trombopatas, trombastenias y dficit de fibringeno. Se observan tiempos prolongados en uremias, mielomas, macroglobulinemias y despus de la ingesta de cido acetilsaliclico.

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En la enfermedad de von Willebrand generalmente es alargado, pero si es normal no invalida el diagnstico de dicha enfermedad. 3. TIEMPO DE COAGULACION Fundamento El tiempo de coagulacin de sangre total es una de las pruebas llamadas globales y abarca la activacin intrnseca de la protrombina y el fibringeno. La sangre, al ser extrada sin mayor contaminacin con tromboplastina tisular, es capaz de coagular cuando se la deposita en un tubo de vidrio. El tiempo que tarda este proceso est en relacin con el sistema de procoagulantes e inhibidores fisiolgicos o adquiridos, que influyen en la formacin de dicho cogulo. Este tiempo de coagulacin in vitro reflejar mejor la eficacia del sistema in vivo, cuanto menos se modifique esta sangre (contacto con el vidrio, burbujas de aire, detergentes, etc.). Materiales y reactivos Tubos de vidrio, perfectamente limpios. Bao a 37C. Cronmetro. Procedimiento 1. Obtener 3 ml de sangre por puncin venosa, de primera intencin y con jeringa plstica. 2. Disparar el cronmetro en el instante en que la sangre venosa se introduce en la jeringa. 3. Desconectar la aguja y vaciar ordenadamente 1 ml de sangre en el primero de los tres tubos de vidrio perfectamente limpios, previamente colocados en gradilla de bao a 37C. 4. Inclinar el primer tubo cada 30 seg. por la misma cara hasta que la sangre se coagule (deja de escurrirse por las paredes del tubo). 5. De inmediato, inclinar el segundo tubo hasta que se coagule; luego, proceder de la misma forma con el tercer tubo. 6. Se toma como tiempo de coagulacin el valor obtenido en el tercer tubo. Interpretacin de resultados Valores de referencia a 37C: 7-15 min. El rango normal debe establecerse en cada laboratorio, con un grupo suficiente de controles (20 como mnimo). Conviene repetir un paciente normal semanalmente, para determinar cualquier variabilidad de los valores previamente obtenidos. Se considera alargado un tiempo de coagulacin que difiere en ms de 2 min del lmite superior del rango normal, establecido en cada laboratorio (media + 2 SD). 23

Se trata de un mtodo poco sensible, pues se prolonga slo en aquellos casos de dficit graves. Un tiempo de coagulacin normal no descarta la existencia de un trastorno de la coagulacin, pero un tiempo prolongado es siempre ndice de un defecto severo de la misma, que puede deberse a una deficiencia de cualquiera de los factores que intervienen en la formacin del cogulo de fibrina, con excepcin de una deficiencia pura de los factores VII y XIII; pero el mtodo es mucho ms sensible a los defectos de los factores que intervienen en la activacin por contacto y en la formacin del activador intrnseco de la protrombina. 4. RETRACCION DEL COAGULO Fundamento La retraccin del cogulo depende de la actividad trombodinmica de las plaquetas, por lo que se require un nmero mnimo de plaquetas normales y adecuados niveles de Ca++. Procedimiento 1. Los tres tubos utilizados para determinar el tiempo de coagulacin deben dejarse en bao a 37C durante por lo menos 3 Hs. Al cabo de este tiempo, observaremos la mejor retraccin de los tres tubos, graduando de acuerdo a la magnitud de la retraccin por apreciacin visual del tamao del cogulo retrado y el suero libre en: a) b) c) d) Normal o completa Incompleta No retrae Hiperretrctil

Interpretacin de resultados Esta prueba depende del nmero de plaquetas, su actividad funcional y de la concentracin de fibringeno, aunque no se relacione muy bien con el nmero de plaquetas (en ciertas condiciones da normal an con 30.000/mm3). Un aumento importante de fibringeno reducir la retraccin por efecto de volumen, mientras que lo opuesto ocurre en casos de hipofibrinogenemia.

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En la trombastenia de Glanzman (alteracin funcional) se observan retracciones incompletas o nulas.

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DETERMINACION DEL TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADA

APTTest
Reactivos para la determinacin del Tiempo de Tromboplastina Parcial Activada SIGNIFICACION CLINICA El tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT), es una prueba sensible a la deficiencia de factores procoagulantes del plasma as como a la presencia de ciertos inhibidotes de la coagulacin. Sirve para detectar anormalidades en la va intrnseca de la coagulacin, como son los factores necesarios para la formacin del activador intrnseco de la protrombina, o sea los factores VIII, IX, XI y XII. Tambin detecta deficiencias severas de los factores II, V, X y fibringeno, no siendo as con los trastornos plaquetarios, las deficiencias de los factores VII y XIII ni los problemas vasculares. La rapidez, sencillez y reproducibilidad de la prueba la hacen muy adecuada para el control de la teraputica anticoagulante por heparina. Tambin permite la identificacin rpida de hemoflicos en potencia, a fin de poder someterlos a tratamientos preventivos prequirrgicos y evitar problemas hemorrgicos. FUNDAMENTOS DEL METODO El ensayo se basa en la medida del tiempo que tarda en coagular un plasma descalcificado, colocado en un bao a 37 oC y en presencia de un exceso de cefalina, activador y calcio. REACTIVOS PROVISTOS Reactivo APTT: viales conteniendo cefalina con tierra de diatomeas como activador particulado. Cloruro de Calcio: solucin de cloruro de calcio 0,025 mol/l. REACTIVOS NO PROVISTOS Agua bidestilada o desionizada. INSTRUCCIONES PARA SU USO Cloruro de Calcio: listo para usar. Reactivo APTT, preparacin: - Abrir un vial quitando el precinto metlico y retirando lentamente el tapn de goma para evitar prdidas del material. - Agregar el volumen de agua bidestilada o desionizada indicado en el envase. - Verificar que la temperatura del agua empleada no sea mayor a 37oC. - Tapar y agitar suavemente hasta obtener una suspensin homognea. Volver a homogeneizar cada vez que se emplee. PRECAUCIONES Los reactivos son para uso diagnstico "in vitro". ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Reactivos Provistos: estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. Reactivo APTT: una vez reconstituido es estable durante 14 das en refrigerador o 30 das congelado (-20oC). El congelado y descongelado slo puede realizarse una vez. Por esto se recomienda dividirlo en porciones, de acuerdo a las necesidades de trabajo. MUESTRA Plasma a) Recoleccin: obtener sangre cuidadosamente (evitando estasis o trauma) y colocar en un tubo con anticoagulante en proporcin 9 + 1 exacta (ejemplo: 4,5 ml de sangre + 0,5 ml de Anticoagulante TP de Wiener lab.). Mezclar suavemente. Centrifugar y separar el plasma antes de los 30 minutos. Es recomendable efectuar la extraccin con jeringas plsticas. b) Aditivos: para obtener el plasma debe emplearse Anticoagulante TP de Wiener lab. o citrato de sodio 0,130 mol/l. c) Sustancias interferentes conocidas: - Las contaminaciones, visibles o no, son causa de tiempos falsamente prolongados. - No debe emplearse EDTA o heparina para obtener plasma. Referirse a la bibliografa de Young para los efectos de las drogas en el presente mtodo. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: el plasma debe mantenerse en refrigerador (2-10oC) hasta el momento de efectuar la prueba. Este perodo no debe prolongarse ms de 4 horas. En caso de no poder procesarse en este lapso, el plasma debe congelarse a -20oC. Este procedimiento al igual que el descongelado debe realizarse con rapidez (sumergiendo en bao a 37oC) previo a la determinacin. La muestra debe conservarse hasta el momento de su anlisis en tubos plsticos para minimizar los efectos de activacin por contacto que pueden ocurrir con los tubos de vidrio. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) - Tubos de hemlisis. - Pipetas y micropipetas capaces de medir los volmenes indicados. - Bao de agua a 37oC. - Cronmetro. - Fuente luminosa, para la observacin del cogulo.

PROCEDIMIENTO Precalentar el Cloruro de Calcio antes de realizar la prueba en bao de agua a 37oC.

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En un tubo de hemlisis colocar: Muestra (plasma desconocido o control) 100 ul Reactivo APTT (homogeneizado) 100 ul Mezclar e incubar de 3 a 5 minutos a 37oC, luego agregar: Cloruro de Calcio (a 37oC) 100 ul Disparar simultneamente un cronmetro. Agitar brevemente para homogeneizar el contenido, mantener en el bao unos 25 segundos. Luego sacar el tubo del bao, inclinar suavemente una vez por segundo y detener el cronmetro en el momento de la formacin del cogulo. Tomar nota del tiempo de coagulacin. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS Los resultados pueden expresarse de distinta forma: 1) Como tiempo de tromboplastina parcial activada en segundos. 2) Como relacin entre el tiempo obtenido con el desconocido y el de un plasma control. METODO DE CONTROL DE CALIDAD Plasma Control normal - patolgico. VALORES DE REFERENCIA El intervalo de valores observados en individuos normales oscila entre 33-48 segundos. Se considera fuera de lo normal valores que difieran en ms de 6 segundos de un plasma control. Es recomendable que cada laboratorio procese un plasma control con cada lote de reactivos empleado y que correlacione los valores obtenidos para los pacientes con el de dicho plasma, haciendo constar estos resultados en el informe. CURVA DE CALIBRACION Este mtodo es til como control de la respuesta a la heparina en pacientes tratados con este anticoagulante. La tcnica empleada es la siguiente: 1) Preparar una Solucin de Trabajo de heparina en solucin fisiolgica cuya concentracin sea 10 Unidades/ml. Debe emplearse la misma heparina que se suministra al paciente. 2) Preparar diluciones de esta Solucin de Trabajo utilizando un pool de plasmas frescos normales o Plasma Control normal como diluyente. Se debern obtener diluciones de 0,8; 0,6; 0,4; 0,2; y 0,1 Unidades/ml. 3) Determinar el tiempo de tromboplastina parcial para cada una de estas soluciones as como para el pool de plasmas y graficar en papel semilogartmico APTT vs. Concentracin de heparina. El valor obtenido para el paciente debe correlacionarse con los valores de la grfica, para obtener la concentracin actual de heparina circulante. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias interferentes conocidas y Estabilidad e instrucciones de almacenamiento en MUESTRA. El mecanismo de la coagulacin involucra una serie de reacciones enzimticas que pueden ser influenciadas por toda condicin que afecte a los sistemas enzimticos en general, razn por la cual se deben observar las mismas precauciones metodolgicas. Debe tenerse en cuenta que variaciones en la relacin anticoagulante/muestra o en la concentracin de citrato utilizada afectan los tiempos de tromboplastina parcial activada, por lo que se recomienda controlar la dosis de anticoagulante empleada al tomar la muestra. PERFORMANCE Reproducibilidad: procesando replicados de las mismas muestras en un mismo da se obtuvieron los siguientes resultados: Nivel 45 seg 62 seg PRESENTACION Equipo para 150 determinaciones (6 x 2,5 ml) (Cd. 1705002). BIBLIOGRAFIA - Bell, W.N.; Alton, H.G. - Nature 174:880 (1954). - Dacie, J.B.; Lewis, S.M. - Hematologa Prctica Ediciones Toray, 2 Edicin (1970). - Wintrobe, M.M. - Hematologa Clnica 3 Edicin Intermdica (1969). - Bragos, I; Rodrguez Pcora, S; Lorenzo, L; Capriotti, G. Evaluacin de un nuevo Reactivo de Tiempo Parcial de Tromboplastina Activada - 53 Triduo Bioqumico Cientfico Anual; Baha Blanca (1988). - Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests", AACC Press, 3rd ed., 1990. D.S. +1,1 seg +1,8 seg C.V. 2,5% 3,0%

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DETERMINACION DEL TIEMPO DE PROTROMBINA O TIEMPO DE QUICK EN UNA ETAPA

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Soluplastin
Tromboplastina clcica para la determinacin del Tiempo de Protrombina o Tiempo de Quick en una etapa

SIGNIFICACION CLINICA
El fenmeno de la coagulacin puede desencadenarse por una va extrnseca (lesin tisular) o por una va intrnseca contacto de la sangre con epitelios distintos del vascular normal). La determinacin del Tiempo de Protrombina o Tiempo de Quick es una prueba global para evaluar la coagulacin extrnseca, siendo sensible a: factor II o protrombina, factor V o proacelerina, factor VII o proconvertina y factor X o Stuart-Prower. Por lo tanto la determinacin se aplica a: - estudios de rutina en los anlisis prequirrgicos; - deteccin de alteraciones en los niveles de uno o ms factores involucrados en la va extrnseca; - control de la teraputica con anticoagulantes orales. FUNDAMENTOS DEL METODO Este ensayo se basa en la medida del tiempo que tarda en coagular un plasma descalcificado, colocado a 37oC y en presencia de un exceso de tromboplastina tisular y calcio. El mtodo no detecta deficiencias de factores de la va intrnseca (VIII, IX, XI y XII). REACTIVO PROVISTO Soluplastin: viales conteniendo tromboplastina de cerebro de conejo, cloruro de calcio para una concentracin final de 0,0125 mol/l y cloruro de sodio para una concentracin final de 0,1 mol/l. REACTIVO NO PROVISTO Agua bidestilada o deionizada. INSTRUCCIONES PARA SU USO - Abrir un vial quitando el precinto metlico y retirando lentamente el tapn de goma para evitar prdidas del material. - Agregar el volumen de agua bidestilada o desionizada indicado en el envase. Verificar que la temperatura del agua empleada no sea mayor de 37oC. - Tapar y agitar suavemente hasta obtener una suspensin homognea. Volver a homogeneizar cada vez que se emplee. PRECAUCIONES El reactivo es para uso diagnstico "in vitro". ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Soluplastin provisto: estable en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. Soluplastin reconstituido: en refrigerador (2-10oC), es estable 5 das a partir del momento de su reconstitucin. MUESTRA Plasma a) Recoleccin: obtener sangre cuidadosamente (evitando estasis o trauma) y colocar en un tubo con anticoagulante en proporcin 9 + 1 exacta (ejemplo: 4,5 ml de sangre + 0,5 ml de anticoagulante). Si se emplea Anticoagulante TP de Wiener lab., se requerirn 7 gotas para 4,5 ml de sangre). Mezclar suavemente. Centrifugar y separar el plasma antes de los 30 minutos. b) Aditivos: para obtener el plasma se debe emplear Anticoagulante TP de Wiener lab. o citrato de sodio 0,130 mol/l. c) Sustancias interferentes conocidas: - las contaminaciones, visibles o no, son causa de tiempos falsamente prolongados; - la presencia de heparina o EDTA invalida los resultados; - hemlisis visibles dificultan la medicin foto-ptica de los resultados. Referirse a la bibliografa de Young para los efectos de las drogas en el presente mtodo. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: el plasma debe mantenerse en el refrigerador (2-10oC) hasta el momento de efectuar el ensayo. En caso de no procesarse dentro de las 4 horas contadas desde la obtencin, la muestra se debe congelar (a -20oC); de tal forma, puede conservarse durante un mes. Este ltimo procedimiento debe ser realizado con rapidez, al igual que el descongelamiento (sumergiendo en bao a 37oC) previo a la determinacin. MATERIAL REQUERIDO (no provisto) - Tubos de hemlisis. - Pipetas y micropipetas para medir los volmenes indicados. - Bao de agua a 37oC. - Cronmetro. - Fuente luminosa para la observacin del cogulo.

PROCEDIMIENTO 1- Colocar el plasma (desconocido o control) en bao de agua a 37oC durante 2-3 minutos (no ms de 10 minutos). 2- En un tubo de hemlisis, colocar 0,2 ml de Soluplastin reconstituido y preincubar a 37oC durante 2-3 minutos (no ms de 10 minutos). 3- Pipetear 100 ul del plasma preincubado y agregar rpidamente al tubo conteniendo 0,2 ml de Soluplastin, disparando simultneamente el cronmetro.

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4- Mantener el tubo dentro del bao y cerca de una fuente de luz. Previo al tiempo estimado de coagulacin, sacar el tubo del bao, inclinar suavemente una o dos veces por segundo y detener el cronmetro en el momento de la aparicin del cogulo. 5- Calcular el tiempo promedio de coagulacin de la determinacin por duplicado para cada plasma (desconocido o control). Si la diferencia entre los replicados de una misma muestra es mayor del 5%, se aconseja repetir el procedimiento desechando los valores anteriores. En caso de emplear un instrumento de medicin, deben seguirse las instrucciones del fabricante del mismo. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS Los resultados pueden expresarse de distintas formas: 1- Tiempo de Protrombina o Tiempo de Quick en segundos. 2- Porcentaje de Actividad Protrombnica respecto de un plasma normal (100% de actividad): para ello se debe trazar la curva de actividad protrombnica de un pool de plasmas frescos normales. Curva de calibracin En tubos de hemlisis, preparar 5 diluciones (cada una por duplicado) de un pool de por lo menos 3 plasmas normales o Plasma Control normal, segn: Diluciones Porcentaje de actividad (%) Pool plasmas normales (ml) Solucin fisiolgica 1:1 100 0,5 1:2 50 0,3 0,3 1:3 33,3 0,3 0,6 1:4 25 0,2 0,6 1:8 12,5 0,2 1,4

Determinar el Tiempo de Protrombina para cada dilucin, empleando el PROCEDIMIENTO descripto. En un papel milimetrado, graficar los resultados en un sistema de coordenadas. Colocar los Tiempos de Protrombina en segundos sobre el eje de las ordenadas y los Porcentajes de Actividad Protrombnica en el eje de las abscisas. Cada laboratorio debe trazar su propia curva de calibracin, correspondiente al lote de reactivos en uso. Repetir con cada nuevo lote de reactivos. 3- Razn Internacional Normatizada (R.I.N.) Para su clculo, deber emplearse la tabla de valores adjunta al equipo. METODO DE CONTROL DE CALIDAD Plasma Control normal - patolgico. VALORES DE REFERENCIA El rango de valores obtenidos en pacientes normales oscila entre: - Tiempo de Protrombina o Tiempo de Quick: 10 - 14 seg - Porcentaje de Actividad Protrombnica: 70 - 100% Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios intervalos o valores de referencia. Para pacientes bajo tratamiento con antivitaminas K se ha establecido un rango teraputico que se puede expresar como: - Porcentaje de Actividad Protrombnica: 25 - 35% R.I.N.: 2,4 - 2,5 LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA. Otras causas de resultados errneos son: - Extraccin defectuosa de sangre venosa. - Las variaciones en la relacin anticoagulante/muestra o en la concentracin de citrato utilizada afectan los Tiempos de Quick por lo que se recomienda controlar la dosis de anticoagulante empleada al tomar la muestra. - La preincubacin en el 2o paso del PROCEDIMIENTO no debe exceder los 10 minutos indicados como lmite mximo. Por otra parte, es conveniente que el reactivo reconstituido se retire del refrigerador inmediatamente antes de iniciar la prueba y vuelva a guardarse al finalizarla, ya que la exposicin por varias horas a temperatura ambiente en forma reiterada, deteriora el reactivo produciendo el alargamiento de los tiempos de protrombina. PERFORMANCE a) Reproducibilidad: procesando replicados de las mismas muestras en un mismo da, se obtuvieron los siguientes datos: X (n=20 11,5 seg 21,2 seg D.S. +0,4 seg +0,6 seg C.V. 3,5% 2,8%

b) Comparacin con mtodo de referencia: procesando distintas muestras con Soluplastin y con otro mtodo tomado como referencia, se observa:

Reactivo Soluplastin Referencia

X (n=60) 13,2 seg 12,8 seg

D.S. +0,3 seg +0,3 seg

C.V. 2,3% 2,3%

PRESENTACION - Equipo para 100 determinaciones (10 x 2 ml) (Cd. 1705001). - Equipo para 10 x 20 determinaciones (10 x 4 ml) (Cd. 1705005). - Equipo para 320 determinaciones (8 x 8 ml) (Cd. 1705003). BIBLIOGRAFIA

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- Quick, A.J. - Fisiologa y Patologa de la Hemostasis - Ed. El Ateneo, Buenos Aires (1952). - Araldi, H.T., et al. - Primer Reactivo Nacional Argentino de Referencia de Tromboplastina de Cerebro Humano Acta Bioqum. Cln. Latinoam. XVI/1:131 (1982). - Comit de Expertos de la O.M.S. en Patrones Biolgicos - Inf. N 28: Normalizacin de la Vigilancia del Tratamiento Anticoagulante (oral) - Serv. Inf. Tec. N 610:49-56 (1977). - Comit de Expertos de la O.M.S. en Patrones Biolgicos - Inf. N 31: Requerimientos para Tromboplastinas y Plasmas usados en la terapia anticoagulante oral - Serv. Inf. Tc. N 658:202-223 (1981). - Suer Casadevall, F. - Nuevas Normas Internacionales para la Expresin del Tiempo de Quick - Anlisis Clnicos X/40:240-245 (1985). - Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests", AACC Press, 3rd ed., 1990.

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DETERMINACIN DE FIBRINGENO

Fibringeno
Reactivo para la determinacin de fibringeno plasmtico

SIGNIFICACION CLINICA

El fibringeno es una glicoprotena que se halla presente en el plasma y en los grnulos plaquetarios Es el factor de la coagulacin . que se encuentra en mayor concentracin plasmtica (200-500 mg/dl). Cuando se produce un trauma o injuria vascular, la trombita formada escinde al fibringeno convirtindolo en monmeros de fibrina que polimerizan espontneamente y luego son estabilizados dando lugar a la malla insoluble de fibrina. Niveles bajos de fibringeno pueden encontrarse en desrdenes hereditarios tales como hipofibrinogenemia, afibrinogenemia, disfibrinogenemia, y tambin en otras circunstancias como enfermedad heptica, coagulacin intravascular diseminada, sndromes fibrinolticos, etc. Niveles elevados pueden encontrarse en diabetes, enfermedad inflamatoria, etc. Actualmente se ha reconocido que niveles altos de fibringeno aumentan el riesgo a padecer enfermedad cardiovascular. FUNDAMENTOS DEL METODO El ensayo se basa en el mtodo de Clauss, designado como procedimiento de referencia por el NCCLS (Nacional Committee for Clinical Laboratory Standards). Cuando un exceso de trombina se adiciona a un plasma diluido, el tiempo de coagulacin es inversamente proporcional a la concentracin de fibringeno plasmtico. El tiempo de coagulacin obtenido se compara posteriormente con una preparacin de fibringeno estandarizada. REACTIVOS PROVISTOS Trombina: viales conteniendo trombina liofilizada. Una vez reconstituida equivale aproximadamente a 100 Unidades NIH de trombina/ml. Buffer Imidazol: solucin de imidazol 0,05 M, pH 7,3. Plasma Referencia: vial conteniendo plasma liofilizado. Ver el valor de fibringeno asignado en el rtulo. REACTIVO NO PROVISTO Agua bidestilada o desionizada. INSTRUCCIONES PARA SU USO Trombina y Plasma Referencia: quitar el precinto metlico y abrir el vial retirando lentamente el tapn de goma para evitar prdidas del material. Agregar el volumen de agua bidestilada o desionizada indicado en el rtulo. Tapar, dejar reposar 30 minutos y luego mezclar suavemente (sin agitar) hasta obtener disolucin completa antes de su uso. Fechar. Se recomienda mantener el reactivo Trombina en el frasco original luego de su reconstitucin y durante su uso. Buffer Imidazol: listo para usar. Evitar su contaminacin. Mantener en su frasco original bien cerrado. PRECAUCIONES Los Reactivos son para uso diagnstico "in vitro". Este producto ha sido preparado a partir de plasmas humanos, los cuales han sido ensayados utilizando los mtodos bajo licencia de la FDA. No se ha encontrado reactividad para HBsAg, HCV y HIV. Pero dado que ningn mtodo de ensayo puede asegurar la ausencia absoluta de agentes infecciosos, los plasmas referencia, controles y muestras de pacientes deben manejarse como si se tratara de material potencialmente infeccioso. ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Reactivos Provistos: son estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. Trombina reconstituida: estable 5 das refrigerada (2-10oC) o 30 das congelada (-20oC). Para descongelarla, hacerlo rpidamente a 37oC. No volver a congelar. Llevar a temperatura ambiente el reactivo antes de volver a usarlo. Evitar calentamientos prolongados. Plasma Referencia reconstituido: estable durante 8 horas refrigerado (2-10oC). MUESTRA Plasma a) Recoleccin: obtener sangre cuidadosamente, evitando estasis o espuma, y colocarla en un tubo con anticoagulante en proporcin 9 + 1 (ejemplo: 4,5 ml de sangre + 0,5 ml de anticoagulante). Mezclar suavemente. Centrifugar y separar el plasma antes de los 30 minutos. La extraccin se debe efectuar con jeringas plsticas. b) Aditivos: para obtener el plasma puede emplearse Anticoagulante TP de Wiener lab. o citrato de sodio 3,8% o 3,2%. No debe emplearse EDTA o heparina. c) Sustancias interferentes conocidas: - Las muestras ictricas, lipmicas o hemolizadas pueden dar resultados errneos. - Niveles elevados de productos de degradacin de fibringeno o fibrina pueden alargar los tiempos de coagulacin especialmente cuando los niveles de fibringeno son menores a 150 mg/dl. - Niveles teraputicos de heparina no interfieren con el ensayo, pero niveles elevados pueden conducir a resultados falsamente disminuidos. Referirse a la bibliografa de Young para los efectos de las drogas en el presente mtodo. d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la muestra debe conservarse hasta el momento de su anlisis en tubos plsticos para minimizar el efecto de activacin por contacto que puede ocurrir con los tubos de vidrio. El plasma debe mantenerse en refrigerador (2-10oC) hasta el momento de efectuarse la prueba. Este perodo no debe prolongarse ms de 4 horas. En caso de no poder procesarse en este lapso, el plasma debe congelarse a -20oC. Este ltimo proceso debe realizarse con rapidez, al igual que el descongelamiento (sumergiendo en bao a 37oC) previo a la determinacin.

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MATERIAL REQUERIDO 1- Provisto - Hoja de papel doble logartmico. 2- No provisto - Tubos de hemlisis. - Tubos plsticos para preparar las soluciones. - Pipetas y micropipetas para medir los volmenes indicados. - Bao de agua a 37oC. - Cronmetro. - Fuente luminosa para la observacin del cogulo. PROCEDIMIENTO I- CURVA DE CALIBRACION 1- Preparar diluciones del Plasma Referencia fibringeno 1:5, 1:10, 1:15, 1:20, 1:30, empleando 0,1 ml del Plasma Referencia reconstituido y 0,4; 0,9; 1,4; 1,9 y 2,9 ml de Buffer Imidazol respectivamente. El plasma diluido 1:10 representa el 100% del valor asignado en el envase. 2- Precalentar 0,2 ml de cada dilucin a 37oC durante 2 minutos. 3- Disparar el cronmetro con el agregado de 0,1 ml de Trombina reconstituida (no precalentar el reactivo de Trombina) a las diluciones preincubadas y registrar el tiempo de formacin del cogulo. 4- Calcular el tiempo promedio de coagulacin para cada dilucin, por duplicado. 5- Construir la curva de calibracin de fibringeno representando los tiempos de coagulacin en funcin de la concentracin de fibringeno, sobre el papel log-log. Unir a travs de una recta la mayora de los puntos representados. La recta final debe contener por lo menos 3 puntos consecutivos. Concentracin fibringeno* 1:5 0,8 0,2 ----mg/dl 1:10 0,9 0,1 ----mg/dl 1:15 1,4 0,1 ----mg/dl 1:20 1,9 0,1 ----mg/dl 1:30 2,9 0,1 ----mg/dl * concentracin de fibringeno indicada en el rtulo del Plasma Referencia Dilucin Bfer Plasma Ref. Factor dilucin x2= x1= x 0,67 = x 0,5 = x 0,33 =

El valor de fibringeno de cada dilucin de la curva se determina multiplicando la concentracin de fibringeno en el Plasma Referencia por el factor de dilucin. Por ejemplo, si en el Plasma Referencia se indica un nivel de fibringeno de 260 mg/dl, entonces las diluciones 1:5, 1:10, 1:15, 1:20 y 1:30 tienen 520, 260, 173, 130 y 87 mg/dl respectivamente. II- MUESTRAS DE PACIENTES Y CONTROLES 1- Preparar diluciones 1:10 de los plasmas de pacientes o plasmas controles en Buffer Imidazol. 2- Precalentar 0,2 ml de cada dilucin a 37oC durante 2 minutos. 3- Rpidamente adicionar 0,1 ml de Trombina y registrar el tiempo de formacin del cogulo. 4- Repetir la determinacin y promediar el resultado para cada muestra. CALCULO DE LOS RESULTADOS Conocido el tiempo de coagulacin del paciente o del control, ingresar este valor a la curva standard e interpolar el valor de fibringeno en cada caso. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS Si el tiempo de coagulacin para la muestra es demasiado corto (por ejemplo, menor a 7 segundos) diluir el plasma 1:20 con Buffer Imidazol y volver a ensayar. Multiplicar el resultado por 2. Si el tiempo de coagulacin para la muestra es demasiado largo (por ejemplo, mayor a 35 segundos) diluir el plasma 1:5 con Buffer Imidazol y volver a ensayar. Multiplicar el resultado por 0,5. METODO DE CONTROL DE CALIDAD Plasma Control normal/patolgico. VALORES DE REFERENCIA El intervalo de valores observados en pacientes normales oscila entre 200 - 400 mg/dl. En general se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios intervalos de referencia, dentro de su poblacin de pacientes. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO - Se deber realizar una curva de calibracin nueva con cada cambio de lote de reactivo o cualquier cambio de instrumento. - Fallas en la reconstitucin de los reactivos pueden ser causa de resultados errneos. - Recoleccin de muestra: las muestras y sus diluciones debern colocarse en tubos de plstico o de vidrio siliconado. Es importante respetar la relacin de anticoagulante y sangre como tambin la concentracin de citrato utilizada. - Debe controlarse que el ensayo se realice a 37oC y que los tubos de trabajo estn absolutamente limpios. PERFORMANCE Reproducibilidad: procesando replicados de las mismas muestras en un mismo da se obtuvieron los siguientes resultados:

Nivel
12,1 seg 20,4 seg

D.S. +0,3 seg +0,6 seg

C.V. 2,7% 3,2%

PARAMETROS PARA ANALIZADORES AUTOMATICOS

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El reactivo Fibringeno se puede usar en forma manual y con mtodos de deteccin mecnicos y foto-pticos. Para instrumentos semiautomticos y automticos se recomienda seguir las instrucciones del aparato. PRESENTACION Equipo para 100 determinaciones (Cd. 1705006) conteniendo: - Trombina: 10 x 1 ml - Plasma Referencia: 1 x 1 ml - Buffer Imidazol: 2 x 60 ml BIBLIOGRAFIA - Clauss, A. - Acta Haematol. 17:237, 1957. - Koepke, J.A. - Am. J. Clin. Pathol. 63:984, 1975. - Collet, J.P. - Blood 82/8:2462, 1993. - Ernest, E. - Ann. Intern. Med. 118/12:956, 1993. - Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests", AACC Press, 3rd ed., 1990.

Wiener lab.
2000 Rosario - Argentina
Elaborado por: Wiener Laboratorios S.A.I.C. Riobamba 2944 2000 - Rosario - Argentina http://www.wiener-lab.com.ar Dir. Tc.: Viviana E. Ctola Bioqumica Producto Inscripto M.S. Disp. N: 5585/98 Cert. N: 2925/98

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